JP4503951B2 - 糖尿病疾患予防・治療剤 - Google Patents
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Description
乾燥したゲットウの葉30gを0.1〜3mmの粒径に粉砕し容器に入れた。ゲットウを入れた容器に水30g、糖蜜0.9gを添加した。かかる粉砕ゲットウを収納した容器に、ラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの各々の菌を培養後、菌数1:1:1の割合で混合し、ゲットウの重量に対し、10重量%を添加し、容器を密閉し、静置培養により発酵を行った。発酵温度は40℃、発酵時間は72時間とした。その後、乾燥機により水分値が10重量%以下になるまで60℃で乾燥した後、滅菌処理(130℃蒸気、5〜15秒)を行い、発酵ゲットウ30gを得た。その後、乾燥した発酵ゲットウの葉1gに対して10mlの割合になるように水を加え、80℃、20分熱水抽出し、上澄みをプールし、沈殿1gに対して10mlの割合になるように再度、水を加え、80℃、20分熱水抽出し、前述の上澄みと合わせて熱水抽出エキスとして凍結乾燥させた。以下このゲットウの熱水抽出凍結乾燥物をサンプルとした。
KKマウスに肥満遺伝子Ayが導入され、KKマウスより早期(7〜8週齢)かつ重度に肥満・高血糖を発現する2型糖尿病モデルとして改良されたKK−Ay糖尿病雄モデルマウス(4週齢)(日本クレア社から入手)を用いた。群分けは、
1)蒸留水5ml/kgを投与したコントロール群(C)(10匹)
2)発酵ゲットウ抽出物(サンプル)250mg/5ml・kgを投与した群(10匹)
3)未発酵ゲットウ抽出物250mg/5ml・kgを投与した群(9匹)
とし、サンプルの投与は7週齢から開始し、曜日を決めて3回/週、投与時刻を17〜18時とし経口投与した。
サンプルを投与して絶食させ、サンプル投与から16〜19時間後にマウスの尾の先端をカミソリで傷つけて採血を行い、血糖値を簡易測定キット(簡易血糖自己測定器ノボアシスト:ノボルディスクファーマ社製)により測定した。以後同様に、2週間に1回の割で採血し、血糖値を測定した。血糖の測定値より、血糖値の測定値からサンプル投与群のコントロール群に対する血糖値の割合を求め、その結果を表1に示す。未発酵ゲットウ抽出物投与群についても同様にして、コントロール群に対する血糖値の割合を求め、その結果を表1に示す。
前日にサンプルを投与した17週齢のマウスを、翌朝4時間絶食後に断頭により殺し、断頭切口から血液を試験管に採取した。その後腹部を切開し、腎、肝を摘出し重量を測ってホイルで包み灌流は行わず−80℃で保存した。血液は3000r.p.m15分で1回遠心してエッペンドルフに血清を分離し、さらに同じ条件で再度遠心して同じエッペンドルフに血清を分離した。このエッペンドルフを冷却遠心(4℃、3000r.p.m、2分)して、別のエッペンドルフと試験管(血清Glu用)に分注してエッペンドルフに取ったものは−80℃で保存した。
実施例4で得た血清のグルコース含有量をグルコースCII・テストワコー(ム
タローゼ・GOD法)(Wako社製)を使用して測定した。結果を図2に示す。図2に示される結果から、サンプル投与群において、血清中のグルコース含有量が低減されることが明かになった。
実施例4で得た血清を−80℃で保存後、溶解して血清インスリンの測定に用いた。血清インスリンの測定にはインスリン測定キット(森永生科学研究所製)を使用し、これはマイクロプレートのELAサンドイッチ法を用いており、マイクロプレートリーダーで測定した。結果を図3に示す。図3に示される結果から、サンプル投与群において著しく血清インスリンの低減が見られ、未発酵抽出物投与群と比較しても、血清中のインスリン含有量が有意に低減されることが明かになった。残った血清は−20℃で冷凍保存した。
−20℃で冷凍保存していた血清(実施例6参照)を溶解して血清一酸化窒素の測定に用いた。一酸化窒素の測定は、NOアナライザー(ENO−20酸化窒素分析計:エイコム社製)を用いて行った。検体の前処理として、血清100μlとメタノール100μlをエッペンドルフにとり、よく混和した後20分間静置し、冷却遠心(4℃、13,000r.p.m、10分)してその上清100μlをサンプル管に分注し、NOアナライザーにより一酸化窒素を測定した。前処理までの操作はすべて氷中で行った。結果を図4に示す。図4に示される結果から、モモタマナ群において、血清の一酸化窒素含有量が低減されることが明かになった。
実施例7において溶解した血清を一晩冷蔵(4℃)保存したものを用いた。血清10μlを試薬とともに半量で操作を行い、コレステロールC−テストワコー(コレステロールオキシダーゼ・フェニノール法)(Wako社製)を使用して総コレステロールを測定した。結果を図5に示す。図5に示される結果から、サンプル投与群、未発酵抽出物投与群共に、血清の総コレステロール含有量が著しく低減されることが明かになった。
実施例4で得た腎臓を−80℃で保存後、5ml/gの割合の1.15%KCl水溶液を用いて、超音波ホモジナイザー処理を行った。この超音波ホモジナイザー処理により腎臓がある程度砕けてから、30秒間遠心(氷中にて10,000r.p.m、)した。得られた上清をさらに上記KCl水溶液で2倍希釈してTBA法により腎ホモジネートのLPOを測定した。結果を図6に示す。図6に示される結果から、サンプル投与群において、腎LPOが低減されることが明かになった。
実施例1の工程において、ゲットウの葉の発酵後、滅菌処理して得られた発酵ゲットウ1gに対し10mlの50%エタノール水溶液を添加し、12時間、室温にて抽出後ろ過した。残渣に再度10mlの50%エタノール水溶液を加え12時間、室温にて抽出後ろ過し50%エタノール抽出液として試料溶液を得た。得られた試料溶液0.5mlに4%デンプン溶液1ml(WAKO社製)とリン酸緩衝液1.5mlを混合後37℃、5分間加温したのち、5.5unit/mlのα−アミラーゼ溶液0.02ml(SIGMA社製)を加え、37℃、120分間反応させた。その後沸騰水中で10分間加温し反応停止後、生成したマルトース量を高速液体クロマトグラフィー(島津社製)で測定した。コントロール(サンプル無添加)の場合のマルトース生成量を100%としサンプル添加時のマルトース生成量の割合、すなわち、α−アミラーゼ活性として図7に示す。図7に示される結果から、サンプル投与群において、α−アミラーゼ活性が低下しており、α−アミラーゼ阻害活性が顕著であり、未発酵ゲットウ抽出物投与群と比較しても、有意であることが明かにされた。
Claims (2)
- ゲットウをラクトバシルス・プランタリム、ストレプトコッカス・サーモフィルス、バシルス・ズブチルスの混合菌により発酵させて得られる発酵処理物を有効成分とすることを特徴とする糖尿病疾患予防・治療剤。
- 発酵処理物が、ゲットウの葉の発酵処理物であることを特徴とする請求項1記載の糖尿病疾患予防・治療剤。
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