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JP4646315B2 - 前立腺癌においてアップレギュレートされた内因性レトロウイルス - Google Patents

前立腺癌においてアップレギュレートされた内因性レトロウイルス Download PDF

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Description

本願は、以下の利益を主張する:国際特許出願PCT/US01/47824(2002年6月13日にWO02/46477として英語で公開された)(2001年12月7日出願);米国特許出願10/016,604(2001年12月7日出願);米国仮特許出願60/340,064(2001年12月7日出願);および米国仮特許出願60/388,046(2002年6月12日出願)。
本明細書中で言及される全ての刊行物および特許出願は、各個々の文書が参考として援用されることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、本明細書中に参考として援用される。
(技術分野)
本発明は、癌、特に前立腺癌の診断に関する。特に、本発明は、腫瘍、特に前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示す、第22染色体上に位置するヒト内因性レトロウイルス(HERV)に関する。
(背景技術)
前立腺癌は、米国の男性における最も一般的な型の癌である。良性前立腺過形成(BPH)は、良性の前立腺細胞の異常な増殖であり、ここで、前立腺は増殖して、尿道および膀胱に圧力をかけ、尿の正常な流れをブロックする。米国における60〜70歳の男性の半分以上、および70〜90歳の90%ほどが、BPHの徴候を有する。BPHは、ほとんど生命を脅かさないが、徴候を軽減するために処置を必要とする。
前立腺において始まる癌は、原発性前立腺癌(または前立腺の癌)と呼ばれる。前立腺癌は、前立腺に留まり得るか、または、近くのリンパ節に伝播し得、そしてまた、骨、膀胱、直腸および他の器官に伝播し得る。前立腺癌は、最近では、血中の前立腺特異的抗原(PSA)および前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)のレベルを測定することにより診断される。血中のPSAレベルは、前立腺癌、BPHまたは前立腺における感染を有する男性において上昇し得る。PAPレベルは、特に、癌が前立腺を越えて伝播した場合、多くの前立腺癌患者において正常値を越えて上昇する。しかし、前立腺癌は、これらの試験単独を使用しては診断し得ない。なぜならば、上昇したPSAまたはPAPレベルはまた、他の非癌性の問題を示し得るからである。
前立腺の状態が良性であるかまたは悪性であるかを決定するのを助力するために、さらなる試験(例えば、経直腸超音波診断、静脈内腎盂X線像および膀胱鏡検査)が通常実施される。これらの試験の結果が、癌が存在し得ることを示唆する場合、この患者は、唯一の確実な診断方法である生検を受けなければならない。従って、複数の回の厄介な試験手順を受ける必要なく、前立腺癌の早期の検出および診断のための、簡単かつ直接的な試験を提供することが望ましい。前立腺癌の予防および/または処置のための組成物および方法を提供することがまた、所望されそして必要である。
参考文献1および2は、HERV−KファミリーのHML−2サブグループのヒト内因性レトロウイルス(HERV)が、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされた発現を示すことを開示する。この所見は、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療に有用であるとして開示される。特に、正常組織に対して高レベルのHML−2発現産物が、サンプルを採取した患者が癌を有することを示すと言われる。
前立腺癌の診断、予防および処置に使用され得る、さらなる、そして改善された材料および方法を提供することが本発明の目的である。
(発明の開示)
第22染色体の20.428メガベース(22q11.2)に位置するHERV−Kファミリーの特定のメンバーが、前立腺腫瘍において優先的かつ有意にアップレギュレートされることが見出されている。この内因性レトロウイルス(本明細書中で「PCAV」と名付けられる)は、他のHERV−Kファミリーメンバーにおいては見出されないいくつかの特徴を有し、これらの特徴は、前立腺癌のスクリーニング、診断および治療(例えば、アジュバント治療)に利用され得る。
本発明は、癌、特に前立腺癌を診断するための方法を提供し、この方法は、第22染色体の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの発現産物の存在または不在を、患者サンプル中で検出する工程を包含する。正常組織に対してより高いレベルの発現産物は、サンプルを採取した患者が、癌を有することを示す。
検出される発現産物は、好ましくは、mRNA転写物であるが、あるいは、このような転写物から翻訳されたポリペプチドであり得る。これらの発現産物は、直接的または間接的に検出され得る。直接的な試験は、患者サンプル中のPCAV RNAまたはポリペプチドを検出するアッセイを使用する。間接的な試験は、PCAVからインビボで直接的に発現されない生体分子を検出するアッセイ(例えば、PCAV mRNAから逆転写されたcDNAを検出するアッセイ、またはPCAVポリペプチドに対する応答において上昇した抗体を検出するアッセイ)を使用する。
(A.ヒト第22染色体内因性レトロウイルス)
公開されたヒトゲノム配列の中の多くの領域が、内因性レトロウイルスと注釈され、配列が決定される前でさえ、ヒトゲノムは、複数のHERVを含むことが知られていた。多くのHERVの1つは、第22染色体の20.428メガベースに位置するHERV−Kであり、本明細書中で「PCAV」と称される。このHERVの発現は、癌組織においてアップレギュレートされることが見出されている。さらに、PCAVは、他のHERVには見出されない5つの特異的な特徴を有する。これらの5つの特徴は、PCAV mRNA転写物で顕著であり、そして、スクリーニング、診断および治療に利用され得る:(1)ゲノム内に他のHERVから区別する特異的なヌクレオチド配列を有するが、この配列は、他のHERVと有意な同一性を共有する;(2)タンデムな5’LTRを有する;(3)フラグメント化された3’LTRを有する;(4)env遺伝子がalu挿入により中断される;および(5)gagが独特の挿入を含む。
(A.1−ヌクレオチド配列)
PCAVは、HERV−KサブファミリーHML2.0のメンバーである。ヒトゲノム一倍体(ハプロイド)あたり、大まかに、30〜50コピーのHML2.0ウイルスが存在する。HML2ウイルスは、ヒトの祖先において少なくとも2倍挿入されていたようである:3000万年前、類人猿系統(ヒトを含む)が猿から枝分かれする前;および2000万年前、枝分かれ後。3000万年挿入由来のウイルスは、時々「旧型」ウイルスと称され、そして、2000万年挿入由来のウイルスは「新型」ウイルスと称される{3}。旧型および新型ウイルスタンパク質は、アミノ酸配列レベルで非常に高く関連するが、いくつかの識別エピトープが存在する。DNA配列の同一性は、ゲノムのある領域で高いが、他の領域(特にLTR)において、保存は、約70%のみである。旧型および新型LTR間の違いの大半は、転写開始の近くにクラスター形成され、ここで、旧型ウイルスは、新型ウイルスと比較して1つまたは2つの挿入を有する。旧型および新型LTRは、系統学分析において2つの別々の群としてクラスター形成する(図1)。相対的遺伝的年齢にと調和して、旧型ウイルスはまた、新型ウイルスよりも多い中断および欠失を含む。
PCAVは、新型および旧型ウイルスの間の再配列から生じたようにみえる。このウイルスの5’領域(図2)は、新型ウイルス由来の162bpが後続する新型LTRから開始する。新型ウイルスの残りは、失われているように見え、552bpの非ウイルス配列がこの162bpの後に続き、次いで、ほとんど完全な旧型ウイルスが続く。旧型ウイルスの3’LTR(図3)は、フラグメント化され、そして、MER11a挿入を含む。
配列番号1は、PCAVの12366bp配列であり、入手可能なヒト第22染色体配列に基づき{4}、最初の5’LTRの開始部から、そのフラグメント化された3’LTRの最後までである。これは、二本鎖ゲノムDNAのセンス鎖である。配列番号10は、配列番号1のヌクレオチド559(転写開始部位の可能性がある)からポリアデニル化部位まで(配列番号1のヌクレオチド11735まで)のPCAVの11101bp配列であるが、より下流の転写開始部位(例えば、ヌクレオチド635±5)がより好ましい。
PCAVの特異的な配列は、mRNAレベルおよびアミノ酸レベルの両方で顕著であり、そして、ゲノム内で他のHERVからPCAVを区別するのに使用され得る。
(A.2−タンデム5’LTR)
HERV−Kの5’LTRの下流(gagオープンリーディングフレームの始点の前)に、保存されたスプライスドナー部位(5’SS)が存在する。このスプライスドナーは、envオープンリーディングフレームの始点のスプライスアクセプター部位(3’SS)に結合し得る(図4)。
HERV−Kゲノムはまた、LTRの3’末端の近くに2つのスプライスアクセプター配列を含むが、これらは普通に使用されない。なぜならば、これらは、上流にウイルススプライスドナーパートナーを有さないからである。しかし、PCAVは、5’末端に2つのLTRを有する:第1のLTRは、新型HERV−K由来であり、第2のLTRは旧型HERV−K由来である。従って、旧型LTRの通常使用されないスプライスアクセプターは、新型LTRのスプライスドナーと協調し得(図2)、そして、これらのスプライスドナー/アクセプター対から生じる転写物は、PCAVに特異的である。
第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位を使用して形成される転写物は、以下:(i)第1の5’LTRの転写開始部位から転写され、第1の5’LTRの下流に近接するスプライスドナー部位まで続く配列を含み、この配列は、(ii)第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位の1つから転写される配列を含み、(i)は(ii)に結合される。このような転写物の検出は、PCAVが転写されていることを示す。
配列番号1において:第1の5’LTRの転写開始部位は、他のウイルスとの相同性によるとヌクレオチド559であるが、経験的にはさらに下流(例えば、約635±2)であるように見える;第1の5’LTRの下流の保存されたスプライスドナー部位は、ヌクレオチド1076〜1081である;第2の5’LTRの3’末端の近くの2つのスプライスアクセプター部位は、ヌクレオチド2593〜2611および2680〜2699である。配列番号2は、予測される転写開始部位とスプライスドナー部位との間の配列である。配列番号3は、第1のスプライスアクセプター部位に後続する最初の10ヌクレオチドである。配列番号4は、第2のスプライスアクセプター部位に後続する最初の10ヌクレオチドである。配列番号5は、配列番号3と融合した配列番号2である。配列番号6は、配列番号4と融合した配列番号2である。
(A.3−フラグメント化した3’LTR)
PCAVの3’LTRは、フラグメント化されており、これとしては、MER11a反復エレメントの挿入が挙げられる(図3)。PCAV mRNAは、ウイルスLTR内のシグナルを使用するよりはむしろ、MER11a挿入内のポリアデニル化シグナルを使用して終止する。MER11a配列が後続する3’HERV−K LTRの部分コピーで終止する転写物は、PCAVに特異的である。
PCAV由来の転写物の3’末端は、部分LTRおよび部分MER11aのコピーを含む(図3)。このような転写物の検出は、PCAVが転写されていることを示す。
配列番号1において:3’LTRは、ヌクレオチド10520から開始して、ヌクレオチド10838まで続き、ここで、3’LTRは、MER11a挿入により中断される;MER11a挿入は、ヌクレオチド10839から開始して、ヌクレオチド11834まで続く;ヌクレオチド11835〜11928の後、3’LTRは、ヌクレオチド11929〜12366まで続く。MER11a挿入内に、そのポリアデニル化シグナルが存在する(ヌクレオチド11654〜11659の間に位置する)。配列番号7は、3’LTRの最初の319ntフラグメントの配列である。配列番号8は、ポリA部位までのMER11a挿入の配列である。配列番号9は、配列番号8に融合した配列番号7である。
(A.4−env内のalu)
遺伝年代に起因する変異により破壊されるのみならず、PCAVのenv遺伝子は、alu配列により中断される。envおよびaluの両方を含む転写物の検出は、PCAVが転写されていることを示す。
配列番号1において、aluは、ヌクレオチド9938〜10244である(配列番号32)。alu配列(9838〜9937)の直前の100ヌクレオチドは、配列番号37であり、その最後の10マー(9928〜9937)は、配列番号33である。alu配列の直後の100ヌクレオチドは、配列番号40であり、その最初の10マー(10244〜10253)は、配列番号34である。alu配列の最初の10ヌクレオチドは、配列番号35であり、最後の10ヌクレオチドは、配列番号41である。配列番号36は、alu/env境界に架橋する20マーであり、配列番号45は、alu配列の末端に架橋する20マーである。配列番号39は、alu/env境界に架橋する8マーであり、配列番号44は、alu配列の末端に架橋する8マーである。配列番号38は、配列番号37+配列番号32であり、配列番号42は配列番号41+配列番号40であり、そして、配列番号43は配列番号32+配列番号40である。
(A.5−独特のgag配列)
PCAV gag遺伝子は、48ヌクレオチド配列(配列番号53)を含み、これは、他のHERV−Kにおいて見出されない。この48マーは、16マーの配列番号110をコードし、これは、新型由来のgagタンパク質または他の旧型HERV−Kにおいて見出されない。配列番号53を含む転写物、または配列番号110を含むポリペプチドまたは配列番号110の内部かもしくは配列番号110を含むエピトープを認識する抗体の検出は、従って、PCAVが転写されていることを示す。
PCAV gag遺伝子はまた、69ヌクレオチド配列(配列番号111)を含み、これは、新型HERV−Kにおいて見出されない。この69マーは、23マーの配列番号55をコードする。配列番号111を含む転写物、または配列番号55を含むポリペプチド、または配列番号55の内部かもしくは配列番号55を含むエピトープを認識する抗体の検出は、従って、旧型HERV−K(代表的には、PCAV)が転写されていることを示す。
(B−mRNA発現産物の検出)
本発明の診断方法は、mRNA検出に基づき得る。PCAV mRNAは、直接的または間接的に検出され得る。mRNAを直接検出することが好ましく、それによってmRNAから誘導された物質(例えば、cDNA)を別に調製する必要性を省く。
(B.1−本発明のPCAV mRNA転写物)
本発明に従って使用するためのmRNA転写物は、PCAVから転写される。転写物の3つの好ましい型は以下の通りである:(1)第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位を使用してスプライシングされる転写物;(2)3’LTRとMER11a配列との両方を含む転写物;(3)aluで中断されたenv遺伝子を含む転写物;および(4)PCAV特異的なgag配列を含む転写物。
本発明は、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されたmRNA転写物を提供する。
本発明はまた、配列番号23、または配列番号23の5’末端から100まで(例えば、10、20、30、40、50、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90または100))のヌクレオチドを欠失するヌクレオチド配列に対してn%以上の同一性(例えば、配列番号1197または配列番号1198に対してn%以上の配列同一性)を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。このヌクレオチド配列は、好ましくは、そのRNAの5’末端であるが、上流配列が存在し得る。このヌクレオチド配列は、そのRNAの3’末端に存在し得るが、ポリAテイルのようなさらなる下流のエレメントが存在し得る。これらのmRNA転写物としては、配列番号23、配列番号1197および配列番号1197の対立遺伝子改変体、SNP改変体、ホモログ、オーソログ、パラログ、変異体などが挙げられる。
本発明は、第5’LTRの3’末端の近位のスプライスアクセプター部位を含むスプライシングによって形成されるmRNA転写物を提供する。したがって、本発明は、配列−N−N−を含むmRNA転写物(例えば、配列番号24、配列番号25、配列番号1199または配列番号1200)を提供し、ここで、Nは、(i)第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの第1の5’LTRから転写された5’末端のmRNAから、(ii)その第1の5’LTRから転写されたmRNAのU5領域の下流の第1のスプライスドナー部位までのヌクレオチド配列(例えば、配列番号26、配列番号1201)であり;そして、Nは、(i)第1のスプライスドナー部位の下流および(ii)第2のスプライスドナー部位の上流に位置するスプライスアクセプター部位のすぐ下流のヌクレオチド配列(例えば、配列番号27または配列番号28)であり、その第2のスプライスドナー部位は、上記の内因性レトロウイルスの第2の5’LTRの下流に存在する。第1のスプラスドナー部位は、好ましくは、(配列番号1におけるヌクレオチド1075の後の)第1の5’LTRの下流の約100ヌクレオチドに位置するHML2サブファミリーにおいて保存される部位である。第2のスプラスドナー部位は、好ましくは、HML2サブファミリーにおいて保存される部位であり、これは、(配列番号1のヌクレオチド2778の後の)の第2の5’LTRの下流のほぼ100ヌクレオチドに位置する。上記のスプライスアクセプターは、好ましくは、第2の5’LTRの下流である。
本発明はまた、配列−N−N−を含むmRNA転写物を提供し、ここで:Nは、配列番号26および/または配列番号1201に対してa%以上の配列同一性を有するヌクレオチドであり、そして、Nは、配列番号27または配列番号28に対してb%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。本発明のmRNA転写物は、図5に例示されている。第2スプライス部位を使用する転写物(すなわち、Nは配列番号28である)が、好ましい。
両方の場合において、Nは、好ましくは、そのRNAの5’末端に位置するが、上流の配列が存在し得る。Nは、そのRNAの3’末端に位置し得るが、通常は、下流配列が存在する。
本発明はまた、配列番号24、配列番号25、配列番号1199または配列番号1200に対するc%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明は、配列−N−N−を含むmRNA転写物(例えば、配列番号29)を提供し、ここで:Nは、第22染色体の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの3’LTRの5’フラグメントの3’末端に由来するヌクレオチド配列(例えば、配列番号30)であり、そしてNは、第22染色体の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス内のMER11a挿入の5’末端からのヌクレオチド配列(例えば、配列番号31)である。
本発明はまた、配列−N−N−を含むmRNA転写物を提供し、ここで:Nは、配列番号30に対してd%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして、Nは、配列番号31に対してe%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。そのRNAは、配列N−N−N−N−を含み、ここで:Nは、MER11a配列のポリAシグナルとポリA部位との間のヌクレオチド配列であり;そして、NはポリAテイルである。
両方の場合において、この転写物は、一般的に、Nの上流の配列を含む。この転写物は、一般的に、ポリAテイルのようなNの下流の配列を含む。
本発明はまた、配列番号29に対してf%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明は、配列−N−N−を含むmRNA転写物(例えば、配列番号38)を提供し、ここで:Nは、第22染色体の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのenv遺伝子におけるalu挿入部分に先立つヌクレオチド配列(例えば、配列番号37)であり、そして、Nは、そのalu挿入部の5’末端で始まるヌクレオチド配列(例えば、配列番号32)である。
本発明はまた、配列−N−N−を含むmRNA転写物を提供し、ここで:Nは、配列番号37に対してmm%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして、Nは、配列番号32に対してnn%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である。
その転写物は、一般的に、Nの上流であってかつNの下流の配列を含む。
本発明はまた、配列番号38に対してpp%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明は、配列−N−N10−を含むmRNA転写物(例えば、配列番号43)を提供し、ここで:Nは、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのenv遺伝子中のalu挿入物の末端のヌクレオチド配列(例えば、配列番号32)であり、そして、N10は、上記のalu挿入物のすぐ下流のヌクレオチド配列(配列番号40)である。
本発明はまた、配列−N−N10−を含むmRNA転写物を提供し、ここで:Nは配列番号41とuu%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列であり、そしてN10は、配列番号40とvv%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列である。
この転写物は、一般にNの上流かつN10の下流の配列を含む。
本発明はまた、配列番号42とww%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明は、配列番号41とuu%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
この転写物は、一般にNの上流かつN10の下流の配列を含む。
本発明はまた、配列番号53とii%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明はまた、配列番号111とii%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物を提供する。
本発明はまた、配列番号1191とii%以上の配列相同性を有するヌクレオチドを含むmRNA転写物を提供する。本発明はまた、配列番号98と少なくともii%の配列相同性を有するポリペプチドをコードするmRNA転写物を提供する。
(B.2−mRNAの直接的検出および間接的検出)
本発明のPCAV mRNA転写物は、例えば、mRNAの配列決定によってか、またはmRNA転写物へのハイブリダイゼーション(例えば、ノーザンブロットによって)によって直接的に検出され得る。サンプル中の特定のRNA配列の存在または不在を検出するための種々の技術が利用可能である{例えば、参考文献20および21}。
mRNA転写物の間接的な検出がまた可能であり、そして、PCAV mRNA転写物由来の核酸について実施される(例えば、PCAV mRNAのcDNAコピーの検出、PCAV mRNAテンプレートから増幅された核酸の検出など)。
RNAを検出するための好ましい方法は、RT−PCR(逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応)である{例えば、参考文献5および13}。前立腺細胞由来のmRNAのRT−PCRは、例えば、参照番号14〜19に報告される。RT−PCRにおいてPCAV特異的なプローブを使用することが好ましい。
直接的または間接的な検出のどちらが使用されても、本発明の方法は、(a)PCAV mRNAの形態でかまたは(b)PCAV mRNAの少なくとも一部および/もしくはPCAV mRNAの少なくとも一部に相補的な配列のコピーを含む核酸の形態でのいずれかの、一本鎖PCAV核酸標的または二本鎖PCAV核酸標的の検出に関する。
本発明の方法は、PCAVゲノムDNAの検出に関しない。なぜならば、これは全てのヒト細胞に存在し、従って、その存在は腫瘍の特徴ではないからである。サンプルがPCAV DNAを含む場合、RNA特異的な検出技術を使用するか、またはPCAV mRNA転写物には存在するが、PCAVゲノムDNAには存在しない配列(例えば、スプライスジャンクション、ポリAテイルなど)に照準を絞ることが好ましい。従って、本発明の方法は、以下の最初の工程を包含し得る:(a)患者サンプル由来のmRNAを抽出する工程;(b)患者サンプルから、mRNAを除去することなくDNAを除去する工程;および/または(c)患者サンプルにおいて、PCAV mRNAは除去も破壊もせず、PCAV DNAを除去するかまたは破壊する工程。代替法として、相同的なDNAの存在により影響されないRNA特異的なアッセイが使用され得る。RT−PCRのために、ゲノムDNAが除去されるべきである。
生物学的サンプルからRNAを選択的に抽出する方法は、周知であり{例えば、参考文献20および21}、これらの方法としては、グアニジウム緩衝液、塩化リチウム、酸フェノール:クロロホルム抽出、SDS/酢酸カリウムなどに基づく方法が挙げられる。全ての細胞RNAが抽出された後、例えば、オリゴ−dT技術を用いて、mRNAが富化され得る。
生物学的サンプルから、mRNAを除去することなくDNAを除去するための方法は、周知であり{例えば、参考文献20の付録C}、これらとしては、DNase消化が挙げられる。DNaseが使用される場合、新たに合成したDNAの消化を妨げるために、DNaseは、続くDNA合成またはDNA増幅の前に、(例えば、EDTAでのキレート化によって、加熱によってかまたはプロテイナーゼK処理とそれに続くフェノール/クロロホルム抽出、およびNHOAc/EtOH沈殿によって)除去されるかまたは不活性化されなければならない。
PCAV RNAを除去せずPCAV DNAを除去するための方法は、PCAV DNA内の配列に特異的である試薬(例えば、PCAVゲノム内のDNA配列を認識するが、対応するRNA配列は切断しない制限酵素)を使用する。
サンプルからPCAV mRNAを特異的に精製するための方法がまた使用され得る。このような方法の1つは、PCAV mRNAに結合する親和性支持体を使用する。この親和性支持体は、PCAV mRNAに結合するポリペプチド配列(例えば、配列特異的な様式でHERV−K mRNAのLTRに結合するcORFポリペプチド、またはRNA転写物中のHERV−K LTRを認識することが示されているHIV Revタンパク質{22})を含み得る。
PCAV mRNAは、検出のためには、野生型の形態を維持する必要はない。PCAV mRNAは、例えば、フラグメント化され得るが、但し、フラグメント化は、mRNA内のPCAV特異的な配列を維持する。
(B.3−検出のためのPCAV核酸標的)
本発明は、(a)第22染色体の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されたmRNA転写物のヌクレオチド配列、および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号10、配列番号1197および/または配列番号1198とqq%以上の配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。PCAVは、第6染色体の47.1メガベースに見られるHERV−Kと約87.5%同一であり、そして、第3染色体の103.75メガベースで見られるHERV−Kと約86%同一である。
本発明は、(a)上で規定したヌクレオチド配列−N−N−および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号5、配列番号6、配列番号1199もしくは配列番号1200とc%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明は、(a)上で規定したヌクレオチド配列−N−N−および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号9とf%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明はまた、(a)上で規定したヌクレオチド配列−N−N−N−N−および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明は、(a)上で規定したヌクレオチド配列−N−N−および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、(a)配列番号38とaa%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明は、(a)上で規定したヌクレオチド配列−N−N10−および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。本発明はまた、配列番号42とhh%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明は、配列番号53とbbb%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
本発明は、配列番号111とfff%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列および/または(b)(a)の相補体を含む核酸を提供する。
特異的な核酸標的としては、配列番号99〜109が挙げられ、これらは、スプライス改変体のcDNA配列であり、配列番号1の599に転写開始部位を仮定し、そして3’末端に4つのA残基を含む。より下流の転写開始部位(例えば、配列番号1のヌクレオチド635)を仮定すると、これらの核酸標的は、配列番号99〜109の5’末端でのヌクレオチドのストレッチを含まない(例えば、これらは、5’ヌクレオチドの、10、20、30、40、50、60、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、100またはそれ以上を含まない)。cDNA配列に基づく25マー配列は、配列番号337〜599として与えられる。
(B.4−mRNAの直接的または間接的な検出のための核酸材料)
本発明はPCAV核酸標的にハイブリダイズし得る核酸を提供する。
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行われ得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加する条件は、当該分野で広く知られ、公開されている{例えば、参考文献21のページ7.52を参照のこと}。(ストリンジェンシーを増すための)適切な条件の例は次のものを含む。:25℃、37℃、50℃、55℃および68℃のインキュベーション温度;10×SSC、6×SSC、1×SSC、0.1×SSC(ここでのSSCは0.15M NaClおよび15mMのクエン酸緩衝剤)の濃度の緩衝液および他の緩衝系を用いたそれらの等価物;0%、25%、50%および75%の濃度のホルムアミド;5分間〜24時間の保温時間;1、2回およびそれ以上の洗浄段階;1分間、2分間または15分間の洗浄インキュベーション時間;および6×SSC、1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水による洗浄溶液。ハイブリダイゼーションの技術およびその最適化は当該分野で周知である{例えば、参考文献20、21、23、24、28などを参照のこと}。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸を本発明の標的と低いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。他の実施形態では、中間のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズする。より好ましい実施形態では、それは高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は50℃および10×SSCである。中間のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は55℃および1×SSCである。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の典型的な一組は68℃および0.1×SSCである。
本発明の好ましい核酸はPCAV核酸標的にハイブリダイズするが、他のHERV−Kからの核酸標的にはハイブリダイズしない。PCAV特異的なハイブリダイゼーションには、PCAV転写物中で見られるが、他のHERV−K転写産物では見られない特徴(例えば、特異的ヌクレオチド配列)、タンデムの5’LTRから生じる特徴、3’LTRにあるMER11aの挿入から生じる特徴、またはenvのalu中断から生じる特徴を利用することによって与えられる。配列の整列は、他のHERV−Kゲノムと大部分異なり、PCAV特異的なハイブリダイゼーションが起こり得るPCAVの領域を決めるために用いられ得る。PCAVに対する特異性は多くの細胞で見られる他の新しいHERV−Kの低レベルの天然のバックグラウンドの発現より高いそのアップレギュレーションを検出するためには好ましい。
本発明の好ましい核酸の1グループは、2番目の5’LTRの3’末端近辺のスプライスアクセプター部位を用いてPCAV産物を特異的に検出し得る。上で記載したように、そのようなスプライシングがPCAVのゲノムDNAにおいて並列しない、配列NおよびNを一緒にする。従って、本発明はPCAV核酸標的中の配列−N−N−(またはその相補体)にハイブリダイズするが、配列NまたはN単独(またはその相補体単独)にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸は、N(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第1の配列およびN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第2の配列を含む。その結果、NおよびNが隣接する標的にハイブリダイズするが、スプライシングによってNおよびNが一緒にならなかった標的にはハイブリダイズしない。そのような核酸は、NおよびNの相対的な位置が異なるので、PCAVゲノムDNAの存在下で、PCAV転写産物を同定し得る。
本発明の好ましい核酸の他のグループは3’LTRおよびMER11a配列を含むmRNAを特異的に検出し得る。従って、本発明はPCAV核酸標的中にある−N−N−配列(またはその相補体)にハイブリダイズするが、配列NおよびN単独(またはその相補体単独)にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第1の配列およびN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第2の配列含む。その結果、その核酸は(i)3’LTRおよび(ii)MER11a配列の両方を含む標的にハイブリダイズするが、(i)および(ii)の1つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムDNAにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
本発明の好ましい核酸の他のグループはaluに中断されたenv遺伝子を含むmRNAを特異的に検出し得る。従って、本発明はPCAV核酸標的にある配列−N−N−(またはその相補体)にハイブリダイズするが、配列NまたはN単独(またはその相補体単独)にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第1の配列およびN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第2の配列含む。その結果、その核酸は(i)aluの中断のすぐ前にあるenv配列および(ii)aluの中断の両方を含む標的にハイブリダイズするが、(i)および(ii)の1つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムDNAにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
本発明はまた、PCAV核酸標的にある配列−N−N10−(またはその相補体)にハイブリダイズするが、配列NまたはN10単独(またはその相補体単独)にはハイブリダイズしない核酸を提供する。その核酸はN(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第1の配列およびN10(またはその相補体)にハイブリダイズし得る第2の配列含む。そのため、その核酸は(i)env配列内のaluの中断の3’領域および(ii)aluの中断のすぐ下流にある配列の両方を含む標的にハイブリダイズするが、(i)および(ii)の1つだけを含む標的にはハイブリダイズしない。核酸は本質的にゲノムDNAにハイブリダイズし得る。しかし、この特性は転写産物の検出には有用でない。
核酸のPCAV核酸標的にハイブリダイズする能力は外因性の性質(例えば、温度、塩濃度など)に加えて、その固有の性質(例えば、標的に対する配列同一性の程度)に関連している。本発明の好ましい核酸のグループは、PCAV核酸標的にハイブリダイズする良好な固有の能力を持っている。
従って、本発明は、PCAV核酸標的断片またはPCAV核酸標的断片の相補体に対してs%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号10の断片または配列番号10の断片の相補体に対してg%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号5の断片または配列番号5の断片の相補体に対してh%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号6の断片または配列番号6の断片の相補体に対してi%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号9の断片または配列番号9の断片の相補体に対してj%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号53の断片または配列番号53の断片の相補体に対してccc%またはそれ以上の同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号1191に対してkkk%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明は、配列番号98に対して少なくともmmm%の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号1198とnnn%またはそれ以上の配列同一性を持つヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号1199と少なくともqqq%の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号1200と少なくともrrr%の配列同一性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
本発明は配列番号10または配列番号10の相補体の少なくともk個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸を提供する。その断片は好ましくは配列番号1197および/または1198の中に位置する。
本発明はまた、配列番号47または配列番号47の相補体の少なくともl個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸配列を提供する。その断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列B1a−B2a(またはその相補体)を含み、B1aは配列番号2の3’末端からm個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、B2aは配列番号46の5’末端からp個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。これらの核酸は、配列NおよびNを共に架橋するスプライス接合部におよび、従って、B1aおよびB2aの相対的な位置が違うので、PCAVゲノムDNAの存在下で、PCAV転写産物を同定し得る。B1a−B2aは、好ましくは、配列番号11(またはその相補体)(ここでm=p=4である)を含み、より好ましくは、配列番号50(またはその相補体)(ここでm=p=10である)を含む。
本発明はまた、配列番号49または配列番号49の相補体の少なくともq個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は好ましくは、ヌクレオチド配列B1b−B2b(またはその相補体)を含み、その中で、B1bは配列番号2の3’末端からr個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびB2bは配列番号48の5’末端からt個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列NおよびNを一緒にするスプライス接合部におよび、B1bおよびB2bの相対的な位置が違うので、PCAVゲノムDNAの存在下で、PCAV転写産物を同定し得る。B1b−B2bは、好ましくは、配列番号12(またはその相補体)(ここでr=t=4である)を含み、より好ましくは、配列番号51(またはその相補体)(ここでr=t=10である)を含む。
本発明はまた、配列番号9または配列番号9の相補体の少なくともu個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列B−B(またはその相補体)を含み、その中で、Bは配列番号7の3’末端からv個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびBは配列番号8の5’末端からw個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列NおよびNの両方の一部を含む。B−Bは、好ましくは、配列番号13(またはその相補体)(ここでv=w=4である)を含み、より好ましくは、配列番号52(またはその相補体)(ここでv=w=10である)を含む。
本発明はまた、配列番号38または配列番号38の相補体の少なくともrr個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、B−B(またはその相補体)のヌクレオチド配列を含み、その中で、Bは配列番号37の3’末端からss個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびBは配列番号32の5’末端からtt個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は配列NおよびNの両方の一部を含む。B−Bは好ましくは、配列番号39(またはその相補体)(ここでss=tt=4である)を含み、より好ましくは、配列番号36(またはその相補体)(ここでss=tt=10である)を含む。
本発明はまた、配列番号43または配列番号43の相補体の少なくともjj個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。断片は、好ましくは、ヌクレオチド配列B−B10、またはその相補体を含み、その中で、Bは配列番号32の3’末端からkk個またはそれ以上のヌクレオチドを含み、およびB10は配列番号40の5’末端からll個またはそれ以上のヌクレオチドを含む。従って、これらの核酸は、配列NおよびN10の両方の一部を含む。B−B10は好ましくは、配列番号44(またはその相補体)(ここでkk=ll=4である)を含み、より好ましくは、配列番号45(またはその相補体)(ここでkk=ll=10である)を含む。
本発明はまた、配列番号53または配列番号53の相補体の少なくともddd個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。本発明は、配列番号111または配列番号111の相補体のヌクレオチドの少なくともgggの連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号112または配列番号112の相補体の少なくともhhh個の連続する断片を含む核酸も提供する。本発明はまた、配列番号1191または配列番号1191の相補体の少なくともjjj個の連続するヌクレオチドの断片を含む核酸も提供する。
本発明は、式5’−X−Y−Z−3’の核酸も提供する。その中で−X−はxヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;−Z−はzヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;−Y−は(a)配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198の内のいずれかのyヌクレオチドの断片または(b)(a)の相補体のどちらかからなるヌクレオチド配列であり;そして上記核酸5’−X−Y−Z−3’は、(i)配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198、もしくは(ii)(i)の相補体のどちらでもない。
−Y−が(a)の場合、−X−のヌクレオチド配列は好ましくは、配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198における配列−Y−の5’側であるxヌクレオチドとbb%より少ない配列同一性を共有し、そして/または−Z−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198における配列−Z−の3’側であるzヌクレオチドとcc%より低い配列同一性を共有する。
−Y−が(b)の場合、−X−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198における配列−Y−の相補体の5’側であるxヌクレオチドの相補体とbb%より少ない配列同一性を共有し、そして/または−Z−のヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1〜13、20〜53、57、58、63、81、86、88〜91、99〜109、111、112、1191、1197または1198における配列−Y−の相補体の3’側であるzヌクレオチドの相補体とcc%より低い配列同一性を共有する。
−X−部分および/または−Z−部分は、プロモーター配列(またはその相補体)を含み得る。
本発明は、配列番号53のヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。この配列は、ヒトゲノム内のPCAVに特異的である。本発明はまた、配列番号111のヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
本発明はまた、配列番号1191を含む核酸も提供する。
様々なPCAV核酸が本発明により、提供される。PCAV配列の25マーの断片は、配列番号120〜1184として提示される。本発明は、これらの配列を25マーの配列として、ならびにその断片(例えば、それぞれ、2×24マー、3×23マー、4×22マー...19×7マー)およびこれらの25マーを含むより長いPCAV断片としても提供する。
本発明の好ましい核酸は、配列番号53および842〜1184のうちの1つ以上を含む。
本発明の核酸は、プローブとして、ならびに/またはハイブリダイゼーションおよび/または増幅反応に用いるプライマーとして特に有用である。
本発明の1つ以上の核酸が、同じ標的にハイブリダイズし得る(例えば、1つ以上が、1本鎖mRNAまたはcDNAにハイブリダイズし得る)。
(B.5−核酸の増幅)
試料中の核酸は、好都合なことに、および敏感に核酸増幅技術(例えば、PCR,SDA、SSSR、LCR、TMA、NASBA,T7増幅など)により検出し得る。この技術は、好ましくは指数関数的な増幅をもたらす。RNAを用いる好ましい技術はRT−PCRである(例えば参考文献20の15章を参照のこと)。その技術は定量的および/またはリアルタイムであり得る。
増幅技術は、一般に、2つのプライマーの使用を含む。標的配列が1本鎖である場合、その技術は、2本鎖の標的を与えるために、相補的な1本鎖を作る準備段階を一般的に含む。2つのプライマーは、2本鎖の標的の異なる1本鎖にハイブリダイズし、次いで伸張する。伸張した産物は、ハイブリダイゼーション/伸張のさらなるラウンドについての標的として働き得る。最終的な効果は、標的内のテンプレート配列を増幅することであり、標的中の2つのプライマーの位置により、テンプレートの5’末端および3’末端が定義される。
本発明は、PCAV核酸標的に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含むキットを提供し、このキットは、第1のプライマーおよび第2のプライマーを含む。第1のプライマーは前記テンプレート配列の一部と実質的に相補的である配列を含み、第2のプライマーは前記テンプレート配列の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含む。実質的な相補性を有する前記プライマー中の配列は増幅されるテンプレート配列の末端を定義する。
本発明のキットは、テンプレート配列および/またはその相補体に実質的に相補的であり、そしてそれらにハイブリダイズし得るプローブをさらに含み得る。このプローブをハイブリダイゼーション技術に使用して、増幅したテンプレートを検出し得る。
本発明のキットは、定量的な測定を補助するために内標を作製し、検出するためのプライマーおよび/またはプローブをさらに含み得る(例えば、15、25)。
本発明のキットは、(例えば、ネスト化した増幅についての)1組以上のプライマーを含み得、そして1つのプライマーは、1つ以上のプライマーの組に共通であり得る。キットはまた、1つ以上のプローブも含み得る。
テンプレート配列は、好ましくは第22染色体のメガベース20.428に位置するHERV−Kの転写物内に位置し、そしてより好ましくは、配列番号10(または配列番号23)のフラグメントである。テンプレート配列は、好ましくは、少なくとも50のヌクレオチド長(例えば、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250、1500、2000、3000、またはそれより長いヌクレオチド)である。テンプレートの長さは、テンプレートが位置する標的の長さにより固有に制限される。しかし、テンプレート配列は500ヌクレオチドより短い方(例えば、450、400、350、300、250、200、175、150、125、100、90、80、70、またはそれより短く)が好ましい。
好ましいテンプレートは、配列番号53および/または配列番号111を含む。
本発明のキットに使用されるプライマーおよびプローブは、好ましくは、上記B.4節で記載される通りの核酸である。特に好ましいプライマーは、配列番号600〜1184(またはその相補体)に基づいたプライマーである。例えば、配列番号600〜1184を含むプライマー、またはpppのフラグメントまたは配列番号600〜1184の内の1つ由来のさらなるヌクレオチドを含むプライマーを含む。
プライマーおよびプローブのさらなる特徴は、以下のB.6節に記載される。
キットは、プライマーの組(i)および(ii)が、配列番号10中のテンプレート配列を決定するような(i)配列番号10の一部と実質的に同一である配列を含む第1のプライマーおよび(ii)配列番号10の一部と実質的に相補的な配列を含む第2のプライマーを含むことが、好ましい。他の好ましいキットは、プライマーの組が、配列番号10中のテンプレート配列を決定するような(i)配列番号10の相補体の一部と実質的に同一である配列を含む第1のプライマーおよび(ii)配列番号10の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含む第2のプライマーを含むことが好ましい。一部の配列およびテンプレート配列は、好ましくは、配列番号1197または配列番号1198の範囲である。
プライマーの1つまたは両方が、プライマーの組がPCAVに特異的であるように、PCAV(または、その相補体)以外の、HERV−Kの一部と実質的に相補的ではないことが好ましい。
配列番号10は、以下の4つのエキソンに分けられ得る:(1)第1の5’LTRの下流の保存されたスプライスドナーまでの配列を含む、ヌクレオチド1〜517;(2)第2の5’LTRの3’末端の付近のスプライスアクセプターと保存されたスプライスドナーの間の配列を含む、ヌクレオチド2142〜2209;(3)ヌクレオチド7608〜7686;および(4)ヌクレオチド9866〜11181(配列番号1のヌクレオチド559で仮定される転写開始点)。エクソン(2)は、タンデムの5’LTRのユニークなPCAV特徴に起因して生じる。しかし、他の3つのエキソンは、他のHERV−Kに存在する。
本発明の好ましいキットにおいて、第1および第2のプライマーは、異なったエキソンに位置している。このアライメントは、増幅されたテンプレート配列が、ゲノムDNAから得られるものより短いことを意味する。なぜなら、それはイントロンの欠如のためである。例えば、以下:
Figure 0004646315
従って、配列番号10を参照すると、プライマーは、以下の組み合わせの間に位置する配列番号10(またはその相補体)のフラグメントを含み得る。
Figure 0004646315
配列番号1を参照すると、これらの組み合わせは以下である:
Figure 0004646315
しかし、さらに下流の転写開始点で、第1のエキソンは、ヌクレオチド559の下流、例えばヌクレオチド633、635または637の周辺から始まり得る。
エキソン1内の例示的なプライマーは、配列番号120〜219である。エキソン2〜4内の例示的なプライマーは、配列番号220〜336である。
他の好ましいキットにおいて、第1のプライマーおよび第2のプライマーの1つまたは両方は、プライマーがスプライシング後のエキソン−エキソンの結合を結びつけるように、第1のエキソンからの第1の配列および第2のエキソンからの第2の配列を含む。例えば、プライマーは、エキソン1と2、エキソン1と3、エキソン1と4、エキソン2と3、エキソン2と4または、エキソン3と4からの配列を含み得る。これらのプライマーは、スプライシングが起こる位置で転写物にハイブリダイズする。
従って、配列番号10を参照すると、プライマーは、以下の組み合わせの3’末端からの第1の配列および以下の組み合わせ(またはその相補体)の5’末端からの第2の配列を含み得る:
Figure 0004646315
しかし、さらに下流の転写開始点を取ると、第1の配列を選択するための「1〜517」の範囲は、「77〜517」の周辺、例えば75〜517、または80〜517と置き換えるべきである。
第2の5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプター部位が、使用されるPCAV標的核酸を検出するための好ましいキットでは、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、Nの一部と実質的に相補的である配列を含むか、または(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマーの組は、PCAV特異的スプライシング部位を結びつけるテンプレート配列を定義する。スプライシング部位が使用された標的の増幅した配列は、スプライシングされない標的(図5)またはゲノムDNAより短い。スプライスアクセプター部位のすぐ上流のLTRにおいて(例えば、PCAVの第2の5’LTR、または他のHERVの1本鎖5’LTRにおいて)転写が開始され得る標的では、増幅した配列は、より上流の5’LTRでの転写が始まるPCAV標的より短い。
第2の5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプター部位が使用される、PCAV産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーはスプライスドナーの下流にあるPCAV配列の一部と実質的に相補的である配列を含み、そのスプライスドナーは、それ自身、第2のPCAV5’LTRの3’末端の近辺にあるスプライスアクセプターの下流に存在するか、または、(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、スプライスドナーの下流にあるPCAV配列の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含み、そのスプライスドナーは、それ自身、第2のPCAV5’LTRの3’末端の近辺にあるスプライスアクセプターの下流に存在するかのいずれかである。プライマーは、エキソン2のいずれかのサイドに位置し、従ってエキソン2を結びつけるテンプレート配列を定義する。増幅した配列は、エキソンが存在しない標的エキソンが存在する標的の中での方が、より長くなり(図6A対図6B)、そしてPCAV標的のみが、より長い増幅産物を与え得る。全てのスプライシング産物は、エキソンを含むか否かに関わらず、スプライシングされないmRNAまたはゲノムDNA標的より短い増幅産物を与える。
第2の5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプター部位が使用される、PCAV産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、(i)第1のプライマーは、N−N中のスプライシング連結部位と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、スプライシング連結部位の上流または下流にあるPCAV配列の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、(ii)第1のプライマーはN−N中のスプライシング部位相補体と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、スプライシング連結部位の上流または下流にあるPCAV配列の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。第1のプライマーは、Nの一部と実質的に相補的な第1の配列およびNの一部と実質的に相補的であり、そしてスプライス部位が使われる標的にはハイブリダイズし得るが、スプライシング部位が使用されない標的にはハイブリダイズし得ない第2の配列を含む。このようなプライマーの組の増幅は、標的配列がスプライシング部位の使用により形成される場合でのみ起こり、スプライシングを受けない標的またはゲノムDNAでは起こらない。
PCAV産物の3’領域を検出するための好ましいキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーはNの一部と実質的に同一である配列を含むか、または、(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。プライマーの組は、3’LTR/MER11aの部位を結合するテンプレート配列を増殖し、そして増幅は、標的配列が、3’LTR配列およびMER11a配列の両方を含む場合でのみ起こる(図7)。
PCAV産物の3’領域を検出するための好ましい他のキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である第1の配列および第2の配列は、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、第2のプライマーは、PCAV配列の上流または下流の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一であるか、第1の配列およびNの相補体の一部と実質的に同一である第2の配列を含み、そして第2のプライマーは、PCAV配列の上流または下流の相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。標的配列が、3’LTR配列およびMER11a配列の両方の配列を含む場合にのみ増幅が生じるように、3’LTR配列およびMER11a配列の両方を含む標的にのみ第1のプライマーは、ハイブリダイズする(図7)。増幅産物はゲノム内のものより短いので第2のプライマーは、好ましくは、エキソン3の中に位置する。
PCAV産物の3’領域を検出するための好ましい他のキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、第2のプライマーは、ポリAテイルの一部と実質的に相補的である配列を含むか、または、(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、第2のプライマーは、ポリAテイルの相補体の一部と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマーの組により定義されるテンプレート配列は、3’LTRがMER11aの挿入を含む標的中では、3’LTRがインタクトである標的(例えば、他のHERV)中より長い(図8)。ポリA特異性はゲノムDNAが増幅されないことを意味する。
alu中断envを含むPCAV産物を検出するための好ましいキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、Nの一部と実質的に相補的な配列を含むかまたは、(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である配列を含み、そして第2のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に相補的な配列を含むかのいずれかである。プライマーの組は、env/aluの連結を結合するテンプレート配列を増幅し、そして増幅はenv配列およびalu配列の両方を含む標的配列でのみ起生じる。
alu中断envを含むPCAV産物を検出するための好ましい他のキットにおいて、(i)第1のプライマーは、Nの一部と実質的に同一である第1の配列および、Nの一部と実質的に同一である第2の配列を含み、そして第2のプライマーは、PCAV配列の上流または下流の一部と実質的に相補的である配列を含むか、または(ii)第1のプライマーは、Nの相補体の一部と実質的に同一である第1の配列およびNの相補体の一部と実質的に同一である第2の配列を含み、そして第2のプライマーは、PCAV配列の上流または下流の相補体の一部と実質的に相補的な配列を含む。第1のプライマーは、増幅が、標的配列がalu配列およびenv配列の両方を含む場合でのみ生じるように、alu配列およびenv配列の両方を含む標的にのみハイブリダイズする。
alu中断envを含むPCAV産物を検出するためのさらなる好ましいキットにおいて、(i)第1プライマーは、Nの部分と実質的に同一な配列を包含し、そして第2プライマーがN10の部分と実質的に相補的である配列を包含するか、または(ii)第1プライマーがNの相補体の部分と実質的に同一である配列を包含し、そして第2プライマーがN10の相補的部分と実質的に相補的である配列を含むかのいずれかである。このプライマー対は、alu中断の末端を架橋するテンプレート配列を増幅する。
alu中断envを含むPCAV産物を検出するための他の好ましいキットにおいて、(i)第1プライマーは、Nの部分と実質的に同一な第1配列およびN10の部分と実質的に同一の第2配列を包含し、そして第2プライマーは、上流のPCAV配列または下流のPCAV配列の部分と実質的に相補的である配列を包含する、あるいは(ii)第1プライマーがNの相補体の部分の部分と実質的に同一である第1配列およびN10の相補体と実質的に同一である第2配列を包含し、そして第2プライマーが、上流のPCAV配列または下流のPCAV配列の相補的位置と実質的に相補的である配列を包含する。第1プライマーは、alu中断envを包含する標的とのみハイブリダイズする。
別の好ましいキットは、(i)配列番号111、112、または53の第1部分と実質的に同一である配列を含む第1プライマーおよび配列番号111、112、または53の第2部分と実質的に相補的である配列を含む第2プライマー、あるいは(ii)配列番号111、112、または53の相補体の第1部分に実質的に同一である配列を含む第1プライマーおよび配列番号111、112または53の相補体の第2部分と実質的に相補的な配列を含む第2プライマーのいずれかを含み、その結果プライマー対が、配列番号111、112または53からなるまたは配列番号111、112または53を含んで、鋳型配列を規定する。
(B.6 本発明の核酸の一般的特徴)
本発明の核酸および転写産物は、好ましくは単離された形態または実質的に単離された形態(すなわち、他の核酸を実質的に含まない(例えば、天然に存在する核酸を実質的に含まない)で、一般的に少なくとも約50%純度(重量%)で、通常は少なくとも約90%純度で、供給される。
本発明の核酸は複数の形態をとり得る。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。他に特定されない限りまたは要求されない限り、核酸を使用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態および二本鎖形態を形成する各々の2つの相補的一本鎖形態の両方を使用し得る。プライマーおよびプローブは、アンチセンス核酸のように、一般的に一本鎖である。
本発明の核酸は、環状または分岐型であり得るが、一般的に線状である。
本発明の核酸は、固体支持体(例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、マイクロアレイ支持体、樹脂など)に結合され得る。
本発明の特定の実施形態において、核酸は、好ましくは少なくとも7ヌクレオチド長(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300ヌクレオチドまたはそれより長い)である。
本発明の特定の実施形態において、核酸は、好ましくは多くとも500ヌクレオチド長(例えば、450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15ヌクレオチドまたはそれより短い)である。
本発明のプライマーおよびプローブ、ならびにハイブリダイゼーションで用いる他の核酸は、好ましくは10〜30の間のヌクレオチド長(例えば、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30ヌクレオチド)である。
本発明の核酸は、おそらく、検出可能な標識(例えば、放射活性標識または蛍光性標識)、あるいはビオチン標識を保有する。このことは、この核酸が、核酸検出技術において使用される場合(例えば、その核酸がプローブまたはプライマーである場合)に、特に有用である。
本発明の核酸はPCAV配列を含むが、その核酸はまた、非PCAV配列を含み得る(例えば、上記で定義されるように、5’−X−Y−Z−3’式の核酸における)。これは、特にプライマーにとって有益であり、このようにPCAV核酸標的に相補的な第1配列および核酸標的に相補的でない第2配列を含み得る。プライマーにおける任意のそのような非相補的配列は、好ましくは相補的配列に対して5’である。代表的な非相補的配列は、制限部位{26}またはプロモーター配列{27}を含む。
本発明の核酸は、多くの方法で(例えば、(少なくとも部分的に)化学合成によって)、ヌクレアーゼ(例えば、制限酵素)を用いてより長い核酸を消化することによって、より短い核酸(例えば、リガーゼまたはポリメラーゼ)を連結することによって、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーからなどで調製され得る。
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、1つ以上の細胞型の形質導入/トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、挿入ヌクレオチドの単離、増幅および複製のために設計された「クローニングベクター」、宿主細胞中の核酸配列の発現のために設計された「発現ベクター」、組み換えウイルスまたはウイルス様微粒子の産生を生じるために設計された「ウイルスベクター」または1つ以上の型のベクターの寄与を含む「シャトルベクター」であり得る。「宿主細胞」としては、外因性核酸のレシピエントであり得るかまたは外因性核酸のレシピエントであった個々の細胞または細胞培養が挙げられる。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、そして子孫は(例えば、形態または総DNA相補体において)、天然の、偶然のまたは人為的な変異および/または変化に起因して、もとの親細胞と必ずしも完全に同一ではないかもしれない。宿主細胞としては、本発明の核酸を用いて、インビボまたはインビトロでトランスフェクトされたまたは感染された細胞が挙げられる。
用語「核酸」は、任意の長さの核酸重合体を包含し、一般的に任意の長さの核酸ポリマーを意味し、核酸はデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらのアナログを包含する。核酸としては、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドが挙げられる。核酸はまた、DNAまたはRNAアナログ(例えば、修飾された骨格(例えば、ペプチド核酸(PNA)またはホスホロチオエート)または修飾塩基を含むDNAアナログまたはRNAアナログ)を包含する。用語「核酸」は、特に示されない限り、核酸の長さや構造に関して制限することを意図しない。そして、次に核酸の非制限例を挙げる:遺伝子または遺伝子フラグメント、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組み換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、任意の供給源由来のDNA、任意の供給源由来のRNA,プローブ、およびプライマー。本発明の核酸がRNAの形態をとる場合、その核酸は5’キャップを有し得る。
核酸がDNAである場合、RNA配列における「U」がDNAにおいて「T」で置換されていることが理解される。同様に、核酸がRNAの場合、DNA配列における「T]がRNAにおいて「U]で置換されていると理解される。
核酸に関連して用いる場合、用語「補体」または「相補的」は、ワトソン−クリック塩基対合をいう。このように、Cの補体はGであり、Gの補体はCであり、Aの補体はT(またはU)であり、T(またはU)の補体はAである。例えば、補体プリミジンン(CまたはT)に対するI(プリンイノシン)のような塩基を使用することが可能である。これらの用語はまた、方向性を意味する(5’−ACAGT−3’の補体は、5’−TGTCA−3’ではなく5’−ACTGT−3’である)。
本発明の核酸は、例えば、ポリペプチドを産生するため;生物学的サンプルにおける核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして;核酸のさらなるコピーを生成するため;リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するため;一本鎖DNAプライマーまた一本鎖DNAプローブとして;あるいは三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして使用され得る。核酸は、好ましくはPCAV核酸標的(例えば、PCAV mRNA)を検出するために使用される。
2つの核酸配列の間のパーセンテージ配列同定に対する言及は、整列する場合、塩基のパーセンテージは、2つの配列を比較すると同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性またはパーセンテージ配列同一性は、例えば、参考文献28の7.7.18節に記載されるもののような、当該分野で公知のソフトウェアプログラムを用いて決定され得る。好ましい整列プログラムは、好ましくはデフォルトパラメーターを用いた、GCG Gap(Genetics Computer Group,Wisconsin、Suite Version 10.1)であり、そのデフォルトパラメーターを以下に示す:オープンギャップ=3;拡張ギャップ=1。
上記で使用されたa、aa、b、bbb、c、ccc、d、e、eee、f、fff、g、h、hh、i、ii、j、kkk、mm、mmm、n、nn、nnn、pp、qq、qqq、rrr、s、uu、vv、およびwwの%の値は、各々独立して、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9、または100であり得る。各々のa、aa、b、bbb、c、ccc、d、e、eee、f、fff、g、h、hh、i、ii、j、mm、n、nn、pp、qq、s、uu、vv、およびwwの値は、お互いに同じあるいは異なり得る。「サイレント」変化(すなわち、コドンに対するコードされるアミノ酸に影響しない)を含む核酸配列は、これら核酸の例である。
上記で使用した各々ddd、ggg、hhh、jj、jjj、k、kk、l、ll、m、p、ppp、q、r、rr、ss、t、tt、u、v、w、yの値は、それぞれ独立に、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、80、90、および100またはそれ以上であり得る。各々ddd、ggg、jj、k、kk、l、ll、m、p、q、r、rr、ss、t、tt、u、v、w、およびyの値は、お互いに同じまたは異なり得る。
x+zの値は、少なくとも1(例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100など)である。好ましくは、x+y+zは、少なくとも8(例えば、少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100など)である。好ましくは、x+y+zの値は、多くとも500(例えば、多くとも450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8)である。
上記で使用されたbbおよびccの%の値は、独立して、各々好ましくは60未満(例えば、50、40、30、20、10)未満であるか、あるいは、0でもかまわない。bbおよびccの値は、お互いに同じまたは異なり得る。
本発明の好ましい核酸は低複雑性をマスクするためのマスキングプログラム(例えば、XBLAST)の適用後に、マスクされないままであるヌクレオチド配列を含む。
核酸がポリペプチド「コードする」といわれる場合、そのポリペプチドは必ずしも翻訳されることを意味せず、その核酸は、ポリペプチドのアミノ酸をコードする一連のコドンを含む。
本発明は以下の19の核酸を含まないことが好ましい:(i)参考文献1で公開されたヌクレオチド配列を含む核酸;(ii)参考文献1における配列番号1〜225内のヌクレオチド配列を含む核酸;(iii)公知の核酸;(iv)参考文献29からの配列番号505、506、507、508、または509を含む核酸(v)参考文献30、31、または32からの配列番号407を含む核酸;(vi)参考文献30、31、または32からの配列番号591を含む核酸;(vii)参考文献33からの配列番号2192を含む核酸;(viii)参考文献34からの診断用タンパク質 #19115を含む核酸;(ix)参考文献35からの配列番号37169を含む核酸;(x)参考文献36からのプローブ番号11882、12335、12181、11701または24114を含む核酸;(xi)参考文献37からのプローブ番号9239または9663を含む核酸;(xii)参考文献38からの配列番号12094または12516を含む核酸;(xiii)参考文献39からの配列番号12377または12795を含む核酸;(xiv)参考文献40からのプロ−ブ番号8509、8960または17545を含む核酸;(xv)参考文献41からのプローブ番号12376、12685、12194、25151または25457を含む核酸;(xvi)参考文献42からの核酸4609を含む核酸;(xvii)参考文献43からの配列番号3685、12135または13658を含む核酸;(xviii)2001年12月7日現在公知である核酸(例えば、配列が公開データベース(例えば、GenBankまたはGeneSeq)において2001年12月7日以前に入手可能である核酸);(XIX)2002年6月10日現在公知である核酸(例えば、配列が公開データベース(例えば、GenBankまたはGeneSeq)において2002年6月10日以前に入手可能な核酸)。
(C ポリペプチド発現産物の検出)
方法がポリペプチド検出に基づいている場合、その方法は、PCAV mRNA転写産物によってコードされたポリペプチドの発現の検出を包含する。この方法は、代表的に1つ以上の次のポリペプチドの検出を包含する:gag(例えば、配列番号57)またはPCAP3/mORF(例えば、配列番号87)。いくつかのPCAV mRNAが、これらの全てのポリペプチド(例えば、ERVK6{44})をコードするが、PCAVは古いウイルスであり、そのprt遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子は、高度に断片化されている。
HML−2ポリペプチドをコードする転写産物は、内在性ゲノムの全長mRNAコピーの選択的スプライシングによって生成される{例えば、参考文献45の図4、参考文献54の図1を参照のこと}。PCAV gagポリペプチドは、ゲノム内の第1長ORF(配列番号1のヌクレオチド2813〜4683;配列番号54)によってコードされている。全長gagポリペプチドはタンパク質分解的に切断される。PCAV prtポリペプチドは、ゲノム内の第2長ORFによってコードされ、そしてプロテアーゼを生成するためにタンパク質分解的に切断されるgag−prt融合ポリペプチドとして翻訳される。PCAV polポリペプチドは、ゲノム内の第3長ORFによってコードされ、そして、3つのpol産物(すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼおよびインテグラーゼ{46})を生成するためにタンパク質分解的に切断されるgag−prt−pol融合ポリペプチドとして翻訳される。PCAV envポリペプチドは、ゲノム内の第4の長ORFによってコードされている。翻訳されたポリペプチドは、タンパク質分解的に切断されている。PCAV cORFポリペプチドは、envと同じ5’領域および開始コドンを共有するORFによってコードされているが、そこでは、スプライシング事象によってenvをコードする配列が除去され、envのORFに関連してリーディングフレーム+1に変化する{47、48}。PCAP3ポリペプチドは、envと同じ5’領域および開始コドンを共有するORFによってコードされているが、そこでは、スプライシング事象によって、envをコードする配列が除去され、envのORFに関連して、リーディングフレーム+2に変化する(第3のリーディングフレーム)。
(C.1−HML−2ポリペプチドの直接検出)
種々の技術が、サンプル中の特定のポリペプチドの存在または非存在を検出するために利用可能である。これらは一般に、抗体とそのポリペプチド中の抗原性アミノ酸配列との間の特異的相互作用に基づく、免疫アッセイ技術である。適切な技術としては、標準的免疫組織学的方法、ELISA、RIA、FIA、免疫沈降、免疫蛍光などが挙げられる。
本発明のポリペプチドはまた、機能的アッセイ(例えば、結合活性または酵素活性を検出するためのアッセイ)によって検出され得る。例えば、cORFについての機能的アッセイは、参考文献48〜50に開示されており、そしてプロテアーゼについての機能的アッセイは、参考文献51に開示されている。PCAP3は、初代前立腺上皮細胞においてアポトーシスを引き起こし、アポトーシスが抑制される場合、細胞をそれらの通常の老化点を超えて増大させ得ることが見出されている。
本発明のポリペプチドを検出する別の方法は、標準的プロテオミクス技術を使用すること(例えば、ポリペプチドを精製または分離し、次いでペプチド配列決定を用いること)である。例えば、ポリペプチドは、2D−PAGEを用いて分離され得、そしてポリペプチドスポットが、配列が標的ポリペプチド中に存在するか否かを同定するために(例えば、質量分析法により)配列決定され得る。
技術は、検出前に標的ポリペプチドの富化を必要とし得る。しかし、免疫蛍光アッセイは、このような富化の必要性なく、細胞について容易に実施され得る。細胞は、最初に固体支持体(例えば、顕微鏡スライドまたはマイクロタイターウェル)上に固定され得る。次いで、細胞膜は、抗体の侵入を可能にするために透過処理され得る(NB:固定および透過処理は、一緒に達成され得る)。次に、この固定された細胞は、このポリペプチドに特異的な、蛍光標識された抗体に曝露され得る。この標識の存在は、標的PCAVポリペプチドを発現する細胞を同定する。このアッセイの感度を上げるために、抗PCAV抗体に結合するために第2抗体を使用することが可能である(標識は、この第2抗体によって保有される){52}。
(C.2−HML−2ポリペプチドの間接的検出)
ポリペプチドを直接的に検出するよりも、ポリペプチドに対応して身体によって生成される分子を検出すること(すなわち、ポリペプチドの間接的検出)が好適であり得る。これは代表的に、抗体の検出を含み、それゆえ、患者のサンプルは一般に、血液サンプルである。抗体は、(例えば、代表的には固定された、本発明のPCAVポリペプチドを用いた)従来の免疫アッセイ技術によって検出され得る。
HERV−Kポリペプチドに対する抗体は、ヒトにおいて(例えば、精上皮腫組織または奇形癌組織において)検出されている{例えば、45、53、54}。
(C.3−ポリペプチド物質)
本発明は、本発明の検出方法において用いられ得るポリペプチドを提供し、ここで、このポリペプチドは、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスによってコードされる。
本発明は、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。配列番号54、55、56、87、98および110は、この群の好ましいメンバーである。
本発明はまた、以下を提供する:(a)配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188のうちの1以上の少なくともddアミノ酸のフラグメントを含むポリペプチド、ならびに(b)配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188のうちの1以上に対して少なくともee%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
これらのポリペプチドは、改変体(例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、変異体など)を包含する。
(a)のフラグメントは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188のT細胞エピトープまたは好ましくはB細胞エピトープを含み得る。T細胞エピトープおよびB細胞エピトープは、(例えば、PEPSCAN{55、56}または類似の方法を用いて)経験的に同定されてもよく、またはこれらは、(例えば、Jameson−Wolf抗原性指数{57}、行列に基づくアプローチ{58}、TEPITOPE{59}、神経ネットワーク{60}、OptiMerおよびEpiMer{61、62}、ADEPT{63}、Tsites{64}、親水性{65}、抗原性指数{66}または参考文献67に開示される方法などを用いて)推定されてもよい。
(a)の好ましいフラグメントは、配列番号55、56および110であるか、または配列番号55、56もしくは110のフラグメントである。配列番号55、56および110は、PCAV gagタンパク質内に見出され、そして他のHERV−Kのバックグラウンド発現よりも高いPCAV発現を検出するために特に有用である。
(b)においては、これらのポリペプチドは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188と比較して、1以上の連続したアミノ酸置換(すなわち、1つのアミノ酸の、関連した側鎖を有する別のアミノ酸での置換)を含み得る。遺伝子にコードされるアミノ酸は、一般に4つのファミリーに分けられる:(1)酸性、すなわち、アスパルテート、グルタメート;(2)塩基性、すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;ならびに(4)非荷電の極性、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、一緒に、芳香族アミノ酸として分類される。一般に、これらのファミリー内での単一のアミノ酸の置換は、生物学的活性に対して大きな影響を有さない。
本発明はまた、式NH−XX−YY−ZZ−COOHを有するポリペプチドを提供し、ここで:XXは、xxアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;ZZは、zzアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;YYは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188からなる群より選択されるアミノ酸配列のyyアミノ酸のフラグメントからなるポリペプチド配列であり;そしてこのポリペプチドNH−XX−YY−ZZ−COOHは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188から選択されるポリペプチド配列のフラグメントではない。
−XX−の配列は、好ましくは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188中の配列−YY−に対してN末端であるxxアミノ酸に対してff%未満の配列同一性を共有する。−ZZ−の配列は、好ましくは、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188中の配列−YY−に対してC末端であるzzアミノ酸に対してgg%未満の配列同一性を共有する。
本発明のポリペプチドは、種々の形態(例えば、ネイティブ、融合体、グリコシル化、非グリコシル化、ミリストイル化、非ミリストイル化、脂質化(lipdated)、非脂質化、モノマー、マルチマー、粒子状、変性など)で調製され得る。
本発明のポリペプチドは、固体支持体に結合され得る。
本発明のポリペプチドは、検出可能な標識(例えば、放射性標識もしくは蛍光標識、またはビオチン標識)を含み得る。
本発明のポリペプチドは、多くの方法で、例えば、(少なくとも部分的に)化学合成により、より長いポリペプチドをプロテアーゼを用いて消化することにより、RNAから翻訳することにより、(例えば、組換え発現からの)細胞培養物からの精製により、生物自体から(例えば、前立腺組織からの単離)、細胞株供給源からなどにより、調製され得る。
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーをいう。このポリマーは、直鎖状であっても、または分枝状であってもよく、これは、改変されたアミノ酸を含んでもよく、そしてこれは、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然でまたは介入による改変されたアミノ酸ポリマーを包含する;例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは改変(例えば、標識成分との結合体化)。この定義にまた含まれるのは、例えば、アミノ酸の1以上のアナログ(例えば、非天然のアミノ酸などが挙げられる)、ならびに当該分野で公知の他の改変を含むポリペプチドである。ポリペプチドは、単鎖または会合した鎖として生じ得る。本発明のポリペプチドは、天然にグリコシル化されていてもよく、または非天然にグリコシル化されていてもよい(すなわち、このポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドにおいて見出されるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する)。
一般に、本発明のポリペプチドは、天然に存在しない環境において提供される(例えば、これらは、それらが天然に存在する環境から分離されている)。特定の実施形態では、このポリペプチドは、コントロールと比較してこのポリペプチドが富化された組成物中に存在する。従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態または実質的に単離された形態で提供される。すなわち、このポリペプチドは、発現された他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、ここで、実質的に含まないとは、組成物の75(重量)%未満、好ましくは50%未満、そしてより好ましくは10%未満(例えば、5%)が、発現された他のポリペプチドから構成されることを意味する。
変異体は、アミノ酸の置換、付加または欠失を含み得る。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換であっても、または(例えば、グリコシル化部位、リン酸化部位もしくはアセチル価部位を変更するため、または機能に必須でない1以上のシステイン残基の置換もしくは欠失による、誤った折畳みを最小にするための)非必須アミノ酸を除去する置換であってもよい。保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸の全体的な電荷、疎水性/親水性、および/または立体的かさ高さを保存する、置換である。改変体は、そのポリペプチドの特定領域(例えば、機能的ドメインおよび/または、このポリペプチドがポリペプチドファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列に関連する領域)の生物学的活性を保持するように、またはその特定領域の生物学的活性が増強されるように設計され得る。改変体の産生のためのアミノ酸改変の選択は、アミノ酸の利用可能性(内部対外部)(例えば、参考文献68)、改変体ポリペプチドの耐熱性(例えば、参考文献69)、所望のグリコシル化部位(例えば、参考文献70)、所望のジスルフィド架橋(例えば、refs.71および72)、所望の金属結合部位(例えば、refs.73および74)、ならびにプロリンループ中での所望の置換(例えば、参考文献75)に基づき得る。システイン枯渇ムテインは、参考文献76に開示されるように産生され得る。
上記で用いられるeeという百分率の値は、50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.9、または100であり得る。
上記で用いられるffおよびggという百分率の値は、独立して各々、好ましくは、60未満(例えば、50、40、30、20、10)であるか、または0でさえあり得る。ffおよびggという値は、互いに同じであっても異なっていてもよい。
上記で用いられるdd、xx、yyおよびzzの値は、各々独立して、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、60、70、75、80、90、100またはそれより高くであり得る。dd、xx、yyおよびzzの各々の値は、互いに同じであっても異なっていてもよい。ddの値は、2000未満(例えば、1000未満、500未満、100未満、または50未満)であり得る。
xx+zzの値は、少なくとも1(例えば、少なくとも、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100など)である。xx+yy+zzの値が少なくとも8(例えば、少なくとも、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100など)であることが好ましい。xx+yy+zzの値が、多くとも500(例えば、多くとも、450、400、350、300、250、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8)であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、一般に、少なくとも7アミノ酸長(例えば、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300アミノ酸またはそれより長い)である。
本発明の特定の実施形態については、ポリペプチドは、好ましくは、多くとも500アミノ酸長(例えば、450、400、350、300、250、200、150、140、130、120、110、100、90、80、75、70、65、60、55、50、45、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15アミノ酸またはそれより短い)である。
2つのアミノ酸配列の間での配列同一性の百分率に対する参照は、整列した場合に、その百分率のアミノ酸が、これら2つの配列を比較して同じであることを意味する。この整列およびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム(例えば、参考文献28の第7.7.18節に記載されるソフトウェアプログラム)を用いて決定され得る。好ましい整列は、12というギャップオープンペナルティ(gap open penalty)および2というギャップ伸長ペナルティ(gap extension penalty)、62というBLOSUM行列でアフィンギャップ検索を用いたSmith−Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。Smith−Waterman相同性検索アルゴリズムは、参考文献77に教示される。
本発明の好ましいポリペプチドは、低複雑性をマスクするためにマスキングプログラム(例えば、XBLAST)の適用後にマスクされていないままであるアミノ酸配列を含む。
本発明が以下を含まないことが好ましい:(i)参考文献1に開示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;(ii)参考文献1中の配列番号1〜225内のアミノ酸配列を含むポリペプチド;(iii)参考文献30、30もしくは32からの配列番号592を含むポリペプチド;(iv)既知のポリペプチド;(v)2001年12月7日時点で公知のポリペプチド(例えば、配列が2001年12月7日よりも前に公のデータベース(例えば、GenBankまたはGeneSeq)で入手可能であるポリペプチド);または(vi)2002年6月10日時点で公知のポリペプチド(例えば、配列が2002年6月10日よりも前に公のデータベース(例えば、GenBankまたはGeneSeq)で入手可能であるポリペプチド)。
(C.4−抗体物質)
本発明は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を提供する。本発明はまた、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドに結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい抗体は、配列番号54、55、56、59、60、61、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、87、92、93、94、95、96、97、98、110、1186および1188内のエピトープを認識する。本発明のより好ましい抗体は、配列番号54、55、56または110内のエピトープを認識する。
本発明の他の好ましい抗体は、HERV−K gagタンパク質を認識する。この抗体は、以下であり得る:(a)PCAV由来のgagおよびまた1以上のさらなるHERV−K由来のgagを認識する、(b)PCAV由来のgagを認識するが、任意の他のHERV−K由来のgagを認識しない、(c)PCAV由来のgagおよびまた1以上の古いHERV−K由来のgagを認識するが、新しいHERV−K由来のgagを認識しない、または(d)1以上のHERV−K由来のgagを認識するが、PCAV由来のgagを認識しない。群(a)における好ましい抗体は、5G2である;群(c)における好ましい抗体は、5A5である。
本発明の抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。
本発明の抗体は、任意の適切な手段(例えば、組換え発現によって、または本発明のポリペプチドを適切な動物(例えば、ウサギ、ハムスター、マウスまたは他の齧歯動物)に投与する(例えば、注射する)ことによって)産生され得る。
本発明の抗体は、標識を含み得る。この標識は、直接的に検出され得る(例えば、放射性標識または蛍光標識)。あるいは、この標識は、間接的に検出され得る(例えば、産物が検出され得る酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラスクトシダーゼ、ペルオキシダーゼなど))。
本発明の抗体は、固体支持体に結合され得る。
一般に、本発明の抗体は、天然に存在しない環境において提供される(例えば、これらは、その天然に存在する環境から分離されている)。特定の実施形態では、この抗体は、コントロールと比較してこれらが富化された組成物中に存在する。従って、本発明の抗体は、好ましくは、単離された形態で、または実質的に単離された形態で、提供される(すなわち、この抗体は、他の抗体を実質的に含まない組成物中に存在する)。ここで、実質的に含まないとは、組成物の75(重量)%未満、好ましくは50%未満、そしてより好ましくは10%未満(例えば、5%)が、他の抗体から作製されることを意味する。
用語「抗体」は、任意の適切な天然免疫グロブリンもしくは人工免疫グロブリン、またはこれらの誘導体を含む。概して、抗体は特異的抗原結合活性を保有するFv領域を含む。この抗体として以下が挙げられるが、これらに限定はされない:免疫グロブリン全体、抗原結合免疫グロブリンフラグメント(例えば、Fv、Fab、F(ab’)など)、単鎖抗体(例えば、scFv)、オリゴボディ(oligobody)、キメラ抗体、ヒト化抗体、表面貼り抗体(veneered antibody)、など。
ヒト免疫系との適合性を上げるため、抗体は、キメラ抗体であってもヒト化抗体であってもよく{例えば、参考文献78および参考文献79}、または完全なヒト抗体が使用され得る。ヒト化抗体は、元の非ヒトモノクローナル抗体より、ヒトにおいてはるかに免疫原性が低いため、アナフィラキシーの危険がはるかに少なく、ヒトの処置のために使用され得る。従って、これらの抗体は、ヒトへのインビボ投与を含む治療適用(腫瘍性疾患の処置のための放射線感作物質としての使用、または癌治療の副作用を減少させる方法における使用など)において好適であり得る。
ヒト化抗体は、種々の方法により達成され得る。この方法としては、以下が挙げられる:(1)非ヒト相補性決定領域(CDR)を、ヒトフレームワークおよび定常領域の上にグラフト(「ヒト化」)する(必要に応じて非ヒト抗体由来の1つ以上のフレームワーク残基の移動を用いる)方法;(2)非ヒト可変ドメインの全体を移植するが、表面残基の置換(「表面貼り(veneering)」)により、それらをヒト様表面で「覆い隠し(cloaking)」する方法。本発明において、ヒト化抗体は、「ヒト化」抗体および「表面貼り」抗体の、両方を含む{参考文献80〜86}。CDRは、一緒になって、ネイティブ免疫グロブリン結合部位のFv領域の、結合親和性と特異性との両方を定義する、アミノ酸配列である{例えば、参考文献87および参考文献88}。
語句「定常領域」は、エフェクター機能を与える抗体分子部分を言及する。キメラ抗体において、マウス定常領域は、ヒト定常領域によって置換される。ヒト化抗体の定常領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域は、5つのアイソタイプのどれかから選ばれ得る:α、δ、ε、γまたはμ。従って、抗体は任意のアイソタイプであり得る(例えば、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE)。IgGが好ましく、これは、任意のサブクラスであり得る(例えば、IgG、IgG)。
ヒト化または完全にヒトの抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むように操作されたトランスジェニック動物を使用しても産生され得る。例えば、参考文献89は、ヒトIg遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示し、ここでこの動物は、内因性の重鎖遺伝子座および軽鎖遺伝子座の不活性化のために、機能する内因性免疫グロブリンを産生しない。参考文献90もまた、免疫原に対して免疫応答を引き起こし得るトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示し、ここで抗体は、霊長類定常領域および/または可変領域を有し、ここで内因性免疫グロブリンをコードする遺伝子座は、置換されているか、不活性化されている。参考文献91は、哺乳動物において免疫グロブリン遺伝子座を改変する(例えば、定常領域または可変領域の全てまたは一部を置換し、改変抗体分子を形成する)ための、Cre/Lox系の使用を開示する。参考文献92は、不活性化された内因性Ig遺伝子座および機能するヒトIg遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を、開示する。参考文献93は、内因性重鎖を欠失し、外来性免疫グロブリン遺伝子座(1つ以上の異種定常領域を含む)を発現する、トランスジェニックマウスを作製する方法を開示する。
上述のトランスジェニック動物を使用して、PCAVポリペプチドに対する免疫応答が生じ得、そして抗体産生細胞はこの動物から取り出されて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用され得る。免疫プロトコール、アジュバントなどは、当該分野で公知であり、例えば、参考文献94に記載されるトランスジェニックマウスの免疫において使用される。モノクローナル抗体は、対応するポリペプチドの生物学的活性または生理学的効果を阻害する能力または中和する能力について、試験され得る。
本発明は、以下を包含しないことが好ましい:(i)参考文献1において開示されるポリペプチドを認識する抗体;(ii)参考文献1の中の配列番号1〜255内のアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体;(iii)公知の抗体;(iv)2001年12月7日現在で公知の抗体(例えば、2001年12月7日よりも前に、GenBankまたはGeneSeqなどの公のデータベースにおいて入手可能な配列のポリペプチド);または(v)2002年6月10日現在で公知の抗体(例えば、2002年6月10日よりも前に、GenBankまたはGeneSeqなどの公のデータベースにおいて入手可能な配列のポリペプチド)。
(D−患者サンプルおよび正常サンプル)
(D.1.−患者サンプル)
本発明の診断方法がmRNA発現の検出に基づく場合、患者サンプルは、一般に細胞(例えば、前立腺細胞、とりわけ管腔上皮由来の前立腺細胞)を含む。これらは、組織サンプル(例えば、前立腺細胞)において存在し得るか、または(例えば、転移の間に)血液循環内に漏れている細胞であり得る。前立腺細胞を含む代わりに、または前立腺細胞を含むのと同じく、このサンプルは、PCAV mRNAを含むビリオンもまた、含み得る。
本発明の診断方法がポリペプチド発現の検出に基づく場合、患者サンプルは、細胞(好ましくは、前立腺細胞)および/もしくはビリオン(mRNAについて上述される)を含み得るか、またはPCAVポリペプチドを認識する抗体を含み得る。このような抗体は、代表的に、血液循環して存在する。
従って、一般に、患者サンプルは組織サンプルであり、好ましくは、前立腺サンプル(例えば、生検)または血液サンプルである。患者サンプルの他の可能性のある供給源としては、単離された細胞、組織全体、または体液(例えば、血液、血漿、血清、尿、胸水、脳脊髄液など)が挙げられる。別の好ましい患者サンプルは、精液サンプルである。
患者は、一般にヒトであり、好ましくはヒト男性であり、より好ましくは成人男性である。
発現産物は、患者サンプルそれ自体において検出され得るか、またはサンプル由来の物質(例えば、細胞溶解産物の上清、RNA抽出物、RNA抽出物から産生されたcDNA、RNA抽出物から翻訳されたポリペプチド、患者から抽出された細胞の培養由来の細胞、など)において検出され得る。これらは、本発明の意味の範囲内で「患者サンプル」であると考えられる。
本発明の検出方法は、インビトロまたはインビボで行われ得る。
(D.2−コントロール)
PCAV転写物は、前立腺腫瘍においてアップレギュレートされる。このようなアップレギュレーションを検出するため、参照点(reference point)(すなわち、コントロール)が代表的に必要とされる。コントロールサンプルの分析は、mRNAおよび/またはタンパク質発現の標準レベルを与え、それに対して、患者サンプルが比較され得る。しかし、PCAV転写は、正常細胞において無視し得るほど僅かであり、そして腫瘍細胞において高度にアップレギュレートされているため、参照点は常に必要というわけではない(顕著な発現は、疾患を示す)。そうであっても、コントロールの使用は、特に標準化または定量的アッセイのために、好ましい。
ネガティブコントロールは、発現のバックグラウンドレベルまたは基礎レベルを与え、これに対して、患者サンプルが比較され得る。ネガティブコントロールに対し、より高いレベルの発現産物は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。逆に、同等のレベルの発現産物は、患者がPCAV関連癌を有さないことを示す。
ネガティブコントロールは、一般に、腫瘍細胞でない細胞由来の物質を含む。ネガティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、PCAV発現がアップレギュレートされていない組織(例えば、非腫瘍非前立腺細胞)由来のサンプルであり得る。ネガティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、患者の人生のより早い段階で採取された前立腺細胞であり得る(例えば、癌が発達する前、またはBPH患者由来)。ネガティブコントロールは、前立腺腫瘍を有さない患者由来の細胞であり得、そしてこの細胞は前立腺細胞であってもなくてもよい。ネガティブコントロールは、適切な細胞株であり得る。代表的には、ネガティブコントロールは、試験される患者サンプルと同じ組織または同じ細胞型(例えば、前立腺細胞または血液サンプル)である。
ポジティブコントロールは、患者サンプルが比較され得る発現レベルを与える。ポジティブコントロールに対して同等のレベルまたはより高いレベルの発現産物は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。逆に、より低いレベルの発現産物は、患者がPCAV関連腫瘍を有さないことを示す。
ポジティブコントロールは、一般に腫瘍細胞または腫瘍を有することが知られる患者から採取した血液サンプル由来の物質を含む。ポジティブコントロールは、患者サンプルと同じ患者由来であるが、患者の人生のより早い段階で採取された前立腺腫瘍細胞であり得る(例えば、寛解をモニターするため)。ポジティブコントロールは、前立腺腫瘍を有する別の患者由来の細胞であり得る。ポジティブコントロールは、適切な前立腺細胞株であり得る。
他の適切なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールは、当業者に明らかである。
コントロールにおけるPCAV発現は、患者サンプルにおける発現と同時に評価され得る。あるいは、コントロールにおけるPCAV発現は、別々に評価され得る(先にまたは後で)。しかし、実際に2つのサンプルを比較するよりむしろ、コントロールは、絶対値(すなわち、(例えば、標準条件下で)前立腺腫瘍患者から採取されたサンプルから、経験的に決定された発現レベル)であり得る。前立腺腫瘍についてのこのようなネガティブコントロールの例としては、生涯のベースライン発現レベルまたは(例えば、健常者のプールにおいて観察される)発現レベルが、挙げられる。
(D.3−アップレギュレーションの程度)
コントロール(100%)に対するアップレギュレーションは、通常少なくとも150%(例えば、200%、250%、300%、400%、500%、600%またはそれより上)である。20〜40倍のアップレギュレーションは、珍しくない。
(E−診断方法および診断)
本発明は、患者サンプルにおいて、22番染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する、前立腺癌を診断するための方法を提供する。
(E.1−診断における使用のための産物)
本発明の診断方法における検出のために好ましい発現産物は、上述のセクションB.1、セクションB.3およびセクションC.3において記載される。
本発明の診断方法における使用のために好ましい試薬は、上述のセクションB.4、セクションC.3およびセクションC.4において記載される。
本発明の診断方法における使用のために好ましいキットは、上述のセクションB.5において記載される。
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体を、診断における使用のために提供する。
本発明はまた、診断アッセイの作製における、本発明の核酸、ポリペプチドおよび抗体の使用も、提供する。
(E.2−本発明のmRNAベースの方法)
本発明は、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法を提供する:(a)患者サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸と接触させる工程;および(b)患者サンプルにおいて、患者サンプル中に存在する核酸への、本発明の核酸のハイブリダイゼーションの、存在または非存在を検出する工程。工程(b)におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する:(a)サンプル中のmRNAを、DNAと比較して富化し、mRNA富化サンプルを与える工程;(b)mRNA富化サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸と接触させる工程;および(c)mRNA増強サンプルにおいて存在するmRNAへの、本発明の核酸のハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程。工程(c)におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。工程(a)における富化は、DNAの抽出を伴わないmRNA抽出、mRNAの除去を伴わないDNA除去、またはPCAV mRNAの破壊を伴わないPCAV DNAの破壊、などの形を採り得る(上述のセクションB.2を参照)。
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する:(a)サンプル中のmRNAのDNAコピーを調製する工程;(b)DNAコピーを、ハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸と接触させる工程;および(c)このDNAコピーに対する本発明の核酸のハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程。工程(c)におけるハイブリダイゼーションの存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。工程(a)におけるDNAの調製は、PCAVに対して特異的(例えば、適切なプライマーを用いたRT−PCRの使用による)または非特異(例えば、細胞性cDNAの調製)であり得る。
患者サンプルを分析する上述の方法において、サンプルと接触した本発明の核酸は、本発明のプローブであり得る。あるいは、この核酸は、本発明のプライマーを含み得、この場合、本方法の関連工程は一般に、2回以上(例えば、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれより多く)の増幅サイクルを含む。プライマーが使用される場合、本方法は、増幅されたDNAに対するハイブリダイゼーションを検出するためのプローブの使用を含み得る。
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者サンプルを分析するための方法も提供する:(a)サンプル中の任意のPCAV核酸標的を増幅する工程;および(b)増幅された標的の存在または非存在を検出する工程。工程(b)における増幅された標的の存在は、サンプルが採取された患者が、前立腺腫瘍を有することを示す。
本発明のこれらの方法は、定性的、定量的または半定量的であり得る。
(E.3−本発明のポリペプチドベースの方法)
本発明は、患者サンプルを、本発明のポリペプチドまたは抗体と接触させる工程を包含する、前立腺癌を診断するための免疫アッセイ法を提供する。
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者の血液サンプルを分析するための方法も提供する:(a)血液サンプルを、本発明のポリペプチドと接触させる工程;および(b)上述のサンプルにおいて、上述のポリペプチドと抗体との間の相互作用の、存在または非存在を検出する工程。工程(b)における相互作用の存在は、血液サンプルが採取された患者が、抗PCAV抗体を惹起していること、従ってこの患者が前立腺腫瘍を有することを示す。工程(a)は、血液サンプルにおける抗体が富化される工程より、前であり得る。
本発明はまた、以下の工程を包含する、患者のサンプルを分析するための方法も提供する:(a)サンプルを、本発明の抗体と接触させる工程;および(b)上述の抗体と上述のサンプルとの間の相互作用の、存在または非存在を検出する工程。工程(b)における相互作用の存在は、サンプルが採取された患者がPCAVポリペプチドを発現すること、従ってこの患者が前立腺腫瘍を有することを示す。工程(a)は、サンプル中の細胞が溶解されるかまたは透過処理される工程、および/またはサンプル中のポリペプチドが富化される工程より、前であり得る。
本発明のこれらの方法は、定性的、定量的、または半定量的であり得る。
上述の方法は、インビボの使用に適合され得る(例えば、腫瘍細胞が存在する位置を確認または同定する)。これらの実施形態において、標的PCAVポリペプチドに特異的な抗体が、個体に投与され得(例えば、注射によって)、そしてこの抗体は、標準的画像化技術(例えば、磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影走査法など)を使用して位置確認される。適切な標的(例えば、スピン標識など)が、使用される。これらの技術を使用して、癌細胞が、別々に標識される。
他のインビボ方法は、PCAVポリペプチドを機能的に検出し得る。例えば、レポーター遺伝子(例えば、GFPのような蛍光タンパク質)と操作可能に連結されるPCAV LTRを有する構築物は、ネイティブなPCAVポリペプチドと平行して発現される。
免疫アッセイの感度を増加させるため、抗PCAV抗体に結合する二次抗体を使用し、その二次抗体によって標識が保持されることが可能である。
(E.4−「診断」の意味)
本発明は、前立腺癌を診断する方法を提供する。本発明に記載の「診断」は、疾患の明確な臨床診断から、患者が可能となるさらなる検査を受けて明確な診断に至り得る徴候の範囲にわたり得る。例えば、本発明の方法は、スクリーニングプロセスとして使用され得、ポジティブサンプルはさらなる分析に供される。
その上、診断は、既に癌を有していると分かっている患者における、癌の進行をモニターする工程を含む。癌はまた、本発明の方法により、段階付けされる。好ましくは、この癌は、前立腺癌である。
関連する癌の処置レジメンの効能(セラメトリックス(therametrics))もまた、本発明の方法により、モニターされ得る(例えば、その効能の決定)。
癌に対する感受性もまた、検出され得る(例えば、癌が発現する前であるが、発現のアップレギュレーションが起こった場合)。予後診断法もまた、包含される。
これらの技術の全ては、本発明における「診断」の一般的な意味の中に入る。
(F−薬学的組成物)
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体を含む、薬学的組成物を提供する。本発明はまた、その医薬品としての使用、および前立腺癌を標的するための医薬品の製造における使用も、提供する。本発明はまた、動物(例えば、患者)に、核酸またはポリペプチドの免疫原性用量を投与する工程を包含する、免疫応答を惹起するための方法を提供する。
本発明によって包含される薬学的組成物は、活性薬剤として、本明細書中で開示される本発明の核酸、ポリペプチド、または抗体を、治療有効量で含む。「有効量」は、有益な効果または望ましい結果(臨床的結果を含む)に充分な量である。有効量は、1回以上投与され得る。本発明の目的について、有効量は、前立腺癌の症状および/または進行を、緩和、改善、安定化、退行、鈍化または遅延するために充分な量である。
本組成物は、癌および原発性の癌の転移を処置するために使用され得る。加えて、この薬学的組成物は、癌処置の従来技術(例えば、腫瘍の、放射能または従来の化学療法に対する感作)と組み合わせて使用され得る。用語「処置」「処置すること」「処置する」などは、本明細書中で、一般に、望ましい薬理学的効果および/または物理的効果を得ることを言及する。この効果は、疾患もしくはその兆候の、完全な予防もしくは部分的な予防の意味で、予防効果であり得、そして/あるいは疾患もしくはその兆候の、部分的な安定化もしくは治癒、または完全な安定化もしくは治癒の意味で、治療効果であり得、そして/あるいは疾患に起因する悪影響であり得る。「処置」は、本明細書中で使用される場合、哺乳動物(特にヒト)における疾患の任意の処置を包含し、以下を含む:(a)疾患または症状に対して罹患しやすくなっているが、まだ疾患を有するとは診断されていない被験体における、疾患または症状の発生の予防;(b)疾患の症状の阻害(すなわち、その進行の妨害);または(c)疾患症状の軽減(すなわち、疾患また症状派における後退)。
薬学的組成物が、差次的に発現される核酸によってコードされる遺伝子産物に特異的に結合する抗体を含む場合、この抗体は、処置部位への送達のために薬物に結合され得るか、または癌細胞(例えば、前立腺癌)を含む部位の画像化を容易にするために検出可能標識と結合され得る。抗体を、薬物および検出可能標識と結合させる方法は、検出可能標識を用いて画像化する方法として、当該分野において周知である。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、望ましい疾患もしくは状態を、処置するか、改善するか、もしくは予防するための治療薬剤の量、または検出可能な治療効果または予防効果を示す治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、化学マーカーまたは抗原レベルによって検出される。治療効果はまた、身体的症状の低減を含む。被験体のための正確な有効量は、被験体の大きさおよび健康状態、性質および症状の程度、ならびに投与のために選択された治療または治療の組み合わせに依存する。所定の条件についての有効量は、慣用実験によって決定され、そして臨床家の判断の範囲内である。本発明の目的のために、有効用量は、一般に、投与される個体における、本発明の組成物の約0.01mg/kg〜約5mg/kg、約0.01mg/kg〜約50mg/kg、約0.05mg/kg〜約10mg/kgである。
薬学的組成物はまた、薬学的受容可能キャリアも、含み得る。用語「薬学的受容可能キャリア」は、治療薬剤(例えば、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬剤)の投与のためのキャリアをいう。この用語は、それ自体はその組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘発せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、大きく、ゆっくりと代謝されるマクロ分子(例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性化ウイルス粒子など)であり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。治療組成物中の薬学的受容可能キャリアとしては、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられる。例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助物質もまた、このような賦形剤の中に存在し得る。代表的には、治療組成物は、注射可能であるように溶液または懸濁液のいずれかとして調製され;注射前に液体賦形剤中に溶解または懸濁するのに適した固体形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的受容可能キャリアの定義の中に含まれる。薬学的に受容可能な塩(例えば、塩酸塩、臭酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロネート、ベンゾエートなどの有機酸の塩)もまた、薬学的組成物内に存在し得る。薬学的受容可能賦形剤の一通りの議論は、参考文献95において入手可能である。
この組成物は、好ましくは、滅菌され、かつ/または発熱物質を含まない。これは、代表的には、約pH7に緩衝される。
一旦処方されると、本発明によって企図されるこの組成物は、(1)被験体に直接投与され得る(例えば、核酸、ポリペプチド、低分子アゴニストまたは低分子アンタゴニストなど);または(2)被験体由来の細胞に、(例えば、エキソビボ遺伝子治療法において)エキソビボで送達され得る。組成物の直接送達は、一般に、非経口(例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内、腫瘍内、または組織の間隙空間)の注射によって達成される。投与の他の様式としては、経口または肺の投与、坐剤、および経皮投与、針、および遺伝子ガンまたはハイポスプレー(hypospray)が挙げられる。投薬処置は、単回投薬計画または多投薬計画であり得る。
被験体へのエキソビボ送達および形質転換細胞の再移植のための方法は、当該分野で公知である{例えば、参考文献96}。エキソビボ投与において有用な細胞の例としては、例えば、幹細胞、特定の造血(hematopoetic)細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または腫瘍細胞が挙げられる。一般に、エキソビボ投与およびインビトロ投与の両方のための核酸の送達は、例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン(polybrene)媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気泳動、リポソームへの核酸の封入、および核へのDNAの直接微量注入などによって達成され、これらは全て当該分野で公知である。
PCAV核酸の差次的な発現は、前立腺癌と相関することが見出されている。腫瘍は、所与の核酸、関連するポリペプチド、または他の関連分子(例えば、アンチセンス、リボザイムなど)に基づく治療薬剤の投与により、治療され得る。他の実施形態において、この障害は、低分子薬物の投与による治療に対して影響を受けやすく、この低分子薬物は、例えば、正常細胞と比較して、癌細胞において発現が増加している遺伝子の、コードされる遺伝子産物の機能のインヒビター(アンタゴニスト)として寄与するか、または癌細胞において発現の減少した遺伝子産物のアゴニストとして寄与し得る(例えば、腫瘍抑制因子として作用する遺伝子産物の活性を促進する)。
発明された薬学的組成物の用量および投与の手段は、治療組成物の特別な性質、患者の症状、年齢、および体重、疾患の進行、ならびに他の関連因子に基づいて決定される。例えば、核酸治療組成物薬剤の投与は、局所的投与または全身投与(注射、経口投与、粒子ガンまたはカテーテル挿入投与、および局所投与が挙げられる)を含む。好ましくは、治療核酸組成物は、本発明の核酸に作動的に連結する、プロモーターを含む発現構築物を含有する。種々の方法が、治療組成物を、直接、体内の特定部位に投与するために、使用され得る。例えば、小さな転移病変が、位置確認され、そして治療組成物が、幾度か、腫瘍体内の幾つかの異なった位置に、注射される。あるいは、腫瘍に寄与する動脈が同定され、そして治療組成物がこのような動脈に注射され、それにより、腫瘍内に直接組成物を送達する。壊死性中心を有する腫瘍が吸引され、組成物が直接、腫瘍の穴のあいた中心に注射される。アンチセンス組成物は、腫瘍の表面に直接的に(例えば、組成物の局所投与により)投与される。X線画像法が、上述の送達方法のいずれかにおいて補助するために使用され得る。
アンチセンス核酸、サブゲノム核酸、または特定の組織に対する抗体を含む治療組成物の標的化された送達もまた、使用され得る。レセプター媒介性DNA送達技術は、例えば、参考文献97〜102において記載される。核酸を含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコールにおける局所的投与について、約100ng〜約200mgの範囲で投与される。約500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μg、および約20μg〜約100μgのDNAの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコールの間に、使用され得る。作用方法(例えば、コードされる遺伝子産物のレベルの増大または阻害)ならびに形質転換および発現の効力などの因子は、アンチセンスサブゲノム核酸の最大効能に必要な用量に影響を及ぼす。より多い発現が、組織のより大きな領域にわたって求められる場合、より多い量のアンチセンスサブゲノム核酸、もしくは引き続きの投与プロトコールにおける同量の再投与、または例えば、腫瘍部位の、隣もしくは近くの異なった組織部分への幾度かの投与が、ポジティブな治療成果を生じるために必要とされ得る。全ての場合において、臨床試験における慣用実験が、最適な治療効果のための特異的な範囲を決定する。
本発明の治療核酸および治療ポリペプチドは、遺伝子送達媒介物を使用して、送達され得る。この遺伝子送達媒介物は、ウイルス起源または非ウイルス起源であり得る(一般に、参考文献103、104、105および106を参照のこと)。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るかまたは制御され得る。
望ましい核酸の送達および望ましい細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当業者に周知である。ウイルスベースの媒介物の代表例としては、組換え体レトロウイルス(例えば、参考文献107〜117を参照)、αウイルスベースのベクター(例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス(Semliki forest virus)(ATCC VR−67;ATCC VR−1247)、ロスリバー熱ウイルス(Ross River virus)(ATCC VR−373;ATCC VR−1246)およびベネズエラウマ脳炎ウイルス(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR−923;ATCC VR−1250;ATCC VR 1249;ATCC VR−532))、アデノウイルスベクター、およびアデノ関連ウイルス(AAV)ベクター(例えば、参考文献118〜123を参照)などが挙げられるが、これらに限定されない。殺傷されたアデノウイルスに連結するDNAの投与{参考文献124}もまた、使用され得る。
非ウイルス送達の媒介物および方法もまた、使用され得、これらとしては、死滅したアデノウイルス単独に連結または非連結のポリカチオン圧縮DNA{例えば、参考文献124}、リガンド連結DNA{参考文献125}、真核細胞送達媒介細胞{例えば、参考文献126〜130}、および核電荷中和または細胞膜との融合が挙げられるが、これらに限定はされない。裸のDNAもまた、使用され得る。代表的な裸のDNA誘導法は、参考文献131および参考文献132において記載される。遺伝子送達媒介物として作用し得るリポソームは、参考文献133〜137に記載される。さらなるアプローチは、参考文献138および参考文献139において記載される。
使用のために適切なさらなる非ウイルス送達は、参考文献139に記載されるアプローチのような、機械的送達系を誘導する。その上、コード配列およびその発現の産物は、光重合ヒドロゲル物質の沈殿または電離放射線を通して送達され得る{例えば、参考文献140および141}。コード配列の送達に使用され得る、遺伝子送達のための他の従来法としては、例えば、手のひらに乗る大きさの遺伝子転移粒子ガン{参考文献142}、または活性化転移遺伝子の電離放射線{140および141}の使用が挙げられる。
(ワクチン組成物)
薬学的組成物は、好ましくは免疫原性組成物であり、そしてより好ましくは、ワクチン組成物である。このような組成物は、哺乳動物(例えば、ヒト)において抗体を惹起するために使用され得る。
この組成物は、さらにアジュバントを含み得る。例えば、この組成物は、1つ以上の以下のアジュバントを含み得る:(1)水中油型乳剤処方物(ムラミルペプチド(muramyl peptide)(以下を参照)のような他の特異的免疫刺激剤または細菌細胞壁成分を含有または非含有)(例えば、(a)マイクロフルイダイザー(microfluidizer)を使用してサブミクロン粒子にまで処方された、5%セクアリン、0.5% Tween 80、および0.5% Span 85 を含有の(必要に応じてMTP−PEを含有する)MF59TM{参考文献143;参考文献144第10章}、(b)10%セクアリン、0.4% Tween 80、5% プルロン遮断(pluronic−blocked)ポリマー L121、およびサブミクロンの乳剤に微小液化されたか(microfluidized)またはボルテックスされてより大きな粒子の大きさの乳剤に生成したthr−MDPを含有するSAF、および(c)2%セクアリン、0.2% Tween 80、およびモノホスホルリン酸A(MPL)、トレハロースジミコレート(trehalose dimycolate)(TDM)、および細胞壁骨格(CWS)からなる群からの1つ以上の細菌細胞壁成分(好ましくはMPL+CWS(DetoxTM))を含有するRibiTMアジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem,Hamilton,MT)など);(2)QS21またはStimulonTM(Cambridge Bioscience,Worcester,MA)のようなサポニンアジュバントが使用され得るか、またはISCOM(免疫刺激性複合体)(ISCOMがさらなる界面活性剤を欠く場合)のようなそこから産生される粒子{参考文献145};(3)フロイント完全アジュバント(CFA)およびフロイント不完全アジュバント(IFA);(4)インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12など)のようなサイトカイン、インターフェロン(例えば、γインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、など;(5)モノホスホリルリン酸A(MPL)または3−O−デアシル化 MPL(3dMPL){例えば、参考文献146、147};(6)3dMPLと、例えば、QS21および/または水中油型乳剤との組み合わせ{例えば、参考文献148、149、150};(7)必要に応じて5メチルシトシンをシトシンの位置に用いた、CpGモチーフを含むオリゴヌクレオチド(すなわち、少なくとも1つのCGジヌクレオチドを含む);(8)ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル{参考文献151};(9)オクトキシノールと組み合わせられたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤{参考文献152}または、少なくとも1つのさらなる非イオン性界面活性剤(例えば、オクトキシノール)と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル{参考文献153};(10)免疫刺激性オリゴヌクレオチド(例えば、CpGオリゴヌクレオチド)およびサポニン{参考文献154};(11)免疫刺激剤および金属塩の粒子{参考文献155};(12)サポニンおよび水中油型乳剤{参考文献156};(13)サポニン(例えば、QS21)+3dMPL+IL−12(必要があれば+ステロール){参考文献157}、(14)アルミニウム塩(好ましくは水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムだが、任意の他の適切な塩もまた使用され得る(例えば、ヒドロキシリン酸塩、オキシ水酸化物、オルトリン酸塩、硫酸塩など{参考文献144の第8章および9章})。異なったアルミニウム塩の混合物もまた、使用され得る。この塩は、任意の適切な形態を取り得る(例えば、ゲル、結晶性、非結晶性など));(15)キトサン;(16)コレラ毒素またはE.coli不安定毒素、またはこれらの無毒化変異体{参考文献158}、(17)ポリ(a−ヒドロキシ)酸(PLGなど)の微小粒子;(18)免疫刺激剤として作用し、組成物の効能を増強する他の薬剤。アルミニウム塩および/またはMF59TMが、好ましい。
本発明のワクチンは、予防ワクチン(すなわち、疾患を防ぐため)または治療ワクチン(すなわち、疾患の兆候を減少させるかまたは消失させるため)であり得る。
効能は、本発明の組成物投与後に、本発明の核酸および/またはポリペプチドの発現をモニターすることにより、試験され得る。
(G−スクリーニング方法および薬物設計)
本発明は、以下の工程を含む、癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する:試験化合物を、PCAV発現がアップレギュレートされている細胞または細胞株に由来する組織サンプルと接触させる工程;およびサンプル中のPCAV発現をモニターする工程。発現の減少は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
本発明はまた、以下の工程を含む、前立腺癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する:試験化合物を本発明の核酸またはポリペプチドと接触させる工程;および試験化合物と核酸/ポリペプチドとの間の結合相互作用を検出する工程。結合相互作用は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
本発明はまた、以下の工程を含む、前立腺癌に対する活性を有する化合物のスクリーニングの方法を提供する:試験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる工程;およびポリペプチドの機能をアッセイする方法。ポリペプチドの機能の阻害(例えば、プロテアーゼ活性の喪失、RNAエクスポートの喪失、逆転写酵素活性の喪失、エンドヌクレアーゼ活性の喪失、インテグラーゼ活性の喪失など)は、試験化合物の抗癌効能の可能性を示す。
代表的な試験化合物としては、ペプチド、ペプトイド、タンパク質、脂質、金属、ヌクレオチド、ヌクレオシド、有機低分子、抗生物質、ポリアミン、ならびにこれらの組み合わせおよび誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。有機低分子は、50ダルトンより多く約2,500ダルトン未満(より好ましくは、約300ダルトン〜約800ダルトン)の分子量を有する。物質の複合混合物(天然産物を含む抽出物など)または混合コンビナトリアル合成の産物もまた、試験され得、そして標的RNAに結合する成分は、その後の工程において、混合物から抽出され得る。
試験化合物は、合成化合物または天然化合物の大ライブラリーから誘導され得る。例えば、合成化合物ライブラリーは、Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)またはArdrich(Milwaukee,WI)から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、使用され得る。さらに、試験化合物は、個々の化合物または混合物のどちらかのコンビナトリアル化学を使用して、合成的に産生され得る。
本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、任意の当該分野で公知の利用可能な技術(シグナル伝達、抗体結合、レセプター結合、マイトジェンアッセイ、化学走性アッセイなど)を使用してスクリーニングされ得る。アッセイ条件は、理想的には、ネイティブの活性が、インビボで示される条件(すなわち、生理学的なpH、温度、およびイオン強度)と類似するべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体における毒性副作用を引き起こさない濃度で、ネイティブの活性の強い阻害または増強を示す。ネイティブなポリペプチドへの結合について競合するアゴニストまたはアンタゴニストは、ネイティブな濃度と同等以上の濃度を必要とし得る。一方、ポリペプチドに不可逆に結合し得るインヒビターが、およそネイティブの濃度で加えられ得る。
このようなスクリーニングおよび実験は、PCAVポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの同定を導き得る。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、PCAV発現および/またはPCAV機能を調節するか、増強するか、または阻害するために使用され得る{159}。
本発明は、本発明のポリペプチドを使用して、結合する能力またはPCAVポリペプチドの活性を調節(例えば、阻害)する能力について化合物をスクリーニングし、これにより、例えばPCAVポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得る化合物を同定する方法に関する。1つのスクリーニングアッセイにおいて、PCAVポリペプチドは、試験化合物の存在下または非存在下において、PCAVの増殖刺激活性に感受性の細胞と共にインキュベートされる。試験化合物を改変し得るかまたは結合し得るPCAV活性の可能性が、測定される。次いで、細胞の増殖が決定される。試験サンプルにおける細胞増殖の減少は、この試験化合物がPCAVポリペプチドに結合し、それによって不活性化するか、またはさもなくば、PCAVポリペプチド活性を阻害することを示す。
PCAV遺伝子を過剰発現するように形質転換されているトランスジェニック動物(例えば、げっ歯類)を使用して、PCAV過剰発現から生じた腫瘍の発達を阻害する能力について、インビボで化合物をスクリーニングし得るか、または一旦発達したこのような腫瘍を処置し得る。侵襲性または悪性の可能性を高められた前立腺腫瘍を有するトランスジェニック動物は、PCAVポリペプチドの効果を阻害する能力についての化合物(抗体またはペプチドを含む)のスクリーニングに使用され得る。このような動物は、例えば、本明細書中の実施例において記載されるように、産生され得る。
上述のようなスクリーニング手順は、前立腺癌処置における薬理学的介入ストラテジーにおける使用可能性についての、薬剤の同定のために、有用である。さらに、PCAVに対応する核酸配列(LTRを含む)は、高められた遺伝子発現の阻害をアッセイするために使用され得る。
PCAV mRNAに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、このポリペプチドの発現を、選択的に低減し得るか、またはこのポリペプチドの発現を与え得る。より詳細には、アンチセンス構築物、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺腫瘍細胞において、PCAVポリペプチドの産生を阻害するために使用され得る。アンチセンスmRNAは、標的癌細胞への発現ベクターの移動によって産生され得、そして本発明のPCAV核酸は、PCAV−mRNA転写の方向に対してアンチセンス方向に方向付けられる。適切なベクターとしては、ウイルスベクター(レトロウイルスベクターを含む)および非ウイルスベクターが挙げられる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞内に直接導入され、同じ目標を達成し得る。オリゴヌクレオチドは、最高レベルの特異性を達成し、そして、例えば、開始ATGでPCAV−mRNAに結合するように、選択/設計され得る。
PCAVポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、このポリペプチドの作用をブロックし、それによって癌細胞の増殖を制御するために使用され得る。これは、PCAVポリペプチドに結合する抗体の注入により、その作用をブロックすることによって、達成され得る。
本発明はまた、本発明の核酸またはポリペプチドに結合する化合物を同定するための、ハイスループットスクリーニング方法を提供する。好ましくは、このアッセイのための全ての生化学工程は、例えば試験管またはマイクロタイタープレート内で、単一の溶液中で行われ、そして、この試験化合物は、最初に単一の化合物濃度で分析される。ハイスループットスクリーニングの目的のため、実験条件は、スクリーニングされた化合物全体の中から「ポジティブ」化合物として同定された試験化合物の割合を達成するように調整される。このアッセイは、好ましくは、標的に対して感知し得る親和性を有する化合物を同定するように設定される(例えば、大化合物ライブラリー由来の総試験化合物の0.1%〜1%が、所定の標的に10μM以下(例えば、1μM、100nM、10nM以下)のKで結合することが示される場合)。
(H−定義)
用語「含む」は、「含有する」および「構成する」ことを意味する(例えば、Xを「含む」組成物は、独占的にXからのみ構成され得るか、または何らかの追加を含み得る(例えば、X+Y))。
用語「約」は、数値xに関する場合、例えば、x±10%を意味する。
用語「腫瘍性細胞」、「新形成細胞」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「癌」および「癌細胞」(交換可能に使用される)は、比較的自立的に増殖し、従って細胞増殖制御の有意の喪失により特徴付けられる、異常な増殖発現型(すなわち、細胞分裂の無制御)を示す細胞を言及する。腫瘍性細胞は、悪性または良性であり得、前立腺癌由来組織を含む。
語「実質的に」は、「完全に」を除外しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要な場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
(本発明を実行するための様式)
本発明の特定の局面は、以下の非限定的な実施例でより詳しく記載される。これらの実施例は、本発明を作製し使用する方法の開示および記載を、当業者に提供するために示される。これらの実施例は、本発明者らがその発明として認識する範囲を制限することを意図しないし、以下の実験が、行われる全てまたは唯一の実験であることを、表すことも意図しない。使用された数字(例えば、量、温度など)に関し、正確さを確実にするための努力がなされているが、ある程度の実験的エラーおよび偏位が、考慮されるべきである。他に示されない限りは、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、そして圧力は大気圧かその近傍である。
(ヒト前立腺細胞サンプルの供給源およびそれによって発現される核酸の単離)
癌において差次的に発現される遺伝子を表わし得る候補核酸を、公に利用可能な供給源ならびに選択した細胞株および患者組織から産生したcDNAライブラリーから得た。標準化cDNAライブラリーを、1人の患者の腫瘍組織から調製し、マイクロアレイ上にスポットするためのクローニングした核酸を、このライブラリーから単離した。100人の患者由来の正常組織および腫瘍組織を、T7 RNAポリメラーゼ転写核酸を産生するために処理し、次いで、マイクロアレイにおいて発現を評価した。
標準化:標準化の目的は、特定の細胞型または組織において発現される全ての転写産物が等しく表される、cDNAライブラリーを産生することである{参考文献160および161}。従って、最適に標準化されたライブラリーにおける、30,000個ほどの少量の組換え体クローンの単離が、細胞の遺伝子発現レパートリー(1細胞あたり10,000個と推定される)全体を表し得る。標準化前立腺ライブラリーを産生するための供給源物質は、Gleason等級3+3の腺癌を有する患者、および医学的サーベイランス下で危険のある被験体プールからの正常前立腺生検に由来する、凍結保存した前立腺腫瘍組織であった。前立腺上皮を、レーザー捕捉微小解剖法(laser capture microdissection)(LCM,Arcturus Engineering Inc.,Mountain View,CA)によって組織の凍結切片から直接回収し、当該分野で周知の方法(例えば、参考文献162)に従って行い、実質的に相同な細胞サンプルを提供した。
全RNAを、LCM回収細胞から、RNeasyTMProtect Kit(Qiagen,Valencia,CA)を用い、製造者の推奨手順に従って、抽出した。RNAを、RiboGreenTMRNA quantification kit(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)を使用して、定量した。全RNAの1μgを、SMARTTM PCR cDNA合成キット(ClonTech,Palo Alto,CA)を使用して逆転写し、PCR増幅した。そのcDNA産物を、アガロースゲル電気泳動法により、標準的手段(参考文献21)を使用して、大きさにより選択した。cDNAを、Bio101 Geneclean(登録商標)IIキット(Qbiogene,Carlsbad,CA)を用いて、抽出した。cDNAの標準化を、以下のハイブリダイゼーション原則の動態学を使用して実行した: cDNAの1.0μgを100℃で10分間熱変性し、次いで、42℃で42時間、120mM NaCl、10mM Tris.HCl(pH=8.0)、5mM EDTA.Naおよび50%ホルムアミドの存在下で、インキュベートした。一本鎖cDNA(「標準化」cDNA)を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー(#130−0520,BioRad,Hercules,CA)により、製造者の推奨手順に従って精製し、3サイクルのPCR増幅により、増幅して、2本鎖cDNAに転換し、そして標準的手順(参考文献21)を用いて、プラスミドベクター内にクローン化した。標準化およびクローニング過程において使用した全てのプライマー/アダプターは、SMARTTM PCR cDNA合成キット(ClonTech,Palo Alto,CA)において、製造者によって提供される。スーパーコンピテント(supercompetent)細胞(XL−2 Blue Ultracompetent Cells,Stratagene,California)を標準化cDNAライブラリーでトランスフェクトし、固体媒地上にプレートし、36℃で一晩増殖させた。
標準化ライブラリーの特徴づけ:ライブラリーにつき10,000配列の組換え体を、ABI PRISM 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems,California)を使用して、キャピラリー配列決定法により分析した。ライブラリーにおける転写物の提示を決定するため、クローンの配列上でBLAST分析を行い、それぞれの単離されたクローンに転写同一性を割り当てた。すなわち、単離された核酸の配列を、XBLASTマスキングプログラムを使用して、最初にマスクして、低複雑性配列を除去した(参考文献163、164および165)。一般に、マスキングは、比較的小さな目的配列を、それらの複雑性の低さに起因して除去すること、および多くの配列に共通の、くり返し領域(例えば、Aluリピート)の類似性に基づいて多くの「ヒット(hit)」を除去すること以外は、最終検索結果に影響しない。次いで、残った配列を、BLASTN 対 GeneBankの検索に使用した。これらの配列をまた、BLASTX 対 NRP(重複性タンパク質)データベース検索の問い合わせ配列としても使用した。
自動化配列決定反応を、AmpliTaq DNA Polymerase,FSを含む、Perkin−Elmer PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitを用いて、製造業者の指示に従って行った。この反応サイクルを、GeneAmp PCR System 9600において、20℃または30℃で1分間アニールさせることを除いては、製造業者の指示に従って行った。配列決定反応物をエタノール沈殿させ、ペレットを8μlの泳動緩衝液中に再懸濁し、1.5μlを配列決定ゲル上で泳動し、そしてデータをABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems,Foster City,CA)によって集計した。
ライブラリーにおいて配列が表わされる回数は、クローニングされたcDNA配列の配列相同性分析を行い、それぞれの単離されたクローンに対する転写同一性を割り当てることにより、決定される。まず、各配列を、それがミトコンドリア、細菌またはリボソームの夾雑物でないかどうかを見るために調べた。このような配列を、その後の分析から除外した。次に、配列人工産物(例えば、ベクターおよび反復要素)をマスクし、そして/またはそれぞれの配列から取り除いた。
残った配列を、BLAST{166}によってGeneBankおよびESTデータベースと遺伝子同定のために比較し、そして配列同士をFastA{167}によって比較して、標準化cDNAライブラリーにおけるcDNA出現の頻度を計算した。配列を、BLASTNプログラム(BLASTN 1.3MP{166})を用いて、GeneBankヌクレオチドデータベースおよびGeneSeqヌクレオチドデータベースに対してもまた検索した。次に、配列を重複性タンパク質(NRP)データベースに対して、BLASTXプログラム(BLASTX 1.3MP{166})を用いて分析した。このタンパク質データベースは、Swiss−Prot、PIR、およびNCBI GenPeptタンパク質データベースの組み合わせである。BLASTXプログラムを、初期BLOSUM−62置換行列を、フィルターパラメータ(filter parameter)「xnu+seg」を用いて実行した。使用したスコア限界(score cutoff)は、75である。
重複クローンのコンティーグ内へのアセンブリを、プログラムSequencher(Gene Codes Corp.;Ann Arbor,Mich.)を使用して、行った。アセンブルしたコンティーグを、GCGパッケージ(Genetic Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53711)Suite Version 10.1内のプログラムを使用して分析した。
(アレイを使用した、前立腺癌に付随する高められたcDNAのレベルの検出)
前立腺癌における異なった発現についてスクリーニングされる種々の候補遺伝子を表すcDNA配列を、核酸アレイ上のハイブリダイゼーションにより、アッセイした。このcDNA配列は、上記のような細胞株または組織から単離されたcDNAクローンを含んだ。分析されたcDNA配列もまた、Unigeneデータベースの配列と重複する配列を含む核酸(種々の起源、種々の機能、および種々の特徴付けのレベルの多様な遺伝子産物をコードする)を含んだ。cDNAを、当該分野で周知である方法に従って、スライド1枚あたり9,216スポットの密度で二連でスポッティングされた4608の配列(コントロールを含む)を表す、およそ200ng/μlのcDNA溶液のおよそ0.8μl用いて、反射スライド(Amersham)上にスポットした。
目的の遺伝子産物に対応する選択されたcDNAクローンのPCR産物を、50%DMSO溶液中で調製した。これらのPCR産物を、Amershamアルミニウムマイクロアレイスライド上に、Molecular Dynamics Generation IIIスポッティングロボットを使用して、スライド1枚あたり9216クローンの密度でスポットした。クローンを二連でスポットし、1アレイあたり4608の異なる配列を得た。
cDNAプローブを、上記の患者から単離された腫瘍組織サンプルおよび正常組織サンプルのレーザー捕捉微小解剖法(LCM,Arcturus Enginering Inc.,Mountain View,CA)により、得た総RNAから調製した。
総RNAを、まずT7 RNAポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用してcDNAに逆転写し、第2鎖DNA合成を続けた。cDNAを、次いでインビトロ転写し、T7プロモーター媒介発現(例えば、参考文献168)を使用してアンチセンスRNAを産生し、次いでこのアンチセンスRNAを、cDNAに変換した。cDNAの第2の組を、T7プロモーターを使用して再びインビトロで転写し、アンチセンスRNAを得た。次いで、このアンチセンスRNAを、蛍光標識するか、またはこのRNAを再びcDNAに変換し、3回目のT7媒介増幅を行って、より多くのアンチセンスRNAを産生した。従って、この手順は、2回または3回のインビトロ転写を提供して、蛍光標識のために使用される最終RNAを産生した。プローブを、RNA出発物質から蛍光標識cDNAを作製することにより、標識した。腫瘍RNAサンプルから調製した蛍光標識cDNAを、正常細胞RNAサンプルから調製した蛍光標識cDNAと比較した。例えば、正常細胞由来のcDNAプローブを、Cy3蛍光色素(緑色)で標識し、そして腫瘍細胞から調製したcDNAプローブを、Cy5蛍光色素(赤色)で標識した。
差次的発現アッセイを、同じ患者の腫瘍細胞由来のプローブと正常細胞由来のプローブとの等量の混合により、行った。アレイを、60℃で約2時間、5×SSC/0.2% SDS/1mM EDTA中でのインキュベーションによりプレハイブリダイゼーションし、次いで、水中で3回およびイソプロパノールで2回、洗浄した。アレイのプレハイブリダイゼーション後、プローブ混合物を、高ストリンジェンシー条件下(一晩、42℃で、50%ホルムアミド、5×SSC、および0.2%SDS中)でアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、アレイを、55℃で3回、以下:1)第1洗浄を1×SSC/0.2%SDS中で;2)第2洗浄を0.1×SSC/0.2%SDS中で;そして3)第3洗浄を0.1×SSC中で、のように洗浄した。
次いでこのアレイを、Molecular Dynamics Generation III二色レーザー走査機/検出機を使用して、緑色および赤色の蛍光について走査した。画像を、BioDiscovery Autogeneソフトウェアを使用して処理し、それぞれの走査の組から得たデータを標準化した。実験を繰り返し、今回、両対照色を用いた2つのプローブの標識により、両方の「色方向」におけるアッセイを行った。時々、各実験を、2枚以上のスライドを用いて繰り返した(それぞれの色方向に1枚)。各走査から得たデータを標準化し、アレイ上のそれぞれの配列についての蛍光のレベルを、4枚のアレイから得た8複製スポット/遺伝子もしくは2枚のアレイから得た4複製スポット/遺伝子または他の順列の比率の幾何平均として表わした。
前立腺腫瘍組織を使用して、高められたシグナルを与えることが見出されるアレイの特徴を、配列決定し、ヒトゲノム配列にマッピングした。高められたアレイスポット特徴は、PCAVの約90%におよび、このような11の配列のPCAVゲノム上の位置は、図9において、個々のアレイの特徴のコードである5桁の数で示される。
11の高められた配列のうち幾つかは、ゲノム内のHERV−K HML2.0ファミリーの中の高度に保存された領域に由来し、従って第22染色体中の20.428メガベースにおけるウイルスに特異的ではないが、他のスポットはそうではない。
(配列27378)
27378(配列番号14)は、前立腺腫瘍において増大したレベルで存在する。この配列は、第22染色体(配列番号1のヌクレオチド977〜1075および2700〜2777)上のゲノムDNA配列の、2つの別個の領域に整列する:
Figure 0004646315
配列番号1において、ヌクレオチド1076〜1077はGTであり、ヌクレオチド2698〜2699はAGであり、これらはそれぞれ、コンセンサススプライスドナー配列およびコンセンサススプライスアクセプター配列である。従って、27378へのハイブリダイゼーションは、スプライシングを確証し、ここで、第1の5’LTRが第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位に結合する(配列番号1のヌクレオチド1075〜ヌクレオチド2700を結合する)。2つのエキソンにおける配列が2つの異なるウイルス(旧型および新型)を形成し、そして、これらは、他のファミリー(新型および旧型のファミリーメンバー)と有意に異なるので、27378産物が、PCAV以外のHERV−Kから転写される見込みはない。
(配列34058)
スポット34058(配列番号15)は、前立腺腫瘍組織において高度に増大している。この配列は、いくつかの「旧型」ゲノムで生じ、エンベロープATGを3’LTRの近くのスプライスアクセプター部位に連結する選択的スプライシング部位をまたぐ。この配列は、第3染色体および第6染色体に見られる関連のHERV−Kよりも密接にPCAVにマッチする(2443での単一のミスマッチ):
Figure 0004646315
Figure 0004646315
(配列26254)
アレイ上の配列26254からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。26254配列(配列番号16)は、第22染色体コンティーグAP000345(配列番号17=AP000345のヌクレオチド63683〜64332)およびAP000346(配列番号18=AP000346のヌクレオチド26271〜26920)(配列番号1のヌクレオチド7065〜7701)とほぼ完全に整列される:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
第22染色体配列に関する4つの点変異は、(染色体についてかまたは26254についてのいずれかの)配列決定誤差を代表し得るか、あるいは、ヒトゲノム内のSNPであり得る。
PCAVは、第3染色体および第6染色体に見られるHERV−Kと最も密接に関連する。26254の領域での、第3染色体、第6染色体および第22染色体のウイルスのアラインメントは、26254が第3染色体または第6染色体由来でありそうもなく、そして、第22染色体のPCAV転写物由来である可能性が最も高いことを示す:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
第3染色体、第6染色体および第22染色体上のHERVは密接に関連するが、従って、これらは、ハイブリダイゼーションにより区別し得る。
(配列30453)
アレイ上の配列30453からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。30453配列(配列番号113)は、第22染色体と整列される:
Figure 0004646315
(配列26503)
アレイ上の配列26503からのシグナルは、正常組織と比較して、前立腺腫瘍組織において増大した。26503配列(配列番号116)は、第22染色体と整列される:
Figure 0004646315
(患者ライブラリー)
患者ライブラリーからクローニングしたHERV−K HML 2.0 cDNAをPCAVと整列する。4人の患者由来のライブラリーからのクローンは、PCAVと95%より大きい同一性で整列する。
配列番号19は、前立腺腫瘍において増大したレベルで存在するcDNA由来である。この470ヌクレオチドの最初の463は、第22染色体のゲノムDNA配列の4つの別々の領域と整列する(配列番号1のヌクレオチド956〜1075、2700〜2777、8166〜8244および10424〜10609):
Figure 0004646315
Figure 0004646315
配列番号1の「ギャップ」の前後にあるジヌクレオチド配列は、以下の通りである:
Figure 0004646315
従って、配列番号1の「ギャップ」は、コンセンサススプライスドナー配列に始まり、コンセンサススプライスアクセプター配列に終わる。従って、cDNA内の配列番号19の存在はスプライシング(ここで、第1の5’LTRが第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位に連結され(配列番号1のヌクレオチド1075がヌクレオチド2700に連結される))、ならびに他のスプライシング事象を確証する。エキソン1および2の配列が2つの異なるウイルス(旧型および新型)由来であり、これらが、他のファミリー(新型および旧型のファミリーメンバー)から有意に異なるので、配列番号19産物はPCAV以外のHERV−Kから転写される見込みはない。
配列番号114(035JN013.F03−FIS)は、入手可能な第22染色体配列と整列する:
Figure 0004646315
配列番号115(035JN015.H02−FIS)は、入手可能な第22染色体配列と整列する:
Figure 0004646315
配列番号117(035JN003.E06−FIS)は、入手可能な第22染色体配列と整列する:
Figure 0004646315
配列番号118(035JN013.C11)は、入手可能な第22染色体配列と整列する:
Figure 0004646315
配列番号119(035JN001.F06)は、入手可能な第22染色体配列と整列する:
Figure 0004646315
(患者の腫瘍サンプル)
2人の患者からの新鮮な凍結前立腺癌組織を、10ミクロン切片にカットし、ガラススライドにマウントし、そしてマウスモノクローナル抗体5G2で染色した。染色を、二次抗体(フルオレセイン結合ヤギ抗マウス)で可視化した。染色は、癌性組織に特異的であることを見出した。サンプルをまた、26254へのハイブリダイゼーションにより分析し、シグナルは、同じ患者由来のコントロールサンプルよりも35〜40倍強かった。
Figure 0004646315
(RTPCR)
種々の組織由来のRNA抽出物を、RT−PCRで分析した。特に、エキソン1とエキソン2との間のスプライシング事象を、図6に示すプライマーを用いて調べた。図10に結果を示す。全てのレーンが、HERV−K HML2.0(すなわち、新型ウイルス)のバックグラウンドレベルの発現(細い線)を示すが、前立腺組織(レーン6)は、より長い産物(太い線)を示し、これは、5’LTRとENVの開始点との間のより長い配列内のHERV−Kの発現を示唆する。他の組織において見られた長いレーン6の産物とバックグラウンド産物との間の長さの差異(約80bp)は、図6Bに図示するエキソン2の長さに対応する。
細胞株由来の抽出物もまた試験した(図11)。再び、「ユビキタス」HERV−K発現のバックグラウンドレベルは、ほとんどの細胞株で明らかであった。前立腺細胞株MDA PCA 2b(レーン7)、およびより少ない程度で、22RV1(レーン6)は、より長いRT−PCR産物を明らかに示した。
(MDA PCA 2b細胞株)
MDA PCA 2b細胞株よりRNAを抽出した。スプライシングされたmRNAをクローニングして配列決定し、第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位が使用されることを確認する。これらのmRNAは、PCAVに正確にマッチする配列を有する4つのエキソンを有する。これらは、LTR1および2に近接するエキソンを有し、このエキソンにエンベロープATGと非常に短いオープンリーディングフレームを含むエキソンが続き、最終的に、最後の3’LTRのフラグメントで終止する。
第2の5’LTRの3’末端の近くのスプライスアクセプター部位の使用はまた、私的な前立腺癌ライブラリー(ChironクローンID 035JN024.B09)に存在するcDNAにおいても見られた。
MDA PCA 2b RNAの3’末端を、RACEによりマッピングした。正方向のPCRプライマーは、配列番号21であり、これは、PCAVおよび新型HERV−Kにマッチする。逆方向PCRプライマーは、配列番号22であった。逆転写のためのプライマーは、配列番号20であった。MDA PCA 2b由来のmRNA標的を用いて、1.3kbに主要なバンドを得た。このバンドをクローニングして配列決定し(T7またはSP6のいずれかの配列決定用プライマーを用いる)、アラインメントを以下に示す:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
これらの増幅産物の配列決定は、転写物がMER11a挿入内のポリAシグナル(ヌクレオチド961で始まる列)を使用して終止することを示す。再び、これは、PCAVに完全に合致する。
(抗gagモノクローナル抗体)
PCAVは、「旧型」HERV−Kである。「新型」HERV−Kの低レベルの発現がまた検出され得る。PCAVおよび「新型」HERV−K由来のgagオープンリーディングフレームは、主要な配列レベルで相同であるが、有意な発散を有する。gagタンパク質は、酵母において発現され、そして、PCAVおよび「新型」HERV−Kの両方について精製され、そして、マウスモノクローナル抗体を生じた。
発現のために使用される「新型」HERV−K gag配列を、前立腺癌細胞株LnCapから単離し、PCAV gag配列を前立腺癌細胞株MDA PCA 2bから単離した。これらの配列を、酵母発現ベクターpBS24.1を用いて、Saccharomyces cerevisiae AD3株における発現のために遺伝的に操作した。このベクターは、酵母における自律複製のための2μの配列を、選択可能なマーカーとして酵母遺伝子leu2dおよびURA3を含む。細菌内のプラスミド複製に必要とされるβ−ラクタマーゼ遺伝子およびColE1の複製起点ならびにa−因子ターミネーターはまた、この発現ベクター中に存在する。組換えタンパク質の発現は、ハイブリッド型ADH2/GAPDHプロモーターの制御下である。
「新型」HERV−KおよびPCAV gagについてのコード配列を、それぞれ2012bpおよび2168bpのHindIII−SalIフラグメントとしてクローニングした。各gagを、2つの部分にサブクローニングした:
1.「新型」HERV−K gagをpSP72にサブクローニングした。ADH/GAPDHプロモーターに隣接するHindIII部位からgagコード配列内のNcoI部位までの143bpの合成オリゴヌクレオチド。orf−99と称されるLnCaP細胞から得たcDNAクローンを鋳型として使用して、NcoIからSalIまでの「新型」HERV−K gag配列の残存する1869bpをPCRにより誘導した。
2.PCRを用いて、2B11.12−44と称されるMDA PCa 2b細胞から得たcDNAクローンを鋳型として使用して、PCAV gagの1715bpのHindIII−Ava3フラグメントを作製した。得られたPCR産物をpGEM7−Zにサブクローニングした。gagタンパク質の3’末端は、2B11.12−44クローンにおいて欠けているので、この構築物の3’末端をコードするAva3−SalIフラグメントを、上記の「新型」HERV−K gagクローンから単離した。
配列確認の後、それぞれのフラグメントを酵母発現ベクター内でADH2/GAPDHプロモーターに連結してpd.LnCap.gag酵母発現プラスミド(「新型」HERV−K gagをコードする)およびpd.MDA.gag酵母発現プラスミド(ハイブリッド型のPCAV/「新型」HERV−K gagをコードする)を作製した
「新型」発現構築物は、配列番号1185であり、配列番号1186をコードする:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
ハイブリッド型構築物は、配列番号1187であり、配列番号1188をコードする:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
コードするタンパク質のアラインメントは、以下の通りである:
Figure 0004646315
S.cerevisiae AD3株(mata、leu2、trpl、ura3−52、prb−1122、pep4−3、prcl−407、cir、trp:DM15[GAP/ADR])を形質転換し、単一の形質転換体を培地中のグルコースの枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、クマシーブルー染色により全酵母抽出物において検出されるように、酵母中で高いレベルで発現した(図15A)。発現したタンパク質は、全酵母抽出物(矢印)において容易に観察された。レーン5および6は「新型」gag、そしてレーン3および4はハイブリッド型gagである。形質転換していないコントロール細胞を、レーン2に示す。
大規模発酵の後、タンパク質を精製し、モノクローナル抗体産生に使用した。8つの大量のmAbを得、これらを、ウェスタンブロットにおいて両方のgagタンパク質を認識する能力について試験した(図16)。8つのmAbのうち、7つが両方の組換えタンパク質を認識し、そして1つ(5A5/D4)がPCAV/HERV−Kハイブリッド型gagタンパク質のみを認識する。抗体5G2は、旧型および新型のgag抗原の両方と交差反応する:
Figure 0004646315
mAb 6F8/F1を図15Aと同じ順序の酵母抽出物を含むゲルのウェスタンブロット(図15B)に使用した。シグナル強度を減少させるために、gag組換えタンパク質を含むサンプルを、組換えタンパク質を含まない酵母抽出物を使用する図15Aに見られるサンプルに対して50倍希釈した。
5G2抗体は、MDA.PCA.2b細胞に結合する(図12B)。この細胞は、抗体の不在下では蛍光を発さなかった(図12A)。前立腺細胞株PC3はまた、反応性であった(図12C)が、MDA.PCA.2bよりも低かった。形質転換した線維芽細胞株(NIH3T3)は、抗HERV−K−gag抗体と反応性でなかった(図12D)。
MDA PCA 2b細胞に見られるgag mRNA構造は、第1の5’LTRで開始し、第2の5’LTRでスプライシングされる。このような配置は、RNAが翻訳適格性であるために必要である。なぜならば、第2の5’LTRは、多くの終止コドンを含み、これは、スプライシングされていないmRNAにおいてgag翻訳を妨げる。
(PCAV配列分析)
第22染色体由来のPCAVのゲノム配列は、配列番号1として与えられる。この配列は、ゲノム中の第1の5’LTRの開始から3’LTRの最終フラグメントの末端まで伸長する。これは、合計12366bpである。
配列番号1内で、第1の5’LTR(新型)はヌクレオチド1〜968である。これは、ヌクレオチド1126までのHERV−K配列が後に続く。ヌクレオチド1127〜1678は非ウイルスであり、これは1464〜1487にTG反復を含む。第2の5’LTR(旧型)は、ヌクレオチド1679〜2668由来である。3’LTRは、ヌクレオチド10520〜10838および11929〜12366として断片化される。MER11a挿入は、ヌクレオチド10839〜11834であり、そのポリAシグナルは、11654〜11659の間に位置する。ポリA付加部位は、11736と11739との間に位置するが、正確にどこかを言うのは可能でない。なぜならば、これらの4つのヌクレオチドは、すでにAであるからである。
配列番号1の中の塩基性コード領域は以下:
Figure 0004646315
である。
スプライスドナー(5’SS)部位は、ヌクレオチド999〜1004、1076〜1081、2778〜2783、8243〜8249、8372〜8378、8429〜8436、8634〜8641、8701〜8708および8753〜8760に位置する。スプライスアクセプター(3’SS)部位は、ヌクレオチド2593〜2611、2680〜2699、8112〜8131、8143〜8165および10408〜10423に位置する。
第1の転写領域の後、ヌクレオチド2700〜2777、8166〜8244および10424〜11739に位置する3つの主要な下流エキソンが存在する。
gag遺伝子(配列番号1のヌクレオチド2813〜4960;配列番号57)は、715aaポリペプチドをコードする(配列番号54)。
プロテアーゼ遺伝子(配列番号1のヌクレオチド4762〜5688;配列番号58)は、3つの終止コドンにより中断される:
Figure 0004646315
終止コドンの間の4つのアミノ酸は、配列番号59〜62である。
pol遺伝子(配列番号86)はまた中断される。既知のpol配列とのアラインメントは、アミノ酸配列の種々のフラグメントを明らかにする(配列番号92〜97):
Figure 0004646315
env遺伝子(配列番号1のヌクレオチド9165〜9816;配列番号63)は、終止コドンにより中断される。最も長い中断されない配列は、アミノ酸配列(配列番号64)をコードする。配列番号63のリーディングフレームは、終止コドンの間にいくつかの短いアミノ酸配列(配列番号65〜80)を含む:
Figure 0004646315
配列番号1のヌクレオチド8916〜9155(配列番号81)はまた、中断されて、いくつかの短いアミノ酸配列(配列番号82〜85)を生じる:
Figure 0004646315
「morf」または「PCAP3」と呼ばれるポリペプチド産物(配列番号87)は、HERV−Kについて以前に見られた「cORF」産物と大まかには等価である。そのコンティーグ配列は、配列番号1のヌクレオチド8183で開始し、ヌクレオチド8244の後にスプライシングが起こり、そして、ヌクレオチド10424に連結される。スプライスジャンクションは、配列番号88内にAGTセリンコドンを形成する(図23):
Figure 0004646315
PCAP3についてのさらなる詳細を以下に示す。
(PCAV gag内の独特なDNA配列)
PCAV gagは、48ヌクレオチド配列(配列番号53)を含み、これは、第3染色体、第6染色体および第1第6染色体上の密接に関連するHERV−Kにおいては見出されない。48マーは、16マーの配列番号110をコードし、これは、新型HERV−Kまたは他の旧型HERV−Kにおいては見出されない。配列番号53を含む99マー(配列番号1からの3614〜3712)のBLAST分析における上位5ヒットを示す:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
(PCAV gag内のエピトープ)
種々のHERV−KのN末端のアラインメントを以下に示す:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
2つの領域は、PCAV特異的な検出試薬を作製するのに特に有用である。第1の領域は、アラインメントのアミノ酸203〜225(配列番号55;配列番号111によりコードされる)である。この領域は、第6染色体上の2つの他のHERV−Kに存在するが、これらの2つのウイルスは、旧型HERV−K群内である。新型HERV−Kのバックグラウンド(「ユビキタス」)発現は、多くの組織において見られる(例えば、図10)が、旧型HERV−Kのバックグラウンド発現は見られない。従って、配列番号55の検出は、新型HERV−Kのバックグラウンド発現を超えて区別され、PCAV発現を検出するのに使用され得る。
第2の領域は、アミノ酸284〜300(配列番号56;配列番号112によりコードされる)から見出される。なぜなら、この配列はPCAVに独特であるからである。配列番号110(配列番号53)は、配列番号56の単一アミノ酸短縮フラグメントである。
ヒトゲノム配列に対する配列番号110のTBLASTN分析は、クローンKB208E9およびKB1572G7の、他のどこかではなく、染色体22q11.2において100%の合致を示す。BLASTP分析は、任意の合致の同定をしそこなう。
ヒトゲノム配列に対する配列番号53のBLASTN分析は、ドラフト配列として働くHomo sapiensの第22染色体のヌクレオチド3180761〜3180808で100%の合致を示し、さらにはヒットしない。
非重複性のGenBank CDSデータベースに対して配列番号110を用いる上位5つのBLASTPヒットを以下に示す:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
従って、配列番号110はPCAVに独特である。
(cDNA配列の予測)
スプライスドナー部位およびアクセプター部位に基づいて、配列番号99〜109を構築した。配列番号109は、第2の5’LTRで開始する。
配列番号99〜108を以下ように配列番号10と整列する:
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
Figure 0004646315
(PCAVの転写開始部位)
他のレトロウイルスとの相同性により、PCAV−mRNA(すなわち、PCAVゲノム内の転写開始部位)の5’末端は、配列番号1のヌクレオチド559の限界TATA配列の30塩基下流に落ち着くべきである。
しかし、実験的な研究は、PCAV−mRNAの5’末端が、さらに下流であることを示唆する。図33は、RT−PCR走査アッセイの結果を示し、これを5’末端のマッピングに用いる。5’LTRのcDNAを、プロウイルスのゲノムの997〜972に広がるアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号1202)を有する総Teral RNAをプライムすることにより調製した。次いで、このcDNAを分割し、そして、968〜950のアンチセンスプライマー(配列番号1203)を用いて、以下のような5’末端をカバーするように設計された一連のプライマーからのセンスプライマーと組み合わせて、PCR分析を実行した:1)571<配列番号1204>、2)600<配列番号1205>、3)626<配列番号1206>、4)660<配列番号1207>、5)712<配列番号1208>。1μgのゲノムHeLa DNAにおける二連のPCR反応をポジティブコントロールとして用い、これらの反応は、全てのプライマー対が有効であることを示した。cDNAでプライムされる反応は、プライマー600と626との間の顕著な差異を示し、これは、プロウイルスゲノムの位置626に近くに5’末端があることを示唆した。
この結果を、RNase保護アッセイを用いて確認した(図34)。プロウイルスゲノム中の塩基(34B)509〜735および(34C)600〜735をカバーする標識したアンチセンスRNAプローブをTeral細胞由来の総RNAにハイブリダイズさせ、標準的な条件下でRNaseで消化した。尿素含有PAGEによる処理および検出の後、両方のプローブが100塩基産物を生じた。これらの2つの結果は合致し、そして、HERV−K RNAの5’末端がプロウイルスゲノムの塩基635周辺(すなわち、TATA依存性遺伝子に有用な30bp下流周辺ではなく、TATAシグナルの100bp下流周辺)であることを示す。
(PCAP3)
PCAVのenv領域の最終エキソン内で、リーディングフレーム1および2は、それぞれenvおよびcORFをコードする(図23)。配列番号87は、PCAP3であり、これは、envとして同じ5’領域を共有するが、ここで、スプライシング事象がenvコード配列を除去し、そして、envのリーディングフレームに対してリーディングフレームを+2移動させる(配列番号88および1191):
Figure 0004646315
従って、このコード配列の大部分は、スプライシングの後に、3’LTRを含むエキソン内に位置決めされる。+2リーディングフレームは、HERV−Kにおいて公知の機能を有さないが、前立腺癌細胞株MDA Pca−2bから調製されたcDNAは、前立腺癌mRNAのようなこれらの転写物を含んだ。例えば、スポット34058(上記参照)は、PCAP3をコードし、患者サンプルの79%において2倍以上、53%において5倍以上アップレギュレートされた。これらの図は、PCAP3が多くの前立腺癌に関与するという見解を支持する。さらに、これらの図は、患者が、Gleasonグレードに従って分類される場合、癌とPCAP3発現との間の全体の関係性を反映しない(グレード3の腫瘍は、PCAP3の高度なアップレギュレーションを示すが、より進行したグレード4の腫瘍は、PCAP3抑制を示すようである)。図18は、標準化前立腺ライブラリーからの6000のランダムESTを採用する前立腺癌のマイクロアレイ分析を示す。レーザー捕捉顕微解剖腫瘍から調製したRNAレベルを、腫瘍周辺の正常組織RNAと比較する。図18のアスタリスクでタグされた配列は、アップレギュレートされ、これらは全て第22染色体の単一の12kb部位由来である。これらの配列は、PCAVの全ての部分に広がる。相対的なPCAV発現は、グレード3の腫瘍において非常に高く、多くの患者が10〜50倍の範囲の腫瘍/正常比を有する。しかし、Gleasonグレード4以上において、この比は1に戻り、そして、いくつかの場合、ウイルス発現が抑制される。同様のパターンがgag発現で見られ(図27)、これは、PCAV発現が前立腺癌の初期段階に関与することを示唆する。
PCAP3は、cORFタンパク質と同じであり、この2つのORFは、開始コドンを共有するが、PCAVの2つの小さな欠損が、フレームシフトと「旧型ウイルス」5’スプライシング部位(スプライスアクセプター)の両方を導入し、これにより、PCAP3特異的なスプライシング事象を可能にする。種々の整列したHERV−Kゲノムを点検すると、PCAP3が元々のタンパク質の変異した形態であることのさらなる証拠が得られる。従って、このタンパク質は、その元々の能力を発揮する可能性は少なく、機能性ドメインの保持を通じて発癌性活性が上昇し得る。env、cORFおよびPCAP3と共通するコードするエキソンは、RNA結合ドメインを含み、これはまた核局在化シグナル(NLS)として機能する。
PCAP3の細胞下の局在化を研究するために、(その役割をより理解するために)、V5タグ(配列番号1189)を有するPCAP3発現アデノウイルスを用いて、初代前立腺上皮細胞に感染させた。このタンパク質は比較的安定であり、抗V5により核細胞質内で標識された(図19)。この低分子タンパク質の細胞内局在化濃度は、核内の何かと特異的に相互作用していることを示す。
機能発現アッセイをまた設計した。このアッセイの第1の成分は、GFP発現を駆動するPCAV LTRを有するアデノウイルスベクター(配列番号1190)である(図24)。種々のヒト細胞株をこのウイルスに感染させ、蛍光顕微鏡によってかまたはFACSによってかのいずれかで蛍光を測定した。ポジティブコントロールとして、GFP発現がEF−aプロモーターによって駆動されるベクターを用い、このベクターは、全ての真核細胞生物において活性であるべきである。
GFP発現は、卵巣癌細胞、直腸癌細胞および肝臓癌細胞において最小であった。GFP発現はまた、不死化腎臓細胞株である293細胞、および初代前立腺上皮細胞においても最小であった。GFPは、種々の前立腺癌細胞株(PC3、LNCaP、MDA2B PCA、DU145)において容易に検出された。代表的なデータを図25に示す。GFP発現パターンは患者サンプルからの遺伝的結果と正確に合致する。これらのデータは、PCAV−mRNA LTRから駆動される発現が、前立腺癌のマーカーであることを示す。
LTRからのGFP発現が初代前立腺細胞においてサイレントであるが、前立腺癌組織において活性であるようであったため、初代前立腺細胞における発現を活性化する能力についてPCAP3を試験した。コード配列を発現カセットに挿入し、アデノウイルスベクターに組み込んだ(図26)。このベクターをGFPベクターとともに初代前立腺上皮細胞に同時感染させ、PCAP3は、GFP発現を弱く活性化した。
別の実験において、高継代PrEC(老化にアプローチする)を旧型HERV−K LTR由来のGFPを発現するアデノウイルスベクター(「MDALTR」:配列番号1196)とともに同時感染させ、二次ベクターが約20のmoiでPCAP3を発現した。3日後、蛍光強度をFACSにより測定し、PCAP3による活性化が見られた。LTR60を用いる同じ実験において、活性化は存在しなかった。
(PCAP3および老化)
前立腺癌は、管腔上皮層で発生すると考えられるが、正常な管腔上皮細胞は、非常に少ない細胞分裂が可能である。対照的に、NIH3T3細胞およびRWPE1細胞(図11および12を参照のこと)は不死である。PCAVは癌の初期段階に関与するようなので、通常は迅速に老化するPCAP3の初代前立腺上皮細胞(PrEC)への影響を試験した。
初代ヒト上皮細胞は、非常に制限された分裂能を有する。特定の数の分裂の後、細胞は、老化に入る。老化は、静止状態(正の増殖シグナルが取り除かれる場合または阻害シグナル(例えば細胞−細胞接触)が生じる場合、不死化細胞または前老化細胞は静止状態に入るが、増殖因子を添加することによってか、または細胞を低密度で再配置することによって、再び分裂を誘導し得る)から明らかであり、そして、増殖培地が定期的に交換される場合、老化細胞は分裂することなく数ヶ月生存し得るが、永久に分裂を停止している。
特定の遺伝子、特にウイルスのオンコジーン(例えば、SV40 T抗原)は、細胞に老化シグナルを無視させる。T抗原は、細胞を刺激して、「複製危機」と呼ばれるさらなる増殖バリアまで分裂を継続させる。危機において2つのプロセスが生じる:細胞が分裂し続けるが、平行して細胞は、蓄積された遺伝的損傷から、非常に高い割合で死ぬ。細胞死が分裂を超える場合、実質的に全ての細胞が短期間に死ぬ。危機の後に増殖する稀な細胞は、不死になり、細胞株を得る。細胞株は、代表的に明白な遺伝的再配置を有する:これらは、これらは三倍体に頻繁に密接し、非相反性の染色体転座が存在し、そして、多くの染色体が欠損および多遺伝子座の増幅を有する{169、170、171}。
危機をもたらす遺伝子産物は、特に興味深い。なぜならば、前立腺癌は、老化後複製により引き起こされ得る高い遺伝的不安定性を示すからである。最近の理論は、前立腺癌が、前立腺上皮内異常形成(PIN)と名付けられた病巣から生じることを保持する{172}。PINの遺伝的分析は、前立腺癌の特徴である遺伝的再配置の多くが、この段階ですでに生じていることを示す{173}。従って、PIN細胞をPCAV発現について試験し、ウイルスが前立腺癌の最初期段階で役割を果たし得るかどうかを決定した。PCAV gagは、豊富に発現することが見出され(図20)、これは、前立腺癌に関する遺伝的変化が生じる時に、PCAV発現が高いことを示す。PCAP3は前立腺癌において発現するようであるので、その役割は、老化後のPrECにおいて細胞分裂を誘導し得るかどうかを見ることによって調べた。
PCAP発現プラスミドを用いた形質転換後の薬物耐性PrEC選択の、最初の試みは失敗した。GFPまたはPCAP3のいずれかを発現するアデノウイルスベクターでの感染後のPrECの分析は、PCAP3細胞における感染4日後の大量の細胞死を明らかにした。ニックしたDNAを有する核を標識する、ターミナルデオキシトランスフェラーゼ末端標識(TLTNEL)の用量依存性の増加は、細胞がアポトーシスに進むことを確認した(図21)。不均衡な増殖シグナルがアポトーシスを誘導するので、このアポトーシスは、薬物耐性PrECの単離の失敗を説明し得、そして、PCAP3による細胞分裂機構の関与に一致する。
これらの結果は、PrECにおけるPCAP3発現の効果が評価され得る前に、アポトーシスがブロックされなければならないことを示唆した。従って、PCAP3+ネオマイシンマーカーをコードするプラスミドを、bcl−2(抗アポトーシス)およびlacZ(マーカー)をコードする発現プラスミドと同時にトランスフェクトした。コントロールとして、細胞を、ネオマイシンおよびlacZ、bcl−2、bcl−XまたはPCAP3のいずれかを発現するプラスミドでトランスフェクトした。選択下で2週間後、lacZ、bcl−2およびbcl−XLのディッシュは全て、多数の耐性細胞を有し、これは増殖してディッシュの画分を満たした。これらの細胞がスプリットする場合、これらは、さらに分裂しなかったが、生存可能であり、そして老化親細胞と類似していた。対照的に、PCAP3およびbcl−2を発現する細胞は、小さな細胞から形成される数コロニーを得、これは、分裂して最初のプレートを満たし、スプリットされると、分裂し続けた。
上記の薬物選択と並行して、細胞の増殖能力を評価した。親PrECは、老化に達する前に、7世代倍加を経た。対照的に、抗アポトーシス遺伝子+PCAP3で同時にトランスフェクトした薬物耐性細胞は、増殖を停止する前に、老化点までよく増殖し、16倍加を経た。約2週間の急速な増殖の後、細胞の増殖は遅くなり、最終的に停止した。同時に、浮いている細胞および死細胞の数は増殖し、そして細胞の外観が変化した−これらの細胞は、通常の上皮細胞の「丸石」外観をもはや有さなかったが、その代わりに、いくつかの形態学を有し、そして、多くの多核細胞が存在した。2週間後、細胞は死亡し、一方で、lacZまたはlacZ+bcl−2でトランスフェクトした細胞は、1ヶ月後に、まだ生存した。
老化細胞または危機に近づいている細胞のいずれも、数が増えない。しかし、これらの細胞の間の1つの違いは、危機に近づいている細胞が分裂し、そして、感知できる速度で死に、従って、細胞分裂が、2つの状態の間で識別し得ることである。ブロモ−デオキシウリジンで標識した後、30%の老化前PrECが標識され、これは、PCAP3+bcl−2でトランスフェクトしたPrECの10%であったが、老化lacZまたはcORF+bcl−2コントロールは、標識されなかった(図22)。
これらの結果は、PCAP3が前立腺上皮細胞において増殖を誘導し得、この増殖が、前立腺癌の根底にある原因であり得ることを示す。
(PCRによるPCAV検出)
プライマー対を試験して、前立腺サンプルについて期待されたPCAV産物(P)を産生するものおよび胸部サンプルについての産物をほとんど産生しないかまたは全く産生しないもの(B)を産生するものを決定した。プライマーを図28のPCAVの5’LTRのマップに示す。正方向のプライマーは、「914」(配列番号1192)または「949」(配列番号1193)であり;逆方向のプライマーは、「2736」(配列番号1194)または「cDNA」(配列番号1195)であった。cDNAプライマーは、スプライスジャンクションをまたぐ。各反応を、30サイクル、MCF7細胞(B)またはMDA PCA 2b細胞(P)のいずれかから抽出した総RNAから調製したdTで初回刺激したcDNAで行った。
結果を図29に示す。プライマーは、前立腺細胞における優先的な増幅を明白に示し、スプライスジャンクションをつなぐこのプライマー(「cDNA」)は、高度に特異的である。
準定量的RT−PCR実験をまた実施した。10人の患者からのLCM由来の前立腺組織から増幅したRNAを2736プライマーを用いて逆転写し、その後、「914」プライマーおよび「cDNA」プライマーのいずれかを用いるか(28サイクル)、または、ヒトβ−アクチンに対する標準的なプライマーを用いて(25サイクル)PCR増幅を行った。結果を図30に示す。正常(N)または癌(C)の合致するサンプルを増幅した。各対についての正常組織に対する癌組織のシグナル比を、PCAV PCR産物上で示す。
プライマー「914」およびプライマー「cDNA」はまた、種々の組織からのdTで初回刺激したcDNAに対する定量的PCRで試験した。図31に示す様に、47歳の患者からの前立腺組織のみが有意なシグナルを生じた。
RT−PCRをまた、種々の年齢の患者からの前立腺組織で実施した。発現レベルをgusB(β−グルクロニダーゼ)と比較した。結果は以下の通りであった:
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基準化したPCAVの図をまた、図32に示す。
本発明の好ましい実施形態の上記の説明は、明瞭および理解の目的で例示および例として示している。これは、開示される詳細な形態にまで本発明を排他的にするかまたは限定することを意図しない。本発明の教示から、多くの変化および改変が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に容易に明らかである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物により規定されることが意図される。
本明細書中に引用される全ての特許、刊行物および参考文献は、その全体が参考として援用される。
(配列一覧索引)
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(参考文献(これらの内容は、全体が本明細書中に参考として援用される))
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図1は、種々の内因性レトロウイルスLTR間の関係を示す系統樹である。「旧型」および「新型」HERV−K LTRが、強調される。 図2は、PCAVゲノムの配置の5’端を図示する。 図3は、PCAVゲノムの配置の3’端を図示する。 図4は、先行技術のHERV−K(「HTDV」{参考文献45})において起こるスプライシング事象(envおよびcORFタンパク質を生じる)を示す。 図5は、PCAVの5’LTRでのスプライシング事象を図示する。 図6は、並列のPCAVの5’LTR(図6B)におけるスプライシング事象が、いかにして他のHERV−K(図6A)におけるそれらと識別され得るかを、図示する。 図7は、特異的にPCAV mRNAを使用するために、プライマーがいかにして使用され得るかを、図示する。 図8は、PCAVの3’末端における挿入が、これを他のHERV−Kから識別するために、いかにして利用され得るかを図示する。 図9は、PCAVゲノムに対するアレイの特徴の可能性の配置の地図を示す。 図10は、種々の組織におけるエキソン1〜2スプライシング事象のRT−PCR分析の結果を示す。各レーンは、以下である:(1)マーカー;(2)胎盤;(3)および(4)脳;(5)精巣;(6)前立腺;(7)胸;(8)子宮;(9)甲状腺;(10)頚;および(11)肺。 図11は、細胞株におけるエキソン1〜2スプライシング事象のRT−PCR分析の結果を示す。各レーンは、以下である:(1)および(12)マーカー;(2)Teral;(3)colo360;(4)PC3;(5)DU145;(6)22RV1;(7)PCA2B;(8)LNCaP;(9)RWPE1;(10)RWPE2;および(11)PrEC。 図12は、以下に対して5G2モノクローナル抗体を使用して得られた蛍光の結果を示す:(12B)MDA PCA 2b細胞;(12C)PC3細胞;(12D)NIH3T3細胞。図12Aは、5G2抗体を有さないMDA PCA 2b細胞を示す。 図13は、以下を用いた前立腺腫瘍サンプルの染色を、示す:(A)ヘマトキシリンおよびエオシン染色(B)mAb 5G2およびフルオロセイン抗マウス、または(C)フルオロセイン抗マウスのみ。 図14は、以下を用いた前立腺腫瘍サンプルの染色を、示す:(A)ヘマトキシリンおよびエオシン染色(B)mAb 5G2およびフルオロセイン抗マウス、または(C)フルオロセイン抗マウスのみ。 図15は、酵母におけるHERV−K gagタンパク質の発現を示す(15Aはタンパク質ゲル染色、および15Bはウェスタンブロット)。 図16は、8つのモノクローナル抗体を用いた、gagタンパク質のウェスタンブロットを示す。 図17は、特定の配列番号をゲノムに対して配置した概略図である(一定比ではない)。 図18は、患者サンプルにおけるPCAV発現のマイクロアレイ分析を示す。右の拡大部分において、見出しは、サンプルのGleason等級を示す。赤は、癌においてアップレギュレートされる配列を同定し、緑は癌において抑制される配列を同定し、そして黒は無変化の点を示す。個々の配列は、垂直に並べられ、そして患者は水平に示される。左のパネルは、103人の患者由来のRNAを用いてアッセイされた全ての6000配列を示し、ほぼ一様なアップレギュレーションを示す領域は、右に拡大される。 図19は、免疫染色を使用したPCAP3の非細胞局在を示す。 図20は、抗gag免疫蛍光を使用した、PIN組織染色を示す。PINの新鮮凍結切片を使用し、そしてPINの評価は、ヘマトキシリン(hemotoxylin)−エオシン染色連続切片において、公認病理学者によってなされた。 図21は、PCAP3をコードするアデノウイルスでトランスフェクトされた細胞(以下のmoiにおいて:100(左上)、50(右上)、25(左下)、またはトランスフェクトされていないコントロール(右下))についての、TUNELを示す。 図22は、ブロモデオキシウリジン標識を使用した、細胞分裂アッセイの結果を示す。 図23は、PCAVゲノム(特にenv、cORFおよびPCAP3について)内におけるスプライシングを示す。 図24は、LTR活性について試験するための発現アッセイにおいて使用されるアデノウイルスベクターを示す。 図25は、このベクターから駆動されるGFP発現の結果を示す。 図26は、PCAP3がPCAV LTRを活性化する能力を試験するために使用されるベクターを示す。 図27は、抗gagモノクローナル抗体5G2を使用して、前立腺癌患者から採取された組織の切片を染色する免疫蛍光実験を示す。図27Aは正常な前立腺を示し、図27Bは萎縮した組織を示し、図27CはGleason等級3の癌を示し、そして図27Dは、Gleason等級4の癌を示す。 図28は、PCAV特異的プライマーの位置(図2の5’領域を参照)を示す。 図29は、これらのプライマーを用いたPCRの結果を示す。「P」は前立腺組織であり、「B」は胸部組織である。 図30は、これらのプライマーを用いたRT−PCRの結果を示す。正常(「N」)前立腺細胞または癌(「C」)前立腺細胞に適合する対を使用した。シグナル比率を、各対について与える。 図31は、種々の組織についての定量的PCR結果を示す。y軸は、HPRTに対して標準化されたPCAVを示す。組織は、左から右へ、以下である:胎盤、胎児脳、胎児心臓、胎児肝臓、脳、心臓、肝臓、膵臓、胃、小腸、結腸、直腸、精巣、前立腺(47歳男性)、卵巣、副腎、甲状腺、腎臓、膀胱、胸部、子宮、頚、骨格筋、肺、脾臓、胸腺、皮膚。 図32は、前立腺組織におけるPCAV mRNA発現の年齢に関係した増加を示す。 図33は、PCAV mRNAの5’末端をマッピングするために使用される、RT−PCRスキャニングアッセイの結果を示す。 図34は、RNase保護アッセイの詳細を与える。長いプローブ(24B)および短いプローブ(24C)の、2つのアンチセンスプローブを使用した。両プローブは、24Aにおいて示される領域に保護される。24Bにおいて、TATAシグナルの位置に基づく「通常の」5’末端に基づいて予測されるバンドの位置が示され、加えて、実際のバンドも達成される。24Bにおける3つのレーンは、以下である:(1)Teral;(2)RNAなし;(3)プローブ(RNAなし)。24Cの2つのレーンは、以下である:(1)Teral;(2)プローブ(RNaseなし)。
(配列表)
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Claims (43)

  1. 前立腺癌を検出するインビトロでの方法であって、該方法は、患者サンプルにおいて、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス(PCAV)の発現産物の存在または非存在を検出する工程を包含する、方法。
  2. 検出される前記発現産物が、mRNA転写物またはポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
  3. mRNA転写物が、ハイブリダイゼーション、配列決定法、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって検出される、請求項1および請求項2に記載の方法。
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、以下の最初の工程:
    (a)前記患者サンプルからmRNAを抽出する工程;
    (b)該患者サンプルから、mRNAを除去することなくDNAを除去する工程;および/または
    (c)該患者サンプルにおいて、PCAV DNAを除去または破壊するがPCAV mRNAを破壊も除去もしない工程
    を、包含する、方法。
  5. 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、前記発現産物が、以下:
    (a)第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されたmRNA転写産物;
    (b)配列番号23、配列番号1197および/または配列番号1198に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、mRNA転写物;
    (c)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの、(1)最初の5’LTRから転写されたmRNAの5’末端から、(2)該最初の5’LTRから転写された該mRNAのU領域の下流の最初のスプライスドナー部位までのヌクレオチド配列であり、そして該Nが、スプライスアクセプター部位のすぐ下流のヌクレオチド配列であって、該スプライスアクセプター部位が、(1)該最初のスプライスドナー部位の下流、および(2)第2のスプライスドナー部位の上流に位置し、該第2のスプライスドナー部位は該内因性レトロウイルスの第2の5’LTRの下流である、mRNA転写産物;
    (d)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、配列番号26および/または配列番号1201に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Nが、配列番号27または配列番号28に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (e)配列番号24、配列番号25、配列番号1199または配列番号1200に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (f)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、配列番号30に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Nが、配列番号31に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (g)配列番号29に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (h)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのenv遺伝子内のalu挿入部分の前にあるヌクレオチド配列であり、そして該Nが、該alu挿入部分の5’末端で始まるヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (i)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、配列番号37に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Nが、配列番号32に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (j)配列番号38に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (k)配列−N−N10−を含むmRNA転写物であって、該Nが、第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスのenv遺伝子内のalu挿入部分の末端にあるヌクレオチド配列であり、そして該N10が、該alu挿入部分のすぐ下流のヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (l)配列−N−N10−を含むmRNA転写物であって、該Nが、配列番号41に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該N10が、配列番号40に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (m)配列番号42に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (n)配列番号41に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (o)配列番号53に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (p)配列番号111に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (q)配列番号1191に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;および
    (r)配列番号98に対し、少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするmRNA転写物;
    からなる群から選択されるmRNA転写物である、方法。
  6. 前記mRNA転写物が、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号37、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号53、配列番号111および/または配列番号1191のうち1つ以上を含む、請求項5に記載の方法。
  7. 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、以下:
    (a)前記患者サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび/またはプローブと接触させる工程;ならびに
    (b)該患者サンプルにおいてハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程
    を、包含する、方法。
  8. 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、以下:
    (a)前記サンプル中のmRNAを、DNAと比較して富化し、mRNA富化サンプルを供給する工程;
    (b)該mRNA富化サンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび/またはプローブと接触させる工程;および
    (c)該mRNA富化サンプルに存在するmRNAに対するハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程
    を、包含する、方法。
  9. 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法であって、該方法は、以下:
    (a)前記サンプル中のmRNAのDNA複製物を調製する工程;
    (b)該DNA複製物を、ハイブリダイゼーション条件下で核酸プライマーおよび/またはプローブと接触させる工程;および
    (c)該DNA複製物に対するハイブリダイゼーションの存在または非存在を検出する工程
    を、包含する、方法。
  10. 前記患者サンプルを、前記レトロウイルスから発現されるポリペプチドを認識する抗体と接触させる工程を包含する、請求項2に記載の方法。
  11. 前記患者サンプルが前立腺細胞を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記患者が成人男性である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 以下:
    (a)第22染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスから転写されるmRNA転写産物のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (b)配列番号10、配列番号1197および/または配列番号1198に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (c)ヌクレオチド配列−N−N−を含む核酸;
    (d)配列番号5、配列番号6、配列番号1199または配列番号1200に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (e)ヌクレオチド配列−N−N−を含む核酸;
    (f)配列番号9に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (g)ヌクレオチド配列−N−N−を含む核酸;
    (h)配列番号38に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (i)ヌクレオチド配列−N−N10−を含む核酸;
    (j)配列番号42のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (k)配列番号42に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (l)配列番号53のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (m)配列番号53に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (n)配列番号111のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (o)配列番号111に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (p)配列番号1191のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (q)配列番号120〜1184のうち1つ以上を含む核酸;
    (r)ストリンジェント条件下で、請求項5に記載の(a)〜()において定義されるmRNA転写物にハイブリダイズし得る核酸;および
    (s)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)または(r)の相補核酸;
    からなる群から選択される核酸であって、ここでN〜N10は請求項5において定義される通りである、核酸。
  14. 配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号38、配列番号42、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号111、配列番号337〜599、および配列番号600〜1184、またはそれらの相補核酸のうち1つ以上を含む、請求項13に記載の核酸。
  15. 以下:
    (a)PCAV核酸標的内で配列−N−N−(またはその相補配列)にハイブリダイズし得るが、単独のN配列にもN配列(またはこれらの相補配列単独)にもハイブリダイズしないプローブ;
    (b)PCAV核酸標的内で配列−N−N−(またはその相補配列)にハイブリダイズし得るが、単独のN配列にもN配列(またはこれらの相補配列単独)にもハイブリダイズしないプローブ;
    (c)PCAV核酸標的内で配列−N−N−(またはその相補配列)にハイブリダイズし得るが、単独のN配列にもN配列(またはこれらの相補配列単独)にもハイブリダイズしないプローブ;
    (d)PCAV核酸標的内で配列−N−N10−(またはその相補配列)にハイブリダイズし得るが、単独のN配列にもN10配列(またはこれらの相補配列単独)にもハイブリダイズしないプローブ;
    (e)配列番号10、配列番号1197もしくは配列番号1198のフラグメント、または配列番号10、配列番号1197もしくは配列番号1198のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (f)配列番号5および/もしくは配列番号1199のフラグメント、または配列番号5および/もしくは配列番号1199のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (g)配列番号6および/もしくは配列番号1200のフラグメント、または配列番号6および/もしくは配列番号1200のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (h)配列番号9のフラグメント、または配列番号9のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (i)配列番号53のフラグメント、または配列番号53のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (j)配列番号1191のフラグメント、または配列番号1191のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (k)配列番号10および/もしくは配列番号1198の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号10および/もしくは配列番号1198の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (l)配列番号47の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号47の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (m)ヌクレオチド配列B1a−B2a(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、B1aは配列番号2の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、B2aは配列番号46の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含む、プローブ;
    (n)配列番号49の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号49の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (o)ヌクレオチド配列B1b−B2b(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、B1bは配列番号2の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、B2bは配列番号48の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含むプローブ;
    (p)配列番号9の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号9の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (q)ヌクレオチド配列B−B(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、Bは配列番号7の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、Bは配列番号8の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含むプローブ;
    (r)配列番号38の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号38の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (s)ヌクレオチド配列B−B(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、Bは配列番号37の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、Bは配列番号32の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含むプローブ;
    (t)配列番号43の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号43の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (u)ヌクレオチド配列B−B10(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、Bは配列番号32の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、B10は配列番号40の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含むプローブ;
    (v)配列番号53の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号53の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (w)配列番号111の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号111の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    (x)配列番号112の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号112の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;ならびに
    (y)配列番号1191の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号1191の相補鎖の少なくとも15の連続したヌクレオチドのフラグメントを含むプローブ;
    からなる群より選択される核酸プローブであって、ここでN〜N10は請求項5において定義される通りであり、そして「PCAV」は、ヒト第22染色体上の20.428メガベースに位置する内因性レトロウイルスであり、該核酸プローブは少なくとも長さが15ヌクレオチドである、核酸プローブ。
  16. 配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号36、配列番号39、配列番号44、配列番号45、配列番号50、配列番号51、配列番号52(またはその相補鎖)のうち1つ以上を含む、請求項15に記載のプローブ。
  17. 式5’−X−Y−Z−3’の核酸であって、ここで:
    −X−は、x個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
    −Z−は、z個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり;
    −Y−は、(a)配列番号1〜13、配列番号20〜53、配列番号57、配列番号58、配列番号63、配列番号81、配列番号86、配列番号88〜91、配列番号99〜109、配列番号111、もしくは配列番号112、または配列番号1191のいずれかのy個のヌクレオチドのフラグメント、あるいは(b)(a)の相補鎖のいずれかからなるヌクレオチド配列であり;
    該核酸5’−X−Y−Z−3’は、(i)配列番号1〜13、配列番号20〜53、配列番号57、配列番号58、配列番号63、配列番号81、配列番号86、配列番号88〜91、配列番号99〜109、配列番号111、もしくは配列番号112、または配列番号1191のフラグメント、あるいは(ii)(i)の相補鎖のどちらでもなく;
    x+zの値は少なくとも1であり;
    yの値は少なくとも15であり、そして
    x+y+zの値は少なくとも16である、
    核酸。
  18. 前記−X−部分および/または前記−Z−部分がプロモーター配列(またはその相補鎖)を含む、請求項17に記載の核酸。
  19. ヒト22番染色体上の20.428メガベースに位置する内因性レトロウイルス内に含まれるテンプレート配列を増幅するためのプライマーを含む、前立腺癌を検出するためのキットであって、該キットは
    第1プライマーおよび
    第2プライマー
    を含み、ここで、該第1プライマーは該テンプレート配列の一部に対して相補的である配列を含み、該第2プライマーは該テンプレート配列の相補鎖の一部に対して相補的である配列を含み、ここで、相補性を有する該プライマー内の配列が、増幅されるべき該テンプレート配列の末端を規定し、該第1プライマーおよび第2プライマーは少なくとも長さが15ヌクレオチドである、キット。
  20. 前記テンプレート配列および/またはその相補鎖に対して相補的でありかつこれらにハイブリダイズし得る、プローブをさらに含む、請求項19に記載のキット。
  21. 前記テンプレート配列が、22番染色体の20.428メガベースに位置するHERV−Kの転写物内に位置する、請求項19または請求項20に記載のキット。
  22. 請求項21に記載のキットであって、前記テンプレート配列が、配列番号10もしくは配列番号23もしくは配列番号1197もしくは配列番号1198のフラグメントであり、そして/または前記テンプレートが、配列番号53および/もしくは配列番号111を含む、キット。
  23. 前記第1プライマーおよび第2プライマーが前記テンプレート配列の異なったエキソンに位置する、請求項19〜22のいずれか1項に記載のキット。
  24. 前記プライマーの1つが、配列番号120〜336のヌクレオチド配列またはそれらの相補配列のうちの1つ以上を含む、請求項19〜23のいずれか1項に記載のキット。
  25. 請求項19〜24のいずれか1項に記載のキットであって、ここで:
    (a)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの一部と相補的である配列を含む;
    (b)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの相補鎖の一部と相補的である配列を含む;
    (c)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライスドナーの下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が第2のPCAV 5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある;
    (d)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライスドナーの下流のPCAV配列の相補鎖の一部と相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が第2のPCAV 5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある;
    (e)前記第1プライマーが、N−Nにおけるスプライシング連結部位と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライシング連結部位の上流もしくは下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含む;
    (f)前記第1プライマーが、N−Nにおけるスプライシング連結部位の相補鎖と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライシング連結部位の上流または下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含む;
    (g)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの一部と相補的である配列を含む;
    (h)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの相補鎖の一部と相補的である配列を含む;
    (i)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である第1配列と、Nの一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の一部に相補的である配列を含む;
    (j)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である第1配列と、Nの相補鎖の一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の相補鎖の一部に相補的である配列を含む;
    (k)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、ポリAテイルの一部に相補的である配列を含む;
    (l)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、ポリAテイルの相補鎖の一部に相補的である配列を含む;
    (m)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの一部と相補的である配列を含む;
    (n)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの相補鎖の一部と相補的である配列を含む;
    (o)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である第1配列と、Nの一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の一部に相補的である配列を含む;
    (p)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である第1配列と、Nの相補鎖の一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の相補鎖の一部に相補的である配列を含む;
    (q)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、N10の一部と相補的である配列を含む;
    (r)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、N10の相補鎖の一部と相補的である配列を含む;
    (s)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である第1配列と、N10の一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の一部に相補的である配列を含む;
    (t)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である第1配列と、N10の相補鎖の一部と同一である第2配列とを含み、そして前記第2プライマーが、上流または下流のPCAV配列の相補鎖の一部に相補的である配列を含む;
    (u)前記第1プライマーが、配列番号111、配列番号112または配列番号53の第1部分と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、配列番号111、配列番号112または配列番号53の第2部分と相補的である配列を含み、その結果該プライマー対は、配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53の内にあるテンプレート配列、配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53からなるテンプレート配列または配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53を含むテンプレート配列を規定する;あるいは
    (v)前記第1プライマーが、配列番号111、配列番号112または配列番号53の相補鎖の第1部分と同一である第1配列を含み、そして前記第2プライマーが、配列番号111、配列番号112または配列番号53の相補鎖の第2部分と相補的である配列を含み、その結果該プライマー対は、配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53の内にあるテンプレート配列、配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53からなるテンプレート配列または配列番号111、配列番号112もしくは配列番号53を含むテンプレート配列を規定する、
    ここで、N〜N10は請求項5において規定される通りであり、そして「PCAV」は、ヒト22番染色体上の20.428メガベースに位置する内因性レトロウイルスである、
    キット。
  26. 以下:
    (a)22番染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスによってコードされる、ポリペプチド;
    (b)配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、および配列番号110からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、(a)のポリペプチド;
    )配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、および配列番号110のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、(a)のポリペプチド;
    )配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、もしくは配列番号110のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含む、(a)のポリペプチド;
    )式NH−XX−YY−ZZ−COOHを有するポリペプチドであって、ここで:
    XXは、xx個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    ZZは、zz個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    YYは、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、および配列番号110のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、もしくは配列番号110のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含む(a)のポリペプチド配列であり;
    該ポリペプチドNH−XX−YY−ZZ−COOHは、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、および配列番号110から選択されたポリペプチド配列のフラグメントではなく;
    xx+zzは少なくとも1である、ポリペプチド
    (f)配列番号1186および配列番号1188からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
    (g)配列番号1186および配列番号1188のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;
    (h)配列番号1186もしくは配列番号1188のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含むポリペプチド;
    (i)式NH −XX−YY−ZZ−COOHを有するポリペプチドであって、ここで:
    XXは、xx個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    ZZは、zz個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    YYは、配列番号1186および配列番号1188のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号1186もしくは配列番号1188のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含む、ポリペプチド配列であり;
    該ポリペプチドNH −XX−YY−ZZ−COOHは、配列番号1186および配列番号1188から選択されたポリペプチド配列のフラグメントではなく;
    xx+zzは少なくとも1である、ポリペプチド
    からなる群より選択される、ポリペプチド。
  27. 請求項26に記載のポリペプチドに結合する抗体。
  28. 請求項27に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号87、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号110、配列番号1186および/または配列番号1188の内のエピトープを認識する、抗体。
  29. HERV−K gagタンパク質を認識する、請求項27または請求項28に記載の抗体。
  30. 22番染色体上の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルス由来のgagを認識するが、他のHERV由来のgagは認識しない、請求項29に記載の抗体。
  31. 前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項28〜30のいずれか1項に記載の抗体。
  32. 請求項5に記載の方法であって、前記mRNA転写物が、以下:
    (a)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、第22染色体上
    の20.428メガベースに位置するヒト内因性レトロウイルスの、(1)最初の5’LTRから転写されたmRNAの5’末端から、(2)該最初の5’LTRから転写された該mRNAのU領域の下流の最初のスプライスドナー部位までのヌクレオチド配列であり、そして該Nが、スプライスアクセプター部位のすぐ下流のヌクレオチド配列であって、該スプライスアクセプター部位が、(1)該最初のスプライスドナー部位の下流、および(2)第2のスプライスドナー部位の上流に位置し、該第2のスプライスドナー部位は該内因性レトロウイルスの第2の5’LTRの下流である、mRNA転写産物;
    (b)配列−N−N−を含むmRNA転写物であって、該Nが、配列番号26および/または配列番号1201に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり、そして該Nが、配列番号27または配列番号28に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列である、mRNA転写産物;
    (c)配列番号24、配列番号25、配列番号1199または配列番号1200に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;
    (d)配列番号1191に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むmRNA転写物;および
    (e)配列番号98に対し、少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするmRNA転写物;
    からなる群から選択される、方法。
  33. 前記mRNA転写物が、配列番号24、配列番号25、および/または配列番号1191のうち1つ以上を含む、請求項6に記載の方法。
  34. 請求項13に記載の核酸であって、該核酸は、
    (a)ヌクレオチド配列−N−N−を含む核酸;
    (b)配列番号5、配列番号6、配列番号1199または配列番号1200に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸;
    (c)配列番号1191のヌクレオチド配列を含む核酸;
    (d)配列番号237〜241、253〜256、および417〜420のうち1つ以上を含む核酸;
    (e)ストリンジェント条件下で、請求項33に記載の(a)〜(e)において定義されるmRNA転写物にハイブリダイズし得る核酸;および
    (f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)の相補核酸;
    からなる群から選択され、NおよびNは請求項5において定義される、核酸。
  35. 配列番号5、配列番号6、配列番号9、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号417〜420、またはそれらの相補核酸のうち1つ以上を含む、請求項14に記載の核酸。
  36. 請求項15に記載のプローブであって、該プローブは、
    (a)PCAV核酸標的内で配列−N−N−(またはその相補配列)にハイブリダイズし得るが、単独のN配列にもN配列(またはこれらの相補配列単独)にもハイブリダイズしないプローブ;
    (b)配列番号5および/もしくは配列番号1199のフラグメント、または配列番号5および/もしくは配列番号1199のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (c)配列番号6および/もしくは配列番号1200のフラグメント、または配列番号6および/もしくは配列番号1200のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (d)配列番号1191のフラグメント、または配列番号1191のフラグメントの相補鎖に対し、90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブ;
    (e)配列番号47の少なくとも15個連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号47の相補鎖の少なくとも15個連続したヌクレオチドのフラグメントを含む、プローブ;
    (f)ヌクレオチド配列B1b−B2b(またはその相補鎖)を含むプローブであって、ここで、B1bは配列番号2の3’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含み、B2bは配列番号48の5’末端由来の6つ以上のヌクレオチドを含む、プローブ;
    (g)配列番号1191の少なくとも15個連続したヌクレオチドのフラグメント、または配列番号1191の相補鎖の少なくとも15個連続したヌクレオチドのフラグメントを含む、プローブ;
    からなる群より選択され、ここでNおよびNは請求項5において定義される通りであり、そして「PCAV」は、ヒト第22染色体上の20.428メガベースに位置する内因性レトロウイルスである、核酸プローブ。
  37. 配列番号11、配列番号12、配列番号50、および配列番号51(またはそれらの相補鎖)のうち1つ以上を含む、請求項16に記載のプローブ。
  38. 請求項17に記載の核酸であって、
    −Y−は、(a)配列番号5、6、11、12、24、25、47、49、50、51、88、99〜109、または配列番号1191のいずれかのy個のヌクレオチドのフラグメント、あるいは(b)(a)の相補鎖のいずれかからなるヌクレオチド配列であり;
    前記核酸5’−X−Y−Z−3’は、(i)配列番号5、6、11、12、24、25、47、49、50、51、88、99〜109、または配列番号1191のフラグメント、あるいは(ii)(i)の相補鎖のどちらでもない、
    核酸。
  39. 前記プライマーの1つが、配列番号237〜241および253〜256のヌクレオチド配列またはそれらの相補配列のうちの1つ以上を含む、請求項24に記載のキット。
  40. 請求項25に記載のキットであって、
    (a)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの一部と相補的である配列を含む;
    (b)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、Nの相補鎖の一部と相補的である配列を含む;
    (c)前記第1プライマーが、Nの一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライスドナーの下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が、第2のPCAV 5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある;
    (d)前記第1プライマーが、Nの相補鎖の一部と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、スプライスドナーの下流のPCAV配列の相補鎖の一部と相補的である配列を含み、ここで該スプライスドナーは、それ自体が、第2のPCAV 5’LTRの3’末端近くのスプライスアクセプターの下流にある;
    (e)前記第1プライマーが、N−Nにおけるスプライシング連結部位と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、該スプライシング連結部位の上流もしくは下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含む;
    (f)前記第1プライマーが、N−Nにおけるスプライシング連結部位の相補鎖と同一である配列を含み、そして前記第2プライマーが、該スプライシング連結部位の上流または下流のPCAV配列の一部と相補的である配列を含む;
    ここで、NおよびNは請求項5において規定される通りであり、そして「PCAV」は、ヒト22番染色体上の20.428メガベースに位置する内因性レトロウイルスである、キット。
  41. 請求項26に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
    (a)配列番号87および配列番号98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項26において定義される(a)のポリペプチド;
    )配列番号87および配列番号98のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項26において定義される(a)のポリペプチド;
    )配列番号87および配列番号98のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含む、請求項26において定義される(a)のポリペプチド;
    )式NH−XX−YY−ZZ−COOHを有するポリペプチドであって、ここで:
    XXは、xx個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    ZZは、zz個のアミノ酸からなるポリペプチド配列であり;
    YYは、配列番号87および配列番号98のうちの1つ以上に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、または配列番号87および配列番号98のT細胞エピトープまたはB細胞エピトープを含む、請求項26において定義される(a)のポリペプチド配列であり;
    該ポリペプチドNH−XX−YY−ZZ−COOHは、配列番号87および配列番号98から選択されたポリペプチド配列のフラグメントではなく;
    xx+zzは少なくとも1である、ポリペプチド
    からなる群より選択される、ポリペプチド。
  42. 請求項28に記載の抗体であって、該抗体は、配列番号87および/または配列番号98の内のエピトープを認識する、抗体。
  43. 診断における使用のための、請求項13〜18、26〜31、35〜38および41〜42のいずれか1項に記載の核酸、ポリペプチドまたは抗体を含む組成物。
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