JP4505749B2 - Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡとそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、アポトーシスの抑制因子として働くＢｃｌ−２タンパク質の発現抑制（ノックダウン）に用いるためのオリゴ二本鎖ＲＮＡ、および、Ｂｃｌ−２タンパク質のノックダウンまたはアポトーシスの促進が所望される疾患を治療および／または予防するための当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物に関する。

Ｂｃｌ−２タンパク質はアポトーシス（プログラム細胞死）の抑制因子として働くため、癌遺伝子として知られている（例えば、田中 信之、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、２００２年、３９巻、６号、ｐ．６３８−６４４参照）。Ｂｃｌ−２タンパク質の大量発現によりアポトーシスが抑制されることは、例えば、ＤＮＡに損傷を受けた細胞がアポトーシスを起こさなくなることによる癌化、および血液学的悪性疾患などの原因となると考えられている。実際に、Ｂｃｌ−２タンパク質はリンパ肉腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌および直腸癌などの様々な固形癌の部位に大量に産生されている（例えば、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ”、１９８９年３月、８６巻、６号、ｐ．１９５８−１９６２；Ｔ．Ｊ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、“Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９２年１２月１５日、５２巻、２４号、ｐ．６９４０−６９４４；Ｈ．Ｊｏｅｎｓｕｕら、“Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９４年１１月、１４５巻、５号、ｐ．１１９１−１１９８；Ｎ．Ｉｋｅｇａｋｉら、“Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、１９９４年１月１日、５４巻、１号、ｐ．６−８；および、Ｍ．Ｐ．Ｂｒｏｎｎｅｒら、“Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”、１９９５年１月、１４６巻、１号、ｐ．２０−２６を参照）。また、Ｂｃｌ−２タンパク質が大量に産生される細胞においては、そのアポトーシス抑制作用から、抗癌剤によっても細胞死が誘導されないため、様々な抗癌剤に対する薬物耐性を引き起こされる。したがって、固形癌および血液学的悪性疾患などのアポトーシスの促進が必要な疾患においてＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑えることは効果的な治療および／または予防となりうる。

これまでに、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制する方法として、アンチセンス法が研究されてきた（例えば、国際公開第９８／５６９０５号パンフレット；特表平１１−５０１５０９号公報；特表２００１−５０５４０１号公報；特表２００１−５０２１７２号公報；および、国際公開第０２／１７８５２ Ａ２号パンフレットを参照）。アンチセンス法は標的ＲＮＡの相補鎖を有するアンチセンスＤＮＡを細胞内に導入することで、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡのＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成させ、ＲＮａｓｅ Ｈの作用により標的ＲＮＡを切断することで、タンパク質の発現を抑制する方法である。しかしながら、アンチセンス法において利用するＲＮａｓｅ Ｈは核内に存在するため、アンチセンスＤＮＡを核内にまで移行させなければならない。また、アンチセンスＤＮＡは一般的に２０塩基程度の一本鎖オリゴＤＮＡであるが、血清を含む培地中や生体内、特に血中ではヌクレアーゼにより分解される。したがってＤＮＡのリン酸結合部位をホスホロチオエート型に置換するなど様々な化学修飾によりヌクレアーゼ抵抗性を持たせる必要がある点で煩雑である。さらに、アンチセンスＤＮＡによるＢｃｌ−２タンパク質の発現抑制によって細胞増殖を有効に抑えるためには、アンチセンスＤＮＡを数百ｎＭ〜数十μＭのオーダーで使用しなくてはならない。

ＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞に導入することにより、導入したｄｓＲＮＡと相補的なｍＲＮＡが特異的に分解され、したがって当該ｍＲＮＡのコードする遺伝子産物の合成が抑制される現象である。ＲＮＡｉは最初に線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において発見された現象（例えば、Ａ．Ｆｉｒｅら、“Ｎａｔｕｒｅ”、１９９８年、３９１巻、ｐ．８０６−８１１参照）であったが、その後、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、原虫（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、ヒドラ、植物（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、さらには哺乳動物細胞ではマウス胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、卵細胞および初期胚においても観察された（例えば、国際公開第０２／４４３２１ Ａ２号パンフレット；国際公開第０１／６８８３６ Ａ２号パンフレット；特表２００２−５１６０６２号公報を参照）。

一方、分化した哺乳動物細胞においては、線虫などと同様のＲＮＡｉによるタンパク質発現抑制効果を得る目的で、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡを導入してもＲＮＡｉの効果は観察されなかった。これは、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの侵入がウイルス感染として認識されることにより、インターフェロン応答として知られている２つの経路が活性化されたためである。一つの経路は、インターフェロンがｄｓＲＮＡ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を誘導し、このＰＫＲがｄｓＲＮＡと結合して活性化し、翻訳開始因子ｅＩＦ２αをリン酸化することによって翻訳を阻害する経路である。もう一方の経路はインターフェロンが２’−５’−オリゴアデニル酸合成酵素（２−５Ａ合成酵素）を誘導し、これがＲＮａｓｅ Ｌを活性化することでｍＲＮＡなどの１本鎖ＲＮＡを切断する経路である。これらの経路が活性化されると、細胞内の全ての遺伝子発現が低下する。したがって、３０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡの導入は、インターフェロン応答により細胞内の全ての遺伝子発現を低下させるため、標的遺伝子に特異的な発現抑制（ノックダウン）効果が得られなかったのである（例えば、Ｋ．Ｕｉ−Ｔｅｉら、“ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ”、２０００年、４７９巻、ｐ．７９−８２を参照）。
Ｔｕｓｃｈｌらの研究グループがショウジョウバエの細胞抽出液を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ系で、加えたｄｓＲＮＡが２１から２３塩基対のｄｓＲＮＡに分解されていることを見いだし、それらの分解されたＲＮＡが標的であるｍＲＮＡの配列認識のガイドとして働く仲介物質であることが示唆された（例えば、Ｐ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅら、“Ｃｅｌｌ”、２０００年３月３１日、１０１巻、１号、ｐ．２５−３３を参照）。そして、実際に化学合成した２１から２２塩基の二本鎖のＲＮＡを上記の反応系に添加することにより、標的ｍＲＮＡが切断されることが確かめられた。Ｔｕｓｃｈｌらのグループは、このようなＲＮＡｉによるタンパク質発現抑制活性を有する短い二本鎖のＲＮＡを、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と名づけた（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒら、“Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、２００１年１月１５日、１５巻、２号、ｐ．１８８−２００を参照）。またｓｉＲＮＡは、それを構成するそれぞれのＲＮＡ鎖の３’末端に２〜３塩基の一本鎖の状態で存在する部分、すなわち、いわゆる突出部を有するものが上記の反応系で強いタンパク質発現抑制活性をもつことが報告されている。さらにＴｕｓｃｈｌらのグループは、ｓｉＲＮＡが上記のインターフェロン応答の問題なしに、分化した哺乳動物細胞においても配列特異的な遺伝子発現抑制活性を示すことを報告した（例えば、国際公開第０１／７５１６４ Ａ２号パンフレット、およびＳ．Ｍ．Ｅｌｂａｓｈｉｒら、“Ｎａｔｕｒｅ”、２００１年５月２４日、４１１巻、ｐ．４９４−４９８を参照）。したがって、ｓｉＲＮＡを用いることで、哺乳動物においても、ＲＮＡｉを利用した標的遺伝子のノックダウンによる、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現抑制を行うことが可能となった。

ＲＮＡｉを利用したタンパク質発現抑制において、標的のｍＲＮＡを切断するために必要なタンパク質として、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ；ヌクレオチド分解酵素複合体）と呼ばれるタンパク質複合体が考えられている。ＲＩＳＣは二本鎖であるｓｉＲＮＡの３’突出部を認識してｓｉＲＮＡを複合体内に取り込み、ターゲットのｍＲＮＡ配列を認識するためのガイドとしていると考えられている。すなわち、この複合体はｓｉＲＮＡと同じ配列を持つｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断すると考えられている。

ＲＩＳＣは細胞質で形成するため、ＲＮＡｉを利用して標的遺伝子をノックダウンする方法においては、ｓｉＲＮＡを細胞質に導入すればよい、すなわち、核まで移行させなくてもよい、という利点がある。また、ｓｉＲＮＡは天然型のヌクレオチドの構成で十分な効果が得られ、修飾は必須ではない。さらに、導入するＲＮＡの量はアンチセンス法で導入するアンチセンスＤＮＡの量と比較して桁違いに少なくても十分な効果を有することからも、簡便で効果的な方法として着目されている。ｓｉＲＮＡを用いたＲＮＡｉに関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、森田 隆および吉田 佳世、「タンパク質 核酸 酵素」、２００２年、４７巻ｐ．１９３９−１９４５；牛田 千里、「タンパク質 核酸 酵素」、２００１年、４６巻、ｐ．１３８１−１３８６；田原 宏昭、「タンパク質 核酸 酵素」、２００１年、４６巻、ｐ．２０１７−２０２４；井垣 達吏および三浦 正幸、「遺伝子医学」、２００２年、６巻、ｐ．４５５−４６０；および、Ｊ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら、“Ｃｅｌｌ”、２００２年９月６日、１１０巻、５号、ｐ．５６３−５７４を参照）。また、アンチセンス鎖だけでもＲＮＡｉ効果の発現が認められたという報告もある（例えば、Ｊ．Ｍａｒｔｉｎｅｚら、“Ｃｅｌｌ”、２００２年９月６日、１１０巻、５号、ｐ．５６３−５７４を参照）。

ｓｉＲＮＡの細胞質への導入方法としては、カチオン性リポソームまたはその他のカチオン性担体などの担体をベクターとして用いる方法、およびリン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法など細胞に直接導入する方法、などが用いられている。また、ｓｉＲＮＡを細胞内で発現するようｓｉＲＮＡをコードする配列を組み込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法も研究されている（例えば、Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２００２年５月、２０巻、５号、ｐ．４９７−５００；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅら、“Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”、２００２年５月、２０巻５号、ｐ．５００−５０５；および、Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、“Ｓｃｉｅｎｃｅ”、２００２年４月１９日、２９６巻、ｐ．５５０−５５３を参照）。

ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡに関しては、いくつかの報告（たとえば、国際公開第０２／０５５６９２ Ａ２号パンフレット；国際公開第０２／０５５６９３ Ａ２号パンフレット；Ｔ．Ｆｕｔａｍｉら、“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ”、２００２年、２号、ｐ．２５１−２５２；Ｄ．Ｐ．ＣｉｏｃａとＹ．Ａｏｋｉ、“Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”、２００３年、１０号、ｐ．１２５−１３３；および、Ｍ．ＪｉａｎｇとＪ．Ｍｉｌｎｅｒ、“Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”、２００３年、１７号、ｐ．８３２−８３７を参照）があるが、いずれも、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡとは異なる配列を有しているか、または具体的な配列が示されていない。

本発明は、アポトーシスの抑制因子として働くＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制することができるオリゴ二本鎖ＲＮＡを提供する。また、本発明は、癌または血液学的悪性疾患などのアポトーシスの促進が所望される疾患を治療および／または予防するための医薬組成物を提供する。

［図１］図１は、一次スクリーニングで得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡをＡ４３１細胞内にトランスフェクションして、２４時間培養した後の、その細胞におけるｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより準定量した結果を示す。縦軸は陰性対照ＧＬ３をトランスフェクションしたときのｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量を１とした時、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡのトランスフェクション時のｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量を示す。横軸は検討を行ったオリゴ二本鎖ＲＮＡの名称を示す。
［図２］図２ａおよびｂは、オリゴ二本鎖ＲＮＡとしてＢ７１７、Ｂ０４３およびＢ５３３をＡ４３１細胞内にトランスフェクションして２４時間培養した後の、その細胞におけるｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量（図２ａ）および構成的発現遺伝子であるＧＡＤＰＨのｍＲＮＡ量（図２ｂ）をＲＴ−ＰＣＲにより準定量した結果を示す。図２ｃは、Ｂ７１７、Ｂ０４３およびＢ５３３を終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の、その細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す。
［図３］図３は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロッティングで行った結果を示す。上段は終濃度３ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の結果である。
［図４］図４は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロッティングで行った結果を示す。上段は終濃度３ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の結果である。
［図５］図５は、選択したオリゴ二本鎖ＲＮＡの細胞増殖に対する効果をセルカウンティングアッセイにより評価した結果を示す。細胞はＡ４３１細胞を用い、オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした後、６日間培養した後の細胞数を測定した。縦軸は、オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしていないＡ４３１細胞の細胞数を１００％としたときの、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしたときの細胞数の割合を示す。横軸は、トランスフェクションしたときの終濃度を示す。
［図６］図６は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロッティングで行った結果を示す。オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度３ｎＭおよび１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションして７２時間培養した後の結果である。
［図７］図７は、Ａ５４９細胞移植後１００日までのマウスの生存数を示す。●は対照群、○はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ７１７を週１回投与した群、および、▲はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ７１７を週３回投与した群の結果である。
［図８］図８は、Ａ５４９細胞移植後１００日までのマウスの生存数を示す。細い線は対照群、太い線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を投与した群の結果である。
［図９］図９は、Ａ５４９細胞移植後６９日までのマウスの生存数を示す。細い線は対照群、点線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を１ｍｇ／ｋｇ体重で投与した群、グレーの線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を３ｍｇ／ｋｇ体重で投与した群、および太い線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与した群の結果である。
［図１０］図１０は、Ａ５４９細胞移植後６９日までのマウスの生存数を示す。細い線は対照群、太い線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を週５回の頻度で計１２回投与した群、および点線はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を週５回の頻度で計５回投与した群の結果である。なお、点線は太い線と重なっている。
［図１１］図１１は、ＰＣ−３細胞移植後３６日までのマウスの腫瘍体積を示す。◆は対照群、□はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３を投与した群、▲はオリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ７１７を投与した群の結果である。
［図１２］図１２は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１００ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１３］図１３は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１０ｎＭで、下段は終濃度３ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１４］図１４は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１００ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１５］図１５は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１００ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１６］図１６は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１００ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１７］図１７は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１０ｎＭで、下段は終濃度３ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。
［図１８］図１８は、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価をウエスタンブロティングで行った結果を示す。上段は終濃度１００ｎＭで、下段は終濃度１０ｎＭでＡ４３１細胞内にトランスフェクションしたものの結果を表す。

Ｂｃｌ−２の発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡ
本発明者らは、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの配列として、遺伝子データベースに登録されているものを比較検討したところ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８として登録されているｂｃｌ−２の完全長ｍＲＮＡの配列がコンセンサスであることを確認した。このＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８の塩基配列（配列番号１９７）に基づいて、一次、二次、三次スクリーニングを行い、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制する活性を有する、オリゴ二本鎖ＲＮＡを選択した。

本明細書においてオリゴ二本鎖ＲＮＡとは、１５から２７塩基対の二重鎖形成部を有する、１５から３１ヌクレオチドのＲＮＡ（一部にデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドを含みうる；以下この段落について同じ）の対であって、このＲＮＡの対の細胞内への導入によりオリゴ二本鎖ＲＮＡと相補的なｍＲＮＡを切断することで、そのｍＲＮＡがコードする遺伝子産物の合成が抑制される活性を有するＲＮＡの対と定義される。

また、本明細書においてオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｔｕｓｃｈｌらが報告しているｓｉＲＮＡに限るものではない。例えば、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいては、３’末端の突出部は必ずしも必要とせず、片方の鎖の塩基数も１９〜２５塩基に限るものではない。本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１５〜３１ヌクレオチドの対であり、１７〜２３ヌクレオチドの対が好ましく、また、２５〜２７ヌクレオチドの対も好ましい。

また、本明細書で二重鎖形成部とは、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいて、当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の対が二重鎖を形成している部分であって、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに対応するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む部分をいう。そして、それぞれのＲＮＡ鎖の二重鎖形成部につづく３’側または５’側に一本鎖がある場合には、これを突出部と呼ぶ。

スクリーニングの詳細は実施例に示すが、簡単に述べると：一次スクリーニングは、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）内から、約９塩基毎に始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるプールからスクリーニングを行った。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたオリゴ二本鎖ＲＮＡに対応するｂｃｌ−２のｍＲＮＡの配列を中心に、３塩基毎にずらした配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡのスクリーニングを行った。三次スクリーニングでは、二次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたオリゴ二本鎖ＲＮＡに対応するｂｃｌ−２のｍＲＮＡの配列を中心に、１塩基毎にずらした配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡのスクリーニングを行った。また、オリゴ二本鎖ＲＮＡにおける様々な長さの突出部を有する配列、および塩基数の短い配列についても、そのＢｃｌ−２発現抑制活性を評価して、スクリーニングを行った。

選択した配列を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価は、後述の実施例に詳細を示すが、当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを培養系の癌細胞などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、所定時間培養した後、当該癌細胞におけるＢｃｌ−２タンパク質発現量およびその低下度をウエスタンブロッティングで評価することにより行った。また、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより準定量し、および／または、細胞増殖を抑制する効果をセルカウンティングアッセイにより、評価した。

本発明者らは上記スクリーニングの結果、配列番号１ないし配列番号８１、配列番号２４０ないし配列番号２５６、および配列番号２７４ないし配列番号２８０から選ばれる塩基配列を有する核酸、および当該塩基配列と相補鎖を形成する配列を含む、配列番号８２ないし配列番号１６２、配列番号２５７ないし配列番号２７３、および配列番号２８１ないし配列番号２８７から選ばれる塩基配列を有する核酸の対からなるオリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたときにＢｃｌ−２タンパク質の発現が大きく低下することを見いだした。さらに、上記の配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいては、突出部の有無に関わらず、また、二重鎖形成部が短くてもＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制できることを見いだした。

３’突出部の配列は活性に影響しないことを本発明者らは明らかにしたので、本発明は、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制することができるオリゴ二本鎖ＲＮＡであって、配列番号１ないし配列番号８１、配列番号２４０ないし配列番号２５６、および配列番号２７４ないし配列番号２８０から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなるセンス鎖ＲＮＡ、およびその相補鎖として、配列番号８２ないし配列番号１６２、配列番号２５７ないし配列番号２７３、および配列番号２８１ないし配列番号２８７から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなるアンチセンス鎖ＲＮＡの対で形成される二本鎖ＲＮＡを構成する塩基対、またはその少なくともいずれか一方の端が合計４塩基対まで削除されていてもよい１５〜１９塩基対を二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡを提供する。

本発明の一態様において、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、二重鎖形成部のＲＮＡ対のうち、一方または両方の配列中の塩基の一部に、１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加を有していてもよい。本発明の別の態様において、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、二重鎖形成部のＲＮＡ対のうち、一方もしくは両方のリボヌクレオチドの一部またはセンス鎖の全部がデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されていてもよい。

本発明の望ましい態様は、センス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡの対が、配列番号１１および配列番号９２、配列番号３０および配列番号１１１、配列番号３６および配列番号１１７、配列番号４３および配列番号１２４、配列番号５５および配列番号１３６、配列番号６２および配列番号１４３、または、配列番号７７および配列番号１５８、に示される塩基配列の対において、それぞれ３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分を二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡである。

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは少なくとも一方のＲＮＡの３’末端または５’末端にヌクレオチドを１ないし４塩基を突出部として有していても、有していなくてもよい。特に、上記配列番号に係る塩基配列の対で示される７つのオリゴ二本鎖ＲＮＡに関しては、突出部がなくとも強いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有する。

突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチドであってもよく、または、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。特に望ましい態様は、突出部としてヌクレオチドを２塩基有するオリゴ二本鎖ＲＮＡである。さらに望ましくは、突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵ、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと一致する配列、または、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列である。

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成しているリボースまたはリン酸バックボーンなどの、少なくとも一部が修飾されていてもよい。修飾される場合、望ましい修飾は、糖の２’位の修飾、糖のその他の部分の修飾、オリゴ二本鎖ＲＮＡのリン酸バックボーンの修飾等である。糖の２’位の修飾は、リボースの２’水酸基をＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどに置換する修飾である。ここで、Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンを示す。糖のその他の部分の修飾体は、４’チオ体などが挙げられる。リン酸バックボーンの修飾体としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体などが挙げられる。

特に望ましい本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂ０４３、Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５３３、Ｂ６１４、Ｂ６３１およびＢ７１７であり、以下にこれらの配列を示す。

Ｂ０４３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４３６：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４６９：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６１４：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６３１：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ７１７：
センス鎖

アンチセンス鎖

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、細胞にトランスフェクションしたとき、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を、当該オリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合に比べて抑制することができる。アンチセンスＤＮＡを用いたＢｃｌ−２タンパク質の発現抑制においては、一般的にアンチセンスＤＮＡを数百ｎＭから数十μＭの濃度で必要とするのと比較して、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、数ｎＭ〜数百ｎＭの濃度でも、細胞にトランスフェクションした後、２４時間以上、例えば７２時間培養した段階でＢｃｌ−２タンパク質発現をオリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合と比較して抑制することができる。望ましくは、オリゴ二本鎖ＲＮＡを３〜１０ｎＭの濃度でＡ４３１細胞（上皮癌細胞）にトランスフェクションした後、７２時間培養した段階でＢｃｌ−２タンパク質発現をオリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合と比較して抑制することができる。

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖単独またはアンチセンス鎖単独の一本鎖の核酸も本発明の範囲内である。すなわち、配列番号１ないし配列番号１６２から選ばれるいずれか１つの塩基配列において３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなるＲＮＡを二重鎖形成部として含む核酸である。

本発明の一態様において、本発明の核酸は、二重鎖形成部のＲＮＡ配列中の塩基の一部に、１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加を有していてもよい。

本発明の核酸は、二重鎖形成部のＲＮＡの３’末端にヌクレオチドを１ないし４塩基を突出部として有していても、有していなくてもよい。突出部のヌクレオチドはリボヌクレオチドであってもよく、または、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。特に望ましい態様は、突出部としてヌクレオチドを２塩基有する核酸である。さらに望ましくは、突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵ、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと一致する配列、または、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列である。

また、本発明の核酸は、配列番号１６３ないし配列番号１９６、ならびに、配列番号１９８ないし配列番号２３９から選ばれるいずれか１つの塩基配列を有する核酸である。

本発明の別の態様において、本発明の核酸は、二重鎖形成部のＲＮＡ配列のリボヌクレオチドの一部がデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されていてもよい。

また、配列番号１ないし配列番号１６２、および配列番号２４０ないし配列番号２８７から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列を有し、さらに当該塩基配列中のウリジン（Ｕ）がチミン（Ｔ）である塩基配列をデオキシリボヌクレオチドとして含む核酸も本発明の範囲内である。これらの核酸は、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生産するためのプラスミドに組み込まれてもよく、または、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡをインビトロ転写反応で得るためのテンプレートＤＮＡとして用いてもよい。または、アンチセンスプローブとして用いてもよい。さらに、上記の核酸はその塩基配列中に１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加した塩基を含み、かつ、当該核酸がテンプレートとなって転写反応などにより生成したＲＮＡが、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成したときにＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有する、という特徴を有する核酸であってもよい。

さらに、本発明は、上記のスクリーニングで得られた特に望ましい本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡ：Ｂ０４３（配列番号１１および配列番号９２）、Ｂ４３６（配列番号３０および配列番号１１１）、Ｂ４６９（配列番号３６および配列番号１１７）、Ｂ５３３（配列番号４３および配列番号１２４）、Ｂ６１４（配列番号５５および配列番号１３６）、Ｂ６３１（配列番号６２および配列番号１４３）、およびＢ７１７（配列番号７７および配列番号１５８）のオリゴ二本鎖ＲＮＡの１９塩基対の二重鎖形成部を含む、２５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡから、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡをスクリーニングする方法を提供する。

また、本発明は、Ｂ０４３、Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５３３、Ｂ６１４、Ｂ６３１、およびＢ７１７からなる群から選択されるオリゴ二本鎖ＲＮＡの１９塩基対の二重鎖形成部を含む、２５から２７塩基対の二重鎖形成部を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡであって、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡをも提供する。

本発明者は上記Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を測定した結果、配列番号２８８ならびに配列番号２９５ないし配列番号３００から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴおよび５’末端の６塩基を除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて６塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に一致する配列を有する核酸、および当該塩基配列と相補鎖を形成する配列を含む、配列番号３１９ならびに配列番号３２６ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴおよびそれに続く６塩基を除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて６塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有する核酸との対からなる二重鎖形成部を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたときにＢｃｌ−２タンパク質の発現が大きく低下することを見いだした。

本発明の好ましい態様は、センス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡの対が、配列番号２８８および配列番号３１９の塩基配列、配列番号２８９および配列番号３２０の塩基配列、配列番号２９０および配列番号３２１の塩基配列、配列番号２９１および配列番号３２２の塩基配列、配列番号２９２および配列番号３２３の塩基配列、配列番号２９３および配列番号３２４の塩基配列、配列番号２９４および配列番号３２５の塩基配列、配列番号２９５および配列番号３２６の塩基配列、配列番号２９６および配列番号３２７の塩基配列、配列番号２９７および配列番号３２８の塩基配列、配列番号２９８および配列番号３２９の塩基配列、配列番号２９９および配列番号３３０の塩基配列、または配列番号３００および配列番号３３１の塩基配列に示される塩基配列の対において、それぞれ３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分を二重鎖形成部として含む２５塩基対のオリゴ二本鎖ＲＮＡである。

突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチドであってもよく、または、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。特に望ましい態様は、突出部としてヌクレオチドを２塩基有するオリゴ二本鎖ＲＮＡである。さらに望ましい態様は、センス鎖ＲＮＡの３’末端突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵまたは二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部と一致する配列を有し、アンチセンス鎖ＲＮＡの３’末端突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵまたは二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡである。

また、本発明者は、本発明の一態様において、配列番号２８８ないし配列番号３００から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて２塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に一致する塩基配列を有する核酸、および当該塩基配列と相補鎖を形成する配列を含む、配列番号３１９ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて２塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に相補的な塩基配列を有する核酸の対からなる二本鎖ＲＮＡである２７塩基対のオリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたときに、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が大きく低下することを見いだした。

本発明の好ましい態様は、センス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡの対が、配列番号３０３および配列番号３３２の塩基配列、または配列番号３０４および配列番号３３４の塩基配列からなる二本鎖ＲＮＡで構成される２７塩基対のオリゴ二本鎖ＲＮＡである。

また、本発明の一態様において、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、二重鎖形成部のＲＮＡ対のうち、一方または両方の配列中の塩基の一部に、１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加を有していてもよい。

さらに、本発明の別の態様において、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、二重鎖形成部のＲＮＡ対のうち、一方もしくは両方のリボヌクレオチドの一部またはセンス鎖の全部がデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されていてもよい。

本発明の望ましい態様は、センス鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖ＲＮＡの対が、配列番号３０５および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３０６および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３０７および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３０８および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３０９および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３１０および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３１１および配列番号３１９の塩基配列、配列番号３１２および配列番号３２０の塩基配列、配列番号３１３および配列番号３２１の塩基配列、配列番号３１４および配列番号３２２の塩基配列、配列番号３１５および配列番号３２３の塩基配列、配列番号３１６および配列番号３２４の塩基配列、または、配列番号３１７および配列番号３２５の塩基配列に示される塩基配列の対において、それぞれ３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分を二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡである。

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ヌクレアーゼ耐性など、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成しているリボースまたはリン酸バックボーンなどの、少なくとも一部が修飾されていてもよい。修飾される場合、望ましい修飾は、糖の２’位の修飾、糖のその他の部分の修飾、オリゴ二本鎖ＲＮＡのリン酸バックボーンの修飾等である。糖の２’位の修飾は、リボースの２’水酸基をＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉなどに置換する修飾である。ここで、Ｒはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ’はアルキレン、好ましくは炭素数１〜６のアルキレンを示す。糖のその他の部分の修飾体は、４’チオ体などが挙げられる。リン酸バックボーンの修飾体としては、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体などが挙げられる。

特に望ましい本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂ０３７−２５、Ｂ０３８−２５、Ｂ０３９−２５、Ｂ−０４０−２５、Ｂ０４１−２５、Ｂ０４２−２５、Ｂ０４３−２５、Ｂ４３０−２５、Ｂ４６３−２５、Ｂ５２７−２５、Ｂ６０８−２５、Ｂ６２５−２５およびＢ７１１−２５であり、以下にこれらの配列を示す。
Ｂ０３７−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０３８−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０３９−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０４０−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０４１−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０４２−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ０４３−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ４３０−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ４６３−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ５２７−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ６０８−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ６２５−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

Ｂ７１１−２５：
センス鎖：

アンチセンス鎖：

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、細胞にトランスフェクションしたとき、当該オリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合に比べて、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制することができる。アンチセンスＤＮＡを用いたＢｃｌ−２タンパク質の発現抑制においては、一般的にアンチセンスＤＮＡを数百ｎＭから数十μＭの濃度で必要とするのと比較して、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡは、数ｎＭ〜数百ｎＭの濃度でも、細胞にトランスフェクションした後、２４時間以上、例えば７２時間培養した段階で、オリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合と比較して、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制することができる。望ましくは、オリゴ二本鎖ＲＮＡを３〜１０ｎＭの濃度でＡ４３１細胞（上皮癌細胞）にトランスフェクションした後、７２時間培養した段階でオリゴ二本鎖ＲＮＡが存在しない場合と比較して、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制することができる。

本発明の核酸を構成するセンス鎖単独またはアンチセンス鎖単独の一本鎖の核酸も本発明の範囲内である。すなわち、配列番号２８８ならびに配列番号２９５ないし配列番号３００から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴおよび５’末端の６塩基を除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて６塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部と一致する塩基配列を有する核酸、若しくは、配列番号３１９ならびに配列番号３２６ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴおよびそれに続く６塩基を除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて６塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部と相補的な塩基配列を有する核酸である。

本発明の一態様において、本発明の核酸は、二重鎖形成部のＲＮＡ配列中の塩基の一部に、１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加を有していてもよい。

本発明の核酸は、突出部のヌクレオチドはリボヌクレオチドであってもよく、または、デオキシリボヌクレオチドであってもよい。特に望ましい態様は、突出部としてヌクレオチドを２塩基有する核酸である。さらに望ましくは、突出部としてｄＴｄＴ、ＵＵ、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに一致する配列、または、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに相補的な配列である。

好ましくは、本発明の核酸は、配列番号２８８ないし配列番号３００、ならびに、配列番号３１９ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列を有する核酸である。

また、本発明の核酸は、配列番号２８８ないし配列番号３００から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて２塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部と一致する塩基配列を有する核酸、若しくは、配列番号３１９ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列の３’末端および／または５’末端に、あわせて２塩基を付加した、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの一部に相補的な塩基配列を有する核酸である。

好ましくは、本発明の核酸は、配列番号３０３ないし配列番号３０４、ならびに、配列番号３３２ないし配列番号３３４から選ばれるいずれか１つの塩基配列を有する核酸である。

本発明の別の態様において、配列番号２８８ないし配列番号３００、ならびに、配列番号３１９ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列を有し、当該塩基配列中のリボヌクレオチドの一部がデオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されている塩基配列を含む核酸も本発明の範囲内である。

また、配列番号２８８ないし配列番号３００、ならびに、配列番号３１９ないし配列番号３３１から選ばれるいずれか１つの塩基配列における３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる塩基配列を有し、さらに当該塩基配列中のウリジン（Ｕ）がチミン（Ｔ）である塩基をデオキシリボヌクレオチドとして含む核酸も本発明の範囲内である。これらの核酸は、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生産するためのプラスミドに組み込まれてもよく、または、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡをインビトロ転写反応で得るためのテンプレートＤＮＡとして用いてもよい。または、アンチセンスプローブとして用いてもよい。さらに、上記の核酸はその塩基配列中に１ないし複数の欠失、置換、挿入または付加した塩基を含み、かつ、当該核酸がテンプレートとなって転写反応などにより生成したＲＮＡが、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成したときにＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有する、という特徴を有する核酸であってもよい。

本発明のＲＮＡおよびＤＮＡは、当業者に既知のホスホアミダイト法またはトリエステル法により固相で、または液相で合成できる。最も一般的な態様はホスホアミダイト法による固相合成法であり、核酸自動合成機または手動にて合成することができる。固相での合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度９０％以上、好ましくは９５％以上の核酸を得るのが望ましい。オリゴ二本鎖ＲＮＡとして用いる場合には、合成・精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖１当量に対して、センス鎖０〜１０当量、好ましくは０．５〜２当量、更に好ましくは０．９〜１．１当量、最も好ましくは等モル量、で混合した後、アニーリングして用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、典型的には、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、９４℃程度で５分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行うが、当業者に知られる他の条件により行ってもよい。

本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡはカチオン性リポソーム、その他のトランスフェクション用のベクターなどの担体を用いて細胞内にトランスフェクションしてもよい。また、本発明の別の態様においては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入してもよい。

医薬組成物
本発明は、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡと当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効な担体との複合体を含むことを特徴とする医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物はＢｃｌ−２タンパク質の過剰発現が原因となっている疾患、アポトーシスの促進が所望される疾患、または血液学的悪性疾患などの治療および／または予防のために用いることができる。これらの疾患は、具体的には、リンパ腫及び白血病の両方を含む血液学的悪性疾患、および固形腫瘍、例えば、肝臓癌、皮膚癌、乳癌、肺癌、消化器癌、前立腺癌、子宮癌、膀胱癌などである。

オリゴ二本鎖ＲＮＡとの複合体を形成する担体は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効な、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどのカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体などを用いてよい。カチオン性リポソームとして望ましいものは、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールを含有するリポソーム（以下リポソームＡと表記する）、オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＴｒａｎｓＩＴ ＴＫＯ（Ｍｉｒｕｓ）、などである。カチオン性ポリマーとして望ましいものは、ＪｅｔＳＩ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（ポリエチレンイミン；Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）などである。ウイルスエンベロープを利用した担体として望ましいものは、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（ＨＶＪ−Ｅリポソーム；石原産業）などである。

本発明の医薬組成物に含まれるオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体は、当業者に既知の方法により調製することができる。簡単に述べると、適当な濃度の担体分散液とオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液とを混合して調製する。カチオン性担体を用いる場合、オリゴ二本鎖ＲＮＡは水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによってオリゴ二本鎖ＲＮＡとカチオン性担体は容易に複合体を形成する。複合体形成のために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などを用いてよい。また、複合体を形成させる際のｐＨおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。例えば、リポソームＡの場合、１０％マルトース水溶液中の１６ｍｇ／ｍｌのリポソーム分散液に、１０％マルトース水溶液中のオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液を、ｐＨ７．４、２５℃で撹拌しながら徐々に添加して調製できる。

複合体は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。当業者であれば、担体とオリゴ二本鎖ＲＮＡの複合体の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、用いる担体に最適な方法を選択できる。

本発明の医薬組成物に含まれるオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体の配合比は、オリゴ二本鎖ＲＮＡ１重量部に対して担体１〜２００重量部が適当である。望ましくは、オリゴ二本鎖ＲＮＡ１重量部に対して２．５〜１００重量部、さらに望ましくは１０〜２０重量部である。

本発明の医薬組成物にはオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、治療および／または予防に有効量の複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点滴剤などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤、または凍結乾燥製剤であってもよい。

液剤の場合、本複合体が、０．００１〜２５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在しているものが適当であり、好ましくは０．０１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在し、より好ましくは０．１〜２％（ｗ／ｖ）の濃度範囲内で存在するのが適当である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例えば、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）；アルブミン、デキストランなどの乳化補助剤；コレステロール、ホスファチジン酸などの安定化剤；塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロースなどの等張化剤；塩酸、硝酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンなどのｐＨ調製剤；などを挙げることができる。医薬的に許容される任意の添加剤は、本複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。

凍結乾燥製剤は、オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体との複合体を分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備乾燥を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。

本発明の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、または５００ｍｌ以下が適当である。

本発明の医薬組成物は、投与単位形態で投与することが望ましく、ヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができ、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよい。特に静脈投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましい。また、癌内局所投与などの局所投与することもできる。これらの投与方法に適した剤型、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等で投与されるのはもちろんである。

例えば、本発明の医薬組成物の用量は、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は、成人に対してオリゴ二本鎖ＲＮＡ量として１日当たり、０．１ｍｇ〜１０ｇ／日／ヒトの範囲が、好ましくは１ｍｇ〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲が一般的である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日１〜数回投与、または１〜数日の間隔で投与することができる。

また、本発明の別の態様においては、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生じるために用いられるＤＮＡを医薬的に許容される添加剤などと一緒に医薬組成物とすることができる。ここで、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生じるために用いられるＤＮＡは、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡの二重鎖形成部の塩基配列をデオキシリボヌクレオチドとして有する（ここで、ヌクレオチド配列中のウリジンはチミンに変換される）ＤＮＡを含む、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生産するためのプラスミドなどを意味する。このような医薬組成物は患者に投与されると、患者の生体内において本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生じるので、前述した本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡと適切な担体を含む医薬組成物と同様の効果を有する、すなわち、Ｂｃｌ−２の過剰発現が原因となっている疾患などの治療および／または予防に有効である。投与形態および投与経路は、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体を含む医薬組成物の場合と同様に、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよく、用量もまた同様に、薬物、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、病気の性質と程度などを考慮した上で決定してよい。

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。

実施例１ スクリーニングとその評価
ｉ）オリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の合成は、自動核酸合成装置を用いた標準的なホスホアミダイト法による固相合成で行った。合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（米国 コロラド州）又は日本バイオサービス（埼玉県）に合成を依頼するか、または本発明者らが行った。

本発明者らが行った手順を簡単に述べる。自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）を用いて、標準的なホスホアミダイト法により所望の塩基配列を形成するよう、モノマーを逐次縮合した。濃水酸化アンモニウム−エタノール（３：１）混合液を用いてＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）よりヌクレオチド鎖を開裂させ、さらに同溶液中で５５℃、１８時間おいて脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて室温で２０時間処理し、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴリボヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーにて精製した。さらに、８０％酢酸水溶液にて室温で３０分処理し、５’位のＤＭＴｒ基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。脱塩後に得られたオリゴヌクレオチドは、キャピラリーゲル電気泳動により９０％以上が目的の全長物質であることを確認した。

こうしてオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な２本の核酸を、後述するように等モルで混合することでオリゴ二本鎖ＲＮＡとして用いた。

ｉｉ）スクリーニングにおける評価方法
スクリーニングにおける評価は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを担体と共に各種癌細胞に導入し、タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングで定量することにより、および、ｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により準定量することにより行った。

オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体の調製
担体として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールと精製卵黄レシチンを含むリポソームＡを用い、オリゴ二本鎖ＲＮＡとの複合体を調製した。オリゴ二本鎖ＲＮＡ１重量部に対してリポソームＡ１６重量部を混合して複合体を調製した。以下に、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度１０μＭの複合体溶液、２ｍｌの調製について示す。ただし、オリゴ二本鎖ＲＮＡ複合体の濃度は、オリゴ二本鎖ＲＮＡが完全に二本鎖形成していると仮定したときに複合体に含まれているオリゴ二本鎖ＲＮＡのモル濃度で示している。

３００μＭになるように注射用水に溶解したセンス鎖およびアンチセンス鎖それぞれ６６．６μｌを試験管中で混合した。これに８６６．８μｌの１０％マルトースを添加し、両鎖をそれぞれ２０μＭの濃度で含む溶液１ｍｌを調製した。これをオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液とした。

１６ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液２６８μｌに１０％マルトース７３２μｌを添加し、４．３ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液１ｍｌを調製した。このリポソーム分散液１ｍｌに上記オリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液１ｍｌを、撹拌しながら徐々に添加した。以上の操作により、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度が１０μＭであるオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体溶液を調製した。この複合体を６００Ｗのバス型超音波装置を用いて２分間分散処理することにより複合体の粒子を均一にした。

ウエスタンブロッティング
上記のオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体を用いてオリゴ二本鎖ＲＮＡが細胞内にトランスフェクションされることで、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が抑制されるかどうかをウエスタンブロッティングによりＢｃｌ−２タンパク質の量の変化を評価することで評価した。

６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）、Ａ３７５細胞（メラノーマ細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌細胞）、またはＡ５４９（肺癌）細胞を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときのオリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度は３ｎＭまたは１０ｎＭである。３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーター内にて７２時間培養した。細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、セルスクレーパーを用いて１．５ｍｌチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いた後、２０〜１００μｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ−４０）を加えて細胞を溶解した。氷上で３０分間静置し、１００，０００×ｇで１５分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、電気泳動用サンプルとした。

電気泳動はポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ ＮＰＧ−５２０Ｌ又はＥ−Ｔ５２０Ｌ）を用い、１レーンあたり総タンパク質の量を１５μｇとしたサンプルをアプライした。泳動終了後、ポリビニリデンフルオラド（ＰＶＤＦ）膜にゲル内のタンパク質を転写し、５％スキムミルク含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ−ＭＬＫ；ここで、ＰＢＳＴの組成は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）中室温で１時間ブロッキングした。まず、Ｂｃｌ−２タンパク質の検出を行った。ブロッキングが終了したＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍に希釈したマウス抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ Ｍ０８８７）中にて、４℃で一晩振盪して一次抗体と結合させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴ−ＭＬＫで１５００倍に希釈したＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ Ｐ０４４７）中にて室温で２時間振盪し、二次抗体と結合させた。ＰＢＳＴで洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光させ、フィルムに露光した。

Ｂｃｌ−２タンパク質の検出終了後、同じＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、Ｂｃｌ−２と同様にＡｃｔｉｎタンパク質の検出を行った。一次抗体にはヤギ抗ヒトＡｃｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−１６１６）を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ Ｐ０４４９）を用いた。それぞれＰＢＳＴ−ＭＬＫで２５００倍、３０００倍に希釈して使用した。

バンドの濃さの判断は、ルシフェラーゼの発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ（ＧＬ３）をトランスフェクションした時のＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さを陰性対照に、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するＢ７１７オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした時のＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さを陽性対照として、目視により行った。目視の結果、バンドの濃さが陽性対照と同等である場合には「＋」、陽性対照よりも薄い場合には「＋＋」、陰性対照よりも薄いが、陽性対照よりも濃い場合には「＋−」とした。なお、二重鎖形成部が２５塩基対以上のオリゴ二本鎖ＲＮＡの場合には、処理濃度が１０ｎＭにおいて陰性対照よりも十分に薄い場合には「＋＋」、僅かに薄い場合には「＋」とし、処理濃度が１００ｎＭにおいて、陰性対照よりも僅かに薄い場合には「＋−」とした。

本明細書において、「活性を保持する」とは、上記と同様に、試験対象のオリゴ核酸ＲＮＡをトランスフェクションした時のＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さ（活性）が「＋−」「＋」「＋＋」以上であることを意味する。

ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ量の準定量
オリゴ二本鎖ＲＮＡのトランスフェクションによるＢｃｌ−２タンパク質発現抑制作用はｍＲＮＡの発現抑制に起因するかどうかを調べるため、ｂｃｌ−２のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲによる準定量により評価した。

６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）を２×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときのオリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度は１０ｎＭである。ＣＯ_２インキュベーター内にて２４時間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、０．５ｍｌのＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン）を用いて細胞を溶解し、１．５ｍｌチューブに移した。２００μｌのクロロホルムを加え、水層と有機層とに分離し、水層からトータルＲＮＡを単離した。

トータルＲＮＡ２μｇを鋳型に、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ １１１４６−０１６）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作成した。この逆転写反応液中に含まれるｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型に用い、キャピラリーＰＣＲ法による検出定量システム（ライトサイクラー、ロッシュ・ダイアグノスティックス）を用いてｂｃｌ−２および構成的発現遺伝子であるＧＡＤＰＨ（Ｄ−ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）特異的なＰＣＲ増幅を行い、ｍＲＮＡ量の準定量を行った。ｂｃｌ−２のＰＣＲ増幅には１００ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡを、ＧＡＤＰＨのＰＣＲ増幅には０．５ｎｇのトータルＲＮＡ由来のｃＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いた。陰性対照としてはルシフェラーゼの発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ（ＧＬ３）でトランスフェクションしたものを用いた。サンプルのｍＲＮＡ量は陰性対照における、ｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量またはＧＡＤＰＨのｍＲＮＡ量を１としたときの相対的な割合として評価した。

ｉｉｉ）スクリーニング
Ｂｃｌ−２タンパク質をコードするｍＲＮＡの配列として、登録されているものを比較検討したところ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８として登録されているｂｃｌ−２の完全長ｍＲＮＡの配列がコンセンサスであることを確認した。このＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８の塩基配列（以下、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡという：配列番号１９７）に基づいて、後述の実施例に示す一次、二次、三次スクリーニングにより、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を抑制する活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡを探索した。

スクリーニングに用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは、１９塩基のセンス鎖ＲＮＡおよびこれに相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として有し、それぞれの３’末端にｄＴｄＴの突出部を有するようにした。また、スクリーニングに用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは「Ｂｘｘｘ」で表し、ここで、「ｘｘｘ」はオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の５’末端の塩基のｂｃｌ−２ ｍＲＮＡにおける翻訳開始点からの位置の番号を表すこととした。

一次スクリーニング
一次スクリーニングにおけるオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡのＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）内から、９塩基毎に始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡと、その相補鎖であるアンチセンス鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡで構成されるものとした。ただし、ＢＬＡＳＴサーチの結果、用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡ中に、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡについての連続１７塩基以上の相補配列が存在する場合には、適宜、１ないし２塩基シフトさせ、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相補配列が１６塩基以下の配列を使用した。

一次スクリーニングの結果、Ｂ００２（配列番号１および配列番号８２）、Ｂ０１０（配列番号２および配列番号８３）、Ｂ０２８（配列番号３および配列番号８４）、Ｂ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０４６（配列番号１４および配列番号９５）、Ｂ０５５（配列番号１５および配列番号９６）、Ｂ０６５（配列番号１６および配列番号９７）、Ｂ０７３（配列番号１７および配列番号９８）、Ｂ０８４（配列番号１８および配列番号９９）、Ｂ１３６（配列番号１９および配列番号１００）、Ｂ１７２（配列番号２０および配列番号１０１）、Ｂ１９９（配列番号２１および配列番号１０２）、Ｂ２０７（配列番号２２および配列番号１０３）、Ｂ２５３（配列番号２３および配列番号１０４）、Ｂ２６２（配列番号２４および配列番号１０５）、Ｂ２８０（配列番号２５および配列番号１０６）、Ｂ３２５（配列番号２６および配列番号１０７）、Ｂ３５２（配列番号２７および配列番号１０８）、Ｂ３９７（配列番号２８および配列番号１０９）、Ｂ４３３（配列番号２９および配列番号１１０）、Ｂ４４２（配列番号３２および配列番号１１３）、Ｂ４５１（配列番号３３および配列番号１１４）、Ｂ４６９（配列番号３６および配列番号１１７）、Ｂ４７８（配列番号３９および配列番号１２０）、Ｂ５１６（配列番号４０および配列番号１２１）、Ｂ５２３（配列番号４１および配列番号１２２）、Ｂ５３９（配列番号４６および配列番号１２７）、Ｂ５５８（配列番号４９および配列番号１３０）、Ｂ５７６（配列番号５０および配列番号１３１）、Ｂ５８６（配列番号５１および配列番号１３２）、Ｂ５９５（配列番号５２および配列番号１３３）、Ｂ６０４（配列番号５３および配列番号１３４）、Ｂ６１３（配列番号５４および配列番号１３５）、Ｂ６２２（配列番号５９および配列番号１４０）、Ｂ６３１（配列番号６２および配列番号１４３）、Ｂ６４２（配列番号６５および配列番号１４６）、Ｂ６４９（配列番号６６および配列番号１４７）、Ｂ６５４（配列番号６７および配列番号１４８）、Ｂ６５８（配列番号６８および配列番号１４９）、Ｂ６６７（配列番号６９および配列番号１５０）、Ｂ６７６（配列番号７０および配列番号１５１）、Ｂ７０３（配列番号７３および配列番号１５４）、Ｂ７１２（配列番号７６および配列番号１５７）、Ｂ７１７（配列番号７７および配列番号１５８）、およびＢ７２１（配列番号７９および配列番号１６０）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果をこの節の最後に示した表１に示す。

一次スクリーニングでＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性のあったオリゴ二本鎖ＲＮＡのうち、特に活性の高かった以下の９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。

Ｂ０３７：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４３３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４６９：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３９：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６２２：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６３１：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ７０３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ７１７：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ７２１：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の高かった９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ４３３、Ｂ４６９、Ｂ５３９、Ｂ６２２、Ｂ６３１、Ｂ７０３、Ｂ７１７およびＢ７２１）についてＲＴ−ＰＣＲによるｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量を評価した。その結果を図１に示す。図中、縦軸は、陰性対照としてＧＬ３（ホタルルシフェラーゼ）の発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡをＡ４３１細胞にトランスフェクションした後、２４時間培養した細胞のｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量を１としたときの、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡ同様にトランスフェクションした後のｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量の割合を示す。一次スクリーニングで得られた９つのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞のすべてにおいて、陰性対照と比較してｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量の減少が観察された。また、以後の実験においては、陽性対照のオリゴ二本鎖ＲＮＡとしてＢ７１７を用いることにした。

二次スクリーニング
二次スクリーニングのオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、一次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の見られたＢ７１７以外の８つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ４３３、Ｂ４６９、Ｂ５３９、Ｂ６２２、Ｂ６３１、Ｂ７０３およびＢ７２１）、および、それらのセンス鎖の５’末端がｂｃｌ−２ ｍＲＮＡにおいて該当する塩基を中心としてそれぞれ上流側および下流側に３塩基および６塩基ずらした位置から始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡから構成されるものとした。ただし、ＢＬＡＳＴサーチの結果、用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡ中に、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡについての連続１７塩基以上の相補配列が存在する場合には、適宜、１ないし２塩基シフトさせ、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ以外のｍＲＮＡとの相補配列が１６塩基以下の配列を使用した。

二次スクリーニングの結果、Ｂ０３１（配列番号４および配列番号８５）、Ｂ０３４（配列番号５および配列番号８６）、Ｂ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０４０（配列番号８および配列番号８９）、Ｂ０４３（配列番号１１および配列番号９２）、Ｂ４３３（配列番号２９および配列番号１１０）、Ｂ４３６（配列番号３０および配列番号１１１）、Ｂ４３９（配列番号３１および配列番号１１２）、Ｂ４６３（配列番号３４および配列番号１１５）、Ｂ４６６（配列番号３５および配列番号１１６）、Ｂ４６９（配列番号３６および配列番号１１７）、Ｂ４７２（配列番号３７および配列番号１１８）、Ｂ４７５（配列番号３８および配列番号１１９）、Ｂ５３３（配列番号４３および配列番号１２４）、Ｂ５３６（配列番号４５および配列番号１２６）、Ｂ５３９（配列番号４６および配列番号１２７）、Ｂ５４３（配列番号４７および配列番号１２８）、Ｂ５４５（配列番号４８および配列番号１２９）、Ｂ６１６（配列番号５７および配列番号１３８）、Ｂ６１９（配列番号５８および配列番号１３９）、Ｂ６２２（配列番号５９および配列番号１４０）、Ｂ６２５（配列番号６０および配列番号１４１）、Ｂ６２８（配列番号６１および配列番号１４２）、Ｂ６３１（配列番号６２および配列番号１４３）、Ｂ６３４（配列番号６３および配列番号１４４）、Ｂ６３６（配列番号６４および配列番号１４５）、Ｂ６９７（配列番号７１および配列番号１５２）、Ｂ７００（配列番号７２および配列番号１５３）、Ｂ７０３（配列番号７３および配列番号１５４）、Ｂ７０６（配列番号７４および配列番号１５５）、Ｂ７０９（配列番号７５および配列番号１５６）、Ｂ７１９（配列番号７８および配列番号１５９）、Ｂ７２１（配列番号７９および配列番号１６０）、Ｂ７２４（配列番号８０および配列番号１６１）、およびＢ７２７（配列番号８１および配列番号１６２）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果をこの節の最後に示した表１に示す。

二次スクリーニングでＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性のあったオリゴ二本鎖ＲＮＡのうち、特に活性の高かった以下の７つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。

Ｂ０３７：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ０４３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４３６：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ４６９：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６１６：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６３１：
センス鎖

アンチセンス鎖

これらのうち、Ｂ０４３およびＢ５３３のオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞のｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量をＲＴ−ＰＣＲにより評価した結果を図２ａに示す。図中、縦軸は、陰性対照としてＧＬ３（ホタルルシフェラーゼ）の発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡをＡ４３１細胞にトランスフェクションした後、２４時間培養した細胞のｍＲＮＡ量を１としたときの、それぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡで同様にトランスフェクションした際のｍＲＮＡ量を示す。いずれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞においても、陰性対照と比較してｂｃｌ−２のｍＲＮＡ量の減少が観察された（図２ａ）。さらに、陽性対照であるＢ７１７のオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしたときよりもｂｃｌ−２ ｍＲＮＡ量は減少していた（図２ａ）。一方、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量には影響が見られなかった（図２ｂ）。また、Ａ４３１細胞に、Ｂ０４３およびＢ５３３のそれぞれのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした後、７２時間培養した細胞中のＢｃｌ−２タンパク質の発現量を、ウエスタンブロッティングにより評価した結果を示す写真を図２ｃに示す。オリゴ二本鎖ＲＮＡを１０ｎＭでトランスフェクションした際には、選択されたオリゴ二本鎖ＲＮＡはＢｃｌ−２タンパク質の発現を顕著に抑制することが観察された（図２ｃ上段）。一方、コントロールであるＡｃｔｉｎタンパク質の量には影響が見られなかった（図２ｃ下段）。

したがって、二次スクリーニングで得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡはいずれも、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡを特異的に分解し、およびＢｃｌ−２タンパク質の発現を特異的に抑制していることが示された。

三次スクリーニング
三次スクリーニングのオリゴ二本鎖ＲＮＡのプールは、二次スクリーニングで高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性のみられた４つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７、Ｂ０４３、Ｂ５３３、およびＢ６１６）および、そのセンス鎖の５’末端がｂｃｌ−２ ｍＲＮＡにおいて該当する塩基を中心として上流側、下流側ともに３塩基程度の範囲で１塩基ごとにずらした位置から始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡから構成されるものとした。ただし、合成収率が低下するであろうと予測できるほどＧＣ含量の高い配列はスクリーニングの対象から除いた。

ウエスタンブロッティングによるＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価結果を示す写真を図３および図４に示して、スクリーニング操作におけるふるい分けの過程について説明する。図３においてＮｏｒｍａｌはオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしていないＡ４３１細胞を、ならびに図３および図４においてＧＬ３は陰性対照に使用したホタルルシフェラーゼの発現抑制をするオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞、を示す。それぞれの写真の下段のＡｃｔｉｎタンパク質はいずれのレーンにおいても同程度に発色しており、電気泳動したサンプル量が各レーン間に大きな差がないことを示す。したがって、Ｂｃｌ−２タンパク質の発色の程度を直接比較し、Ｂｃｌ−２タンパク質のバンドが顕著に減少していた場合に、対応するオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性が高いと判断した。

三次スクリーニングではＢ０３７（配列番号６および配列番号８７）、Ｂ０３９（配列番号７および配列番号８８）、Ｂ０４０（配列番号８および配列番号８９）、Ｂ０４１（配列番号９および配列番号９０）、Ｂ０４２（配列番号１０および配列番号９１）、Ｂ０４３（配列番号１１および配列番号９２）、Ｂ０４４（配列番号１２および配列番号９３）、Ｂ０４５（配列番号１３および配列番号９４）、Ｂ５３１（配列番号４２および配列番号１２３）、Ｂ５３３（配列番号４３および配列番号１２４）、Ｂ５３４（配列番号４４および配列番号１２５）、Ｂ６１４（配列番号５５および配列番号１３６）、Ｂ６１５（配列番号５６および配列番号１３７）、および、Ｂ６１６（配列番号５７および配列番号１３８）のオリゴ二本鎖ＲＮＡにＢｃｌ−２タンパク質発現を抑える活性が認められた。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡの活性をウエスタンブロッティングにより評価した結果をこの節の最後に示した表１に示す。

Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の特に高かった以下の３つのオリゴ二本鎖ＲＮＡを選択した。

Ｂ０４３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ６１４：
センス鎖

アンチセンス鎖

これらの３つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０４３、Ｂ５３３およびＢ６１４）は、１０ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制し、さらに３ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現を有意に抑制していることが明らかとなった（図３および図４）。
表１に、一次から三次スクリーニングの過程で、タンパク質発現抑制活性の認められたオリゴ二本鎖ＲＮＡを一覧にして示す。

実施例２ セルカウンティングアッセイによる細胞増殖に対するオリゴ二本鎖ＲＮＡ の評価
選択したオリゴ二本鎖ＲＮＡを、癌細胞にトランスフェクションした場合の細胞増殖の抑制能を、セルカウンティングアッセイを用いて評価した。

ｉ）方法
９６穴プレートにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）を５×１０^２ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｄ６０４６）中で２４時間培養した。培養プレートから培地を吸引し、１３５μｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を１５μｌ添加し、終量を１５０μｌとした。ＣＯ_２インキュベーター内で６日間培養した。Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８溶液（ＤＯＪＩＮＤＯ）を１５μｌずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で呈色反応を２時間行った。マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍ（参照波長は５９５ｎｍ）の吸光度を測定した。オリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションしていないＡ４３１細胞の細胞数を１００％としたときの相対的な細胞数の割合を生細胞率として評価した。陰性対照としては、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡのオリゴ二本鎖ＲＮＡをトランスフェクションした細胞を用いた。陽性対照としてはＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡの一つであるＢ７１７でトランスフェクションした細胞を用いた。Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡとしては、Ｂ０４３およびＢ５３３について評価した。

ｉｉ）結果
結果を図５に示す。どちらのオリゴ二本鎖ＲＮＡもトランスフェクションの際の濃度が１ｎＭ程度で細胞数が減少し始め、１０ｎＭになると細胞数が２０％程度に減少した。したがって、本発明のオリゴ二本鎖ＲＮＡはＢｃｌ−２タンパク質の発現を抑制した結果、細胞増殖を抑える効果を発揮することが明らかとなった。
実施例３ 一塩基変異オリゴ二本鎖ＲＮＡの効果
ｉ）一塩基変異の効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡの変異が及ぼす影響を調べるため、一塩基変異体を調製し、実施例１に示したウエスタンブロッティングによりそのオリゴ二本鎖ＲＮＡとしての活性を評価した。

一塩基変異体としてのオリゴ二本鎖ＲＮＡとしては、以下の３つを調製した。一塩基変異により変化したヌクレオチドは下線で示した。

Ｂ０４３−１５Ａ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−１８Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ７１７−１０Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ０４３−１５ＡはＢ０４３のセンス鎖５’末端から１５番目の塩基対Ｃ−ＧをＡ−Ｕに、Ｂ５３３−１８ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から１８番目の塩基対Ｃ−ＧをＵ−Ａに、およびＢ７１７−１０ＵはＢ７１７のセンス鎖５’末端から１０番目の塩基対Ａ−ＵをＵ−Ａに、それぞれ変換した一塩基変異体である。

Ｂ０４３−１５Ａの結果は図３に、Ｂ５３３−１８ＵおよびＢ７１７−１０Ｕの結果は図４に示した。いずれの一塩基変異体オリゴ二本鎖ＲＮＡも、正常型と比較すると活性は多少低下はするものの、ある程度のＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を保持することを確認した。
ｉｉ）一塩基変異の位置の効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡの変異の位置が活性に及ぼす影響を調べるため、Ｂ５３３のオリゴ二本鎖ＲＮＡについて変異の位置の異なる一塩基変異体を７種類調製し、実施例１にその方法を示したウエスタンブロッティングによりそのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を評価した。

一塩基変異体オリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂ５３３オリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の５’末端からの位置が２、５、８、１０、１２、１５、１８番目に一塩基変異を有するものを用いた。具体的には、Ｂ５３３−２ＡはＢ５３３のセンス鎖５’末端から２番目の塩基対Ｕ−ＡをＡ−Ｕに、Ｂ５３３−５ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から５番目の塩基対Ｇ−ＣをＵ−Ａに、Ｂ５３３−８ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から８番目の塩基対Ｃ−ＧをＵ−Ａに、Ｂ５３３−１０ＡはＢ５３３のセンス鎖５’末端から１０番目の塩基対Ｕ−ＡをＡ−Ｕに、Ｂ５３３−１２ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から１２番目の塩基対Ａ−ＵをＵ−Ａに、Ｂ５３３−１５ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から１５番目の塩基対Ｃ−ＧをＵ−Ａに、およびＢ５３３−１８ＵはＢ５３３のセンス鎖５’末端から１８番目の塩基対Ｃ−ＧをＵ−Ａに、それぞれ変換した一塩基変異体である。

用いたＢ５３３オリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその一塩基変異体オリゴ二本鎖ＲＮＡを以下に示す。
Ｂ５３３
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−２Ａ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−５Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−８Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−１０Ａ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−１２Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−１５Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

Ｂ５３３−１８Ｕ：
センス鎖

アンチセンス鎖

結果は表２に示した。

二重鎖形成部の中心の近くに一塩基変異を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡほど、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制活性が低下する傾向があった。しかしながら、最も活性が低下した、二重鎖形成部のセンス鎖からの位置が８番目、１０番目および１２番目に一塩基変異を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ５３３−８Ｕ、Ｂ５３３−１０Ａ、Ｂ５３３−１２Ｕ）においても、１０ｎＭの濃度で細胞にトランスフェクションした場合には、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を明らかに抑制した。したがって、１塩基変異体であっても、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を阻害するのに有効なオリゴ二本鎖ＲＮＡであることが示唆された。
実施例４ ２１塩基よりも短いオリゴ二本鎖ＲＮＡの活性
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の塩基数および３’末端もしくは５’末端の突出部の塩基数が、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に対して及ぼす影響を検討した。Ｂ５３３の二重鎖形成部の一部を含む、それぞれ１６から２１塩基のセンス鎖およびアンチセンス鎖、を用いた。これらの核酸を以下の表３に示すようにそれぞれ組み合わせて、二重鎖形成部が１６から１９塩基対、および、３’末端の突出部が０塩基から３塩基もしくは５’末端の突出部が１塩基から２塩基であるオリゴ二本鎖ＲＮＡを用意した。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１にその方法を記したウエスタンブロッティングにより評価した。

表３に示した全ての組合せのオリゴ二本鎖ＲＮＡで、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有していた。したがって、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の長さはＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に大きな影響を及ぼさないことが示された。具体的には、オリゴ二本鎖ＲＮＡの二重鎖形成部、すなわち、オリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖が相補的である部分は１５〜１９塩基対であれば活性には大きな影響を及ぼさないことが示された。また、３’末端突出部の塩基数としては０〜３塩基、および５’末端突出部の塩基数としては０〜２塩基であれば活性に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。

さらに、Ｂ５３３−２０ｂ、Ｂ５３４−２０ｂのオリゴ二本鎖ＲＮＡの３’末端突出部はｄＴｄＴではなく、二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと一致する配列および二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列であったが、強いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を示した（表３）。したがって、３’末端突出部の配列は、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと一致する配列および／またはｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列であってもよいことを意味する。このことは、３’突出部の配列はｄＴｄＴに限らず、どのような配列を有していてもオリゴ二本鎖ＲＮＡとしての活性を保持すること示すものである。
実施例５ 一部ＤＮＡ置換体の効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの一部のデオキシリボヌクレオチドへの置換が、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に影響を与えるか否かを、一部ＤＮＡ置換体オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いて評価した。

評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸は、Ｂ０４３およびＢ５３３オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するそれぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖に加えて、Ｂ０４３およびＢ５３３オリゴ二本鎖ＲＮＡのそれぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖について、その一部を以下に示すようにデオキシリボヌクレオチドに置換した核酸を調製することで得た。具体的なデオキシリボヌクレオチド置換位置および配列を以下に示す。

Ｂ０４３センス鎖の系統：
（１）Ｂ０４３ ｓｅｎｓｅ：

（２）Ｂ０４３−４ｎｔ−Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３センス鎖の３’末端の４塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（３）Ｂ０４３−６ｎｔ−Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３センス鎖の３’末端の６塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（４）Ｂ０４３−Ｇ−ｄＧ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３センス鎖のＧ塩基をすべてリボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドに置換した核酸。

（５）Ｂ０４３−Ｕ−ｄＴ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３センス鎖のリボヌクレオチドのＵ塩基をすべてデオキシリボヌクレオチドのＴ塩基に置換した核酸。

Ｂ５３３センス鎖の系統：
（１）Ｂ５３３ ｓｅｎｓｅ：

（２）Ｂ５３３−４ｎｔ−Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３センス鎖の３’末端の４塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（３）Ｂ５３３−６ｎｔ−Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３センス鎖の３’末端の６塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（４）Ｂ５３３−Ｇ−ｄＧ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３センス鎖のＧ塩基をすべてリボヌクレオチドからデオキシリボヌクレオチドに置換した核酸。

（５）Ｂ５３３−Ｕ−ｄＴ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３センス鎖のリボヌクレオチドのＵ塩基をすべてデオキシリボヌクレオチドのＴ塩基に置換した核酸。

Ｂ０４３アンチセンス鎖の系統：
（１）Ｂ０４３ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：

（２）Ｂ０４３−４ｎｔ−Ｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３アンチセンス鎖の３’末端の４塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（３）Ｂ０４３−２ｎｔ２ｎｔ−Ｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３アンチセンス鎖の５’末端および３’末端のそれぞれ２塩基をデオキシリボヌクレオチドに置換した核酸。

Ｂ５３３アンチセンス鎖の系統：
（１）Ｂ５３３ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：

（２）Ｂ５３３−４ｎｔ−Ｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３アンチセンス鎖の３’末端の４塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（３）Ｂ５３３−２ｎｔ２ｎｔ−Ｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：
Ｂ５３３アンチセンス鎖の５’末端および３’末端のそれぞれ２塩基をデオキシリボヌクレオチドに置換した核酸。

上記のＢ０４３センス鎖の系統から選ばれるセンス鎖およびＢ０４３アンチセンス鎖の系統から選ばれるアンチセンス鎖の対、または、Ｂ５３３センス鎖の系統から選ばれるセンス鎖およびＢ５３３アンチセンス鎖の系統から選ばれるアンチセンス鎖の対を評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡとした。用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せは表４に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１に記載したウエスタンブロッティングにより評価した。

表４に示す組合せのオリゴ二本鎖ＲＮＡはいずれも、Ｂｃｌ−２タンパク発現抑制活性を有していた。この結果は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の一部がデオキシリボヌクレオチドであっても、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性には大きな影響は与えないことを意味する。これらの一部ＤＮＡ置換体オリゴ二本鎖ＲＮＡもまた、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制するために利用可能であることが明らかとなった。
実施例６ ３’突出部の修飾の効果
スクリーニングにおいては３’突出部としてｄＴｄＴを用いたが、このｄＴｄＴを２’−メトキシエチル体に変換したとき、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に及ぼす影響を検討した。

オリゴ二本鎖ＲＮＡはＢ７１７において３’突出部が２’−メトキシエチル体のＴＴであるＢ７１７−ＭＯＥを用いた。

結果を図６に示す。Ｂ７１７−ＭＯＥのレーンとＢ７１７のレーンのＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さは同程度である。これは、突出部が２’−メトキシエチル体に変換しても突出部にｄＴｄＴを有するものを同等の活性を有することを示している。したがって、３’突出部のヌクレオチドが修飾されていてもオリゴ二本鎖ＲＮＡとしての活性を保持することを確認した。
実施例７ 平滑末端型オリゴ二本鎖ＲＮＡの効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する３’末端突出部の有無が、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に及ぼす影響を検討した。３’末端突出部を除いた１８塩基対および１９塩基対からなる平滑末端型オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いて評価を行った。具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその結果を表５に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１にその方法を記したウエスタンブロッティングにより評価した。

表５に示す組合せの平滑末端型オリゴ二本鎖ＲＮＡは、いずれもＢｃｌ−２タンパク質抑制活性を示しており、平滑末端型のオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいても３’末端突出型と同等程度の活性を保持することが示唆された。
実施例８ オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの効果（１）
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４５日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ７１７（配列番号７７および１５８）を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比；オリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）を、週１回（計６回）または週３回（計１８回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、オリゴ二本鎖ＲＮＡとして１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。対照群には週３回、１０％マルトース溶液を投与した（計１８回）。図７に移植後１００日までの生存数を示す。

両薬物投与群と対象群との間のカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
実施例９ オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの効果（２）
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４４日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３（配列番号１１および９２）を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比；オリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）を、週２回（計１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、オリゴ二本鎖ＲＮＡとして１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。対象群には週２回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。図８に移植後１００日までの生存数を示す。

Ｂ０４３投与群と対象群との間のカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
実施例１０ オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの効果（３） −用量依存性−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植６日後から４４日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３（配列番号１１および９２）を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比；オリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）を、週２回（計１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、オリゴ二本鎖ＲＮＡとしてそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。対象群には週２回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。その結果を図９に示す。

１ｍｇ／ｋｇ体重投与群、３ｍｇ／ｋｇ体重投与群、１０ｍｇ／ｋｇ体重投与群と対象群との間の、癌移植６９日後までのカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が見られた（それぞれＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０１）。
実施例１１ オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いたｉｎ ｖｉｖｏでの効果（４） −連続投与スケジュ ールの検討−
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の脾臓にＡ５４９細胞（１０^６細胞／マウス）を移植し、１０分後に脾臓を摘出した。移植５日後から１０日後まで、または移植５日後から２０日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３（配列番号１１および９２）を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比；オリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）を、週５回（計５回または１２回）の頻度で静脈内投与した。１回当たりの投与量は、オリゴ二本鎖ＲＮＡとして１０ｍｇ／ｋｇ体重とした。対象群には週５回、１０％マルトース溶液を投与した（計１２回）。その結果を図１０に示す。

癌移植６９日後において、５回投与群および１２回投与群共に１０匹全てが生存していた。そして、両薬物投与群と対象群との間の、癌移植６９日後までのカプランマイヤー曲線を一般化ウイルコクソン検定したところ、統計的に有意差が見られた（Ｐ＜０．０１）。
実施例１２ オリゴ二本鎖ＲＮＡを用いた局所投与効果
ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ、オス、５週齢）の右脇腹皮下に、１００μＬのＰＢＳに懸濁した２．５×１０^６個のＰＣ−３細胞を移植した。移植７日後から１８日後まで、実施例１で示した方法で調製したｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡ Ｂ０４３（配列番号１１および９２）またはＢ７１７（配列番号７７および１５８）を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比；オリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）を、週５回（計１０回）の頻度で癌周辺部の皮下へ投与した。１回当たりの投与量は、オリゴ二本鎖ＲＮＡとして０．１ｍｇ／マウスとした。対象群には週５回、１０％マルトース溶液を投与した（計１０回）。腫瘍体積は、腫瘍を楕円体とみなし、「体積＝短径×短径×長径÷２」の式により求めた。その結果を図１１に示す。

腫瘍体積の増加は、Ｂ０４３投与群、Ｂ７１７投与群と対象群との間でいずれも癌移植１４日後から３６日後に渡って統計的に有意に減少した（Ｐ＜０．０１、ダネット検定）。
実施例１３ スクリーニングで得られたｂｃｌ−２オリゴ二本鎖ＲＮＡの周辺配列のＢｃｌ−２ タンパク質抑制活性の評価
二次スクリーニングの結果、高いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性のみられた４つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５３３、Ｂ６３１）の周辺配列、およびＢ７１７（スクリーニングの際、陽性対照として用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡ）の周辺配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡについてのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を、実施例１に示したウエスタンブロッティングにより評価した。Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５５３、Ｂ６３１、またはＢ７１７の周辺配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５５３、またはＢ６３１オリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の５’末端がｂｃｌ−２ ｍＲＮＡにおいて該当する塩基を中心として上流側または下流側に１ないし３塩基ずらした位置から始まる１９塩基のセンス鎖ＲＮＡとその相補鎖ＲＮＡを二重鎖形成部として含むオリゴ二本鎖ＲＮＡから構成される。Ｂ４３６、Ｂ４６９、Ｂ５５３、Ｂ６３１およびＢ７１７の周辺配列の具体的な塩基配列は以下の表６に示す。

Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価の結果は表６に示した。

上記の周辺配列を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡも、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有することが明らかになった。
実施例１４ その他のオリゴ二本鎖ＲＮＡについてのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性 の評価
以下の表７にその配列を具体的に示したオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ５２１、Ｂ５５７、Ｂ５８４、Ｂ６３５、Ｂ７３４、Ｂ７３５、Ｂ７３６）について、実施例１に示したウエスタンブロッティングによりＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を評価した。結果を表７に示す。

実施例１５ オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価（１）
ｉ）オリゴ二本鎖ＲＮＡの調製
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の合成は、自動核酸合成装置を用いた標準的なホスホアミダイト法による固相合成で行った。合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（米国 コロラド州）又は日本バイオサービス（埼玉県）に合成を依頼するか、または本発明者が行った。

本発明者が行った手順を簡単に述べる。自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステムズ、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９）を用いて、標準的なホスホアミダイト法により所望の塩基配列を形成するよう、モノマーを逐次縮合した。濃水酸化アンモニウムーエタノール（３：１）混合液を用いてＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）よりヌクレオチド鎖を開裂させ、さらに同溶液中で５５℃、１８時間おいて脱保護した。

その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて室温で２０時間処理し、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴリボヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーにて精製した。さらに、８０％酢酸水溶液にて室温で３０分処理し、５’位のＤＭＴｒ基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。脱塩後に得られたオリゴヌクレオチドは、キャピラリーゲル電気泳動により９０％以上が目的の全長物質であることを確認した。

こうしてオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の各々を合成し、二重鎖形成部が相補的な２本の核酸を、後述するように等モルで混合することでオリゴ二本鎖ＲＮＡとして用いた。

ｉｉ）Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価方法
Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを担体と共に各種癌細胞に導入し、タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングにより評価した。

オリゴ二本鎖ＲＮＡと担体の複合体の調製
担体として２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールと精製卵黄レシチンを含むリポソームＡを用い、オリゴ二本鎖ＲＮＡとの複合体を調製した。オリゴ二本鎖ＲＮＡ１重量部に対してリポソームＡ１６重量部を混合して複合体を調製した。以下に、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度１０μＭの複合体溶液、２ｍｌの調製について示す。ただし、オリゴ二本鎖ＲＮＡ複合体の濃度は、オリゴ二本鎖ＲＮＡが完全に二本鎖形成していると仮定したときに複合体に含まれているオリゴ二本鎖ＲＮＡのモル濃度で示している。

３００μＭになるように注射用水に溶解したセンス鎖およびアンチセンス鎖それぞれ６６．６μｌを試験管中で混合した．これに８６６．８μｌの１０％マルトースを添加し、両鎖をそれぞれ２０μＭの濃度で含む溶液１ｍｌを調製した．これをオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液とした。

１６ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液２６８μｌに１０％マルトース７３２μｌを添加し、４．３ｍｇ／ｍｌのリポソームＡ分散液１ｍｌを調製した。このリポソーム分散液１ｍｌに上記オリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液１ｍｌを、撹拝しながら徐々に添加した。以上の操作により、オリゴ二本鎖ＲＮＡの終濃度が１０μＭであるオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体溶液を調製した。この複合体を６００Ｗのバス型超音波装置を用いて２分間分散処理することにより複合体の粒子を均一にした。

ウエスタンブロッティング
上記のオリゴ二本鎖ＲＮＡ−リポソーム複合体を用いて本発明に係るオリゴ二本鎖ＲＮＡが細胞内にトランスフェクションされることで、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現が抑制されるかどうかをウエスタンブロッティングによりＢｃｌ−２タンパク質の量の変化を評価することで評価した。

６ｃｍ径のシャーレにＡ４３１細胞（上皮癌細胞）、Ａ３７５細胞（メラノーマ細胞）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（乳癌細胞）、またはＡ５４９（肺癌）細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を含むＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。翌日、培養ディッシュから培地を吸引し、２．７ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｄ６０４６）を加えて培地交換した。そこに、１０％マルトース水溶液中で混合したオリゴ二本鎖ＲＮＡ／リポソームＡ複合体（重量比はオリゴ二本鎖ＲＮＡ：リポソームＡ＝１：１６）溶液を０．３ｍｌ添加し、終量を３ｍｌとした。このときのオリゴ二本鎖ＲＮＡの最終濃度は３ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭである。３７度の５％ＣＯ２インキュベーター内にて７２時間培養した。細胞をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄し、セルスクレーバーを用いて１．５ｍｌチューブに移した。１０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を取り除いた後、２０〜１００μｌのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ＰＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０）を加えて細胞を溶解した。氷上で３０分間静置し、１００，０００×ｇで１５分間遠心後、上清を新しいチューブに移し、電気泳動用サンプルとした。

電気泳動はポリアクリルアミドゲル（ＡＴＴＯ Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用い、１レーンあたり総タンパク質の量を１５μｇとしたサンプルをアプライした。泳動終了後、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）膜にゲル内のタンパク質を転写し、５％スキムミルク含有ＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ−ＭＬＫ；ここで、ＰＢＳＴの組成は、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）中室温で１時間ブロッキングした。まず、Ｂｃｌ−２タンパク質の検出を行った。ブロッキングが終了したＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍に希釈したマウス抗ヒトＢｃｌ−２モノクローナル抗体（ＤＡＫＯ Ｍ０８８７）中にて、４℃で一晩振盪して一次抗体と結合させた。ＰＶＤＦ膜をＰＢＳＴで洗浄後、ＰＢＳＴ−ＭＬＫで２０００倍に希釈したＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ ＰＯ２６０）中にて室温で２時間振塗し、二次抗体と結合させた。ＰＢＳＴで洗浄後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（ＢｉｏＲａｄ）によりＢｃｌ−２タンパク質の量を検出した。

Ｂｃｌ−２タンパク質の検出終了後、同じＰＶＤＦ膜を蒸留水で洗浄し、Ｂｃｌ−２と同様にＡｃｔｉｎタンパク質の検出を行った。一次抗体にはヤギ抗ヒトＡｃｔｉｎ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＳＣ−１６１６）を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇ抗体（ＤＡＫＯ ＰＯ４４９）を用いた。それぞれＰＢＳＴ−ＭＬＫで５００倍、１５００倍に希釈して使用した。

ルシフェラーゼの発現を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ（ＧＬ３）をトランスフェクションした時のＢｃｌ−２タンパク質のバンドの濃さを陰性対照として、これらと比較して目視で行った。二重鎖形成部が２５塩基対以上のオリゴ二本鎖ＲＮＡの場合には、処理濃度が１０ｎＭにおいて陰性対照よりも十分に薄い場合には「＋＋」、僅かに薄い場合には「＋」とし、そして処理濃度が１００ｎＭにおいて陰性対照よりも僅かに薄い場合には「＋−」とした。
相補鎖部分が２５塩基対であるオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活 性の評価
Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価に用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７２５８の塩基配列（以下、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡという：配列番号１９７）に基づいて、以下のオリゴ二本鎖ＲＮＡを用意した。

本発明者は、二重鎖形成部が２５塩基の対であるオリゴ二本鎖ＲＮＡが、強いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有するか否かを評価するため、Ｂ０４３−２５アンチセンス鎖、およびその相補鎖である、Ｂ０４３−２５センス鎖を用意し、オリゴ二本鎖ＲＮＡを得た。さらにＢ０４３−２５アンチセンス鎖の３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる２５塩基の配列をｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの相補的な配列に一致するように３’末端側に１ないし６塩基シフトした２５塩基の配列の３’末端に２塩基のｄＴを付加したＢ０４２−２５、Ｂ０４１−２５、Ｂ０４０−２５、Ｂ０３９−２５、Ｂ０３８−２５、Ｂ０３７−２５アンチセンス鎖、および、Ｂ０４３−２５センス鎖の３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる２５塩基の配列をｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの配列に一致するように５’末端側に１ないし６塩基シフトした２５塩基の配列の３’末端に２塩基のｄＴを付加したＢ０４２−２５、Ｂ０４１−２５、Ｂ０４０−２５、Ｂ０３９−２５、Ｂ０３８−２５、Ｂ０３７−２５センス鎖を用意し、各オリゴ二本鎖ＲＮＡを得た。

また、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価に用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡは「ＢＸＸＸ−２５」で表し、ここで、「ＸＸＸ」はオリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖の５’末端の塩基のｂｃｌ−２ ｍＲＮＡにおける翻訳開始点からの位置の番号を表すこととした。上記７つのオリゴ二本鎖ＲＮＡ（Ｂ０３７−２５、Ｂ０３８−２５、Ｂ０３９−２５、Ｂ０４０−２５、Ｂ０４１−２５、Ｂ０４２−３５およびＢ０４３−２５）のＢｃｌ−２タンパク質発現抑制作用について、ウエスタンブロッティングにより評価した。

その結果を表８に示す。

表８に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質をほぼ完全に抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図１２、１３）。

したがって、Ｂ０４３−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡのみならず、Ｂ０４３−２５アンチセンス鎖の３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる２５塩基の配列を、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの相補的な配列に一致するように３’末端側に１ないし６塩基シフトした２５塩基の配列に、さらに３’末端に２塩基のｄＴを付加したアンチセンス鎖、および、それらアンチセンス鎖の３’末端の２塩基のｄＴを除いた部分からなる２５塩基の配列に相補的な配列の３’末端に２塩基のｄＴを付加したセンス鎖からなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有することが示された。
実施例１６ オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性の評価（２）
本発明者は、他の部分における相補鎖部分が２５塩基対であるオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に及ぼす影響を検討した。具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡは、Ｂ４３０−２５、Ｂ４６３−２５、Ｂ５２７−２５、Ｂ６０８−２５、Ｂ６２５−２５およびＢ７１１−２５のオリゴ二本鎖ＲＮＡである。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１５にその方法を記したウエスタンブロティングにより評価した。

その結果を表９に示す。

表９に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質をほぼ完全に抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図１３）。

したがって、相補的である部分が２５塩基対であるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、強いＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を有することが示された。
実施例１７ 相補鎖部分が２５塩基対であるオリゴ二本鎖ＲＮＡ３’末端の突出部の 効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する３’末端の突出部のｄＴｄＴであるデオキシリボヌクレオチドを二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列である突出部を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に影響を与えるか否かを、評価した。

評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸は、Ｂ０３７−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖に加えて、Ｂ０３７−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端にｄＴｄＴの替わりに二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列を突出部として有する核酸を調製することで得た。具体的な配列を以下に示す。
Ｂ０３７−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０３７ＳＳＯＨ２５ ｓｅｎｓｅ：

Ｂ０３７−２５アンチセンス鎖の系統：
（１）Ｂ０３７−２５ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：

（２）Ｂ０３７ＳＳＯＨ２５ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：

具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその結果を表１０に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１５に記載したウエスタンブロティングにより評価した。

表１０に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質をほぼ完全に抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図１４）。

この結果は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の二重鎖形成部に続いてｂｃｌ−２ ｍＲＮＡと相補鎖を形成しうる配列である３’末端突出部であっても、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性には大きな影響を与えないことを意味する。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡもまた、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制するために利用可能であることが明らかとなった。このことは、３’突出部の配列はｄＴｄＴに限らず、どのような配列を有していてもオリゴ二本鎖ＲＮＡとして活性を保持することを示すものである。
実施例１８ 相補鎖部分が２５塩基対である平滑末端型オリゴ二本鎖ＲＮＡの効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸の３’末端突出部の有無が、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に及ぼす影響を検討した。３’末端突出部を除いた２５塩基対からなる平滑末端型オリゴＲＮＡを用いて評価を行った。具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその結果を表１１に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１５にその方法を記したウエスタンブロティングにより評価した。

表１１に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質をほぼ完全に抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図１５）。

この結果により、平滑末端型オリゴ二本鎖ＲＮＡは、いずれもＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を示しており、平滑末端型のオリゴ二本鎖ＲＮＡにおいても３’末端突出型と同程度の活性を保持することが示唆された。

実施例１９センス鎖ＤＮＡ体の効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖のリボヌクレオチド全部をデオキシリボヌクレオチドに置換することによって、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性が影響を受けるか否かを、センス鎖の全部がＤＮＡであるオリゴ二本鎖ＲＮＡを用いて評価した。

評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸は、Ｂ０３７−２５、Ｂ０３８−２５、Ｂ０３９−２５、Ｂ０４０−２５、Ｂ０４１−２５、Ｂ０４２−２５およびＢ０４３−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するそれぞれのセンス鎖を以下に示すようにデオキシヌクレオチドに置換した核酸を調製することで得た。

具体的な配列を以下に示す。
Ｂ０３７−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ｓｅｎｓｅ

（２） Ｂ０３７ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０３８−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３８−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０３８ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３８センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０３９−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３９−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０３９ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３９センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０４０−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０４０−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０４０ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４０センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０４１−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０４１−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０４１ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４１センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０４２−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０４２−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０４２ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４２センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０４３−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０４３−２５ ｓｅｎｓｅ：

（２） Ｂ０４３ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０４３センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその結果を表１２に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性について、実施例１５に記載したウエスタンブロティングにより評価した。

表１２に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質を僅かに抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現を僅かに抑制することが明らかとなった（図１６）。

この結果は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の全部がデオキシリボヌクレオチドであっても、Ｂｃｌ−２タンパク発現抑制活性を有することを確認した。これらオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の全部がデオキシリボヌクレオチドであるオリゴ二本鎖ＲＮＡもまた、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制するために利用可能であることがわかった。
実施例２０ センス鎖一部ＤＮＡ置換体の効果
オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖のリボヌクレオチドの一部をデオキシリボヌクレオチドに置換することによって、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性が影響を受けるか否かを、一部ＤＮＡ置換体ＲＮＡを用いて評価した。

評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸は、Ｂ０３７−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するそれぞれのセンス鎖を以下に示すようにデオキシヌクレオチドに置換した核酸を調製することで得た。具体的な配列を以下に示す。
Ｂ０３７−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ｓｅｎｓｅ

（２） Ｂ０３７ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（３） Ｂ０３７−２５−ｄＣ−Ｓ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のリボヌクレオチドのＣ塩基をすべてデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（４） Ｂ０３７−２５−ｄＧ−Ｓ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のリボヌクレオチドのＧ塩基をすべてデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（５） Ｂ０３７−２５−ｄＧＣ−Ｓ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のリボヌクレオチドのＧ塩基およびＣ塩基をすべてデオキシリボヌクレオチドとした核酸。

（６） Ｂ０３７−２５−１０Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖の３’末端の１０塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（７） Ｂ０３７−２５−１４Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖の３’末端の１４塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（８） Ｂ０３７−２５−１８Ｄ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖の３’末端の１８塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０３７−２５アンチセンス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ

上記Ｂ０３７−２５センス鎖の系統から選ばれるセンス鎖およびＢ０３７−２５アンチセンス鎖の対を評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡとした。

用いたオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の組合せは、表１３に示す。

これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制作用については、実施例１に記載したウェスタンブロッティングにより評価した。

表１３に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質をほぼ完全に抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現をほぼ完全に抑制することが明らかとなった（図１７）。

この結果は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の一部がデオキシリボヌクレオチドであっても、Ｂｃｌ−２タンパク質発現抑制活性には大きな影響がないことを意味する。これらのセンス鎖一部ＤＮＡ置換体オリゴ二本鎖ＲＮＡもまた、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制するために利用可能であることが明らかとなった。
実施例２１ リン酸ジエステル結合部分が全てホスホロチオエート体の効果
リボヌクレオチド全部をデオキシリボヌクレオチドに置換し、すべてのリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合に変換したセンス鎖を有するオリゴ二本鎖ＲＮＡを用いて、オリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性に与える影響を評価した。

評価に用いるオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成する核酸は、Ｂ０３７−２５オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖を構成するリボヌクレオチド全部をデオキシヌクレオチドに置換し、すべてのリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合に変換することで得た。

具体的な配列を以下に示す。
Ｂ０３７−２５センス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ｓｅｎｓｅ

（２） Ｂ０３７ＤＮＡ２５ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとした核酸（ＵはＴとした）。

（３） Ｂ０３７ＤＮＡ２５ＰＳ ｓｅｎｓｅ：
Ｂ０３７センス鎖のすべての塩基をデオキシリボヌクレオチドとし、リン酸ジエステル結合は全てホスホロチオエートである核酸（ＵはＴとした）。

Ｂ０３７−２５アンチセンス鎖の系統：
（１） Ｂ０３７−２５ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ

具体的に検討したオリゴ二本鎖ＲＮＡおよびその結果を表１４に示す。これらのオリゴ二本鎖ＲＮＡのＢｃｌ−２タンパク質発現抑制作用については、実施例１５に記載したウェスタンブロッティングにより評価した。

表１４に示すオリゴ核酸ＲＮＡは、１００ｎＭでトランスフェクションした際にはＢｃｌ−２タンパク質を僅かに抑制し、さらに１０ｎＭでトランスフェクションしてもＢｃｌ−２タンパク質の発現を僅かに抑制することが明らかとなった（図１８）。

この結果は、オリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖において全部の核酸がデオキシリボヌクレオチドであり、すべてのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合であっても、Ｂｃｌ−２タンパク発現抑制活性がみられることを確認した。これらオリゴ二本鎖ＲＮＡを構成するセンス鎖の全部がデオキシリボヌクレオチドであり、すべてのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合であるオリゴ二本鎖ＲＮＡもまた、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制するために利用可能であることがわかった。

本発明は、Ｂｃｌ−２タンパク質発現を抑制する活性の高いオリゴ二本鎖の提供に貢献する。癌など、Ｂｃｌ−２タンパク質の過剰発現が原因となっている疾患を治療および／または予防するための医薬組成物の提供に貢献すると共に、それらの疾患を治療および／または予防する方法の開発に貢献する。

Claims (15)

1. 配列番号１１および配列番号９２の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、配列番号４３及び配列番号１２４の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、ならびに、配列番号５５および配列番号１３６の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、からなる群より選ばれるいずれか１つのＲＮＡの対で形成される二重鎖形成部を含むオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
2. オリゴ二本鎖ＲＮＡであって、配列番号１１および配列番号９２の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、配列番号４３及び配列番号１２４の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、ならびに、配列番号５５および配列番号１３６の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、からなる群より選ばれるいずれか１つのＲＮＡの対において、少なくとも一方のＲＮＡの塩基配列中に、１ないし複数の欠失、置換、挿入、または付加したヌクレオチドを含む二重鎖形成部を含み、かつＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を保持する、前記オリゴ二本鎖ＲＮＡ。
3. オリゴ二本鎖ＲＮＡであって、配列番号１１および配列番号９２の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、配列番号４３及び配列番号１２４の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、ならびに、配列番号５５および配列番号１３６の各塩基配列の３’末端から２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対、からなる群より選ばれるいずれか１つのＲＮＡの対において、該ＲＮＡの対の一方を構成するリボヌクレオチドの一部もしくは全部、または該ＲＮＡの対の少なくとも一方のＲＮＡを構成するリボヌクレオチドの一部が、デオキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドで置換されている二重鎖形成部を含み、かつＢｃｌ−２タンパク質発現抑制活性を保持する、前記オリゴ二本鎖ＲＮＡ。
4. 二重鎖形成部の少なくとも一方のＲＮＡの３’末端または５’末端に突出部としてヌクレオチドを１ないし４塩基付加した、請求項１から３のいずれか１項に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
5. ３’末端または５’末端に突出部として付加した１ないし４塩基のヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである、請求項４に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
6. ３’末端に突出部として付加したヌクレオチドが２塩基のチミンヌクレオチド（ｄＴ）である、請求項４に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
7. 少なくとも一方のＲＮＡのヌクレオチドを構成するリボースまたはリン酸バックボーンの少なくとも一部が修飾されている、請求項１から６のいずれか１項に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
8. リボースまたはリン酸バックボーンの修飾が、リボースの２’水酸基をＨ、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、Ｎ_３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩから選択される置換基に置換する修飾（Ｒはアルキルまたはアリールを、およびＲ’はアルキレンを示す）、リボースを４’チオ体とする修飾、ならびに、リン酸バックボーンの修飾はホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、またはホスホロアミデート体とする修飾、から選択される１または複数の修飾からなる、請求項７に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡ。
9. オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効な担体と請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡとの複合体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
10. オリゴ二本鎖ＲＮＡを細胞内に移行させるのに有効な担体が、カチオン性担体である、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 請求項１から８のいずれか１項に記載のオリゴ二本鎖ＲＮＡを生成するための核酸を含む医薬組成物。
12. Ｂｃｌ−２タンパク質の発現抑制が所望される疾患の治療および／または予防のための請求項９から１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. アポトーシスの促進が所望される疾患の治療および／または予防のための、請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 癌の治療および／または予防のための請求項１２に記載の医薬組成物。
15. 血液学的悪性疾患の治療および／または予防のための請求項１２に記載の医薬組成物。

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