JP4825957B2 - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Description

本発明は、アスコピロンＰを用いた、腫瘍を治療するための剤に関する。更に詳細には、アスコピロンＰと、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。

１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは、ある種の子嚢菌や紅藻由来の酵素であるα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることで生産することができる。１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは、グルコースから水分子が１つ取れた特異的な構造を有する糖である。既に、これまで抗酸化活性（特許文献１参照）や抗菌活性を示すことが報告されているが（特許文献２参照）、さらに、最近の研究では血糖降下作用（特許文献３参照）も報告され、生理活性を持つことでも注目されている。

アスコピロンは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを出発物質として酵素反応により調製できることが報告されている（特許文献４、特許文献５および特許文献６参照）。元来、アスコピロンはある種の子嚢菌により生合成されることが知られており（非特許文献１参照）、Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ目（例えば、Ｐｉｃａｒｉａ ｌｅｉｏｃａｒｐａおよびＡｎｔｈｒａｃｏｂｉａ ｍｅｌａｌｏｍａ）ならびにＴｕｂｅｒａｌｅｓ目（例えば、Ｔｕｂｅｒ ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍ）の菌体抽出液を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースに作用させ調製できることも報告されている。また、菌の種類により生合成されるアスコピロンの構造も異なる。

アスコピロンの一つであるアスコピロンＰ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）は、１９７８年および１９８１年に、米国の科学者のグループによって、アミロペクチン、アミロース、及びセルロースの熱分解で合成されることが報告され、有機合成の出発物質として使用された。（非特許文献２および非特許文献３参照）。
アスコピロンＰは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースと同様に抗酸化活性（特許文献７参照）、抗菌活性を有することが報告されている（特許文献８および特許文献９参照）。

現在、臨床の場で使用されている抗腫瘍剤の多くは、化学的性質上、フリーラジカル産生による細胞障害性を有し、それによる炎症惹起作用により、副作用（肝障害、腎障害、骨髄抑制、肺障害等）を併発する危険性が高い。これに対し、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよびアスコピロンは抗酸化活性をもつことから、従来の抗腫瘍剤にみられるような副作用は少ないと考えられる。また、他の抗腫瘍剤との併用において、抗腫瘍効果の増強が期待できるだけでなく、副作用の軽減をもたらす化学療法補助薬への応用も期待できる。
特表平９−５０５９８８号公報 特表２００１−８９３７７号公報 特表２００３−５１９６６０号公報 ＷＯ０３／３８０８４ ＷＯ０３／３８０８５ ＷＯ０３／３８１０７ ＷＯ００／５６８３８ ＷＯ０２／２６０６０ ＷＯ０２／２６０６１ Ｍ．Ａ．Ｂａｕｔｅ．，ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，（１９９１）４１−４５ Ｓｈａｆｉｚａｄｅｈ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，６７，（１９７８）４３３−４４７ Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，９０，（１９８１）３１９−３２５

本発明の目的は、アスコピロンＰ並びに、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体とを組み合わせて使用することで副作用が低減された安全で且つ優れた抗腫瘍剤を提供することにある。

さらに本発明の他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。

一般に臨床の場においては、腫瘍の化学療法において、抗腫瘍剤単独での効果には限界があり、併用化学療法、すなわち、他剤と併用した治療法が多用されているのが現状である。本発明者らは、アスコピロンＰの抗腫瘍能について、鋭意研究を重ねた結果、食事からも摂取できる栄養素であるビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体とアスコピロンＰを併用することによって、それぞれの化合物を単独で使用したときよりもさらに優れた抗腫瘍効果を示すことを見出し、本発明に到達した。

本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、
（１）アスコピロンＰと、
（２）ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種
を含有しそして上記ビタミンＡ誘導体がレチナール、レチノイン酸またはカロテンであることを特徴とする抗腫瘍剤によって達成される。

本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第２に、
（１）アスコピロンＰと、
（２）ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を、それぞれ別個の製剤として含有しそして上記ビタミンＡ誘導体がレチナール、レチノイン酸またはカロテンであることを特徴とする腫瘍治療のためのキットによって達成される。
すなわち、生体内に腫瘍細胞を保有する個体にアスコピロンＰと、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を適当量しかるべき方法で投与することにより、有意に腫瘍の増殖ないし転移を抑制することが可能となる。

アスコピロンＰと、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を腫瘍の増殖抑制あるいは転移抑制のために併用することで、それぞれの化合物を単独で使用するときよりも投与量を大幅に低減できるだけでなく、抗腫瘍効果を著しく改善することができる。

アスコピロンＰとは、例えば子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来の１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース脱水酵素による１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの脱水産物、その他に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースをアルカリ条件下で処理するか或いは、加熱処理するなどの化学的あるいは物理的操作によって１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを脱水して得られる化合物であってもよい。本発明で用いられるアスコピロンＰは下記式

で表される。

本発明の有効成分の一つであるビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体は、主として乳製品をはじめとする動物性食品に広範に含まれており、レチノール、レチナール、レチノイン酸などと呼ばれる化合物である。また、植物性食品、特に緑黄色野菜にもプロビタミンＡとしてカロテンが多く含有されており、摂取した際体内で変化してビタミンＡとなる。ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体の例としては、下記式

で表わされる化合物を挙げることができる。

本発明におけるビタミンＡ誘導体の一つであるａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ａｔＲＡ）は臨床の場で急性前骨髄球性白血病の化学療法で用いられる抗腫瘍薬である。
本発明において使用されうるビタミンＡ誘導体としては、上述したとおり、レチナール、レチノイン酸等が挙げられるが、中でもレチノイン酸、さらに詳細には９−ｃｉｓ−レチノイン酸、ａｔＲＡが好ましい。

本発明における製剤は、それ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合などを考慮して決定することができる。投与方法としては、例えば、注射や点滴などの方法によって静脈内や皮下、腹腔内など直接体内に投与する方法や、経口投与などによることができ、特別に制限されない。

また、本発明における抗腫瘍剤は、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体並びに、アスコピロンＰを有効成分として含有する単一組成物だけでなく、各化合物をそれぞれ有効成分として単独に含む製剤の組合せで構成されるキットのような形態であってもよい。キットの場合は、各製剤を投与直前に混合してもよく、あるいはそれぞれの製剤を異なる投与方法で投与してもよい。

本発明における抗腫瘍剤の投与量は、投与方法、腫瘍の種類および重篤度により異なるが、例えば、体重１ｋｇ当り一回あたりの投与量としてアスコピロンＰを０．０００００１μｇ〜１，０００ｍｇとしたとき、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を０．００１ｍｇ〜１０ｍｇとすることができる。また好ましくは、アスコピロンＰを０．０００１μｇ〜１００ｍｇとしたとき、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を０．０３ｍｇ〜３ｍｇとすることができ、ビタミンＡ過剰症が生じない程度での投与が可能である。

本発明の剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、経皮吸収剤等が挙げられるが、特に制限されない。また、本発明の剤は、製剤を調製するうえで必要な他の成分例えば、製剤担体や賦形剤、安定剤等を含有することもできる。
さらに、本発明の効果を奏する限り、他の抗腫瘍剤あるいはその他の薬理成分あるいはブドウ糖などの栄養成分を含むことも可能である。
また、アスコピロンＰと、ビタミンＡおよび／またはビタミンＡ誘導体を一緒に食品に添加して、がん予防を目的とした健康食品のような形態をとることも可能である。

本発明の抗腫瘍剤は、人間以外の哺乳動物にも投与することができる。すなわち、その場合、人間以外の哺乳動物に対し、アスコピロンＰと、ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を、組合せで投与することによって、腫瘍の治療を行うことができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳述する。本発明はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
なお、以下の試験では、アスコピロンは公知の方法に基づいて調製したものを使用した。

実施例１
[アスコピロンＰとａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸の抗腫瘍活性の相乗効果]
ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（ａｔＲＡ）は臨床の場で急性前骨髄球性白血病の化学療法で用いられる抗腫瘍薬である。そこで，急性前骨髄球性白血病由来の細胞株（Ｕ９３７）でアスコピロンＰとａｔＲＡの抗腫瘍活性の相乗効果を調べた。
Ｕ９３７細胞の細胞培養液を種々の濃度のアスコピロンＰ溶液、ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチノイン酸（ａｔＲＡ）さらにアスコピロンＰとａｔＲＡの混合溶液で刺激した。このときの溶液はいずれもジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したものを用い、ＤＭＳＯのみ添加したものをコントロールとした。

所定の時間培養後、細胞を回収した後、４℃で３０分間７０％エタノールで固定した後、５０μｇ／ｍｌプロピジウムヨード（ＰＩ）溶液で染色した。３０分後、ＦＡＣＳを用いてＤＮＡヒストグラムを作成し、細胞死の割合を調べた。結果を図１に示す。

ａｔＲＡ（１μＭ）、アスコピロンＰ（０．３ｍＭ）およびアスコピロンＰ（０．７ｍＭ）で刺激後の死細胞の割合はそれぞれ３．４％、７．２％および２０．７％であり、単剤での抗腫瘍活性が確認された。さらに、アスコピロンＰとａｔＲＡの混合溶液では、死細胞の割合は３４．０％と３９．６％で、単剤の場合と比較して高い値を示した。この結果から、アスコピロンＰとａｔＲＡとの併用によって抗腫瘍効果が増強されることが示唆された。

次に、アスコピロンＰ単独で殺細胞効果が最も低かったＨｅＬａ細胞（ＡＰＰ１．４ｍＭで死細胞の割合は８．３±２．０％）でＵ９３７細胞と同様の実験を試みた（図２）。ａｔＲＡの濃度を１／１０に下げ（０．１μＭ）、さらにアスコピロンＰを３．５ｎＭ、０．３５ｎＭに下げた場合においても両者を併用することで殺細胞効果の増強を認めた。このことより、アスコピロンＰはａｔＲＡと併用することで、極めて低い投与量で抗腫瘍効果を示すことが示唆された。

実施例２
［アスコピロンＰとレチノイン酸の抗腫瘍活性の相乗効果］
アスコピロンＰと９−ｃｉｓレチノイン酸（ＲＡ）の抗腫瘍活性の相乗効果を、ＨｅＬａ細胞を用いて実施例１と同様の方法で評価した（図３）。アスコピロン、レチノイン酸いずれも本実験で供した濃度において、単独では殺細胞効果がほとんど認められなかった。しかしながら、両者を併用した場合、死細胞の割合は顕著に増加することから、抗腫瘍効果が増強されることが示唆された。

実施例３
[Ｂ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ細胞に対するｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍試験]
Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにＢ１６ ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（１×１０^５個）を尻尾に皮下播種し、約３ｍｍの腫瘍が生じた時点で、局所に皮下注射を開始した（４日間、計５回）。投与量はアスコピロンＰを２．５ｍｇ／ｋｇ、９−ｃｉｓレチノイン酸（ＲＡ）を３０μｇ／ｋｇとし、腫瘍の直径の増減で抗腫瘍効果を評価した。なおこの際、アスコピロンＰ、ＲＡはＰＢＳ（燐酸緩衝液）に溶解したものを使用し、ＰＢＳのみを投与したものをコントロールとした。結果を図４に示す。

アスコピロンＰとＲＡを併用した群は、他の３群とは明らかに異なり、１日目（２４時間後）から腫瘍の萎縮が認められ、また腫瘍の増大速度も遅いことがわかった。すなわち、アスコピロンＰとＲＡのin vivoにおける抗腫瘍活性の相乗効果を示すものである。また、屠殺後の解剖所見では、ＰＢＳ投与群とレチノイン酸単独投与群において数匹臀部に腫瘍の転移が認められたが、アスコピロンＰとレチノイン酸を併用した群では転移がほとんど観察されなかった。

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による死細胞の定量評価（Ｕ９３７細胞／アスコピロンＰおよびａｔＲＡの効果） フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による死細胞の定量評価（ＨｅＬａ細胞／アスコピロンＰおよびａｔＲＡの効果） フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による死細胞の定量評価（ＨｅＬａ細胞／アスコピロンＰおよびレチノイン酸の効果） アスコピロンＰおよびレチノイン酸投与後マウスの腫瘍容積

Claims (7)

1. （１）アスコピロンＰ
   並びに
   （２）ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種
   を有効成分として含有しそして上記ビタミンＡ誘導体がレチナール、レチノイン酸またはカロテンであることを特徴とする抗腫瘍剤。
2. ビタミンＡ誘導体がレチノイン酸である請求項１に記載の剤。
3. ビタミンＡ誘導体が９−ｃｉｓレチノイン酸またはａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸である請求項１に記載の剤。
4. （１）アスコピロンＰ
   並びに
   （２）ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種
   を、それぞれ別個の製剤として含有しそして上記ビタミンＡ誘導体がレチナール、レチノイン酸またはカロテンであることを特徴とする腫瘍の治療のためのキット。
5. ビタミンＡ誘導体がレチノイン酸である請求項４に記載のキット。
6. ビタミンＡ誘導体が９−ｃｉｓレチノイン酸またはａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸である請求項４に記載のキット。
7. 人間以外の哺乳動物に対して
   （１）アスコピロンＰ
   並びに
   （２）ビタミンＡおよびビタミンＡ誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種
   を、組み合わせで投与しそして上記ビタミンＡ誘導体がレチナール、レチノイン酸またはカロテンであることを特徴とする腫瘍の治療方法。

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