JP4783422B2 - プロテオリピド膜及び脂質膜バイオセンサー - Google Patents

Description

優先権情報
本出願は、２００５年４月１２日に提出された、米国特許出願番号 第６０／６７０，５２４号の利点をクレームするものであり、その全文は参照により本願に援用される。
我々は、膜タンパク質の付着を制御できるであろうことを種々の単一及び二重層の作成により実証してきた。脂質、ヘテロ及びホモ機能性脂質、リン脂質、コレステロール、単鎖及び二重鎖両親媒性物質、ミセル形成組成物、リポソーム形成物質、イオン性洗剤、陰イオン性洗剤、カチオン性洗剤、両性イオン性洗剤及びその他の試薬であって、膜結合タンパク質の付着及び折り畳みを可能とするための適切な環境の作成に必要とされるものを含むが、これに制限されることのない、様々な疎水性物質などの代替試薬を使用する当業者にとって、本発明は直接または前もってタンパク質に固定化された生体分子、小分子または試験用試薬の、該膜状環境におけるバイオセンサーに対する付着、折り畳み、ならびに結合性試験のためのツールとなるものである。

Ｂｉａｃｏｒｅ社のＸ、２０００、３０００、Ｔ１００、Ｓ５１及びＣシステムなどの従来のバイオセンサー、または蛍光性に基づくアプローチなどの標識依存性の技術を用いた脂質分析は困難であるが、これは、当業者に既知のように、クエンチングまたは励起に関する様々な問題を抱える非極性環境において、標識がうまく働かないからである。さらに、標識は、脂質の検討に使用されるシステムを予測不能な方法で、さらに重要なことに望まない方法でしばしば混乱させる。Ｂｉａｃｏｒｅなどのフローベースシステムが、保持されるべき構造的に脆弱な環境をかき乱し、非極性環境にて測定を実施させる。その上、ＳＰＲフローフォーマットは非常に低い試料処理能力しか持たないために、適切な環境を構築するために膨大な時間を加え、適切なタンパク質の付着、アセンブリ及び折り畳みを可能とし、フロー環境において適正に付着し、折り畳まれているべきタンパク質との相互作用に対する試験への時間量を増加させる。

本発明の一実施形態では、比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサーであって、バイオセンサーの表面が酸化チタン、二酸化チタンまたはリン酸チタンであるとともに、一つまたはそれ以上の非極性分子が酸化チタンまたはリン酸チタン表面に固定化されているものを提供する。この非極性分子は、脂質、ヘテロ機能性脂質、ホモ機能性脂質、リン脂質、コレステロール、単鎖の両親媒性物質、二重鎖の両親媒性物質、ミセル形成化合物、リポゾーム形成物質、イオン性洗剤、陰イオン性洗剤、カチオン性洗剤または両性イオン性洗剤であっても構わない。非極性分子は非標識であっても構わない。バイオセンサーは、マイクロタイタープレートの底部に組み込むことが可能であり、あるいは、マイクロアレイフォーマット内とすることが可能である。バイオセンサーは、マイクロタイタープレートの底部に組み込むことが可能であり、マイクロタイタープレートの各ウェルは約５ｍｍ^２乃至約５０ｍｍ^２である。酸化チタン、二酸化チタンまたはリン酸チタンの表面をシランで被覆して、チタン−シランまたはリン酸チタン−シラン表面を形成することが可能である。バイオセンサーを更に一種またはそれ以上の洗剤で被覆することが可能である。チタン−シラン表面またはリン酸チタン−シラン表面を、ＰＥＯ（ａ）−ＰＥＯ（ｂ）−ＰＥＯ（ａ）の形状でポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドとのブロック共重合体によって被覆することが可能である。

本発明の別の実施形態では、脂質層における化学的あるいは物理的相互作用を分析する方法を提供し、ここで脂質層は比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサーに固定化されている。この方法には、脂質層を種と接触させること、ならびに、（ａ）光の波長がシフトすると種が脂質層と相互に作用する場合には、バイオセンサーの照射に使用される光の反射波における最大値または伝送波における最小値を検出する、あるいは、（ｂ）屈折率の変化が、種の脂質層との相互作用を示した場合には、バイオセンサーの照射に使用される光の屈折率の変化を検出することによって、脂質層と種の相互作用を分析することが含まれる。約３００またはそれ以上の試料を約１０分またはそれ以内で分析することが可能である。脂質層は、静止状態で種に接触することができる。脂質層及び種との相互作用を、静止状態で分析できる。脂質層及び種は無標識であっても構わない。

本発明は、単位時間当たりのより多くの試料数／読み込みに対する脂質及び脂質ベースの分析を可能とする、マイクロタイタープレートベース内または、マイクロアレイフォーマット内のバイオセンサーを提供するものである。現在、単一器具上のリポソームＳＰＲセンサーを使用した単結合の相互作用イベントに対する一般的な分析には、２０乃至３０分かかる。例えば、Ｂａｉｒｄら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年３１０巻：第９３乃至９９ページ、を参照されたい。本発明は、この時間での一つの器具上における４乃至６×３８４ウェルの試料に対するバイオセンサープレートの読み込みを可能にするだろう。有利なことに、本発明における検体用の標識は不要である。

Ｓｔｅｎｌｕｎｄらは、市販のＳＰＲ装置内において活性膜結合タンパク質に対する好適な環境を作り上げようと試みることが困難であることを示している。Ａｎａｌｙｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００３年、３１６巻：第２４３乃至２５０ページ、を参照されたい。一般的に、これらの装置は、フローベースの装置であり、これにより工程が複雑化する。Ｓｔｅｎｌｕｎｄは、疎水性物質及び洗剤の適切な化合物が必須であり、実現しなければならないが、タンパク質の種類ごとに異なるものと思われ、実験的によってのみしか化合物を得られない。経済的に、時間及び金銭の両面から言えば、営利事業の制約内にいる科学者にとって、このタイプの開発は、複数のウェルのマイクロタイタープレートをベースとする、あるいはマイクロアレイスライドをベースとするフォーマット内に巨大な表面領域を提供する、比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサーのような装置を用いることによってのみ達成できる。

さらに、ＳＰＲタイプの装置は非常に直径が小さく（サンプリングスペースの技術面及び経済面に有意に規定される）、準最適な「混濁した」疎水性物質及び洗剤によって目詰まりしがちである。このタイプの目詰まりは、比色共鳴バイオセンサースライドまたはマイクロタイタープレートベースの装置、あるいは格子型導波路の装置では発生し得ない。また、比色共鳴バイオセンサーにおける混濁は、現在のＳＰＲ装置のような失敗に対する高いコストをもない。さらに、Ｓｔｅｎｌｕｎｄが実証したように、彼らのアプローチによる活性タンパク質は、おそらく、元となるタンパク質含有細胞成分の不完全な可溶化の後、何かの事情で活性化されたものであろう。比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路装置は、可溶化が弱いものの、活性タンパク質含有細胞成分をそのまま直接塗布することに対する、十分かつ実用的な表面を提供し、その結果、さらに別の経路によって活性タンパク質の割合をより高くするであろう。可溶化が弱い細胞成分は、おそらく彼らが採用した装置を目詰まりさせ、物質の適切な付着には不十分な表面領域を提供したため、この経路はＳｔｅｎｌｕｎｄのアプローチでは得られない。さらに、適切な付着ならびに生来の環境から除去されたタンパク質に結合した膜の折り畳みは、非常に顕著な時間的要因を有することが示されているが（Ｃａｎｔｏｒ及びＳｃｈｉｍｍｅｌ、ｐａｒｔｓ １−３ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｗ．Ｈ. Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０年版、特に第２５章、第１３２７乃至１３７１ページ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉａ ａｎｄ ｔｏ Ｂｉｌａｙｅｒｓを参照されたい）、この要因は、フロー装置には使用不能なことである。静的モードで作動する比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路の装置は、より好ましいものであると考えられ、これらによって付着及び折り畳みの進行のリアルタイム測定を行なうことが可能となろう。

本発明の一実施形態は、比色共鳴バイオセンサー及び／または格子型導波路バイオセンサー上で、非極性の環境または部分的な非極性環境における結合及び固定化イベントの測定を可能にすることである。例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、“Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｔ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｄｉｒｅｃｔ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ、第８１巻、第３１６乃至３２８ページ、２００２年１月５日；米国特許公開番号 第２００４／００９１３９７号；米国特許番号 第６，９５８，１３１号；米国特許番号 第６，７８７，１１０号；米国特許番号 第５，７３８，８２５号；米国特許番号 第６，７５６，０７８号を参照されたい。比色共鳴バイオセンサー及び格子型導波路バイオセンサーは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーではない。

比色共鳴バイオセンサーは、表面バインディングプラットフォームとして使用される比色共鳴回折格子表面を有する。光学構造を作り出すために導波モード共鳴現象が使用されるが、これは、白色光を点灯した際に、単一波長のみを反射するように設計されている。分子が表面に付着する際には、格子に連結される光の光学経路の変化によって、反射波（色）がシフトする。格子表面に対するレセプター分子の結合により、相補的に結合した分子は、いずれかの種類の蛍光プローブまたは粒子ラベルを使用せずに検出され得る。検出技術は、０．１ｎｍ以下の厚さの結合剤の変化を解析することが可能であり、流体に浸した、あるいは乾燥させた格子表面で実施可能である。

読み出しシステムは、例えば、光ファイバースコープを通じて、法線入射での格子の小さなスポットを照射する白色光ランプ、ならびに、こちらも法線入射での第二のファイバーを通じて反射した光を集める分光計により、例えば構成される。単一の分光計による読み出しは、それぞれ数ミリ秒単位で実施されるため、格子表面上で並行して発生する大量の分子間相互作用を迅速に測定することが可能であるとともに、リアルタイムで反応力学をモニターすることが可能である。光の反射波長の最大値または伝送波長の最小値は、バイオセンサーを照射するために使用することが可能であり、光の波長におけるシフトを検出することが可能である。格子ベースの導波路型バイオセンサーは、バイオセンサーを照射するために使用される光の屈折率における変化を検出することにより測定することが可能であるが、ここで、屈折率における変化は、種がバイオセンサー表面上の非極性分子と相互作用したことを示した。この技術は、例えば、多数の生体分子の相互作用が並行して測定されるアプリケーションにおいて、とりわけ、試験下において分子ラベルが分子の機能性を改変するか、あるいは阻害するであろう場合に有用である。標的タンパク質を有する医薬組成物ライブラリーのハイスループットスクリーニング、ならびにプロテオミクスのためのタンパク質−タンパク質の相互作用のマイクロアレイスクリーニングは、このアプローチにより得られた感受性及びスループットを必要とするアプリケーションの事例である。米国出願番号 第６０／２４４，３１２号、２０００年１０月３０日出願；米国出願番号 第０９／９２９，９５７号、２００１年８月１５日出願；米国出願番号 第６０／２８３，３１４号、２００１年４月１２日出願；米国出願番号 第６０／３０３，０２８号、２００１年７月３日出願；米国出願番号 第０９／９３０，３５２号、２００１年８月１５日出願；米国出願番号 第１０／４１５，０３７号、２００１年１０月２３日出願；米国出願番号 第１０／３９９，９４０号、２００４年１月１６日出願；米国出願番号 第１０／０５９，０６０号、２００２年１月２８日出願；米国出願番号 第１０／０５８，６２６号、２００２年１月２８日出願；米国出願番号 第１０／２０１，８１８号、２００２年７月２３日出願；米国出願番号 第１０／２３７，６４１号、２００２年９月９日出願；米国出願番号 第１０／１８０，３７４号、２００２年６月２６日出願；米国出願番号 第１０／２２７，９０８号、２００２年８月２６日出願；米国出願番号 第１０／２３３，７３０号、２００２年９月３日出願；米国出願番号 第１０／２０１，８７８号、２００２年７月２３日出願；米国出願番号 第１０／１８０，６４７号、２００２年６月２６日出願；米国出願番号 第１０／１９６，０５８号、２００２年７月１５日出願；米国出願番号 第１０／２５３，８４６号、２００２年９月２５日出願；米国出願番号 第１０／６６７，６９６号、２００３年９月２２日出願、もまた参照されたいが、これらはすべて、参照によりその全文を本明細書に援用する。

比色共鳴バイオセンサー及び格子型導波路の表面は、高屈折率を有する物質、例えば、硫化亜鉛、二酸化チタン、酸化チタン、酸化タンタル及び窒化ケイ素であることが可能である。種々の表面化学は、脂質環境が要求されるタンパク質の試験をサポートするバイオセンサーのアセンブリに適合する。例えば、米国特許番号 第６，６４５，６４４号（有機ホスホン酸塩ならびに無機リン酸塩コート剤）；米国特許番号 第６，１４６，７６７号（自動アセンブリ化有機単分子層）；Ｇａｗａｌｔら （２００１年） Ｌａｎｇｍｕｉｒ、Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ Ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ Ａｌｋａｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ｏｘｉｄｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｔｉｔａｎｉｕｍ １７（１９），第５７３６乃至５７３８ページ（チタニウムの自然酸化物表面上の溶液からのアルカンホスホン酸のアセンブリ後、穏やかに加熱することにより、強力に表面結合した、アルカン鎖が順序正しく並んだ酸のフィルムが作成される）；Ｇａｗａｌｔら （１９９９年） Ｌａｎｇｍｕｉｒ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｏｎｄｉｎｇ ｏｆ ａｌｋａｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｏ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｔｉｔａｎｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ−ｂｏｕｎｄ ａｌｋｏｘｙｚｉｃｒｉｎｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ １５：８９２９乃至８９３３ページ；Ｗａｎｇら （１９９８年） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ＴｉＯ_２ ｓｕｒｆａｃｅｓ １０（２）：１３５乃至１３８ページ；Ｆｏｌｋｅｒｓら （１９９５年）Ｌａｎｇｍｕｉｒ、Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ ｏｆ ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ｏｘｉｄｅｓ ｏｆ ｍｅｔａｌｓ １１：８１３乃至８２４ページを参照されたい。本発明の一実施形態において、バイオセンサー表面はシラン、界面活性剤、ポリエチレンオキシドのブロック共重合体及びＰＥＯ（ａ）−ＰＰＯ（ｂ）−ＰＥＯ（ａ）の形状のポリプロピレンオキシド、またはこれらの組み合わせで被覆されている。

強力な紫外線領域に配置されるか、あるいは８時間を超えて水溶液中に浸漬させない限り、表面がもともと疎水性の性質を有しているため、比色共鳴バイオセンサーのＴｉＯ／ＴｉＯ_２コーティングは、特にこのアプリケーションの影響を受けやすい。本明細書に記載の処理は、とりわけ、マイクロタイターまたはマイクロチップフォーマットにおいてラベルを使用することなく、細胞及び生命のプロセスの研究に関連する結合イベントの測定のための特殊な生物学的に関連する環境における結合イベントの研究を可能にする。脂質単分子層、脂質二分子層、脂質、リポソーム、プロテオリピド、脂質二分子膜、ミセル、膜結合タンパク質、リポタンパク質、細胞、細胞抽出物、合成による細胞由来の物質及び同等のもの（すなわち、非極性分子）は、本発明のバイオセンサー表面に固定化され得る。これらの非極性分子、例えば脂質層は、例えば、炭水化物、タンパク質、糖質及びその他の生体分子を含み得る。いったん固定化されれば、例えば、種（すなわち、化合物、脂質またはタンパク質のいずれかのタイプ）をバイオセンサー表面に添加することによる、脂質層をわたる受動的な薬剤吸収、タンパク質とフォスファチジルイノシトールの相互作用、ならびに膜受容体−リガンドの相互作用のアッセイに、これらを使用することが可能である。図１及び図２を参照されたい。本発明の一実施形態において、非極性分子、種、あるいは非極性分子及び種の両者はラベル化されない。

特に、膜結合タンパク質、とりわけ、製薬会社及びバイオテクノロジー企業により最重要とされる薬剤ターゲットである、Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として知られている膜結合タンパク質の研究に関連する一連のすべての作業を、本発明は可能にするものである。ＧＰＣＲを、例えば、バイオセンサー表面上の脂質膜の状態で、比色共鳴バイオセンサー表面または格子型導波路バイオセンサーに固定化することが可能であり、阻害剤結合を検出することが可能である。本発明に関する、別の治療上重要なクラスのタンパク質は、細胞内および細胞間シグナルを制御するイオンチャンネル及び細胞表面タンパク質である。薬剤、その他の膜に結合または関連するタンパク質と相互に作用し、細胞、シグナルタンパク質、代謝産物に結合するかあるいは結合せず、細胞内の複数の組成物との相互作用を誘発するなど、これらの相互作用に関連する変化を起こすため、一連の作業には、本来の環境におけるこれらのタンパク質の研究が含まれる。その他の非極性物質を、結合相互作用分析を目的として、これらの表面に固定化することが可能である。

本発明に関する機能的有利には、例えば、マイクロタイターウェル中でラベル化されていない、これらの本来の環境におけるこれらのタンパク質、脂質、脂質ベースの分子及びその他の非極性物質が含まれる。結合相互作用または構造変化は、本発明の組成物及び方法を使用して定量化することができる。

いずれのサイズまたは厚さの脂質層であっても、比色共鳴バイオセンサー表面、例えば、実施例１に記載されているような疎水性の比色共鳴バイオセンサー表面上に作成することができる。例えば、脂質単分子層（例えば、ＰＯＰＣリポソームまたはＴａＯ上のミセル）、脂質二分子層（例えば、アンカーリポソームに対する（アルカン類など）親油基を含むヒドロゲル）；脂質二分子層に結合する、Ｌａｈｉｒｉの両親媒性アンカー脂質表面（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２０００年、第１６巻、７８０５乃至７８１０ページ）；ＳＡ表面上のビオチン化リポソーム（Ｂｉｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９９９年、第１７巻、第１１０５乃至１１０８ページ）；プロテオリピド二分子層（洗剤可溶化ＧＰＣＲを方向性を持たせながら表面に付着させ、洗剤を除去する間に脂質ミセルを用いて固定化されたＧＰＣＲの周囲に脂質膜を再構築する）（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年１月１５日；３００（２）：１３２乃至８ページ；過剰発現した受容体を含む膜画分を使用）。脂質表面もまた、例えば、Ｂａｉｒｄら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年 ３１０：９３乃至９９ページ；Ｓｔｅｎｌｕｎｄら、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３年 ３１６：２４３乃至２５０ページ；Ａｂｄｉｃｈｅ及びＭｙｓｚｋａ、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４年 ３２８：２３３乃至２４３ページ；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ２００５年 １６：１４５７乃至１４８３ページ；米国特許番号 第６，７５６，０７８号に記載されている。

ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ脂質に付着したＰＥＧ５０００、ＤＰＰＥ脂質に付着したＰＥＧ２０００−ビオチン、脂質上のカルボキシ−ＮＨＳ ＰＥＧ、ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；分子量 ７６０．１；ａｖａｎｔｉ ８５０４５７）、ＰＥ−ｒｈｏｄ（ジアシルホスファチジルエタノールアミン−ｌｉｓｓａｍｉｎｅローダミン Ｂ；１８：１；分子量 １２５９．１１；ａｖａｎｔｉ ８１０１５０；ｅｘｃ． ５５０ ｅｍ． ５９０）リポソーム外部での蛍光）、ＭＰＥＧ−５０００−ＰＥ（１，２ ジパルミトイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００；分子量 ５７２７；ａｖａｎｔｉ ８８０２００］、ＭＰＥＧ−２０００−ＰＥ（１，２ ジパルミトイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００；分子量 ２７３１．３９；ａｖａｎｔｉ ８８０１６０］、ＰＥ−ＮＢＤ（１８：１，１２：０−Ｎ−ＮＢＤ、ホスファチジルエタノールアミン−ＮＢＤ；分子量 １２５９．１１；ａｖａｎｔｉ ８１０１３３；ｅｘｃ． ４６０ ｅｍ． ５３４）リポソーム内部の蛍光）などの脂質はバイオセンサー表面に固定化することが可能である。

比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサー表面上の脂質の被覆範囲は、例えば、蛍光脂質をリポソームに組み込み、蛍光シグナルを調べる脂質単分子層及び二分子層に対する予測シグナルのモデルを使用することにより、あるいはＢＳＡ結合をモニターすることにより（密集した脂質表面はＢＳＡ結合への抵抗性を有する）分析が可能である。

本発明の一実施形態において、本発明のバイオセンサーは、例えば液体を含有する容器の底部表面のように内表面を含有していても構わない。液体を含有する容器は、例えば、マイクロタイタープレートウェル、試験管、ペトリ皿またはマイクロ流体チャンネルであっても構わない。本発明の一実施形態は、いずれかの類型のマイクロタイタープレートに組み込まれたバイオセンサーである。例えば、バイオセンサー表面上の反応容器の壁面をアッセンブリすることによって、マイクロタイタープレートの底部表面にバイオセンサーを組み込むことが可能であり、これによって各ウェルは個別の試験用試料に曝露することが可能となる。したがって、それぞれのマイクロタイタープレートウェルは、別々の反応容器として機能することが可能である。したがって、反応流体が混ぜ合わされずに、それぞれの化学反応を隣接するウェル内で発生させることが可能であり、化学的に異なる試験溶液をそれぞれのウェルに入れることが可能である。

医薬的な高スループットスクリーニング研究所、分子生物学研究所ならびに診断分析研究所にとって、最も一般的な分析フォーマットは、マイクロタイタープレートである。このプレートは標準サイズのプラスチックカートリッジで、格子内に配列された９６、３８４または１５３６個の各反応容器を含んでいる。これらのプレートの標準的なメカニカル構造により、液剤の分注、ロボットによるプレート処理、ならびに検出システムはこの一般的なフォーマットと共に作動するように設計されている。本発明のバイオセンサーは、標準マイクロタイタープレートの底表面に組み込むことが可能である。バイオセンサー表面を広範囲に作ることが可能であり、読み出しシステムがバイオセンサー表面と物理的に接触しないことから、任意の数の各バイオセンサー領域を特定することができるが、このバイオセンサー領域は、照明光学系の焦点解析及びバイオセンサー表面にわたる照明／検出プローブをスキャンするｘ−ｙ局面によってのみ限定される。マイクロタイタープローブの各ウェルは、例えば約１ｍｍ^２を超えるものであるか、あるいは、約５，１０、１５、２０、３０、５０、１００ｍｍ^２またはこれを超えるものであってもよい。

本発明の別の実施形態において、バイオセンサーはマイクロアレイフォーマットである。一つまたはそれ以上の異なる非極性種（例えば、脂質）「スポット」は、バイオセンサー上の異なる位置のマイクロアレイ中に配置される。非極性種スポットのマイクロアレイは、表面には多くの異なる位置が含まれ、それぞれが異種の非極性種スポットまたは異なる量の非極性種スポットを伴うようなバイオセンサーの表面上に一つまたはそれ以上の非極性種スポットを含有している。例えば、一つのアレイには１、１０、１００、１，０００、１０，０００または１００，０００ヶ所の異なる位置を含むことが可能である。ｘ−ｙ座標中の標準的な格子パターン内には、一つまたはそれ以上のスポットが通常設計されていることから、このようなバイオセンサー表面はマイクロアレイと呼ばれている。しかしながら、本発明のマイクロアレイは、規則または不規則なパターンのいずれかの型で設計された、一つまたはそれ以上のスポットを含有することが可能である。例えば、異なる部位は一つまたはそれ以上の特定の非極性種のスポットのマイクロアレイを特定することができる。

本発明のマイクロアレイの一例は、核酸マイクロアレイであり、アレイ内のそれぞれの異なる位置に異なる核酸分子を含んでいる。この実施形態において、核酸マイクロアレイ内のスポットは、テスト試料中の核酸の対立ストランドとの相補的な化学結合を検出する。

本発明の一実施形態において、一つの読み取り機を用いて、約１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００またはそれ以上の各ウェルまたは試料を、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０分またはそれ以下の時間で分析することが可能である。

本明細書に具体的に記載される本発明は、本明細書に特に記載されていないようないずれかの構成要素（単数または複数）または制限（単数または複数）なしに、適切に実施することができる。したがって、本明細書中の各事例において、例えば、「…を含む（ｃｏｐｒｉｓｉｎｇ）」、「…を必須として含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ））、「…よりなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の用語は、いずれも他の二つの用語に置き換えても構わない。採用された用語及び表現は、記載上の用語として制限されずに使用されるものであり、このような用語及び表現の使用において、図示され、記載される特徴またはこれらの一部と同等のものを排除することを意図するものではなく、クレームされる本発明の権利範囲内において様々な変更が可能であると認識される。したがって、本発明は好適な実施形態により具体的に開示されるものの、本明細書に開示される概念のオプション機能は、当業者により行なわれてもよく、こうしたオプション機能は、明細書の記載及びこれに付属する特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内としてみなされるものであると解釈されるべきである。

さらに、本発明の特徴及び態様がマーカッシュグループまたは代替となるその他のグルーピングの用語として記載されている場合、当業者であれば、本発明は、いずれも個別あるいはサブグループとしての構成要素としても記載されるものであることに気付くであろう。

以下は、例証することを目的としているだけであり、先の広義語で記載される本発明の権利範囲を制限することを目的とするものではない。この開示において引用されるすべての参考文献は、参照により本願明細書に援用される。

＜実施例１：安定した疎水性バイオセンサー表面＞
安定した疎水性比色共鳴バイオセンサー表面は、撥水シラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １７−１３３２−０１）を、比色共鳴バイオセンサーＴｉＯ表面を含むウェル、例えば、９６−ウェルプレートに注入することにより調製することができる。７分間インキュベーションを行なう。９０μｌのヘキサン（無水）（Ｓｉｇｍａ ２２７０６４）を各ウェルに注入する。９０μｌのシラン混合物を、マルチチャンネルピペットを用いて吸引する。９０μｌのヘキサン（第２回目の注入）をウェルに注入する。９０μｌのシラン混合物（第２回目の吸引）を、マルチチャンネルピペットを用いて吸引する。９０μｌのヘキサン（第３回目の注入）をウェルに注入する。ウェルに残っている全溶液を、真空ポンプに接続した８チャンネルステンレススチール製の多岐管を用いて吸引する。最終吸引後、バイオセンサーを空気中に戻す。１００μｌのＰＢＳでプレートを二回洗浄した後、プレートに１００μｌのＰＢＳを充填する。エネルギーをプレート中にわたって均一に分散させるために超音波処理浴内でプレートを前後に動かしながら、５乃至１０秒間、プレートを超音波処理する。Ｎ_２ガンを使用し、プレートの裏面を乾燥させる。

マイクロタイターバイオセンサープレートのウェル中で、５０μｌの撥水シランを処理時間７分間でインキュベートすることにより、比色共鳴バイオセンサー表面を撥水シラン（オクタメチルシクロテトラシロキサン中２％ ｗ／ｖ）で処理した。シラン溶液を吸引し、表面を９０μｌのヘキサンで３回洗浄した。ヘキサンによる最終洗浄後、プレートを乾燥させることにより、マイクロタイターバイオセンサープレートを処理した。プレートをｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した。シラン処理を行ったバイオセンサー表面にＰＰＬを沈着させた。４０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＰＬを含むｐＨ９．０５の１０ｍＭ リン酸ナトリウムを、マイクロタイターバイオセンサープレートの各直径６ｍｍのウェルに加えた。マイクロタイターバイオセンサープレートを室温で一晩乾燥させた。プレートをＰＢＳで３回洗浄した。

ＴｉＯ表面へのｐｏｌｙ−ｐｈｅ−ｌｙｓの付着の増加により証明されたように、撥水シランを用いたバイオセンサー表面の処理により、バイオセンサー表面の疎水性特性が増加した。ヘキサン洗浄よりも撥水処理のほうがより有効な疎水性表面処理である。図３及び表１を参照されたい。

撥水コーティングの目的は、ＴｉＯの疎水性特性を増加させることであり、これは、生体膜環境を形成するための表面にとって必要な特性である。適切な撥水コーティングは、フェニルアラニン残基及び撥水シランとの非極性相互作用を介して、被験（タンパク質）ポリマーであるｐｏｌｙ−ｐｈｅ−ｌｙｓのバイオセンサーに対する吸着作用の増加をもたらす。適切なタンパク質の付着及び折り畳みをサポートするだろうバイオセンサー上の膜状環境を作り上げるためには、表面が疎水性の撥水タイプであることが重要である。この場合、リジン上の（フェニルアラニン−リジンのポリマーにおけるアミノ酸残基は、疎水性相互作用に関与しない）アミンは、続いて化学的に変化して、次に他のタンパク質と共に（それらの第１級アミンを通じて）シッフ塩基を形成し得るアルデヒド基となる。

５０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンを含むｐＨ５．０の酢酸ナトリウムを、マイクロタイターバイオセンサープレートにおける直径６ｍｍの各ウェルに加えた。この溶液をウェル中で１時間インキュべートした後、ｐＨ５．０の酢酸ナトリウムで３回洗浄した。結果を図４及び第２表に示す。表２のデータは、疎水性コーティングの均質な層がバイオセンサー上に形成されたこと、この塗布された層の均質な化学的修飾、ならびに、これに続くバイオセンサーへの更なる機能的タンパク質層の付着を示している。

５０μｌの撥水シランを７分間でバイオセンサーマイクロタイタープレートのウェルに加えた。このシランを吸引し、９０μｌのヘキサンでバイオセンサーを３回洗浄した。ヘキサンによる最終洗浄後、マイクロタイターバイオセンサープレートを５分間処理した。プレートをｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した。４０μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＰＬを含むｐＨ９．０５の１０ｍＭ リン酸ナトリウムを、ウェルに加えた。バイオセンサープレートを室温で一晩乾燥させて、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。

図５及び表３は、バイオセンサー表面との静電相互作用によるものではなく、むしろバイオセンサー表面の疎水性特性によって結合が操作されることを示している。ｐｏｌｙ−ｐｈｅ−ｌｙｓ（ＰＰＬ）及びｐｏｌｙ−ｌｙｓ−ｌｙｓ（ＰＬＬ）の二つのポリマーは、ＰＰＬ内に疎水性フェニルアラニンの残基の存在を除けば、ほぼ同一である。リジン残基はプラスに帯電しており、ポリマーの結合に影響を与える可能性があると共に、バイオセンサーへの付着におけるこの態様を試験するために使用される。本実施例において、ＰＰＬに比べて非常に付着が少ないことから証明されるように、リジン上の帯電は明らかに、バイオセンサーへのポリマーの付着に関する主たる原動力ではない。バイオセンサーは疎水性にコーティングされており、この実施例のタンパク質（ＰＰＬ）のようなその他の疎水性ポリマーを引き付けて吸収する。

＜実施例３：撥水シラン処理によるＰＰＬ結合性の改善＞
撥水処理の前に、バイオセンサープレートをＯ_２プラズマ処理した。バイオセンサープレートの直径６ｍｍウェル内で、５０μｌの撥水シランによる７分間のインキュベーション処理を行なった。残存するシランを吸引し、９０μｌのヘキサンでバイオセンサーを３回洗浄した。最終ヘキサン洗浄後、バイオセンサープレートを５分間処理した。バイオセンサープレートをｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した。ｐＨ６．０、７．４、９．０及び１０．１の１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_３緩衝液中において、０．１ｍｇ／ｍｌ ＰＰＬ溶液を調製したが、これらの緩衝液は、ｐＨ４．０の１１ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_３緩衝液を１ＭのＮａＯＨで調節することにより調製された。４０ｍｌのＰＰＬ溶液をバイオセンサープレートのウェルに加え、室温で一晩乾燥させた。バイオセンサープレートをＰＢＳで３回洗浄した。図６は、モデルタンパク質であるＰＰＬの捕捉を改善することを目的とした、疎水性コーティングの最適化の結果である。

＜実施例４：撥水シラン処理による表面の疎水性特性の増大＞
撥水処理前に、バイオセンサーにＯ_２プラズマ処理を行なった。バイオセンサー物質の一部分に、撥水シランによる７分間のインキュベーション処理を行なった。残存するシランを吸引し、バイオセンサーをヘキサンで３回洗浄した。最終ヘキサン洗浄後、バイオセンサーを５分間処理した。その後バイオセンサーををｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄した。水接触角測定を、ＡＳＴ製品（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）である水接触角測定装置を使用して行なった。図７を参照されたい。

水接触角試験の結果より、バイオセンサー表面に疎水性表面が形成されたことがさらに立証された。水接触角がより高くなると、表面がより疎水性となることが示される。このタイプの試験では、脂質試験における調製に用いるバイオセンサー表面上のさまざまな層の形成の確認が、比色共鳴バイオセンサーで容易に実施されるが、非常に狭い表面領域（通常は１ｍｍ^２以下）を有し、提供されるフローセルの密封性を有する市販のＳＰＲフロー装置上でこれを実施することは、はるかに難しい。本発明は、一般的に表面領域が最大約２８ｍｍ^２で、完全に開放されており、このタイプの測定及びその他の定量的な表面解析（すなわち、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）、エネルギー分散型分光（ＥＤＳ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ））は容易に実施される。

ＴｉＯ表面のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）修飾
ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤の１％溶液を水中で作製した。この溶液の１００μｌを非加工ＴｉＯもしくは疎水性ＴｉＯ（撥水シラン修飾）ウェルに分注する。この界面活性剤を２時間かけてセンサー表面に吸収させた。その後バイオセンサーを水で３回洗浄した。

バイオセンサー表面へのタンパク質結合
０．１ｍｇ／ｍｌでストレプトアビジン溶液を含むＰＢＳを作製した。この溶液の１００μｌをウェルに分注した。ウェル内の溶液を１時間インキュべートした。結合しなかった物質を除去してバイオセンサーをＰＢＳで３回洗浄した。

種々のタンパク質密度による表面の作製
１ｍｇ／ｍｌ乃至０．００１ｍｇ／ｍｌの様々な濃度のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７を水中で作製した。１００μｌのＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）溶液を、疎水性処理済みＴｉＯ（撥水シラン修飾）ウェルに分注した。この界面活性剤を２時間かけてセンサー表面に吸収させた。液体界面活性剤を除去し、バイオセンサーを水で３回洗浄した。１００μｌのストレプトアビジン溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）でコーティングしたウェルに分注して、１時間インキュベートした。ストレプトアビジンを除去してバイオセンサーをＰＢＳで３回洗浄した。

ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤は、生体膜が細胞環境中にパーティションを形成し、極性部分から非極性部分などの分子種の一つのタイプを分離するのと同様の方法でミセルを形成する、非イオン性洗剤である。このことによって、これらは、バイオセンサー上に、混成（ｍｉｘｅｄ）極性タンパク質（すなわち、いくらかの極性領域及びいくらかの非極性領域を有するタンパク質）の適切な付着及び折り畳みが行なわれるような環境を作るための、適切なモデル及び試薬となる。

撥水コート化ＴｉＯに対するＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）結合
X 図８は、界面活性剤（ポリプロピレンオキシド）の疎水性ブロックと疎水性撥水表面との好ましい相互作用に起因した、より多量のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤結合を示している。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ウェルに対してはＮ＝２４、ならびに、対照ウェルに対してはＮ＝８。

１． ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）バイオセンサーは、ＴｉＯに対するタンパク質結合の低下を示す。
図９は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤の分子量の関数として、非加工ＴｉＯに対するストレプトアビジン結合の減少を示している。バイオセンサーへのＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）洗剤吸着の効果、ならびに、撥水層の表面上におけるＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）層の形成、したがって、バイオセンサー上に二重の層（すなわち、撥水性の疎水性層及びＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）の疎水性層）が形成されたことを実証している。このことは、二重層に修飾されたセンサー表面に対するタンパク質の付着及び付着密度の制御能をさらに実証している。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ウェルに対してはＮ＝２４、ならびに、対照ウェルに対してはＮ＝８。

２． ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤は、ＴｉＯ及び撥水コート化ＴｉＯに対するストレプトアビジンの結合能を低下させる。
図１０は、より高密度のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）を吸着した表面は、その下の疎水性ＴｉＯ表面に対するストレプトアビジン結合を低下させることを示している。対照表面には非加工ＴｉＯ及び撥水修飾ＴｉＯが含まれる。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ウェルに対してはＮ＝２４、ならびに、対照ウェルに対してはＮ＝８。

３． ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）層濃度の濃度を変化させることにより種々の密度のストレプトアビジンを作製するために使用された、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）が吸着された表面。
ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤は、撥水修飾表面に対するタンパク質結合量を制御するために使用できる。吸着されたＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）層であって、その中に分散させたタンパク質を含むものは、対象のタンパク質を正確に選択することによって、ならびに、吸着された界面活性剤層中の隙間のタンパク質に適するようにＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）層の密度を注意深く操作することによって、膜結合タンパク質のためのモデルシステムとして使用することができるであろう。表１１は種々のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）修飾表面に対するストレプトアビジン結合を示している。タンパク質の結合量は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）密度の低下にしたがって、特定の臨界濃度に減少し、その後ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）コーティングの完全性／連続性の関数として増加する。

図１２におけるＢＩＮＤ Ｉｍａｇｅｒ^ＴＭ画像は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）コート化表面上に様々な表面密度のストレプトアビジンを有するウェルを示している。

洗剤ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０の結合
ｐＨ７．４のＰＢＳでバイオセンサープレートを３回洗浄した。ＰＢＳを除去し、新たな溶液を加えて２５乃至４０分間インキュべートを行なった。
ａ ＰＢＳ
ｂ ２．５％のＤＭＳＯを含むＰＢＳ
ｃ ２．５％のグリセロールを含むＰＢＳ
ｄ ０．５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳ
ｅ ５％のＤＭＳＯを含むＰＢＳ
プレートはＰＢＳで１０回洗浄した。

合成膜状環境の組成において洗剤は重要な試薬である。図１３は、バイオセンサー表面に安定した洗剤の吸着を集めることが可能であることを示している。ＴＷＥＥＮ（登録商標）は、極性の先端及び非極性の末端を有する非イオン性洗剤である。バイオセンサー表面の化学的性質は、膜状環境の構成においてＴＷＥＥＮ（登録商標）を正しく位置づけるように必要に応じて操ることができる。

シラン層の密度を増加させるためのリン酸を用いたＴｉＯ_２表面の修飾
リン酸を含む環境は、生体脂質の重要な特性である。これらは一般的に脂質のヘテロ機能要素として発見されるものであり、非極性区画を隔離するように脂質を隔離し、正しく位置づける。本実施例では、バイオセンサーと膜状環境との結合した成分を保持していることが示されており、とりわけ、これは脂質試験の支持表面である、シラン機能性を有するリン酸塩の二層構造に関連している。

帯電した活性リン酸チタン（ＴｉＰ）層を得るためのＴｉＯ_２表面の修飾用プロトコル
ＴｉＯ_２コート化ＢＩＮＤ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ（登録商標）試料を、０．０１４５ＭのＨ_３ＰＯ_４溶液を含む水中で、様々な期間で浸した。バイオセンサー試料をリン酸浴から取り除き、水で十分に洗浄した。試料を８０℃で１８時間乾燥させ、さらなる解析及び修飾まで貯蔵した。アミノプロピルトリメトキシシランの１％溶液を、９５％エタノール中で新たに作成した。新たに作成したアミノプロピルトリメトキシシラン溶液を含む９５％エタノール中に、バイオセンサーストリップを一分間浸し、エタノールで４回洗浄して窒素下で乾燥させた。バイオセンサーストリップを、アルミ箔パッケージ中で６５％の相対湿度にて一晩貯蔵した。表５は、ＴｉＰ及びシラン修飾ＴｉＰ表面のＸＰＳ結果を示す。

Ｓｉの欄は、Ｈ_３ＰＯ_４による２時間の表面修飾に対する、最も高いシラン含有量を用いたＴｉＰ修飾の機能として、シラン含有量が増加することを示している。シラン及びリン酸は明らかに存在している。表６のデータはＸＰＳの結果による原子百分率を、リン及びチタンを考慮せずに、また、ＸＰＳスペクトラム中のシランのみの寄与を考慮せずに正規化されたことを示している。

Ｈ_３ＰＯ_４修飾表面のシラン含有量はＴｉＯ表面と類似するものの、二つの表面のアミン基の活性が異なることは、グルタルアルデヒド修飾試薬を使用したアミノ−シラン修飾表面のアルデヒド反応の範囲を測定することにより実証されるとおりである。表６に示される窒素（Ｎ）及びシリコン（Ｓｉ）の有意な存在は、目的の物質である３−アミノプロピルトリメトキシシランによるバイオセンサー表面への安定した適用及び修飾を実証している。実際、これらの二つの要素の存在は、目的の物質の安定な追加による以外に、解析される表面深度において予測されていなかった。

図１４は、シラン修飾ＴｉＯ及びＴｉＯ／ＳｉＯ_２表面のアルデヒド修飾に対するＢＩＮＤ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ（登録商標）シグナルである。Ｎ＝１プレート（９６ウェル）。

図１５は、ＴＩＰ修飾シラン表面に対するより高いＢＩＮＤ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ（登録商標）ＰＷＶシフトにより実証されるように、アルデヒド修飾における改善を示している。この結果は反復可能である。Ｎ＝１プレート（９６ウェル）。

図１６は、リン酸処理を行なった試料を８０℃で１８時間乾燥させた場合のＴｉＰ層の永続性を示している。室温で乾燥させた試料は時間の関数として水接触角の結果を用いて比較した。非アニール化試料が生来のＴｉＯ_２表面の高接触角（約６０乃至７０）特性に戻る一方、安定した低接触角が長時間保持されることによって実証されているように、アニール化した試料が疎水性表面を維持する。

図１は、例えばＳＲＵ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＢＩＮＤ（登録商標）バイオセンサーなどの、比色共鳴バイオセンサーへの脂質の塗布を示している。 図２は、リポソーム作成の工程を示している。 図３は、撥水シランは、ヘキサン洗浄に比べより効果的な疎水性表面処理であることを示している。 図４は、ＰＰＬ及びアルデヒド処理後のストレプトアビジン結合を示している。 図５は、シラン除去処理後のＰｏｌｙ（ポリ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ対Ｐｏｌｙ（ポリ）−Ｌｙｓ付着を示している。 図６は、モデルタンパク質ＰＰＬの捕捉を改善するための疎水性コーティングの最適化の結果を示している。 図７は、シラン除去処理を行ったバイオセンサーに対する水接触角の測定結果を示している。 図８は、界面活性剤（ポリプロピレンオキシド）の疎水性ブロックと疎水性撥水表面との間の好適な相互作用に起因する、より多量のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤結合性を立証している。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ウェルに対しＮ＝２４、対照ウェルに対しＮ＝８である。 図９は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤の分子量の作用としての非加工ＴｉＯに対するストレプトアビジン結合の減少を示している。 図１０は、表面に吸収されている、より高密度のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）が、その下の疎水性ＴｉＯ表面に対するストレプトアビジン結合を減少させることを示している。対照の表面には、非加工ＴｉＯ及び撥水修飾したＴｉＯが含まれる。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ウェルに対しＮ＝２４、対照ウェルに対しＮ＝８である。 図１１は、種々のＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）修飾表面へのストレプトアビジン結合を示している。 図１２は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）による被覆表面上における、異なる面密度のストレプトアビジンを使用したウェルを明示するＢＩＮＤ Ｉｍａｇｅｒ^ＴＭの画像を示している。 図１３は、安定した洗剤吸収により、バイオセンサー表面をアセンブリすることができることを示している。 図１４は、シラン修飾ＴｉＯ及びＴｉＯ／ＳｉＯ_２表面のアルデヒド修飾に対するＢＩＮＤ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ（登録商標）シグナルを示している。Ｎ＝１プレート（９６ウェル）。 図１５は、ＴＩＰ修飾シラン表面に対する、より高いＢＩＮＤ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲ（登録商標）ＰＷＶシフトにより証明されたアルデヒド修飾における改良を示している。結果は反復可能である。Ｎ＝１プレート（９６ウェル）。 図１６は、リン酸で処理した試料を８０℃で１８時間乾燥させた場合の、ＴｉＰ層の不変性を示している。

Claims (13)

1. バイオセンサーの表面が酸化チタン、二酸化チタンまたはリン酸チタンであり、酸化チタン、二酸化チタンまたはリン酸チタン表面をシランで被覆して、酸化チタン−シラン、二酸化チタン−シランまたはリン酸チタン−シラン表面を形成するとともに、脂質二分子層または脂質単分子層が、酸化チタン−シラン、二酸化チタン−シランまたはリン酸チタン−シラン表面に固定化されている、比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサー。
2. バイオセンサーが、マイクロタイタープレートの底部に組み込まれる、またはマイクロアレイフォーマット内にある、請求項１に記載のバイオセンサー。
3. バイオセンサーは、マイクロタイタープレートの底部に組み込まれるものであり、マイクロタイタープレートの各ウェルが約５ｍｍ^２乃至約５０ｍｍ^２である、請求項２に記載のバイオセンサー。
4. 脂質二分子層または脂質単分子層は、標識を有さない、請求項１に記載のバイオセンサー。
5. バイオセンサーが、一種またはそれ以上の界面活性剤でさらに被覆されている、請求項１に記載のバイオセンサー。
6. 酸化チタン−シラン表面、二酸化チタン−シラン表面またはリン酸チタン−シラン表面を、ＰＥＯ（ａ）−ＰＰＯ（ｂ）−ＰＥＯ（ａ）の形状でポリエチレンオキシド及びポリプロピレンオキシドとのブロック共重合体で被覆した、請求項１に記載のバイオセンサー。
7. 比色共鳴バイオセンサーまたは格子型導波路バイオセンサーを用いた、脂質二分子層または脂質単分子層における化学的あるいは物理的相互作用を分析する方法であって、脂質層を種に接触させること、ならびに、（ａ）光の波長がシフトすると種が脂質層と相互に作用する場合には、バイオセンサーの照射に使用される光の反射波長における最大値または伝送波長における最小値を検出することにより、あるいは、（ｂ）屈折率の変化が、種が脂質層と相互に作用したことを示した場合には、バイオセンサーの照射に使用される光の屈折率の変化を検出することにより、脂質層と種の相互作用を分析することが含まれるものであり、ここで、バイオセンサーは酸化チタン−シラン、二酸化チタン−シランまたはリン酸チタン−シラン表面を含み、脂質二分子層または脂質単分子層が酸化チタン−シラン、二酸化チタン−シランまたはリン酸チタン−シラン表面上に固定化されている、該方法。
8. バイオセンサーが、マイクロタイタープレートの底部に組み込まれる、またはマイクロアレイフォーマット内にある、請求項７に記載の方法。
9. バイオセンサーは、マイクロタイタープレートの底部に組み込まれるものであり、マイクロタイタープレートの各ウェルが約５ｍｍ^２乃至約５０ｍｍ^２である、請求項８に記載の方法。
10. 約３００またはそれ以上の試料を約１０分またはそれ以内で分析することが可能である、請求項７に記載の方法。
11. 脂質層は、静止状態で種に接触する、請求項７に記載の方法。
12. 脂質層と種との相互作用が、静止状態で分析される、請求項７に記載の方法。
13. 脂質層及び種は、無標識である、請求項７に記載の方法。

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