JP4671148B2 - Nucleic acid molecules that specifically bind to prion proteins - Google Patents
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Description
本発明は、プリオン蛋白質を標的とする核酸分子であって、特にマウスプリオン蛋白質を標的とするRNA分子に関する。本発明はさらに、該核酸分子を含むプリオン病の診断、予防または治療用の医薬組成物に関する。 The present invention relates to a nucleic acid molecule that targets a prion protein, and particularly to an RNA molecule that targets a mouse prion protein. The present invention further relates to a pharmaceutical composition for diagnosis, prevention or treatment of prion diseases comprising the nucleic acid molecule.
プリオンと呼ばれる蛋白質性感染性粒子は、羊のスクレイピー、ウシ海綿状脳症(BSE)、ミンクの伝達性ミンク脳症(TME)、ならびに人間の場合のクールー病、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)および致死的家族性不眠症(FFI) のような伝達性海綿状脳症(TSE) の原因物質であると考えられている(非特許文献１)。アミロイド様桿状体に付随するプリオン(非特許文献２−３) またはスクレイピーに付随する原線維（SAF）（非特許文献４）の主たる成分は、Ｎ末端切除された、プリオン蛋白質PrPSc（非特許文献５）の極めてプロテアーゼ耐性な種であるプリオン蛋白質PrP27-30であることが判明し(非特許文献６)、これはプリオン調製物中の小伸長物であることも見出されている(非特許文献２)。N末端の67アミノ酸を欠くPrP27-30は、プロテイナーゼＫ消化により(非特許文献３及び７)、またはリソソームプロテアーゼ消化により(非特許文献８)、PrPScから生成する。プリオン調製物中のPrPScおよびPrP27-30の分布は、プロテアーゼの存在または不在に応じて異なる。 Proteinaceous infectious particles called prions are found in sheep scrapie, bovine spongiform encephalopathy (BSE), mink transmissible mink encephalopathy (TME), as well as Koolou disease in humans, Gerstmann-Stroisler-Scheinker syndrome (GSS) ), A causative agent of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) such as Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and lethal familial insomnia (FFI) (non-patent document 1). The main component of prion associated with amyloid-like rods (Non-patent Documents 2-3) or fibrils (SAF) associated with scrapie (Non-patent Document 4) is a prion protein PrPSc (Non-patent Documents) with N-terminal excision. 5) was found to be a prion protein PrP27-30, which is a very protease-resistant species (Non-patent document 6), and this was also found to be a small extension in a prion preparation (Non-patent document 6). Reference 2). PrP27-30 lacking the N-terminal 67 amino acids is produced from PrPSc by proteinase K digestion (Non-patent Documents 3 and 7) or by lysosomal protease digestion (Non-patent Document 8). The distribution of PrPSc and PrP27-30 in the prion preparation varies depending on the presence or absence of protease.
解剖学的所見としては、正常型プリオン蛋白質(PrPc) は脳で高い発現が見られ、精巣、胎盤、心臓、肺で中程度の発現、脾臓、腎臓でわずかに検出される（非特許文献９）ことから、PrPcは脳において特に重要な役割を担っていると考えられるが、他の組織においてもなんらかの役割を果たしていると考えられる。 As anatomical findings, normal prion protein (PrPc) is highly expressed in the brain, moderately expressed in the testis, placenta, heart, and lung, and slightly detected in the spleen and kidney (Non-patent Document 9). Therefore, PrPc is thought to play a particularly important role in the brain, but is also considered to play some role in other tissues.
現在に至るまで、プリオン調製物中に特定の核酸は検出されておらず(非特許文献１０)、この事は、プリオン自体が感染性であり、核酸の不在下で複製できることを示唆している(非特許文献１)。蛋白質単独仮説(非特許文献１)によれば、外因性PrPSc／PrP27-30は、遍在する細胞イソ型PrPcのN末端をPrPSc／PrP27-30に変換することができると考えられている。このプロセスにはシャペロンが関与していると思われる(非特許文献１１)。PrPSc／PrP27-30は単量体として(非特許文献１)、またはPrPSc／PrP27-30オリゴマーから成る核形成体もしくは結晶の種として（非特許文献１２）現れ得る。 To date, no specific nucleic acids have been detected in prion preparations (Non-Patent Document 10), suggesting that prions themselves are infectious and can replicate in the absence of nucleic acids. (Non-Patent Document 1). According to the protein single hypothesis (Non-patent Document 1), exogenous PrPSc / PrP27-30 is considered to be able to convert the N-terminal of ubiquitous cellular isoform PrPc to PrPSc / PrP27-30. It seems that chaperone is involved in this process (Non-patent Document 11). PrPSc / PrP27-30 can appear as a monomer (Non-patent document 1) or as a nucleator or crystal seed composed of PrPSc / PrP27-30 oligomer (Non-patent document 12).
PrPcはその二次構造の点でのみPrP27-30と相違する：PrPcのαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ42%および3%である(非特許文献１３)。対照的に、PrP27-30のαヘリックスおよびβシート含有量はそれぞれ21%および54%である(非特許文献１３)。これらの結果は、PrPcのPrPSc／PrP27-30への変換が、恐らくはプリオン蛋白質の二次構造の極端な変化を相伴うという事を示している。PrPcを発現しないノックアウトマウスを使用する一連の実験は、細胞プリオン蛋白質が幾つかの細胞プロセスで重要な役割を果たしていることを示唆してはいるが (非特許文献１４−１６)、PrPcの正確な生理学的役割は依然として推測の域を出ない。しかしながら、PrPcは伝達性海綿状脳症の進行に必要であることが判明している(非特許文献１７及び１８)。 PrPc differs from PrP27-30 only in its secondary structure: PrPc has α-helix and β-sheet contents of 42% and 3%, respectively (Non-patent Document 13). In contrast, the α-helix and β-sheet contents of PrP27-30 are 21% and 54%, respectively (Non-patent Document 13). These results indicate that the conversion of PrPc to PrPSc / PrP27-30 is likely accompanied by extreme changes in the secondary structure of the prion protein. Although a series of experiments using knockout mice that do not express PrPc suggest that cellular prion proteins play an important role in several cellular processes (Non-Patent Documents 14-16), the accuracy of PrPc Physiological roles still remain speculative. However, it has been found that PrPc is necessary for the progression of transmissible spongiform encephalopathy (Non-patent Documents 17 and 18).
スクレイピーに感染したシリアゴールデンハムスター由来のmRNAの翻訳は、NH2末端の22アミノ酸シグナルペプチドおよびカルボキシ末端の23アミノ酸シグナル配列を含む254アミノ酸蛋白質を導いた（非特許文献５及び１９）。成熟蛋白質PrPcおよびスクレイピーのイソ型PrPScは23ないし231のアミノ酸を含んでいる。PrPScのみが、142のアミノ酸から成るプロテイナーゼK耐性イソ型PrP27-30（アミノ酸90-231）へとプロセシングされ得る(非特許文献３)。 Translation of mRNA from Syrian golden hamster infected with scrapie led to a 254 amino acid protein containing a 22 amino acid signal peptide at the NH2 terminus and a 23 amino acid signal sequence at the carboxy terminus (Non-patent Documents 5 and 19). The mature protein PrPc and scrapie isoform PrPSc contain from 23 to 231 amino acids. Only PrPSc can be processed into proteinase K resistant isoform PrP27-30 (amino acids 90-231) consisting of 142 amino acids (Non-patent Document 3).
この性質を使用して、プリオン蛋白質に関連する疾病の診断検定が設計されているが、その場合、全PrPcを減成するためプローブをプロテイナーゼＫで処理し、次いでプリオン蛋白質に対する抗体と反応させる(非特許文献２０)。しかし、この検定は、PrPcのプロテイナーゼＫ消化が不完全であり、故に偽陽性結果が導かれるという事実により、感受性が障害され得るという不利な面がある。さらに、プロテイナーゼＫ消化という余分な工程は時間を消費する。 Using this property, a diagnostic assay for diseases related to prion protein has been designed, in which case the probe is treated with proteinase K to degrade total PrPc and then reacted with an antibody against prion protein ( Non-patent document 20). However, this assay has the disadvantage that sensitivity can be compromised by the fact that proteinase K digestion of PrPc is incomplete, thus leading to false positive results. Furthermore, the extra step of proteinase K digestion is time consuming.
これまでに判明しているPrPcの生体内での機能としては、二価の銅イオンと結合すること（非特許文献２１）、およびこれによりスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）活性を有すること(非特許文献２２)、造血系細胞分化により発現制御を受けていること(非特許文献２３及び２４)、精細管の精子細胞に発現するPrPcのホモログであるDpl蛋白質と相互作用し、精子形成に関与していること(非特許文献２５)、およびシグナル伝達系に関与していること(非特許文献２６)などが挙げられる。特に、PrPcのN末端側にあるオクタリピート領域は、SOD活性に必須であること(非特許文献２２)および、オクタリピート領域を欠損したPrPcを過剰発現させたノックアウトマウスを作成すると行動異常を起こし、神経細胞の脱落が見られる(非特許文献２６)ことから、PrPcのN末端側もまた重要であると考えられる。また、PrPcのN末端を欠損したマウスはプリオン病を発症しない(非特許文献２７)ことから、PrPcのN末端はPrPscへの構造変化に関与していると考えられる。 The in vivo functions of PrPc that have been identified so far include binding to a divalent copper ion (Non-patent Document 21), and thereby having superoxide dismutase (SOD) activity (Non-patent Document). 22) expression control by hematopoietic cell differentiation (Non-patent Documents 23 and 24), interaction with Dpl protein, which is a homolog of PrPc expressed in sperm cells of seminiferous tubules, and is involved in spermatogenesis. (Non-patent document 25) and being involved in a signal transmission system (non-patent document 26). In particular, the octarepeat region on the N-terminal side of PrPc is essential for SOD activity (Non-patent Document 22), and behavioral abnormalities occur when a knockout mouse overexpressing PrPc lacking the octarepeat region is created. From the fact that neuronal loss occurs (Non-patent Document 26), the N-terminal side of PrPc is also considered important. In addition, since the mouse lacking the N-terminus of PrPc does not develop prion disease (Non-patent Document 27), it is considered that the N-terminus of PrPc is involved in the structural change to PrPsc.
正常型プリオンから異常型プリオンへの変化に必要と推測されるオクタリピートを含むPrPcのN末端23-89はグリシンに富むゆえに、安定な３次構造を構成しているとは考えられないため、PrPcのN末端23-89の部分のみを薬剤のターゲットとすることは困難だと考えられる。 Since the N-terminal 23-89 of PrPc, which contains the octa repeat presumed to be necessary for the change from normal prion to abnormal prion, is rich in glycine, it is not considered to constitute a stable tertiary structure. It is considered difficult to target only the N-terminal 23-89 part of PrPc.
従って、プリオン病の診断、予防および治療に使用しうる、プリオン蛋白質に特異的に結合する分子を選択する際には、PrP27-30およびそれに関連したプリオン蛋白質のアミノ酸90番目以降の断片、またはN末端側23-89ではなく、全長プリオン蛋白質を標的とする必要がある。 Therefore, when selecting a molecule that specifically binds to a prion protein that can be used for the diagnosis, prevention, and treatment of prion disease, PrP27-30 and the related fragment of the prion protein after the 90th amino acid, or N It is necessary to target the full-length prion protein, not the terminal 23-89.
本発明者らは、マウスプリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子、特に全長マウス正常型プリオン蛋白質を標的とするRNAアプタマーを作製することができないかと考え、これを課題とした。 The present inventors considered whether it was possible to produce a nucleic acid molecule that specifically binds to the mouse prion protein, in particular, an RNA aptamer that targets the full-length mouse normal prion protein.
上述した目的を達成するため、鋭意研究を行った結果、全長マウス正常型プリオン蛋白質に対するRNAアプタマーを見い出し、本発明を関するに至った。 As a result of intensive studies in order to achieve the above-mentioned object, an RNA aptamer for a full-length mouse normal prion protein was found, and the present invention was related.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）を包含する。
（１） プリオン蛋白質を識別可能な核酸分子の同定および／または分離するための方法であって、
(i) プリオン蛋白質を、複数種の核酸分子と混合し；
(ii) 当該プリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；
(iii) 所望により、その分離された核酸分子を増幅後、工程 (i) および(ii) を反復し；
(iv) 分離された核酸分子の、プリオン蛋白質に対する結合特異性を決定する；
工程を含む方法。
That is, the present invention includes the following (1) to (15).
(1) A method for identifying and / or separating a nucleic acid molecule capable of discriminating a prion protein,
(i) mixing a prion protein with multiple types of nucleic acid molecules;
(ii) selecting and separating nucleic acid molecules capable of binding to the prion protein;
(iii) optionally amplifying the separated nucleic acid molecule, then repeating steps (i) and (ii);
(iv) determining the binding specificity of the separated nucleic acid molecule for the prion protein;
A method comprising steps.
（２） 上記核酸分子がRNA分子である、上記（１）記載の方法。
（３） プリオン蛋白質と特異的に結合するRNAアプタマー。
（４） 以下の配列番号１または２に示される塩基配列を有する、30塩基長のランダム領域（NはA、C、GまたはU）をもつ複数種のRNA分子より、上記（１）に記載の方法を使用して得られる、上記（３）記載のRNAアプタマー。
5’-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号1)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号2)
(2) The method according to (1) above, wherein the nucleic acid molecule is an RNA molecule.
(3) An RNA aptamer that specifically binds to a prion protein.
(4) From a plurality of types of RNA molecules having a 30-base-long random region (N is A, C, G or U) having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 below, described in (1) above The RNA aptamer according to the above (3), which is obtained using the method described above.
5'-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 2)
（５） 塩基配列5’-HGGH-3’ （HはA、CまたはU）を一分子中に４箇所以上含む、上記（３）または（４）記載のRNAアプタマー。
（６） 配列番号1および2で示される配列を有するRNA分子のランダム領域中に塩基配列5’-GGWGG-3’（WはAまたはU）を１箇所以上含む、上記（３）〜（５）のいずれか記載のRNAアプタマー。
(5) The RNA aptamer according to the above (3) or (4), comprising 4 or more base sequences 5′-HGGH-3 ′ (H is A, C or U) in one molecule.
(6) The above (3) to (5) comprising at least one base sequence 5′-GGWGG-3 ′ (W is A or U) in a random region of an RNA molecule having the sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 2. ) RNA aptamer according to any one of
（７） 下記の塩基配列
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
からなる群から選択される何れかの塩基配列からなることを特徴とする、上記（３）〜（６）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（８） 塩基配列中の１以上の塩基の2’-位の水酸基がヌクレアーゼ耐性基で置換された、上記（３）〜（７）のいずれか記載のRNAアプタマー。
(7) The following base sequence
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 4)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 6)
The RNA aptamer according to any one of (3) to (6) above, which comprises any one of a base sequence selected from the group consisting of:
(8) The RNA aptamer according to any one of (3) to (7) above, wherein the 2′-position hydroxyl group of one or more bases in the base sequence is substituted with a nuclease resistant group.
（９） 塩基配列中の１以上の塩基Cおよび／またはUの2’-位の水酸基がフルオロ基で置換された、上記（３）〜（８）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（１０） 5’-末端に機能性化合物が付加された、上記（３）〜（９）のいずれか記載のRNAアプタマー。
（１１） 機能性化合物がビオチンである、上記（１０）記載のRNAアプタマー。
(9) The RNA aptamer according to any one of (3) to (8) above, wherein the 2′-position hydroxyl group of one or more bases C and / or U in the base sequence is substituted with a fluoro group.
(10) The RNA aptamer according to any one of (3) to (9) above, wherein a functional compound is added to the 5′-terminus.
(11) The RNA aptamer according to (10) above, wherein the functional compound is biotin.
（１２） 上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の診断用組成物。
（１３） 上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーをサンプルと接触させることを含む、プリオン病の診断方法。
（１４） 上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを用いてプリオン蛋白質を濃縮することを含む、プリオン病診断のための前処理方法。
（１５） 上記（３）〜（１１）のいずれか記載のRNAアプタマーを含む、プリオン病の治療及び／または予防のための医薬組成物。
(12) A composition for diagnosing prion disease, comprising the RNA aptamer according to any one of (3) to (11) above.
(13) A method for diagnosing prion disease, comprising bringing the RNA aptamer according to any one of (3) to (11) above into contact with a sample.
(14) A pretreatment method for diagnosing a prion disease, comprising concentrating a prion protein using the RNA aptamer according to any one of (3) to (11) above.
(15) A pharmaceutical composition for treating and / or preventing prion diseases, comprising the RNA aptamer according to any one of (3) to (11) above.
本発明に関わるRNAアプタマーは、プリオン蛋白質に特異的に結合する新規の機能性核酸分子である。すなわち、本発明に関わるRNAアプタマーは、プリオン病の診断方法への応用や、プリオン病の発症予防やプリオン病発症後の治療に使用可能であり、診断成績、治療成績の向上が期待できる。 The RNA aptamer according to the present invention is a novel functional nucleic acid molecule that specifically binds to a prion protein. That is, the RNA aptamer according to the present invention can be used for application to a diagnosis method for prion disease, for prevention of onset of prion disease and for treatment after onset of prion disease, and improvement of diagnosis results and treatment results can be expected.
以下、本発明を、図面を用いて詳細に説明する。先ず、本明細書で説明する用語の定義は以下の通りである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the drawings. First, terms used in this specification are defined as follows.
「アプタマー」とは、アミノ酸のような小分子から、タンパク質及びウイルスのような高分子に至る種々の分子に対して特異的に認識して結合することができる核酸分子を意味し、特に本発明ではプリオン蛋白質に直接結合することが可能な機能性RNA分子をいう。アプタマーは、インビトロ選択法によって得ることができる。 “Aptamer” means a nucleic acid molecule that can specifically recognize and bind to various molecules ranging from small molecules such as amino acids to macromolecules such as proteins and viruses. The term refers to a functional RNA molecule that can bind directly to a prion protein. Aptamers can be obtained by in vitro selection methods.
「インビトロ選択法」とは、ランダム化された核酸分子の大きな集団から、定められた標的分子と結合する核酸分子(RNA、修飾されたRNA、ssDNAまたはdsDNA)を選択し、増幅するサイクルを繰り返すことによって、より標的分子と高い親和性で結合する核酸分子 を選別する方法である(Tuerkら, Science.; 249 (4968):505-10, 1990；Famulokら, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31、979-988, 1992)。すなわち、最初はごく僅かしかないそのような分子もPCR法で増幅され、結合の弱い分子はサイクルをくり返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残る。 “In vitro selection method” refers to selecting a nucleic acid molecule (RNA, modified RNA, ssDNA or dsDNA) that binds to a defined target molecule from a large population of randomized nucleic acid molecules and repeating a cycle of amplification. By selecting a nucleic acid molecule that binds to a target molecule with higher affinity (Tuerk et al., Science .; 249 (4968): 505-10, 1990; Famulok et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 31, 979-988, 1992). That is, only a few such molecules are initially amplified by the PCR method, and weakly bound molecules are discriminated by repeating the cycle, leaving only molecules that specifically bind in the end.
この方法を使用して、HIV-1逆転写酵素(Tuerkら, 1992)、HIV-1インテグラーゼ(Allenら, Virology, 209, 327-336, 1995)、ヒトα-トロンビン(Kubikら, Nucleic Acids Res.22, 2619-2626, 1994)、ショウジョウバエの性致死蛋白質（Sakashitaら, Nucleic Acids. Res. 22, 4082-4086, 1994）およびC型肝炎ゲノム由来のプロテアーゼ(Fukudaら, Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000) を包含する様々な標的蛋白質を特異的に認識する核酸の分離が報告されている。 Using this method, HIV-1 reverse transcriptase (Tuerk et al., 1992), HIV-1 integrase (Allen et al., Virology, 209, 327-336, 1995), human α-thrombin (Kubik et al., Nucleic Acids Res.22, 2619-2626, 1994), Drosophila sex lethal protein (Sakashita et al., Nucleic Acids. Res. 22, 4082-4086, 1994) and protease derived from the hepatitis C genome (Fukuda et al., Eur. J. Biochem 267 (12), 3685-3694, 2000) have been reported to isolate nucleic acids that specifically recognize various target proteins.
「正常型プリオン蛋白質(PrPc)」とは、供給源となった生物の如何に拘わらず、このプリオン蛋白質の細胞イソ型ならびにそのフラグメントおよび誘導体を含む。本明細書において、特に「mPrPc」と表記した場合は、マウス由来の組換えPrP23-231を表す。 “Normal prion protein (PrPc)” includes the cellular isoform of this prion protein and fragments and derivatives thereof, regardless of the source organism. In the present specification, in particular, “mPrPc” represents mouse-derived recombinant PrP23-231.
「ヌクレアーゼ耐性修飾」とは、任意のRNA分子中の2’-位の水酸基を、化学合成または酵素反応によりフルオロ基、メトキシ基などの任意のヌクレアーゼ耐性基に置換することを言う。本発明において、ヌクレアーゼ耐性修飾とは、特にピリミジンヌクレオシドの2’-F修飾をいう。 “Nuclease resistance modification” refers to replacement of the 2′-position hydroxyl group in any RNA molecule with any nuclease resistance group such as a fluoro group or a methoxy group by chemical synthesis or enzymatic reaction. In the present invention, the nuclease resistance modification particularly refers to a 2'-F modification of a pyrimidine nucleoside.
「末端ビオチン化」とは、任意の核酸の5’-末端および／または3’-末端にビオチンを合成または酵素反応により付加することをいう。本発明では特に、5’-末端のビオチン化をいう。 “Terminal biotinylation” refers to the addition of biotin to the 5′-end and / or 3′-end of any nucleic acid by synthesis or enzymatic reaction. In the present invention, this refers to biotinylation at the 5'-end.
マウスプリオン蛋白質に対するRNAアプタマーのインビトロ選択
本発明の基礎となるインビトロ選択法について説明する。本発明は、以下の工程：
(i) プリオン蛋白質を、複数種の核酸分子と混合し；
(ii) 当該プリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択および分離し；
(iii) 所望により、その分離された核酸分子を増幅後、工程 (i) および(ii) を反復し；
(iv) 分離された核酸分子の、プリオン蛋白質に対する結合特異性を決定する；
を含む方法に関する。
In Vitro Selection of RNA Aptamers for Mouse Prion Protein The in vitro selection method underlying the present invention is described. The present invention includes the following steps:
(i) mixing a prion protein with multiple types of nucleic acid molecules;
(ii) selecting and separating nucleic acid molecules capable of binding to the prion protein;
(iii) optionally amplifying the separated nucleic acid molecule, then repeating steps (i) and (ii);
(iv) determining the binding specificity of the separated nucleic acid molecule for the prion protein;
Relates to a method comprising:
本発明では、核酸分子として、一本鎖または二本鎖核酸分子、例えばRNA、修飾されたRNA、一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAを使用することが可能である。特に、本発明においては一本鎖RNAを表す。 In the present invention, a single-stranded or double-stranded nucleic acid molecule such as RNA, modified RNA, single-stranded DNA or double-stranded DNA can be used as the nucleic acid molecule. In particular, in the present invention, it represents a single-stranded RNA.
好ましい態様において、上記の方法で用いられる核酸分子はRNAである。 In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule used in the above method is RNA.
プリオン蛋白質と特異的に結合する核酸分子が選択される元である出発物質を構成する複数種の核酸分子は、種々の配列を有する核酸分子の混合物のプールとすることが好ましい。このプールは核酸分子の任意の混合物であってよいが、好ましくはランダム化された分子のプールである。好ましくはこのプールの核酸分子は化学合成され、またはインビトロ転写により生成される。ここで複数種とは、1012〜1072（420〜4120）種類、好ましくは1018〜1036（430〜460）種類である。 The plural types of nucleic acid molecules constituting the starting material from which the nucleic acid molecules that specifically bind to the prion protein are selected are preferably a pool of a mixture of nucleic acid molecules having various sequences. This pool may be any mixture of nucleic acid molecules, but is preferably a randomized pool of molecules. Preferably, the nucleic acid molecules of this pool are chemically synthesized or generated by in vitro transcription. Here, the plural types are 10 12 to 10 72 (4 20 to 4 120 ) types, preferably 10 18 to 10 36 (4 30 to 4 60 ) types.
RNA分子の場合、プリオン蛋白質のイソ型の一つと特異的に結合する分子についてスクリーニングされるRNAプールは、好ましくは菊池ら(J Biochem (Tokyo), 133(3), 263-270, 2003)および／または福田ら(Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000)において記載されるRNAプールである。このプールは、30の位置でランダム化された60および74ヌクレオチドのRNA分子から成り、対応するDNA配列の転写から生成される。これらのRNAプールは、およそ1 x 1018の異なる配列のRNA分子を含んでいる。本発明においては、上記方法を適宜改変することができ、例えばランダム化された配列は20〜60塩基長とすることができ、それに応じてプールを構成するRNA分子の種類は1012〜1036の範囲であり得る。 In the case of RNA molecules, the RNA pool screened for molecules that specifically bind to one of the prion protein isoforms is preferably Kikuchi et al. (J Biochem (Tokyo), 133 (3), 263-270, 2003) and / Or RNA pool as described in Fukuda et al. (Eur. J. Biochem. 267 (12), 3685-3694, 2000). This pool consists of 60 and 74 nucleotide RNA molecules randomized at 30 positions and is generated from transcription of the corresponding DNA sequence. These RNA pools contain approximately 1 x 10 18 different sequences of RNA molecules. In the present invention, the above method can be modified as appropriate. For example, the randomized sequence can have a length of 20 to 60 bases, and the types of RNA molecules constituting the pool are 10 12 to 10 36 accordingly. Range.
本発明に係る方法は、哺乳動物における種々のプリオン病、例えば羊のスクレイピー、子牛のウシ海綿状脳症(BSE)、ミンクの伝達性ミンク脳症(TME)、人間の場合のクールー病、ゲルストマン-シュトロイスラー-シャインカー症候群(GSS)、致死性家族性不眠症(FFI)、クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、ラバ、シカおよびエルクの慢性消耗病(CWD)またはネコのネコ海綿状脳症(FSE)のような伝達性海綿状脳症に関係するプリオン蛋白質を識別できる核酸分子の同定および分離に使用することができる。伝達性海綿状脳症はまた、アラビアオリックス、グレータークーズー、エランド、アンコール、ムフロン、ピューマ、チータ、シミターホーンドオリックス、オセロットおよびトラ等でも知られている。従って、本発明の方法は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス等のげっ歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の種々の哺乳動物のプリオン蛋白質を標的として使用することができる。 The method according to the present invention comprises a variety of prion diseases in mammals such as sheep scrapie, calf bovine spongiform encephalopathy (BSE), mink transmissible mink encephalopathy (TME), Koolou disease in humans, Gerstman- Stroisler-Scheinker syndrome (GSS), lethal familial insomnia (FFI), Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), chronic wasting disease of mule, deer and elk (CWD) or feline cat spongiform encephalopathy (FSE) Can be used to identify and isolate nucleic acid molecules that can identify prion proteins associated with transmissible spongiform encephalopathy. Transmissible spongiform encephalopathy is also known in Arabian Oryx, Greater Kudu, Eland, Angkor, Muflon, Puma, Cheetah, Scimiter Horned Oryx, Ocelot and Tiger. Therefore, the method of the present invention can use prion proteins of various mammals such as rodents such as humans, monkeys, dogs, cats and mice, cows, goats and sheep.
核酸分子のプールをプリオン蛋白質と混合する工程、及びプリオン蛋白質と結合することのできる核酸分子を選択及び分離する工程は、種々の方法で実施することができる。 The step of mixing a pool of nucleic acid molecules with a prion protein and the step of selecting and separating nucleic acid molecules that can bind to the prion protein can be carried out in various ways.
本発明の一つの好ましい態様では、プリオン蛋白質は溶液に含まれた状態である。この場合、プリオン蛋白質に結合している核酸分子は、例えばニトロセルロース膜を使用した分離検定を実施し、蛋白質／核酸複合体を回収することにより分離することができる。その後、この核酸分子を複合体から分離し、既知の方法によってさらに精製することができる。 In one preferred embodiment of the present invention, the prion protein is in a state contained in a solution. In this case, the nucleic acid molecule bound to the prion protein can be separated by, for example, performing a separation assay using a nitrocellulose membrane and recovering the protein / nucleic acid complex. The nucleic acid molecule can then be separated from the complex and further purified by known methods.
もう一つの好ましい態様においては、プリオン蛋白質を、例えば磁気ビーズまたは樹脂のようなマトリックス上に固定化する。固定化は当業者に知られる手段によって達成することができる。例えば、蛋白質をマトリックスに共有結合させ、またはマトリックス上に存在する基と、この基を特異的に認識する蛋白質のドメインとの間の特異的相互作用によって蛋白質をマトリックスに結合させることができる。このようなドメインは、下に述べるような組換えDNA技術によってプリオン蛋白質に融合させることができる。 In another preferred embodiment, the prion protein is immobilized on a matrix such as magnetic beads or resin. Immobilization can be accomplished by means known to those skilled in the art. For example, the protein can be covalently bound to the matrix, or the protein can be bound to the matrix by a specific interaction between a group present on the matrix and a protein domain that specifically recognizes this group. Such a domain can be fused to a prion protein by recombinant DNA techniques as described below.
プリオン蛋白質が固定化されると、プリオン蛋白質に結合しない核酸分子は、適当な緩衝液による洗浄により、反応後に除去することができる。その後、プリオン蛋白質に結合しているこの核酸分子は、例えば7M尿素により、固定化された蛋白質から溶離し、さらに例えばフェノール抽出および沈澱化により精製することができる。 When the prion protein is immobilized, nucleic acid molecules that do not bind to the prion protein can be removed after the reaction by washing with an appropriate buffer. The nucleic acid molecule bound to the prion protein can then be eluted from the immobilized protein with, for example, 7M urea and further purified by, for example, phenol extraction and precipitation.
プリオン蛋白質が溶液状態である場合、プリオン蛋白質に結合している核酸分子は、例えばニトロセルロース膜を利用した検定を実施し、蛋白質−核酸複合体を分離することにより分離することができる。その後、この核酸分子を複合体から分離し、既知の方法によってさらに精製することができる。 When the prion protein is in a solution state, the nucleic acid molecule bound to the prion protein can be separated by, for example, performing an assay using a nitrocellulose membrane and separating the protein-nucleic acid complex. The nucleic acid molecule can then be separated from the complex and further purified by known methods.
上記核酸分子の選択及び分離の工程は、２種以上の方法で行うことが好ましい。それによって、特定の選択系に依存せずに標的分子と結合する核酸分子を選択することが可能である。 The nucleic acid molecule selection and separation steps are preferably performed by two or more methods. Thereby, it is possible to select a nucleic acid molecule that binds to a target molecule without depending on a specific selection system.
本発明によれば、例えばインビトロ転写、逆転写またはポリメラーゼ連鎖反応またはこれらの技術の組み合わせにより、工程(i)および(ii)により得られる核酸分子を増幅し、そして工程(i)および(ii)を反復することが可能である。この事により、使用されたプリオン蛋白質に特異的に結合する核酸分子のさらなる選択および増幅が導かれる。工程 (i) および(ii)の反復は、5〜20サイクルとすれば良く、好ましくは8〜15サイクルである。 According to the invention, the nucleic acid molecule obtained by steps (i) and (ii) is amplified, for example by in vitro transcription, reverse transcription or polymerase chain reaction or a combination of these techniques, and steps (i) and (ii) Can be repeated. This leads to further selection and amplification of nucleic acid molecules that specifically bind to the prion protein used. The repetition of the steps (i) and (ii) may be 5 to 20 cycles, preferably 8 to 15 cycles.
もしこの方法の工程(i)ないし(iii)を数サイクル実施するならば、１またはそれ以上のサイクルに固定化された蛋白質を、そして１またはそれ以上のサイクルに溶液の蛋白質を使用することが可能である。溶液状態の蛋白質が使用されるサイクルは、固定化された蛋白質が結合しているマトリックスに結合している核酸分子の除去を可能にする。 If steps (i) to (iii) of this method are carried out several cycles, using immobilized protein in one or more cycles and using solution protein in one or more cycles Is possible. The cycle in which the protein in solution is used allows the removal of nucleic acid molecules bound to the matrix to which the immobilized protein is bound.
この方法に用いられるプリオン蛋白質は、任意の既知のプリオン蛋白質イソ型または係る蛋白質のフラグメントもしくは誘導体であってよい。 The prion protein used in this method may be any known prion protein isoform or a fragment or derivative of such protein.
好ましい態様において、プリオン蛋白質は、組み換えプリオン蛋白質である。特に好ましい態様においては、組み換えマウスプリオン蛋白質が使用される。さらなる好ましい態様において、この方法で用いられるプリオン蛋白質は、細胞イソ型ＰrＰcである。 In a preferred embodiment, the prion protein is a recombinant prion protein. In a particularly preferred embodiment, recombinant mouse prion protein is used. In a further preferred embodiment, the prion protein used in this method is cellular isoform PrPc.
本発明に係る方法の最終工程では、分離された核酸分子を、プリオン蛋白質に対する結合特異性について試験する。 In the final step of the method according to the invention, the isolated nucleic acid molecule is tested for binding specificity for the prion protein.
したがって、本発明に係る方法は、プリオン蛋白質のイソ型またはそのフラグメントもしくは誘導体の一方と特異的に結合する核酸分子の同定および分離を可能にし、それにより異なるイソ型の識別を可能にする。 Thus, the method according to the invention allows the identification and separation of nucleic acid molecules that specifically bind to one of the prion protein isoforms or one of its fragments or derivatives, thereby allowing the distinction of different isoforms.
本発明の方法を実施して、mPrPcを識別できるRNA分子を４種類分離することができた。 By implementing the method of the present invention, four types of RNA molecules capable of identifying mPrPc could be separated.
従って、本発明はまた、本発明に係る方法により取得可能な核酸分子、即ち、プリオン蛋白質に結合する一本鎖RNA、一本鎖DNAまたは二本鎖DNA分子に関するものである。これらは、細胞イソ型PrPc、即ちプロセシングされた型PrPc23-231、またはこれらの蛋白質の誘導体に、特異的に結合する核酸分子を包含する。 Accordingly, the present invention also relates to a nucleic acid molecule obtainable by the method according to the present invention, that is, a single-stranded RNA, single-stranded DNA or double-stranded DNA molecule that binds to a prion protein. These include nucleic acid molecules that specifically bind to cellular isoform PrPc, ie, processed form PrPc23-231, or derivatives of these proteins.
マウスプリオン蛋白質に対する結合活性を持つRNAアプタマー配列
本発明に係るRNAアプタマーは、配列番号１または２の、ランダム配列を有するRNA分子より、インビトロ選択法により選択される。選択されるRNA分子は、塩基配列5’-HGGH-3’ （HはA、CまたはU）を一分子中に４箇所以上含む。かかる配列を有することにより、アプタマーが分子構造学的に安定なG４量体(Lin Y.ら, Nucleic Acids Res. 22, 5229-34, 1994.等)を形成し、mPrPcに結合しうる高次構造を形成するのに必須と推測される。
RNA aptamer sequence having binding activity to mouse prion protein The RNA aptamer according to the present invention is selected from RNA molecules having a random sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 by an in vitro selection method. The RNA molecule to be selected contains 4 or more base sequences 5′-HGGH-3 ′ (H is A, C or U) in one molecule. By having such a sequence, the aptamer forms a molecular structurally stable G tetramer (Lin Y. et al., Nucleic Acids Res. 22, 5229-34, 1994. etc.) and can bind to mPrPc. Presumed to be essential to form the structure.
好ましい態様において、RNAアプタマーは、上記と同様の理由により、ランダム領域に5’-GGWGG-3’（WはAまたはU）の配列を含んでいる。 In a preferred embodiment, the RNA aptamer contains a 5'-GGWGG-3 '(W is A or U) sequence in the random region for the same reason as described above.
さらにより好ましくは、当該RNAアプタマーは、以下の配列である。
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA -3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
Even more preferably, the RNA aptamer has the following sequence:
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 4)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 6)
本発明の方法または類似の方法によって核酸分子の選択を行う場合、元となる核酸分子のプールを構成する核酸分子と同じ塩基長の核酸分子が得られる場合もあるが、選択の過程で１〜５塩基程度短いものが好適な結合特異性を有するものとして得られる場合もある。従って、本発明のRNAアプタマーは、その塩基長が元となる核酸分子と同じ塩基長を有するものに限定されない。尚、上記配列番号３及び４のRNAアプタマーは57塩基長、配列番号５及び配列番号６のRNAアプタマーは74塩基長である。 When nucleic acid molecules are selected by the method of the present invention or a similar method, nucleic acid molecules having the same base length as the nucleic acid molecules constituting the pool of the original nucleic acid molecules may be obtained. In some cases, a short of about 5 bases can be obtained as having suitable binding specificity. Accordingly, the RNA aptamer of the present invention is not limited to those having the same base length as the nucleic acid molecule from which the base length is derived. The RNA aptamers of SEQ ID NOs: 3 and 4 are 57 bases long, and the RNA aptamers of SEQ ID NOs: 5 and 6 are 74 bases long.
マウスプリオン蛋白質に対する結合活性を持つRNAアプタマーの化学修飾
本発明に係る核酸分子は、それらの安定性を増し、そして／またはそれらの生化学的および／または生物物理学的性質を改変するため、１またはそれ以上の位置でさらに修飾しても良い。
Chemical modification of RNA aptamers with binding activity to mouse prion protein The nucleic acid molecules according to the present invention have the following advantages in order to increase their stability and / or modify their biochemical and / or biophysical properties: Or you may further modify in the position beyond it.
好ましい態様において、RNAアプタマー分子中の2’-位の水酸基を、化学合成または酵素反応によりフルオロ基、アミノ基、メトキシ基などの任意のヌクレアーゼ耐性基に置換することができる。 In a preferred embodiment, the hydroxyl group at the 2'-position in the RNA aptamer molecule can be substituted with any nuclease resistant group such as a fluoro group, an amino group, or a methoxy group by chemical synthesis or enzymatic reaction.
より好ましい態様において、該核酸分子はピリミジンヌクレオチドの2’-水酸基の１ないしそれ以上の箇所において、フルオロ基に置換することができる。 In a more preferred embodiment, the nucleic acid molecule can be substituted with a fluoro group at one or more positions of the 2'-hydroxyl group of the pyrimidine nucleotide.
好ましい態様において本発明に係る核酸分子は、それらを生化学的な検定に供するため、そして／またはそれらの生化学的および／または生物物理学的性質を改変するため、核酸分子の末端の一方または両端の位置をフルオロセイン、ローダミンなどの蛍光物質、ビオチン、マルトースなどのタグ分子等の当分野において通常用いられる機能性化合物で修飾することができる。 In a preferred embodiment, the nucleic acid molecules according to the invention are used at one of the ends of the nucleic acid molecule in order to subject them to biochemical assays and / or to modify their biochemical and / or biophysical properties or The positions at both ends can be modified with functional compounds usually used in the art such as fluorescent substances such as fluorescein and rhodamine, and tag molecules such as biotin and maltose.
より好ましい態様において、該核酸分子は5’-末端に適切なリンカーを介してビオチン化することができる。 In a more preferred embodiment, the nucleic acid molecule can be biotinylated via a suitable linker at the 5'-end.
マウスプリオン蛋白質に対するRNAアプタマーの結合活性
本発明に係るRNAアプタマーは、プリオン蛋白質に対して結合活性を示す。例えば、評価対象のRNA分子がプリオン蛋白質に対して結合活性を示すか否かについては、プリオン蛋白質に対する結合活性を測定することによって検討することができる。
Binding activity of RNA aptamer to mouse prion protein The RNA aptamer according to the present invention exhibits binding activity to prion protein. For example, whether or not the RNA molecule to be evaluated exhibits binding activity to the prion protein can be examined by measuring the binding activity to the prion protein.
結合活性を測定する際には、結合対象となるプリオン蛋白質を含む反応液に、評価対象のRNA分子を添加し、当該RNA分子と結合対象との結合を検出する。RNA分子と結合対象との結合は、RNA分子を標識化する場合には放射線検出器や蛍光検出器で、RNA分子を標識化しない場合には水晶振動子や表面プラズモン共鳴検出装置等によって検出することができる。 When measuring the binding activity, an RNA molecule to be evaluated is added to a reaction solution containing a prion protein to be bound, and the binding between the RNA molecule and the binding target is detected. The binding between the RNA molecule and the binding target is detected with a radiation detector or a fluorescence detector when the RNA molecule is labeled, and with a crystal oscillator or a surface plasmon resonance detector when the RNA molecule is not labeled. be able to.
診断用組成物および医薬組成物
本発明に係るプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーは、プリオン病を診断、予防または治療するために用いることができる。
Diagnostic Composition and Pharmaceutical Composition The RNA aptamer that specifically binds to the prion protein according to the present invention can be used for diagnosing, preventing or treating prion diseases.
プリオン病を診断するためには、係る組成物は、診断目的のために一般的に用いられる添加物を含有してよい。本発明に係る核酸分子および診断用組成物は、伝達性海綿状脳症の診断のための方法で使用することができる。係る方法は、例えば、身体から取得したプローブ（サンプル）を、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類と接触させ（例えば共にインキュベートし）、その後、該核酸分子とプリオン蛋白質のイソ型PrPcおよびPrPScとの相互作用を測定することを含む。 For diagnosing prion disease, such compositions may contain additives commonly used for diagnostic purposes. The nucleic acid molecule and diagnostic composition according to the present invention can be used in a method for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy. Such methods include, for example, contacting a probe (sample) obtained from the body with at least one of the nucleic acid molecules of the present invention (eg, incubating together), and then isolating PrPc and PrPSc of the nucleic acid molecule and the prion protein. And measuring the interaction.
伝達性海綿状脳症に罹患中は、イソ型PrPScの量が増加し、細胞イソ型PrPcの総量は減少するため、原則として二つのイソ型の一方または他方と結合する核酸分子を診断に使用することが可能である。すなわち、正常な状態（対照）と比較して、イソ型PrPScの量の増加、あるいは細胞イソ型PrPcの量の減少が検出されれば、伝達性海綿状脳症に罹患している可能性が高いと診断することができる。 During the course of transmissible spongiform encephalopathy, the amount of isoform PrPSc increases and the total amount of cellular isoform PrPc decreases, so in principle, nucleic acid molecules that bind to one or the other of the two isoforms are used for diagnosis. It is possible. That is, if an increase in the amount of isoform PrPSc or a decrease in the amount of cellular isoform PrPc is detected compared to the normal state (control), it is highly likely that the patient is suffering from transmissible spongiform encephalopathy. Can be diagnosed.
一方で、プローブ中のプリオン蛋白質の少なくとも一つのイソ型の量を定量するため、本発明に係る核酸分子の少なくとも１種類を使用することが可能である。 On the other hand, in order to quantify the amount of at least one isoform of the prion protein in the probe, it is possible to use at least one nucleic acid molecule according to the present invention.
他方では、プローブ中のイソ型の絶対量および／または相対量を測定するため、PrPcイソ型に特異的に結合する核酸分子をPrPScイソ型に特異的に結合する核酸分子と組み合わせて使用することが可能である。 On the other hand, to measure the absolute and / or relative amount of isoforms in the probe, use nucleic acid molecules that specifically bind to PrPc isoforms in combination with nucleic acid molecules that specifically bind to PrPSc isoforms. Is possible.
好ましい態様において、プローブは様々な臓器、好ましくは組織から、例えば脳、扁桃、回腸、皮質、硬膜、プルキニエ細胞、リンパ節、神経細胞、脾臓、筋肉細胞、胎盤、膵臓、眼球、脊髄またはパイエル板から、例えば薄い切片の形で取得することができる。別法としてプローブは、体液、好ましくは血液、脳脊髄液、乳または精液から取得することができる。 In preferred embodiments, the probe is from various organs, preferably tissues, such as the brain, tonsils, ileum, cortex, dura mater, Purkinje cells, lymph nodes, nerve cells, spleen, muscle cells, placenta, pancreas, eyeball, spinal cord or Peyer. It can be obtained from a plate, for example, in the form of a thin section. Alternatively, the probe can be obtained from a body fluid, preferably blood, cerebrospinal fluid, milk or semen.
脳をプローブとして使用する場合、診断は殆どの場合死後に実施する。例外的に脳生検を生きている生物に実施することができる。脳は、伝達性海綿状脳症に罹患し得る任意の生物、例えば羊、子牛、マウス、ネコ、ハムスター、ラバ、シカ、エルクもしくは人間、またはTSEに罹患し得る上記のようなその他の生物に源を発することができる。脳は、PrP0/0(ノックアウト)、PrPsc（感染した）およびPrPc（野生型）または未知のPrP状態である生物を供給源とすることができる。血液、乳、脳脊髄液、精液または上に述べたその他の臓器由来の組織をプローブとして使用する場合は、生きている個体に対する診断が可能である。 When the brain is used as a probe, diagnosis is most often performed after death. Exceptionally, a brain biopsy can be performed on a living organism. The brain refers to any organism that may suffer from transmissible spongiform encephalopathy, such as sheep, calves, mice, cats, hamsters, mules, deer, elks or humans, or other organisms as described above that may suffer from TSE. A source can be emitted. The brain can be sourced from organisms that are PrP0 / 0 (knockout), PrPsc (infected) and PrPc (wild-type) or unknown PrP status. When blood, milk, cerebrospinal fluid, semen or other organ-derived tissue as described above is used as a probe, it is possible to diagnose living individuals.
また、プリオン病を診断するための有効な前処理操作として、本発明のRNAアプタマーは、例えばプリオン濃縮カラムの担体として用いることができる。濃縮操作は低濃度の異常プリオン蛋白の検出を可能にするため、プリオン病の生前診断が可能になる。例えば、RNAアプタマーを共有結合または適切なリガンドを介してビーズに固定したカラムを作製する。大容量の血清や血液等の液性生体材料、およびそれらを用いて作られた製剤等をカラムに通し、結合したPrPScを小容量の溶出液で溶出することにより、PrPScの高度濃縮液を作製する。作成した濃縮液は通常の抗体法等で検出し、PrPSc混入の有無を判断することが可能である。 Further, as an effective pretreatment operation for diagnosing prion disease, the RNA aptamer of the present invention can be used as a carrier of a prion concentration column, for example. Since the concentration operation enables detection of a low concentration of abnormal prion protein, it enables prenatal diagnosis of prion disease. For example, a column in which an RNA aptamer is immobilized on beads via a covalent bond or an appropriate ligand is prepared. A highly concentrated solution of PrPSc is prepared by passing liquid biomaterials such as large volumes of serum and blood and preparations made using them through a column and eluting the bound PrPSc with a small volume of eluate. To do. The prepared concentrated solution can be detected by an ordinary antibody method or the like to determine the presence or absence of PrPSc contamination.
プリオン病を予防又は治療するには、プリオン病を発症した被験者の組織または細胞（例えば脳など）に、上述したプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーを導入することによって、PrPcに結合し、PrPScの増殖を阻止することができる。プリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーの導入は、例えば、導入対象のプリオン蛋白質に特異的に結合するRNAアプタマーをリポソームに封入し細胞内に取り込む方法（“lipidic vector systems for gene transfer”(1997) R.J lee 及び L. Huang Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 14: 173-206; 中西守ら、蛋白質 核酸 酵素 vol.44, No. 11, 1590-1596 (1999)）、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃による方法などで行うことができる。 In order to prevent or treat prion disease, it binds to PrPc by introducing an RNA aptamer that specifically binds to the above-described prion protein into tissues or cells (for example, brain, etc.) of a subject who has developed prion disease, PrPSc growth can be blocked. For example, RNA aptamers that specifically bind to prion proteins can be introduced by encapsulating RNA aptamers that specifically bind to the prion protein to be introduced into liposomes and incorporating them into cells (“lipidic vector systems for gene transfer” (1997 RJ lee and L. Huang Crit, Rev. Ther. Drug Carrier Sys. 14: 173-206; Mamoru Nakanishi et al., Protein Nucleic Acid Enzyme vol.44, No. 11, 1590-1596 (1999)), calcium phosphate method, electroporation , Lipofection method, microinjection method, gene gun method and the like.
なお、RNAアプタマーを有効成分として含む医薬組成物は、必要により医薬上許容される担体（例えば生理食塩水、緩衝液などの希釈剤）、賦形剤等の通常用いられる成分を適宜含むことができる。本発明の医薬組成物は、プリオン病の予防または治療に使用することができる。被験者への投与量、投与方法、投与頻度は、被験者の年令、体重、性別、疾病の状態、重篤度、生体の応答性によって適宜変化させうるし、また、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり投与が継続される。 In addition, the pharmaceutical composition containing an RNA aptamer as an active ingredient may appropriately contain a commonly used ingredient such as a pharmaceutically acceptable carrier (for example, a diluent such as a physiological saline or a buffer) or an excipient as necessary. it can. The pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of prion diseases. The dosage, administration method, and administration frequency to the subject can be appropriately changed depending on the subject's age, body weight, sex, disease state, severity, living body responsiveness, and until the effectiveness of the treatment is confirmed. Or the administration is continued for a period until a reduction in the disease state is achieved.
本発明はさらに、本発明に係る核酸分子を含む医薬組成物に関するものである。係る組成物は所望により製薬上許容し得る担体を含むことができる。 The invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid molecule according to the invention. Such compositions can optionally include a pharmaceutically acceptable carrier.
これらの組成物は、例えば上に列挙されたような伝達性海綿状脳症等のプリオン病の治療に有用であり得る。例えば、PrPcに特異的に結合する核酸分子を適用することにより、イソ型PrPcからプリオン関連イソ型PrPScへの変換を抑制することが可能となり得る。 These compositions may be useful for the treatment of prion diseases such as, for example, transmissible spongiform encephalopathy as listed above. For example, by applying a nucleic acid molecule that specifically binds to PrPc, it may be possible to suppress the conversion of isoform PrPc to prion-related isoform PrPSc.
さらに、本発明に係る核酸分子を使用して、プリオン蛋白質イソ型の特異的結合に必要な三次元構造を同定することができる。この情報の助けにより、プリオン蛋白質イソ型と特異的に結合できる他の化合物を分離または合成することができる。したがって、本発明はさらに、本発明に係る核酸分子の三次元構造から導かれる情報に基づき無機または有機化合物、好ましくは糖類、アミノ酸、蛋白質または炭水化物より成る群から選ばれる、核酸分子以外の化合物を同定する方法を提供する。 Furthermore, the nucleic acid molecule according to the present invention can be used to identify the three-dimensional structure necessary for the specific binding of the prion protein isoform. With the help of this information, other compounds that can specifically bind to the prion protein isoform can be separated or synthesized. Accordingly, the present invention further provides compounds other than nucleic acid molecules selected from the group consisting of inorganic or organic compounds, preferably sugars, amino acids, proteins or carbohydrates, based on information derived from the three-dimensional structure of the nucleic acid molecules according to the present invention. A method for identification is provided.
さらに、本発明に係る核酸分子を使用して、PrPSc結合分子の同定が可能である。例えば、TSE感染脳など、PrPScを含む生体材料を上記のRNAアプタマーを用いたプリオン濃縮カラムで濃縮し、生体内でPrPScと結合している蛋白質等の生体内分子の同定および得られたPrPSc結合性生体内分子によるPrPSc生成の影響等を明らかにすることが可能である。 Furthermore, PrPSc binding molecules can be identified using the nucleic acid molecules according to the present invention. For example, PrPSc-containing biomaterials such as TSE-infected brains are concentrated using the above-mentioned RNA aptamer with a prion concentration column, and in vivo molecules such as proteins bound to PrPSc are identified and PrPSc binding obtained. It is possible to clarify the effect of PrPSc generation by the biological biomolecules.
PrPSc結合性生体内分子の検出は、例えば、洗浄操作を行った後、RNAアプタマーを特異的に消化する酵素等を作用させ、ビーズとの結合を切断後、遊離したPrPSc-PrPSc結合性生体内分子複合体を電気泳動等で検出し、質量分析計等で同定することにより行うことができる。 The detection of PrPSc-binding in vivo molecules can be performed, for example, after washing operation, by causing an enzyme or the like that specifically digests RNA aptamer to act, and after cleaving the bond with beads, the released PrPSc-PrPSc binding in vivo The molecular complex can be detected by electrophoresis or the like and identified by a mass spectrometer or the like.
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
[実施例１]
マウスプリオン蛋白質と特異的に結合するRNA分子のインビトロ選択
マウス由来の組換えPrP23-231 (mPrPc)(プリオニクス)およびRNAプールを用いて、各々のプールについて下記の表に示す条件でインビトロ選択法（図１に模式的に示した）を実施した。
[Example 1]
In vitro selection of RNA molecules that specifically bind to mouse prion protein Using mouse-derived recombinant PrP23-231 (mPrPc) (prionics) and RNA pools, each pool was analyzed in vitro under the conditions shown in the table below ( (Schematically shown in FIG. 1).
本発明で用いたRNAプールは、記載のように（Kikuchiら, J Biochem (Tokyo), 133(3), 263-270, 2003；Fukudaら, Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000）２種のDNAプール（N30K:79塩基長、N30V:93塩基長、いずれも転写プロモーターの存在のため、転写されるRNAプールの塩基長より19塩基長い）からインビトロ転写によって作製した。簡潔に述べると、得られるRNAプールは、30塩基のランダム化された配列、すなわち塩基の順列430＝1.03 x1018分子、を含む。その結果、およそ1.03 x1018の異なる配列と1.03 x1018の複雑度を有するプールが生成したが、これは一つのプールのコピーに相当する(即ち、各々一つ一つのRNA分子がプール内で一重に表される)。 The RNA pool used in the present invention was prepared as described (Kikuchi et al., J Biochem (Tokyo), 133 (3), 263-270, 2003; Fukuda et al., Eur. J. Biochem. 267 (12), 3685- 3694, 2000) In vitro transcription was made from two DNA pools (N30K: 79 bases long, N30V: 93 bases long, both of which are 19 bases longer than the base length of the RNA pool being transcribed due to the presence of a transcription promoter). . Briefly, the resulting RNA pool contains a 30 base randomized sequence, ie, a base permutation 4 30 = 1.03 × 10 18 molecules. The result was a pool with approximately 1.03 x 10 18 different sequences and 1.03 x 10 18 complexity, which corresponds to one copy of the pool (i.e., each single RNA molecule is single in the pool). Is represented).
詳細には、RNAプールの技術的特徴は以下の5'領域の固定配列と3'領域の固定配列の間にランダム化された30ヌクレオチドの配列（塩基順列430＝1.03 x1018通り）を有するものである。 Specifically, the technical features of the RNA pool have the following 30 nucleotide sequence (base sequence 4 30 = 1.03 x10 18 ways) randomized between the 5 'region fixed sequence and the 3' region fixed sequence: Is.
5'領域のヌクレオチド配列：
N30K: 5’-AGTAATCGACTCACTATAGGTAGATACGATGGA-3’(配列番号7)
N30V: 5’-AGTAATCGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-3’ (配列番号8)
Nucleotide sequence of the 5 ′ region:
N30K: 5'-AGTAATCGACTCACTATAGGTAGATACGATGGA-3 '(SEQ ID NO: 7)
N30V: 5'-AGTAATCGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 8)
3'領域のヌクレオチド配列：
N30K: 5’-CATGACGCGCAGCCA-3’(配列番号9)
N30V: 5’-CCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3’ (配列番号10)
Nucleotide sequence of the 3 ′ region:
N30K: 5'-CATGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 9)
N30V: 5'-CCTTTCCTCTCTCCTTCCTCTTCT-3 '(SEQ ID NO: 10)
１プールの複雑度が430（＝1.03 x1018分子＝１プールコピー）であり、各々のRNA分子がプール内で一重に表される2種類のRNAプールの配列は以下のように示される。
N30K（60ヌクレオチド）
5’-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号1)
N30V（74ヌクレオチド）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3'（配列番号２）
The complexity of one pool is 4 30 (= 1.03 × 10 18 molecules = 1 pool copy), and the sequences of two types of RNA pools in which each RNA molecule is represented in a single manner in the pool are shown below.
N30K (60 nucleotides)
5'-GGUAGAUACGAUGGANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 1)
N30V (74 nucleotides)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 2)
5’領域のヌクレオチド配列中5'側19塩基（5’-AGTAATACGACTCACTATA-3’、配列番号１１）は、転写されていないため、DNAプールにのみ属する。 In the nucleotide sequence of the 5 'region, 19 bases on the 5' side (5'-AGTAATACGACTCACTATA-3 ', SEQ ID NO: 11) are not transcribed and belong only to the DNA pool.
なお、以下の操作は20 mＭ Tris-HCl (pH 7.5)、100 mＭ NaClを含有する結合緩衝液中で、下記表１及び２に示す反応条件下、mPrPcの存在下で反応させた(図１)。表１はN30Kプールからの選択条件、表２はN30Vプールからの選択条件を示し、表中、G1〜G10はそれぞれの選択サイクルを示し、「RNA」は用いた選択対象のRNA分子の濃度、「mPrP」はマウスプリオン蛋白質の濃度、「tRNA」は競合RNA分子の濃度をそれぞれ示す。また、N30Kからの選択（表１）においては、更に選択圧を高めるために、６サイクル目からN30Vプールから10サイクルの選択を経たRNAプールを共存させた。尚、当業者には容易に理解されるように、N30Kプールから選択されたRNA分子とN30Vプールから選択されたRNA分子は、末端の配列を異なるように設計しているため、容易に分離可能である。反応はすべてのサイクルにおいて室温静置で行った。 The following operation was performed in a binding buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 100 mM NaCl in the presence of mPrPc under the reaction conditions shown in Tables 1 and 2 below (FIG. 1). ). Table 1 shows the selection conditions from the N30K pool, Table 2 shows the selection conditions from the N30V pool. In the table, G1 to G10 show each selection cycle, “RNA” is the concentration of the RNA molecule to be selected, “MPrP” represents the concentration of mouse prion protein, and “tRNA” represents the concentration of competing RNA molecules. Moreover, in the selection from N30K (Table 1), in order to further increase the selection pressure, an RNA pool that had undergone 10 cycles of selection from the N30V pool was allowed to coexist from the 6th cycle. As will be readily understood by those skilled in the art, RNA molecules selected from the N30K pool and RNA molecules selected from the N30V pool are designed to have different end sequences, so they can be easily separated. It is. The reaction was performed at room temperature for all cycles.
ニトロセルロース膜を用いたインビトロ選択法
福田らの方法(Eur. J. Biochem. 267(12), 3685-3694, 2000)に従い行った。
表１及び２に示す組成でmPrPcとRNAプールおよび必要に応じて競合分子（tRNA）を反応溶液中にて反応させた後、HAポップ-トップキット（ミリポア）上に固定した0.45μm孔径ニトロセルロース膜（ミリポア）で濾過した。このとき、膜上にはmPrPcおよびmPrPc-RNA複合体が残る。膜を回収後、7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
In vitro selection method using nitrocellulose membrane was performed according to the method of Fukuda et al. (Eur. J. Biochem. 267 (12), 3685-3694, 2000).
After reacting mPrPc with RNA pool and competing molecule (tRNA) as necessary in the reaction solution with the composition shown in Tables 1 and 2, 0.45μm pore size nitrocellulose immobilized on HA Pop-Top Kit (Millipore) Filter through a membrane (Millipore). At this time, mPrPc and mPrPc-RNA complex remain on the membrane. After the membrane was recovered, RNA molecules were recovered by shaking and elution in a 7M urea-0.3M sodium acetate solution.
磁気ビーズに固定化したプリオン蛋白質を用いたインビトロ選択法
N30Kプールを用いた9サイクル目のインビトロ選択操作において、ダイナビーズM-450(ダイナル)上に固定したmPrPcを標的分子として用いた。mPrPcの磁気ビーズへの固定は、付属のマニュアルに従って行った。反応溶液を加えた後、磁気分離を行い、回収した磁気ビーズを7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
In vitro selection method using prion protein immobilized on magnetic beads
In the in vitro selection operation in the ninth cycle using the N30K pool, mPrPc immobilized on Dynabead M-450 (Dynal) was used as a target molecule. The fixation of mPrPc to magnetic beads was performed according to the attached manual. After adding the reaction solution, magnetic separation was performed, and the recovered magnetic beads were eluted by shaking in a 7M urea-0.3M sodium acetate solution to recover RNA molecules.
プレートを用いたインビトロ選択法
N30Vプールを用いた7サイクル目のインビトロ選択操作において、ゼノバインドプレート（ゼノポア）上に固定したmPrPcを標的分子として用いた。mPrPcのゼノバインドプレートへの固定は、付属のマニュアルに従って行った。反応溶液を加えた後、磁気分離を行い、回収した磁気ビーズを7M尿素-0.3M酢酸ナトリウム溶液中で振盪溶出して、RNA分子を回収した。
In vitro selection method using plates
In the in vitro selection operation in the seventh cycle using the N30V pool, mPrPc immobilized on a xenobind plate (xenopore) was used as a target molecule. The fixation of mPrPc to the xenobind plate was performed according to the attached manual. After adding the reaction solution, magnetic separation was performed, and the recovered magnetic beads were eluted by shaking in a 7M urea-0.3M sodium acetate solution to recover RNA molecules.
[実施例２]
逆転写反応
リバートエイドM-MuLV逆転写酵素キット（MBIファーメンタス）に従い逆転写反応を行った。具体的には、実施例１にて抽出されたRNAの全量に、逆転写反応溶液と以下に示される各々の3’-プライマー 50 pmolを加えた後、94℃で2分間反応後、室温に15分静置させた。反応後、0.25 mM dNTPs、逆転写酵素100ユニットを加えて42℃で１時間反応させた。
[Example 2]
Reverse transcription reaction Reverse transcription was performed according to the revert aid M-MuLV reverse transcriptase kit (MBI Fermentas). Specifically, the reverse transcription reaction solution and 50 pmol of each of the 3′-primers shown below were added to the total amount of RNA extracted in Example 1, followed by reaction at 94 ° C. for 2 minutes, and then at room temperature. Let stand for 15 minutes. After the reaction, 0.25 mM dNTPs and 100 units of reverse transcriptase were added and reacted at 42 ° C. for 1 hour.
3’-末端プライマーのヌクレオチド配列：
N30K：5’-TGGCTGCGCGTCATG-3’ (配列番号12)
N30V: 5’-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3’ (配列番号13)
Nucleotide sequence of 3'-end primer:
N30K: 5'-TGGCTGCGCGTCATG-3 '(SEQ ID NO: 12)
N30V: 5'-AGAAGAGGAAGGAGAGAGGAAAGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
[実施例３]
ポリメラーゼ連鎖反応
GeneTaq PCRキット（ニッポンジーン）に従い、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。具体的には、実施例２で精製したサンプルの全量に、PCR反応溶液と配列番号７、８、１２及び１３の5’-及び3’-プライマーを各々50 pmol、0.2 mM dNTPsおよびGeneTaqポリメラーゼ１ユニットを加えた後、94℃、1分間−55℃、１分15秒−72℃、1分15秒のサイクルを任意の回数行った。反応後、アガロースゲル電気泳動を行い、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅の確認をエチジウムブロマイド染色で行った。産物の増幅の確認後、エタノール沈澱を行い、凍結乾燥したサンプルを30 mM NaCl中に溶かした。
[Example 3]
Polymerase chain reaction
Polymerase chain reaction was performed according to the GeneTaq PCR kit (Nippon Gene). Specifically, 50 pmol, 0.2 mM dNTPs, and
[実施例４]
転写反応
アンプリスクライブT7転写キット（エピセントレ）に従い転写反応を行った。具体的には、実施例３で増幅されたｃDNAの50% を、転写反応溶液と7.5 mM ATP、7.5 mM GTP、7.5 mM CTP、7.5 mM UTP、10 mM DTT、T7 RNA ポリメラーゼ２ユニットを加えて、37℃で2時間反応させた。反応後、DNアーゼ0.5ユニットを加え、15分反応させた。RNA断片は、既知の方法に従って回収した(Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)。
[Example 4]
Transcription reaction Transcription reaction was carried out according to Ampris Live T7 transcription kit (Epicentre). Specifically, 50% of the cDNA amplified in Example 3 was added to the transcription reaction solution and 7.5 mM ATP, 7.5 mM GTP, 7.5 mM CTP, 7.5 mM UTP, 10 mM DTT, and 2 units of T7 RNA polymerase. And reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, 0.5 unit of DNase was added and allowed to react for 15 minutes. RNA fragments were recovered according to known methods (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977).
[実施例５]
ニトロセルロース結合検定
α-32P標識（Sambrookら, Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989）されたRNA 10 nMを、結合緩衝液中でプリオン蛋白質0ないし150nＭの存在下、プリオン蛋白質100 nM の存在下においてはtRNA（NEB）0ないし150 nＭの存在下で、10分間室温で反応した。反応混合物をHA ポップ-トップ 装置上に固定したニトロセルロース膜で濾過した後、反応緩衝液１mＬで洗浄し、BAS2500（富士フィルム）により測定した。
[Example 5]
Nitrocellulose binding assay α- 32 P labeled (Sambrook et al., Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989) RNA 10 nM in the presence of 0 to 150 nM prion protein in binding buffer In the presence of 100 nM, the reaction was carried out at room temperature for 10 minutes in the presence of tRNA (NEB) 0 to 150 nM. The reaction mixture was filtered through a nitrocellulose membrane fixed on an HA pop-top apparatus, washed with 1 mL of a reaction buffer, and measured with BAS2500 (Fuji Film).
10サイクルの選択の後、N30KプールにおいてはmPrPcに結合した選択されたRNAの約70%が、N30VプールにおいてはmPrPcに結合した選択されたRNAの50%が、ニトロセルロース膜上に固定化された。 After 10 cycles of selection, approximately 70% of the selected RNA bound to mPrPc in the N30K pool and 50% of the selected RNA bound to mPrPc in the N30V pool are immobilized on the nitrocellulose membrane. It was.
RNA結合の比率は以下のように決定した：反応溶液中に加えた放射能ラベルしたRNA分子の総放射能活性を100%と定めた。 2回の洗浄工程の後に保持されている放射能がRNA結合のパーセンテージを表す。 The ratio of RNA binding was determined as follows: The total radioactivity of radiolabeled RNA molecules added to the reaction solution was defined as 100%. The radioactivity retained after two washing steps represents the percentage of RNA binding.
[実施例６]
配列解析
10サイクルの増幅および選択の後に同定されたRNA分子の配列を決定するため、これらのRNA分子をcDNAに逆転写し、PCR（Sambrookら, Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989）により増幅した。得られたcDNAをpGEM-T EASY(プロメガ)中にサブクローニングし、cDNAクローンの配列をSangerらの方法（1977）に従って決定した。同定された4種類のRNA分子（RNAアプタマー60-3、60-2、74-9及び74-25）の配列を配列番号3〜6に示す。
[Example 6]
Sequence analysis
To determine the sequence of RNA molecules identified after 10 cycles of amplification and selection, these RNA molecules were reverse transcribed into cDNA and by PCR (Sambrook et al., Molecular cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, 1989). Amplified. The obtained cDNA was subcloned into pGEM-T EASY (Promega), and the sequence of the cDNA clone was determined according to the method of Sanger et al. (1977). The sequences of the four identified RNA molecules (RNA aptamers 60-3, 60-2, 74-9 and 74-25) are shown in SEQ ID NOs: 3-6.
60-3（N30Kプール由来）
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号3)
60-2（N30Kプール由来）
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
74-9（N30Vプール由来）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
74-25（N30Vプール由来）
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCU CUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
60-3 (from N30K pool)
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
60-2 (from N30K pool)
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 4)
74-9 (from N30V pool)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 5)
74-25 (from N30V pool)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCU CUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 6)
[実施例７]
ヌクレアーゼ耐性修飾
デュラスクライブT7転写キット（エピセントレ）に従い転写反応を行った。具体的には、実施例３で増幅されたｃDNAの50%を、転写反応溶液と3.75 mM ATP、3.75 mM GTP、3.75 mM 2’-F CTP、3.75 mM 2’-F UTP、10 mM DTT、T7 RNA ポリメラーゼ２ユニットを加えて、37℃で8時間反応させた。反応後、DNアーゼ0.5ユニットを加え、15分反応させた。RNA断片は、既知の方法に従って回収した(Sangerら, Proc. Notl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977)。
[Example 7]
A transcription reaction was performed according to a nuclease resistant modified Durascribe T7 transcription kit (Epicentre). Specifically, 50% of the cDNA amplified in Example 3 was transferred to the transcription reaction solution and 3.75 mM ATP, 3.75 mM GTP, 3.75
[実施例８]
結合定数測定
この目的のためにα-32P標識したRNAアプタマー（配列番号3〜6）10 nMを、0、0.5、1、5、10、50、100、500、1000 nMのmPrPcの存在下に、上記の検定条件の下で37℃で10分間反応した。反応混合物をHA ポップ-トップ 装置上に固定したニトロセルロース膜で濾過した後、反応緩衝液１mＬで洗浄した。
[Example 8]
Binding constant measurements α- 32 P-labeled RNA aptamers (SEQ ID NOs: 3-6) for this purpose 10 nM in the presence of 0, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000 nM mPrPc And reacted at 37 ° C. for 10 minutes under the above assay conditions. The reaction mixture was filtered through a nitrocellulose membrane fixed on an HA pop-top apparatus, and then washed with 1 mL of reaction buffer.
フィルターを乾燥し、２時間のオートラジオグラフィーに付した。シグナルの強度をBAS2500（富士フィルム）上で、燐の画像化により測定した。 The filter was dried and subjected to 2 hours autoradiography. The intensity of the signal was measured by phosphorous imaging on a BAS2500 (Fuji Film).
平衡結合定数の算出のために、RNAおよび蛋白質間の二分子反応を想定した。 For the calculation of the equilibrium binding constant, a bimolecular reaction between RNA and protein was assumed.
平衡状態のRNA／蛋白質複合体の濃度［ｃ］は、膜上に残った放射能の量およびRNAの既知の比放射能から決定することができる。平衡結合定数（Ｋd）の算出には以下の式が使用された(Meisterernstら, Nucleic acids Res, 16, 4419-4435, 1988)：
Ro＝Req＋[RP]eq；
Peq＝Po−[RP]eq；
R＝RNAアプタマー
P＝mPrPc；
The concentration of the RNA / protein complex at equilibrium [c] can be determined from the amount of radioactivity remaining on the membrane and the known specific activity of the RNA. The following equation was used to calculate the equilibrium binding constant (K d ) (Meisterernst et al., Nucleic acids Res, 16, 4419-4435, 1988):
Ro = Req + [RP] eq;
Peq = Po− [RP] eq;
R = RNA aptamer
P = mPrPc;
RNAアプタマーおよびmPrPcの複合体に対する以下の平衡結合定数(Ｋd)は、RNAアプタマー60-3および60-2について、それぞれＫd＝5.6 x 10 -9 Ｍ(60-3)、9.4 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図２）。 The following equilibrium binding constants (K d ) for RNA aptamer and mPrPc complexes are as follows for RNA aptamers 60-3 and 60-2: K d = 5.6 × 10 −9 M (60-3), 9.4 × 10 − Calculated as 9 M (60-2) (Figure 2).
何れも、bPrPc(ウシ組換えプリオン蛋白質；ロシュ)に対しては親和性が弱くなり、それぞれＫd＝72 x 10 -9 Ｍ(60-3)、120 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図２）。 In either case, the affinity for bPrPc (bovine recombinant prion protein; Roche) is weak, and K d = 72 × 10 −9 M (60-3) and 120 × 10 −9 M (60-2), respectively. (Fig. 2).
また、ピリミジン2’-F修飾したRNAアプタマー60-3および60-2について、Ｋd＝27.5 x 10 -9 Ｍ(60-3)、23.0 x 10 -9 Ｍ(60-2)と計算された（図３）。
In addition, for the
[実施例９]
5’-末端ビオチン化反応
5’末端核酸ラベリングシステム（ベクター）に従い、5’-末端ビオチン化反応を行った。具体的には、実施例８で得られたRNA分子600 pmolを反応溶液中でアルカリフォスファターゼで37℃、30分反応させた。反応後、1.3 μgのATPγSの存在下でT4ポリヌクレオチドキナーゼで37℃、30分反応させた。反応後、ビオチンマレイミド380μg存在下で65℃、30分反応させた。反応後、定法によりエタノール沈澱操作を行い、回収した。回収した産物は、吸光度測定により濃度を測定した。
[Example 9]
5'-terminal biotinylation reaction
A 5′-terminal biotinylation reaction was performed according to a 5′-terminal nucleic acid labeling system (vector). Specifically, 600 pmol of the RNA molecule obtained in Example 8 was reacted with alkaline phosphatase in a reaction solution at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the reaction was performed with T4 polynucleotide kinase at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of 1.3 μg of ATPγS. After the reaction, the reaction was carried out at 65 ° C. for 30 minutes in the presence of 380 μg of biotinmaleimide. After the reaction, ethanol precipitation was performed by a conventional method and recovered. The concentration of the collected product was measured by absorbance measurement.
[実施例１０]
ドットブロットアッセイ
RNAアプタマーに対するmPrPcの相互作用部位をマッピングするため、本発明者らは一連のGST融合組換えプリオン蛋白質（独立行政法人 動物衛生研究所 横山 隆氏より提供）を使用した。
[Example 10]
Dot blot assay
In order to map the interaction site of mPrPc to RNA aptamer, we used a series of GST-fused recombinant prion proteins (provided by Takashi Yokoyama, Incorporated Administrative Institution).
操作は基本的にParamjeetら(RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256)の方法に従って行った。GST融合組換えプリオン蛋白質をニトロセルロース膜に1μg滴下、乾燥後、１%BSAでブロッキングをした後、5’末端をビオチン化したRNAアプタマー60-3、74-9、または74-25で一定時間反応させた。反応後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）（ロシュ）を一定時間反応させ、ビオチンを介してRNAアプタマー／SA-AP複合体を形成させる。反応後、膜を洗浄し、発光基質CDP-Star（ロシュ）を湿潤させ、発光反応を行った。検出は、ポラロイドミニカメラ（アマシャム）で行った。 The operation was basically performed according to the method of Paramjeet et al. (RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256). 1 μg of GST-fused recombinant prion protein is dropped onto a nitrocellulose membrane, dried, blocked with 1% BSA, and then fixed for 5 hours with RNA aptamer 60-3, 74-9, or 74-25 with biotinylated 5 ′ end Reacted. After the reaction, streptavidin-alkaline phosphatase (SA-AP) (Roche) is reacted for a predetermined time to form an RNA aptamer / SA-AP complex via biotin. After the reaction, the membrane was washed, the luminescent substrate CDP-Star (Roche) was wetted, and the luminescent reaction was performed. Detection was performed with a Polaroid mini camera (Amersham).
GST融合組換え蛋白質23-231および89-231が、5’-ビオチン化したRNAアプタマー60-3と相互作用し(図４)、このことは、アプタマーによる認識のためには、マウスのプリオン蛋白質のアミノ末端残基aa23ないしaa155で十分であることを証明している。 GST fusion recombinant proteins 23-231 and 89-231 interact with 5′-biotinylated RNA aptamer 60-3 (FIG. 4), which indicates that the mouse prion protein for recognition by the aptamer The amino-terminal residues aa23 to aa155 are proved to be sufficient.
[実施例１１]
ノースウエスタンアッセイ
基本的にParamjeetら(RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256)の方法に従って行った。5週齢DDYマウス脳ホモジネートをSDS-PAGEで展開した後、ニトロセルロース膜に転写し、１％BSA-0.5 μg/μl Poly U(アマシャム)でブロッキングをした後、5’末端をビオチン化、または32P標識したRNAアプタマー60-3で一定時間反応させた。
[Example 11]
Northwestern assay was basically performed according to the method of Paramjeet et al. (RNA-Protein interaction protocols, Humana press, 245-256). After developing a 5-week-old DDY mouse brain homogenate by SDS-PAGE, transferring to a nitrocellulose membrane and blocking with 1% BSA-0.5 μg / μl Poly U (Amersham), biotinylation at the 5 ′ end, or The reaction was performed with 32 P-labeled RNA aptamer 60-3 for a certain period of time.
5’末端をビオチン化したRNAアプタマーの場合、反応後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（SA-AP）（ロシュ）を一定時間反応させ、ビオチンを介してRNAアプタマー／SA-AP複合体を形成させる。反応後、膜を洗浄し、発光基質CDP-Star（ロシュ）を湿潤させ、発光反応を行った。検出は、ポラロイドミニカメラ（アマシャム）で行った。 In the case of an RNA aptamer in which the 5 'end is biotinylated, after the reaction, streptavidin-alkaline phosphatase (SA-AP) (Roche) is reacted for a predetermined time to form an RNA aptamer / SA-AP complex via biotin. After the reaction, the membrane was washed, the luminescent substrate CDP-Star (Roche) was wetted, and the luminescent reaction was performed. Detection was performed with a Polaroid mini camera (Amersham).
5’末端を32P標識したRNAアプタマーの場合、反応後膜を洗浄し、BAS2500（富士フィルム）上で、燐の画像化により測定した。 In the case of an RNA aptamer labeled at the 5 ′ end with 32 P, the membrane was washed after the reaction and measured by imaging phosphorous on BAS2500 (Fuji Film).
その結果、RNAアプタマー60-3は目的の位置（29KDa）付近に特異的なバンドが検出され（図５）、このバンドは抗体6H4（ロシュ）を用いた場合と同じ位置に検出された。 As a result, a specific band was detected in the vicinity of the target position (29 KDa) in RNA aptamer 60-3 (FIG. 5), and this band was detected at the same position as when antibody 6H4 (Roche) was used.
Claims (10)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’(配列番号3)
5’-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3’ (配列番号4)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号5)
5’-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3’ (配列番号6)
からなる群から選択される何れかの塩基配列を含み、かつプリオン蛋白質と特異的に結合することを特徴とする、RNAアプタマー。 The following base sequence
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUUUAUGUGCGUAUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-GGUAGAUACGAUGGAGGUGUAUUGCAUGCGUGUGUUUGGAGGCAUGACGCGCAGCCA-3 '(SEQ ID NO: 4)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGGUUUGGCGCGUGGUGGAGUCGGGUUGAGCGCCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-GGGAGAAUUCCGACCAGAAGCUAUGGAGGUGGAGGCUGCUUUCUGGUUGACCUUUCCUCUCUCCUUCCUCUUCU-3 '(SEQ ID NO: 6)
An RNA aptamer comprising any base sequence selected from the group consisting of and specifically binding to a prion protein.
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