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JP4633463B2 - Ｐｅｇ化タンパク質の凝集レベルを低下させるための方法 - Google Patents

Ｐｅｇ化タンパク質の凝集レベルを低下させるための方法 Download PDF

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JP4633463B2 JP2004538262A JP2004538262A JP4633463B2 JP 4633463 B2 JP4633463 B2 JP 4633463B2 JP 2004538262 A JP2004538262 A JP 2004538262A JP 2004538262 A JP2004538262 A JP 2004538262A JP 4633463 B2 JP4633463 B2 JP 4633463B2
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Description

本出願は、２００２年９月２０日に出願されたその対応する仮出願第６０／４１２，２２７号に対して優先権を主張する非仮出願である。本出願は、２００３年８月２５日に出願された米国特許非仮出願第Ｐ−１０７，８９１号の一部継続出願である。前記の仮出願及び非仮出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は概して、目的とするＰＥＧ化ポリペプチドを作製するための組換え法を対象とする。これらの方法は、低レベルのその凝集体及び／又は特定のアイソフォーム不純物を含むＰＥＧ化ポリペプチド産物を生成する。特に、本発明は、（１）その凝集体及び／又はアイソフォーム不純物が低減した成長ホルモンを調製するための組換え法、及び（２）その凝集体及び／又はアイソフォーム不純物が低減した成長ホルモンアンタゴニスト（例えば、ペグビソマント及びそのタンパク質中間体など）を調製するための組換え法も対象とする。より詳細には、本発明の方法によって低減するアイソフォーム不純物は、成長ホルモン及び成長ホルモンアンタゴニスト（又はその中間体）の、それぞれトリスルフィド及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物である。また、この凝集体は、一般に、ＰＥＧ化成長ホルモン、ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト、又はＰＥＧ化タンパク質の望ましくない凝集体である。
ペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃｏｒｐ．）は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである。ペグビソマントは、構造的に改変されているヒト成長ホルモン（「ｈＧＨ」）の類似体である。ペグビソマントのタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）のアミノ酸配列は、９個の位置においてｈＧＨのアミノ酸配列と異なる。具体的なアミノ酸置換は以下の通りである：Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、及び１１７９Ｔ。当分野で充分理解されているように、最初の文字（即ちＨ１８Ｄ）が、番号付けした位置におけるｈＧＨの配列中のアミノ酸を表し（即ち、１８番目のアミノ酸位置は、Ｈ１８Ｄによって示される）、これが二番目の文字（即ちＨ１８Ｄ）によって示されるアミノ酸と置換される。したがってＨ１８Ｄは、野生型ｈＧＨアミノ酸配列の１８番目のアミノ酸位置における、アミノ酸ｈｉｓとアミノ酸ａｓｐの置換を示す。
図１Ａに、ペグビソマント（ＰＥＧＢ−２０３６又はＢ−２０３６ＰＥＧ）のタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）のアミノ酸配列構造を概略的に示し、星印はポリエチレングリコールポリマー（「ＰＥＧ」単位）結合の可能性のある部位示す。さらに、このペグビソマントのタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６−ＰＥＧ単位の結合なし）のアミノ酸配列表を、配列番号１として本明細書では同定する。比較のために、ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列表を、配列番号２として本明細書では同定する。両方の配列表を、ここで提供する。ｈＧＨの配列に関しては、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ他、「疎水性条件下での電気泳動による、大腸菌の生合成ヒト成長ホルモンの定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｕｎｄｅｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８１７：２０５〜２１４（１９９８）も参照のこと。
構造的にペグビソマントは、主に４〜６個のＰＥＧ単位が共有結合している、（１９１アミノ酸残基を含む）タンパク質である。ペグビソマントのタンパク質成分／中間体（Ｂ−２０３６）の分子量は、２１，９９８ダルトンである。ペグビソマントのそれぞれのＰＥＧ単位の分子量は、約５０００ダルトンである。したがって、ペグビソマントの主要な分子量は、約４２，０００（４ＰＥＧ単位／１分子）、４７，０００（５ＰＥＧ単位／１分子）及び５２，０００（６ＰＥＧ単位／１分子）ダルトンである。
アゴニストに関しては、理論によって縛られずに、ホルモン仲介の受容体ホモ二量体化を含めて、１個のｈＧＨ分子がその隣接する（及び同一の）受容体分子の２個と結合すると、内因性ｈＧＨがその受容体を活性化させると考えられる。米国特許第５，８４９，５３５号及び米国特許第６，０５７，２９２号を参照のこと。ｈＧＨの活性は、同一ｈＧＨ分子上の２つの別個の結合部位（部位１及び部位２）の、その隣接する（及び同一の）受容体の２個と結合するその能力に依存する。部位１及び部位２として示されるこれらのｈＧＨ結合部位を１及び２と番号付けして、ｈＧＨ依存性ホモ二量体化を仲介する２つの隣接する（及び同一の）ｈＧＨ受容体とのそれらの結合の順序を表す。
さらに、理論によって縛られずに、ペグビソマントは細胞表面上のヒト成長ホルモン受容体（「ＧＨ受容体」）と選択的に結合し、この場合ペグビソマントは、内因性ヒト成長ホルモンの結合を阻害し、それによってヒト成長ホルモンのシグナル変換を妨げると考えられる。（ｈＧＨと比較した）ペグビソマントのタンパク質部分（「成分又は中間体」とも呼ばれる）に対する構造的改変によって、ペグビソマントはｈＧＨ分子とｈＧＨ受容体の間の相互作用を競合的に阻害することができる。ペグビソマントはＧＨ受容体と結合し、したがってＧＨ結合を阻害する。なぜならその受容体が占有されるからである。この構造的改変によって受容体の二量体化が妨げられ、その結果としてシグナル変換が起こらない。ｈＧＨ分子とｈＧＨ受容体の間の必要とされる密接な相互作用をこのように阻害することによって、ペグビソマントはｈＧＨ受容体のｈＧＨ仲介のホモ二量体化を阻害し、ペグビソマントはそのアンタゴニスト活性を付与する。
このアンタゴニストを使用して、外科手術、放射線療法、及び／又は他の従来の医学的療法に対して適切に応答しない患者、又は他の場合これらの療法に耐えることができない患者の先端巨大症だけには限られないが、これらを含めた状態を治療する。さらに、ペグビソマントのタンパク質部分（Ｂ−２０３６）に対する構造的改変によって、ペグビソマントはｈＧＨのそれより低いプロラクチン受容体に対して結合親和性を示し、これによってペグビソマントの使用と関係がある望ましくない授乳関連の副作用を最小限にする。
ペグビソマントのタンパク質中間体部分（Ｂ−２０３６）は、成長ホルモン受容体アンタゴニスト（Ｂ−２０３６）の遺伝子を保有するプラスミドを加えることによって遺伝的に改変されている大腸菌の系統によって合成される。次いで、Ｂ−２０３６を微生物細胞から回収し精製する。次いで、精製したＢ−２０３６をＰＥＧ化して、ペグビソマント（ＰＥＧＢ−２０３６）を生成する。米国特許第５，８４９，５３５号及び第６，０５７，２９２号は、Ｂ−２０３６を作製する方法、及び１つ又は複数のＰＥＧ単位とＢ−２０３６を結合させるための方法を記載しているが、ただし許容不能な高レベルのそのトリスルフィド及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成の低下、減少、排除、反転及び／又は防止の仕方に関する詳細は含まない。
Ｂ−２０３６を作製するための従来の組換え製造法を使用することによって遭遇する問題の１つは、その脱ｐｈｅ及びトリスルフィドアイソフォームなどの、そのアイソフォーム不純物の形成である。Ｂ−２０３６からＢ−２０３６ＰＥＧ（即ち、ペグビソマントなどのＰＥＧ化Ｂ−２０３６）を作製するための、従来の製造法及び精製法を使用することによって遭遇する他の問題は、以下でさらに論じるＢ−２０３６ＰＥＧの望ましくない「凝集体」の形成である。
脱ｐｈｅアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６分子がそのアミノ末端フェニルアラニンを欠いている不純物である。Ｂ−２０３６の−ＮＨ２端と隣接する主題のアミノ末端フェニルアラニン残基（即ち、文字「Ｆ」によって示される）を示す図１Ａを参照のこと。トリスルフィドアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６分子がその分子内に「トリスルフィド架橋」を形成する過剰なイオウ原子を含む不純物である。図１Ｂ中のボックスを参照のこと。さらに、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ他、「大腸菌内での発現中に形成される、組換えヒト成長ホルモンのトリスルフィド変異体の単離及び特徴付け（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｆｏｒｍｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４７：３１１〜３２１（１９９６）、及びＡ．Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ他、「大腸菌内で生成される、生合成ヒト成長ホルモンのトリスルフィド誘導体の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｕｌｐｈｉｄｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３６５〜３７３（１９９４）を参照のこと。理論によって縛られずに、これらのアイソフォーム不純物は、典型的には、遺伝的に改変された宿主細胞内でＢ−２０３６の細胞増殖（例えば発酵）及び発現（合成及び分泌）中、及び／又はＢ−２０３６タンパク質の抽出及び精製中に生成されると考えられる。
「凝集体」に関する問題に関しては、このような「凝集体」の形成によって、目的とするタンパク質の収率の低下、及びそれを生成するコストの増大が起こる。また、「凝集体」レベルが高すぎる場合、最終タンパク質は、それが治療用途には不適切となるほど低純度のものである可能性がある。
特定の不純物に関しては、国際出願ＷＯ９４／２４１５７（１９９４年１０月２７日に公開されたもの）に、元のｈＧＨと比較して過剰なイオウ原子を含む、ｈＧＨの疎水性誘導体が開示されている。ＷＯ９４／２４１５７の３ページ、３〜１０行目を参照のこと。ｈＧＨの疎水性誘導体の過剰なイオウ原子は、「トリスルフィド架橋」を形成し、ｈＧＨトリスルフィド変異体が生じる。ＷＯ９４／２４１５７の７ページ、１１〜１６行目を参照のこと。ＷＯ９４／２４１５７の参照文献は、このｈＧＨトリスルフィド変異体は、ｈＧＨトリスルフィド変異体をシステイン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール又はジチオトレイトールなどのメルカプト化合物で処理することによって、その元のｈＧＨ形に転換することができることをさらに述べている。ＷＯ９４／２４１５７の４ページ及び５ページを参照のこと。
国際出願ＷＯ９６／０２５７０（１９９６年２月１日に公開されたもの）は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、亜硫酸アンモニウム、又は亜硫酸マグネシウム塩又は亜硫酸カルシウム塩などのアルカリ土類金属亜硫酸塩を使用して、ｈＧＨトリスルフィド変異体をその元の形に転換するための、他の方法を記載している。ＷＯ９４／２４１５７の４ページ、１７〜２１行目を参照のこと。
「少量のトリスルフィドを有する組換えペプチドを生成するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｌｏｗ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅｓ）」という表題の、国際出願ＷＯ００／０２９００（２０００年１月２０日に公開されたもの）は、組換えペプチド、例えばタンパク質及び少量ペプチドの生成における、トリスルフィドの量を減少させるための方法を述べている。本発明は、組換えペプチドの生成におけるトリスルフィドの量を、以前に示唆されたのと同様の成長ホルモンの形成されたトリスルフィドの原形への変換によってではなく、発酵の最中又は発酵後に金属塩を好ましくは過剰に加えることによって減少させることができた、という新規で予想外の知見に基づく。ＷＯ００／０２９００の２ページ、２１〜２７行目を参照のこと。ＷＯ００／０２９００の参照文献は、タンパク質は任意の組換えタンパク質であってよいが、組換え成長ホルモンであることが好ましく、これはヒト及び動物の成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）などであってよいことをさらに述べている。ＷＯ００／０２９００の３ページ、４〜６行目を参照のこと。
「細胞からタンパク質を抽出するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｆｒｏｍ Ｃｅｌｌｓ）」という表題の、国際出願Ｎｏ．ＷＯ０２／０５７４７８（２００２年７月２５日に公開されたもの）は、宿主細胞を還元剤及び洗浄剤と接触させることによって、宿主細胞からタンパク質を切り離す方法を対象としている。この参照文献では、還元剤の目的が、「その元の立体配座であるタンパク質の回収を容易にすること」であると述べられている。ＷＯ０２／０５７４７８の２ページ、１６〜１８行目を参照のこと。さらにＷＯ０２／０５７４７８は、「１つ又は複数の還元剤は、ジスルフィド結合を還元する、且つ／或いはスルフヒドリル残基をその還元形で保つ、物質である」と記載している。任意のこのような１つ又は複数の還元剤を使用することができる。好ましい実施形態では、使用する１つ又は複数の還元剤は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）；ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）；システイン（Ｃｙｓ）及びトリス２−カルボキシエチホスフィン（ＴＣＥＰ）からなる群から選択される。ＷＯ０２／０５７４７８の３ページ２４行目〜４ページ４行目を参照のこと。
精製に関する他の参照文献に関しては、米国特許Ｎｏ．６，２６５，５４２Ｂ１（Ｆａｈｍｅｒ他、表題「分子の精製（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」）；米国特許Ｎｏ．６，３３３，３９８Ｂ１（Ｂｌａｎｋ、表題「タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」）；米国特許Ｎｏ．５，７４７，６３９（表題「ポリエチレングリコールを精製するための、疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用（Ｕｓｅ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｏ Ｐｕｒｉｆｙ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ）」を参照）；国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９６／１９４５９（Ｉｂｒａｈｉｍ他、表題「活性状態のリンカー、並びにその作製法及び精製法（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｉｎｋｅｒｓ；ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ）」）；及び米国特許出願Ｎｏ．Ｕ．Ｓ．２００２／００２２７１Ａｌ（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ他、表題「抗体の精製（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」を参照のこと。
しかしながら、前述の参照文献は、ペグビソマント又はそのタンパク質成分Ｂ−２０３６などの成長ホルモンアンタゴニストと関係があるアイソフォーム不純物形成、及び／又はＰＥＧ化タンパク質、例えばペグビソマントの凝集体形成の防止、反転、低下又は排除に関しては言及していない。したがって、そのアイソフォーム不純物（トリスルフィド及び／又は脱ｐｈｅ）の形成、及び／又はＰＥＧ化タンパク質の凝集体形成を低下、減衰、防止、最小化、反転させるか、且つ／又は排除するＢ−２０３６を作製する改善された方法が必要とされる。同様に、これらの参照文献は、成長ホルモンの脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成及び／又はＰＥＧ化タンパク質、例えばＰＥＧ化成長ホルモン又はＰＥＧ化ヒト成長ホルモンの凝集体形成の検出、減衰、最小化、反転、低下又は排除に関しても言及していない。したがって、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成、及び／又はＰＥＧ化タンパク質、例えばＰＥＧ化成長ホルモン又はＰＥＧ化ヒト成長ホルモンの凝集体形成を低下、減衰、防止、最小化、反転させるか、且つ／又は排除する成長ホルモンを作製する改善された方法が必要とされる。
組換えＰＥＧ化ポリペプチド成長ホルモンアゴニスト、組換えＰＥＧ化ポリペプチドヒト成長ホルモンアゴニスト、組換えＰＥＧ化ポリペプチド成長ホルモンアンタゴニスト、及び／又は組換えＰＥＧ化ポリペプチドヒト成長ホルモンアンタゴニスト、及びそれらの低レベルの望ましくない凝集体及び／又はアイソフォーム不純物を作製するための改善された方法を提供するための前述の必要性を鑑みて、本発明は、組換えＰＥＧ化ポリペプチド成長ホルモン（ヒト成長ホルモンだけには限らないがこれを含む）、及び組換えＰＥＧ化ポリペプチド成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストだけには限らないがこれを含む）、及び低レベルのそれらの凝集体、脱ｐｈｅ及び／又はトリスルフィドアイソフォーム不純物を生成するための改善された方法を対象とする。
組換え成長ホルモン（ｈＧＨだけには限らないがこれを含む）に関しては、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成は、それぞれ（１）キレート剤又は（２）金属塩を充分加えることによって低下させる。
組換え成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストだけには限らないがこれを含む）に関しては、そのトリスルフィドアイソフォーム不純物は、トリスルフィドアイソフォーム不純物と、それぞれ（１）メルカプト化合物、（２）キレート剤、（３）金属塩、（４）メルカプト化合物及び金属塩又は（５）メルカプト化合物とを、キレート剤と接触させた後、ただしキレート剤の不在下で充分に接触させることによって低下させる。
組換え成長ホルモンアンタゴニスト（ヒト成長ホルモンアンタゴニストだけには限らないがこれを含む）に関しては、その脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の形成は、それぞれ（１）キレート剤又は（２）金属塩を充分加えることによって低下させる。
組換えＰＥＧ化タンパク質（ＰＥＧ化ホルモン、ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト、ＰＥＧ化ヒト成長ホルモンアンタゴニスト、ＰＥＧ化成長ホルモン及び／又はＰＥＧ化ヒト成長ホルモンを含むが、それらに限定されない）に関しては、そのＰＥＧ化アイソフォームの分離中に陰イオン交換クロマトグラフィーによって望ましいレベル以下に凝集のレベルを維持するか或いは低下させる。
好ましい実施形態の詳細な説明
本出願において、以下の略語を使用する。
ＡＣ アフィニティクロマトグラフィー
ＡＥＸ 陰イオン交換
ＡＰＩ 活性薬剤成分
ＢＩ 大量の中間体；Ｂ−２０３６（ＰＥＧ化なし）
Ｂ−２０３６ＰＥＧ ＰＥＧ化Ｂ−２０３６
ＰＥＧＢ−２０３６ ＰＥＧ化Ｂ−２０３６
ＣＥ キャピラリー電気泳動
ＣＥＸ 陽イオン交換
ｃｍ センチメートル
ＣＶ カラム容量
ＤＥＡＦ ジエチルアミノエチル
ＨＥＰＥＳ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジンＮ−（２−エタン）スルホン酸
ＨＩＣ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
ＩＥＸ イオン交換
ｋＤａ キロダルトン
Ｌ リットル
ＬＰＭ １分間当たりのリットル
ｍＬ又はｍｌ ミリリットル
ｍＭ ミリモル
ｍＳ ミリジーメン
ＭＷＣＯ 分画分子量
μｍ マイクロメートル
Ｎ 規定度
ＮａＣｌ 塩化ナトリウム
ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム
ＮＷＰ 正規化した水の浸透性
ＰＥＧ ポリエチレングリコール分子又はその変異体
ＰＥＧ−１ ＰＥＧの１分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−２ ＰＥＧの２分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−３ ＰＥＧの３分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−４ ＰＥＧの４分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−５ ＰＥＧの５分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−６ ＰＥＧの６分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−７ ＰＥＧの７分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−８ ＰＥＧの８分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＰＥＧ−９ ＰＥＧの９分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６の１分子又はその変異体
ＲＰＨＰＬＣ 逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＤ 標準偏差
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥＨＰＬＣ サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー
ＴＭＰ 膜内外の性質
ＴＲＩＳ トリス−（２−ヒドロキシメチル）アミノメタン
ＵＦ／ＤＦ 限外濾過／ダイアフィルトレーション
ＵＶ 紫外線
ＷＦＩ 注入用の水
用語「ＰＥＧ化タンパク質」は、ホルモン、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニスト、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト、抗体（又はその断片）、及びＢ−２０３６ＰＥＧを含むが、それらに限定されない。また、「ＰＥＧ化タンパク質」は、１つ又は複数の部位においてＰＥＧ化されている１つ又は複数の当該のタンパク質も含むが、これらに限定されない。
特に明示しない限り、用語「凝集体」は、ＰＥＧ化していてもＰＥＧ化されていなくてもよい、１つ又は複数の当該のタンパク質のスパゲッティ様の塊を指す。「凝集体」は、立体的相互作用又は互いの相互作用によってグループ分けされている多数のタンパク質分子である。「凝集」の例には、（１）多数のＰＥＧ化タンパク質分子、（２）多数の非ＰＥＧ化タンパク質分子、及び／又は（３）少なくとも１つのＰＥＧ化タンパク質分子と少なくとも１つの非ＰＥＧ化タンパク質分子の間の絡み合いがあるが、これらだけには限られない。
特に明示しない限り、「非ＰＥＧ化タンパク質不純物」は、非ＰＥＧ化タンパク質、即ち結合したＰＥＧ分子又はその変異体を含まないタンパク質を含むが、それらに限定されない。
特に明示しない限り、「化学量論的重量比」は、非ＰＥＧ化タンパク質分子の量に対する当該の遊離ＰＥＧ分子の量を指す。
特に明示しない限り、用語「ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム」は、好ましくは共有結合によって結合している１つ又は複数のＰＥＧ部分を有する当該のタンパク質を指す。例えば、用語「ＰＥＧ−１」は、好ましくはリシンアミノ酸残基及び／又はアミノ末端などの位置で１つのＰＥＧ分子が結合しているＢ−２０３６を指す。同様に、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９は、Ｂ−２０３６の１分子と結合したＰＥＧ分子の数を指す。したがって、ＰＥＧ−２は、２つのＰＥＧ分子が結合している１つのＢ−２０３６を指し、ＰＥＧ−３は、１分子のＢ−２０３６に結合している３分子のＰＥＧなどを指す。
特に明示しない限り、用語「充填層容量」は、製造者の提案する作業条件に従い充填した、特定の樹脂の充填層容量を指す。
特に明示しない限り、用語「アイソフォーム不純物」は、少なくとも本明細書に記載するトリスルフィドアイソフォーム不純物、又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を指す。用語「アイソフォーム不純物」は、当分野で認められている他の不純物を含むこともできる。
用語「ＣＥ回収伝導度」は、ＣＥに施された回収ＣＶ分画の伝導度の測定値を指す。
用語「成長ホルモンアンタゴニスト」及び「成長ホルモン受容体アンタゴニスト」は、成長ホルモンとその成長ホルモン受容体の結合を阻害するか、或いは相殺して、成長ホルモンの生物学的作用を阻害するＰＥＧ化ポリペプチド及びポリペプチドを含む（ただし、これらだけには限られない）。ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト又はＰＥＧ化「成長ホルモン受容体アンタゴニスト」は、ＰＥＧ化Ｂ−２０３６、Ｂ−２０３６、又はそれらの変異体であることが好ましい。「変異体」には、（それぞれ）成長ホルモン受容体アンタゴニスト活性を有するその相同体（Ｂ−２０３６と比較して、特に保存アミノ酸の置換、付加又は欠失がある相同体）、類似体、断片、擬似ペプチド、抗体などがあるが、これらだけには限られない。
用語「成長ホルモンアゴニスト」及び「成長ホルモン受容体アゴニスト」は、その成長ホルモン受容体と結合し、それを活性化させる、ＰＥＧ化ポリペプチド及びポリペプチドを含む（ただし、これらだけには限られない）。「成長ホルモンアゴニスト」又は「成長ホルモン受容体アゴニスト」は、ＰＥＧ化ヒト成長ホルモン、ヒト成長ホルモン又はそれらの変異体であることが好ましい。「変異体」には、（それぞれ）成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有する、その相同体（ヒト成長ホルモンと比較して、特に保存アミノ酸の置換、付加又は欠失がある相同体）、類似体、断片、擬似ペプチド、抗体などがあるが、これらだけには限られない。
用語「及び（ａｎｄ）」は、関連不純物（例えば、トリスルフィド又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物及び／又は凝集体）のレベルの、目的とする低下をもたらすためのプロセスを列挙するのに適切或いは必要な、「及び」又は「又は」を意味することができる。
用語「又は（ｏｒ）」は、関連不純物（例えば、トリスルフィド又は脱ｐｈｅアイソフォーム不純物及び／又は凝集体）のレベルの、目的とする低下をもたらすためのプロセスを列挙するのに適切或いは必要な、「及び」又は「又は」を意味することができる。
本明細書で使用するように、特に明示しない限り、用語「低下」（又はその明らかな活用形）は、トリスルフィドアイソフォーム不純物であっても脱ｐｈｅアイソフォーム不純物であっても、当該のＰＥＧ化タンパク質及び／又は関連アイソフォーム不純物の「凝集」レベルの量を、維持、排除、最小化、減少、防止、反転及び／又は減衰させることを意味する。
特に明示しない限り、用語「宿主細胞」（又はその明らかな活用形）は、その中で組換えＢ−２０３６又は組換えｈＧＨを形成することができる任意の宿主細胞を指す。したがって、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞、植物宿主細胞、或いは大腸菌又はさらに酵母菌細胞などの微生物宿主細胞であってよい。宿主細胞は、その中で目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分又は組換えｈＧＨを増殖させるのに充分な細胞でなければならないことを記すことは重要である。このように、宿主細胞が何でなければならないかに関して制約はない。ただし、宿主細胞は、当該のＢ−２０３６タンパク質成分もしくは組換えｈＧＨ、又はそれらの「変異体」を組換えによって生成することができる細胞でなければならない。
さらに、本明細書で使用するように、特に明示しない限り、用語「増殖（ｇｒｏｗｉｎｇ）」（又はその明らかな活用形、例えばｇｒｏｗｔｈ）は、宿主細胞を発酵及び培養、或いは充分に増殖させて所望量の組換えＢ−２０３６タンパク質成分又は組換えｈＧＨを生成することを含むが、それらに限定されない。
さらに、特に明示しない限り、本発明は組換えＢ−２０３６及び組換えＢ−２０３６ＰＥＧに関して記載するが、それが哺乳動物成長ホルモン又はそのアンタゴニスト、ヒト成長ホルモン又はそのアンタゴニスト、或いはウシ成長ホルモン又はそのアンタゴニストなどであろうと、任意の組換え成長ホルモンアゴニスト、組換え成長ホルモンアンタゴニストと共に、本発明を使用することができることは理解されよう。
ペグビソマント（本明細書ではＰＥＧＢ−２０３６又はＢ−２０３６ＰＥＧと呼ぶ）は、組換え宿主細胞（例えば、組換え、遺伝的改変型大腸菌宿主細胞）中で生成される、ＰＥＧ化形態の組換えタンパク質（Ｂ−２０３６）である。Ｂ−２０３６タンパク質は、細胞増殖中（例えば発酵によって）及び発現中（合成及び分泌）に生成される。その生成後、Ｂ−２０３６を単離し（例えばホモ二量体化による）、次に精製する（例えば抽出、遠心分離、逆相及び陰イオン交換クロマトグラフィー、並びにバッファー交換による）。しかしながら、示したように、Ｂ−２０３６タンパク質の組換え生成中に、Ｂ−２０３６のトリスルフィド及び脱ｐｈｅアイソフォーム不純物である、Ｂ−２０３６の望ましくないアイソフォーム不純物が形成される。
示したように、図１Ａは、それぞれの文字表記した位置にどのアミノ酸が存在するかを示す標準的な１文字の略語で、Ｂ−２０３６のアミノ酸配列を示す。参考のために、文字とその関連アミノ酸の間の対応を示す、以下の表１を参照のこと。
Figure 0004633463
さらに、Ｂ−２０３６のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１として示し、アミノ酸配列ｈＧＨは、本明細書では配列番号２として示す。
１．組換え成長ホルモンアンタゴニスト、及びそのトリスルフィドアイソフォーム不純物
図１Ｂは、Ｂ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物のアミノ酸配列構造を示す。特に、このトリスルフィドアイソフォーム不純物は、Ｂ−２０３６タンパク質成分の１８２位と１８９位のシステイン間の架橋中に、過剰なイオウ原子を含む。
ａ．メルカプト化合物による、トリスルフィドアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、選択したメルカプト化合物と、組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物との接触によって、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン原形への転換がもたらされると考えられる。さらに、これもまた理論によって縛られずに、メルカプト化合物の存在によって、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成が妨げられる可能性がある。
典型的には、メルカプト化合物を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質を好ましくはＰＥＧ化して、ＰＥＧＢ−２０３６（ペグビソマント）を生成させる。ＰＥＧ化の手順に関しては、米国特許第５，８４９，５３５号及び米国特許第５，６７２，６６２号を参照のこと。
任意のメルカプト化合物を本発明に関して使用することができ、これは、Ｂ−２０３６タンパク質成分及びそのトリスルフィドアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくはＢ−２０３６の生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な化合物である。本発明と共に使用するのに適した好ましいメルカプト化合物には、亜硫酸塩、グルタチオン、β−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、メルカプトエチルアミン、ジチオエリトリトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、システイン、及びシスチンと組み合わせたシステインがあるが、これらだけには限られない。
本発明と共に使用するのに適した他の適切なメルカプト化合物は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｊ．Ｈｏｕｋ及びＧ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、「チオール−ジスルフィド相互交換に関する構造−反応性の関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｉｏｌ−Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ）」Ｊ．Ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：６８２５〜６８３６（１９８７）；（２）Ｓｉｇｍｕｎｄ、Ｍ．、「アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質中のスルヒドロ基の化学及び生化学（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｌｆｈｙｄｒｏ Ｇｒｏｕｐ ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、１ｓｔＥｄ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７３）。特に、本発明と共に使用するのに適した代表的なメルカプト化合物の一覧に関しては、前の項目（１）中に示される、Ｈｏｕｋ他の表ＩＩを参照のこと。
適切なメルカプト化合物の中では、システイン、又はシスチンと組み合わせたシステイン（二量体化システイン）が最も好ましい。本発明と共に使用するのに適した、システイン、又はシステインとシスチンの組合せ（存在する場合は二量体化システイン）の量は、形成されるトリスルフィドアイソフォーム不純物を、その最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度）のそれぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適した、システインと任意のシスチンとの組合せ初期濃度は、それぞれ少なくとも約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約１ｍＭ〜約５ｍＭであることが好ましい。
メルカプト化合物はバッファー溶液として提供することが好ましい。そのバッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を妨げない、或いは一度それが形成された後に分解しない、バッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましいバッファーはＴｒｉｓである。好ましい最初のバッファー濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約４〜約９、約７．５〜約８．５、或いは約７．５〜約８．０の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。特に、高濃度のメルカプト化合物が使用される場合、例えば約９．５という高いｐＨレベルを許容することができる。したがって、例えば、Ｂ−２０３６に対して多量のシステインが使用される場合、したがって、バッファーのｐＨは約９．５という程度に高くてよい。
前述のように、メルカプト化合物はバッファー溶液として提供することが好ましい。さらに、バッファー中のメルカプト化合物の量は、メルカプト化合物のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比が、約０．５〜約１，０００であるような量でなければならない。使用するメルカプト化合物が、システインの組合せ、及び場合によっては、シスチンと組み合わせたシステインであるとき、このことが特に当てはまる。或いは、メルカプト化合物のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比は、それぞれ約１〜約１，０００、約１〜約５００、又は約１〜約１０であってよい。
典型的には、メルカプト化合物と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）Ｂ−２０３６タンパク質成分との（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに）充分な接触が終了した後、バッファー中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、バッファー、メルカプト化合物、及びＢ−２０３６を含むがそれだけには限られないその他の成分を含む増殖培地の温度範囲は、Ｂ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物にメルカプト化合物を加えた後に、好ましくは約０℃〜約２５℃の温度に保たなければならない。また、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約８℃に保つことが好ましい。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、メルカプト化合物及びＢ−２０３６などを含む）の温度を、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度未満の温度に保つことが望ましい。
さらに、Ｂ−２０３６成分とメルカプト化合物との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約２４時間、又は約１時間〜約４時間でなければならない。
典型的には、メルカプト化合物とＢ−２０３６成分との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は約１００リットル〜約３００リットルの容量を有する。他の適切な代表的な容量は、１６０リットル〜約５００リットルの任意の範囲であってよい。
メルカプト化合物とＢ−２０３６成分との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（１つの増殖培地中の宿主細胞、その溶解物、バッファー、メルカプト化合物、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、Ｂ−２０３６タンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
ｂ．キレート剤によるトリスルフィドアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、選択したキレート剤と、（１）トリスルフィドアイソフォーム不純物、（２）組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６、（３）（アンタゴニストの組換え生成用の）宿主細胞の細胞成分、及び（４）（１）〜（３）のすべての組合せとの接触によって、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン原形への転換、又は不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。さらに、これもまた理論によって縛られずに、キレート剤の存在によって、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成が妨げられる可能性がある。
典型的には、キレート剤を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質を好ましくはＰＥＧ化して、ＰＥＧＢ−２０３６（ペグビソマント）を生成させる。ＰＥＧ化手順に関しては、米国特許第５，８４９，５３５号を参照のこと。
任意のキレート剤を本発明に関して使用することができ、これは、Ｂ−２０３６タンパク質成分及びそのトリスルフィドアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくはＢ−２０３６の生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分なキレート剤である。本発明と共に使用するのに適した好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＰＡがあるが、これらだけには限られない。他の代表的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、エデト酸カルシウム２ナトリウム、エデト酸２ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸３ナトリウム、ペニシルアミン、ペンテテートトリナトリウムカルシウム、ペンテト酸、スクシマー、及びトリエンチンがあるが、これらだけには限られない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形であることを記す。
本発明と共に使用するのに適した他の適切なキレート剤は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
適切なキレート剤の中では、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明と共に使用するのに適したキレート剤の量は、形成されるトリスルフィドアイソフォーム不純物を、その最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適したＥＤＴＡの初期濃度は、それぞれ少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭであることが好ましい。
キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。そのバッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を妨げないか、或いは一度それが形成された後に分解しないバッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましいバッファーはＴｒｉｓである。好ましいバッファー初期濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約６〜約９、約６．５〜約７．５、或いは約７．２〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
前述のように、キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。さらに、バッファー中のキレート剤の量は、キレート剤のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比が約１〜約１，０００であるような量でなければならない。或いは、キレート剤のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比は、それぞれ約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、約６０〜約１１０であってよい。
典型的には、キレート剤と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）Ｂ−２０３６タンパク質成分との（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに）充分な接触が終了した後、バッファー中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、キレート剤、及びＢ−２０３６を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、Ｂ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物にキレート剤を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。好ましくは、約４℃の温度でキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を加えることによって、Ｂ−２０３６を含むホモジェネートの温度が、均質化により約３０℃に上昇することを記す。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、キレート剤及びＢ−２０３６などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、キレート剤とＢ−２０３６成分との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は１００リットル〜約３００リットルの容量を有する。他の適切な代表的な容量は、１６０リットル〜約５００リットルの任意の範囲であってよい。
キレート剤とＢ−２０３６成分との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、キレート剤、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、Ｂ−２０３６タンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
ｃ．金属塩によるトリスルフィドアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、選択した金属塩と、（１）トリスルフィドアイソフォーム不純物、（２）組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６、（３）（アンタゴニストの組換え生成用の）宿主細胞の細胞成分、及び（４）（１）〜（３）のすべての組合せとの接触によって、システイン−Ｓ−Ｓ−Ｓ−システイントリスルフィド架橋の、そのシステイン−Ｓ−Ｓ−システイン原形への転換、又は不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。さらに、これもまた理論によって縛られずに、金属塩の存在によって、トリスルフィド架橋自体のさらなる形成が妨げられる可能性がある。
典型的には、金属塩を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質を好ましくはＰＥＧ化して、ＰＥＧＢ−２０３６（ペグビソマント）を生成させる。ＰＥＧ化手順に関しては、米国特許第５，８４９，５３５号を参照のこと。
任意の金属塩を本発明に関して使用することができ、それは、Ｂ−２０３６タンパク質成分及びそのトリスルフィドアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくはＢ−２０３６の生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な金属塩である。本発明と共に使用するのに適した金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。本発明と共に使用するのに適した好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛、及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。
他の適切な金属塩は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
本発明と共に使用するのに適した金属塩の中では、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２、及びこれらの組合せも好ましい。本発明と共に使用するのに適した金属塩の量は、形成されるトリスルフィドアイソフォーム不純物を、その最高濃度（又はその最高平均濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、トリスルフィドアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高濃度（又はその最高平均濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適した金属塩（例えばリン酸ナトリウム）の初期濃度は、それぞれ少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭであることが好ましい。
金属塩はバッファー溶液として提供することが好ましい。しかしながら、リン酸ナトリウムは、バッファー及び適切な金属塩として作用することができる。しかしながら、さらに別の適切な金属塩を、リン酸ナトリウムバッファーに加えることができる。バッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を妨げないか、或いは一度それが形成された後に分解しないバッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましいバッファー初期濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約４〜約９、約４．５〜約７．５、或いは約５．５〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
金属塩をバッファー溶液として提供した後（或いはＮａＰの場合、ＮａＰ溶液が金属塩及びバッファーとして作用する場合）、バッファー（又はバッファーとしても作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、金属塩のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比が、約１〜約１０，０００であるような量でなければならない。或いは、金属塩のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比は、それぞれ約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であってよい。
典型的には、金属塩と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）Ｂ−２０３６タンパク質成分との（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに）充分な接触が終了した後、バッファー中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、金属塩、及びＢ−２０３６を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、Ｂ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に金属塩を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。金属塩（例えばＮａＰ）を用いた均質化によって、ホモジェネートの温度が上昇する可能性があることを記す。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、金属塩、Ｂ−２０３６、及び場合によってはメルカプト化合物などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、金属塩とＢ−２０３６成分との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は約２００リットル〜約１，５００リットルの容量を有する。
金属塩とＢ−２０３６成分との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、金属塩、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、Ｂ−２０３６タンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
２．組換え成長ホルモンアンタゴニスト、及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物
ａ．キレート剤による脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、キレート剤を組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６に加えることにより、そのレベルを実際に低下させること、及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成を防止することによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。
典型的には、キレート剤を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質を好ましくはＰＥＧ化して、ＰＥＧＢ−２０３６（ペグビソマント）を生成させる。ＰＥＧ化手順に関しては、米国特許第５，８４９，５３５号を参照のこと。
任意のキレート剤を本発明に関して使用することができ、これは、Ｂ−２０３６タンパク質成分及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくはＢ−２０３６の生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分なキレート剤である。本発明と共に使用するのに適した好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＰＡがあるが、これらだけには限られない。他の代表的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、エデト酸カルシウム２ナトリウム、エデト酸２ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸３ナトリウム、ペニシルアミン、ペンテテートトリナトリウムカルシウム、ペンテト酸、スクシマー、及びトリエンチンがあるが、これらだけには限られない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形であることを記す。
本発明と共に使用するための他の適切なキレート剤は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
適切なキレート剤の中では、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明と共に使用するのに適したキレート剤の量は、形成される脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を、その最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適したＥＤＴＡの最初の濃度は、それぞれ少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭであることが好ましい。
キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。そのバッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を妨げない、或いは一度それが形成された後に分解しないバッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましいバッファーはＴｒｉｓである。好ましいバッファー初期濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約６〜約９、約６．５〜約７．５、或いは約７．２〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
前述のように、キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。さらに、バッファー中のキレート剤の量は、キレート剤のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比が、約１〜約１，０００であるような量でなければならない。或いは、キレート剤のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比は、それぞれ約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、約６０〜約１１０であってよい。
典型的には、キレート剤と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）Ｂ−２０３６タンパク質成分との（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに）充分な接触が終了した後、バッファー中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、キレート剤、及びＢ−２０３６を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、Ｂ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物にキレート剤を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。好ましくは、約４℃の温度でキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を加えることによって、Ｂ−２０３６を含むホモジェネートの温度が、均質化により約３０℃に上昇することを記す。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、キレート剤及びＢ−２０３６などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、Ｂ−２０３６成分とキレート剤との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、キレート剤とＢ−２０３６成分との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は１００リットル〜約３００リットルの容量を有する。他の適切な代表的な容量は、１６０リットル〜約５００リットルの任意の範囲であってよい。
キレート剤とＢ−２０３６成分との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、キレート剤、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、Ｂ−２０３６タンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
ｂ．金属塩による脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、金属塩を組換え成長ホルモンアンタゴニストＢ−２０３６に加えることにより、そのレベルを実際に低下させること、及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成を防止することによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。
典型的には、金属塩を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換えＢ−２０３６タンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、Ｂ−２０３６タンパク質を精製することが好ましい。その後、精製したタンパク質を好ましくはＰＥＧ化して、ＰＥＧＢ−２０３６（ペグビソマント）を生成させる。ＰＥＧ化手順に関しては、米国特許第５，８４９，５３５号を参照のこと。
任意の金属塩を本発明に関して使用することができ、それは、Ｂ−２０３６タンパク質成分及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくはＢ−２０３６の生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な金属塩である。本発明と共に使用するのに適した金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。本発明と共に使用するのに適した好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛、及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。
本発明と共に使用するのに適した、他の適切な金属塩は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
本発明と共に使用するのに適した金属塩の中では、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２、及びこれらの組合せも好ましい。本発明と共に使用するのに適した金属塩の量は、形成される脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を、その最高濃度（又はその最高平均濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高濃度（又はその最高平均濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適した金属塩（例えばリン酸ナトリウム）の最初の濃度は、それぞれ少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭであることが好ましい。
金属塩はバッファー溶液として提供することが好ましい。しかしながら、リン酸ナトリウムは、バッファー及び適切な金属塩として作用することができる。しかしながら、追加の適切な金属塩を、リン酸ナトリウムバッファーに加えることができる。バッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を害さないバッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましい最初のバッファー濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約４〜約９、約４．５〜約７．５、或いは約５．５〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
金属塩をバッファー溶液として提供した後（或いはＮａＰの場合、ＮａＰ溶液が金属塩及びバッファーの両者として作用する）、バッファー（又はバッファーとしても作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、金属塩のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比が、約１〜約１０，０００であるような量でなければならない。或いは、金属塩のモル数とＢ−２０３６タンパク質のモル数とのモル比は、それぞれ約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であってよい。
典型的には、金属塩と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）Ｂ−２０３６タンパク質成分との（トリスルフィドアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに）充分な接触が終了した後、バッファー中のＢ−２０３６タンパク質成分は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、金属塩、及びＢ−２０３６を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、Ｂ−２０３６タンパク質成分を含む宿主細胞又はその溶解物に金属塩を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、Ｂ−２０３６成分を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。金属塩（例えばＮａＰ）を用いた均質化によって、ホモジェネートの温度が上昇する可能性があることを記す。Ｂ−２０３６タンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、Ｂ−２０３６のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、金属塩、Ｂ−２０３６、及び場合によってはメルカプト化合物などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、Ｂ−２０３６成分と金属塩との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、金属塩とＢ−２０３６成分との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は２００リットル〜約１，５００リットルの容量を有する。
金属塩とＢ−２０３６成分との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、金属塩、Ｂ−２０３６成分及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、Ｂ−２０３６タンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
３．組換え成長ホルモン、及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物
ａ．キレート剤による脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、キレート剤を組換え成長ホルモンに加えることにより、そのレベルを実際に低下させ、及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成を防止することによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。
典型的には、キレート剤を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換え成長ホルモンタンパク質を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、成長ホルモンタンパク質を精製することが好ましい。
任意のキレート剤を本発明に関して使用することができ、キレート剤は、成長ホルモンタンパク質及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくは成長ホルモンの生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分なキレート剤である。本発明と共に使用するのに適した好ましいキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びＤＴＰＡがあるが、これらだけには限られない。他の代表的なキレート剤には、デフェロキサミン、ジチオカルブナトリウム、エデト酸カルシウム２ナトリウム、エデト酸２ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸３ナトリウム、ペニシルアミン、ペンテテートトリナトリウムカルシウム、ペンテト酸、スクシマー、及びトリエンチンがあるが、これらだけには限られない。エデト酸ナトリウムは、ＥＤＴＡの塩形であることを記す。
本発明と共に使用するための他の適切なキレート剤は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
適切なキレート剤の中では、ＥＤＴＡが最も好ましい。本発明と共に使用するのに適したキレート剤の量は、形成される脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を、その最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高平衡濃度（又はその最高平均平衡濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適したＥＤＴＡの最初の濃度は、それぞれ少なくとも約０．０１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、又は約２ｍＭ〜約５ｍＭであることが好ましい。
キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。そのバッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を妨げない、或いは一度それが形成された後に分解しない、バッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましいバッファーはＴｒｉｓである。好ましい最初のバッファー濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約６〜約９、約６．５〜約７．５、或いは約７．２〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
前述のように、キレート剤はバッファー溶液として提供することが好ましい。さらに、バッファー中のキレート剤の量は、キレート剤のモル数と成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）のモル数とのモル比が、約１〜約１，０００であるような量でなければならない。或いは、キレート剤のモル数と成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）のモル数とのモル比は、それぞれ約２０〜約１，０００、約５０〜約２５０、約６０〜約１１０であってよい。
典型的には、キレート剤と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）の間の、（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための）充分な接触が終了した後、バッファー中の成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、キレート剤、及び成長ホルモンタンパク質を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞又はその溶解物にキレート剤を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。好ましくは、約４℃の温度でキレート剤（例えばＥＤＴＡ）を加えることによって、成長ホルモンタンパク質を含むホモジェネートの温度が、均質化により約３０℃に上昇することを記す。成長ホルモンタンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、成長ホルモンタンパク質のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、キレート剤及び成長ホルモンタンパク質などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、成長ホルモンタンパク質とキレート剤との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、キレート剤と成長ホルモンタンパク質との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１０リットル〜約５００リットル、又は約１００リットル〜約３００リットルの容量を有する。他の適切な代表的な容量は、１６０リットル〜約５００リットルの任意の範囲であってよい。
キレート剤と成長ホルモンタンパク質との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、キレート剤、成長ホルモンタンパク質及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、成長ホルモンタンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
ｂ．金属塩による脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の低下
理論によって縛られずに、金属塩を組換え成長ホルモンに加えることにより、そのレベルを実際に低下させること、及び／又はさらなる脱ｐｈｅ形成を防止することによって、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルの低下がもたらされると考えられる。
典型的には、金属塩を、宿主細胞の増殖の最中又は後（或いは最中及び後）に、目的とする組換え成長ホルモンタンパク質成分を合成する宿主細胞に加える。さらに、増殖及び接触ステップを行った後に、成長ホルモンタンパク質を精製することが好ましい。
任意の金属塩を本発明に関して使用することができ、これは、成長ホルモンタンパク質成分及びその脱ｐｈｅアイソフォーム不純物と接触させる場合（好ましくは適切に混合させる場合）、好ましくは成長ホルモンの生成物を分解（或いは実質的に分解）せずに、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な金属塩である。本発明と共に使用するのに適した金属塩には、アルカリ土類金属塩、アルカリ土類金属塩、遷移金属塩及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。本発明と共に使用するのに適した好ましい金属塩には、リン酸カリウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化亜鉛、及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。
本発明と共に使用するための他の適切な金属塩は、以下の参照文献中に記されている：（１）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓ．Ｂｕｄａｖａｒｉ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．、「治療カテゴリー及び生物学的活性の索引（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃａｔｅｇｏｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）」、ｐ．ＴＨＥＲ１９（ｕｎｄｅｒ“ＣＨＥＬＡＴＩＮＧ ＡＧＥＮＴ”）、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ（１９９６）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版、（２）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１６ｔｈ Ｅｄ．、Ａｒｔｈｕｒ Ｏｓｏｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）、及びその今日までのそれぞれ毎回の後版；（３）「米国薬局方（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）」、２１ｔｈ Ｒｅｖｉｓｉｏｎ（１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、「米国薬局方の慣習（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）」、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８５）、及びそれらの今日までのそれぞれ毎回の後版；（４）ＳＩＧＭＡ、「ライフサイエンス調査カタログの生化学物質及び試薬（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ（２００２〜２００３）；及び（５）Ａｌｄｒｉｃｈ、「ファインケミカル及び研究室用機器のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）」、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（２０００〜２００１）及びその（２００２〜２００３）版。
本発明と共に使用するのに適した金属塩の中では、リン酸ナトリウム、ＺｎＣｌ２、及びこれらの組合せも好ましい。本発明と共に使用するのに適した金属塩の量は、形成される脱ｐｈｅアイソフォーム不純物を、その最高濃度（又はその最高平均濃度、この場合、多数のバッチを平均する）の少なくとも約１０％低下させるのに充分な量でなければならない。好ましくは、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物の量の低下は、形成されるその最高濃度（又はその最高平均濃度）の、それぞれ少なくとも約２０％、３０％、４０％、又は５０％である。本発明と共に使用するのに適した金属塩（例えばリン酸ナトリウム）の最初の濃度は、それぞれ少なくとも約０．１ｍＭ、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、約５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約１００ｍＭであることが好ましい。
金属塩はバッファー溶液として提供することが好ましい。しかしながら、リン酸ナトリウムは、バッファー及び適切な金属塩として作用することができる。しかしながら、追加の適切な金属塩を、リン酸ナトリウムバッファーに加えることができる。バッファーは、本発明と共に使用するのに適したバッファー、即ちＢ−２０３６タンパク質成分の形成を害さない、或いは一度それが形成された後に分解しない、バッファーであることが好ましい。本発明に関して使用するのに適した適切なバッファーには、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンがあるが、これらだけには限られない。好ましい最初のバッファー濃度は、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、より好ましくは約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、さらにより好ましくは約８ｍＭ〜約７０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである。他の適切なバッファーを使用することができる。これらのバッファーは、それぞれ約４〜約９、約４．５〜約７．５、或いは約５．５〜約７．５の範囲に、増殖培地の任意の場所のｐＨを維持するのに充分であることが好ましい。
金属塩をバッファー溶液として提供した後（或いはＮａＰの場合、ＮａＰ溶液が金属塩及びバッファーとして作用する場合）、バッファー（又はバッファーとしても作用するＮａＰ溶液）中の金属塩の量は、金属塩のモル数と成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）のモル数とのモル比が、約１〜約１０，０００であるような量でなければならない。或いは、金属塩のモル数と成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）のモル数とのモル比は、それぞれ約３００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、又は約５００〜約２５００であってよい。
典型的には、金属塩と（宿主細胞中或いは宿主細胞由来の）成長ホルモンタンパク質（例えばｈＧＨ）の間の、（脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための）充分な接触が終了した後、バッファー中の成長ホルモンタンパク質は、それぞれ約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。
さらに、増殖培地及びバッファー、金属塩、及び成長ホルモンタンパク質を含むがそれだけには限られないその他の成分の温度範囲は、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞又はその溶解物に金属塩を加えた後に、好ましくは約０℃〜約３５℃の温度に保たなければならない。さらに、成長ホルモンタンパク質を含む宿主細胞及び／又はそれに由来する溶解物の温度は、それぞれ約１℃〜約１５℃、約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約１５℃に保つことが好ましい。金属塩（例えばＮａＰ）を用いた均質化によって、ホモジェネートの温度が上昇する可能性があることを記す。成長ホルモンタンパク質の変性が約４０＋℃で起こることを記すことは重要である。このように、成長ホルモンタンパク質のタンパク質変性温度未満の温度に、ホモジェネート（即ち、宿主細胞、増殖培地、バッファー、金属塩、成長ホルモンタンパク質、及び場合によってはメルカプト化合物などを含む）の温度を保つことが望ましい。
さらに、成長ホルモンタンパク質と金属塩との接触時間は、脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるのに充分な時間でなければならない。脱ｐｈｅアイソフォーム不純物のレベルを低下させるための代表的な適切な接触時間は、それぞれ少なくとも約３０分、約１時間〜約４８時間、又は約５時間〜約１５時間であるはずである。
典型的には、金属塩と成長ホルモンタンパク質との充分な接触の後、これらを含むバッファーは、それぞれ約１リットル〜約５，０００リットル、約１００リットル〜約２，０００リットル、又は２００リットル〜約１，５００リットルの容量を有する。
金属塩と成長ホルモンタンパク質との接触中に、関心が持たれる可能性がある他のパラメータには、混合速度などの事項がある。混合速度は、形成される可能性がある泡沫の量を最少に抑えながら、（増殖培地中の、宿主細胞、その溶解物、バッファー、金属塩、成長ホルモンタンパク質及び任意の他の成分の）均質な混合物を形成するのに充分なものでなければならない。当業者は、充分な混合速度を如何にすべきかを、容易に決定することができる。混合速度が、温度が前述の範囲に保たれ、成長ホルモンタンパク質成分の任意の分解が最少になるようなものでなければならないことは明らかである。
４．ＰＥＧ化ポリペプチド、及びその凝集体
ａ．陰イオン交換クロマトグラフィーによる凝集体の低下
Ｂ−２０３６ＰＥＧの製造及び精製において、大量の中間体又はＢ−２０３６分子は前述のように調製する。その後、Ｂ−２０３６分子を以下の６ステップに従い処理して、当該のＢ−２０３６ＰＥＧタンパク質である最終ＡＰＩを生成させる。これらの６ステップは以下の通りである：
１．ＰＥＧ化Ｂ−２０３６を生成するためのＰＥＧ化、
２．ＨＩＣ回収物を生成するための、ＨＩＣクロマトグラフィー（場合により行われるステップ）
３．ダイアフィルトレーション回収物を生成するための、限外濾過／ダイアフィルトレーション（場合により行われるステップ）
４．ＡＥＸ回収物を生成するための、ＡＥＸクロマトグラフィー及び回収
５．ダイアフィルトレーション回収物を生成するための、ＡＥＸ回収物のダイアフィルトレーション、及び
６．最終ＡＰＩを生成するための、ＡＰＩ濾過（滅菌目的、好ましくは、０．２２μのフィルターを介して凍結用の回収ボトルに）。
前述のステップ１〜６は例示的なものであり、フローチャート１及び実施例１に示す。
ステップ１を参照すると、このＰＥＧ化ステップは、当該のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームをもたらす、特許請求する本発明の最初のステップを行う。その後、両方共に任意選択であるとみなされる、ＨＩＣステップ２及び後のダイアフィルトレーションステップ３を行って、ステップ２中に除去することができる任意の非ＰＥＧ化タンパク質、遊離ＰＥＧ分子、又は任意の他の不純物を除去することが好ましい。ステップ３の後、次いで、ステップ３のダイアフィルトレーション回収物をステップ４の陰イオン交換クロマトグラフィーに供して、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８及びＰＥＧ−９アイソフォームを分離し、次いでこれらを回収して、好ましくは、ステップ５においてダイアフィルトレーションのさらなる処理、それに続く最終ＡＰＩ生成物を生成するためのステップ６の滅菌濾過のために、最終生成物中のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６アイソフォームのレベルを濃化して最終生成物にする。
ここでＰＥＧ化ステップ１に戻り参照すると、Ｂ−２０３６分子自体をＰＥＧ化してＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８及びＰＥＧ−９アイソフォームを含めたＢ−２０３６ＰＥＧにするのに充分な条件にＢ−２０３６分子を供する。好ましいＰＥＧ化のパラメータを、フローチャート１及び実施例１に示す。ＰＥＧ分子が好ましくは共有結合によって結合することができるＢ−２０３６分子及び任意の他の分子は、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−５Ｋ、ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボネート−５Ｋ、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート−５Ｋ、ＰＥＧ２−マレミド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）、ＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシイミド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）、及びＰＥＧ２−アルデヒド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）からなる群から選択されるＰＥＧ分子である。ＰＥＧ化用にＢ−２０３６分子（又はＰＥＧ化が必要とされる任意の他の当該のタンパク質）に加えられるＰＥＧ分子の量は、遊離（非結合）ＰＥＧ分子の量と、非ＰＥＧ化タンパク質分子の量との化学量論的重量比が約０．５〜約１００、好ましくは約１．５〜約２．５、より好ましくは約１．９〜約２、最も好ましくは約１．９５〜約２．０５であるような量でなければならない。ＰＥＧ化の際に、Ｂ−２０３６分子（又はＰＥＧ化される任意の他の当該のタンパク質）は、約３〜約１０、好ましくは約７．２〜約７．８、より好ましくは約７．４〜約７．８、最も好ましくは約７．４０〜約７．８０のＰＥＧ化ｐＨでＰＥＧ化される。ＰＥＧ化ステップを行う温度を、ＰＥＧ化温度と呼ぶ。ＰＥＧ化温度は約０℃〜約４０℃、好ましくは約１０℃〜約３０℃、及びより好ましくは約１８℃〜約２５℃である。
ここで場合により行われるＨＩＣステップ２を参照すると、このステップを行うための好ましいパラメータを、実施例１及びフローチャート１に示す。場合により行われるＨＩＣクロマトグラフィーステップ２中に、ＰＥＧ化タンパク質及び任意の非ＰＥＧ化タンパク質を、ＨＩＣ樹脂の充填層容量１リットル当たりタンパク質約１０ｇ以下のＨＩＣ充填、好ましくはＨＩＣ樹脂の充填層容量１リットル当たりタンパク質約５ｇ以下のＨＩＣ充填、或いはＨＩＣ樹脂の充填層容量１リットル当たりタンパク質約４．１ｇ以下でＨＩＣ樹脂に充填する。さらに、ＨＩＣ充填伝導度は約３０〜約６０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは約４０〜約５２ｍＳ／ｃｍ、或いはより好ましくは約４５〜約５１ｍＳ／ｃｍである。さらに、ＨＩＣステップは、約１０〜約４０℃、好ましくは約１５〜約３０℃、最も好ましくは約１８〜約２５℃のＨＩＣ温度で行う。場合により行われるＨＩＣステップ２は、ＨＩＣ充填に存在する、少なくとも幾らかの遊離ＰＥＧ、非ＰＥＧ化タンパク質及び凝集体をそれぞれ除去する。
ＨＩＣステップ２の後に、ＨＩＣ回収物を得る。次いでこのＨＩＣ回収物を、限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ３に供し、このステップは、ＨＩＣステップ２が行われる場合には限外濾過／ダイアフィルトレーションステップも行われるという意味で場合により行われるものである。しかしながら、ＨＩＣステップ２が行われない場合、限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ３を行う必要はない。或いは、限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ３を、場合により行われるＨＩＣステップ２の不在下で行うこともできる。限外濾過／ダイアフィルトレーションステップ３を行う好ましい条件は、実施例１及びフローチャート１に示す。本明細書において、このステップをＵＦ／ＤＦ＃３と呼ぶ。このＵＦ／ＤＦ＃３ステップは、約３ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、好ましくは約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａ、より好ましくは約１０ｋＤａ〜約１２ｋＤａ、最も好ましくは約１０ｋＤａの分画分子量（ＭＷＣＯ）を有するＵＦ／ＤＦ＃３膜で行う。
ステップ３の後、この時点で得られる生成物を、ダイアフィルトレーション回収物と呼ぶ。次いでこのダイアフィルトレーション回収物を、陰イオン交換クロマトグラフィーであるステップ４及び回収ステップに供す。このＡＥＸクロマトグラフィー及び回収ステップを行うための好ましい条件は、実施例１及びフローチャート１に示す。前のステップ（即ちステップ３）のダイアフィルトレーション回収物、又はＰＥＧ化タンパク質（例えば、ステップ１のＢ−２０３６ＰＥＧ、ステップ２及び３が行われない場合）をステップ４に供す。実際には、ステップ２のＨＩＣ処理を行わずに、Ｂ−２０３６ＰＥＧ又はステップ１のＢ−２０３６ＰＥＧを含むステップ３のダイアフィルトレーション回収物を、陰イオン交換樹脂に、任意の遊離ＰＥＧ、任意のＰＥＧ化タンパク質、非ＰＥＧ化タンパク質、部分的にＰＥＧ化したタンパク質、及び任意の不純物（トリスルフィド不純物又は脱ｐｈｅ不純物など）、及びその任意の凝集体と共に充填する。
使用する樹脂は、陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂であることが好ましい。好ましいＡＥＸ樹脂には、ＡＮＸ４、ＤＥＡＦ、Ｑ−セファロース、Ｑ−セファロースＦＦ、ＱセファロースＨＰ、及びＱ−セファロースＸＬがあるが、これらだけには限られない。好ましいＡＥＸ樹脂は、Ｑ−セファロースＦＦである。
ＡＥＸ樹脂は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、及びこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含むことが好ましい。さらにＡＥＸ樹脂は、ジエチルアミノエチル、ジエチルアミノプロピル、ジメチルエタノールアミン、トリメチル−アンモニウム−エチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジル、及びポリアミン官能基からなる群から選択される官能基を含む。さらにＡＥＸ樹脂は、親水性ポリエーテル、架橋ジビニルベンゼンポリスチレン、架橋アガロース、ポリプロピレン、親水性アクリルアミドビニル、メタクリル、重合ヒドロゲル及びセラミックビーズ基材、複合シリカ−デキストラン物質、ポリマー重合シリカ、ジビニルベンゼンスチレン、ジビニルベンゼンポリアクリル、架橋セルロース、コポリマーメタクリレート、ポリスチレン、アクリル、Ｇ５０００親水性ゲル、及びセルロースからなる群から選択される支持体物質を含むことが好ましい。さらに、マクロ孔樹脂又はゲル樹脂を含む、ＡＥＸ樹脂を使用することが好ましい。典型的には、支持体物質は、約１０〜約５００μｍ、及び好ましくは約３０μｍの径を有する。
ＡＥＸ充填は、約１０ｍＳ／ｃｍ以下、好ましくは約５ｍＳ／ｃｍ以下、最も好ましくは約２．４ｍＳ／ｃｍ以下のＡＥＸ充填伝導度で行う。ＡＥＸ樹脂は、約５〜約１０、好ましくは約６．６〜約９、より好ましくは約６．９〜約７．１のＡＥＸ充填ｐＨで充填する。
トリスルフィド不純物又は脱ｐｈｅ不純物などの任意の不純物、又はその凝集体を含むＰＥＧ化タンパク質の充填は、ＡＥＸ充填がＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質１０ｇ以下、好ましくはＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質５．５ｇ以下、より好ましくはＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約４．１ｇ以下であるような充填である。
一実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、ＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及びＰＥＧ化タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物を含む。
他の実施形態によれば、ＡＥＸ樹脂に充填されるＰＥＧ化タンパク質、又はＰＥＧ化タンパク質を与える最初のステップで得られるＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びにその任意の凝集体を含む。
ＰＥＧ化タンパク質、及びその任意の凝集体、トリスルフィド、及び／又は脱ｐｈｅ不純物、任意の非ＰＥＧ化又は部分的にＰＥＧ化したタンパク質、並びに任意の遊離ＰＥＧを、ＡＥＸ樹脂に充填した後に、溶出ステップにおける溶出溶液による溶出を施し、次に多量分画中の溶出液を回収する。分画は、カラム容量の容量分画である。溶出ステップは、ｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって行うことができる。イオン強度勾配によって溶出を行う場合、ＡＥＸ樹脂から充填ＰＥＧ化タンパク質を溶出させるのに充分な塩濃度でイオン塩を含む溶出バッファーに溶かした塩溶液を用いて、溶出を行う。イオン塩は塩化物塩であることが好ましい。イオン塩は、ＮａＣｌ、塩化リチウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫化アンモニウム、リン酸アンモニウム、ＫＩ、及びＫＣｌからなる群から選択されることがより好ましい。ＡＥＸ樹脂と共に使用するための他の適切なイオン塩が認められており、ここに述べるが如く組み込んである。イオン塩は、バッファー溶液として提供される塩化ナトリウムであることが好ましい。溶出バッファーに加えた塩溶液による溶出中に、（例えばＮａＣｌ塩溶液に関する）塩濃度勾配は、ＣＶ当たり約２〜約５０ｍＭ、好ましくはＣＶ当たり約５〜約２５ｍＭ、及びより好ましくはＣＶ当たり約１０〜約２０ｍＭ、最も好ましくはＣＶ当たり約１０〜約１２．５ｍＭである。塩溶液が加えられている溶出バッファーは、約５〜約１０、好ましくは約６．６〜約９、最も好ましくは約６．９〜約７．１のｐＨを有する。さらに溶出ステップは、約５０℃以下、好ましくは約３５℃以下、より好ましくは約２〜約３０℃、さらにより好ましくは約１５〜約３０℃、最も好ましくは約１８〜約２５℃の溶出温度で行う。
塩溶液を含む溶出バッファーは、ＡＥＸ樹脂カラム中に導入され、３００ｃｍ／１時間以下、好ましくは約１０〜約１５０ｃｍ／１時間、より好ましくは３０〜約１００ｃｍ／１時間、さらにより好ましくは約５０〜約１００ｃｍ／１時間、さらにより好ましくは約５０〜約７０ｃｍ／１時間、さらにより好ましくは約６０〜約６５ｃｍ／１時間、最も好ましくは約６０ｃｍ／１時間の直線速度でカラムに流す。
ＡＥＸ樹脂から溶出液を回収する際、約０．１〜約５のカラム容量（ＣＶ）、好ましくは約０．１〜約１のＣＶ分画、より好ましくは約０．１〜約０．５ＣＶ、最も好ましくは約０．１〜約０．２ＣＶ容量分画の範囲の複数の容量分画中の溶出液を回収することが好ましい。したがって例えば、１００の別個の分画を回収することができるが、この数は、さまざまなＣＶ分画を回収するためにＡＥＸ樹脂を通して送られる塩溶液と溶出バッファーの合計量に応じて、少なくなったり多くなったりする可能性がある。ＡＥＸカラムの出口において（典型的には、ＡＥＸカラムの底部において）溶出液が回収されるに従って、ＣＶ分画が連続的に回収されることは理解されよう。
回収したＣＶ分画のそれぞれが、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８及びＰＥＧ−９などの、所与のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを含むことが好ましい。次いで回収したＣＶ分画を回収に供して、どの分画がどのＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを含むかを決定し、次に、このように回収した目的のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを選択的に組み合わせることができる。
ｂ．回収
したがって、次に、ＡＥＸ樹脂から回収したＣＶ分画を、ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８及びＰＥＧ−９などのＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを個別量選択するための回収ステップに供す。さまざまな分析技法を使用して、目的とするＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを選択的に回収することができる。これらの技法には、ＣＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＩＥＸクロマトグラフィー、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＡＥＸクロマトグラフィー、ＣＥＸクロマトグラフィー、ＲＰＨＰＬＣ、ＳＥＨＰＬＣ、アフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）、及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。ＣＥ又はＲＰＨＰＬＣが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより好ましい。さらに、理論によって縛られずに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで使用される試薬（例えばドデシル硫酸ナトリウム）は、形成される任意の凝集体の測定を不明瞭にすると考えられる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイで使用されるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は凝集体を破壊し、したがって少量の凝集体しか測定されないか、或いは凝集体の量が全く測定されないと考えられる。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを首尾よく使用して、個々のＰＥＧ化タンパク質をフィンガープリンティングする（例えば、回収した分画のＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８及びＰＥＧ−９の定性的及び定量的組成を測定する）ことができる。回収のためにＣＥによる分析を行う場合、その分析は、約５〜約５０℃、好ましくは約５〜約４５℃、より好ましくは約２０〜約４０℃、最も好ましくは約３０〜約３２℃のＣＥ温度で行う。
さらに、ＣＥを使用する場合、約０〜約６０ｍＳ／ｃｍ、より好ましくは約５〜約１０ｍＳ／ｃｍのＣＥ回収伝導度（サンプル分画の伝導度を指す）でＣＥを行う。次いで、前述のＣＥ回収伝導度範囲内の伝導度を有するサンプル分画を、ＰＥＧ化タンパク質のフィンガープリンティング用に、ＣＥキャピラリー中に導入する。このようにして得た関連ＣＶ分画のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームのフィンガープリントを、参照標準に対して比較して、そのサンプル中に存在する個々のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを同定する。
それぞれのフィンガープリントのピークによって得られる面積比は、その分画中のそのピークに対応するアイソフォームの重量％に正比例する。次いで、目的とするアイソフォームの重量％で目的とするＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを含ませるために、ＣＥによってこのように同定した分画を、場合によっては、同様に選択した他の分画と混合して、所望のアイソフォーム混合物を得る。この処理によって、ＡＰＩ組成物が生成する。
例えば、Ｓｗａｐａｎ Ｋ Ｃｈｏｗｄｂｕｒｙ他、「質量分析法によるポリマーと結合したタンパク質のフィンガープリンティング：ポリエチレングリコール結合スーパーオキシドジスムターゼの調査（Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｂｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｖｏｌ．６、ｐｐ．４７８〜４８７、１９９５を参照のこと。
回収したＣＶ分画についてＣＥ分析を行うためには、バッファー中のＰＥＧ化タンパク質濃度は、それぞれ少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌ、又は約２〜約３ｍｇ／ｍｌである。ＣＥ、又は前述の回収用分析技法のいずれかを使用して、さまざまなＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを合わせて、ＰＥＧ化タンパク質の所望の回収物を得ることができる。したがって、例えば、回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−１〜ＰＥＧ９、１つ又は複数のＰＥＧ−２〜ＰＥＧ−９、１つ又は複数のＰＥＧ−３〜ＰＥＧ−９、１つ又は複数のＰＥＧ−３〜ＰＥＧ−８、１つ又は複数のＰＥＧ−３〜ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−３〜ＰＥＧ−６の１つ、１つ又は複数のＰＥＧ−４〜ＰＥＧ−６、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−５、１つ又は複数のＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６、及びＰＥＧ−５をそれぞれ含む可能性がある。
前述の回収物の中で、ＰＥＧ化タンパク質のさまざまな回収物が好ましい。例えば、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の回収物に関しては、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の回収物は、その個々の回収物中のＰＥＧ化タンパク質アイソフォームの合計重量に対して、少なくとも７０重量％のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６を含むようなものでなければならない。ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６のＰＥＧ化タンパク質分画は、回収物中に存在するＰＥＧ化タンパク質アイソフォームの合計重量に対して、少なくとも約７５重量％であることが好ましい。この値は、それぞれ、少なくとも約８０重量％、少なくとも約８５重量％、少なくとも約９０重量％、及び少なくとも約９４重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９６重量％、少なくとも約９７重量％、少なくとも約９８重量％、少なくとも約９９重量％、少なくとも約９９．５重量％、及び少なくとも約９９．９重量％であることがより好ましい。
回収に関しては、ＣＶ分画において回収したＰＥＧ化タンパク質アイソフォームについて回収を行い、この場合ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームは、バッファー溶液として提供される。ＰＥＧ化タンパク質が含まれているバッファーは、約５〜約１０、好ましくは約６．６〜約９、より好ましくは約６．９〜約７．１のｐＨを有する。さらにバッファーは、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンからなる群から選択されるバッファーである。
この時点で、前述の方法（以下で論じる実施例１、３及び４中でも述べる）に従い処理した回収ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームは、回収した生成物の凝集レベルが、前述のステップ１〜５及び場合により行われるステップ２及び３を施したＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して、約１０重量％以下であるようなものであるはずである。凝集体のレベルは、前述の合計重量に対して、それぞれ約９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１．５重量％、１重量％、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、０．４重量％、０．３重量％、０．２重量％、０．１重量％、０．０５重量％及び０．０１重量％以下であることが好ましい。
このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、及びＰＥＧ−８から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、及びＰＥＧ−７から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−５から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になることが好ましい。このように回収したＰＥＧ化タンパク質は、１つ又は複数のＰＥＧ−５から本質的になることが好ましい。
前述の回収法は、このようなアイソフォームが陰イオン交換クロマトグラフィーに供されたかどうかに関係なく、ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを回収するために使用することができる。
ＰＥＧ化タンパク質がＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストである場合、凝集のレベルが、回収物及び回収したＣＶ分画中のＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して６重量％以下であることが好ましい。凝集のレベルは、前述の合計重量に対して、それぞれ約５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、及び１重量％以下であることがより好ましい。さらに、ＰＥＧ化タンパク質がＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト及びそのさまざまなアイソフォームである場合、その任意のトリスルフィド不純物、任意の脱ｐｈｅ不純物、及び任意の凝集体全体の「合計レベル」は、回収物及び回収したＣＶ分画中のＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォーム、その任意のトリスルフィド不純物、任意の脱ｐｈｅ不純物、及び任意の凝集体の合計重量に対して約１５重量％のレベルであることが好ましい。（その任意のトリスルフィド不純物、任意の脱ｐｈｅ不純物、及び任意の凝集体の合計の）前述の合計レベルは、前述の合計重量に対して、それぞれ約１２重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、及び１％重量％以下であることが好ましい。
また、好ましくは、ＰＥＧ化タンパク質成長ホルモンアンタゴニストがＢ−２０３６ＰＥＧである場合、そのポリペプチド骨格は配列番号１のＢ−２０３６である。同様に、また、好ましくは、ＰＥＧ化タンパク質が成長ホルモンアゴニストである場合、そのポリペプチド骨格は配列番号２のポリペプチドである。
ＡＥＸクロマトグラフィー及び回収のステップ４の後、後続の限外濾過／ダイアフィルトレーションのステップ５を行う。このＵＦ／ＤＦステップ５を行うための好ましいパラメータは、実施例１及びフローチャート１に示す。ステップ５の最後に、ダイアフィルトレーション回収物を回収する。次いでこのダイアフィルトレーション回収物をステップ６に供し、このステップは、前述のダイアフィルトレーション回収物でそのように得た活性薬剤成分を取得し、好ましくは０．２２μｍのフィルターによる濾過によって、それを滅菌するためのものである。ＡＰＩ濾過のステップ６を行うための好ましいパラメータは、実施例１及びフローチャート１に示す。
最後に、以下の実施例１では、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用する、特許請求する本発明の好ましい手順を、前述のステップ１〜６のそれぞれの詳細を引用して示す。比較の目的で、陰イオン交換クロマトグラフィーステップを、陽イオン交換クロマトグラフィーステップ、及びそれと関連する適切なバッファー交換ステップに置き換えた、比較例２を示す。実施例２の手順の結果を表２に示すが、そこにおいて、凝集レベルは、凝集体が約６０重量％という高い値から約６重量％までの任意の範囲である。実施例３では、実施例１及びフローチャート１の手順、又は実施例２及びフローチャート２の手順に適用可能な回収法を記載し、そこでは、ＣＥ分析技法と同等の分析技法として、ＲＰＨＰＬＣを使用する。図２、３及び４は、ＲＰＨＰＬＣがＣＥと同等であることを示す。実施例４には、ＣＥ分析技法の好ましい手順を示す。
本発明の実施形態
１．ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームの凝集のレベルを低下させるための方法であって、
（ａ）前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを用意するステップ、及び
（ｂ）前記凝集の前記レベルを低下させるのに充分な条件下において、陰イオン交換樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによって、前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを分離するステップを含む方法。
２．前記ステップ（ａ）が、非ＰＥＧ化又は部分的にＰＥＧ化した形の前記タンパク質をＰＥＧ化する、或いはその両方をＰＥＧ化するステップ（ａ１）を含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記ステップ（ａ１）が、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−５Ｋ、ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボネート−５Ｋ、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート−５Ｋ、ＰＥＧ２−マレミド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）、ＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシイミド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）、及びＰＥＧ２−アルデヒド−４０Ｋ（２×２０Ｋ）からなる群から選択される遊離ＰＥＧでＰＥＧ化することを含む、実施形態２に記載の方法。
４．前記遊離ＰＥＧと前記非ＰＥＧ化タンパク質との化学量論的重量比が約０．５〜約１００である、実施形態３に記載の方法。
５．前記化学量論的重量比が約１．５〜約２．５である、実施形態４に記載の方法。
６．前記化学量論的重量比が約１．９〜約２である、実施形態５に記載の方法。
７．前記化学量論的重量比が約１．９５〜約２．０５である、実施形態６に記載の方法。
８．前記ＰＥＧ化ステップ（ａ１）を約３〜約１０のＰＥＧ化ｐＨで行う、実施形態２に記載の方法。
９．前記ＰＥＧ化ｐＨが約７．２〜約７．８である、実施形態８に記載の方法。
１０．前記ＰＥＧ化ｐＨが約７．４〜約７．８である、実施形態９に記載の方法。
１１．前記ＰＥＧ化ｐＨが約７．４０〜約７．８０である、実施形態１０に記載の方法。
１２．前記ＰＥＧ化ステップ（ａ１）を約０〜約４０℃のＰＥＧ化温度で行う、実施形態２に記載の方法。
１３．前記ＰＥＧ化温度が約１０〜約３０℃である、実施形態１２に記載の方法。
１４．前記ＰＥＧ化温度が約１８〜約２５℃である、実施形態１３に記載の方法。
１５．ＨＩＣ樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により前記ＰＥＧ化タンパク質を選択する、場合により行われるＨＩＣステップ（ａ２）をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
１６．ＨＩＣ樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により前記ＰＥＧ化タンパク質を選択する、場合により行われるＨＩＣステップ（ａ２）をさらに含む、実施形態２に記載の方法。
１７．前記ＨＩＣステップ（ａ２）が、前記ＰＥＧ化タンパク質及び任意の非ＰＥＧ化タンパク質を、ＨＩＣ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約１０ｇ以下のＨＩＣ充填で、前記ＨＩＣ樹脂に充填することを含む、実施形態１６に記載の方法。
１８．前記ＨＩＣ充填が、ＨＩＣ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約５ｇ以下である、実施形態１７に記載の方法。
１９．前記ＨＩＣ充填が、ＨＩＣ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約４．１ｇ以下である、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記ＨＩＣステップ（ａ２）において、前記充填を約３０〜約６０ｍＳ／ｃｍのＨＩＣ充填伝導度で行う、実施形態１７に記載の方法。
２１．前記ＨＩＣ充填伝導度が約４０〜約５２ｍＳ／ｃｍである、実施形態２０に記載の方法。
２２．前記ＨＩＣ充填伝導度が約４５〜約５１ｍＳ／ｃｍである、実施形態２１に記載の方法。
２３．前記ＨＩＣステップ（ａ２）を約１０〜約４０℃のＨＩＣ温度で行う、実施形態１７に記載の方法。
２４．前記ＨＩＣ温度が約１５〜約３０℃である、実施形態２３に記載の方法。
２５．前記ＨＩＣ温度が約１８〜約２５℃である、実施形態２４に記載の方法。
２６．前記ＨＩＣステップ（ａ２）からの溶出液を限外濾過／ダイアフィルトレーションする、ＵＦ／ＤＦ＃３ステップ（ａ３）（ＵＦ／ＤＦ＃３）をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。
２７．前記ＵＦ／ＤＦ＃３ステップ（ａ３）を、約３ｋＤａ〜約２０ｋＤａのＵＦ／ＤＦ＃３膜分子量断片（ＭＷＣＯ）を有するＵＦ／ＤＦ＃３膜で行う、実施形態２６に記載の方法。
２８．前記ＵＦ／ＤＦ＃３膜ＭＷＣＯが約８ｋＤａ〜約１５ｋＤａである、実施形態２７に記載の方法。
２９．前記ＵＦ／ＤＦ＃３膜ＭＷＣＯが約１０ｋＤａ〜約１２ｋＤａである、実施形態２８に記載の方法。
３０．前記ＵＦ／ＤＦ＃３膜ＭＷＣＯが約１０ｋＤａである、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記ステップ（ｂ）が、その任意の不純物及び任意の凝集体を含む前記ＰＥＧ化タンパク質を前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂に充填して、充填ＰＥＧ化タンパク質を得るステップ（ｂ１）をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
３２．前記ＡＥＸ樹脂が、ＡＮＸ４、ＤＥＡＦ、Ｑ−セファロース、Ｑ−セファロースＦＦ、ＱセファロースＨＰ、及びＱ−セファロースＸＬからなる群から選択される、実施形態３１に記載の方法。
３３．前記ＡＥＸ樹脂がＱ−セファロースＦＦである、実施形態３２に記載の方法。
３４．前記ステップ（ｂ１）を、約１０ｍＳ／ｃｍ以下のＡＥＸ充填伝導度で行う、実施形態３１に記載の方法。
３５．前記ＡＥＸ充填伝導度が約５ｍＳ／ｃｍ以下である、実施形態３４に記載の方法。
３６．前記ＡＥＸ充填伝導度が約２．４ｍＳ／ｃｍ以下である、実施形態３５に記載の方法。
３７．前記ステップ（ｂ１）を約５〜約１０のＡＥＸ充填ｐＨで行う、実施形態３１に記載の方法。
３８．前記ＡＥＸ充填ｐＨが約６．６〜約９である、実施形態３７に記載の方法。
３９．前記ＡＥＸ充填ｐＨが約６．９〜約７．１である、実施形態３８に記載の方法。
４０．前記ステップ（ｂ１）を、ＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約１０ｇ以下の、その任意の不純物及び前記凝集体を含むＰＥＧ化タンパク質のＡＥＸ充填で行う、実施形態３１に記載の方法。
４１．前記ＡＥＸ充填が、ＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約５．５ｇ以下である、実施形態４０に記載の方法。
４２．前記ＡＥＸ充填が、ＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質約４．１ｇ以下である、実施形態４０に記載の方法。
４３．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４４．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４５．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４６．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４７．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４８．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
４９．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、及び任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、実施形態１に記載の方法。
５０．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物、及び前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物を含む、実施形態１に記載の方法。
５１．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びに任意の凝集体、そのトリスルフィド不純物及び脱ｐｈｅ不純物を含む、実施形態１に記載の方法。
５２．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、並びにその任意の凝集体及びトリスルフィド不純物を含む、実施形態１に記載の方法。
５３．前記ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９、及びその任意の凝集体を含む、実施形態１に記載の方法。
５４．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される技法によって、個別量の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを回収して回収ＰＥＧ化タンパク質を生成させる、回収ステップ（ｃ）をさらに含む、実施形態１に記載の方法。
５５．キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される技法によって、個別量の前記ＰＥＧ化タンパク質の前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを回収して回収ＰＥＧ化タンパク質を生成させる、回収ステップ（ｃ）をさらに含む、実施形態４２に記載の方法。
５６．前記回収ステップ（ｃ）を、約５〜約５０℃のＣＥ温度で前記ＣＥによって行う、実施形態５４に記載の方法。
５７．前記回収ステップ９ｃ）を、約５〜約５０℃のＣＥ温度で前記ＣＥによって行う、実施形態５５に記載の方法。
５８．前記ＣＥ温度が約５〜約４５℃である、実施形態５６に記載の方法。
５９．前記ＣＥ温度が約２０〜約４０℃である、実施形態５８に記載の方法。
６０．前記ＣＥ温度が約３０〜約３２℃である、実施形態５９に記載の方法。
６１．前記回収ステップ（ｃ）を、約０〜約６０ｍＳ／ｃｍのＣＥ回収伝導度で前記ＣＥによって行う、実施形態５６に記載の方法。
６２．前記ＣＥ回収伝導度が約５〜約１０ｍＳ／ｃｍである、実施形態６１に記載の方法。
６３．前記回収ステップ（ｃ）を、少なくとも約０．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でバッファー溶液として提供される前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームについて行う、実施形態５４に記載の方法。
６４．前記回収ステップ（ｃ）を、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でバッファー溶液として提供される前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームについて行う、実施形態５６に記載の方法。
６５．前記回収ステップ（ｃ）を、約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でバッファー溶液として提供される前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームについて行う、実施形態５４に記載の方法。
６６．前記タンパク質濃度が約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態６５に記載の方法。
６７．前記タンパク質濃度が約２〜約３ｍｇ／ｍｌである、実施形態６６に記載の方法。
６８．前記回収ステップ（ｃ）を、約０．１〜約１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度でバッファー溶液として提供される前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームについて行う、実施形態５６に記載の方法。
６９．前記タンパク質濃度が約０．５〜約１０ｍｇ／ｍｌである、実施形態６７に記載の方法。
７０．前記タンパク質濃度が約２〜約３ｍｇ／ｍｌである、実施形態６８に記載の方法。
７１．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９を含む、実施形態６３に記載の方法。
７２．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９を含む、実施形態６３に記載の方法。
７３．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９を含む、実施形態６３に記載の方法。
７４．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、及びＰＥＧ−８を含む、実施形態６３に記載の方法。
７５．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、及びＰＥＧ−７を含む、実施形態６３に記載の方法。
７６．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６を含む、実施形態６３に記載の方法。
７７．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６を含む、実施形態６３に記載の方法。
７８．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−５を含む、実施形態６３に記載の方法。
７９．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６を含む、実施形態６３に記載の方法。
８０．前記回収ＰＥＧ化タンパク質がＰＥＧ−５を含む、実施形態６３に記載の方法。
８１．ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の回収ＰＥＧ化タンパク質分画が、前記ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも約７０重量％を構成する、実施形態７１に記載の方法。
８２．ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の前記回収ＰＥＧ化タンパク質分画が、前記ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも約７５重量％を構成する、実施形態７１に記載の方法。
８３．ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の前記回収ＰＥＧ化タンパク質分画が、前記ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも約８０重量％を構成する、実施形態７１に記載の方法。
８４．ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の前記回収ＰＥＧ化タンパク質分画が、前記ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも約９０重量％を構成する、実施形態７１に記載の方法。
８５．ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６の前記回収ＰＥＧ化タンパク質分画が、前記ＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９ＰＥＧ化タンパク質アイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも約９４重量％を構成する、実施形態７１に記載の方法。
８６．前記ＰＥＧ化タンパク質がその中に与えられている前記バッファーが、約５〜約１０のｐＨを有する、実施形態６４に記載の方法。
８７．前記バッファーが約６．６〜約９のｐＨを有する、実施形態８６に記載の方法。
８８．前記バッファーが約６．９〜約７．１のｐＨを有する、実施形態８７に記載の方法。
８９．前記ＰＥＧ化タンパク質が含まれている前記バッファーが、Ｔｒｉｓ、リン酸、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、トリエチルアミン、及びヒスチジンからなる群から選択される、実施形態６４に記載の方法。
９０．前記凝集の前記レベルが、前記アイソフォーム及び前記凝集体の合計重量に対して約１０重量％以下である、実施形態１に記載の方法。
９１．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約９重量％以下である、実施形態９０に記載の方法。
９２．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約８重量％以下である、実施形態９１に記載の方法。
９３．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約７重量％以下である、実施形態９２に記載の方法。
９４．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約６重量％以下である、実施形態９３に記載の方法。
９５．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約５重量％以下である、実施形態９４に記載の方法。
９６．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約４重量％以下である、実施形態９５に記載の方法。
９７．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約３重量％以下である、実施形態９６に記載の方法。
９８．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約２重量％以下である、実施形態９７に記載の方法。
９９．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約１．５重量％以下である、実施形態９８に記載の方法。
１００．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約１重量％以下である、実施形態９９に記載の方法。
１０１．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．９重量％以下である、実施形態１００に記載の方法。
１０２．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．８重量％以下である、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．７重量％以下である、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．６重量％以下である、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．５重量％以下である、実施形態１０４に記載の方法。
１０６．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．４重量％以下である、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．３重量％以下である、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．２重量％以下である、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．１重量％以下である、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．０５重量％以下である、実施形態１０９に記載の方法。
１１１．前記凝集の前記レベルが、前記合計重量に対して約０．０１重量％以下である、実施形態１１０に記載の方法。
１１２．前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に溶出溶液を用いて前記充填ＰＥＧ化タンパク質をｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって溶出させるステップ（ｂ３）、及び複数の容量分画中の溶出液を回収するステップ（ｂ４）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１１３．前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に前記ＡＥＸ樹脂から前記充填ＰＥＧ化タンパク質を溶出させるのに充分な塩濃度勾配でイオン塩を含む、溶出バッファーに溶かした塩溶液を用いて、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を溶出する溶出ステップ（ｂ３）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１１４．前記イオン塩が塩化物塩である、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．前記イオン塩がＮａＣｌである、実施形態１１４に記載の方法。
１１６．前記ステップ（ｂ）をカラム容量（ＣＶ）を有するカラム中で行い、前記塩濃度勾配がＣＶ当たり約２〜約５０ｍＭである、実施形態１１５に記載の方法。
１１７．前記塩濃度勾配がＣＶ当たり約５〜約２５ｍＭである、実施形態１１６に記載の方法。
１１８．前記塩濃度勾配がＣＶ当たり約１０〜約２０ｍＭである、実施形態１１７に記載の方法。
１１９．前記溶出バッファーが約５〜約１０のｐＨを有する、実施形態１１３に記載の方法。
１２０．前記溶出バッファーが約６．６〜約９のｐＨを有する、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．前記溶出バッファーが約６．９〜約７．１のｐＨを有する、実施形態１２０に記載の方法。
１２２．前記溶出ステップ（ｂ３）を、５０℃以下の溶出温度で行う、実施形態１１３に記載の方法。
１２３．前記溶出温度が約３５℃以下である、実施形態１２２に記載の方法。
１２４．前記溶出温度が約２〜約３０℃である、実施形態１２３に記載の方法。
１２５．前記溶出温度が約１５〜約３０℃である、実施形態１２３に記載の方法。
１２６．前記溶出温度が約１８〜約２５℃である、実施形態１２３に記載の方法。
１２７．前記ステップ（ｂ）をカラム中で行い、前記溶出バッファーが約３００ｃｍ／１時間以下の前記カラムを通過する直線速度を有する、実施形態１１３に記載の方法。
１２８．前記直線速度が約１０〜約１５０ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．前記直線速度が約３０〜約１５０ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１３０．前記直線速度が約５０〜約１００ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１３１．前記直線速度が約５０〜約７０ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１３２．前記直線速度が約６０〜約６５ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１３３．前記直線速度が約６０ｃｍ／１時間である、実施形態１２７に記載の方法。
１３４．前記ＰＥＧ化タンパク質が、ホルモン、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、成長ホルモンアンタゴニスト、ヒト成長ホルモンアンタゴニスト、抗体、及びＢ−２０３６ＰＥＧからなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
１３５．前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂が、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、第四級アミン、及びこれらの組合せからなる群から選択される官能基を含む、実施形態１に記載の方法。
１３６．前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂が、ジエチルアミノエチル、ジエチルアミノプロピル、ジメチルエタノールアミン、トリメチル−アンモニウム−エチル、トリメチルベンジルアンモニウム、ジメチルエタノールベンジル、及びポリアミン官能基からなる群から選択される官能基を含む、実施形態１に記載の方法。
１３７．前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂が、親水性ポリエーテル、架橋ジビニルベンゼンポリスチレン、架橋アガロース、ポリプロピレン、親水性アクリルアミドビニル、メタクリル、重合ヒドロゲル及びセラミックビーズ基材、複合シリカ−デキストラン物質、ポリマー重合シリカ、ジビニルベンゼンスチレン、ジビニルベンゼンポリアクリル、架橋セルロース、コポリマーメタクリレート、ポリスチレン、アクリル、Ｇ５０００親水性ゲル、及びセルロースからなる群から選択される支持体物質を含む、実施形態１に記載の方法。
１３８．前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂がマクロ孔樹脂を含む、実施形態１に記載の方法。
１３９．前記陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂がゲル樹脂を含む、実施形態１に記載の方法。
１４０．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４１．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４２．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４３．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、及びＰＥＧ−８から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４４．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、及びＰＥＧ−７から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４５．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４６．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４７．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−５から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４８．前記回収ＰＥＧ化タンパク質が、１つ又は複数のＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１４９．前記回収ＰＥＧ化タンパク質がＰＥＧ−５から本質的になる、実施形態６３に記載の方法。
１５０．前記ステップ（ｂ）をカラム容量（ＣＶ）を有するカラム中で行い、前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に溶出溶液を用いて前記充填ＰＥＧ化タンパク質をｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって溶出させるステップ（ｂ３）、及び約０．１〜約５の前記カラム容量（ＣＶ）の複数の容量分画中の溶出液を回収するステップ（ｂ４）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１５１．前記ステップ（ｂ）をカラム容量（ＣＶ）を有するカラム中で行い、前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に溶出溶液を用いて前記充填ＰＥＧ化タンパク質をｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって溶出させるステップ（ｂ３）、及び約０．１〜約１の前記カラム容量（ＣＶ）の複数の容量分画中の溶出液を回収するステップ（ｂ４）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１５２．前記ステップ（ｂ）をカラム容量（ＣＶ）を有するカラム中で行い、前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に溶出溶液を用いて前記充填ＰＥＧ化タンパク質をｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって溶出させるステップ（ｂ３）、及び約０．１〜約０．５の前記カラム容量（ＣＶ）の複数の容量分画中の溶出液を回収するステップ（ｂ４）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１５３．前記ステップ（ｂ）をカラム容量（ＣＶ）を有するカラム中で行い、前記ステップ（ｂ）が、前記充填ＰＥＧ化タンパク質を洗浄するステップ（ｂ２）、次に溶出溶液を用いて前記充填ＰＥＧ化タンパク質をｐＨ勾配又はイオン強度勾配によって溶出させるステップ（ｂ３）、及び約０．１〜約０．２の前記カラム容量（ＣＶ）の複数の容量分画中の溶出液を回収するステップ（ｂ４）をさらに含む、実施形態３１に記載の方法。
１５４．前記イオン塩が、ＮａＣｌ、塩化リチウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫化アンモニウム、リン酸アンモニウム、ＫＩ、及びＫＣｌからなる群から選択される、実施形態１１３に記載の方法。
１５５．前記塩濃度勾配がＣＶ当たり約１０〜約１２．５ｍＭである、実施形態１１８に記載の方法。
１５６．ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを回収するための方法であって、前記方法が、
（ａ）キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、及びこれらの組合せからなる群から選択される技法によって、前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを分離及び回収するステップを含む方法。
１５７．前記技法がＲＰＨＰＬＣ又はＣＥである、実施形態１４０に記載の方法。
１５８．前記アイソフォーム及び前記凝集体の合計重量を有するＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームの、凝集レベルを低下させるための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームを与えるステップ、及び
（ｂ）前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約６重量％以下に低下させるのに充分な条件下において、陰イオン交換クロマトグラフィーによって陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂上で、前記ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームを分離するステップを含む方法。
１５９．前記条件が、前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約５重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１５８に記載の方法。
１６０．前記条件が、前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約４重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１５８に記載の方法。
１６１．前記条件が、前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約３重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１５８に記載の方法。
１６２．前記条件が、前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約２重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１５８に記載の方法。
１６３．前記条件が、前記凝集の前記レベルを、前記合計重量に対して約１重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１５８に記載の方法。
１６４．前記アイソフォーム、前記不純物及び前記凝集体の合計重量を有するＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームの、任意のトリスルフィド不純物、任意の脱ｐｈｅ不純物及び任意の凝集体の、全体の合計レベルを低下させるための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームを与えるステップ、及び
（ｂ）任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約１５重量％以下に低下させるのに充分な条件下において、陰イオン交換クロマトグラフィーによって陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂上で、前記ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニストアイソフォームを分離するステップを含む方法。
１６５．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約１２重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１６６．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約１０重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１６７．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約９重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１６８．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約８重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１６９．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約７重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７０．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約６重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７１．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約５重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７２．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約４重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７３．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約３重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７４．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約２重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７５．前記条件が、任意の前記トリスルフィド不純物、任意の前記脱ｐｈｅ不純物、及び任意の前記凝集体の前記合計レベルを、前記合計重量に対して約１重量％以下に低下させるのに充分である、実施形態１６４に記載の方法。
１７６．前記成長ホルモンアンタゴニストがＢ−２０３６ＰＥＧであり、前記Ｂ−２０３６ＰＥＧが、配列番号１のＢ−２０３６の成長ホルモンアンタゴニストのポリペプチド骨格を含む、実施形態１３４に記載の方法。
１７７．前記成長ホルモンが、配列番号２のＰＥＧ化形のポリペプチドである、実施形態１３４に記載の方法。
１７８．前記支持体物質が約１０〜約５００μｍの直径を有する、実施形態１３７に記載の方法。
１７９．前記直径が９０μｍの平均値を有する、実施形態１７８に記載の方法。
１８０．ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを回収するための方法であって、
（ａ）前記ＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを選択したアイソフォームに分離するステップ、及び
（ｂ）前記選択したアイソフォームを合わせて、前記選択したアイソフォームのより多くの回収をもたらすステップを含む方法。
１８１．前記選択したアイソフォームが、約７０重量％以上である、（（ＰＥＧ−４＋ＰＥＧ−５＋ＰＥＧ−６の第一の重量）／（より多くの前記回収物中に存在する任意のＰＥＧ−１＋ＰＥＧ−２＋ＰＥＧ−３＋ＰＥＧ−４＋ＰＥＧ−５＋ＰＥＧ−６＋ＰＥＧ−７＋ＰＥＧ−８＋ＰＥＧ−９の第二の重量））の回収重量比を有する、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６である、実施形態１８０に記載の方法。
１８２．前記回収重量比が約７５重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８３．前記回収重量比が約８０重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８４．前記回収重量比が約８５重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８５．前記回収重量比が約９０重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８６．前記回収重量比が約９４重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８７．前記回収重量比が約９５重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８８．前記回収重量比が約９６重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１８９．前記回収重量比が約９７重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１９０．前記回収重量比が約９８重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１９１．前記回収重量比が約９９重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１９２．前記回収重量比が約９９．５重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１９３．前記回収重量比が約９９．９重量％以上である、実施形態１８１に記載の方法。
１９４．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９である、実施形態１８０に記載の方法。
１９５．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９である、実施形態１８０に記載の方法。
１９６．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９である、実施形態１８０に記載の方法。
１９７．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９である、実施形態１８０に記載の方法。
１９８．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、及びＰＥＧ−８である、実施形態１８０に記載の方法。
１９９．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、及びＰＥＧ−７である、実施形態１８０に記載の方法。
２００．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６である、実施形態１８０に記載の方法。
２０１．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−５である、実施形態１８０に記載の方法。
２０２．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６である、実施形態１８０に記載の方法。
２０３．前記選択したアイソフォームが、１つ又は複数のＰＥＧ−４及びＰＥＧ−６である、実施形態１８０に記載の方法。
２０４．少なくとも２つのＰＥＧ化タンパク質アイソフォームの混合物から、選択したＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを得るための方法であって、
（ａ）前記混合物から前記選択したＰＥＧ化タンパク質アイソフォームを分離するステップを含む方法。
２０５．出発組成物から濃化組成物を調製するための方法であって、前記出発組成物が非ＰＥＧ化Ｂ−２０３６、及びＰＥＧ−１、ＰＥＧ−２、ＰＥＧ−３、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、及びＰＥＧ−９からなる群から選択される、１つ又は複数のＰＥＧ化アイソフォームのＢ−２０３６を含み、
（ａ）前記出発組成物を複数の分画に分離するステップであって、少なくとも１つの分画中の、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６アイソフォームと、非ＰＥＧ化Ｂ−２０３６及びＰＥＧ化Ｂ−２０３６アイソフォーム全体の第一の分画重量比が、少なくとも１つの他の分画中の、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６アイソフォームと、非ＰＥＧ化Ｂ−２０３６及びＰＥＧ化Ｂ−２０３６アイソフォーム全体の第二の分画重量比と異なるステップ、
（ｂ）それぞれの分画の残りの、或いは分画をサンプル採取する際に、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６アイソフォームと、非ＰＥＧ化Ｂ−２０３６及びＰＥＧ化Ｂ−２０３６アイソフォーム全体の重量比を決定するステップ、及び
（ｃ）前記分画のすべてより少ない分画を選択的に組み合わせて前記濃化組成物を生成させるステップであって、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６アイソフォームと、非ＰＥＧ化Ｂ−２０３６及びＰＥＧ化Ｂ−２０３６アイソフォーム全体の濃化分画の重量比が、前記出発組成物中より前記濃化組成物中で大きいステップを含む方法。
本出願中のすべての数値及び同定した分子は例示的なものであり、特許請求の範囲を限定しようとするものではない。以下の事項は例として示すものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。本出願中に引用した、本、雑誌、雑誌記事、特許、又は任意の他の刊行物などに対するすべての引用は、あらゆる目的でその全体が参照によって、本明細書に明確に組み込まれている。
（実施例）
陰イオン交換クロマトグラフィーによる、ＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト（Ｂ−２０３６−ＰＥＧ）の凝集のレベルの維持又は低下
Ｂ−２０３６ＰＥＧの凝集レベルの、維持（望ましいレベル未満、例えば合計重量の６重量％以下）又は低下は、米国特許商標庁に２００３年８月２５日に出願された、「低レベルのアイソフォーム不純物を有する、成長ホルモン及びそのアンタゴニストを生成するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｎｄ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｔｈｅｒｅｏｆ Ｈａｖｉｎｇ Ｌｏｗｅｒ Ｌｅｖｅｌｓ Ｏｆ Ｉｓｏｆｏｒｍ Ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ）」という表題の米国特許非仮出願第Ｐ−１０７，８９１号中に示されたのと同様に調製した出発物質として、ＢＩ（大量の中間体Ｂ−２０３６）を使用することによって行った。組換え大腸菌発現系における、（Ｂ−２０３６を生成するための）発酵は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ他により、米国特許第５，８４９，５３５号中に記載されたのと同様に行った。Ｂ−２０３６ＢＩの精製は、前述の米国特許非仮出願（Ｐ−１０７，８９１）によって記載されたのと同様に行った。次いでこの物質を、以下のフローチャート１に示す、最初のＰＥＧ化及び疎水性相互作用クロマトグラフィーステップを使用することによって処理して、Ｂ−２０３６ＰＥＧを生成した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ステップ２）の後、Ｂ−２０３６ＰＥＧを、ｐＨ７、２５ｍＭのＴＲＩＳバッファー中のＵＦ／ＤＦに供した（ｐＨ４の酢酸ナトリウムバッファーの代わりに、実施例２、ステップ３、フローチャート２のプロセスと同様に）。次いで滞留物を、ＱセファロースＦＦカラム強陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。このステップは、ＰＥＧ化した数種を回収用の分画に別々に分離して、ＡＰＩ放出に必要なＰＥＧ化種の分布を得る。このカラムは、ＰＥＧ化ＢＩ（Ｂ−２０３６ＰＥＧ）のＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６生成物を濃化する。平衡化ステップ、及び２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０による２ＣＶの洗浄の後に、２０ＣＶの直線勾配、０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．０中によって、生成物を溶出させる。分画の分析は、実施例２、フローチャート２に示すのと同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではなくＣＥを使用して行う。同一事項に関する前の考察を参照のこと。ペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、≧７５％ＰＥＧ４＋５＋６（第一の分画）及び≧９４％ＰＥＧ４＋５＋６（最終分画）及び≧０．５ｍｇ／ｍＬの回収基準でＣＥによって分析した、分画からの回収物としてクロマトグラフィープロフィールから回収する。次いで得られた生成物を、フローチャート１に記載するのと同様に、Ｂ−２０３６ＰＥＧ精製プロセスの残りを供した。分画の選択及び回収の後、ＳＥＨＰＬＣによる回収した物質及び最終ＡＰＩの分析を行ったところ、検出可能な凝集は示されなかった。同じことを示す以下の表１を参照のこと。
Figure 0004633463
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以下のデータは、前述の実施例１の手順を使用して得た。
Figure 0004633463
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Ｂ−２０３６ＰＥＧのＳ−セファロースＦＦ凝集（陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂）に対する、添加剤の影響を評価するための小規模手順
１５ｍｌの遠心分離チューブに、１．５ｍｌのＳ−セファロースＦＦ樹脂（沈殿層容量）を加えた。添加剤の１％溶液１０ｍｌで２回洗浄して、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４中で評価を行うことによって、この樹脂をタンパク質結合用に調製した。それぞれの洗浄の後、（遠心分離によって）上清を回収し、デカントし捨てた。この洗浄した樹脂ペレットに、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４中で評価しようとする添加剤の１％溶液２．５ｍｌを加え、（フローチャート２、ステップ１〜３の方法によって調製した）ステップ３からの約５ｍｇのＢ２０３６ＰＥＧを含む一定量のＵＦ／ＤＦ滞留物を加えた。次いで樹脂を溶液中に再懸濁させ、２〜２４時間軽く混合しながらインキュベートした。インキュベート後、溶液を遠心分離にかけ、上清をデカントし捨てた。次いでＢ−２０３６ＰＥＧを、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４及び０．２５ｍｌの２．５Ｍ塩化ナトリウム中で評価するための、添加剤の１％溶液２．５ｍｌを樹脂ペレットに加えることによって、樹脂から溶出させた。生成した溶液中の樹脂を再懸濁させ、２０分間軽く混合しながらインキュベートした。インキュベート後、遠心分離によって上清を保持し、サイズ排除クロマトグラフィー（例えばＳＥＨＰＬＣ（サイズ排除ＨＰＬＣ）による分析用にデカントした。次いで、使用した樹脂ペレットを捨てる。陽イオン交換クロマトグラフィー樹脂を使用して評価するために、それぞれの添加剤に関して前述の手順を繰り返して、凝集体形成が排除されたか或いは充分低下したかどうかを判定した。この前述の手順を使用して、以下の表２の結果を得た。表２に反映されるように、陽イオン樹脂を使用して試験した添加剤は、陰イオン樹脂が形成される凝集体のレベルを低下させたほどうまくいかなかった。
Figure 0004633463
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ＲＰＨＰＬＣ分析技法
ここでＲＰＨＰＬＣを使用して、ペグビソマントの陰イオン交換精製からのＱ−セファロースカラム分画中に見られるＰＥＧ化種（例えばＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５、及びＰＥＧ−６）の割合を調べて定量化する。
２５μＬのそれぞれのＱ−セファロース（陰イオン交換ステップ、前の実施例１参照）分画（０．５〜１．３ｍｇ／ｍＬの範囲のタンパク質濃度）を、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＮカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；３．５μｍ；パーツ番号８６３９７３〜９０５；シリアル番号ＵＳＭＪ００１２０５）に供する。移動相Ａは０．１％トリフルオロ酢酸であり、移動相Ｂは０．０８５％トリフルオロ酢酸をアセトニトリルに溶解させたものからなる。周囲温度において流速１．０ｍＬ／１分で２０分間の、バッファーＢ４０〜５０パーセントの直線勾配を、ペグビソマントの各種ＰＥＧ化形を分離するために使用する。２１４ｎｍでの吸光度を調べる。
以下の図２〜４に示すように、ＲＰＨＰＬＣによって得られた結果は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって導かれた結果とほぼ同じである。さらに、ＣＥ分析技法の代表的手順に関する、以下の実施例４を参照のこと。
Figure 0004633463
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ＣＥ分析技法
Ｑ−セファロース分画を、以下のようにキャピラリー電気泳動によって分析した。５０μｍの内径及び３７ｃｍの有効長を有するキャピラリーを、１．０ＮのＮａＯＨで１０分間２０ｐｓｉの圧力において洗浄し、次に泳動バッファーで２０分間洗浄することによって、調整した。泳動バッファー、４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、０．１ｍｇ／ｍＬのポリエチレンオキシド、ｐＨ１．９〜２．０を、１０×ストック溶液から調製し、０．２２μｍのフィルターで濾過して、キャピラリー中の詰りを引き起こす可能性がある粒子を除去した。
サンプルを室温まで温めて、サンプルの希釈バッファー（４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、ｐＨ１．９〜２．２）又は泳動バッファーと接触した際の凝集体形成を防いだ。０．５ｍｇ／ｍＬ未満であったサンプルは分析しなかった。０．５ｍｇ／ｍＬ以上であったサンプルは希釈せずに注入し、一方２．０ｍｇ／ｍＬを超える濃度を有していたサンプルは、サンプルの希釈バッファーを使用して２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０〜６０秒間０．５ｐｓｉの圧力を使用して、サンプルをキャピラリー中に注入した。サンプル注入の後に、泳動バッファーを０．５ｐｓｉで３秒間注入して、サンプルを濃縮した。サンプルは２５分間３０ｋＶにおいて最低３０℃で分離し、２１４ｎｍで検出した。キャピラリーは、それぞれの後のサンプル注入の前に、０．１ＮのＮａＯＨで少なくとも１分間２０ｐｓｉにおいて、及び泳動バッファーで２分間洗浄して、滞留サンプルをキャピラリー壁から除去した。サンプル保存温度は２５〜３０℃に保った。
その結果の電気泳動図を、隣接するピーク間の最下点のピークを分けることによってまとめて、補正領域の割合を計算した。
前述の手順、及びステップ４、フローチャート１、実施例１の開示を使用すると、ＣＥにより得られる結果は、前の図２〜４中に示される結果である。
最初の回収例
Ｑ−セファロース分画を、以下のようにＣＥによって分析した。５０μｍの内径及び３７ｃｍの有効長を有するキャピラリーを、１．０ＮのＮａＯＨで１０分間２０ｐｓｉの圧力において洗浄し、次に泳動バッファーで２０分間洗浄することによって、調整した。泳動バッファー、４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、０．１ｍｇ／ｍＬのポリエチレンオキシド、ｐＨ１．９〜２．０を、１０×ストック溶液から調製し、０．２２μｍのフィルターで濾過して、キャピラリー中の詰りを引き起こす可能性がある粒子を除去した。
サンプルを室温まで温めて、サンプルの希釈バッファー（４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、ｐＨ１．９〜２．２）又は泳動バッファーと接触するときの、凝集体形成を防いだ。０．５ｍｇ／ｍＬ未満であったサンプルは分析しなかった。０．５ｍｇ／ｍＬ以上であったサンプルは希釈せずに注入し、一方２．０ｍｇ／ｍＬを超える濃度を有していたサンプルは、サンプルの希釈バッファーを使用して２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０〜６０秒間０．５ｐｓｉの圧力を使用して、サンプルをキャピラリー中に注入した。サンプル注入の後に、泳動バッファーを０．５ｐｓｉで３秒間注入して、サンプルを濃縮した。サンプルは２５分間３０ｋＶにおいて最低３０℃で分離し、２１４ｎｍで検出した。キャピラリーは、それぞれの後のサンプル注入の前に、０．１ＮのＮａＯＨで少なくとも１分間２０ｐｓｉにおいて、及び泳動バッファーで２分間洗浄して、任意の滞留サンプルをキャピラリー壁から除去した。サンプル保存温度は２５〜３０℃に保った。
その結果の電気泳動図を、隣接するピーク間の最下点のピークを分けることによってまとめて、補正領域の割合を計算した。
前述の手順、及びステップ４、フローチャート１、実施例１の開示を使用して、ＣＥにより得られる結果は、以下の表５ａ中に示される結果である。一群の濃化したＰＥＧ化アイソフォームを、回収分画として認められる基準を使用することによって調製し、≧７４％ＰＥＧ４＋５＋６（第一の分画）及び≧９４％ＰＥＧ４＋５＋６（最終分画）及び≧０．５ｍｇ／ｍＬの組成で、ＣＥによってこれらの分画を分析した。分画６〜２５（以下の表５ａ）を選択し、これらの基準を使用して回収物と合わせた。ＵＦ／ＤＦ＃３出発物質及び組み合わせた回収分画は、前述のようにＣＥ分析に供した。分画を選択し回収した後、回収した物質を分析することによって、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６アイソフォームの濃化が示される。以下に同様のことを示す、表５ｂを参照のこと。
Figure 0004633463
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第二の回収例
Ｑ−セファロース分画を、以下のようにＣＥによって分析した。５０μｍの内径及び３７ｃｍの有効長を有するキャピラリーを、１．０ＮのＮａＯＨで１０分間２０ｐｓｉの圧力において洗浄し、次に泳動バッファーで２０分間洗浄することによって調整した。泳動バッファー、４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、０．１ｍｇ／ｍＬのポリエチレンオキシド、ｐＨ１．９〜２．０を、１０×ストック溶液から調製し、０．２２μｍのフィルターで濾過して、キャピラリー中の詰りを引き起こす可能性がある粒子を除去した。
サンプルを室温まで温めて、サンプルの希釈バッファー（４０ｍＭのリン酸、４ｍｇ／ｍＬのＯ’Ｏ−ビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール、ｐＨ１．９〜２．２）又は泳動バッファーと接触するときの、凝集体形成を防いだ。０．５ｍｇ／ｍＬ未満であったサンプルは分析しなかった。０．５ｍｇ／ｍＬ以上であったサンプルは希釈せずに注入し、一方２．０ｍｇ／ｍＬを超える濃度を有していたサンプルは、サンプルの希釈バッファーを使用して２．０ｍｇ／ｍＬに希釈した。１０〜６０秒間０．５ｐｓｉの圧力を使用して、サンプルをキャピラリー中に注入した。サンプル注入の後に、泳動バッファーを０．５ｐｓｉで３秒間注入して、サンプルを濃縮した。サンプルは２５分間３０ｋＶにおいて最小３０℃で分離し、２１４ｎｍで検出した。キャピラリーは、それぞれの後のサンプル注入の前に、０．１ＮのＮａＯＨで少なくとも１分間２０ｐｓｉにおいて、及び泳動バッファーで２分間洗浄して、任意の滞留サンプルをキャピラリー壁から除去した。サンプル保存温度は、２５〜３０℃に保った。
その結果の電気泳動図を、隣接するピーク間の最下点のピークを分けることによってまとめて、補正領域の割合を計算した。
前述の手順、及びステップ４、フローチャート１、実施例１の開示を使用すると、ＣＥにより得られる結果は、以下の表６ａ中に示される結果である。一群の濃化したＰＥＧ化アイソフォームを、回収分画として認められる基準を使用することによって調製し、≧７５％ＰＥＧ４＋５＋６（第一の分画）及び≧９４％ＰＥＧ４＋５＋６（最終分画）及び≧０．５ｍｇ／ｍＬの組成で、ＣＥによってこれらの分画を分析した。分画３〜２０（以下の表６ａ）を選択し、これらの基準を使用して回収物と合わせた。ＵＦ／ＤＦ＃３出発物質（ＨＩＣ回収物として測定したもの）及び合わせた回収分画は、前述のようにＣＥ分析に施した。分画を選択し回収した後、回収した物質を分析することによって、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−５及びＰＥＧ−６アイソフォームの濃化が示される。以下に同様のことを示す、表６ｂを参照のこと。
Figure 0004633463
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前述の記載は組換えＢ−２０３６及び組換えＢ−２０３６ＰＥＧに関するものであるが、特に明示しない限り、本発明の主題は、任意の組換えＰＥＧ化成長ホルモンアゴニスト、組換えＰＥＧ化成長ホルモンアンタゴニスト、（それは、哺乳動物成長ホルモン又はそのアンタゴニストであっても、ＰＥＧ化ヒト成長ホルモン又はそのアンタゴニストであっても、ＰＥＧ化ウシ成長ホルモン又はそのアンタゴニストであってもよい）、任意のＰＥＧ化タンパク質、任意のＰＥＧ化ホルモン、任意のＰＥＧ化抗体（又は断片）などと共に使用することができることは理解されよう。
配列番号１に対応するＢ−２０３６のアミノ酸配列を示す図である。図１Ａ中の星印（＊）は、ＰＥＧ単位とＢ−２０３６のそれぞれの分子の、共有結合の可能性のある９個の部位を示す。９個の可能性のある部位が同定されるが、９個の部位すべてが、ＰＥＧ単位と共有結合する必要はないことを記す。Ｂ−２０３６分子当たり４〜６個のＰＥＧ単位が存在することが好ましい。 その望ましい形（「元のＧＨＡ」と示す）と比較した、Ｂ−２０３６のトリスルフィドアイソフォーム不純物（「トリスルフィド（＋３２ａｍｕ）」と示す）の構造を示す図である。 キャピラリー電気泳動及び逆相ＨＰＬＣによって測定した、Ｑ−セファロースＦＦ分画７〜１８中に見られたＢ−２０３６ＰＥＧ４種の割合（％）の、グラフによる比較を示す図である。 キャピラリー電気泳動及び逆相ＨＰＬＣによって測定した、Ｑ−セファロースＦＦ分画７〜１８中に見られたＢ−２０３６ＰＥＧ５種の割合（％）の、グラフによる比較を示す図である。 キャピラリー電気泳動及び逆相ＨＰＬＣによって測定した、Ｑ−セファロースＦＦ分画７〜１８中に見られたＢ−２０３６ＰＥＧ６種の割合（％）の、グラフによる比較を示す図である。

Claims (12)

  1. ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームの凝集のレベルを低下させるための方法であって、
    （ａ）前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームを用意するステップ、
    （ｂ）その任意の不純物および凝集体を含む前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームを陰イオン交換（ＡＥＸ）樹脂上に充填し、ここで充填が１０ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度、ｐＨが５から１０、およびＡＥＸ樹脂の充填層容量１Ｌ当たりタンパク質１０ｇ以下のタンパク質濃度で行われるステップ、及び
    （ｃ）ＡＥＸクロマトグラフィーによって、前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームを分離するステップ、
    を含み、
    ここで前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームは、ＰＥＧ化されたＢ−２０３６（配列番号１）である、
    方法。
  2. 前記ＡＥＸ樹脂が、ＡＮＸ４（商標）、ＤＥＡＥ（商標）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（商標）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商標）、及びＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ（商標）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  3. 前記ステップ（ｂ）において、充填が５ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度で行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ステップ（ｂ）において、充填が２．４ｍＳ／ｃｍ以下の伝導度で行われる、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記ステップ（ｂ）を、６．６〜９のＡＥＸ充填ｐＨで行う、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ステップ（ｂ）を、６．９〜７．１のＡＥＸ充填ｐＨで行う、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームが、１つ又は複数の部位でＰＥＧ化されている、請求項１に記載の方法。
  8. 前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト及びそのアイソフォームが、
    ＰＥＧ−１（ＰＥＧ１分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−２（ＰＥＧ２分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−３（ＰＥＧ３分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−４（ＰＥＧ４分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−５（ＰＥＧ５分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−６（ＰＥＧ６分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−７（ＰＥＧ７分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−８（ＰＥＧ８分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、及び
    ＰＥＧ−９（ＰＥＧ９分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    からなる群から選択される１つ又は複数の前記ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニストアイソフォーム、
    並びにその任意の凝集体、トリスルフィド不純物（分子内で「トリスルフィド架橋」を形成している追加の硫黄原子を含有している成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト分子）及び脱ｐｈｅ不純物（アミノ末端でフェニルアラニンが失われている成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト分子）、並びに前記タンパク質の任意の非ＰＥＧ化不純物、並びに任意の遊離ＰＥＧ分子を含む、請求項７に記載の方法。
  9. キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー（ＡＣ）、及びこれらの組合せからなる群から選択される技法によって、個別量のＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニストアイソフォームを回収して回収ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニストを得る、回収ステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記回収ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニストが、１つ又は複数の
    ＰＥＧ−１（ＰＥＧ１分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−２（ＰＥＧ２分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−３（ＰＥＧ３分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−４（ＰＥＧ４分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−５（ＰＥＧ５分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−６（ＰＥＧ６分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−７（ＰＥＧ７分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、
    ＰＥＧ−８（ＰＥＧ８分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、及び
    ＰＥＧ−９（ＰＥＧ９分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）
    を含む、請求項９に記載の方法。
  11. ＰＥＧ−４（ＰＥＧ４分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−５（ＰＥＧ５分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）及びＰＥＧ−６（ＰＥＧ６分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）の回収ＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニスト分画が、前記ＰＥＧ−１（ＰＥＧ１分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−２（ＰＥＧ２分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−３（ＰＥＧ３分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−４（ＰＥＧ４分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−５（ＰＥＧ５分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−６（ＰＥＧ６分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−７（ＰＥＧ７分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、ＰＥＧ−８（ＰＥＧ８分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）、及びＰＥＧ−９（ＰＥＧ９分子と共にＰＥＧ化したＢ−２０３６（配列番号１）の１分子またはその変異体）のＰＥＧ化成長ホルモン（ＧＨ）アンタゴニストアイソフォーム及びその任意の凝集体の合計重量に対して少なくとも７０重量％を構成する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記凝集の前記減少したレベルが、前記アイソフォーム及び前記凝集体の合計重量に対して１０重量％以下である、請求項１に記載の方法。
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