JP4839144B2 - Host microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism used for producing a useful protein or polypeptide, and a method for producing a protein or polypeptide.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, pharmaceuticals, detergents, daily necessaries such as cosmetics to various chemical raw materials.
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicumATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。 In industrial production of useful substances by such microorganisms, improvement of productivity is one of the important issues, and breeding of produced bacteria by genetic techniques such as mutation has been performed as a technique. Particularly recently, with the development of microbial genetics and biotechnology, more efficient breeding of production bacteria using genetic recombination techniques has been carried out. Furthermore, in response to the rapid development of genome analysis technology in recent years, attempts have been made to decode genome information of target microorganisms and actively apply them to industry. Industrially useful host microorganisms whose genome information has been disclosed include Bacillus subtilis Marburg No. 168 (Non-patent Document 1), Escherichia coli K-12 MG1655 (Non-patent Document 2), Corynebacterium Corynebacterium glutamicum ATCC132032 and the like are mentioned, and strains with improved information have been developed using these genomic information. However, despite the above efforts, the production efficiency has not always been satisfactory.
prsA遺伝子は、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。sigF遺伝子、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、sigE遺伝子はいずれも胞子形成に関連する遺伝子であることが知られている。また、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子は、枯草菌ゲノム上においては連続して存在することが知られており、flgM遺伝子、motA遺伝子、sigD遺伝子とともに、鞭毛形成や鞭毛の駆動、或いは鞭毛機能に関わる遺伝子の発現制御等に関与する遺伝子であることが知られている。
しかしながら、prsA遺伝子を過剰発現しており、かつ、これらの胞子形成関連遺伝子や鞭毛関連遺伝子が不活化した微生物はこれまで知られておらず、特にその様な微生物がprsA遺伝子を過剰発現している微生物に比べ、有用なタンパク質又はポリペプチドの優れた生産性を示すことは予想すらされていない。
However, microorganisms that overexpress the prsA gene and inactivate these sporulation-related genes and flagella-related genes have not been known so far, and in particular such microorganisms overexpress the prsA gene. It is not even expected to show superior productivity of useful proteins or polypeptides compared to existing microorganisms.
本発明は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高い微生物を提供することを目的とする。 An object of this invention is to provide the microorganism with high productivity of the target protein or target polypeptide.
本発明者らは、prsA遺伝子を過剰発現した微生物から、胞子関連遺伝子や鞭毛関連遺伝子を削除又は不活化した微生物は、格段に優れた目的タンパク質又は目的ポリペプチド生産性を示すことを見出した。 The present inventors have found that a microorganism in which a spore-related gene or flagellar-related gene is deleted or inactivated from a microorganism that overexpresses the prsA gene exhibits significantly superior productivity of a target protein or polypeptide.
すなわち本発明は、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入してなるか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を微生物に導入してなり、かつ、胞子関連遺伝子若しくは鞭毛関連遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の１以上をゲノムから削除又は不活化した微生物に目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入してなる組換え微生物を提供するものである。 That is, the present invention is a transcription initiation control region having a function in a microorganism or a transcription initiation control region and a ribosome binding site introduced upstream in the genome of a Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene, or a microorganism A transcription initiation control region or a transcription initiation control region and a ribosome binding site having a function in B. subtilis prsA gene or a gene fragment linked upstream of a gene corresponding to the gene, and introduced into a microorganism, and a spore-related gene or Provided is a recombinant microorganism obtained by introducing a gene encoding a target protein or polypeptide into a microorganism in which one or more of flagellum-related genes or genes corresponding thereto are deleted or inactivated from the genome.
また、本発明は、上記の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。 The present invention also provides a method for producing a protein or polypeptide using the above-described recombinant microorganism.
本発明の組換え微生物は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が高いものである。よって、これを用いて目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができる。 The recombinant microorganism of the present invention has high productivity of the target protein or polypeptide. Therefore, when the target protein or target polypeptide is produced using this, the time and cost required for production of the substance can be reduced.
この明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。 In this specification, the identity of amino acid sequences and base sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Specifically, it is calculated by performing an analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。 In the present specification, the transcription initiation control region is a region including a promoter and a transcription initiation point, and the ribosome binding site is a Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc. Natl. Acad) that forms a translation initiation control region together with the initiation codon. Sci. USA 74, 5463 (1974)).
本発明の組換え微生物の宿主となる微生物としては、特に限定されず、野生型のものでも変異を施したものでものよく、具体的には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましく、バチルス（Bacillus）属細菌としては、枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましく、特に枯草菌（Bacillus subtilis）168株が好ましい。 The microorganisms to be the host of the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited, and those of the wild type may also were subjected to mutation, specifically, Bacillus such as Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) (Bacillus) bacteria and Clostridium (Clostridium) bacteria, or yeast, and examples of the inter alia Bacillus (Bacillus) bacteria are preferred, Bacillus (Bacillus) bacteria, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) are preferred, in particular Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ) 168 strain is preferred.
本発明の枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子とは、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子が挙げられる。また枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価な活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５Mクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
The Bacillus subtilis prsA gene of the present invention refers to a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene refers to a gene having a Bacillus subtilis prsA gene substantially the same function, for example, Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacillus cereus (Bacillus cereus), In Bacillus thuringiensis , Oceanobacillus iheyensis, etc., each prsA gene identified mainly by genome analysis can be mentioned. Examples of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene include any of the following genes (1) to (4).
(1) A protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding a protein having a functionally equivalent activity.
(2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding. Here, examples of the “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. Examples include conditions of constant temperature for 8 to 16 hours for hybridization.
(3) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA that codes for various proteins. Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
本発明の微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、宿主となる微生物において機能する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位であれば特に限定されないが、例えば、枯草菌spoVG遺伝子若しくはaprE遺伝子又はこれらの遺伝子に相当する遺伝子の上流に位置する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が好ましい。枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２１０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域としての機能を有する領域が挙げられる。また、枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一例としては、配列番号９の塩基番号３８〜２３０の塩基配列からなる領域、又はこれらの配列と相同な配列からなり転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有する領域が挙げられる。 The transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site that function in the microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it is a transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site that functions in the host microorganism. For example, a Bacillus subtilis spoVG gene or aprE gene or a transcription initiation control region or a transcription initiation control region located upstream of a gene corresponding to these genes and a ribosome binding site are preferred. As an example of the transcription initiation control region of the Bacillus subtilis spoVG gene, a region comprising the nucleotide sequence of base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 9, or a region comprising a sequence homologous to these sequences and having a function as a transcription initiation control region Is mentioned. In addition, as an example of the transcription initiation control region and the ribosome binding site of the Bacillus subtilis spoVG gene, a region comprising the nucleotide sequence of base numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 9, or a transcription initiation control region comprising a sequence homologous to these sequences And a region having a function as a ribosome binding site.
prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流への当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の導入には、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。 Introducing the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site upstream of the prsA gene or the gene corresponding to the gene into the genome, the original prsA gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene In addition to those that replace part or all of the transcription initiation control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the original transcription initiation control region, or those that are inserted with the transcription initiation control region and the ribosome binding site left intact included.
当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上のprsA遺伝子上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial.93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5’側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3’側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物の宿主として枯草菌を用いる場合、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位から、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への相同組換えによる置換は、Mol.Gen.Genet.,223,268,1990記載の方法等を利用して行うことが出来る。
The transcription initiation control region, or the substitution to the transcription initiation control region and the ribosome binding site can be performed using, for example, a known method by homologous recombination. That is, first, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene and a drug resistance gene fragment upstream of the transcription initiation control region or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, , Downstream of the prsA gene translation initiation control region and part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene , 77, 61, 1989). In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene, a drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the prsA gene A DNA fragment is obtained in which a translation initiation control region and a part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene are joined in this order. Next, by incorporating such a DNA fragment into the parent microbial cell by a known method, the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene of the parent microbial genome, and the translation initiation control region and structural gene of the prsA gene Double crossover homologous recombination occurs in two places of the region including part or all of the region or part or all of the structural gene region of the prsA gene. As a result, the original transcription initiation regulatory region, or transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site is the transcriptional initiation regulatory region, or a transformant which is substituted in the transcriptional initiation regulatory region and the ribosome binding site, an index the drug resistance gene Can be separated as Thereby, the transcription initiation control region introduced upstream of the prsA gene on the genome, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are genetically stably maintained. Specifically, known methods for introducing a DNA fragment for introduction into a host microorganism include competent cell transformation methods (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), protoplast transformation methods (Mol. Gen. Genet 168, 111 (1979)) or electroporation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)), etc., and competent cell transformation methods are particularly preferred. Further, in the present specification, upstream and downstream of a gene is not a position from the replication start point, and upstream indicates a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target, while downstream is The region following the 3 'side of the gene or region captured as the target is shown.
In particular, when Bacillus subtilis is used as the host of the microorganism of the present invention, the transcription initiation control region of the spoVG gene, or the transcription initiation control region and the ribosome from the transcription initiation control region of the prsA gene, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site. Substitution by homologous recombination to the binding site can be performed using the method described in Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, or the like.
また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域と当該転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。 In addition, for the insertion of the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site, appropriately select the transcription initiation control region to be inserted or the sequence of the DNA fragment added to both ends of the transcription initiation control region and the ribosome binding site. For example, it can be carried out by the same method as the above-described substitution method. For example, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region and a drug resistance gene fragment are linked upstream of the transcription initiation control region, and a DNA containing a part or all of the original transcription initiation control region downstream. Combine the fragments. In this way, bound DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation regulatory region, a drug resistance gene fragment, the transcriptional initiation regulatory region, the order of the DNA fragment containing a part or all of the original transcription initiation regulatory region, Obtain a DNA fragment. Next, after inserting such a DNA fragment into a host microorganism, a transformant can be isolated using a drug resistance gene as an index. On the genome of the transformant thus separated, the original transcription initiation control region and the transcription initiation control region are stably maintained in a state where they are adjacent to each other without any gap.
本発明において当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。 In the present invention, the transcription initiation control region or the upstream in the genome where the transcription initiation control region and the ribosome binding site are introduced is not particularly limited as long as it is upstream of the start codon of the prsA gene, but within 2000 base pairs adjacent to each other. This region is preferable, a region within 500 base pairs is more preferable, a region within 100 base pairs is more preferable, and a region within 50 base pairs is particularly preferable.
また、本発明における転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、及びprsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）など公知の方法により連結することにより得ることができる。かかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができ、また、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。 In addition, the transcription initiation control region in the present invention or the gene fragment in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene can be obtained by a known cloning method such as PCR using the genome of Bacillus subtilis or other microorganisms as a template. Based on the obtained transcription initiation control region or transcription initiation control region and ribosome binding site fragment, and prsA gene fragment, restriction enzyme method, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), etc. It can obtain by connecting by a well-known method. Such a fragment can be introduced into the cytoplasm by a vector such as a plasmid, and homologous recombination is performed between the nucleic acid fragment introduced into the cell and the chromosome by a known transformation method. Can be introduced.
なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。 The chromosomal region to be introduced in the host is preferably a non-essential gene or a non-essential gene non-gene region upstream, for example, aprE gene, sacB gene, nprE gene, amyE gene, ybxG gene internal, or while the interior of the non-gene region of the gene upstream and the like, inside the amyE gene, or the interior of the non-gene region of ybxG gene upstream preferred. Here, a non-essential gene means a gene that allows a host to survive at least under certain conditions even if it is destroyed. In addition, no problem arises even when a part or all of a non-essential gene upstream or a non-gene region upstream of a non-essential gene is involved in introduction.
以下、具体、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いた当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による親微生物ゲノム上への導入方法について説明する。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（２））の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加した断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加した断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じる。PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図１）。
薬剤マーカー遺伝子としては、エリスロマイシン耐性遺伝子等を用いることが出来る。また、ここで行うPCR反応は、表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Presspp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。薬剤耐性マーカーによる選択は、例えば、エリスロマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離したのち、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上への導入が確認されるものを選択することにより行えばよい。尚、上記薬剤耐性マーカー遺伝子は、一般的に用いられる抗生物質を用いた選択に利用可能なものであれば特に限定されないが、エリスロマイシン耐性遺伝子の他には、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等の薬剤耐性マーカー遺伝子が挙げられる。
Hereinafter,, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77,61,1989) the transcriptional initiation regulatory region, or a transcriptional initiation regulatory region and the ribosome binding site prsA gene with a DNA fragment prepared by A method of introducing the gene fragment linked upstream of the parent microorganism genome by double crossing will be described.
The DNA fragment for introduction used here is about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (1)) adjacent to the upstream of the introduction site on the parent microorganism genome, and about 0.1 to 3 adjacent to the downstream. Preferably, the transcription initiation control region or a fragment comprising the transcription initiation control region and a ribosome binding site (hereinafter referred to as fragment (3)), between the 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (2)), prsA gene fragment ( Hereinafter, it is a DNA fragment into which a fragment (4)) and a drug resistance marker gene fragment (hereinafter referred to as fragment (5)) are inserted. First, five fragments of fragment (1) to fragment (5) are prepared by the first PCR. At this time, for example, the upstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the downstream end of fragment (1), and the downstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the upstream end of fragment (4) Designed to add the 10-30 base pair sequence upstream of fragment (5) at the downstream end of (4), and the 10-30 base pair sequence downstream of fragment (5) upstream of fragment (2). Were used (FIG. 1).
Next, the second PCR is carried out using the five types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of fragment (1) and the downstream primer of fragment (2). This causes annealing with the fragment (3) in the sequence of the fragment (3) added to the downstream end of the fragment (1). Similarly, the sequence of the fragment (3) added to the upstream end of the fragment (4) Annealing with fragment (3) occurs in the sequence, annealing with fragment (5) occurs in the sequence of fragment (5) added to the downstream end of fragment (4), and upstream of fragment (2) Annealing with the fragment (5) occurs in the sequence of the fragment (5) added to. As a result of PCR amplification, a DNA fragment in which the five fragments (1) to (5) are bound in the order of (1), (3), (4), (5), and (2) can be obtained (FIG. 1).
As a drug marker gene, an erythromycin resistance gene or the like can be used. The PCR reaction performed here uses the primer sets shown in Tables 1-1 to 1-3, and uses a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo). Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Presspp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) and the like.
When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent method or the like, genetic recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the introduction site on the same genome. A cell into which a transcription initiation control region or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene can be isolated by selection with a drug resistance marker. Selection with a drug resistance marker can be performed, for example, by isolating colonies that grow on an agar medium containing erythromycin and then selecting those that are confirmed to be introduced onto the genome by PCR using the genome as a template. Good. The drug resistance marker gene is not particularly limited as long as it can be used for selection using commonly used antibiotics. In addition to the erythromycin resistance gene, the chloramphenicol resistance gene, neomycin resistance And drug resistance marker genes such as genes, spectinomycin resistance genes, tetracycline resistance genes and blasticidin S resistance genes.
本発明の組換え微生物で削除又は不活化される胞子関連遺伝子としては、胞子形成に関連する遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、sigF遺伝子、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子及びsigE遺伝子が挙げられる。これらは単独で削除又は不活性化してもよいし、2以上を組み合わせて削除又は不活性化してもよい。 The spore-related gene deleted or inactivated by the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it is a gene related to spore formation, for example, sigF gene, spo0J gene, spoIIR gene, scoC gene, ylbO gene, Examples include spoIIE gene and sigE gene. These may be deleted or inactivated alone, or may be deleted or inactivated in combination of two or more.
本発明の組換え微生物で削除又は不活化される鞭毛関連遺伝子としては、鞭毛の機能に関連する遺伝子であれば特に制限されないが、例えば、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子及びsigD遺伝子が挙げられる。これらは単独で削除又は不活性化してもよいし、2以上を組み合わせて削除又は不活性化してもよく、前記の胞子関連遺伝子の1以上と組み合わせて削除又は不活性化してもよい。このうち、fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子又はsigD遺伝子をそれぞれ削除又は不活性化すること、又はflgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子を同時に削除又は不活性化することが好ましい。 The flagella-related gene deleted or inactivated by the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited as long as it is a gene related to the function of flagella. For example, flgB gene, flgC gene, fliE gene, fliF gene, fliG gene , FliH gene, fliI gene, fliJ gene, ylxF gene, fliK gene, ylxG gene, flgE gene, fliL gene, fliM gene, fliY gene, cheY gene, fliZ gene, fliP gene, fliQ gene, fliR gene, flhB gene, flhA Gene, flhF gene, ylxH gene, cheB gene, cheA gene, cheW gene, cheC gene, cheD gene, flgM gene, motA gene and sigD gene. These may be deleted or inactivated alone, or may be deleted or inactivated in combination of two or more, or may be deleted or inactivated in combination with one or more of the aforementioned spore-related genes. Of these, fliG gene, flhA gene, flgM gene, motA gene or sigD gene are deleted or inactivated, respectively, or flgB gene, flgC gene, fliE gene, fliF gene, fliG gene, fliH gene, fliI gene, fliJ gene Gene, ylxF gene, fliK gene, ylxG gene, flgE gene, fliL gene, fliM gene, fliY gene, cheY gene, fliZ gene, fliP gene, fliQ gene, fliR gene, flhB gene, flhA gene, flhF gene, ylxH gene, It is preferable to delete or inactivate the cheB gene, cheA gene, cheW gene, cheC gene and cheD gene simultaneously.
上に挙げた遺伝子について、遺伝子番号、遺伝子機能は後記の表５及び表７に示す。なお、これら各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997)、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。 The gene numbers and gene functions of the genes listed above are shown in Tables 5 and 7 below. The names, numbers, functions, etc. of these genes were reported by Kunst et al. (Nature, 390, 249-256, 1997) and published online on the JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: // Bacillus.genome.ad.jp/, updated on March 10, 2004).
後記表５及び表７に示される各遺伝子に相当する遺伝子とは、表５及び表７に示される各遺伝子と実質的に同じ機能を有する遺伝子をいい、例えば、表５及び表７の各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子が挙げられる。尚、ここで、塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。 The gene corresponding to each gene shown in Table 5 and Table 7 below refers to a gene having substantially the same function as each gene shown in Table 5 and Table 7, for example, each gene in Table 5 and Table 7 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, derived from other microorganisms, preferably Bacillus bacteria The gene derived from it is mentioned. Here, the identity of the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985).
遺伝子の削除又は不活化は、表５及び表７に示した１又は２以上の標的遺伝子を計画的に削除又は不活化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法により行うことができる。 The deletion or inactivation of the gene is not limited to the method of systematically deleting or inactivating one or more target genes shown in Table 5 and Table 7, but also after giving a random deletion or inactivation mutation of the gene. The protein productivity can be evaluated and the gene analysis can be performed by an appropriate method.
標的とする遺伝子を計画的に削除又は不活化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活化した標的遺伝子、又は標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子外側の２箇所（好ましくは、上流側、下流側それぞれ1箇所）で二重交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を削除或いは不活化することが可能である。 In order to systematically delete or inactivate a target gene, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is introduced into the parent microbial cell, and the parent gene is homologously recombined in a part of the target gene. It is possible to disrupt and inactivate target genes on the microbial genome. Alternatively, a target gene inactivated by mutation such as base substitution or base insertion, or a linear DNA fragment containing the upstream and downstream regions of the target gene but not the target gene is constructed by a method such as PCR. Into the parental microbial cells and double-crossed at two sites outside the mutation site in the target gene of the parental microorganism genome, or two sites outside the target gene (preferably, one site each upstream and downstream). By causing homologous recombination, it is possible to delete or inactivate the target gene on the genome.
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を削除又は不活化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を用いることによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。 In particular, when Bacillus subtilis is used as a parental microorganism for constructing the microorganism of the present invention, there have already been several reports on methods for deleting or inactivating target genes by homologous recombination (Mol. Gen. Genet. , 223, 268, 1990, etc.), the host microorganism of the present invention can be obtained by using such a method.
また、ランダムな遺伝子の不活化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。 In addition, random gene inactivation can also be carried out by a method of causing homologous recombination similar to the above method using a randomly cloned DNA fragment, or by irradiating a parental microorganism with γ rays or the like. is there.
以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される削除用DNA断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子削除方法は下記に限定されるものではない。 Hereinafter, the deletion method by the double crossing method using the DNA fragment for deletion prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) will be described. The gene deletion method in is not limited to the following.
本方法で用いる削除用DNA断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図３）。 The deletion DNA fragment used in this method is between about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment adjacent to the upstream of the gene to be deleted, and about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment adjacent to the downstream. A fragment into which a drug resistance marker gene fragment is inserted. First, an upstream fragment and a downstream fragment of the gene to be deleted and three fragments of a drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR. At this time, for example, at the downstream end of the upstream fragment, the upstream side of the drug resistance marker gene is prepared. A primer designed to add a 10-30 base pair sequence, and conversely, a 10-30 base pair sequence downstream of the drug resistance marker gene is used at the upstream end of the downstream fragment (FIG. 3).
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片との間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図３）。 Next, using the three types of PCR fragments prepared in the first round as templates, the second round PCR is performed using the upstream primer of the upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment. As a result, in the drug resistance marker gene sequence added to the downstream end of the upstream fragment and the upstream end of the downstream fragment, annealing with the drug resistance marker gene fragment occurs, and as a result of PCR amplification, the upstream fragment and the downstream fragment In the meantime, a DNA fragment into which a drug resistance marker gene is inserted can be obtained (FIG. 3).
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の削除用DNA断片が得られる。 When using a chloramphenicol resistance gene as a drug resistance marker gene, for example, using the primer sets shown in Table 1-1 to Table 1-3, a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc. By performing SOE-PCR under the usual conditions shown in the book (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989), etc. A DNA fragment for gene deletion is obtained.
かくして得られた削除用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある削除対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、目的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。即ち、表１−１〜表１−３に示したプライマーセットを用いて調製した削除用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換していることを確認すれば良い。 When the DNA fragment for deletion thus obtained is introduced into the cell by a competent method or the like, gene recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the same gene to be deleted, and the target gene Can be isolated by selection with a drug resistance marker. That is, when a deletion DNA fragment prepared using the primer sets shown in Table 1-1 to Table 1-3 is introduced, colonies that grow on an agar medium containing chloramphenicol are isolated, and the genome is used as a template. What is necessary is just to confirm that the target gene on the genome is replaced with the chloramphenicol resistance gene by PCR method described above.
なお、本発明の組換え微生物において削除又は不活化される遺伝子のうち、flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子及びcheD遺伝子からなる２９の遺伝子から削除又は不活性化する数としては、２５以上が好ましく、２８以上がより好ましい。また、上記２９遺伝子以外の遺伝子から削除又は不活性化する数としては、５以下が好ましく、３以下がより好ましい。 Among the genes deleted or inactivated in the recombinant microorganism of the present invention, flgB gene, flgC gene, fliE gene, fliF gene, fliG gene, fliH gene, fliI gene, fliJ gene, ylxF gene, fliK gene, ylxG Gene, flgE gene, fliL gene, fliM gene, fliY gene, cheY gene, fliZ gene, fliP gene, fliQ gene, fliR gene, flhB gene, flhA gene, flhF gene, ylxH gene, cheB gene, cheA gene, cheW gene, The number to be deleted or inactivated from 29 genes consisting of cheC gene and cheD gene is preferably 25 or more, more preferably 28 or more. Further, the number to be deleted or inactivated from the genes other than the 29 gene is preferably 5 or less, and more preferably 3 or less.
本発明の組換え微生物に導入される目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子は、特に限定されず、食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられ、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素 (Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、α-アミラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERMBP-6946）由来のα-アミラーゼが挙げられる。バチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス(Bacillus)属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。また、セルラーゼの具体例としては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。 The gene encoding the target protein or target polypeptide to be introduced into the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited, and is useful for foods, pharmaceuticals, cosmetics, detergents, fiber treatments, medical tests, etc. Examples include various enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, and diagnostics, and bioactive peptides. preferable. In addition, the functions of industrial enzymes are classified into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase / Synthetase). ) And the like, and preferable examples include hydrolase genes such as cellulase, α-amylase, and protease. Specific examples include α-amylase, among which α-amylase derived from microorganisms, preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus , more preferably derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERMBP-6946). Is mentioned. As a more specific example of α-amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946), an alkali derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Examples include amylase and amylase having an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more with the amino acid sequence. The amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Specific examples of cellulases include cellulases belonging to family 5 in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309 (1991)). Among them, microorganisms, especially bacteria belonging to the genus Bacillus. Derived cellulase. Specific examples of proteases include serine proteases, metal proteases, and the like derived from microorganisms, particularly from bacteria belonging to the genus Bacillus .
また、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス(Bacillus)属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、または、配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換、もしくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは複数個の塩基配列が付加されているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関る機能を保持しているDNA断片を意味する。 In addition, the gene encoding the target protein or target polypeptide is upstream of the control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site and an initiation codon. It is desirable that at least one region selected from a translation initiation control region containing a secretory signal peptide region and a secretory signal peptide region be bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are linked, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus , It is desirable that the initiation control region and the translation initiation control region are 0.6 to 1 kb upstream of the cellulase gene and appropriately bound to the gene encoding the target protein or polypeptide. For example, Bacillus (Bacillus) bacteria as described in 2000-210081 and JP 4-190793 Patent Publication JP, i.e. KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM -64 strain (FERM BP- It is desirable that the cellulase gene derived from 2886) and the transcription initiation control region, translation initiation control region and secretion signal peptide region of the cellulase gene are appropriately combined with the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, or the base sequence 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of a DNA fragment comprising a nucleotide sequence having identity or any of the above nucleotide sequences It is desirable that a DNA fragment consisting of a base sequence partially deleted, substituted, or added is appropriately linked to the structural gene of the target protein or polypeptide. Here, a DNA fragment consisting of a base sequence in which a part of the base sequence is deleted, substituted, or added is a part of the base sequence deleted, substituted, or added with a plurality of base sequences. However, it means a DNA fragment that retains functions related to gene transcription, translation, and secretion.
上記の目的タンパク質又は目的ポリペプチドをコードする遺伝子の導入は、かかる遺伝子を結合させた組換えプラスミドを、コンピテントセル形質転換法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって行うことができる。また、相同組換えにより、かかる遺伝子を含むDNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても行うことができる。 The introduction of a gene encoding the target protein or polypeptide described above is carried out by transforming a recombinant plasmid to which such a gene has been combined into a general character such as a competent cell transformation method, a protoplast transformation method, or an electroporation method. It can be carried out by incorporating it into host microbial cells by a conversion method. It can also be carried out by homologous recombination by directly incorporating into the host microorganism genome a DNA fragment in which an appropriate homologous region with the host microorganism genome is bound to a DNA fragment containing such a gene.
本発明の組換え微生物を用いれば有用なタンパク質又は目的ポリペプチドを効率的に生産することができる。本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。 Use of the recombinant microorganism of the present invention makes it possible to efficiently produce useful proteins or target polypeptides. For production of the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention, the strain is inoculated into a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components, and cultured by an ordinary microorganism culture method. Then, after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified.
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。 For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。 Further, in the following examples, upstream and downstream of a gene are not positions from the replication start point, but upstream is a region continuing on the 5 ′ side of the start codon of the gene that is regarded as a target in each operation / step. On the other hand, “downstream” indicates a region continuing 3 ′ of the stop codon of the gene taken as a target in each operation / step.
また、枯草菌の形質転換は以下の様に行った。すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。 Further, Bacillus subtilis was transformed as follows. That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared. Next, 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) is added to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), and after shaking culture at 37 ° C. for 1 hour, an appropriate drug is obtained. LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing the whole amount was smeared. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.
培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。 Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used for measuring the amylase activity in the culture supernatant. In other words, 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1% NaCl-1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries) was added to 100 μL of R1 and R2 mixture (R1 (coupling enzyme): R2 (amylase substrate) ) = 5: 1 (Vol.)) Was added and mixed, and the amount of p-nitrophenol released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance (OD405 nm) at 405 nm. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.
実施例１ prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表１−１に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１−１に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１−１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.3kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.3kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示すamyEfw2とprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.4kb及び3.3kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。
Example 1 Construction of a prsA gene expression-enhanced strain A mutant strain with enhanced prsA gene expression was constructed as follows (see FIG. 2). Transcription of the spoVG gene using the PVG-FW and PVG-R and prsA / PVG-F and prsA / Em2-R primer sets shown in Table 1-1 using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template A 0.2 kb fragment (A) containing the initiation regulatory region and ribosome binding site and a 0.9 kb fragment (B) containing the prsA gene were amplified by PCR. In addition, a plasmid pMUTIN4 (Microbiology. 144, 3097 (1998)) was used as a template, and a 1.3 kb fragment (C) containing an erythromycin (Em) resistance gene was obtained by PCR using the emf2 and emr2 primer sets shown in Table 1-1. Amplified. Subsequently, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the PVG-FW2 and emr2 primer sets shown in Table 1-1 was performed. fragment (a) (B) bonded to as made in the order of (C), transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene is linked upstream of prsA gene (at the position of initiation codon of the spoVG gene prsA gene A 2.4 kb DNA fragment (D) was obtained, which was linked so that the initiation codon was located), and further to which the Em resistance gene was bound downstream. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, using the amyEfw2 and amyE / PVG2-R and amyE / Em2-F and amyErv2 primer sets shown in Table 1-1, the 5 'side of the amyE gene A 1.0 kb fragment containing the region (E) and a 1.0 kb fragment containing the 3 ′ region of the amyE gene (F) were amplified by PCR. Next, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to serve as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1-1 was performed to obtain 3 fragments. (E) (D) coupled to so as to become the order of (F), and ligation prsA gene downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene, a further 2.4kb to the Em resistance gene downstream bound A DNA fragment (G) having a total base length of 4.3 kb in which the DNA fragment was inserted in the center of the amyE gene was obtained. The resulting 4.3 kb DNA fragment (G) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method and grown on LB agar medium containing erythromycin (1 μg / mL) and lincomycin (25 μg / mL). Colonies were isolated as transformants. Using the genomic DNA extracted from the resulting transformant as a template, PCR was performed using the amyEfw2 and prsA / Em2-R and prsA / PVG-F and amyErv2 primer sets shown in Table 1-1. and to confirm amplification of the DNA fragment of 3.3 kb, that the DNA fragment prsA gene are linked downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 strain genome is inserted confirmed. The strain obtained in this way was named prsA-Ka strain.
実施例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−１
実施例１にて得られたprsA-Ka株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１−１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（I）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表１−１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御領域、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
実施例１にて得られたprsA-Ka株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表２に示した様に、宿主としてprsA-Ka株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはprsA-Ka株にてprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。
Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-1
Evaluation of heterologous protein productivity of the prsA-Ka strain obtained in Example 1 was carried out as follows using the productivity of alkaline amylase derived from Bacillus bacteria consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as an index.
Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, primer sets for K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 1-1 were used. PCR was performed, and a 1.5 kb DNA fragment (H) of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 encoding alkaline amylase (JP 2000-184882 A, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) Was amplified. In addition, using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, primer sets of S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) shown in Table 1-1 PCR is used to amplify a 0.6 kb DNA fragment (I) containing the transcription initiation control region, translation initiation control region, and region encoding the secretory signal sequence of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081). did. Subsequently, the obtained 2 fragments of (H) (I) were mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 1-1. Was performed to obtain a 2.1 kb DNA fragment (J) in which the alkaline amylase gene was linked downstream of the transcription initiation control region, translation initiation control region, and secretory signal sequence encoding the alkaline cellulase gene. The obtained 2.2 kb DNA fragment (J) was inserted into the Bam HI- Xba I restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
Plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating alkaline amylase productivity was introduced into the prsA-Ka strain obtained in Example 1 and Bacillus subtilis 168 strain as a control by the protoplast transformation method. The resulting strain was shaken and cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture solution was added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% Maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 2, when the prsA-Ka strain was used as the host, a higher secretory production of alkaline amylase was observed compared to the control 168 strain (wild type). This increases than the expression wild strain of prsA gene in prsA-Ka strain, by PrsA protein content on the cell membrane was increased, the secretion efficiency of proteins was estimated to be due to improved results.
実施例３ ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
図３に基づいて、ゲノム中sigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、sigF遺伝子は枯草菌の胞子形成期に特異的に機能するシグマ因子SigFをコードする遺伝子である。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１−１に示したsigF-FW及びsigF/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、sigF/Cm-F及びsigF-RVのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigF遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表１−１に示したcatf及びcatrのプライマーセットを用いて、0.85kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
次に、図３に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１−１に示したsigF-FW2及びsigF-RV2のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.8kbのDNA断片（D）を得た。
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってsigF遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、sigF遺伝子欠失株（ΔsigF株）を構築した。また上記形質転換における168株に替えて実施例１にて構築したprsA-Ka株を用いることにより、prsA-Ka株ゲノム中のsigF遺伝子をCm耐性遺伝子にて置換した菌株（prsAKΔsigF株）を構築した。
Example 3 Replacement of a sigF gene in a genome with a drug resistance gene A method of replacing a sigF gene in a genome with a drug resistance gene will be described with reference to FIG. The sigF gene encodes a sigma factor SigF that functions specifically during the sporulation of Bacillus subtilis.
Using a genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template, using the sigF-FW and sigF / Cm-R primer sets shown in Table 1-1, a 1.0 kb fragment adjacent to the upstream of the sigF gene in the genome ( A) was amplified by PCR. Further, a 1.0 kb fragment (B) adjacent to the downstream of the sigF gene in the genome was amplified by PCR using the genomic DNA as a template and a primer set of sigF / Cm-F and sigF-RV.
Furthermore, a 0.85 kb chloramphenicol (Cm) resistance gene region (C) was prepared by PCR using plasmid pC194 DNA as a template and the catf and catr primer sets shown in Table 1-1.
Next, as shown in FIG. 3, three fragments of the obtained 1.0 kb fragment (A), 1.0 kb fragment (B) and Cm resistance gene region (C) were mixed and used as a template. 2.8kb containing 3 fragments in the order of 1.0kb fragment (A), Cm resistance gene region (C), 1.0kb fragment (B) by SOE-PCR using sigF-FW2 and sigF-RV2 primer sets DNA fragment (D) was obtained.
Furthermore, 168 strains were transformed using the obtained DNA fragment (D) by the competent cell transformation method. After transformation, colonies that grew on the LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) were isolated as transformants.
The genomic DNA of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed by PCR that the sigF gene was replaced with the Cm resistance gene. As described above, a sigF gene deletion strain (ΔsigF strain) was constructed. In addition, by using the prsA-Ka strain constructed in Example 1 instead of the 168 strain in the above transformation, a strain (prsAKΔsigF strain) in which the sigF gene in the prsA -Ka strain genome was replaced with a Cm resistance gene was constructed. did.
実施例４ ゲノム中spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、或いはsigE遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のspo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子或いは、sigE遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、spo0J遺伝子欠失株（Δspo0J株）、spoIIR遺伝子欠失株（ΔspoIIR株）、scoC遺伝子欠失株（ΔscoC株）、ylbO遺伝子欠失株（ΔylbO株）、spoIIE遺伝子欠失株（ΔspoIIE株）、及びsigE遺伝子欠失株（ΔsigE株）を構築した。各菌株の構築には表１−１〜表１−３に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表３及び表４に示した。尚、spo0J遺伝子、spoIIR遺伝子、scoC遺伝子、ylbO遺伝子、spoIIE遺伝子、及びsigE遺伝子はいずれも枯草菌の胞子形成に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表５に示した。
Example 4 Replacement of the spo0J gene, spoIIR gene, scoC gene, ylbO gene, spoIIE gene, or sigE gene in the genome with a drug resistance gene 168 strains in the same manner as the replacement of the sigF gene shown in Example 3 with a drug resistance gene Replacing spo0J gene, spoIIR gene, scoC gene, ylbO gene, spoIIE gene or sigE gene with chloramphenicol resistance gene in the genome , spo0J gene deletion strain (Δspo0J strain), spoIIR gene deletion strain (ΔspoIIR Strain), scoC gene deletion strain (ΔscoC strain), ylbO gene deletion strain (ΔylbO strain), spoIIE gene deletion strain (ΔspoIIE strain), and sigE gene deletion strain (ΔsigE strain). The primers shown in Table 1-1 to Table 1-3 were used for the construction of each strain, and the correspondence between each primer and the primer used for the construction of the ΔsigF strain is shown in Tables 3 and 4. The spo0J gene, spoIIR gene, scoC gene, ylbO gene, spoIIE gene, and sigE gene are all genes that encode proteins known to be involved in Bacillus subtilis sporulation. The function of each gene is shown in Table 5.
また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記各遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔylbO株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株を構築した。 In addition, by replacing each gene on the genome of the prsA-Ka strain constructed in Example 1 with a chloramphenicol resistance gene, prsAKΔspo0J strain, prsAKΔspoIIR strain, prsAKΔscoC strain, prsAKΔylbO strain, prsAKΔspoIIE strain, And prsAKΔsigE strain was constructed.
実施例５ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−２
実施例３及び４にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図４に示した様に、ΔylbO株では168株より低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔylbO株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。またprsAKΔsigF株、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株においてもprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加（図４の斜線部分に相当）は、ΔsigF株、Δspo0J株、ΔspoIIR株、ΔscoC株、ΔspoIIE株、或いはΔsigE株各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加（図４の黒塗りで示す部分に相当）より顕著であった。即ち、prsAKΔsigF株、prsAKΔspo0J株、prsAKΔspoIIR株、prsAKΔscoC株、prsAKΔylbO株、prsAKΔspoIIE株、及びprsAKΔsigE株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
Example 5 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-2
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Examples 3 and 4 was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and prsA-Ka strain constructed in Example 1 were also evaluated. As shown in FIG. 4, the ΔylbO strain showed lower secretory production than the 168 strain, whereas the prsAKΔylbO strain showed higher secretory production of alkaline amylase than the prsA-Ka strain. In addition, prsAKΔsigF strain, prsAKΔspo0J strain, prsAKΔspoIIR strain, prsAKΔscoC strain, prsAKΔspoIIE strain, and prsAKΔsigE strain also showed higher secretory production of alkaline amylase than prsA-Ka strain, and increased production of each strain relative to prsA-Ka strain ( (Corresponding to the shaded area in FIG. 4) is an increase in production with respect to the Bacillus subtilis 168 strain indicated by each of the ΔsigF strain, Δspo0J strain, ΔspoIIR strain, ΔscoC strain, ΔspoIIE strain, or ΔsigE strain (the portion shown in black in FIG. Equivalent). That is, in the prsAKΔsigF strain, the prsAKΔspo0J strain, the prsAKΔspoIIR strain, the prsAKΔscoC strain, the prsAKΔylbO strain, the prsAKΔspoIIE strain, and the prsAKΔspoEE strain, the combination of prsA gene expression and deletion of each gene synergistically improves the production of alkaline amylase. It was thought that it acted on.
実施例６ ゲノム中flgB遺伝子〜cheD遺伝子領域の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上で連続して存在するflgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子（flgB遺伝子、flgC遺伝子、fliE遺伝子、fliF遺伝子、fliG遺伝子、fliH遺伝子、fliI遺伝子、fliJ遺伝子、ylxF遺伝子、fliK遺伝子、ylxG遺伝子、flgE遺伝子、fliL遺伝子、fliM遺伝子、fliY遺伝子、cheY遺伝子、fliZ遺伝子、fliP遺伝子、fliQ遺伝子、fliR遺伝子、flhB遺伝子、flhA遺伝子、flhF遺伝子、ylxH遺伝子、cheB遺伝子、cheA遺伝子、cheW遺伝子、cheC遺伝子、cheD遺伝子）を、実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔflaA(29)株を構築した。使用したプライマーを表１−１〜表１−３に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表６に示した。また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記29遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔflaA(29)株を構築した。尚、flgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子はいずれも枯草菌の運動性・走化性に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表７に示した。
29 gene (FLGb gene FLGb gene ~ CHED gene present in succession on the genome strain substituted Bacillus subtilis 168 by a drug resistance gene of Example 6 genome FLGb gene ~ CHED gene region, FLGc gene, FliE gene, FliF gene, fliG gene, fliH gene, fliI gene, fliJ gene, ylxF gene, fliK gene, ylxG gene, flgE gene, fliL gene, fliM gene, fliY gene, cheY gene, fliZ gene, fliP gene, fliQ gene, fliR gene, flhB gene , FlhA gene, flhF gene, ylxH gene, cheB gene, cheA gene, cheW gene, cheC gene, cheD gene) in the same manner as the replacement of the sigF gene with the drug resistance gene shown in Example 3, and chloramphenicol The ΔflaA (29) strain was constructed by replacement with a resistance gene. The used primers are shown in Table 1-1 to Table 1-3, and the correspondence between each primer and the primer used for the construction of the ΔsigF strain is shown in Table 6. The prsAKΔflaA (29) strain was constructed by replacing the 29 genes on the genome of the prsA-Ka strain constructed in Example 1 with a chloramphenicol resistance gene in the same manner. In addition, all the 29 genes of flgB gene to cheD gene are genes encoding proteins known to be involved in the motility and chemotaxis of Bacillus subtilis. The function of each gene is shown in Table 7.
実施例７ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−３
実施例６にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表８に示した様に、ΔflaA株(29)では168株より低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔflaA(29)株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。即ち、prsAKΔflaA(29)株では、prsA遺伝子発現強化とflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。
Example 7 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-3
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Example 6 was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and prsA-Ka strain constructed in Example 1 were also evaluated. As shown in Table 8, the ΔflaA strain (29) showed a lower secretory production than the 168 strain, whereas the prsAKΔflaA (29) strain showed a higher secretory production of alkaline amylase than the prsA-Ka strain. That is, in the prsAKΔflaA (29) strain, it was considered that the combination of enhanced prsA gene expression and deletion of the flgB gene to cheD gene region acted synergistically on the production of alkaline amylase secretion.
実施例８ ゲノム中fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、或いはsigD遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、168株ゲノム中のfliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、或いはsigD遺伝子のクロラムフェニコール耐性遺伝子による置換を行い、fliG遺伝子欠失株（ΔfliG株）、flhA遺伝子欠失株（ΔflhA株）、flgM遺伝子欠失株（ΔflgM株）、motA遺伝子欠失株（ΔmotA株）、及びsigD遺伝子欠失株（ΔsigD株）を構築した。各菌株の構築には表１−１〜表１−３に示すプライマーを使用し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表９及び表１０に示した。尚、fliG遺伝子、flhA遺伝子、flgM遺伝子、motA遺伝子、及びsigD遺伝子はいずれも枯草菌の運動性・走化性に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。各遺伝子の機能を表７に示した。
Example 8 Replacement of fliG gene, flhA gene, flgM gene, motA gene, or sigD gene in the genome with a drug resistance gene In the same manner as the replacement of the sigF gene shown in Example 3 with a drug resistance gene, Substitution of fliG gene, flhA gene, flgM gene, motA gene, or sigD gene with chloramphenicol resistance gene, fliG gene deletion strain (ΔfliG strain), flhA gene deletion strain (ΔflhA strain), flgM gene deletion A lost strain (ΔflgM strain), a motA gene deletion strain (ΔmotA strain), and a sigD gene deletion strain (ΔsigD strain) were constructed. The primers shown in Table 1-1 to Table 1-3 were used for the construction of each strain, and the correspondence between each primer and the primer used for the construction of the ΔsigF strain is shown in Table 9 and Table 10. The fliG gene, flhA gene, flgM gene, motA gene, and sigD gene are all genes encoding proteins known to be involved in the motility and chemotaxis of Bacillus subtilis. The function of each gene is shown in Table 7.
また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上の上記各遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔfliG株、prsAKΔflhA株、prsAKΔflgM株、prsAKΔmotA株、及びprsAKΔsigD株を構築した。 In addition, by replacing each gene on the genome of the prsA-Ka strain constructed in Example 1 with a chloramphenicol resistance gene in the same manner, the prsAKΔfliG strain, the prsAKΔflhA strain, the prsAKΔflgM strain, the prsAKΔmotA strain, and the prsAKΔsigD strain Built.
実施例９ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−４
実施例８にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。図５に示した様に、ΔflhA株とΔsigD株では168株と同等、若しくはより低い分泌生産を示したのに対し、prsAKΔflhA株とprsAKΔsigD株ではprsA-Ka株より更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。またprsAKΔfliG株、prsAKΔflgM株、及びprsAKΔmotA株においてもprsA-Ka株より高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、それぞれの株のprsA-Ka株に対する生産量の増加（図５の斜線部分に相当）は、ΔfliG株、ΔflgM株、或いはΔmotA株各々で示された枯草菌168株に対する生産量増加（図５の黒塗りで示す部分に相当）より顕著であった。即ち、prsAKΔfliG株、prsAKΔflhA株、prsAKΔflgM株、prsAKΔmotA株、及びprsAKΔsigD株では、prsA遺伝子発現強化と各々の遺伝子欠失との組合せがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。またfliG遺伝子とflhA遺伝子は実施例６及び７記載のflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域内に存在する遺伝子であり、prsAKΔfliG株やprsAKΔflhA株にて認められた相乗的な効果は、prsA-Ka株よりflgB遺伝子〜cheD遺伝子領域内の他の遺伝子を単独で欠失させた場合にも同様に得られる効果であると推測された。
Example 9 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-4
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Example 8 was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and prsA-Ka strain constructed in Example 1 were also evaluated. As shown in FIG. 5, the ΔflhA strain and the ΔsigD strain showed secretory production equivalent to or lower than that of the 168 strain, whereas the prsAKΔflhA strain and the prsAKΔsigD strain exhibited higher secretory production of alkaline amylase than the prsA-Ka strain. Admitted. In addition, the prsAKΔfliG strain, prsAKΔflgM strain, and prsAKΔmotA strain also showed higher secretory production of alkaline amylase than the prsA-Ka strain, and the increase in production of each strain relative to the prsA-Ka strain (corresponding to the hatched portion in FIG. 5) was , ΔfliG strain, ΔflgM strain, or ΔmotA strain, respectively, was more prominent than the increase in production amount corresponding to 168 strains of Bacillus subtilis (corresponding to the shaded areas in FIG. 5). That is, in the prsAKΔfliG strain, the prsAKΔflhA strain, the prsAKΔflgM strain, the prsAKΔmotA strain, and the prsAKΔmotig strain, the combination of the prsA gene expression enhancement and each gene deletion is considered to have a synergistic effect on the increase in the production of alkaline amylase secretion. It was. The fliG gene and the flhA gene are genes existing in the flgB gene to cheD gene region described in Examples 6 and 7, and the synergistic effect observed in the prsAKΔfliG strain and the prsAKΔflhA strain is greater than that of the prsA-Ka strain . It was speculated that the same effect was obtained when other genes in the gene to cheD gene region were deleted alone.
比較例１ ゲノム中comA遺伝子領域の薬剤耐性遺伝子による置換
枯草菌168株ゲノム上のcomA遺伝子を、実施例３に示したsigF遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換と同様にして、クロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換してΔcomA株を構築した。使用したプライマーを表１−１〜表１−３に示し、それぞれのプライマーとΔsigF株の構築に用いたプライマーとの対応を表１１に示した。また実施例１にて構築したprsA-Ka株のゲノム上のcomA遺伝子を同様にクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換することにより、prsAKΔcomA株を構築した。尚、comA遺伝子は枯草菌のDNA受容能（コンピテンス）に関与することが知られているタンパク質をコードする遺伝子である。comA遺伝子の遺伝子番号及び機能を表１２に示した。
Comparative Example 1 Replacement of the comA gene region in the genome with a drug resistance gene The chloramphenicol resistance gene was replaced by replacing the comA gene on the Bacillus subtilis 168 genome with the drug resistance gene of the sigF gene shown in Example 3. The ΔcomA strain was constructed by replacing with The used primers are shown in Table 1-1 to Table 1-3, and the correspondence between each primer and the primer used for the construction of the ΔsigF strain is shown in Table 11. Further, the prsAKΔcomA strain was constructed by replacing the comA gene on the genome of the prsA-Ka strain constructed in Example 1 with a chloramphenicol resistance gene in the same manner. The comA gene is a gene encoding a protein known to be involved in the DNA acceptability (competence) of Bacillus subtilis. Table 12 shows the gene number and function of the comA gene.
比較例２ アルカリアミラーゼ分泌生産評価−５
比較例１にて構築した菌株のアルカリアミラーゼ分泌生産性評価を、実施例２と同様に行った。対照として枯草菌168株及び実施例１にて構築したprsA-Ka株についても評価を行った。表１３に示した様に、prsA-Ka株に対してcomA遺伝子欠失を行うことによるアルカリアミラーゼの分泌生産向上は認められなかった。即ち、prsA遺伝子発現強化とcomA遺伝子欠失（コンピテンス欠損）との組合せによる相乗効果は認められず、むしろコンピテンス欠損はprsA遺伝子発現強化の効果を損なうことが示された。
Comparative Example 2 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production-5
The alkaline amylase secretion productivity evaluation of the strain constructed in Comparative Example 1 was performed in the same manner as in Example 2. As control, Bacillus subtilis 168 strain and prsA-Ka strain constructed in Example 1 were also evaluated. As shown in Table 13, no increase in secretory production of alkaline amylase was observed by deleting the comA gene from the prsA-Ka strain. That is, it was shown that the synergistic effect by the combination of prsA gene expression enhancement and comA gene deletion (competence deficiency) was not observed, but rather competent deficiency impaired the effect of prsA gene expression enhancement.
実施例１０ バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化と各遺伝子欠失との組み合わせにおけるアルカリアミラーゼ分泌生産評価
バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号１１３）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例１の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１４に示したBce/PVG-FとBce/catf-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また上記比較例にて構築したprsA-Kc株より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したamyEfw2とPVG-R、及びcatfとamyErv2のプライマーセットを用いて、amyE遺伝子の5’側領域の下流にspoVG遺伝子転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む領域が連結した1.2kb断片（Ｂ）、及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の下流にamyE遺伝子の3’側領域が連結した1.9kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した遺伝子断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長3.8kbのDNA断片（Ｄ）を得た。得られた3.8kbDNA断片（Ｄ）を用いて枯草菌168株を形質転換し、prsAbc-K株を構築した。
次いで、実施例４及び実施例６と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりspoIIE遺伝子、sigE遺伝子、flgB遺伝子〜cheD遺伝子の29遺伝子、及びfliG遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔspoIIE株、prsAbcKΔsigE株、prsAbcKΔflaA(29)株、及びprsAbcKΔfliG株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株、prsAbcKΔspoIIE株、prsAbcKΔsigE株、prsAbcKΔflaA(29)株、及びprsAbcKΔfliG株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株、ΔspoIIE株、ΔsigE株、ΔflaA(29)株、及びΔfliG株についても評価を行った。その結果、図６に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められたが、prsAbc-K株より各遺伝子を欠失した菌株においてはより顕著な生産性向上が認められ、実施例５、実施例７、及び実施例９で見られたのと同様、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子発現強化と各遺伝子欠失との組み合わせがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、相乗的に作用したものと考えられた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
Example 10 Bacillus cereus (Bacillus cereus) from prsA gene expression enhancement and evaluation alkaline amylase secretory production in combination with the gene deletion Bacillus cereus (Bacillus cereus) derived prsA gene (SEQ ID NO: 113), the Bacillus subtilis prsA gene The corresponding gene. In the same manner as in Example 1, a mutant strain with enhanced expression of the Bacillus cereus- derived prsA gene was constructed. In other words, using the genomic DNA extracted from Bacillus cereus as a template and using the Bce / PVG-F and Bce / catf-R primer sets shown in Table 14, the Bacillus cereus- derived prsA gene is included. A 0.9 kb fragment (A) was amplified by PCR. In addition, using the genomic DNA extracted from the prsA-Kc strain constructed in the above comparative example as a template, and using the amyEfw2 and PVG-R and catf and amyErv2 primer sets shown in Table 1, the 5 'region of the amyE gene A 1.2 kb fragment (B) in which the spoVG gene transcription initiation regulatory region and the region containing the ribosome binding site are linked downstream of the 1.9 kb fragment (3) of the amyE gene linked to the downstream of the chloramphenicol resistance gene ( C) was amplified by PCR. Subsequently, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed and used as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed. ) (a) (binding was as made in the order of C), Bacillus cereus (Bacillus cereus downstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene) derived prsA gene is linked further chloramphenicol downstream thereof A DNA fragment (D) having a total base length of 3.8 kb was obtained in which the gene fragment to which the resistance gene was bound was inserted in the center of the amyE gene. The resulting 3.8 kb DNA fragment (D) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain to construct prsAbc-K strain.
Next, in the same manner as in Example 4 and Example 6, the spoIIE gene, sigE gene, flgB gene to cheD gene 29 gene, and fliG gene were converted into the chloramphenicol resistance gene from the genome of the prsAbc-K strain. The substituted prsAbcKΔspoIIE strain, prsAbcKΔsigE strain, prsAbcKΔflaA (29) strain, and prsAbcKΔfliG strain were constructed.
For the constructed prsAbc-K strain, prsAbcKΔspoIIE strain, prsAbcKΔsigE strain, prsAbcKΔflaA (29) strain, and prsAbcKΔfliG strain, alkaline amylase secretion production was evaluated in the same manner as in Example 2. As controls, Bacillus subtilis 168 strain, ΔspoIIE strain, ΔsigE strain, ΔflaA (29) strain, and ΔfliG strain were also evaluated. As a result, as shown in FIG. 6, the prsAbc-K strain showed a secretion production significantly higher than that of 168 strains, but the strain lacking each gene from the prsAbc-K strain showed a marked improvement in productivity. In the same way as seen in Example 5, Example 7, and Example 9, the combination of enhanced expression of prsA gene derived from Bacillus cereus and deletion of each gene improves alkaline amylase secretion production. On the other hand, it was thought that it acted synergistically. That is, the use of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene, it was confirmed that the effectiveness of the same in the case of using the Bacillus subtilis prsA gene is obtained.
Claims (12)
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価な活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (1) Coding a protein consisting of a base sequence having 90% or more identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an activity functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA.
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (2) A protein that is hybridized under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding.
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (3) It consists of an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a DNA encoding a protein functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. gene.
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。 (4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA that codes for various proteins.
（１）配列番号４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（２）配列番号４で示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有し、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（３）配列番号４で示されるアミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加され、且つアミラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 10, wherein the gene encoding the target protein or polypeptide is a gene comprising the base sequence according to any one of (1) to (3) below.
(1) a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4,
(2) a base sequence encoding a protein having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 and having amylase activity;
(3) A nucleotide sequence encoding a protein having one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 deleted, substituted or added and having amylase activity.
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