JP4649593B2 - Method for decomposing polyhydroxyalkanoate resin - Google Patents
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Description
本発明は、新規な生物学的処理法によるポリヒドロキシアルカノエートの分解方法に関する。 The present invention relates to a method for degrading polyhydroxyalkanoates by a novel biological treatment method.
最近、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱え、生物学的分解処理法が注目されている。ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂は生分解性を有し、次世代のプラスチックとして種々の用途開発が進められているが、近い将来、現在使用されているプラスチック同様廃棄物問題がクローズアップされることが十分に予想される。 Recently, disposal of plastic waste has become a problem. Incineration and landfill are the main methods for treating plastic waste, but incineration has problems such as the promotion of global warming and landfill has a problem of reducing landfills. Biological decomposition treatment methods are attracting attention. Polyhydroxyalkanoate resins are biodegradable, and various applications are being developed as next-generation plastics. However, in the near future, waste problems as well as currently used plastics will be highlighted. Fully expected.
ポリヒドロキシアルカノエートは土壌中や水系の中で加水分解する高分子であり、環境分解が困難である汎用プラスチックに代わる生分解性プラスチックの素材として注目されている。ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂はその構成モノマーの種類によりポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリヒドロキシヘキサン酸、ポリヒドロキシヘプタン酸、ポリヒドロキシオクタン酸、ポリヒドロキシノナン酸、ポリヒドロキシデカン酸等あるいはそれらの共重合体が存在している。 Polyhydroxyalkanoate is a polymer that hydrolyzes in soil and water, and has attracted attention as a material for biodegradable plastics that can replace general-purpose plastics that are difficult to decompose in the environment. Polyhydroxyalkanoate resin may be polyhydroxybutyric acid, polyhydroxyvaleric acid, polyhydroxyhexanoic acid, polyhydroxyheptanoic acid, polyhydroxyoctanoic acid, polyhydroxynonanoic acid, polyhydroxydecanoic acid, etc. A copolymer is present.
ポリヒドロキシアルカノエートの一種であるポリヒドロキシ酪酸は様々な微生物のエネルギー源として細胞内で合成され、貯蔵されることが知られている（非特許文献１及び２参照）。また、好気性の微生物（非特許文献３〜５）や嫌気性の微生物（特許文献１、非特許文献６及び７）によってポリヒドロキシ酪酸が分解されることが知られている。
しかしながら、従来の報告はほとんどが２５〜３０℃での分解反応に限定されており、コンポストなどの高温条件でポリヒドロキシアルカノエート系樹脂を積極的に分解させるための技術の検討はまだ十分なされているとは言えなかった。そこで、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂およびそれらを含むプラスチックを４０〜６０℃付近で分解処理する新規微生物およびその方法を提供することを目的とする。 However, most of the conventional reports are limited to the decomposition reaction at 25 to 30 ° C., and the technology for actively decomposing the polyhydroxyalkanoate resin under a high temperature condition such as compost is still sufficiently studied. I couldn't say. Then, an object of this invention is to provide the novel microorganisms and its method of decomposing | disassembling polyhydroxyalkanoate type-resin and the plastics containing them at 40-60 degreeC vicinity.
本発明者らは、前記課題を解決するべく広範にスクリーニングを行い、鋭意研究を重ねた結果、微生物学的手段により優れたポリヒドロキシアルカノエート分解活性を有するストレプトマイセス属放線菌および放線菌が生産する酵素を新たに見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of extensive screening and extensive research to solve the above problems, the present inventors have found that Streptomyces spp. And actinomycetes having superior polyhydroxyalkanoate-degrading activity by microbiological means. A new enzyme to be produced has been found and the present invention has been completed.
即ち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供する。 That is, the present invention provides the following (1) to (9).
（１） ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解能を有し、分子量が約４７０００〜５６０００、至適ｐＨが４〜１０、至適温度が４０〜５５℃である、ストレプトマイセス属放線菌由来の酵素。 (1) Enzyme derived from Streptomyces genus Actinomycetes having resolution of polyhydroxyalkanoate resin, molecular weight of about 47000-56000, optimum pH of 4-10, and optimum temperature of 40-55 ° C. .
（２） ポリヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸塩、及び／またはヒドロキシ酪酸エステルにより誘導生産される上記（１）に記載の酵素。 (2) The enzyme according to (1) above, which is inducibly produced by polyhydroxyalkanoate, hydroxybutyric acid, polyhydroxybutyrate, and / or hydroxybutyric acid ester.
（３） ストレプトマイセス属放線菌が、ストレプトマイセス・サーモブルガリス（Streptomyces thermovulgaris）、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス（Streptomyces thermoolivaceus）、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス（Streptomyces thermohygroscopicus）、またはストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス（Streptomyces thermocarboxydovorans）である、上記（１）または（２）に記載の酵素。 (3) Streptomyces thermovulgaris (Streptomyces thermovulgaris), Streptomyces thermoolivaceus, Streptomyces thermohygroscopicus, or Streptomyces thermohygroscopicus The enzyme according to (1) or (2) above, which is Streptomyces thermocarboxydovorans.
（４） ストレプトマイセス属放線菌が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８である、上記（１）または（２）に記載の酵素。 (4) The enzyme according to (1) or (2) above, wherein the Streptomyces genus actinomycetes is accession number FERM BP-10158 .
（５） ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂を上記（１）〜（４）のいずれかに記載の酵素と接触させ、反応させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法。 (5) A method for decomposing a polyhydroxyalkanoate resin, comprising contacting the polyhydroxyalkanoate resin with the enzyme according to any one of (1) to (4) and causing the reaction.
（６） ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂をストレプトマイセス属放線菌と接触させ、４０〜５５℃で反応させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法。 (6) A method for decomposing a polyhydroxyalkanoate resin, comprising contacting a polyhydroxyalkanoate resin with Streptomyces actinomycetes and reacting at 40 to 55 ° C.
（７） ストレプトマイセス属放線菌が、ストレプトマイセス・サーモブルガリス、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス、またはストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランスである、上記（６）に記載の方法。 (7) The above-mentioned Streptomyces thermobulgaris, Streptomyces thermoolivius, Streptomyces thermohygroscopicus, or Streptomyces thermocarbox boranes The method according to (6).
（８） ストレプトマイセス属放線菌が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８である、上記（６）に記載の方法。 (8) The method according to (6) above, wherein the Streptomyces genus actinomycetes is accession number FERM BP-10158 .
（９） ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解能を有する、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８である、ストレプトマイセス属放線菌。 (9) Streptomyces genus actinomycetes having accession number FERM BP-10158 , which has the resolution of a polyhydroxyalkanoate resin.
本発明のポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法は、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂及びそれを含む廃棄物の処理方法であり、これまでの焼却処理方法のように排ガスも生じず、埋立処理に比べて極めて省時間な技術であり、廃棄物処理上で極めて価値の高い方法である。特に、生分解性プラスチックであるポリヒドロキシアルカノエート系樹脂に対し、単に土壌中での自然な分解を待つのではなく、分解活性を有する微生物や酵素を使用して積極的に分解することによって、環境により良い処理方法が提供される。また、コンポスト化施設で本発明の処理方法を用いることにより、ポリヒドロキアルカノエート系樹脂を有機酸等の有用物質や堆肥に転換することも可能である。更にまた、本発明の方法を用い、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂のリサイクル利用が容易なものとなる。 The method for decomposing a polyhydroxyalkanoate resin according to the present invention is a method for treating a polyhydroxyalkanoate resin and a waste material containing the polyhydroxyalkanoate resin, and no exhaust gas is produced as in the incineration treatment method so far. This is an extremely time-saving technology and a very valuable method for waste disposal. In particular, for polyhydroxyalkanoate resins that are biodegradable plastics, instead of simply waiting for natural degradation in the soil, by actively degrading using microorganisms and enzymes that have degradation activity, A better treatment method is provided for the environment. Further, by using the treatment method of the present invention at a composting facility, it is possible to convert the polyhydroxyalkanoate resin into useful substances such as organic acids and compost. Furthermore, by using the method of the present invention, it becomes easy to recycle the polyhydroxyalkanoate resin.
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2003-376263号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。 This specification includes the contents described in the specification and / or drawings of Japanese Patent Application No. 2003-376263, which is the basis for the priority of the present application.
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解能を有するストレプトマイセス属放線菌由来の新規酵素を提供する。本発明の酵素は、分子量が約４７０００〜５６０００、至適ｐＨが４〜１０、好ましくは７〜８、至適温度が４０〜５５℃である。また、本発明の酵素は、ポリヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸塩、及び／またはヒドロキシ酪酸エステルの存在下で誘導生産されることが見出された。 The present invention provides a novel enzyme derived from Streptomyces genus actinomycetes having a resolution of polyhydroxyalkanoate resin. The enzyme of the present invention has a molecular weight of about 47,000 to 56000, an optimum pH of 4 to 10, preferably 7 to 8, and an optimum temperature of 40 to 55 ° C. It has also been found that the enzyme of the present invention is inducibly produced in the presence of polyhydroxyalkanoate, hydroxybutyric acid, polyhydroxybutyrate, and / or hydroxybutyric acid ester.
本発明でいうポリヒドロキシアルカノエート系樹脂とは、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリヒドロキシヘキサン酸、ポリヒドロキシヘプタン酸、ポリヒドロキシオクタン酸、ポリヒドロキシノナン酸、ポリヒドロキシデカン酸等あるいはそれらの共重合体である。さらに、γ−ブチロラクトンに化学触媒を使ってβ−プロピオラクトン、β−ブチロラクトン、β−ブチロラクトン、ε−カプロラクトン、ω−ペンタデカラクトン等の他の成分を共重合させたポリヒドロキシ酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含み、重合体中のヒドロキシアルカノエート成分の重量比率が10%以上のものをいう。また、本発明の分解方法において適用し得るポリヒドロキシアルカノエートの数平均分子量は10,000〜１０6、好ましくは50,000〜300,000程度のものであるが、本発明はこれらに特に限定されるものではない。ポリヒドロシキアルカノエートの市販品は、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸とポリヒドロキシ吉草酸の共重合体がアルドリッチ社の製品として知られているが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。The polyhydroxyalkanoate resin referred to in the present invention is polyhydroxybutyric acid, polyhydroxyvaleric acid, polyhydroxyhexanoic acid, polyhydroxyheptanoic acid, polyhydroxyoctanoic acid, polyhydroxynonanoic acid, polyhydroxydecanoic acid, or the like. It is a copolymer. Furthermore, polyhydroxy acid copolymer obtained by copolymerizing γ-butyrolactone with other components such as β-propiolactone, β-butyrolactone, β-butyrolactone, ε-caprolactone, ω-pentadecalactone using a chemical catalyst. And a blend of the above-mentioned polymers and with other component polymers, wherein the weight ratio of the hydroxyalkanoate component in the polymer is 10% or more. The number average molecular weight of the polyhydroxyalkanoate applicable in the decomposition method of the present invention is 10,000 to 10 6 , preferably about 50,000 to 300,000, but the present invention is not particularly limited to these. Commercially available products of polyhydroxyalkanoate are known as polyhydroxybutyric acid and polyhydroxybutyric acid and polyhydroxyvaleric acid as a product of Aldrich, but the method of the present invention is not limited thereto. Absent.
本発明の酵素は、例えば、ストレプトマイセス・サーモブルガリス（Streptomyces thermovulgaris）、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス（Streptomyces thermoolivaceus）、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス（Streptomyces thermohygroscopicus）、またはストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス（Streptomyces thermocarboxydovorans）等のストレプトマイセス属放線菌から得ることができる。 The enzyme of the present invention may be, for example, Streptomyces thermovulgaris, Streptomyces thermoolivaceus, Streptomyces thermohygroscopicus, or Streptomyces thermohygroscopicus. It can be obtained from Streptomyces genus actinomycetes, such as Thermo Carboxide Borans (Streptomyces thermocarboxydovorans).
上記のストレプトマイセス属放線菌は、独立行政法人 理化学研究所（埼玉県和光市広沢2-1）等の微生物系統保存施設に保存されており、入手することができる。本発明において、特に限定するものではないが、好ましくはストレプトマイセス・サーモブルガリス(JCM4338)、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス菌株(JCM4921)、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス(JCM4917)、ストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス（JCM10367）の中から一種、または複数の菌株を選択して用いることが望ましい。 The above Streptomyces genus actinomycetes are preserved in a microbial strain storage facility such as RIKEN (2-1 Hirosawa, Wako City, Saitama Prefecture) and can be obtained. In the present invention, although not particularly limited, preferably Streptomyces thermobulgaris (JCM4338), Streptomyces thermoolivous strain (JCM4921), Streptomyces thermohygroscopic (JCM4917), Streptomyces thermohygroscopicus (JCM4917), It is desirable to select and use one or more strains from Myces thermocarboxidobolans (JCM10367).
本発明者等はまた、上記酵素を産生する新規ストレプトマイセス属放線菌を土壌中から見出した。この新規ストレプトマイセス属放線菌は、寒天培地にポリヒドロキシ酪酸（数平均分子量Mn：2.1×105）を分散させたシャーレを使用し、つくば市内の土を接種、50℃で培養し、クリアーゾーンを形成した菌の中から取得した。分解活性の認められた株から、24時間以内の培養で明瞭なクリアーゾーンを形成し、特に活性の高いものをMG2株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）にブタペスト条約の規定下で２００３年１１月４日付けで受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９５７８として寄託、その後、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８として国際寄託した。上記放線菌株（MG2）は、２５〜６０℃の温度条件下で培養が可能であり、５０℃で特に良好な増殖を示した。系統発生学的分析の結果、MG2株はStreptomyces thermocarboxydovorans及びStreptomyces thermodiastaticusとそれぞれ97.0％及び96.5％の配列類似性を示す新規菌種であることが見出された。 The present inventors have also found a novel Streptomyces actinomycete from the soil that produces the enzyme. This novel Streptomyces genus actinomycetes uses a petri dish in which polyhydroxybutyric acid (number average molecular weight Mn: 2.1 × 10 5 ) is dispersed in an agar medium, inoculate the soil in Tsukuba city, and is cultured at 50 ° C. It was obtained from the bacteria that formed the clear zone. A clear zone was formed by culturing within 24 hours from a strain with a degrading activity, and the one with particularly high activity was named the MG2 strain. The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (Ibaraki Prefecture) Deposited as FERM P-19578 on November 4, 2003 under the provisions of the Budapest Treaty, and deposited internationally as FERM BP-10158 in the center of Tsukuba City, 1-1-1 Higashi 1-chome. The actinomycetes (MG2) can be cultured under temperature conditions of 25-60 ° C., and showed particularly good growth at 50 ° C. As a result of phylogenetic analysis, it was found that the MG2 strain is a novel strain showing 97.0% and 96.5% sequence similarity with Streptomyces thermocarboxydovorans and Streptomyces thermodiastaticus, respectively.
上記のストレプトマイセス属放線菌は、培地中（菌体外）に上記本発明の酵素を分泌し得ることが明らかとなった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析による測定の結果、本発明の酵素の分子量は約４７０００〜５６０００の範囲である。 It has been clarified that the above Streptomyces actinomycetes can secrete the enzyme of the present invention into the medium (outside the cells). As a result of measurement by SDS-PAGE electrophoresis analysis, the molecular weight of the enzyme of the present invention is in the range of about 47000 to 56000.
本発明はまた、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂を上記本発明の酵素と接触させ、反応させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法を提供する。 The present invention also provides a method for decomposing a polyhydroxyalkanoate resin, wherein the polyhydroxyalkanoate resin is brought into contact with the enzyme of the present invention and reacted.
本発明はまた、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂をストレプトマイセス属放線菌と接触させ、４０〜５５℃で反応させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法を提供する。 The present invention also provides a method for decomposing a polyhydroxyalkanoate resin, comprising contacting the polyhydroxyalkanoate resin with Streptomyces actinomycetes and reacting at 40 to 55 ° C.
本発明の方法は、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解をストレプトマイセス属放線菌あるいは該放線菌由来の酵素により行うことで、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解処理を可能にするものである。 In the method of the present invention, the polyhydroxyalkanoate resin is decomposed by Streptomyces genus actinomycetes or an enzyme derived from the actinomycetes, thereby allowing the polyhydroxyalkanoate resin to be decomposed.
本発明の方法において使用される好ましいストレプトマイセス属放線菌は、ストレプトマイセス・サーモブルガリス、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス、またはストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランスである。 The preferred Streptomyces actinomycetes used in the method of the present invention is Streptomyces thermobulgaris, Streptomyces thermoolivousus, Streptomyces thermohygroscopic, or Streptomyces thermocarboxy Dovorance.
本発明の方法において使用される更なる好ましいストレプトマイセス属放線菌は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８として国際寄託されている菌株の属する放線菌である。 Further preferred Streptomyces actinomycetes used in the method of the present invention are actinomycetes to which the strain deposited internationally under the deposit number FERM BP-10158 belongs.
特に好ましい放線菌としては、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０１５８として本発明者等が寄託したMG2株が挙げられる。 Particularly preferred actinomycetes include the MG2 strain deposited by the present inventors under the accession number FERM BP-10158 .
本発明の方法は、無機塩類を含む培地を用いてポリヒドロキシアルカノエートと上記ストレプトマイセス属のMG2株、ストレプトマイセス・サーモブルガリス株、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス株、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス株、ストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス株の放線菌またはこれら放線菌由来の酵素をインキュベートすることにより分解することを特徴とする。 In the method of the present invention, polyhydroxyalkanoate and the Streptomyces MG2 strain, Streptomyces thermobulbularis strain, Streptomyces thermoolivius strain, Streptomyces strain using a medium containing inorganic salts. It is characterized by being decomposed by incubating actinomycetes of thermohygroscopic strains, Streptomyces thermocarboxide borane strains, or enzymes derived from these actinomycetes.
上記の菌株は、その培養に好適な基本培地、例えば窒素源を含む無機塩類培地に酵母エキス５０〜５００ppmを添加した培地中で生育培養させた培養液と共に、液状でポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の処理に提供しても良いが、必要に応じて、菌体を定法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の処理に提供しても良い。 The above-mentioned strain is a liquid polyhydroxyalkanoate resin together with a culture medium grown and cultured in a basic medium suitable for the culture, for example, a medium obtained by adding 50 to 500 ppm of yeast extract to an inorganic salt medium containing a nitrogen source. It may be provided for treatment, but if necessary, powder obtained by freeze-drying microbial cells by a conventional method, the powder and various vitamins and minerals, necessary nutrient sources such as yeast extract, casamino acid, peptone, etc. You may provide for the process of polyhydroxyalkanoate type-resin as preparation of solid form, such as a tablet compressed later.
本発明における培養において使用される基本培地は、無機塩類を含み、窒素源として例えば、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等が使用され、その他無機塩としてリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウムおよび硫酸マンガン等の通常利用される培養源が使用される。通常の菌の培地と異なり、少量の酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、マルトエキス等の添加が有効な場合がある。また、粉末状のポリヒドロキシアルカノエートを分散させるために、界面活性剤であるプライサーフ（第一工業製薬）やオクチルグルコシドを使用しても良い。さらに、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解能を有する酵素の生産を誘導するために、ポリヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸塩、および、ヒドロキシ酪酸エステルを培地に添加することが有効である。培地のpHは4.0〜10.0であり、好ましく5.0〜8.0である。また、培養温度は２５〜７０℃であり、好ましくは４０〜５５℃である。 The basic medium used in the culture in the present invention contains inorganic salts, and as a nitrogen source, for example, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, etc. are used, and other inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, sulfuric acid. Commonly used culture sources such as magnesium, sodium chloride, ferrous sulfate, sodium molybdate, sodium tungstate and manganese sulfate are used. Unlike a normal fungal medium, addition of a small amount of yeast extract, casamino acid, peptone, malto extract or the like may be effective. Moreover, in order to disperse | distribute powdery polyhydroxyalkanoate, you may use Prisurf (Daiichi Kogyo Seiyaku) and octyl glucoside which are surfactant. Furthermore, it is effective to add polyhydroxyalkanoate, hydroxybutyric acid, polyhydroxybutyrate, and hydroxybutyric acid ester to the medium in order to induce the production of an enzyme having a resolution of the polyhydroxyalkanoate resin. The pH of the medium is 4.0 to 10.0, preferably 5.0 to 8.0. Moreover, culture | cultivation temperature is 25-70 degreeC, Preferably it is 40-55 degreeC.
ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂を本発明の方法に従ってストレプトマイセス属放線菌のMG2株、ストレプトマイセス・サーモブルガリス株、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス株、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス株、ストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス株が生産する酵素で分解する場合、酵素にｐH調節剤、安定剤、賦形剤、界面活性剤などを適時添加して使用することができる。 According to the method of the present invention, the polyhydroxyalkanoate-based resin MG2 strain of Streptomyces genus Actinomyces, Streptomyces thermobulgaris strain, Streptomyces thermoolivius strain, Streptomyces thermohygroscopicus strain, When degrading with an enzyme produced by a Streptomyces thermocarboxide borane strain, a pH regulator, a stabilizer, an excipient, a surfactant and the like can be added to the enzyme as appropriate.
本発明のポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の生物学的分解方法は、培養槽に先に示した基本培地、処理されるべきポリヒドロキシアルカノエート系樹脂、上記菌株および菌株を配合した粉末、錠剤、または培養液を添加することで行われることが望ましいが、上記菌株を活性汚泥およびコンポストに組み込んでも良い。分解効率からすれば、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂は粉末状に粉砕しておくことが最も好ましいが、フィルム状でも良い。なお、基本培地に対するポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の投入量は、0.01〜10重量％が望ましい。添加する微生物量は極小量であっても構わないが、投入量が処理時間に影響を及ぼさないためにポリヒドロキシアルカノエート系樹脂に対して0.01重量％以上が好ましい。 The biodegradation method of the polyhydroxyalkanoate resin of the present invention comprises the basic medium shown in the culture tank, the polyhydroxyalkanoate resin to be treated, the above-mentioned strain and the powder, tablet containing the strain, or Although it is desirable to be carried out by adding a culture solution, the above strain may be incorporated into activated sludge and compost. From the viewpoint of decomposition efficiency, the polyhydroxyalkanoate resin is most preferably pulverized into a powder form, but may be in a film form. The input amount of the polyhydroxyalkanoate resin to the basic medium is preferably 0.01 to 10% by weight. The amount of microorganisms to be added may be minimal, but is preferably 0.01% by weight or more with respect to the polyhydroxyalkanoate resin so that the input amount does not affect the treatment time.
分解に要する時間はポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の組成、形状及び量、使用した微生物の種類やその酵素及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化し、一概に特定できるものではないが、かかる条件下に数分から数週間、数ヶ月間維持することにより、ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解が達成される。 The time required for degradation varies depending on the composition, shape and amount of the polyhydroxyalkanoate resin, the type of microorganism used, its relative amount to the enzyme and resin, and other various culture conditions. Although not maintained under such conditions for several minutes to weeks or months, the degradation of the polyhydroxyalkanoate resin is achieved.
以下に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be further described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）新規ストレプトマイセス属放線菌の取得
寒天培地（表２の組成の培地に寒天を添加）にポリヒドロキシ酪酸（数平均分子量Mn：2.1×10５、三菱ガス化学株式会社製「ビオグリーン」）を１％分散させたシャーレを使用し、つくば市内の土を接種、50℃で培養し、クリアーゾーンを形成した菌の中から取得した。(Example 1) Acquisition of novel Streptomyces actinomycetes Agar medium (added agar to medium having composition shown in Table 2) and polyhydroxybutyric acid (number average molecular weight Mn: 2.1 × 10 5 , “Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.” Using a petri dish containing 1% biogreen "), the soil in Tsukuba city was inoculated, cultured at 50 ° C, and obtained from bacteria that formed a clear zone.
得られた新規ストレプトマイセス属放線菌の生物学的な特徴を表１に示す。
得られた菌株から常法により16S-rRNAを得、その配列を特定した。配列を配列番号１に示す。 16S-rRNA was obtained from the obtained strain by a conventional method, and its sequence was specified. The sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
この配列を種々の従来公知の菌と比較した結果、この菌はStreptomyces thermocarboxydovorans及びStreptomyces thermodiastaticusとそれぞれ97.0％及び96.5％の配列同一性を有しており、従来知られていない新規放線菌であることが明らかとなった。本発明者等はこの新規放線菌をMG2株と命名した。 As a result of comparing this sequence with various conventionally known bacteria, this bacterium has 97.0% and 96.5% sequence identity with Streptomyces thermocarboxydovorans and Streptomyces thermodiastaticus, respectively, and is a novel actinomycetes that has not been known so far. Became clear. The present inventors named this novel actinomycetes strain MG2.
（実施例２）ポリヒドロキシ酪酸樹脂粉末の分解活性
実施例１で得られたMG2株によるPHB粉末の分解を検討した。(Example 2) Decomposition activity of polyhydroxybutyric acid resin powder Decomposition of PHB powder by the MG2 strain obtained in Example 1 was examined.
下記表２の組成の基本培地100ml及び200mgのPHB粉末（数平均分子量Mn：2.1×10５、三菱ガス化学株式会社製「ビオグリーン」、250μmのワイヤースクリーンを通過した均一な粒子径のもの）を入れた500mlのエルレンマイヤーフラスコにMG2株の培養液５mlを入れ、ロータリーシェーカー（180rpm）中で５０℃でインキュベートした。
12時間ごとに培地をクロロホルムで抽出して未分解のポリマーを回収し、ロータリーエバポレーターで乾燥させた。一方、細胞も回収し、遠心分離し、乾燥させた後、水溶性の有機炭素（TOC）をTOC-5000分析装置（島津製作所）で測定すると共に、スルホネートポリスチレンゲルカラムによるHPLCで、４ｍＭ過塩素酸を移動相（0.6ml/分）として４０℃で分解産物を分析した。同時に、Enzymatic Bioanalysis kit（Boehringer Mannheim/R-Biopharm）を用いてD-3ヒドロキシ酪酸を検出した。 Every 12 hours, the medium was extracted with chloroform to recover the undegraded polymer and dried on a rotary evaporator. On the other hand, after collecting cells, centrifuging and drying, water-soluble organic carbon (TOC) was measured with a TOC-5000 analyzer (Shimadzu Corporation), and 4 mM perchlorine was measured by HPLC using a sulfonate polystyrene gel column. The degradation products were analyzed at 40 ° C. using acid as the mobile phase (0.6 ml / min). At the same time, D-3 hydroxybutyric acid was detected using an Enzymatic Bioanalysis kit (Boehringer Mannheim / R-Biopharm).
その結果、24時間のインキュベーションで、PHB粉末の５０％の分解が認められ、それと共に水溶性全有機炭素（TOC）が細胞中に蓄積した（図１）。培養液中には、D-3ヒドロキシ酪酸、アジピン酸及びコハク酸の蓄積が検出された。PHB粉末は３日間のインキュベーションで完全に分解された。 As a result, 50% degradation of the PHB powder was observed after 24 hours of incubation, and water-soluble total organic carbon (TOC) was accumulated in the cells (FIG. 1). Accumulation of D-3 hydroxybutyric acid, adipic acid and succinic acid was detected in the culture solution. The PHB powder was completely degraded after 3 days of incubation.
（実施例３）ポリヒドロキシ酪酸フィルムの分解
実施例１で得られたMG2株によるPHBフィルム（三菱ガス化学株式会社製「ビオグリーン」を用いてキャストフィルムを作製）の分解を、走査型電子顕微鏡（JEOL model JSM-T220、15kV）で検討した。(Example 3) Decomposition of polyhydroxybutyric acid film The decomposition of the PHB film (produced by “Biogreen” manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) by the MG2 strain obtained in Example 1 was performed using a scanning electron microscope. (JEOL model JSM-T220, 15 kV).
実施例２と同様の条件下でインキュベーションを行ったところ、フィルム上に付着した細胞の作用により、フィルム上に半球形の穴が形成され、６日間のインキュベーションによってフィルムは完全に分解された。 When incubation was performed under the same conditions as in Example 2, hemispherical holes were formed on the film by the action of cells attached on the film, and the film was completely degraded by 6 days of incubation.
（実施例４）種々のストレプトマイセス属放線菌における分解活性
寒天培地にポリヒドロキシ酪酸（数平均分子量Mn：2.1×10５）を分散させたシャーレを使用し、種々のストレプトマイシン属放線菌の菌株を接種、50℃で培養した。クリアーゾーンの形成度合いは＋＋＋（１−２日間で形成）、＋＋（５−７日間で形成）、＋（８−１４日間で形成）、−（形成なし）で示した。
表３の結果から明らかなように、実施例１で得られたMG2株、ストレプトマイセス・サーモブルガリス、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス、及びストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランスではっきりとしたクリアーゾーンが形成し、ポリヒドロキシ酪酸分解活性を有することが確認された。 As is apparent from the results in Table 3, the MG2 strain, Streptomyces thermobulgaris, Streptomyces thermoolivius, Streptomyces thermohygroscopicus, and Streptomyces sp. Obtained in Example 1 were obtained. It was confirmed that a clear zone was formed by thermocarboxide borane and had polyhydroxybutyric acid decomposing activity.
（実施例５）種々のストレプトマイセス属放線菌における分解活性
表４の組成の培地（pH7.0）100mlに対し、180ミクロン以下に粉末加工したポリヒドロキシ酪酸（数平均分子量Mn：2.1×10５）を炭素源として200mg添加したものを用意し、表５に示す各菌株を接種、50℃で４日間、180rpm回転型振とう機で培養した。(Example 5) Degradation activity in various Streptomyces actinomycetes Polyhydroxybutyric acid (number average molecular weight Mn: 2.1 × 10 6) powder-processed to 180 μm or less with respect to 100 ml of medium (pH 7.0) having the composition shown in Table 4 5 ) with 200 mg added as a carbon source was prepared. Each strain shown in Table 5 was inoculated and cultured at 50 ° C. for 4 days on a 180 rpm rotary shaker.
添加した粉末加工ポリヒドロキシ酪酸の分解に伴い、水溶性全有機炭素(TOC、ppm)を算出した。その結果は表５に示したように、本発明に係る分解能を有する菌を添加したものでは、全有機炭素が１６〜９３７ppm生成した。
以上のことから、放線菌ストレプトマイセス属のMG2株、ストレプトマイセス・サーモブルガリス株、ストレプトマイセス・サーモオリバシウス株、ストレプトマイセス・サーモハイグロスコピクス株、ストレプトマイセス・サーモカーボキシドボランス株は高分子のポリヒドロキシ酪酸を分解できることが確認された。 Based on the above, the MG2 strain of the genus Streptomyces, Streptomyces thermobulbularis, Streptomyces thermoolivius strain, Streptomyces thermohygroscopic strain, Streptomyces thermocarboxy It was confirmed that the Dovolance strain can degrade high molecular weight polyhydroxybutyric acid.
（実施例６）酵素活性のｐＨ安定性
実施例１で得たMG2株を用い、ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性のｐＨ安定性を検討した。(Example 6) pH stability of enzyme activity Using the MG2 strain obtained in Example 1, the pH stability of polyhydroxyalkanoate degrading enzyme activity was examined.
100mgのPHB粉末を含む表４の組成の培地100mlにMG2株を入れ、５０℃で４８時間振とう培養し、ろ過後、ろ液を0.01Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ 7.0）に対して透析した。透析された酵素液１mlに種々のｐＨの緩衝液（ｐＨ 3.0、3.5、4.0及び5.0のクエン酸緩衝液及びｐＨ 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5及び8.0のリン酸緩衝液、それぞれ0.1Ｍ、3.9ml）を添加し、５℃で２４時間インキュベーションした後、PHB 10mg及び0.5％(w/v)オクチルグルコピラノシドを含有する緩衝液中で５０℃で１６時間反応させ、培地中の水溶性全有機炭素量及びDL-ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩を実施例２と同様にして測定した。DL-ヒドロキシ酪酸ナトリウム塩の検出の結果を図２に示す。 The MG2 strain was placed in 100 ml of the medium having the composition shown in Table 4 containing 100 mg of PHB powder, and cultured with shaking at 50 ° C. for 48 hours. After filtration, the filtrate was dialyzed against 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0). . To 1 ml of the dialyzed enzyme solution, various pH buffers (pH 3.0, 3.5, 4.0 and 5.0 citrate buffers and pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 and 8.0 phosphate buffers, 0.1M, 3.9 ml) and incubation at 5 ° C. for 24 hours, followed by reaction in a buffer containing 10 mg of PHB and 0.5% (w / v) octylglucopyranoside at 50 ° C. for 16 hours. Carbon amount and DL-hydroxybutyric acid sodium salt were measured in the same manner as in Example 2. The results of detection of DL-hydroxybutyric acid sodium salt are shown in FIG.
図２の結果から、本発明の酵素は、ｐＨ４〜１０の範囲で安定であり、特にｐＨ５〜８の範囲で高い活性を維持し得ることが確認された。
From the result of FIG. 2, it was confirmed that the enzyme of the present invention is stable in the range of
（実施例７）酵素活性の温度安定性
MG2株のポリヒドロキシアルカノエート分解酵素活性の温度安定性を検討した。(Example 7) Temperature stability of enzyme activity
The temperature stability of polyhydroxyalkanoate degrading enzyme activity of MG2 strain was investigated.
菌株を４８時間培養した後、培地５mlをとり、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃または９０℃で６０分間、振とうしながらインキュベートした後、５０℃で４時間インキュベートして培地中の水溶性全有機炭素量を測定した。反応混合液の組成は、PHB粉末10mg、0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）、0.5％(w/v)オクチルグルコピラノシド0.1ml、及び菌体をポアサイズ0.2μｍのミリポアフィルターでろ過した培地１mlである。結果を図３に示す。 After culturing the strain for 48 hours, 5 ml of the medium is taken and incubated at 50 ° C., 60 ° C., 70 ° C., 80 ° C. or 90 ° C. for 60 minutes with shaking, and then incubated at 50 ° C. for 4 hours. The amount of water-soluble total organic carbon was measured. The composition of the reaction mixture was 10 mg of PHB powder, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 0.1 ml of 0.5% (w / v) octylglucopyranoside, and 1 ml of medium obtained by filtering the cells with a Millipore filter having a pore size of 0.2 μm. It is. The results are shown in FIG.
この結果から、本発明の酵素は、６０℃までの範囲で安定であることが確認された。 From this result, it was confirmed that the enzyme of the present invention is stable up to 60 ° C.
（実施例８）基質による分解活性の誘導
種々の反応基質の存在下で、酵素活性の誘導が見られるか否かを検討した。(Example 8) Induction of degradation activity by substrate It was examined whether or not induction of enzyme activity was observed in the presence of various reaction substrates.
表６及び７に示す種々の基質の存在下で、水溶性全有機炭素（TOC）の生成及びヒドロキシ酪酸の生成を検出した。反応混合液の組成は実施例６と同じとし、５０℃で１６時間反応させた。その結果、表に示すように、ポリヒドロキシアルカノエート、ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸塩、及び／またはヒドロキシ酪酸エステルの存在下で、可溶性TOC量及びヒドロキシ酪酸量の有意な増加が検出された。
（参考例１）
実施例１で得られたMG2株を用い、種々のポリマーに対する分解活性の有無を実施例４と同様にして検討した。(Reference Example 1)
Using the MG2 strain obtained in Example 1, the presence or absence of degradation activity for various polymers was examined in the same manner as in Example 4.
ポリマー粉末として、ポリ（エチレンスクシネート）（PES、数平均分子量5.92×１０４、日本触媒社製）、ポリ（エステルカーボネート）（PEC、カーボネート含量１８モル％、数平均分子量2.4×１０５、三菱ガス化学株式会社製）、ポリカプロラクトン（PCL、商品名Tone P-767、数平均分子量6.73×１０４、ユニオンカーバイド社製）、ポリ（ブチレンスクシネート）（PBS、商品名Bionolle 1020、数平均分子量4.8×１０４、昭和ハイポリマー社製）、ポリ（L-ラクチド）（PLA、商品名Lacty 1012、数平均分子量1.88×１０５、島津製作所製）を用い、各ポリマーを含有する寒天培地上においてMG2株を５０℃で培養した。結果を表８に示す。
表８の結果から明らかなように、MG2株との接触によって、ポリヒドロキシ酪酸樹脂だけでなく、ポリエチレンスクシネート及びポリエステルカーボネートも分解され、また弱い活性ではあるが、ポリカプロラクトン及びポリブチレンスクシネートも分解されることが見出された。この傾向は、MG2株の培養液を用い、水溶性分解産物の蓄積を測定した場合も同様であった。 As is apparent from the results in Table 8, not only polyhydroxybutyric acid resin but also polyethylene succinate and polyester carbonate are decomposed by contact with MG2 strain, and polycaprolactone and polybutylene succinic acid are weakly active. Nates were also found to be degraded. This tendency was the same when the accumulation of water-soluble degradation products was measured using a culture solution of MG2 strain.
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。 All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
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