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JP4838436B2 - Anti-human hepatic triglyceride lipase antibody - Google Patents

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JP4838436B2
JP4838436B2 JP2001105697A JP2001105697A JP4838436B2 JP 4838436 B2 JP4838436 B2 JP 4838436B2 JP 2001105697 A JP2001105697 A JP 2001105697A JP 2001105697 A JP2001105697 A JP 2001105697A JP 4838436 B2 JP4838436 B2 JP 4838436B2
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Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、家族性ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ欠損症、肝疾患・低栄養状態、動脈硬化症等の診断薬として有用な高い抗原認識特異性を有する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体及びこれを用いた試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ(Hepatic triglyceride lipase,HL)はHepatocyteで合成される65kDaの糖蛋白質である。リポ蛋白リパーゼ(Lipoprotein lipase, LPL)と同様に、HLはトリグリセリドの水解を触媒し、トリグリセリドリッチなカイロミクロンや超低比重リポ蛋白(VLDL)からコレステロールリッチレムナント粒子への転換を起こす。各リパーゼはヘパリン結合蛋白質でヒトや実験動物のポストヘパリン血漿(PHP)中に見出される。初期の研究ではレムナントクリアランスでのHLの役割が確立されていた。ラットやサルへの抗HL IgGの注入によるHL活性阻害により、放射活性標識したレムナント粒子の肝臓取込みが損なわれ、血漿VLDLやLDL画分の蓄積が起こる。ヒトでは家族性HL欠損症が存在するとコレステロールやトリグリセリドを含むレムナント様粒子の血漿レベルが上がり、早発の動脈硬化性疾患を呈する。トランスジェニックのマウスやウサギでのヒトHLの発現は総血漿コレステロールの低下を呈する。高脂肪食負荷のHLノックアウトマウスでは、HLの発現により異常脂質プロファイルの矯正が起こり、大動脈コレステロールが明らかに減少する。これらの結果はHLの抗動脈硬化的役割を支持している。
また、HLは肝で合成される半減期の短い糖蛋白質であることから、肝機能や栄養状態を反映する極めて臓器特異性の高い診断マーカーとしても注目されている。
【0003】
健常人及び上記各種疾患に罹患している患者の体液中のHLを定量する方法として、主に原理の異なる2種類の方法(活性量及び蛋白量)が行なわれている。HLは肝内皮細胞表面に係留している酵素であることから、ヘパリンを静注して血中に遊離の状態で取り出すことが行われている。このヘパリン投与後の血漿をポストヘパリン血漿(PHP)と呼んでいる。現在、PHP中にはトリグリセリドを分解する2種類のリパーゼが存在することが知られており、HLと肝外組織の毛細血管内皮細胞表面に糖鎖を介して係留しているリポ蛋白リパーゼ(Lipoprotein lipase,LPL)である。HLを精密に測定するためには、HLとLPLを分別定量することが必要である。HLを活性量で定量する方法としては、一般的には2種の酵素(HLとLPL)の一方を何らかの方法により不活性化後、残存するもう一方の酵素を至適条件下で測定する方法がある。代表的な方法としては、(1)1MのNaClでLPLを不活性化後、PHP中の残存するHL活性を測定する方法、(2)ヘパリンセファロースカラムを用いHLとLPLをNaClの濃度により分別溶出後、それぞれの酵素活性を測定する方法などがある。しかし、(1)の方法は、NaClの選択中和後、NaClが残存する活性酵素に悪い影響を与え、活性を部分的に不活性化させてしまい、(2)のカラム法は、時間がかかり、回収率に問題があることが知られている。
【0004】
HLを蛋白量で測定する方法に関しては、池田康行ら(メディカルイムノロジー(Medical Immunology)、第18巻、第4号、643頁、1989年)がモノクローナル抗体を用いた定量方法を報告している。しかし、原料ロット間差が知られている細胞壁由来の不溶性担体を使用し、遠心分離が必要であるなど操作が煩雑である。また、このモノクローナル抗体の抗原認識部位は知られておらず、抗原測定などに用途が限定される。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、ヒトHLに特に結合特異性を有する抗ヒトHL抗体、及び当該抗体を用いて血中HLを簡単かつ高感度に測定する方法を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において本発明者らは、高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗HL抗体を得るべく種々検討した結果、配列番号1又は2のいずれか1つの配列部分がヒトHLの免疫応答優位部位であり、これらの配列に極めて高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗ヒトHL抗体を得ることに成功し、更に当該抗体を用いたイムノアッセイによれば、ヒトHLを簡便かつ高感度に測定できること、また、当該抗体はHLの測定のみならず、ヒトHLの分離・精製や、本配列部分又は、本配列以外の配列に異常がある遺伝子異常症の検出にも極めて有用であることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
すなわち、本発明は、配列番号1もしくは2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸のうち1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を認識する抗ヒトHL抗体又はそのフラグメントを提供するものである。
また、本発明は上記の抗ヒトHLモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するものである。
また、本発明は上記の抗ヒトHL抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を含有するヒトHL測定試薬を提供するものである。
また、本発明は、ヒト血液由来検体に上記の抗ヒトHL抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を反応させることを特徴する該検体中のヒトHL測定法を提供するものである。
更に本発明は、上記の抗ヒトHL抗体又はそのフラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化抗ヒトHL抗体又は固定化フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりヒトHLを分離又は精製する方法を提供するものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明抗ヒトHL抗体が、ヒトHLに対して反応性を有し、かつ抗原認識部位が配列番号1もしくは2で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸のうち1〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列を認識するものである。ここにおけるアミノ酸の変異の数及び部位は、特に限定されない。「1〜数個」とは、常用される技術、例えば部位特異的変異誘発法により生じさせることができる個数を意味し、具体的には1〜10個程度を意味するが、好ましくは1〜6個、更に好ましくは1〜3個である。
【0009】
本発明の抗ヒトHL抗体は、ヒトHLに対して反応性を有し、かつヒトLPLと反応しないのが好ましい。
【0010】
本発明抗ヒトHL抗体にはモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも含まれるが、モノクローナル抗体が好ましい。特に好ましい例としては、FERM P−18181として寄託されたハイブリドーマ3A2により産生され、配列番号1を認識するモノクローナル抗体3A2が挙げられる。
【0011】
本発明抗体が、認識する配列番号1又は2で示されるアミノ酸配列は、ヒトHLにおける免疫応答優位部位である。このようなヒトHLの免疫応答優位部位に対する抗体は例えば次の工程(a)、(b)及び(c)により製造できる。
【0012】
(a)免疫抗原の調製・選択
蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の一次構造を利用して、組換え蛋白質を発現させ、抗原として調製する工程(a−1)及び蛋白質の基本的な性質を利用し、親水性領域及び一次構造に動物種間が明確な合成ペプチドの配列を選択して合成する工程(a−2)である。ペプチドを選択する方法としては、ホップとウッド法(Hopp & Woods法、プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、第78巻、第3824〜3828頁、1981年)、Perker antigenicity法、Protrusion index antigenicity法及びWelling antigenicity法などを使用することが出来る。合成するペプチドの種類は、好ましくは5〜10個以上、更に好ましくは5〜10個である。
【0013】
(b)蛋白質の免疫応答優位部位の特定
(ア)(a−1)で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を(a−2)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位を特定する工程。
(イ)(a−1)で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞培養上清を、(a−2)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、ハイブリドーマ細胞群中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。
(ウ)(a−2)で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を(a−2)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。
(エ)(a−2)で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞培養上清を、(a−2)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、ハイブリドーマ細胞群中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程。
【0014】
上記工程(ア)及び(イ)により、選択的に高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗体を製造することが容易になり、更にハイブリドーマ細胞樹立後に抗体の特異性を評価する複数の工程(ウェスタンブロティング法、高原を固相化した酵素免疫測定法、免疫沈降法、高価なペプセット(PepSetTM、倉敷紡績(株)社製)など)を大幅に省略化できる。また各々5〜10個のペプチドをそれぞれ哺乳動物に免疫する煩雑さを解消し、省力化と経費削減を達成できる。
上記工程(ウ)及び(エ)により、各々5〜10個のペプチドをそれぞれ哺乳動物に免疫する煩雑さを解消し、省力化と経費削減達成ができる。
【0015】
(c)蛋白質中の免疫応答優位部位に対する抗体の製造
上記(イ)及び(ウ)の工程で得られたハイブリドーマ細胞から、蛋白質中の免疫応答優位部位を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択して、組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの2種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するハイブリドーマ細胞を製造することも出来るが、下記の(オ)、(カ)及び(キ)の工程によりモノクローナル抗体を製造するのが好ましい。
【0016】
(オ)生体試料より単離した蛋白質抗原又は、(a−1)で発現させた当該蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から、免疫抗原と免疫応答優位部位に対応するペプチド群をそれぞれ固相化した担体に反応せしめ、免疫応答優位部位を認識し、免疫抗原に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程。
【0017】
(カ)(b)で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの2種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程。
【0018】
(キ)(b)で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗血清及びポリクローナル抗体を製造する工程及び、抗血清を免疫応答優位部位に対応するペプチドを固相化した担体に反応させたのち、常法に従い担体を単離後、担体より抗体画分を分画して、高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するポリクローナル抗体群を濃縮する工程。
【0019】
抗原として用いられるヒトHLとしては、配列番号3記載のアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ヒトHL蛋白質中の特定のアミノ酸配列を有するペプチドとしては、例えばヒトHLの配列番号1で示されるアミノ酸配列又は配列番号1記載のアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドや、ヒトHLの配列番号2で示されるアミノ酸配列又は配列番号2記載のアミノ酸配列において、1〜複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
上記組換えHL(配列番号3)、配列番号1の配列及び配列番号2の配列で示される配列を含むペプチド類は、常法により化学合成又は遺伝子発現させることにより得られる。ペプチドの合成法としては、「実験医学(別冊)細胞工学ハンドブック」(黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第66〜74頁、1992年)等に記載されているような一般的な方法に従って合成できる。例えばt−BOC(tert-butyloxylcarbony 1)法、Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbony 1)法あるいはMAP(Multiple Antigen Peptide)法を使用することができる。遺伝子発現による方法としては、アミノ酸配列を各々発現可能なように配列した遺伝子を発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。宿主細胞としては、原核細胞(例えば大腸菌)及び真核細胞(例えばCHO細胞)のいずれをも使用することができる。
担体との結合を効果的にするためには、配列番号1又は2のいずれかで示されるペプチドのN又はC末端にシステイン、リジン、アルギニン等のアミノ酸を付与することもできる。N又はC末端にシステインを付与した場合、システインのアミノ基あるいはカルボキシ基はフリーにし、反対側の末端はブロックする。また、アミノ末端をフリーにして合成し、カルボキシ末端をアミドにし、担体との結合にビスイミドエステルを用いてもよい。ペプチドの担体としては、アルブミン、グロブリン等の哺乳動物由来蛋白質、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質、不活性化した結核菌等の微生物、ポリリジン、ポリアスパラギン等のポリアミノ酸、多糖類などが使用できる。
【0020】
ヒトHLをコードするDNAとしては、例えば、配列番号3記載のアミノ酸配列からなるヒトHLをコードするDNA(配列番号4)を利用できる。配列番号4記載の塩基配列からなるDNAは、常法に従って化学合成することができ、またヒト肝臓から常法に従って抽出したmRNAを鋳型とし、配列番号4記載の塩基配列にしたがって設計したプライマーを用いたRT−PCR法により増幅することもできる。更に、ヒトHLをコードするDNAは、常法に従って作製したヒト肝臓由来のcDNAライブラリーから、配列番号4記載の塩基配列に従って設計したプローブを用いて得ることもできる。ヒトHLをコードするDNAからのヒトHLの調製は、例えば、ヒトHLをコードするDNAを含む組換えベクターを作製し、該ベクターより適当な宿主細胞を形質転換し、該形質転換体を適当な培地で培養して得られる培養物を精製することにより行うことができる。
【0021】
本発明のモノクローナル抗体は、実験医学(別冊)細胞工学ハンドブック(黒木登志夫ら編集、羊土社発行、第66〜第74頁、1992年)及び単クローン抗体実験操作入門(安東民衛ら著作、講談社発行、1991年)等に記載されているようなモノクローナル抗体の一般的な製造方法に従って、いわゆる細胞融合によって製造されるハイブリドーマ(融合細胞)から製造することができる。かかるハイブリドーマは、抗原を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【0022】
具体的には、精製ヒトHLを抗原として、又は当該ヒトHLのアミノ酸配列の一部である配列番号1又は2のいずれかの配列からなるペプチド、もしくはこれと担体との結合物を抗原として該抗原を哺乳動物(ヒト抗体を産生するように遺伝子工学的に作出されたヒト抗体産生マウスのようなトランスジェニック動物も含む)、具体的には、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ、更に具体的にはマウス、ラットあるいはハムスターの皮下内、筋肉内、静脈内、フットパッド内あるいは腹腔内に1〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約1〜14日毎に1〜4回免疫を行なって、最終免疫より約1〜5日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞が取得される。
【0023】
ハイブリドーマの創製は、例えばケーラー及びミルシュタインらの方法(ネイチャー(Nature)、第256巻、第495〜第497頁、1975年)及びそれに準じる修飾方法に従って行なうことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄あるいは扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ又はヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラット又はヒトに由来する自己抗体産生能のないミエローマ細胞とを細胞融合することにより調製される。例えばマウス由来のミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63−AG8.653(653)、P3/NS1/1−Ag4−1(NS−1)、P3/X63−Ag8.U1(P3U1)、SP2/O−Ag14(Sp2/O,Sp2)PA1、F0あるいはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3−Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU−266AR1、GM1500−6TG−A1−2、UC729−6、CEM−AGR、D1R11あるいはCEM−T15等を使用することができる。
【0024】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェル中培養上清の哺乳動物の免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、例えばRIA、ELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。ここでは、前述の(c)の(オ)及び(カ)の工程により効率的にヒトHLに対する抗体を産生するハイブリドーマが選択できる。
【0025】
目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングする方法は、通常の方法に従えば良く、特に限定されない。ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行なうことができる。
【0026】
ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の生産は、ハイブリドーマをインビトロ又はインビボで培養し、得られた培養上清又は哺乳動物の腹水から単離することにより行なうことかできる。インビトロの培養では、モノクローナル抗体を産生させるために用いられる既知の栄養培地、あるいは既知の基本培地から誘導調整されるあらゆる栄養培地を用いて実施することができる。基本培地としては、例えば、Ham’F12培地、MCDB1553培地あるいは低カルシウムMEM培地等の低カルシウム培地及びMCDB104培地、MEM培地、D−MEM培地、RPMI−1640培地、ASF104培地あるいはRD培地等の高カルシウム培地等が挙げられ、該基本培地は、目的に応じて、例えば血清、ホルモン、サイトカイン及び/又は種々無機あるいは有機物質等を含有することができる。インビボの培養では、マウス、ラット、モルモット、ハムスター又はウサギ等、好ましくはマウス、もしくはラット、より好ましくはマウスの腹水等で実施することができる。モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈殿法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー(DEAE、DE52等)、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインAカラム等のアフィニティーカラムクロマトグラフィーに供すること等により行なうことができる。
【0027】
本発明のポリクローナル抗体は、前記モノクローナル抗体の調製で挙げたのと同様の文献に記載されているような一般的な方法に従って、調製することができる。すなわち、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマあるいはウシ等の哺乳動物やニワトリなどの鳥類、好ましくはラット、モルモット、ウサギあるいはヤギに、配列番号1又は2のいずれかのペプチド、もしくはそれらの混合物又はその担体との結合物を、モノクローナル抗体の製造方法で述べたような方法で免疫して、これにより製造されるヒトHLに反応性を有する抗体を含む血清、乳あるいは卵を、上記モノクローナル抗体の場合と同様にして単離、精製することにより調製することができる。
【0028】
精製蛋白質を用いるポリクローナル抗体の生産方法は、良く知られた方法であるが、抗原にごくわずかにでも抗原性を有する夾雑物があれば、それらに対する抗体も共に生産されてしまうことが問題となっている。また、精製蛋白質をヒト生体試料から得ようとする場合は、倫理的な問題、原材料中の感染性物質による作業者の健康への問題、製造物のロット間差の問題など、多くの問題がある。これに対し本発明の配列番号1又は2の配列のペプチドを利用する方法は、原料に由来する問題がなく、製造ロット間差についてもほとんど無視することができ、更に、配列番号1又は2の配列が、蛋白質発現やペプチド合成設備を有する施設であれば容易に入手することができるなど、生体試料由来の精製蛋白質を用いる方法に比べ、数多くのメリットがあり、極めて有用である。また、配列番号1又は2は、選択的に蛋白質の免疫応答優位部位に対する高い結合特異性(抗原認識特異性)抗体を製造する様に設計されており、免疫抗原としての優位性は極めて高い。
以上のようにして得られた本発明の抗ヒトHL抗体は、蛋白分解酵素であるペプシン、パパイン等で処理する等の常法により、抗体フラグメント、すなわちFab’又はF(ab’)2とすることができ、本発明の測定法や精製法においては、本発明の抗ヒトHL抗体のみならず、このような抗体フラグメントを使用することもできる。
【0029】
上記本発明の抗ヒトHL抗体、そのフラグメント又はそれらの標識体を用いれば、簡便かつ高感度にヒト血液由来検体中のHLを検出又は定量することが可能となる。
ヒト血液由来検体としては、特に限定されないが、例えば、血漿、血清等が挙げられる。
【0030】
検体を測定するためには、上記で得られた抗体を用いて免疫学的測定方法を実施すればよい。測定方法としては、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテツクス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセイ、イムノクロマトアッセイ、光学免疫測定法などを利用することができる。本発明の測定系としては、得られたヒトHLに対する抗体を用い放射免疫測定法(RIA)、酵素免疫測定法(EIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、免疫比濁法、免疫沈降法、イムノクロマト法などの公知の免疫測定方法を構築することにより、ヒトHLを測定することができる。標識として酵素を使うことは有利であり、酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、及びβ−D−ガラクトシダーゼなどが好適である。また、標識に金コロイド、ラテックスやカーボン粒子のような目視で判別できるものを用いても有利である。
【0031】
免疫測定法の一つの例として、いわゆる競合免疫測定法がある。例えば、検体に放射性同位体等で標識したヒトHLを一定量混合し、更に抗ヒトHL抗体を混合し検体中のヒトHL及び標識ヒトHLを反応させる。検体中のヒトHLは、標識ヒトHLと競合して抗ヒトHL抗体と反応するため、検体中にヒトHLが存在する分、標識ヒトHLとの反応が減少する。反応後、抗ヒトHL抗体をあらかじめ固相担体に結合させておくか、抗イムノグロブリン抗体、プロテインAと抗ヒトHL抗体を反応させることにより、結合、非標識ヒトHLを分離する。一般に用いられる方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素等を検出することによりヒトHLを測定することが可能となる。
【0032】
免疫測定法のもう一つの例として、いわゆるサンドイッチ系がある。例えば、抗ヒトHL抗体をマイクロタイタープレート、ビーズ、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の免疫測定法に一般に用いられる担体に結合させ、これを検体と接触させる事により、検体中のヒトHLを担体上にある抗ヒトHL抗体と反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等で標識した抗ヒトHL抗体と接触させ、担体上にある抗ヒトHL抗体と結合したヒトHLと反応させる。一般に用いられている方法により結合していない分画を洗い、標識されている放射性同位元素、酵素、蛍光物質、ビオチン等を検出することによりヒトHLを測定することが可能となる。また、金コロイド、ラテックスやカーボン粒子のような視覚的に判定可能な物質を前述の抗体の一方に標識をして、上述のサンドイッチ系又は競合法に応用し、判定することも可能である。この測定系に用いる抗ヒトHL抗体、標識抗ヒトHL抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又はその組み合わせのいずれを用いることも可能である。
【0033】
ここで肝要なことは、担体に結合する抗体とヒトHLとの複合体が標識抗体と結合できるよう、抗体を組み合わることであり、このような抗体の組み合わせは、前述の系の組み立て、その系に適用してみることにより選択することができる。
【0034】
凝集検定も有利な実施形態であり、前述の抗体の一方で被覆された粒子と、他の抗体で被覆された粒子を作製する。検出すべき物質への粒子の結合により、凝集が起こり、これは濁りの変化を判定あるいは検出することができる。また、代表的なヒトHL蛋白質濃度を測定できる免疫測定法であるサンドイッチELISA法の場合、本発明のモノクローナル抗体3A2をプラスチックプレートに固定化し、2次抗体に本発明のポリクローナル抗体、3次抗体にペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体を用いるのが好ましい。
【0035】
本発明の抗ヒトHL抗体又はフラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化抗ヒトHL抗体又は固定化フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、試料中に含まれるヒトHLを分離又は精製することができる。
【0036】
このようなヒトHLを分離又は精製に用いられる不溶性担体としては、(1)ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等のプラスチックやガラスに代表されるような水不溶性物質からなるプレート、試験管、もしくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ボール、フィルター、あるいはメンブレン等のほか、(2)セルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、多孔性シリカ系担体等を用いることができる。
【0037】
このようなアフィニティークロマトグラフィーとしては、例えば(a)不溶性担体として上記(1)のフィルター、メンブレン等を用い、これに本発明の抗ヒトHL抗体又はその抗体フラグメントを固定化した後、この不溶性担体と試料を接触させることにより試料中に含まれるヒトHLを分離する方法、(b)不溶性担体として上記(2)のようなセルロース系担体等を用い、これに本発明の抗ヒトHL抗体又はその抗体フラグメントを常法により固定化(物理的吸着、架橋による高分子化、マトリックス中への封印あるいは非共有結合等による固定化)し、この不溶性担体をガラス製、プラスチック製あるいはステンレス製等のカラムに充填し、カラム(例えば、円柱状カラム)に、試料(例えば、血漿、血清等の体液試料、培養上清あるいは遠心上清等)を通じて溶出させることにより、試料中に含まれるヒトHLを分離又は精製する方法が挙げられる。
【0038】
上記(b)のアフィニティークロマトグラフィーに用いられる不溶性担体(2)の具体例としては、本発明の抗ヒトHL抗体又はその抗体フラグメントを固定できるものであれば、特に限定されないが、例えば、市販品であるアマシャム ファルマシア バイオテク(amersham pharmacia biotech)社製のSepharose 2B、Sepharose 4B、Sepharose 6B、CNBr-Activated 4B、AH-Sepharose 4B、CH-Sepharose 4B、Activated CH-Sepharose 4B、Epoxy-activated Sepharose 6B、Activated thiol-Sepharose 4B、Sephadex、CM-Sephadex、ECH-Sepharose 4B、EAH-Sepharose 4B、NHS-activated SepharoseあるいはThiopropyl Sepharose 6B等、バイオラッド(Bio-Rad)社製のBio-Gel A、Cellex、Cellex AE、Cellex-CM、Cellex PAB、Bio-Gel P、Hydrazide Bio-Gel P、Aminoethyl Bio-Gel P、Bio-Gel CM、Affi-Gel 10、Affi-Gel 15、Affi-Prep 10、Affi-Gel Hz、Affi-Prep Hz、Affi-Gel 102、CMBio-Gel A、Affi-Gel heparin、Affi-Gel 501あるいはAffi-Gel 601等、和光純薬工業社製のクロマゲルA、クロマゲルP、エンザフィックスP-HZ、エンザフィックスP-SHあるいはエンザフィックスP-AB等、セルバ(Serva)社製のAE-Cellurose、CM-CelluroseあるいはPAB Cellurose等を挙げることができる。
【0039】
【実施例】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【0040】
実施例1(組換えヒトHL蛋白質の製造)
(1)ヒトHLをコードするcDNAの調製
市販ヒト肝臓由来のcDNAライブラリー(宝酒造(株)社製)を鋳型として、特異的プライマー〔センスプライマー:5'−GGAATTCGGACAAAGCCTGAAACCAG-3'(配列番号5)、アンチセンスプライマー:5'-GTTTCGCTTTCTAGTCTACTCCTAGGC-3'(配列番号6)〕を用いて、下記の条件でPCRを行い、ヒトHLのcDNAをクローニングした。すなわち、特異的プライマーを用いて、PCRにより増幅したDNA断片を、下記の条件で制限酵素EcoRI及びBamHIの2種により切断後、常法により、アガロース電気泳動により分離し、約1.4KbpのDNA断片をゲルごと切り出した後、Geneclean II(BIO 101社製)で抽出し、目的とするcDNA断片を得た。
【0041】
<PCR試薬条件>
Takara Ex TaqTM(5units/μl) 0.25〜0.5μl
10X Ex TaqTM Buffer 10μl
dNTP Mixture(各2.5mM) 8μl
Template(cDNAライブラリー) 1μl
Primer(配列番号5) 0.2〜1.0μl
Primer(配列番号6) 0.2〜1.0μl
滅菌蒸留水 最終液量100μlへ
【0042】
<PCR温度反応条件>
95℃、5.0分
以下の3ステップを37回繰り返した。
95℃、0.5分
65℃、1.0分
72℃、2.0分
【0043】
<制限酵素反応条件>
得られた各PCR産物10μl当り、制限酵素バッファー(50mM NaCl, 100mM Tirs-HCl, 10mM MgCl2,0.025% Triton X-100, pH7.5)を1μl及び制限酵素EcoRI及びBamHI(BioLabs社製)を2μl添加して、37℃で一晩反応させ消化させた。
【0044】
このようにして得られた、約1.4KbpのDNA断片を、DNA Ligation Kit(宝酒造(株)社製)を用いて、上記条件により、制限酵素EcoRI及びBamHIの2種により切断したpMAL−p2ベクター(BioLabs社製)に挿入した。次いで、このpMAL−p2_HLベクターを、大腸菌JM109コンピテントセル(Invitrogen社製)に導入した。更に、この大腸菌より、プラスミドDNAを抽出し、プラスミドDNAのシーケンスを行い、約1.4Kbpの目的とするcDNA断片の塩基配列を確認した。このようにして得られた、約1.4KbpのPCR産物は、目的とするヒトHLをコードするcDNAであることが確認された。
【0045】
(2)組換えヒトHL蛋白質の調製
上記で得られたヒトHLのcDNAをマルトース結合蛋白質(MBP)の下流に組み込み、MBPとHLの結合蛋白質として発現するように構築されたプラスミド(pMAL−p2_HLベクター)を形質転換した大腸菌を100μg/mLのAmpicillinを含むLB培地5mLに植菌し、37℃で一晩振盪培養した。この培養液を100μg/mLのアンピシリン及び0.3mMのイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を含むLB培地100mLに植菌し、37℃で2時間振盪培養した。培養液を遠心(4,000×g,10min)で集菌し、菌体を200mMのNaCl及び1mMのEDTAを含む20mMのトリス緩衝液(pH7.4)(以下、緩衝液(A)と呼ぶ。)で懸濁、遠心(4,000×g,10min)し、菌体を洗浄した。菌体を緩衝液(A)の100mLで懸濁後、超音波処理して菌体を破砕させた。これを遠心(9,000×g,10min)し、上清を回収して粗酵素液とした。得られた粗精製酵素をガラスカラム管に充填し緩衝液(A)で平衡化したアミロースレジン(BioLabs社製)に添加した。吸着し酵素を緩衝液(A)で十分洗浄後、10mMのmaltoseを含む緩衝液(A)で溶出させた。溶出パターンを波長280nmの吸光度により観察し、精製組換えヒトHLとMBPの結合蛋白質画分を得た。
【0046】
実施例2(抗ヒトHLモノクローナル抗体の調製)
(a)免疫抗原の選択・調製
一般的に蛋白質の構造として外部に露出している部位と考えられるアミノ酸配列中の親水性の高い部位を免疫抗原又はハイブリドーマ細胞のスクリーニングに用いるためヒトHLの蛋白構造解析を行なった。塩基配列・アミノ酸配列の解析は専用ソフトDNASIS-Macv.3.6(日立ソフトウェア社製)を使用した。抗原認識部位として提示されやすい親水性領域推定法として、ホップとウッド法(Hopp & Woods)法、プロシーディングスナショナルアカデミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)、第78巻、第3824〜第3828頁、1981年)を参考にした。また、ある動物種に異種の抗原を免疫した際、抗原として提示されるアミノ酸配列としては、抗原のアミノ酸に動物の種差が明瞭に認められる領域を免疫することが重要であることを考え、ホモロジー検索を行い、より種差のある配列を選択した。ヒトHLのアミノ酸配列からハイドロホビシティ(Hydrophobicity)を計算した。全体としては疎水性が強いが、N末端、中央部及びC末端に親水性の領域がある。遺伝子配列が決定されている動物のHLアミノ酸配列間のホモロジー検索結果(Multiple alignment)、全体的にHLアミノ酸配列は動物種差がほとんど無く、N末端とC末端に若干の種差が認められるのみであった。上記疎水性部位の推定及び由来動物の異なるHLのアミノ酸配列のホモロジー評価、更に個々のアミノ酸の構造特性、担体との結合性を総合的に判断して、抗原として使用する、あるいは抗体を製造するハイブリドーマの選択に使用する配列を決定した。
【0047】
上記観点より、本実施例で合成し用いたペプチドは、配列番号3で示されるヒトHLのアミノ酸配列中、24〜43番目のアミノ酸配列からなるペプチド(配列番号1;以下「ペプチド1」という)、45〜63番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド2」という)、255〜275番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド3」という)、330〜338番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド4」という)、367〜385番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド5」という)、428〜446番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド6」という)、467〜476番目のアミノ酸配列からなるペプチド(以下「ペプチド7」という)、490〜499番目のアミノ酸配列からなるペプチド(配列番号2;以下「ペプチド8」という)とした。これらのペプチド合成は、tBOC(tert-butyloxylcarbonyl)法、Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)法等により行なった。
【0048】
合成ペプチドと担体蛋白の結合法には、担体蛋白としてキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を用いた。10mgの担体用のKLH(PIERCE社製)を蒸留水の1mLに溶解させ、Sulfo−SMCC(PIERCE社製)の2mgを、1mLの蒸留水に溶解し、その100μlとKLH溶液200μlを混合し、室温で1時間攪拌した。0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したPD−10(ファルマシアバイオテック社製)に添加した。0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.4)で溶出させ、溶出パターンを波長280nmでの吸光度で測定した。該溶出パターンに従いマレイミド活性化KLHを回収後、合成ペプチド(4mg/mL蒸留水)の0.5mLを加え、室温で2時間攪拌し、100倍容のPBSで透析し、免疫抗原あるいは酵素免疫測定法に供した。
【0049】
(b)蛋白質の免疫応答優位部位の特定
(b−1)(a)で発現させた蛋白質抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を(a)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程は以下の通りに実施した。
【0050】
組換えヒトHLを用いた場合、免疫方法は8〜10週令のBALB/cマウスの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、精製組換えヒトHLを適当なアジュバンド「例えば、フロインドアジュバンドあるいは、リビアジュバンドシステム(Ribi Ajuvant System、RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH社製)と共に注射することにより初回(0日)免疫した。初回免疫から14日目、28日目、42日目に精製組換えヒトHLを皮下あるいは腹腔内に注射することにより追加免疫し、最終投与2週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。合成ペプチドと担体蛋白の結合物を用いた場合、0.3mgの結合物とフロインドの完全アジュバンド(Freud's Complete adjuvant、Sigma社製)を等量混合し、ウサギ四肢及び背中の皮膚数十ヶ所に注射して免疫した。2ヵ月〜3ヵ月の間に5〜6回同様に投与した。最終投与2週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。下記に示した論理的・戦略的に選択後合成した合成ペプチドを固相化した酵素免疫測定法を用い、マウス血清中の抗体群の検定を実施した。
【0051】
(b−2)(a)で合成したペプチドを担体蛋白質と結合させ、各々のペプチドと担体蛋白質の結合物を等量ずつ混合した抗原、又は、各々のペプチドを等量ずつ混合して担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、得られた抗血清を(a)で合成したペプチドをそれぞれ固相化した担体に反応させ、抗血清中の特定のペプチドに対する抗体群の分布を評価することにより、免疫応答優位部位の特定する工程は以下の通りに実施した。
【0052】
合成ペプチドと担体の結合物に付いては、各々の合成ペプチドを担体と結合させ、担体との結合物としたのち、(1)ペプチド2、4〜8の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原と、(2)ペプチド1及び2の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原の2種類を用い、各々のペプチドをウサギに免疫する煩雑さを解消し、省力化を達成した。得られた抗血清に付いては、下記に示した合成ペプチドを固相化した酵素免疫測定法を用い、マウス血清中の抗体群の検定を実施した。
【0053】
ペプチド1〜8を1mg/mLの濃度で高純度の蒸留水に溶解させた。150mMのNaClを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.4:以下PBSという)に溶解ペプチド各々を10μg/mLの濃度で調製後、96穴EIAプレートに50μl/穴ずつ分注し、室温で2時間放置し抗原をプレートに固相化した。0.05%のTween 20を含むPBS(以下、T−PBSという)で2回洗浄後、ブロッキング試薬(ブロックエース、大日本製薬社製)を350μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置し底面上の蛋白結合残基をブロックした。T−PBSにより2回洗浄後、第1次抗体として、T−PBSに上記で調製したマウス血清及びウサギ血清の各々を100倍に希釈後、50μl/穴ずつ分注し室温で2時間放置する。T−PBSにより2回洗浄後、第2抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物及び抗ウサギイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(TAGO社製)の50000倍希釈液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置した。T−PBSにより2回洗浄後、OPD基質液(o−フェニレンジアミンヂアミン2塩酸塩の60mgをクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.2)の20mLに溶かした溶液に、30%の過酸化水素の20μlを加えた溶液)を50μl/穴ずつ分注し発色後、1.5Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長492nm、副波長620nmで測定する。組換えヒトHLをマウスに免疫して得られた血清を抗血清(a)、ペプチド2、4〜8の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清(b)、ペプチド1及び2の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清(c)とした。この結果を表1及び図1に示す。
【0054】
【表1】

Figure 0004838436
【0055】
組換えヒトHLをマウスに免疫して得られた血清を抗血清(a)中では、ペプチド1に対する抗体群が優位に多く、ペプチド1が、ヒトHLのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であった。
ペプチド2、4〜8の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原ウサギに免疫して得られた血清を抗血清(b)中では、ペプチド8に対する抗体群が優位に多く、ペプチド8が、ヒトHLのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であることが、明らかとなった。
ペプチド1及び2の担体との結合物を等量ずつ混合した免疫抗原をウサギに免疫して得られた血清を抗血清(c)中では、ペプチド2よりペプチド1に対する抗体群が優位に多く、ペプチド1が、ヒトHLのアミノ酸配列中で免疫応答優位部位であった。
【0056】
以上の結果から、抗ヒトHLモノクローナル抗体を製造する場合、ペプチド1又は8を哺乳動物に免疫することにより抗体産生細胞を取得し、該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞(ミエローマ細胞)からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造できることが明らかとなった。
同様に、抗ヒトHLポリクローナル抗体を製造する場合、ペプチド1又は8を哺乳動物に免疫することにより抗血清を取得し、製造できることが明らかとなった。
また、ペプチド1に対する抗HL抗体を取得する場合、哺乳動物としてマウス又はウサギが好適であり、ペプチド8に対する抗HL抗体を取得する場合、哺乳動物としてウサギが好適であることが明らかとなった。
【0057】
(c)蛋白質中の免疫応答優位部位に対する抗体の製造
(c−1)(b)で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、該免疫動物の脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させ、得られるハイブリドーマ細胞から組換え蛋白質と免疫応答優位部位に対応するペプチドの2種類の抗原をそれぞれ固相化した担体に反応させ、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を製造する工程は以下の通りに実施した。
【0058】
免疫方法は、8〜10週令のBALB/cマウスの皮下あるいは、静脈内あるいは腹腔内に、ペプチド1の担体との結合物を適当なアジュバンド(例えば、フロインドアジュバンドあるいは、リビアジュバンドシステム(RIBI Ajuvant System、RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH社製)と共に注射することにより初回(0日)免疫した。初回免疫から14日目、28日目、42日目にペプチド1の担体との結合物を皮下あるいは腹腔内に注射することにより追加免疫し、更に下記に述べるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ調製の前々日及び前日にも同様にして採集免疫し、マウスから脾細胞を調製して細胞融合に用いた。
【0059】
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞P3−U1を正常培地(RPMI−1640に1.5mMのグルタミン及び13%の牛胎児血清を加えた培地)に培養(37℃、CO2、5%通気)し、4日後に2×107以上の細胞を得た。
【0060】
RPMI−1640(日水製薬社製)でよく洗浄した免疫マウス脾細胞1×108個とマウス骨髄腫細胞2×107個と混合し、1500rpmで5分間遠心分離にかけた。
沈殿として得られた脾細胞とP3−U1の混合した細胞群をほぐした後、攪拌しながら50%のポリエチレングリコール及び、10%のDMSO混合溶液の1mLを加え、2分後にRPMI−1640を徐々に加え、全容量が50mLとなるようにした。1000rpmで5分間遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、HAT培地(上記正常培地にヒポキサンチン10-4M、チミジン1.5×10-5M、及びアミノプテリン4×10-7Mを加えた培地)の30mLを加え、5mL容メスピペットでゆるやかに細胞を懸濁し、5%CO2インキュベーター中37℃で2時間培養した。1500rpmで5分間遠心分離後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、HAT培地に懸濁し、96穴培養プレートに200μl/穴ずつ分注し、5%CO2インキュベーター中37℃で10〜14日間培養した。
【0061】
抗ヒトHLモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、抗原を固相化した酵素免疫測定法を用いて行なった。
実施例1で調製した組換えヒトHL及びペプチド1をPBSに1μg/mLの濃度で調製後、96穴EIAプレートに50μl/穴ずつ分注し、室温で2時間放置し抗原をプレートに固相化した。T−PBSを350μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。T−PBSにより2回洗浄後、T−PBSを50μL/穴ずつ分注し、第1次抗体として、クリーンベンチ内でハイブリドーマ培養上清を96穴EIAプレートに100μl/穴ずつ移し、4℃で一晩又は室温で2時間放置した。T−PBSにより2回洗浄後、第2抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(TAGO社製)の5000倍希釈液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置した。T−PBSにより2回洗浄後、OPD基質液(o−フェニレンジアミン2塩酸塩の60mgをクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.2)の20mLに溶かした溶液に、30%の過酸化水素の20μlを加えた溶液)を50μl/穴ずつ分注し発色後、1.5Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長492nm、副波長620nmで測定した。
【0062】
抗HLモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが認められた穴について、限界希釈法によりクローニングを2〜4回繰返し、安定して抗体産生の認められたものを、抗HLモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択した。樹立されたハイブリドーマ3A2を2001年1月24日付けにて通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、寄託番号FERM P−18181として寄託した。
【0063】
(c−2)モノクローナル抗体の大量調製
プリスタン処理(2,6,10,14−テトラメチルペンタデカンの0.5mL/匹を腹腔内投与し、1〜2週間飼育する。)した10週令マウス(BALB/c)に上記のハイブリドーマ株各1×106個細胞/匹を腹腔内注射した。10〜21日後にハイブリドーマ株は腹水癌化し、腹腔内に腹水があるマウスから、腹水(4〜10mL/匹)を採取し、遠心分離して固形分を除去した。上清を50%硫安塩析後、PBSで一晩透析し、これを粗精製モノクローナル抗体とした。
【0064】
(c−3)(b)で明らかとなった蛋白質中の免疫応答優位部位に対応するペプチドを担体蛋白質と結合させた抗原で哺乳動物を免疫し、免疫応答優位部位を認識し、蛋白質に対して高い結合特異性(抗原認識特異性)を有する抗血清及びポリクローナル抗体を製造する工程及び、抗血清を免疫応答優位部位に対応するペプチドを固相化した担体に反応させたのち、常法に従い担体を単離後、担体より抗体画分を分画して、高い結合特異性(抗原認識特異性)を有するポリクローナル抗体群を濃縮する工程は以下の通りに実施した。
【0065】
上記(a)で調製したペプチド1又は8と担体(KLH)の結合物の0.1〜0.3mgとフロインドの完全アジュバンド(Freud's Complete adjuvant、Sigma社製)を等量混合し、ウサギ四肢及び背中の皮膚数十ヶ所に注射して免疫した。2ヶ月〜3ヶ月の間に5〜6回同様に投与した。最終投与2週間後に全血液を採取し、その血清を取得した。血清を50%硫安塩析後、PBSで一晩透析し、これを粗精製ポリクローナル抗体とした。
【0066】
(c−4)(抗ヒトHL抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の精製)
上記で取得したモノクローナル抗体3A2の粗精製モノクローナル抗体及び、粗精製ポリクローナル抗体に、MAPS II結合バッファー(バイオラッド社製)を等量加え、0.45μmのフィルター(ミリポア社製)で濾過し、白沈を除いた。得られた濾液をHiTrap Protein Aアフィニティーカラム(ファルマシアバイオテック社製)にて添加した。MAPS II結合バッファーで洗浄後、MAPS II溶出バッファー(バイオラッド社製)で溶出させた(3mL/チューブ,約10本)。溶出パターンを波長280nmでの吸光度で測定し、溶出パターンに従い、抗体を含む分画を回収した。
(c−5)(アイソタイプの決定)
マウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定キット(ZYMED社製)を用い、キット添付の実験操作プロトコールに従って操作を行い、モノクローナル抗体3A2のアイソタイプを決定した。3A2はIgG2a,κであることが確認された。
【0067】
実施例3(アフィニティークロマトグラフィーによるヒトHLの精製
ヒトPHPから実施例2で調製した精製モノクローナル抗体3A2を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、高純度のヒトHLを精製した。
(1)固相化モノクローナル抗体(カラム充填用吸着体)の調製
CNBr活性化セファロース4B(CNBr-activated Sepharose 4B、ファルマシアバイオテック社製)を用い、添付のプロトコールに従って操作を行なった。CNBr活性化セファロース4Bを1mMの塩酸で20分間膨潤させ、G3グレードの細孔のグラスフィルター付きブフナーロート上で同1mMの塩酸で洗浄する。ゲルを0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.1Mの炭酸水素ナトリウム(pH8.3)の緩衝液(以下、結合バッファーという。)に懸濁し、結合バッファーに対し一晩透析した抗体を添加し、室温で2時間混合し抗体とゲルを結合させる。11000rpmで5分間遠心分離し上清を除去し、0.1Mのトリス緩衝液(pH8.0)に懸濁後、室温で2時間放置する。グラスフィルターにより濾過後、グラスフィルター上で結合バッファー及び0.5Mの塩化ナトリウムを含む0.1Mの酢酸緩衝液(pH4.0)で交互に洗浄する。最後に適当量のPBSに懸濁しカラムに充填させる。
【0068】
(2)ヘパリンセファロース4Bクロマトグラフィーによる精製
複数の健常人から採血したヘパリン負荷後の末梢血を、常法に従い遠心分離により血球系細胞を除去し、ヒト血漿PHPを得、使用時まで−80℃で保存した。−80℃保存ヒト血漿200mLを37℃恒温槽で溶解し、不溶物を除くために遠心(5000×g,30min,4℃)した。
このPHPをガラスカラム管(2×40cm、バイオラッド社製)に充填し、0.3MのNaCl及び10%のGlycerolを含む5mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したHeparin-Sepharose 4Bに添加した。0.3MのNaCl及び10%のGlycerolを含む5mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄後、0.3〜1.5MのNaCl、10%のGlycerolを含む5mMのリン酸緩衝液(pH7.4)で濃度勾配溶出させた(8mL/チューブ,65本)。溶出パターンを波長280nmでの吸光度と下記に示した分画したフラクションを固相化した酵素免疫測定法を用い、HTGLとLPLの分別状態を検定した。
【0069】
各々の分画したフラクションを、96穴EIAプレートに50μl/穴ずつ分注し、室温で2時間放置し抗原プレートに固相化した。T−PBSを350μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。T−PBSにより2回洗浄後、T−PBSを50μl/穴ずつ分注し、第1次抗体として、実施例3で調製した精製抗ヒトHLモノクローナル抗体3A2及び、精製した抗LPLモノクローナル抗体(特開平05−223822記載のモノクローナル抗体が適当である。)を10μg/mLの濃度に希釈後、50μl/穴ずつ分注し、室温で2時間放置した。T−PBSにより2回洗浄後、第2抗体として、ヤギの抗マウスイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(TAGO社製)の5000倍希釈液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置した。T−PBSにより2回洗浄後、OPD基質液(o−フェニレンジアミン2塩酸塩の60mgをクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.2)の20mLに溶かした溶液に、30%の過酸化水素の20μlを加えた溶液)を50μl/穴ずつ分注し発色後、1.5Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させる。プレートリーダーにて吸光度を主波長492nm、副波長620nmで測定した。
【0070】
結果を図2に示す。実施例2で調製した精製抗ヒトHLモノクローナル抗体3A2により検出されたHL蛋白質は、約0.8MのNaCl濃度で溶出されており、チャン(Chao-Fu Cheng)ら(ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)、第260巻、第19号、第10720−10727頁、1985)の文献の結果と一致しており、本発明の抗ヒトHLモノクローナル抗体3A2が、特異的にヒトHLを認識していることを示している。また、本発明の抗ヒトHLモノクローナル抗体3A2は、抗LPLモノクローナル抗体で検出される約1.5MのNaCl濃度で溶出されるLPLには、交差反応性を示さず、▲1▼ヒトHLに対して抗原抗体反応が認められる。▲2▼少なくともヒトリポ蛋白リパーゼに対しては、抗原抗体反応が認められない、ことが証明された。
【0071】
(3)アフィニティークロマトグラフィーによる精製
上記(2)で調製したHLを含む溶液をPBSに対して一晩透析後、(1)で調製したアフィニティーカラムに加えた。カラムをPBSで洗浄し、3MのNaSCNを含むPBSで溶出させ、溶出画分のパターンを、波長280nmでの吸光度により測定した。結果を図3に示す。該溶出パターンに従い、ヒトHLを含む画分を集め、PBSで透析し、極めて高純度の精製ヒトHLを調整した。
【0072】
常法に従ってSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)により解析した。結果を図4に示す。泳動・スポット画像解析ソフトDensitograph Ver.4.03C(アトー(株)社製)を用い分子量と純度を評価した結果、分子量約65,000の一種からなり、極めて高い純度であることが確認された。
【0073】
実施例4
サンドイッチELISAによるヒトHLの定量法の確立
(1)固相化抗体の作製
PBSに精製モノクローナル抗体3A2又は、精製ポリクローナル抗体を10μg/mLに希釈し、96穴EIAプレートに50μl/穴ずつ分注し、室温で2時間放置し抗体をプレートに固相化した。T−PBSで2回洗浄後、1%のBSAを含むT−PBSを350μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置し底面上の蛋白結合性残基をブロックした。内容物を除去後、1%のBSA及び10%のシュークロースを含むT−PBSを350μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置後、内容物を除去して自然乾燥させた。
【0074】
(2)モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のペルオキシダーゼ標識
5mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)にペルオキシダーゼ(以下、HRPという)を10mg/mLの濃度で溶解した溶液に、メタ過ヨウ酸ナトリウムを蒸留水で1000mg/mLの濃度で溶解した溶液を、HRP:メタ過ヨウ酸ナトリウム=1mg:0.43mgの比で加え、暗所、室温で30分間反応させた。次いで反応液を5mMの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で平衡化したセファデックスG−25(1.5×30cm、ファルマシアバイオテック社製)のカラムに添加して、活性化HRP画分を回収した。次に精製モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を0.1Mの重炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.3)で一晩透析した溶液に、活性化HRP画分を重量比1:1で混合し、暗所、室温で1時間反応させた。反応後、テトラヒドロホウ酸ナトリウムを蒸留水で2mg/mLの濃度で溶解した溶液を、反応液500μlに対して10μlで混合し、暗所、室温で15分間反応させた。反応後、等量の飽和硫安を加え、氷上で1時間放置した。12,000rpmで10分間遠心分離後、上清を除去してHRP標識抗体を回収し、PBSに懸濁した。波長280nmでの吸光度を測定し、吸光度を用い以下の試験を行った。
【0075】
(3)サンドイッチELISAによる定量系(2抗体法)
(1)で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体(以下、固相化マイクロプレートという)を用いる。固相化マイクロプレートの各ウェルに0.2%のBSA及び0.05%のTriton X-100を含むPBS(以下、BT−PBSという)で希釈した測定試料(ヘパリン負荷前血漿、PHP、精製HL)を50μl/穴ずつ加え、室温で2時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをT−PBSで2回洗浄後、BT−PBSBで希釈した(2)で作製したHRP標識モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体溶液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをT−PBSで2回洗浄後、OPD基質液(o−フェニレンジアミン2塩酸塩の60mgをクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.2)の20mLに溶かした溶液に、30%の過酸化水素の20μlを加えた溶液を50μl/穴ずつ分注し発色後、1.5Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長492nm、副波長620nmで測定した。
【0076】
(4)サンドイッチELISAによる定量系(3抗体法)
(1)で作製した固相化抗体、モノクローナル抗体3A2(以下、固相化マイクロプレート)を用いる。固相化マイクロプレートの各ウェルにBT−PBSで希釈した測定試料(ヘパリン負荷前血漿、PHP、精製HL)を50μl/穴ずつ加え、室温で2時間インキュベートした。固相化マイクロプレートをT−PBSで2回洗浄後、第2抗体としてBT−PBSでポリクローナル抗体を10μg/mLに希釈した溶液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間インキュベートした。
固相化マイクロプレートをT−PBSで2回洗浄後、第3抗体として、ヤギの抗ウサギイムノグロブリン−ペルオキシダーゼ結合物(TAGO社製)の5000倍希釈液を50μl/穴ずつ分注し、室温で1時間放置した。固相化マイクロプレートをT−PBSで2回洗浄後、OPD基質液(o−フェニレンジアミン2塩酸塩の60mgをクエン酸・リン酸緩衝液(pH5.2)の20mLに溶かした溶液にね30%の過酸化水素の20μlを加えた溶液を50μl/穴ずつ分注し発色後、1.5Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を主波長492nm、副波長620nmで測定した。
又は、TMB基質(PIERCE社製)を50μl/穴ずつ分注し発色後、2.0Nの硫酸溶液を50μl/穴ずつ分注し反応を停止させた。プレートリーダーにて吸光度を450nmで測定した。被検体中のHL濃度は、各々精製HL及び標準PHPを標準物質として作成した検量線から求めた。
【0077】
(5)検量線作製(精製HL)
実施例3で調製した精製HLを標準物質として、(4)で確立したサンドイッチELISAを用いて検量線を作製した。結果を図5に示す。10〜1000ng/mLの濃度範囲で良好な検量線が得られた(y=0.315Ln(x)−0.5275、相関係数:R2=0.9963)。この検量線から被検体中のHL濃度を計算した。
【0078】
(6)測定系の正確性確認
(5)で作成した検量線から、同時に測定したPHPを40倍、80倍及び160倍して測定後、各点のHL濃度を計算して、希釈直線性から測定系の正確性を確認した。結果を図6に示す。40〜160倍まで良好な希釈直線性を示した(y=894.41x−0.9684、相関係数:R2=0.9857)。
【0079】
(7)サンドイッチELISA系の特異性検討
特異性を検討するため、ヘパリン負荷前血漿及びヘパリン負荷後血漿(PHP)を40倍、80倍及び160倍して測定後、各点のHL濃度を計算して、特異性を確認した。結果を図7に示す。ヘパリン負荷後血漿(PHP)は、40〜160倍まで良好な希釈直線性(y=551.94x+2.2692、相関係数:R2=0.9816)を示し、ヘパリンを静注して肝内皮細胞表面に係留しているHLを血中に遊離の状態で取り出し、特異的に測定していることが明らかとなった。一方、ヘパリン負荷前血漿は、HLが肝内皮細胞表面に係留した状態であり、血中に遊離で存在するHLはほとんどないが、微量のHL(y=24.878x+5.3756、相関関数:R2=0.9322)を測定できた。
【0080】
【発明の効果】
本発明の抗ヒトHL抗体は、ヒトHLに対する特異性が高く、LPLに反応しないので、ヒトHL測定用抗体として有用である。従って、本発明抗体を用いれば簡便かつ高感度でヒトHLを測定することができ、動脈硬化症及び肝機能診断に有利である。
【0081】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図1】ヒトHLの免疫応答優位部位を特定した結果を示す図である。
【図2】ヘパリンセファロース4Bクロマトグラフィーにより分画したフラクションを固相化した酵素免疫測定法を用い、HTGLとLPLの分別状態を検定した結果を示す図である。
【図3】モノクローナル抗体3A2を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるヒトHLのクロマトグラムを示す図である。
【図4】モノクローナル抗体3A2を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたヒトHLの精製度を示す電気泳動図である。
【図5】本発明によって確立されたサンドイッチELISAによるヒトHLの定量法の検量線を示す図である。
【図6】本発明によって確立されたサンドイッチELISAによるヒトHLの定量法の正確性を示す図である。
【図7】本発明によって確立されたサンドイッチELISAによるヒトHLの定量法の特異性を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an anti-human hepatic triglyceride lipase antibody having high antigen recognition specificity useful as a diagnostic agent for familial human hepatic triglyceride lipase deficiency, liver disease / malnutrition, arteriosclerosis and the like, and the same It relates to a reagent.
[0002]
[Prior art]
Human hepatic triglyceride lipase (HL) is a 65 kDa glycoprotein synthesized by Hepatocyte. Like lipoprotein lipase (LPL), HL catalyzes the hydrolysis of triglycerides, causing the conversion of triglyceride rich chylomicrons and very low density lipoproteins (VLDL) into cholesterol rich remnant particles. Each lipase is a heparin-binding protein and is found in human and laboratory animal post-heparin plasma (PHP). Early studies established the role of HL in remnant clearance. Inhibition of HL activity by injection of anti-HL IgG into rats and monkeys impairs liver uptake of radioactively labeled remnant particles, resulting in accumulation of plasma VLDL and LDL fractions. In humans, the presence of familial HL deficiency increases the plasma levels of remnant-like particles containing cholesterol and triglycerides, and presents early-onset atherosclerotic disease. Expression of human HL in transgenic mice and rabbits exhibits a reduction in total plasma cholesterol. In HL knockout mice loaded with a high fat diet, the abnormal lipid profile is corrected by the expression of HL, and aortic cholesterol is clearly reduced. These results support the anti-atherogenic role of HL.
In addition, since HL is a glycoprotein with a short half-life synthesized in the liver, it has attracted attention as a diagnostic marker with extremely high organ specificity that reflects liver function and nutritional status.
[0003]
As a method for quantifying HL in body fluids of healthy persons and patients suffering from the above-mentioned various diseases, two types of methods (activity amount and protein amount) having different principles are mainly used. Since HL is an enzyme anchored on the surface of hepatic endothelial cells, heparin is intravenously injected and removed in the blood in a free state. This plasma after heparin administration is called post-heparin plasma (PHP). Currently, it is known that there are two types of lipases that decompose triglycerides in PHP, and lipoprotein lipase (Lipoprotein) anchored via glycans on the surface of capillary endothelial cells of HL and extrahepatic tissues. lipase, LPL). In order to accurately measure HL, it is necessary to separately quantify HL and LPL. As a method for quantifying HL by the amount of activity, generally, after inactivating one of two enzymes (HL and LPL) by some method, the other remaining enzyme is measured under optimum conditions. There is. Typical methods include: (1) Inactivation of LPL with 1M NaCl and then measuring the remaining HL activity in PHP; (2) Separation of HL and LPL according to NaCl concentration using a heparin sepharose column There is a method for measuring each enzyme activity after elution. However, the method (1) adversely affects the active enzyme in which NaCl remains after the selective neutralization of NaCl and partially inactivates the activity. The column method (2) It is known that there is a problem with the recovery rate.
[0004]
Regarding the method for measuring HL by the amount of protein, Yasuyuki Ikeda et al. (Medical Immunology, Vol. 18, No. 4, p. 643, 1989) have reported a quantitative method using a monoclonal antibody. . However, the operation is complicated, such as using an insoluble carrier derived from a cell wall, which is known to have a difference between raw material lots, and requiring centrifugation. Further, the antigen recognition site of this monoclonal antibody is not known, and its use is limited to antigen measurement and the like.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide an anti-human HL antibody having binding specificity particularly to human HL, and a method for measuring blood HL easily and with high sensitivity using the antibody.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
Under such circumstances, the present inventors have made various studies to obtain an anti-HL antibody having high binding specificity (antigen recognition specificity), and as a result, one of the sequence parts of SEQ ID NO: 1 or 2 is an immune response of human HL. We succeeded in obtaining an anti-human HL antibody which is a superior site and has an extremely high binding specificity (antigen recognition specificity) to these sequences. Furthermore, according to an immunoassay using the antibody, human HL can be easily and highly enhanced. In addition to the measurement of HL, the antibody is extremely useful not only for the measurement of HL but also for the isolation and purification of human HL and the detection of genetic abnormalities in which this sequence part or sequences other than this sequence are abnormal. As a result, the present invention has been completed.
[0007]
That is, the present invention provides an anti-human HL antibody or a fragment thereof that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, or added. Is.
The present invention also provides a hybridoma that produces the above-described anti-human HL monoclonal antibody.
The present invention also provides a human HL measurement reagent containing the above-described anti-human HL antibody, a fragment thereof or a label thereof.
The present invention also provides a method for measuring human HL in a specimen characterized by reacting the above-mentioned anti-human HL antibody, a fragment thereof or a label thereof with a human blood-derived specimen.
Furthermore, the present invention provides a method for separating or purifying human HL by affinity chromatography using an immobilized anti-human HL antibody or an immobilized fragment obtained by immobilizing the above-mentioned anti-human HL antibody or a fragment thereof on an insoluble carrier. Is.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The anti-human HL antibody of the present invention is reactive to human HL, and the amino acid sequence whose antigen recognition site is represented by SEQ ID NO: 1 or 2 or one to several amino acids among the amino acids are deleted or substituted Alternatively, it recognizes the added amino acid sequence. The number and site of amino acid mutations here are not particularly limited. “1 to several” means the number that can be generated by a commonly used technique, for example, site-directed mutagenesis, specifically means about 1 to 10, preferably 1 to Six, more preferably 1-3.
[0009]
The anti-human HL antibody of the present invention is preferably reactive with human HL and does not react with human LPL.
[0010]
The anti-human HL antibody of the present invention includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and monoclonal antibodies are preferred. A particularly preferred example is monoclonal antibody 3A2, which is produced by hybridoma 3A2 deposited as FERM P-18181 and recognizes SEQ ID NO: 1.
[0011]
The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 recognized by the antibody of the present invention is an immune response dominant site in human HL. An antibody against such an immune response dominant site of human HL can be produced, for example, by the following steps (a), (b) and (c).
[0012]
(A) Preparation and selection of immune antigen
Utilizing the primary structure of the protein amino acid sequence and base sequence, expressing the recombinant protein and preparing it as an antigen (a-1) and utilizing the basic properties of the protein, the hydrophilic region and the primary structure This is a step (a-2) of selecting and synthesizing a sequence of a synthetic peptide that is clear between animal species. As a method of selecting a peptide, Hop and Wood method (Hopp & Woods method, Proceedings National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 78, pp. 3824-3828, 1981), Perker antigenicity method, Protrusion index antigenicity method, Welling antigenicity method and the like can be used. The number of peptides to be synthesized is preferably 5-10 or more, more preferably 5-10.
[0013]
(B) Identification of immune response dominant site of protein
(A) A mammal is immunized with the protein antigen expressed in (a-1), and the obtained antiserum is reacted with a carrier on which the peptide synthesized in (a-2) is solid-phased. Identifying an immune response dominant site by evaluating the distribution of an antibody group against the specific peptide.
(A) A mammal is immunized with the protein antigen expressed in (a-1), the spleen cells of the immunized animal and myeloma cells are fused, and the resulting hybridoma cell culture supernatant is (a-2) The step of identifying an immune response dominant site by reacting each of the peptides synthesized in step 1 with a solid-phased carrier and evaluating the distribution of antibody groups against a specific peptide in a hybridoma cell group.
(C) An antigen in which the peptide synthesized in (a-2) is bound to a carrier protein, and an equal amount of each peptide and a conjugate of the carrier protein is mixed, or an equal amount of each peptide is mixed and the carrier protein Distribution of antibody groups against specific peptides in the antiserum by immunizing mammals with the antigen bound to the antibody and reacting the antiserum obtained with the carrier synthesized with the peptide synthesized in (a-2) The step of identifying an immune response dominant site by evaluating.
(D) An antigen in which the peptide synthesized in (a-2) is bound to a carrier protein, and an equal amount of each peptide and a conjugate of the carrier protein is mixed, or an equal amount of each peptide is mixed to a carrier protein. Immunization of mammals with antigens bound to spleen cells, and fusion of spleen cells and myeloma cells of the immunized animals, and solidification of the resulting hybridoma cell culture supernatant with the peptides synthesized in (a-2) A step of identifying an immune response dominant site by reacting with the carrier and evaluating the distribution of the antibody group against the specific peptide in the hybridoma cell group.
[0014]
By the above steps (a) and (b), it becomes easy to produce an antibody having a selectively high binding specificity (antigen recognition specificity), and a plurality of antibodies that evaluate the specificity of the antibody after hybridoma cell establishment is established. Process (Western blotting, enzyme immunoassay with solid plateau, immunoprecipitation, expensive pepset (PepSetTM, Kurashiki Boseki Co., Ltd.), etc.). Moreover, the troublesomeness of immunizing each mammal with 5 to 10 peptides can be eliminated, and labor saving and cost reduction can be achieved.
By the steps (c) and (d), the trouble of immunizing each mammal with 5 to 10 peptides can be eliminated, and labor saving and cost reduction can be achieved.
[0015]
(C) Production of antibodies against immune response dominant sites in proteins
A peptide corresponding to the recombinant protein and the immune response dominant site is selected from the hybridoma cells obtained in the steps (a) and (c) above by selecting a hybridoma that produces an antibody that recognizes the immune response dominant site in the protein. It is also possible to produce hybridoma cells that react with each of these two types of antigens on a solid-phased carrier, recognize immune response dominant sites, and have high binding specificity (antigen recognition specificity) to proteins. Monoclonal antibodies are preferably produced by the following steps (e), (f) and (g).
[0016]
(E) a hybridoma obtained by immunizing a mammal with a protein antigen isolated from a biological sample or the protein antigen expressed in (a-1), and fusing spleen cells and myeloma cells of the immunized animal By reacting the immune antigen and the peptide group corresponding to the immune response dominant site from the cells with the solid-phased carrier, the immune response dominant site is recognized, and high binding specificity (antigen recognition specificity) to the immune antigen is achieved. A step of producing a monoclonal antibody by screening hybridoma cells having the same.
[0017]
(F) Immunizing a mammal with an antigen obtained by binding a peptide corresponding to an immune response dominant site in the protein identified in (b) to a carrier protein, and fusing the spleen cells and myeloma cells of the immunized animal The resulting hybridoma cells are allowed to react with a carrier in which two types of antigens, the recombinant protein and the peptide corresponding to the immune response dominant site, are immobilized, recognize the immune response dominant site, and have high binding specificity to the protein. A step of producing a monoclonal antibody by screening hybridoma cells having sex (antigen recognition specificity).
[0018]
(G) Immunizing a mammal with an antigen obtained by binding a peptide corresponding to an immune response dominant site in the protein identified in (b) to a carrier protein, recognizing the immune response dominant site, and being high against the protein A step of producing antiserum and polyclonal antibody having binding specificity (antigen recognition specificity), and after reacting the antiserum with a carrier on which a peptide corresponding to an immune response dominant site is immobilized, the carrier is treated according to a conventional method. A step of concentrating a polyclonal antibody group having a high binding specificity (antigen recognition specificity) by separating an antibody fraction from a carrier after isolation.
[0019]
Examples of human HL used as an antigen include those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence. Examples of the peptide having a specific amino acid sequence in human HL protein include deletion, substitution or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of human HL or the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. A peptide having an amino acid sequence, or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 of human HL or a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 Is mentioned.
Peptides containing the recombinant HL (SEQ ID NO: 3), the sequence of SEQ ID NO: 1 and the sequence represented by the sequence of SEQ ID NO: 2 can be obtained by chemical synthesis or gene expression by a conventional method. The peptide synthesis method is according to a general method as described in “Experimental Medicine (separate volume) Cell Engineering Handbook” (edited by Toshio Kuroki et al., Published by Yodosha, pages 66-74, 1992). Can be synthesized. For example, t-BOC (tert-butyloxylcarbony 1) method, Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbony 1) method or MAP (Multiple Antigen Peptide) method can be used. As a method by gene expression, it can be prepared by inserting a gene in which an amino acid sequence is expressed in each expression into an expression vector, transforming a host cell with the expression vector, and culturing the transformed cell. it can. As a host cell, both prokaryotic cells (for example, E. coli) and eukaryotic cells (for example, CHO cells) can be used.
In order to make the binding with the carrier effective, amino acids such as cysteine, lysine and arginine can be added to the N- or C-terminus of the peptide represented by either SEQ ID NO: 1 or 2. When cysteine is added to the N or C terminus, the amino group or carboxy group of cysteine is free and the opposite end is blocked. Alternatively, the amino terminus may be synthesized free, the carboxy terminus may be an amide, and a bisimide ester may be used for binding to the carrier. As a peptide carrier, proteins derived from mammals such as albumin and globulin, proteins such as keyhole limpet hemocyanin, microorganisms such as inactivated Mycobacterium tuberculosis, polyamino acids such as polylysine and polyasparagine, and polysaccharides can be used. .
[0020]
As DNA encoding human HL, for example, DNA encoding human HL consisting of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 4) can be used. The DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 4 can be chemically synthesized according to a conventional method, and a primer designed according to the base sequence described in SEQ ID NO: 4 is used using mRNA extracted from human liver according to a conventional method as a template. It can also be amplified by the RT-PCR method. Furthermore, DNA encoding human HL can also be obtained from a cDNA library derived from human liver prepared according to a conventional method, using a probe designed according to the base sequence described in SEQ ID NO: 4. For preparation of human HL from DNA encoding human HL, for example, a recombinant vector containing DNA encoding human HL is prepared, an appropriate host cell is transformed from the vector, and the transformant is appropriately converted. It can be performed by purifying a culture obtained by culturing in a medium.
[0021]
The monoclonal antibody of the present invention includes experimental medicine (separate volume) cell engineering handbook (edited by Toshio Kuroki et al., Published by Yochisha, pages 66-74, 1992) and an introduction to monoclonal antibody experimentation (authored by Ando Tamie et al., It can be produced from a hybridoma (fused cell) produced by so-called cell fusion according to a general production method of a monoclonal antibody as described in Kodansha, 1991). Such a hybridoma obtains an antibody-producing cell by immunizing a mammal with an antigen, prepares a hybridoma from the antibody-producing cell and a myeloma cell (myeloma cell) having no autoantibody-producing ability, and clones the hybridoma. This is produced by selecting a clone that produces a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity for the antigen used for immunization of mammals.
[0022]
Specifically, the purified human HL is used as an antigen, or a peptide consisting of any one of SEQ ID NOs: 1 and 2 that is a part of the amino acid sequence of the human HL, or a conjugate of this peptide and a carrier. Antigens to mammals (including transgenic animals such as human antibody-producing mice that have been genetically engineered to produce human antibodies), specifically mice, rats, hamsters, guinea pigs or rabbits, and more specifically Specifically, immunization is carried out by injecting the mouse, rat or hamster once or several times subcutaneously, intramuscularly, intravenously, in a foot pad or intraperitoneally. Usually, immunization is performed 1 to 4 times about every 1 to 14 days from the initial immunization, and antibody-producing cells are obtained from the immunized mammal about 1 to 5 days after the final immunization.
[0023]
The hybridoma can be created, for example, according to the method of Kohler and Milstein et al. (Nature, Vol. 256, 495-497, 1975) and a modification method according thereto. That is, antibody-producing cells contained in the spleen, lymph nodes, bone marrow, tonsils, etc., preferably spleen, obtained from a mammal immunized as described above, and preferably a mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit or human It is prepared by cell fusion with a myeloma cell having no autoantibody producing ability derived from a mammal such as mouse, rat or human. For example, mouse-derived myeloma cells include mouse-derived myeloma P3 / X63-AG8.653 (653), P3 / NS1 / 1-Ag4-1 (NS-1), P3 / X63-Ag8. U1 (P3U1), SP2 / O-Ag14 (Sp2 / O, Sp2) PA1, F0 or BW5147, rat-derived myeloma 210RCY3-Ag. 2.3. Human-derived myeloma U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11, CEM-T15, or the like can be used.
[0024]
The screening of hybridomas producing monoclonal antibodies is carried out by culturing the hybridomas in, for example, a microtiter plate, and determining the reactivity of the culture supernatant in the wells in which proliferation has been observed with the antigen used in the immunization of mammals, for example, RIA. It can be carried out by measuring by an enzyme immunoassay such as ELISA. Here, a hybridoma that efficiently produces an antibody against human HL can be selected by the steps (c) and (f) of (c) described above.
[0025]
A method for cloning a hybridoma that produces the target monoclonal antibody may be a conventional method, and is not particularly limited. The hybridoma can be cloned by, for example, a limiting dilution method, a soft agar method, a fibrin gel method, a fluorescence excitation cell sorter method, or the like.
[0026]
Production of monoclonal antibodies from hybridomas can be carried out by culturing the hybridomas in vitro or in vivo and isolating the resulting culture supernatant or ascites from mammals. In vitro culture can be carried out using any known nutrient medium that is used to produce monoclonal antibodies, or any nutrient medium that is derivatized from a known basal medium. Examples of the basic medium include low calcium medium such as Ham'F12 medium, MCDB1553 medium or low calcium MEM medium, and high calcium such as MCDB104 medium, MEM medium, D-MEM medium, RPMI-1640 medium, ASF104 medium or RD medium. Examples of the basic medium include serum, hormones, cytokines, and / or various inorganic or organic substances, depending on the purpose. In vivo culture can be carried out in mice, rats, guinea pigs, hamsters or rabbits, preferably mice or rats, more preferably ascites in mice. Isolation and purification of the monoclonal antibody can be carried out by using the above-mentioned culture supernatant or ascites, saturated ammonium sulfate, euglobulin precipitation method, caproic acid method, caprylic acid method, ion exchange chromatography (DEAE, DE52 etc.), anti-immunoglobulin column or It can be performed by subjecting to affinity column chromatography such as a protein A column.
[0027]
The polyclonal antibody of the present invention can be prepared according to a general method as described in the same literature as mentioned in the preparation of the monoclonal antibody. That is, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a goat, a pig, a horse or a mammal such as a cow, or a bird such as a chicken, preferably a rat, a guinea pig, a rabbit or a goat, and the peptide of any one of SEQ ID NO: 1 or 2, Serum, milk, or egg containing antibodies reactive to human HL produced by immunizing the mixture or the conjugate with the carrier by the method described in the method for producing monoclonal antibodies, It can be prepared by isolating and purifying as in the case of the monoclonal antibody.
[0028]
A method for producing a polyclonal antibody using a purified protein is a well-known method. However, if there is a very small amount of antigenic impurities in the antigen, an antibody against them is also produced. ing. In addition, when trying to obtain purified protein from human biological samples, there are many problems such as ethical problems, health problems of workers due to infectious substances in the raw materials, and problems between product lots. is there. On the other hand, the method using the peptide having the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 of the present invention has no problem derived from the raw material, and can also neglect the difference between production lots. Compared to the method using a purified protein derived from a biological sample, the sequence can be easily obtained as long as the facility has protein expression and peptide synthesis facilities, and is extremely useful. SEQ ID NO: 1 or 2 is designed so as to selectively produce an antibody with high binding specificity (antigen recognition specificity) against the immune response dominant site of the protein, and is extremely superior as an immune antigen.
The anti-human HL antibody of the present invention obtained as described above is treated with a proteolytic enzyme such as pepsin, papain, etc., by an ordinary method such as antibody fragment, that is, Fab 'or F (ab').2In the measurement method and purification method of the present invention, not only the anti-human HL antibody of the present invention but also such an antibody fragment can be used.
[0029]
If the anti-human HL antibody of the present invention, a fragment thereof or a label thereof is used, HL in a human blood-derived sample can be detected or quantified easily and with high sensitivity.
Although it does not specifically limit as a human blood origin specimen, For example, plasma, serum, etc. are mentioned.
[0030]
In order to measure the specimen, an immunological measurement method may be performed using the antibody obtained above. As a measuring method, an immunoturbidimetric method, an enzyme immunoassay method, a latex immunoassay method, a radioimmunoassay, a phloreumnoassay, an immunochromatographic assay, an optical immunoassay method and the like can be used. As the measurement system of the present invention, radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (FIA), immunoturbidimetric method, immunoprecipitation method, using the obtained antibody against human HL, Human HL can be measured by constructing a known immunoassay method such as immunochromatography. It is advantageous to use an enzyme as a label, and as the enzyme, peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase and the like are suitable. It is also advantageous to use a label that can be discriminated visually, such as gold colloid, latex, or carbon particles.
[0031]
One example of an immunoassay is a so-called competitive immunoassay. For example, a certain amount of human HL labeled with a radioisotope or the like is mixed in the sample, and further anti-human HL antibody is mixed to react the human HL and labeled human HL in the sample. Since the human HL in the sample competes with the labeled human HL and reacts with the anti-human HL antibody, the reaction with the labeled human HL is reduced by the presence of the human HL in the sample. After the reaction, the anti-human HL antibody is bound to a solid phase carrier in advance, or the anti-immunoglobulin antibody, protein A and anti-human HL antibody are reacted to separate bound and unlabeled human HL. It is possible to measure human HL by washing a fraction that is not bound by a generally used method and detecting a labeled radioisotope or the like.
[0032]
Another example of an immunoassay is the so-called sandwich system. For example, anti-human HL antibody is bound to a carrier generally used in immunoassay methods such as microtiter plates, beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, etc. React with anti-human HL antibody. A fraction that is not bound by a commonly used method, washed with a radioisotope, enzyme, fluorescent substance, biotin labeled anti-human HL antibody, and human bound to the anti-human HL antibody on the carrier React with HL. It is possible to measure human HL by washing the fraction not bound by a generally used method and detecting the labeled radioisotope, enzyme, fluorescent substance, biotin and the like. Alternatively, a visually identifiable substance such as colloidal gold, latex, or carbon particles may be labeled on one of the aforementioned antibodies, and applied to the above-described sandwich system or competition method for determination. As the anti-human HL antibody and labeled anti-human HL antibody used in this measurement system, any of a monoclonal antibody, a polyclonal antibody, or a combination thereof can be used.
[0033]
What is important here is to combine the antibodies so that the complex of the antibody that binds to the carrier and human HL can be bound to the labeled antibody. It can be selected by applying it to the system.
[0034]
An agglutination assay is also an advantageous embodiment, producing particles coated with one of the aforementioned antibodies and particles coated with the other antibody. Aggregation occurs due to the binding of the particles to the substance to be detected, which can determine or detect changes in turbidity. In the case of sandwich ELISA, which is an immunoassay that can measure a typical human HL protein concentration, the monoclonal antibody 3A2 of the present invention is immobilized on a plastic plate, and the polyclonal antibody or tertiary antibody of the present invention is used as a secondary antibody. It is preferable to use a peroxidase-labeled anti-rabbit antibody.
[0035]
Human HL contained in a sample can be separated or purified by affinity chromatography using an immobilized anti-human HL antibody or fragment obtained by immobilizing the anti-human HL antibody or fragment of the present invention on an insoluble carrier. .
[0036]
Examples of such insoluble carriers used for separation or purification of human HL include: (1) Plates made of water-insoluble substances such as polystyrene resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, and other water-insoluble substances; In addition to tubes or tubes having internal volume, beads, balls, filters, membranes, etc. (2) Cellulosic carriers, agarose carriers, polyacrylamide carriers, dextran carriers, polystyrene carriers, polyvinyl alcohol A system carrier, a polyamino acid carrier, a porous silica carrier and the like can be used.
[0037]
As such affinity chromatography, for example, (a) using the filter, membrane, etc. of (1) above as an insoluble carrier, the anti-human HL antibody of the present invention or an antibody fragment thereof is immobilized thereon, and then this insoluble carrier is used. A method of separating human HL contained in a sample by bringing the sample into contact with the sample, (b) using a cellulose-based carrier as in (2) above as an insoluble carrier, and the anti-human HL antibody of the present invention or The antibody fragment is immobilized by a conventional method (physical adsorption, polymerization by crosslinking, sealing in a matrix or immobilization by noncovalent bonding, etc.), and this insoluble carrier is a column made of glass, plastic or stainless steel. And a sample (for example, body fluid sample such as plasma, serum, etc.) There is by eluting through a centrifugal supernatant, etc.), and a method of separating or purifying the human HL contained in the sample.
[0038]
Specific examples of the insoluble carrier (2) used in the affinity chromatography (b) above are not particularly limited as long as the anti-human HL antibody of the present invention or an antibody fragment thereof can be immobilized. Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B, CNBr-Activated 4B, AH-Sepharose 4B, CH-Sepharose 4B, Activated CH-Sepharose 4B, Epoxy-activated Sepharose 6B, Activated by Amersham Pharmacia biotech Bio-Gel A, Cellex, Cellex AE manufactured by Bio-Rad, such as thiol-Sepharose 4B, Sephadex, CM-Sephadex, ECH-Sepharose 4B, EAH-Sepharose 4B, NHS-activated Sepharose or Thiopropyl Sepharose 6B , Cellex-CM, Cellex PAB, Bio-Gel P, Hydrozide Bio-Gel P, Aminoethyl Bio-Gel P, Bio-Gel CM, Affi-Gel 10, Affi-Gel 15, Affi-Prep 10, Affi-Gel Hz, Affi-Prep Hz, Affi-Gel 102, CMBio-Gel A, Affi-Gel heparin, Affi-G el 501 or Affi-Gel 601 etc., Chromagel A, Chromagel P, Enzafix P-HZ, Enzafix P-SH or Enzafix P-AB from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., AE- from Serva Cellurose, CM-Cellurose, PAB Cellurose, etc. can be mentioned.
[0039]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited to these Examples.
[0040]
Example 1 (Production of recombinant human HL protein)
(1)Preparation of cDNA encoding human HL
Using a commercially available cDNA library derived from human liver (Takara Shuzo Co., Ltd.) as a template, specific primers [sense primer: 5'-GGAATTCGGACAAAGCCTGAAACCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 5), antisense primer: 5′-GTTTCGCTTTCTAGTCTACTCCTAGGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)] was used for PCR under the following conditions to clone human HL cDNA. That is, a DNA fragment amplified by PCR using a specific primer was cleaved with two kinds of restriction enzymes EcoRI and BamHI under the following conditions, and then separated by agarose electrophoresis by a conventional method to obtain a DNA of about 1.4 Kbp. The fragment was cut out together with the gel and then extracted with Geneclean II (manufactured by BIO 101) to obtain the target cDNA fragment.
[0041]
<PCR reagent conditions>
Takara Ex TaqTM(5units / μl) 0.25-0.5μl
10X Ex TaqTM Buffer 10 μl
dNTP Mixture (2.5mM each) 8μl
Template (cDNA library) 1 μl
Primer (SEQ ID NO: 5) 0.2 to 1.0 μl
Primer (SEQ ID NO: 6) 0.2-1.0 μl
Sterile distilled water to a final volume of 100 μl
[0042]
<PCR temperature reaction conditions>
95 ° C, 5.0 minutes
The following 3 steps were repeated 37 times.
95 ° C, 0.5 minutes
65 ° C, 1.0 minute
72 ° C, 2.0 minutes
[0043]
<Restriction enzyme reaction conditions>
Restriction enzyme buffer (50 mM NaCl, 100 mM Tirs-HCl, 10 mM MgCl) per 10 μl of each PCR product obtained2, 0.025% Triton X-100, pH 7.5) and 2 μl of restriction enzymes EcoRI and BamHI (manufactured by BioLabs) were added and reacted overnight at 37 ° C. for digestion.
[0044]
The thus obtained DNA fragment of about 1.4 Kbp was cleaved with two kinds of restriction enzymes EcoRI and BamHI using the DNA Ligation Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) under the above conditions. Inserted into a vector (BioLabs). Subsequently, this pMAL-p2_HL vector was introduced into E. coli JM109 competent cell (manufactured by Invitrogen). Furthermore, plasmid DNA was extracted from this Escherichia coli, the plasmid DNA was sequenced, and the base sequence of the target cDNA fragment of about 1.4 Kbp was confirmed. The PCR product of about 1.4 Kbp obtained in this way was confirmed to be cDNA encoding the target human HL.
[0045]
(2)Preparation of recombinant human HL protein
100 μg / ml of E. coli transformed with the plasmid (pMAL-p2_HL vector) constructed so that the cDNA of human HL obtained above was incorporated downstream of maltose binding protein (MBP) and expressed as a binding protein of MBP and HL. Inoculated into 5 mL of LB medium containing mL of Ampicillin and cultured overnight at 37 ° C. with shaking. This culture solution was inoculated into 100 mL of LB medium containing 100 μg / mL ampicillin and 0.3 mM isopropylthiogalactoside (IPTG), and cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours. The culture solution is collected by centrifugation (4,000 × g, 10 min), and the cells are 20 mM Tris buffer (pH 7.4) containing 200 mM NaCl and 1 mM EDTA (hereinafter referred to as buffer solution (A)). ) And suspension (4000 × g, 10 min) to wash the cells. The cells were suspended in 100 mL of the buffer solution (A) and then sonicated to disrupt the cells. This was centrifuged (9,000 × g, 10 min), and the supernatant was recovered to obtain a crude enzyme solution. The obtained crude purified enzyme was added to an amylose resin (manufactured by BioLabs) filled in a glass column tube and equilibrated with buffer (A). The adsorbed enzyme was sufficiently washed with the buffer (A) and then eluted with a buffer (A) containing 10 mM maltose. The elution pattern was observed by absorbance at a wavelength of 280 nm, and a purified recombinant human HL-MBP binding protein fraction was obtained.
[0046]
Example 2(Preparation of anti-human HL monoclonal antibody)
(A)Selection and preparation of immune antigen
In order to use a highly hydrophilic site in an amino acid sequence considered to be a site exposed to the outside as a protein structure in general for screening of immune antigens or hybridoma cells, the protein structure of human HL was analyzed. Dedicated software DNASIS-Macv.3.6 (manufactured by Hitachi Software) was used for the analysis of the base sequence and amino acid sequence. As a hydrophilic region estimation method which is easily presented as an antigen recognition site, Hopp & Woods method, Procedural National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), Vol. 78, 3824- 3828, 1981). In addition, when an animal species is immunized with a heterologous antigen, the amino acid sequence presented as the antigen is considered to be important because it is important to immunize a region where the species difference of the animal is clearly recognized in the amino acid of the antigen. A search was performed and sequences with more species differences were selected. Hydrophobicity was calculated from the amino acid sequence of human HL. As a whole, it is highly hydrophobic, but there are hydrophilic regions at the N-terminal, central part and C-terminal. As a result of homology search (Multiple alignment) between HL amino acid sequences of animals whose gene sequences have been determined, there is almost no difference in animal species in the HL amino acid sequence as a whole, and only slight species differences are observed at the N-terminus and C-terminus. It was. Prediction of the above hydrophobic site and homology evaluation of amino acid sequences of different HL in the animal from which it was derived, and further, structural properties of individual amino acids and binding properties to the carrier are comprehensively determined to use them as antigens or produce antibodies The sequence used for hybridoma selection was determined.
[0047]
From the above viewpoint, the peptide synthesized and used in this example is a peptide consisting of amino acid sequences 24 to 43 in the human HL amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO: 1; hereinafter referred to as “peptide 1”). A peptide consisting of the 45th to 63rd amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 2”), a peptide consisting of the 255th to 275th amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 3”), and a peptide consisting of the 330th to 338th amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 3”). The peptide consisting of the 367-385th amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 5”), the peptide consisting of the 428-446th amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 6”), the 467-476th position. A peptide comprising the amino acid sequence (hereinafter referred to as “peptide 7”), the 490th to 499th amino acids Peptide consisting acid sequence; and (SEQ ID NO: 2 or less "peptide 8") and. These peptides were synthesized by tBOC (tert-butyloxylcarbonyl) method, Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) method and the like.
[0048]
Keyhole limpet hemocyanin (KLH) was used as the carrier protein for the method of binding the synthetic peptide and the carrier protein. 10 mg of KLH for carrier (PIERCE) is dissolved in 1 mL of distilled water, 2 mg of Sulfo-SMCC (PIERCE) is dissolved in 1 mL of distilled water, 100 μl thereof and 200 μl of KLH solution are mixed, Stir at room temperature for 1 hour. This was added to PD-10 (manufactured by Pharmacia Biotech) equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4). Elution was performed with 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4), and the elution pattern was measured by absorbance at a wavelength of 280 nm. After recovering maleimide-activated KLH according to the elution pattern, add 0.5 mL of synthetic peptide (4 mg / mL distilled water), stir at room temperature for 2 hours, dialyze against 100 volumes of PBS, and measure immune antigen or enzyme immunoassay. Subject to law.
[0049]
(B) Identification of immune response dominant site of protein
(B-1) Immunizing a mammal with the protein antigen expressed in (a), reacting the obtained antiserum with a carrier on which the peptide synthesized in (a) is immobilized, and identifying the antiserum The process of specifying the immune response dominant site by evaluating the distribution of antibody groups against the peptides was performed as follows.
[0050]
When recombinant human HL is used, the immunization method is as follows: 8-10 week old BALB / c mice subcutaneously, intravenously or intraperitoneally, purified recombinant human HL is mixed with an appropriate adjuvant [for example, Freundo adjuvant or Immunized for the first time (day 0) by injection together with Ribi Ajuvant System (manufactured by RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH) Purified recombinant human HL was administered on days 14, 28 and 42 from the first immunization. Booster immunization was performed by injection subcutaneously or intraperitoneally, and whole blood was collected 2 weeks after the final administration, and the serum was obtained.When a conjugate of synthetic peptide and carrier protein was used, 0.3 mg of conjugate Freund's Complete adjuvant (Freud's Complete adjuvant, manufactured by Sigma) was mixed in equal amounts and immunized by injection into dozens of skins on the limbs and back of the rabbit. The whole blood was collected and the serum was obtained 2 weeks after the final administration, and the enzyme immunoassay method in which a synthetic peptide synthesized after the logical and strategic selection shown below was immobilized. The antibody group in mouse serum was assayed.
[0051]
(B-2) An antigen obtained by binding the peptide synthesized in (a) to a carrier protein, and mixing each peptide and the conjugate of the carrier protein in equal amounts, or mixing each peptide in equal amounts to obtain a carrier protein Mammals are immunized with the antigen bound to the antibody, and the resulting antiserum is reacted with the carrier on which the peptide synthesized in (a) is immobilized, and the distribution of antibodies against specific peptides in the antiserum is evaluated. Thus, the step of specifying the immune response dominant site was performed as follows.
[0052]
Regarding the conjugate of the synthetic peptide and the carrier, each synthetic peptide is bound to the carrier to obtain a conjugate with the carrier, and (1) the equivalent of the conjugate of peptide 2, 4 to 8 with the carrier. Uses two types of immune antigens: (1) mixed antigens mixed with equal amounts of conjugates of peptide 1 and 2 carriers, eliminating the inconvenience of immunizing rabbits with each peptide, and saving labor Achieved. The obtained antiserum was assayed for antibody groups in mouse serum using the enzyme immunoassay method in which the synthetic peptide shown below was immobilized.
[0053]
Peptides 1-8 were dissolved in high purity distilled water at a concentration of 1 mg / mL. Each dissolved peptide was prepared at a concentration of 10 μg / mL in a 20 mM phosphate buffer (pH 7.4: hereinafter referred to as PBS) containing 150 mM NaCl, and then dispensed at 50 μl / well into a 96-well EIA plate for 2 hours at room temperature. The antigen was immobilized on the plate. After washing twice with PBS containing 0.05% Tween 20 (hereinafter referred to as T-PBS), 350 μl / well of blocking reagent (Block Ace, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was dispensed and allowed to stand at room temperature for 1 hour. The protein binding residue on the bottom surface was blocked. After washing twice with T-PBS, each of the mouse serum and rabbit serum prepared above as T-PBS is diluted 100 times as the primary antibody, then dispensed in 50 μl / well and left at room temperature for 2 hours. . After washing twice with T-PBS, 50 μl / well of a 50000-fold diluted solution of goat anti-mouse immunoglobulin-peroxidase conjugate and anti-rabbit immunoglobulin-peroxidase conjugate (TAGO) was used as the second antibody. And left at room temperature for 1 hour. After washing twice with T-PBS, the OPD substrate solution (60 mg of o-phenylenediaminediamine dihydrochloride in 20 mL of citrate / phosphate buffer (pH 5.2) was dissolved in 30% peroxide. A solution containing 20 μl of hydrogen) is dispensed at 50 μl / well, and after color development, a 1.5 N sulfuric acid solution is dispensed at 50 μl / well to stop the reaction. Absorbance is measured with a plate reader at a main wavelength of 492 nm and a sub-wavelength of 620 nm. Sera obtained by immunizing mice with recombinant human HL was obtained by immunizing rabbits with an immunizing antigen obtained by mixing equal amounts of antiserum (a) and peptide 2, 4-8 conjugate with a carrier. Antiserum (c) was obtained by immunizing rabbits with an immunizing antigen in which equal amounts of serum and antiserum (b) and a conjugate of peptide 1 and 2 were combined. The results are shown in Table 1 and FIG.
[0054]
[Table 1]
Figure 0004838436
[0055]
In the serum obtained by immunizing mice with recombinant human HL, the antibody group against peptide 1 is predominant in antiserum (a), and peptide 1 is an immune response dominant site in the amino acid sequence of human HL. It was.
In antiserum (b), the serum obtained by immunizing an immunizing antigen rabbit mixed with equal amounts of the conjugates of peptides 2 and 4 to 8 with the carrier has a predominantly antibody group against peptide 8, and peptide 8 However, it became clear that it is an immune response dominant site in the amino acid sequence of human HL.
In antiserum (c), the serum obtained by immunizing rabbits with an immunizing antigen mixed with equal amounts of the conjugates of the peptides 1 and 2 with the carrier, the antibody group against peptide 1 is predominant over peptide 2. Peptide 1 was the immune response dominant site in the amino acid sequence of human HL.
[0056]
From the above results, when producing an anti-human HL monoclonal antibody, antibody-producing cells are obtained by immunizing a mammal with peptide 1 or 8, and the antibody-producing cells and myeloma cells having no autoantibody-producing ability ( It was revealed that the hybridoma can be produced by preparing a hybridoma from a myeloma cell), cloning the hybridoma, and selecting a clone that produces a monoclonal antibody having specific affinity for the antigen used for immunization of the mammal. .
Similarly, when producing an anti-human HL polyclonal antibody, it became clear that antiserum can be obtained and produced by immunizing a mammal with peptide 1 or 8.
In addition, it was found that when an anti-HL antibody against peptide 1 is obtained, a mouse or rabbit is suitable as the mammal, and when an anti-HL antibody against peptide 8 is obtained, rabbit is preferred as the mammal.
[0057]
(C) Production of antibodies against immune response dominant sites in proteins
(C-1) Immunizing a mammal with an antigen in which a peptide corresponding to an immune response dominant site in the protein revealed in (b) is bound to a carrier protein, and spleen cells and myeloma cells of the immunized animal The hybridoma cells obtained are reacted with a carrier in which two types of antigens, a recombinant protein and a peptide corresponding to the immune response dominant site, are immobilized respectively, and the immune response dominant site is recognized and high in protein. The process of producing a monoclonal antibody by screening hybridoma cells having binding specificity (antigen recognition specificity) was performed as follows.
[0058]
The immunization method involves subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in a BALB / c mouse of 8 to 10 weeks old, a conjugate of peptide 1 with a suitable adjuvant (for example, Freundajuband or Libijjuband system). (RIBI Ajuvant System, manufactured by RIBI IMMUNOCHEM RESEARCH) for the first immunization (day 0) On the 14th, 28th and 42nd days from the first immunization, the peptide 1 conjugate with the carrier was administered subcutaneously or Booster immunization was performed by injection into the abdominal cavity, and immunization was performed in the same manner two days before and after the preparation of the monoclonal antibody-producing hybridoma described below. Spleen cells were prepared from mice and used for cell fusion.
[0059]
8-Azaguanine resistant mouse myeloma cells P3-U1 were cultured in normal medium (RPMI-1640 plus 1.5 mM glutamine and 13% fetal calf serum) (37 ° C., CO25% aeration) and 2 × 10 after 4 days7The above cells were obtained.
[0060]
Immunized mouse splenocytes 1 × 10 thoroughly washed with RPMI-1640 (manufactured by Nissui Pharmaceutical)8And mouse myeloma cells 2 × 107And was centrifuged at 1500 rpm for 5 minutes.
After loosening the mixed cells of splenocytes and P3-U1 obtained as a precipitate, 1 mL of 50% polyethylene glycol and 10% DMSO mixed solution was added with stirring, and RPMI-1640 was gradually added after 2 minutes. In addition, the total volume was adjusted to 50 mL. After centrifuging at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is discarded, and the cells are loosened gently.-FourM, thymidine 1.5 × 10-FiveM and aminopterin 4 × 10-730 mL of medium supplemented with M), gently suspend the cells with a 5 mL volumetric pipette, and add 5% CO2The cells were cultured at 37 ° C. for 2 hours in an incubator. After centrifuging at 1500 rpm for 5 minutes, discard the supernatant, loosen the cells gently, suspend in HAT medium, and dispense 200 μl / well into a 96-well culture plate.2The cells were cultured at 37 ° C. for 10 to 14 days in an incubator.
[0061]
Screening for hybridomas producing anti-human HL monoclonal antibodies was performed using an enzyme immunoassay with an antigen immobilized.
Recombinant human HL and peptide 1 prepared in Example 1 were prepared in PBS at a concentration of 1 μg / mL, then dispensed into a 96-well EIA plate at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 2 hours, and the antigen was immobilized on the plate. Turned into. T-PBS was dispensed at 350 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block protein-binding residues on the bottom surface. After washing twice with T-PBS, 50 μL / well of T-PBS was dispensed, and as a primary antibody, the hybridoma culture supernatant was transferred to a 96-well EIA plate at 100 μl / well in a clean bench at 4 ° C. Left overnight or at room temperature for 2 hours. After washing twice with T-PBS, as a second antibody, a 5000-fold diluted solution of goat anti-mouse immunoglobulin-peroxidase conjugate (manufactured by TAGO) was dispensed at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing twice with T-PBS, OPD substrate solution (60 mg of o-phenylenediamine dihydrochloride in 20 mL of citrate / phosphate buffer (pH 5.2) was dissolved in 30% hydrogen peroxide. 20 μl / solution) is dispensed at 50 μl / well and after color development, 1.5 N sulfuric acid solution is dispensed at 50 μl / well to stop the reaction. Absorbance was measured with a plate reader at a main wavelength of 492 nm and a subwavelength of 620 nm.
[0062]
With respect to the holes in which the hybridoma producing the anti-HL monoclonal antibody was observed, cloning was repeated 2 to 4 times by the limiting dilution method, and the one in which antibody production was stably recognized was selected as the anti-HL monoclonal antibody-producing hybridoma strain. The established hybridoma 3A2 was deposited with the deposit number FERM P-18181 at the Biotechnology Institute of Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry on January 24, 2001.
[0063]
(C-2) Large-scale preparation of monoclonal antibodies
Each of the above hybridoma strains was treated with pristane-treated mice (BALB / c) treated with pristane (0.5 mL / mouse of 2,6,10,14-tetramethylpentadecane intraperitoneally and bred for 1-2 weeks). 1 × 106Individual cells / mouse were injected intraperitoneally. After 10 to 21 days, the hybridoma strain became ascites tumor, and ascites (4 to 10 mL / animal) was collected from a mouse having ascites in the abdominal cavity and centrifuged to remove solids. The supernatant was salted out with 50% ammonium sulfate and dialyzed overnight against PBS to obtain a crudely purified monoclonal antibody.
[0064]
(C-3) Immunizing a mammal with an antigen obtained by binding a peptide corresponding to an immune response dominant site in the protein identified in (b) to a carrier protein, recognizing the immune response dominant site, A step of producing antiserum and polyclonal antibody having high binding specificity (antigen recognition specificity), and reacting the antiserum with a carrier on which a peptide corresponding to an immune response dominant site is immobilized, followed by a conventional method After isolating the carrier, the antibody fraction was fractionated from the carrier and the polyclonal antibody group having high binding specificity (antigen recognition specificity) was concentrated as follows.
[0065]
0.1 to 0.3 mg of the conjugate of peptide 1 or 8 prepared in (a) above and carrier (KLH) and Freund's Complete adjuvant (manufactured by Sigma) are mixed in equal amounts, and the rabbit limbs are mixed. And immunization was carried out by injection into dozens of skins on the back. The same administration was performed 5 to 6 times during 2 to 3 months. Two weeks after the final administration, whole blood was collected and its serum was obtained. The serum was salted out with 50% ammonium sulfate and dialyzed overnight against PBS to obtain a crude purified polyclonal antibody.
[0066]
(C-4)(Purification of anti-human HL antibody, monoclonal antibody and polyclonal antibody)
To the crude monoclonal antibody 3A2 obtained above and the roughly purified polyclonal antibody, an equal amount of MAPS II binding buffer (Bio-Rad) is added and filtered through a 0.45 μm filter (Millipore). Removed the sink. The obtained filtrate was added using a HiTrap Protein A affinity column (Pharmacia Biotech). After washing with MAPS II binding buffer, elution was performed with MAPS II elution buffer (Biorad) (3 mL / tube, about 10 tubes). The elution pattern was measured by absorbance at a wavelength of 280 nm, and the fraction containing the antibody was collected according to the elution pattern.
(C-5)(Determination of isotype)
Using a mouse monoclonal antibody isotype determination kit (manufactured by ZYMED), the operation was performed according to the experimental operation protocol attached to the kit, and the isotype of monoclonal antibody 3A2 was determined. 3A2 is IgG2a, Κ.
[0067]
Example 3 (Purification of human HL by affinity chromatography)
High-purity human HL was purified by affinity chromatography using the purified monoclonal antibody 3A2 prepared in Example 2 from human PHP.
(1) Preparation of immobilized monoclonal antibody (adsorbent for column packing)
The operation was performed using CNBr-activated Sepharose 4B (CNBr-activated Sepharose 4B, Pharmacia Biotech) according to the attached protocol. CNBr activated Sepharose 4B is swollen with 1 mM hydrochloric acid for 20 minutes and washed with 1 mM hydrochloric acid on a Buchner funnel with a glass filter with G3 grade pores. The gel was suspended in a buffer solution of 0.1 M sodium bicarbonate (pH 8.3) containing 0.5 M sodium chloride (hereinafter referred to as binding buffer), and the antibody dialyzed overnight against the binding buffer was added. Mix for 2 hours at room temperature to bind antibody to gel. After centrifuging at 11000 rpm for 5 minutes, the supernatant is removed, suspended in 0.1 M Tris buffer (pH 8.0), and left at room temperature for 2 hours. After filtration through a glass filter, the glass filter is washed alternately with 0.1 M acetate buffer (pH 4.0) containing binding buffer and 0.5 M sodium chloride. Finally, it is suspended in an appropriate amount of PBS and packed in a column.
[0068]
(2) Purification by heparin sepharose 4B chromatography
Peripheral blood after heparin load collected from a plurality of healthy individuals was centrifuged to remove blood cells and obtain human plasma PHP, which was stored at −80 ° C. until use. 200 mL of human plasma stored at −80 ° C. was dissolved in a 37 ° C. constant temperature bath and centrifuged (5000 × g, 30 min, 4 ° C.) to remove insoluble matters.
This PHP was packed in a glass column tube (2 × 40 cm, manufactured by Bio-Rad) and equilibrated with 5 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.3 M NaCl and 10% Glycerol. Added to 4B. After washing with 5 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.3 M NaCl and 10% Glycerol, 5 mM phosphate buffer containing 0.3 to 1.5 M NaCl, 10% Glycerol ( Concentration elution was performed at pH 7.4) (8 mL / tube, 65 tubes). The fractionation state of HTGL and LPL was assayed using an enzyme immunoassay in which the absorbance at a wavelength of 280 nm and the fractionated fractions shown below were immobilized on an elution pattern.
[0069]
Each fraction was fractionated into a 96-well EIA plate at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 2 hours to be immobilized on an antigen plate. T-PBS was dispensed at 350 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour to block protein-binding residues on the bottom surface. After washing twice with T-PBS, 50 μl / well of T-PBS was dispensed, and as the primary antibody, purified anti-human HL monoclonal antibody 3A2 prepared in Example 3 and purified anti-LPL monoclonal antibody (special Monoclonal antibodies described in Kaihei 05-223822 are suitable), diluted to a concentration of 10 μg / mL, dispensed 50 μl / well, and left at room temperature for 2 hours. After washing twice with T-PBS, as a second antibody, a 5000-fold diluted solution of goat anti-mouse immunoglobulin-peroxidase conjugate (manufactured by TAGO) was dispensed at 50 μl / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing twice with T-PBS, OPD substrate solution (60 mg of o-phenylenediamine dihydrochloride in 20 mL of citrate / phosphate buffer (pH 5.2) was dissolved in 30% hydrogen peroxide. 20 μl / solution) is dispensed at 50 μl / well and after color development, 1.5 N sulfuric acid solution is dispensed at 50 μl / well to stop the reaction. Absorbance was measured with a plate reader at a main wavelength of 492 nm and a subwavelength of 620 nm.
[0070]
The results are shown in FIG. The HL protein detected by the purified anti-human HL monoclonal antibody 3A2 prepared in Example 2 was eluted at a NaCl concentration of about 0.8 M, and Chao-Fu Cheng et al. (The Journal of Biological Chemistry ( The Journal of Biological Chemistry), Vol. 260, No. 19, pp. 10720-10727, 1985), and the anti-human HL monoclonal antibody 3A2 of the present invention specifically inhibits human HL. Indicates that it is recognized. In addition, the anti-human HL monoclonal antibody 3A2 of the present invention shows no cross-reactivity with LPL eluted at a NaCl concentration of about 1.5 M detected by the anti-LPL monoclonal antibody. Antigen-antibody reaction is observed. (2) It was proved that no antigen-antibody reaction was observed at least against human lipoprotein lipase.
[0071]
(3) Purification by affinity chromatography
The solution containing HL prepared in (2) above was dialyzed overnight against PBS and then added to the affinity column prepared in (1). The column was washed with PBS and eluted with PBS containing 3M NaSCN, and the pattern of the eluted fraction was measured by absorbance at a wavelength of 280 nm. The results are shown in FIG. According to the elution pattern, fractions containing human HL were collected and dialyzed with PBS to prepare purified human HL with extremely high purity.
[0072]
Analysis was performed by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) according to a conventional method. The results are shown in FIG. As a result of evaluating the molecular weight and purity using electrophoresis / spot image analysis software Densitograph Ver.4.03C (manufactured by Atto Co., Ltd.), it was confirmed that it was composed of one kind of molecular weight of about 65,000 and had extremely high purity.
[0073]
Example 4
Establishment of quantitative method for human HL by sandwich ELISA
(1) Preparation of immobilized antibody
Purified monoclonal antibody 3A2 or purified polyclonal antibody was diluted to 10 μg / mL in PBS, dispensed 50 μl / well into a 96-well EIA plate, and allowed to stand at room temperature for 2 hours to immobilize the antibody on the plate. After washing twice with T-PBS, T-PBS containing 1% BSA was dispensed at 350 μl / well and left at room temperature for 1 hour to block protein-binding residues on the bottom surface. After removing the contents, 350 μl / well of T-PBS containing 1% BSA and 10% sucrose was dispensed at room temperature for 1 hour, and then the contents were removed and air-dried.
[0074]
(2) Peroxidase labeling of monoclonal and polyclonal antibodies
In a solution of peroxidase (hereinafter referred to as HRP) dissolved in 5 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) at a concentration of 10 mg / mL, a solution of sodium metaperiodate dissolved in distilled water at a concentration of 1000 mg / mL. , HRP: sodium metaperiodate = 1 mg: 0.43 mg, and allowed to react in the dark at room temperature for 30 minutes. Next, the reaction solution was added to a Sephadex G-25 column (1.5 × 30 cm, manufactured by Pharmacia Biotech) equilibrated with 5 mM sodium acetate buffer (pH 4.5), and the activated HRP fraction was added. It was collected. Next, the activated HRP fraction was mixed at a weight ratio of 1: 1 to a solution obtained by dialyzing the purified monoclonal antibody and polyclonal antibody with 0.1 M sodium bicarbonate buffer (pH 9.3) overnight. For 1 hour. After the reaction, a solution prepared by dissolving sodium tetrahydroborate in distilled water at a concentration of 2 mg / mL was mixed with 10 μl of 500 μl of the reaction solution, and allowed to react in the dark at room temperature for 15 minutes. After the reaction, an equal amount of saturated ammonium sulfate was added and left on ice for 1 hour. After centrifugation at 12,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed to recover the HRP-labeled antibody and suspended in PBS. The absorbance at a wavelength of 280 nm was measured, and the following test was performed using the absorbance.
[0075]
(3) Quantitative system by sandwich ELISA (2 antibody method)
The solid-phased antibody, monoclonal antibody or polyclonal antibody (hereinafter referred to as solid-phased microplate) prepared in (1) is used. Measurement samples diluted with PBS containing 0.2% BSA and 0.05% Triton X-100 (hereinafter referred to as BT-PBS) in each well of the solid-phased microplate (pre-heparin-loaded plasma, PHP, purification) HL) was added in 50 μl / well and incubated at room temperature for 2 hours. After washing the solid-phased microplate twice with T-PBS, 50 μl / well of the HRP-labeled monoclonal antibody or polyclonal antibody solution prepared in (2) diluted with BT-PBSB was dispensed and incubated at room temperature for 1 hour. . After washing the solid-phased microplate twice with T-PBS, the OPD substrate solution (60 mg of o-phenylenediamine dihydrochloride was dissolved in 20 mL of citrate / phosphate buffer (pH 5.2), 30 After adding 50 μl / well of a solution containing 20% of hydrogen peroxide and coloring, 1.5 N sulfuric acid solution was dispensed in 50 μl / well, and the reaction was stopped. The measurement was performed at 492 nm and a subwavelength of 620 nm.
[0076]
(4) Quantification system by sandwich ELISA (3 antibody method)
The solid-phased antibody prepared in (1), monoclonal antibody 3A2 (hereinafter, solid-phased microplate) is used. 50 μl / well of a measurement sample (plasma before heparin loading, PHP, purified HL) diluted with BT-PBS was added to each well of the solid-phased microplate and incubated at room temperature for 2 hours. After washing the solid-phased microplate twice with T-PBS, 50 μl / well of a solution obtained by diluting the polyclonal antibody with BT-PBS to 10 μg / mL as the second antibody was dispensed and incubated at room temperature for 1 hour.
The solid-phased microplate was washed twice with T-PBS, and a 5000-fold diluted solution of goat anti-rabbit immunoglobulin-peroxidase conjugate (manufactured by TAGO) as a third antibody was dispensed at 50 μl / well at room temperature. And left for 1 hour. After washing the solid-phased microplate twice with T-PBS, the OPD substrate solution (60 mg of o-phenylenediamine dihydrochloride was dissolved in 20 mL of citrate / phosphate buffer (pH 5.2) 30 After adding 50 μl / well of a solution containing 20% of hydrogen peroxide, the reaction was stopped by dispensing 50 μl / well of a 1.5 N sulfuric acid solution. The measurement was performed at 492 nm and a subwavelength of 620 nm.
Alternatively, TMB substrate (manufactured by PIERCE) was dispensed at 50 μl / well and after color development, a 2.0 N sulfuric acid solution was dispensed at 50 μl / well to stop the reaction. Absorbance was measured at 450 nm with a plate reader. The HL concentration in the specimen was determined from a calibration curve prepared using purified HL and standard PHP as standard substances, respectively.
[0077]
(5) Calibration curve preparation (purified HL)
A calibration curve was prepared using the sandwich ELISA established in (4) using the purified HL prepared in Example 3 as a standard substance. The results are shown in FIG. A good calibration curve was obtained in the concentration range of 10 to 1000 ng / mL (y = 0.315 Ln (x) -0.5275, correlation coefficient: R2= 0.9963). From this calibration curve, the HL concentration in the subject was calculated.
[0078]
(6) Accuracy confirmation of measurement system
From the calibration curve created in (5), simultaneously measured PHP was multiplied 40 times, 80 times and 160 times, and the HL concentration at each point was calculated to confirm the accuracy of the measurement system from the dilution linearity. . The results are shown in FIG. Good dilution linearity was exhibited up to 40 to 160 times (y = 894.41x−0.9684, correlation coefficient: R2= 0.9857).
[0079]
(7) Specificity of sandwich ELISA system
In order to examine the specificity, after measuring the plasma before heparin loading and plasma after heparin loading (PHP) 40 times, 80 times and 160 times, the HL concentration at each point was calculated to confirm the specificity. The results are shown in FIG. Heparinized plasma (PHP) has good dilution linearity up to 40-160 times (y = 551.94x + 2.2692, correlation coefficient: R2= 0.9816), heparin was intravenously injected, and HL anchored on the surface of hepatic endothelial cells was taken out in the blood in a free state, and it was revealed that it was specifically measured. On the other hand, the plasma before heparin loading is a state in which HL is anchored on the surface of hepatic endothelial cells, and there is almost no HL present free in the blood, but a very small amount of HL (y = 2.878x + 5.3756, correlation function: R2= 0.9322) could be measured.
[0080]
【The invention's effect】
Since the anti-human HL antibody of the present invention has high specificity for human HL and does not react with LPL, it is useful as an antibody for measuring human HL. Therefore, if the antibody of the present invention is used, human HL can be measured easily and with high sensitivity, which is advantageous for arteriosclerosis and liver function diagnosis.
[0081]
[Sequence Listing]
Figure 0004838436
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[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the results of specifying an immune response dominant site of human HL.
FIG. 2 is a diagram showing the results of testing the fractionated state of HTGL and LPL using an enzyme immunoassay method in which a fraction fractionated by heparin sepharose 4B chromatography is solid-phased.
FIG. 3 is a diagram showing a chromatogram of human HL by affinity chromatography using monoclonal antibody 3A2.
FIG. 4 is an electrophoretogram showing the degree of purification of human HL purified by affinity chromatography using monoclonal antibody 3A2.
FIG. 5 is a diagram showing a calibration curve of a method for quantifying human HL by sandwich ELISA established according to the present invention.
FIG. 6 is a diagram showing the accuracy of a method for quantifying human HL by sandwich ELISA established according to the present invention.
FIG. 7 is a graph showing the specificity of a method for quantifying human HL by sandwich ELISA established according to the present invention.

Claims (6)

配列番号2で示されるアミノ酸配列を認識する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体又はそのフラグメント。An anti-human hepatic triglyceride lipase antibody or a fragment thereof that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. ハイブリドーマ3A2(FERM P−18181)より産生される、配列番号1で示されるアミノ酸配列を認識する抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼモノクローナル抗体3A2又はそのフラグメント。Anti-human hepatic triglyceride lipase monoclonal antibody 3A2 or a fragment thereof that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 produced from hybridoma 3A2 (FERM P-18181). ハイブリドーマ3A2(FERM P−18181)。  Hybridoma 3A2 (FERM P-18181). 請求項1又は2記載の抗体又はフラグメント又はそれらの標識体を含有するヒト肝性トリグリセリドリパーゼ測定試薬。According to claim 1 or 2, wherein the antibody or fragment, or human hepatic triglyceride lipase assay reagent containing their labels. ヒト血液由来検体に請求項1又は2記載の抗体又はフラグメント又はそれらの標識体を反応させることを特徴とする該検体中のヒト肝性トリグリセリドリパーゼ測定法。Human hepatic triglyceride lipase measurement of the specimen in which comprises reacting the human blood-derived sample to claim 1 or 2, wherein the antibody or fragment, or their labels. 請求項1又は2記載の抗体又はフラグメントを不溶性担体に固定化してなる固定化抗体又は固定化フラグメントを用いたアフィニティークロマトグラフィーによりヒト肝性トリグリセリドリパーゼを分離又は精製する方法。Method for separating or purifying the human hepatic triglyceride lipase by affinity chromatography using immobilized antibodies or immobilized fragment antibody of claim 1 or 2 wherein or is immobilized to fragment on an insoluble carrier.
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