JP4953824B2 - 宿主に対して抗病性を付与する新規な菌株および菌体組成物 - Google Patents

Description

本発明は、高い酪酸生成能を有するブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ、以下Ｂ．ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓとも表す。）の菌体を含有することを特徴とする発がんの抑制、免疫力の向上、病原性感染の予防及び治療、炎症性腸疾患の予防及び治療、アレルギー性疾患の予防及び治療に有用な新規な菌体組成物に関する。

近年、乳酸生成能の高いラクトバチルスやビフィドバクテリウムなどを用いたプロバイオティクス製剤が報告され（特許文献１）、またその多くが製品化されている。これらの製剤の基本的な機能は整腸作用であり、宿主がこれらの製剤を摂取した場合、これら製剤に含まれる乳酸産生菌が産生した乳酸により腸管内のｐＨが低下する。そのため、そのような低いｐＨ環境では生息できない悪玉菌の菌数が減少し、その結果として整腸作用を示すとされている。このように微生物の機能性により、宿主に対して健康増進や抗病性など効果をもたらすプロバイオティクスという概念は社会的に広く受け入れられ、またその効果についても認められてきている背景にある。本発明においてプロバイオティクスとは、動物およびヒトの健康に有益な作用を示す生きている微生物のことを指す。

さらに最近では、これらの乳酸菌の産生する乳酸の効果だけでなく、供給した微生物細胞自体に含まれるペプチドグリカンやその他タンパク質などによる宿主の免疫賦活作用、また、ある特定の細菌に対して狭い範囲の抗菌活性を示すバクテリオシンを持つことも示されている（非特許文献１）。

また、ヒトや動物の腸内発酵により生成される短鎖脂肪酸が注目されている。短鎖脂肪酸は腸管内のｐＨを低下させる機能や腸管運動の促進（非特許文献２）、Ｎａ吸収の促進効果などが示されている。これら短鎖脂肪酸の中でも特に注目されているのは酪酸である。その機能としては、結腸上皮細胞におけるエネルギー源として重要であること（非特許文献３）、また、抗がん作用（非特許文献４）や腸管粘膜の分化促進効果など、宿主にとって非常に有益な効果をもたらすことが示されている。

しかし、酪酸自体をそのまま経口で投与することは、独特の臭気や、安全性の面からも問題があった。そのため、このような重要な生理活性物質をより効果的に宿主に対して作用させるためには、直接経口投与するよりも、少量を腸内で産生し常時吸収させた方が効果的であると考えられる。

微生物を利用した腸内酪酸濃度上昇促進剤としては、ラクトバチルス・アシドフィルス及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガムの菌体を有効成分とするものが開示されている（特許文献２）。しかし、当該特許中には実際の疾病に関しての効果の記載は無く、この菌体を投与することにより、抗病性がどの程度あるかは不明である。

また、酪酸生成能を有する微生物としてクロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、以下Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍとも表す。）を用いる方法が開示されている（非特許文献５）。このように既に公知化されている文献によれば、酪酸生成菌としてすでに商品化されているクロストリジウム・ブチリカムは整腸作用がある。しかし、前がん病変細胞の抑制効果については、十分な効果を得るためには特殊な基質と一緒に投与する必要があり、当該微生物単独では効果が低いという問題点があった（非特許文献６）。また、同様に炎症性腸疾患の予防効果を検討した結果においても、当該微生物単独では効果が低いという問題点があった。

また、これら文献にはプロバイオティクスとしてブチリビブリオ・フィブリソルベンスを使用する具体的な方法は明記されておらず、またその効果も明らかにされていない。

以上のことから、宿主に対して一層の健康増進や抗がん性や免疫賦活機能を有することによる抗病性の作用が高く、かつ酪酸生成能を有する菌株が強く望まれていた。

特開２００２−３０６１２５号公報 特開平１０−８４９０９号公報 Ｋａｗａｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，２００４，５（５），３９３−８，″Ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎｓ ｇａｓｓｅｒｉｃｉｎ Ａ ａｎｄ ｃｉｒｃｕｌａｃｉｎ Ａ″ Ｃｈｅｒｂｕｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８，２７５，Ｇ１４１５−Ｇ１４２２，″Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｍｏｄｉｆｙ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｏｔｉｌｉｔｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｎｅｒｖｅｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＹＹ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ″ Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｕｔ，１９８１，２２，７６３−７７９，″Ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｆａｔｔｙａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ″ Ｈａｇｕｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９７，１１２，１０３６−１０４０，″Ｂｕｔｙｒａｔｅａｃｔｓ ａｓ ａ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ：ｆｕｒｔｈｅｒ ｆｕｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｅｒｓｕｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｂａｔｅ″ Ｋａｎａｕｃｈｉ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．，２００３，９（４），３３３−３４６，″Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｆｌｏｒａ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ″ Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，４７（１２），９５１−９５８，″Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｍｙｌｏｓｅ ｍａｉｚｅ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ｏｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｒｙｐｔ ｆｏｃｉ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃｏｌｏｎ″

本発明の目的は、発がん抑制効果、免疫賦活効果、病原菌感染予防・治療効果、炎症性腸疾患予防・治療効果およびアレルギー性疾患予防・治療効果を有する、新規に単離したブチリビブリオ・フィブリソルベンスの菌体を提供することにある。また本菌は、高い酪酸生成能を有し、プロバイオティクスとして用いることができ、更には、それを用いた発がん抑制方法、免疫賦活化方法、病原菌の予防・治療方法、炎症性腸疾患の予防・治療方法およびアレルギー性疾患予防・治療方法を提供することにある。

本発明者らは、ヒトや動物などの一層の健康増進や抗がん性や免疫賦活機能などを有し、かつ腸内での酪酸生成能を有する、安全で安価に提供可能なプロバイオティクス製剤を求めて鋭意研究を進めてきたところ、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスにこのような機能があることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明を以下に示す。
（１）独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６３として寄託されたブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株。
（２）上記（１）に記載のブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株の菌体、その培養物または抽出物を含むことを特徴とする菌体組成物。
（３）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する医薬品。
（４）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する飼料添加物。
（５）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する発がんを抑制する治療剤。
（６）上記（２）に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む発がんを抑制する方法。
（７）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する免疫賦活化剤。
（８）上記（２）に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む免疫賦活化の方法。
（９）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する病原菌の感染予防及び／又は治療剤。
（１０）上記（２）に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む病原菌の感染を予防及び／又は治療する方法。
（１１）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有する炎症性腸疾患に対する予防及び／又は治療剤。
（１２）上記（２）に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む炎症性腸疾患を予防及び／又は治療する方法。
（１３）上記（２）に記載の菌体組成物を有効成分として含有するアレルギー性疾患に対する予防及び／又は治療剤。
（１４）上記（２）に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含むアレルギー性疾患に対する予防及び／又は治療する方法。

本発明の菌体組成物は抗癌作用、免疫賦活効果、炎症性腸疾患予防・治療効果、病原菌感染予防効果およびアレルギー性疾患予防・治療効果などを有する。

菌体組成物およびジメチルヒドラジンの投与スケジュールを示す図である。 ＤＳＳおよびブチリビブリオ・フィブリソルベンス投与マウスにおけるＤＡＩを示す図である。 ３−ＭＣ誘発繊維肉腫形成に及ぼす菌体組成物投与の効果を示す図である。 ３−ＭＣおよび菌体組成物の投与が体重増加に与える影響を示す図である。

以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書において、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスの「タイプＩ」とは、当該細菌の発酵能の違いによる分類の１種である（Ｓｈａｎｅ ＢＳ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９６９，５５，４４５−４５７，″Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｒｕｍｅｎ ｏｆ ｓｈｅｅｐ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｏ ｌｏｗ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｆｆ ｈａｙ″）。タイプＩは酪酸生成に発酵経路が偏っており、細菌の発酵によって生成される乳酸の割合はタイプＩＩｂと比較して少なく、酪酸を多く生成する。
表に示したように、本発明のＭＤＴ−１株は酪酸生成量の多いタイプＩの菌株の中で、細胞外ｐＨの低下に対する耐性が最も高いため、酸性の腸管内においても有利に増殖することが期待される。

本明細書において、「発がんを抑制する方法」とは、例えば大腸管粘膜の前癌病変である異常陰窩病巣などの形成を予防する方法である。すなわち、あらかじめ発がんの可能性の全く無い平常時、または発がんの可能性がある場合に、事前に本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、発がんを完全に防御する事ができたり、またはそのリスクを低減させる事ができる。また、同様に既に発がんしている可能性がある場合にも、ただちに本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、がんの進行を防いだり、または低減させる事ができる。

本明細書において、「免疫賦活化の方法」とは、例えば、ヒトや動物の体内に病原菌やウイルスなどが侵入してきた場合に、すばやく抗病性を示すためのＮＫ細胞数の増加、ＩｇＧ産生など液性免疫の応答の速さや効率化、腸管免疫系の応答の速さや効率化などにより、免疫力を一層増強させる方法である。すなわち、あらかじめ病原菌やウイルスなど感染の可能性の全く無い平常時、または病原菌やウイルスなどに感染するであろう可能性がある場合に、事前に本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、上述した体内に侵入した病原菌やウイルスなどの感染を完全に防御する事ができたり、または低減させる事ができる。また、同様に既に病原菌やウイルスなどが体内に侵入した可能性がある場合にも、ただちに本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、上述した病原菌やウイルスなどの感染による発症・発病を完全に防御する事ができたり、または低減させる事ができる。

また本明細書において、「病原菌の感染を予防及び／又は治療方法」とは、例えばサルモネラ属やキャンピロバクター属などに代表される病原菌がヒトや動物の消化管内または呼吸器官内に侵入してきた場合、その病原菌の感染や、それらの感染による発症・発病を予防する方法である。すなわち、あらかじめ感染の可能性の全く無い平常時、または感染するであろう可能性がある場合に、事前に本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、上述した病原菌の感染を完全に防御する事ができたり、または低減させる事ができる。また、同様に既に病原菌に感染した可能性がある場合にも、ただちに本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、上述した病原菌の感染による発症・発病を完全に防御する事ができたり、または低減させる事ができる。

本明細書において、「炎症性腸疾患を予防及び／又は治療する方法」とは、例えば潰瘍性大腸炎やクローン病として知られている難病性の疾病の発症・発病を予防及び／又は治療する方法である。すなわち、上述した疾病を既に患っているヒトや動物に、本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤を投与することにより、上述した疾病を完全に治療する事ができたり、または症状を低減させる事ができる。また同様に、上述した疾病を患う可能性の全く無い平常時、または上述した疾病を患う可能性がある場合に、事前に本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、上述した疾病を完全に防御する事ができたり、または低減させる事ができる。

本明細書において、「アレルギー性疾患を予防及び／又は治療する方法」とは、例えば免疫細胞であるヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１へ傾けることによって、アレルギー性疾患の症状を改善および／または治療する効果である。アレルギー性疾患とは、具体的にはアトピー性皮膚炎や花粉症、食品由来の成分を原因とする下痢等の症状を示す。すなわち、あらかじめアレルギー症状の可能性の全く無い平常時、またはアレルギー症状の発症する可能性がある場合に、事前に本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、アレルギー症状の発症を完全に防御する事ができたり、またはそのリスクを低減させる事ができる。また、同様に既にアレルギー症状が発症している可能性がある場合にも、ただちに本発明の菌体又は菌体組成物およびこれらを含む製剤をヒトや動物に投与することにより、アレルギー症状の進行を防いだり、または低減させる事ができる。

本発明の菌体組成物における菌体は、これまで説明した各種特質を示す限り、その起源は特に限定されるものではなく、その由来としては、ブチリビブリオ属に属する微生物であり、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスがより好ましく、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスのタイプＩに分類される菌がさらに好ましく、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６３菌株）が特に好ましい。本発明のＭＤＴ−１株の変異株としては、本発明の効果が得られる限り限定されないが、ＭＤＴ−１株の継代培養株、人工変異株ならびに自然変異株、遺伝子組み換え株などを挙げることができる。ＭＤＴ−１株の菌学的性状は以下の通りである。

ＭＤＴ−１株の菌学的性状
ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株は、グラム陰性の桿菌である。本菌は偏性嫌気性菌であり、増殖には高い嫌気度を必要とする。本菌の糖利用性を下記の表に示した。

また、本菌の増殖時に生成する発酵産物は下記の通りである。

なお、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にＦＥＲＭ Ｐ−２０２９３として平成１６年１１月９日に寄託されている（尚、当該ＭＤＴ−１株は、平成１７年１２月５日付けで、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６３として国際寄託に移管された）。

以下、ＭＤＴ−１菌株の培養方法について述べる。
本発明において、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスを培養するには、中性ｐＨ付近において緩衝能を示す成分を有していれば通常の栄養培地を使用でき、炭素源、窒素源、金属類、短鎖脂肪酸、ビタミン類、アミノ酸類を十分に含有するものであれば、天然培地、合成培地いずれも用いることができる。

培地中の炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、でんぷん等が使用できる。また、窒素源としてはペプトン、イースト、肉エキス等を使用できる。さらに無機塩類としては、リン酸水素２カリウム、リン酸２水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、酢酸カリウム等を用いることができる。

培養法としては、炭酸ガスや窒素ガスなどによる置換により高い嫌気度を保ち、１０℃〜７０℃、好ましくは２５℃〜６０℃、より好ましくは３０〜４５℃で、２〜９６時間、好ましくは３〜４８時間より好ましくは５〜２４時間攪拌培養することにより、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスを培養することができる。
本発明の菌体組成物においては、上記ブチリビブリオ属に属する微生物の菌体、その培養物あるいは抽出物を含む。その培養物としては、上記のように当該菌を培養して得られた培養上澄等が挙げられ、抽出物としては当該菌体を溶菌させて得られる溶菌液から有効成分を抽出して得られる抽出物が挙げられる。本発明の菌体組成物においては、本発明の効果をより有効に発現できることから、上記ブチリビブリオ属に属する微生物の菌体を含むことが好ましい。
以下に、本発明の菌体組成物が上記ブチリビブリオ属に属する微生物の菌体を含む場合を例として、本発明の菌体組成物について説明する。

得られた培養液を遠心分離機で処理することにより、菌体を含む沈殿物を得る。また、菌体を等張液等の溶液に浮遊させ、菌体組成物を得ることもできる。等張液等の溶液としては塩化ナトリウム溶液等を用いることができる。

本発明の酪酸生成能を有する微生物を含む菌体組成物を取得するためには、その微生物に適した、上記に記載されたような条件で培養を行ない、本発明の微生物を含む菌体を回収し、必要により、任意成分（溶液、当該菌体以外の菌体、担体、及び希釈液等）を加えることにより、本発明の菌体組成物を調製することができる。

菌体組成物中の菌体含量は、その使用目的に応じて、上述したような充分な機能性が発揮可能である限り、特に限定されるものではないが、例えば、菌体組成物全重量に対して０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。

本発明の菌体組成物は、本発明の菌体に加え、更に本発明菌体以外の菌体、例えば、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、又はクロストリジウム属の少なくとも１つを含むことができる。本発明の菌体以外の菌体を併用することにより、本発明の菌体を単独で含む菌体組成物に比べて、プロバイオティクスとしての効果をより一層向上させることが期待される。

本発明の菌体組成物は、有効成分である本発明の菌体を単独で含有することもできるし、あるいは、有効成分である本発明の菌体と一緒に、適当な担体及び／又は希釈剤を含有することもできる。前記担体又は希釈剤としては、有効成分である本発明の菌体の発がん抑制効果、免疫賦活効果、病原菌感染予防・治療効果、炎症性腸疾患予防・治療効果およびアレルギー性疾患予防・治療効果を抑制又は阻害することがない限り、菌体組成物の担体又は希釈剤として一般的に用いられている担体又は希釈剤、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、又はソルビトール等）、界面活性剤、又は防腐剤を用いることができる。

本発明の菌体又は菌体組成物を、それ単独で、あるいは、上述したような製剤の形で用いることにより、ヒトまたは宿主動物のガンの発生、免疫力の向上、病原菌の感染予防、炎症性腸疾患予防およびアレルギー性疾患予防をすることができる。またあるいは、既に発がんした場合、免疫力が低下した場合、病原菌に感染した可能性のある場合、炎症性腸疾患に罹患した可能性のある場合またはアレルギー性疾患に罹患した可能性のある場合のヒトまたは宿主動物に対しても本発明の菌体又は菌体組成物を投与する事によりそれぞれの症状を治療もしくは軽減する事ができる。
本発明における対象生物としては、本発明の効果を有効に発現できる生物であれば特に限定されるものではなく、例えばヒトあるいは動物が挙げられる。その動物としては、愛玩動物及び家畜動物が挙げられ、特に魚類、両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類等の脊椎動物が挙げられる。それらの具体例としては、養殖あるいは愛玩されている魚類、両生類及び爬虫類、愛玩されている鳥類、イヌ、猫、げっ歯類等の愛玩哺乳類、牛、豚等の家畜哺乳類、及び家禽が挙げられる。

本発明の菌体又は菌体組成物の投与としては、消化管内に菌体又は菌体組成物が到達しうる形態が望ましく、腸に到達する形態がさらに望ましい。例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤又は経口用液剤などによる経口投与あるいは座剤を用いた非経口投与を挙げることができる。
本発明の医薬品、飼料添加物、発がん抑制治療剤、免疫賦活化剤、病原菌感染予防・治療剤、炎症性腸疾患予防・治療剤およびアレルギー性疾患予防・治療剤における、有効成分としての上記菌体組成物の含有量としては、本発明の効果が得られる限り、特に限定されるものではないが、菌体の量で表すと、１０^３〜１０^１４ｃｆｕ／ｇが好ましく、より好ましくは１０^５〜１０^１３ｃｆｕ／ｇがより好ましく、特に好ましくは１０^６〜１０^１２ｃｆｕ／ｇである。

本発明の医薬品、飼料添加物、発がん抑制治療剤、免疫賦活化剤、病原菌感染予防・治療剤、炎症性腸疾患予防・治療剤、アレルギー性疾患予防・治療剤、及び、本発明の方法において、有効成分である上記菌体組成物の投与法（投与量、投与回数、投与期間）は、上記菌体が腸に到達し、腸で生育でき、本発明の効果が得られる限り、特に限定されるものではなく、対象動物、目的、菌体の生育状況を考慮して適宜設定できうる。
その投与量としては、本発明の効果が得られる限り、特に限定されるものではないが、例えば、１回の投与あたりの菌体の量で表すと、対象動物１ｋｇあたり、１０^３〜１０^１５ｃｆｕが好ましく、より好ましくは１０^６〜１０^１４ｃｆｕがより好ましく、特に好ましくは１０^８〜１０^１２ｃｆｕである。

上記範囲の投与量を、例えば、単回投与してもよいし、一定の期間にわたって継続して投与してもよい。継続して投与する場合、投与期間としては、例えば、２日〜６ヶ月以上が好ましく、より好ましくは３日〜６ヶ月以上、特に好ましくは７日〜６ヶ月以上である。本発明においては、より長期間にわたり投与を継続することにより、本発明の効果をより発現できる。
継続して投与する場合、その投与頻度としては、例えば、１ヶ月に１回以上の投与が好ましく、より好ましくは２週間に１回以上の投与であり、特に好ましくは１週間に１回〜毎日の投与である。
投与方法としては、１日の投与量を上記範囲として、１日１回全量を投与してもよいし、１日２回から３回に分割して投与してもよい。あるいは、１日の投与量を上記範囲となるように、飼料などに混合して投与してもよい。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではなく、ここに示さなかった変法あるいは修飾手段の全てを包括する。

＜＜実施例１・菌体組成物の調製＞＞
本発明の菌体組成物を得るために、リン酸水素２カリウム（和光純薬工業社製）０．９ｇ、リン酸２水素カリウム（和光純薬工業社製）０．９ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬工業社製）１．８ｇ、硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）１．８ｇ、塩化カルシウム２水和物（和光純薬工業社製）０．２４ｇ、硫酸マグネシウム７水和物（和光純薬工業社製）０．３７５ｇ、酢酸カリウム（和光純薬工業社製）１ｇ、プロピオン酸ナトリウム（和光純薬工業社製）０．５ｇ、ｎ−酪酸ナトリウム（和光純薬工業社製）０．３ｇ、吉草酸（和光純薬工業社製）０．１ｇ、イソ酪酸（和光純薬工業社製）０．１ｇ、イソ吉草酸（和光純薬工業社製）０．１ｇ、２−メチル酪酸（和光純薬工業社製）０．１ｇ、クエン酸鉄アンモニウム（和光純薬工業社製）１０ｍｇ、塩化マンガン（和光純薬工業社製）６ｍｇ、硫酸コバルト（和光純薬工業社製）２ｍｇ、塩化ニッケル（和光純薬工業社製）０．４ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム（和光純薬工業社製）０．４ｍｇ、１５％硫酸銅（和光純薬工業社製）１ｍｇ、硫酸カリウムアルミニウム（和光純薬工業社製）０．３ｍｇ、ホウ酸（和光純薬工業社製）０．３ｍｇ、硫酸亜鉛（和光純薬工業社製）２ｍｇ、リン酸ピリドキサール（和光純薬工業社製）２ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸（和光純薬工業社製）０．５ｍｇ、ビオチン（和光純薬工業社製）０．２ｍｇ、フェニルプロピオン酸（関東化学社製）２ｍｇ、Ｌ−アルギニン（和光純薬工業社製）２ｍｇ、パンビタン（武田薬品工業社製）１００ｍｇ、ビタミンＫ_１（ＳＩＧＭＡ社製）０．０３μｌ、グルコース（和光純薬工業社製）３ｇ、イーストエクストラクト（ディフコ社製）３ｇ、トリプトンペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１．５ｇ、トリプチケース（Ｂｅｃｔｏｎｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）１．５ｇ、システイン塩酸塩（和光純薬工業社製）１ｇ（ｐＨ７．０）からなる培地（以下、培地Ａと称する）をＣＯ_２置換した後密栓し、加熱滅菌した後、培地Ａ（４０ｍＬ）に、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６３）を接種し、３７℃で攪拌しながら５時間培養した。得られた培養液を遠心分離器にて遠心分離（３０００Ｇ，３０分間）し、菌体を含む沈殿物を得た。次に、菌体を０．８％ＮａＣｌ溶液に菌体数が１０^１０ｃｆｕ／ｍＬとなるように浮遊し、菌体組成物を得た。

＜＜実施例２・ＡＣＦ形成の抑制効果＞＞
マウスＤＭＨ（ジメチルヒドラジン；Ａｌｄｒｉｃｈ製）誘発異常腺窩巣（ＡＣＦ）の形成を抑制能について、本発明の菌体組成物を用いて評価を行った。また、酪酸菌として既に市販されているクロストリジウム・ブチリカムについても同様の試験を行い、その抑制効果を比較した。
供試動物として、４週齢のオスＪｃｌ：ＩＣＲマウス（日本クレア）を用い、試験は１区１０頭で、下記の表の通りの試験区を設定した。
実施例１に記載した方法で得た菌体組成物を胃ゾンデを用いマウスに強制経口投与した。対照区には０．８％ＮａＣｌ溶液を、投与区には菌体組成物をそれぞれ、０．１ｍＬ（１０^９ｃｆｕ）ずつ投与した。菌体組成物およびジメチルヒドラジン（ＤＭＨ；Ａｌｄｒｉｃｈ製）の投与スケジュールは図１の通りとした。
試験開始から３１日後に大腸管粘膜の前癌病変である異常陰窩病巣（ＡＣＦ：Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｃｒｙｐｔ Ｆｏｃｉ）を測定した。マウスを安楽死させた後、マウスの腸管の盲腸の下から肛門までを取り出し、中央を切り開き１０％ホルマリン（純正化学社製）で固定した。その後、メチレンブルー（関東化学社製）で染色し、光学顕微鏡を用いてＡＣＦを数えた。

体重変化および臓器の状態
ＤＭＨ投与によって体重増加量が減少するが、本発明の菌体組成物を経口投与することによって改善された（表５）。Ｃ． ｂｕｔｙｒｉｃｕｍの経口投与には、そのような効果は見られなかった。試験終了時の肝臓の質量に有意差は見られなかったが（表６）、体重あたりの肝臓の質量はＤＭＨ投与によって減少し、本発明の菌体組成物によってＤＭＨ非投与区と同程度まで改善された。脾臓の質量はＤＭＨ投与によって増加し、本発明の菌体組成物によってある程度改善された。これらについても、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍには、効果は見られなかった。

腸管の状態およびＡＣＦ
結腸から直腸までの長さは、ＤＭＨ投与によって短くなり、本発明の菌体組成物によってある程度改善された。また、盲腸の質量および結腸直腸の質量は、ＤＭＨ投与によって減少し、本発明の菌体組成物によってある程度改善された。盲腸内容物および結腸内容物のｐＨには、違いは見られなかった。また、本発明の菌体組成物を経口投与することによって、ＡＣＦの形成数が約半分に抑制された。これらについても、Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍには、効果は見られなかった。

＜＜実施例３・免疫賦活効果＞＞
体内に侵入した病原菌やウイルスなどの異物に対して、先ず最初に攻撃を行うとされているＮＫ細胞を測定することにより、どの程度宿主の免疫力が賦活化されているかを検討した。
供試動物として８週齢のオスＪｃｌ：ＩＣＲマウス（日本クレア）を用い、試験は１区３頭で行った。
実施例１に記載した方法で得た菌体組成物を胃ゾンデを用いマウスに強制経口投与した。対照区には０．８％ＮａＣｌ溶液を、投与区には菌体組成物をそれぞれ、０．１ｍＬ（１０^９ｃｆｕ）ずつ投与した。投与は３日間連続で行い、最初の投与から一週間後に、マウスを屠殺した。
頚椎脱臼により屠殺したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を取り出した。赤血球を溶解した後に、細胞を２回洗浄し、１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＢＳ（緩衝液；表参照）に懸濁した。調製した脾臓リンパ球懸濁液１００μＬに、それぞれ後述する抗体を１０μＬ添加し、氷上で３０分間放置した。その後、ＰＢＢＳで２回洗浄し、測定に用いた。細胞の測定には、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。細胞の標識にはＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）、ＰＥ標識抗ＣＤ１９抗体（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ社製）、およびＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社製）を用いた。
菌体組成物の経口投与により、リンパ球中のＴ細胞とＢ細胞の割合が減少し、ＮＫ細胞とＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞の割合が増加した（表１０）。細胞数に換算した場合には、Ｔ細胞とＢ細胞の数には、菌体組成物の経口投与による影響は見られなかった（表１１）。しかし、ＮＫ細胞数は３．５倍に、ＮＫＴ細胞数は３．８倍に増加した。それ故、マウスへの菌体組成物の経口投与は免疫作用を昂進させる。

＜＜実施例４・病原菌感染予防効果＞＞
キャンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）は食中毒の原因菌であり、糞や汚染された食物から経口的に摂取され、腸管に定着する。そこでブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株に感染予防効果があるか否かを検討した。
供試動物として５週齢のオスＪｃｌ：ＩＣＲマウス（日本クレア）を用い、試験は１区１０匹で行った。
実施例１に記載した方法で得た菌体組成物を胃ゾンデを用いてマウスに強制経口投与した。対照区には０．８％ＮａＣｌ溶液を、投与区には菌体組成物をそれぞれ、０．２ｍＬ（１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）ずつ投与した。投与は感染の４日前から３日間連続し、その２日後にキャンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｃｏｌｉ）１１５８０−３株（鶏由来）を０．２ｍＬ（１０^７ＣＦＵ／ｍＬ）ずつ経口接種した。感染の翌日から４日間連続、感染前と同様に菌体組成物を投与した。感染後５日目に屠殺、解剖し、盲腸便を採取した。これを０．８％ＮａＣｌにて１０倍系列で希釈し、キャンピロバクター１０％ヒツジ血液寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン）に塗布した。嫌気培養器にて、４２℃、４８時間培養の後に生菌数（コロニー）を測定し、盲腸便１ｇあたりのキャンピロバクター数（ｌｏｇＣＦＵ／ｇ）を算出した。
対照区および菌体組成物区とも死亡例は認められなかった。
表１２に示したように、盲腸便中のキャンピロバクター数は対照区で平均８．２７ｌｏｇＣＦＵ／ｇ（７．８８〜８．８２ｌｏｇＣＦＵ／ｇ）、菌体組成物区は平均６．９６ｌｏｇＣＦＵ／ｇ（４．７９〜８．６９ｌｏｇＣＦＵ／ｇ）であった。対照区に比べ、菌体組成物区の方が１．３１ｌｏｇＣＦＵ／ｇ有意に減少した。
以上の結果から菌体組成物を投与するとキャンピロバクターの感染が軽減した。即ち、本菌体組成物を摂取し続けることにより、感染の予防または軽減が出来ることが明らかとなった。

＜＜実施例５・炎症性腸疾患予防効果＞＞
潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は治療の難しい疾病である。そこでブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株にも同様な効果があるが否かを検討した。
供試動物として４週齢のオスＪｃｌ：ＩＣＲマウス（日本クレア）を用い、試験は１区６頭で行った。
実施例１に記載した方法で得た菌体組成物を胃ゾンデを用いマウスに強制経口投与した。対照区には０．８％ＮａＣｌ溶液を、投与区には菌体組成物をそれぞれ、０．１ｍＬ（１０^９ｃｆｕ）ずつ投与した。投与は３日間連続で行った。
ＩＢＤを誘発するため、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製）を３％（ｗ／ｖ）となるように飲用水に溶解し、マウスに自由摂取させた。ＤＳＳは菌体組成物の３日間連続投与の翌日から７日間投与した。８日目に屠殺、解剖し、腸管の長さおよび質量を測定した。
Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）の算出は以下のように実施した。すなわち、体重の減少、糞の形状（下痢便の度合）、および潜血のそれぞれを０から４までの５段階で評価した。この場合、症状が重いものほど高い数値で評価した。これら３つの測定項目の合計数を３で割った値をＤＡＩとした。
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性の測定法は以下のように実施した。すなわち、大腸の末端の６ｃｍの部位を５ｍｌ／Ｌ（ｖ／ｖ）のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＴＡＢ；界面活性剤）（和光純薬工業社製）を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）で懸濁し、超音波破砕した。遠沈後（１５，０００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ）の上清０．１ｍＬを、２０ｍＭグアヤコール（ＳＩＧＭＡ製）（ｇｕａｉａｃｏｌ）と５ｍｌ／Ｌ過酸化水素（関東化学社製）を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．０）２．９ｍＬ混合し、波長４６０ｎｍにおける吸光度の変化を測定し、ＭＰＯ活性とした。
表６に示したように、ＤＳＳ投与により体重は減少したが、菌体組成物を経口投与していたマウスでは、減少の程度が軽減した。

ＤＳＳを投与することにより脾臓の増大、肝臓の縮小、および大腸の短縮が観察されたが、菌体組成物を投与することによりこれらの変化の程度が軽減した（表１４）。

体重の減少、糞の形状、および潜血のそれぞれを数値化したＤＡＩ値からも、菌体組成物投与により病状が軽減したと考えられた（図２）。また、菌体組成物を投与したマウスにおける腸管組織のＭＰＯ活性は、ＤＳＳのみを投与したマウスの約４０％に低下した（表１５）。この結果から、菌体組成物を投与したマウスの腸管組織では、好中球が少なく、炎症の程度が低かったと考えられる。

以上の結果から菌体組成物の経口投与はＩＢＤの症状を軽減する。すなわち、本菌体組成物を摂取し続けることにより、炎症性腸炎を予防することができることが明らかとなった。

＜＜実施例６・抗アレルギー作用＞＞
マウスへのブチリビブリオ・フィブリソルベンスの経口投与により、脾臓におけるＮＫ（ナチュラルキラー）細胞数が増加した。ＮＫ細胞はサイトカインＩＦＮ−γを生成する。ＩＦＮ−γはヘルパーＴ細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位にする能力を持つ。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはアレルギーに影響を及ぼす指標である。そこで、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスがアレルギー性疾患にも効果があるが否がをサイトカインを測定することにより検討した。
ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株を２０ｍｌの合成培地で対数増殖期中期まで培養した。菌体をＰＢＳ（緩衝液）で１度洗浄した後で遠沈により回収し、菌体数が２×１０^７ｃｆｕ／ｍｌとなるように１０％ウシ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（コージンバイオ社製）で懸濁した。
マウスから脾臓を摘出し、脾細胞を取り出した。赤血球を溶解した後に、細胞を２回洗浄し、４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように１０％ウシ血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（コージンバイオ社製）に懸濁した。脾細胞懸濁液０．５ｍｌをシャーレに添加し、さらに菌液もしくは培地０．５ｍｌを添加し、５％ＣＯ_２インキュベーター内で７２時間インキュベートした。
サイトカインの定量は、以下のように実施した。すなわち、細胞培養液を遠沈し、その上清をサンプルとし、ＩＦＮ−γとＩＬ−４の定量は、ＥＬＩＳＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて添付の説明書に従い測定した。
その結果、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株を添加することにより、ＩＦＮ−γの産生量は増加した。一方、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ２優位にする能力を持つＩＬ−４の産生量は低下した（表１６）。ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株の存在により、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスはＴｈ１側に傾くと考えられる。従って、ブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株の経口投与は、アレルギー性疾患にも効果がある。

＜＜実施例７・肉腫形成に及ぼす影響＞＞
大腸以外の部位に形成される癌に対する抑制効果があるかどうかを確認するために、３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ（３−ＭＣ）の皮下投与によって誘発したマウスの繊維肉腫形成に対する影響を調べた。

試験は、３−ＭＣ非投与／菌体組成物非投与区（１０頭）、３−ＭＣ投与／菌体組成物非投与区区（１３頭）、および３−ＭＣ投与／菌体組成物投与区（１１頭）の３区で行った。
実施例１に記載した方法で得た菌体組成物をそれぞれ、０．１ｍＬ（１０^９ｃｆｕ）ずつ、４週齢のＪｃｌ：ＩＣＲマウス（日本クレア）に週３回の頻度で強制経口投与した。最初の投与から１週間後に２０ｍｇの３−ＭＣ（ＳＩＧＭＡ）を２．０ｍＬのオリーブオイルに溶解し、マウスの右脇腹に０．１ｍＬ（３−ＭＣ、１ｍｇ）を皮下投与した。対照区には同量のオリーブオイルを投与した。皮下投与の１週間後に一度触診し、直径３ｍｍ以上のしこりを腫瘍とした。触診は１５週間行った。また、各区３頭ずつを投与５週間後に屠殺し、リンパ球組成（ＮＫ細胞）を測定した。

屠殺したマウスの脾臓を摘出し、０．１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ（ＢＳＡ／ＰＢＳ）に脾細胞を懸濁し、遠沈洗浄を行った。低張液（１４ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ_４Ｃｌ，１７ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６）を用いて赤血球を除去した後、ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄した。この細胞懸濁液にＴ細胞の蛍光標識抗体［ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ１９抗体、ＰＥ標識抗ＮＫ１．１抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌｏｒｉｄａ）］を加えて標識した。標識されたリンパ球の数は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて測定した。

３−ＭＣ誘発繊維肉腫形成に対する影響
図３に示したように、オリーブオイルを皮下投与したマウスでは、腫瘍の形成はみられなかった。３−ＭＣのみを投与した試験区では、３−ＭＣ投与後５週目から腫瘍が現れ始め、この時点での腫瘍形成率は２０％であった。その後も形成率は増加し続け、３−ＭＣ投与後９週目で全てのマウスに腫瘍が形成された。一方、菌体組成物投与区においては５週目では０％、９週目において、５０％の腫瘍形成率であった。そして、１５週後でさえも形成率は７５％であった。この結果から、菌体組成物の経口投与は、３−ＭＣで誘発したマウスの腫瘍形成を遅延・抑制する効果が確認された。なお、３−ＭＣ処理および菌体組成物の投与はマウスの体重増加には影響を与えなかった（図４）。

脾臓リンパ球組成に対する影響
菌体組成物による腫瘍形成の遅延・抑制効果にＮＫ細胞が関与しているか否かを調べるために、脾臓中のリンパ球組成を測定した。菌体組成物の影響が大きく出るためにはある程度の時間が必要であると考えられたため、腫瘍が形成され始める直前、すなわち３−ＭＣ投与４週間後にリンパ球の測定を行った。４週間後の体重、肝臓、脾臓の重量および食餌の摂取量に試験区間で有意差は見られなかった（表１７）。しかし、ＮＫ細胞とＮＫＴ細胞の割合は菌体組成物の投与により有意に増加した（表１８）。

発癌の初期にはＮＫ細胞が重要な役割をもつと考えられており、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が増加することにより発癌を抑制する可能性が報告されている。また、実施例３に示したように、本菌体組成物を経口投与することにより脾臓中のＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側に傾くことが確認されている。Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−αはＮＫ細胞の増殖を促進することが知られているので、その結果として、ＮＫ細胞が増加し、癌の形成を遅延・抑制すると考えられる。
以上の結果から、本菌体組成物を経口投与することにより、大腸以外の部位における癌も抑制することができることが確認された。

本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００４年１２月２８日出願の日本特許出願（特願２００４−３７９６９３）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。

本発明は、抗癌作用、免疫賦活効果、炎症性腸疾患予防・治療効果、病原菌感染予防効果およびアレルギー性疾患予防・治療効果などを有する菌体組成物を提供する。

Claims (14)

1. 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４６３として寄託されたブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株。
2. 請求項１に記載のブチリビブリオ・フィブリソルベンスＭＤＴ−１株の菌体、その培養物または抽出物を含むことを特徴とする菌体組成物。
3. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する医薬品。
4. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する飼料添加物。
5. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する発がんを抑制する治療剤。
6. 請求項２に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む発がんを抑制する方法。
7. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する免疫賦活化剤。
8. 請求項２に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む免疫賦活化の方法。
9. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する病原菌の感染予防及び／又は治療剤。
10. 請求項２に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む病原菌の感染を予防及び／又は治療する方法。
11. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有する炎症性腸疾患に対する予防及び／又は治療剤。
12. 請求項２に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含む炎症性腸疾患を予防及び／又は治療する方法。
13. 請求項２に記載の菌体組成物を有効成分として含有するアレルギー性疾患に対する予防及び／又は治療剤。
14. 請求項２に記載の菌体組成物を脊椎動物（ヒトを除く）に有効量投与することを含むアレルギー性疾患に対する予防及び／又は治療する方法。

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