JP4594381B2 - 肝細胞増殖因子に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００４年４月１５日に出願された米国特許出願第１０／８２５，０６０号の一部継続出願である。米国特許出願第１０／８２５，０６０号は、２００３年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／４６４，０６１号の利益を主張する。これらのいずれも、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。

（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規の生物製剤を開発するための、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組み換えＤＮＡ技術との組み合わせに関し、より具体的には、例えば、肝細胞増殖因子に結合し、かつこれを中和するモノクローナル抗体の産生に関する。

（発明の背景）
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、間葉細胞によって産生される多機能性ヘテロ二量体ポリペプチドである。ＨＧＦは、新脈管形成、形態形成および細胞遊走誘発（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ならびに種々の細胞型の増殖および分散を刺激することが示されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＨＧＦの多面的な活性は、そのレセプターである、プロトオンコジーンｃＭｅｔによってコードされる膜貫通チロシンキナーゼを介して媒介される。種々の正常な細胞機能を制御することに加えて、ＨＧＦおよびそのレセプターであるｃＭｅｔは、腫瘍のイニシエーション、浸潤、および転移に関与することが示されている（非特許文献６；非特許文献７)。ＨＧＦ／ｃＭｅｔは、種々のヒト固形腫瘍（肺、結腸、直腸、胃、腎臓、卵巣、皮膚、多発性骨髄腫および甲状腺組織に由来する腫瘍を含む）において、共発現され、しばしば過剰発現される（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。ＨＧＦは、これらの腫瘍に対して、オートクリン増殖因子（非特許文献１２；非特許文献１３）およびパラクリン増殖因子（非特許文献１０）および抗アポトーシス制御因子（非特許文献１４）として機能する。

ＨＧＦは、プラスミノゲンおよび血液凝固の他の酵素に対して配列類似性および構造類似性を有する１０２ｋＤａのタンパク質である。（非特許文献１５；非特許文献１０；これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）（図１）。ヒトＨＧＦは、７２８アミノ酸前駆体（プレプロＨＧＦ）として合成され、このプレプロＨＧＦが不活性な単鎖形態（プロＨＧＦ）へ細胞内切断を受ける（非特許文献１５；非特許文献１６）。細胞外分泌の際に、プロＨＧＦが切断され、α−サブユニットおよびβ−サブユニットからなる、生物学的に活性なジスルフィド結合したヘテロ二量体分子がもたらされる（非特許文献１５；非特許文献１７）。上記α−サブユニットは、Ｎ末端ヘアピンドメインおよび４つのクリングルドメインからなる、４４０残基（グリコシル化されて６９ｋＤａ）を含有する。上記β−サブユニットは、２３４残基（３４ｋＤａ）を含有し、セリンプロテアーゼ様ドメイン（タンパク質分解活性は欠く）を有する。ＨＧＦの切断は、レセプターの活性化のために必要とされるが、レセプターの結合のためには必要とされない（非特許文献１８；非特許文献１９）。ＨＧＦは、４つの推定上のＮ−グリコシル化部位を含み、１つは上記α−サブユニットに、３つは上記β−サブユニットに存在する。ＨＧＦは、２つの独特の細胞特異的結合部位：ｃＭｅｔレセプターに対する高親和性（Ｋｄ＝２ｘ１０^−１０Ｍ）結合部位および硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に対する低親和性（Ｋｄ＝１０^−９Ｍ）結合部位、を有し、これらは細胞表面および細胞外基質に存在する（非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２）。ＮＫ２（上記α−サブユニットのＮ末端および最初の２つのクリングルドメインを含むタンパク質）は、ｃＭｅｔへの結合および運動性に関するシグナルカスケードの活性化のためには十分であるが、全長のタンパク質がマイトジェンの応答のためには必要とされる（非特許文献１０）。ＨＳＰＧは、ＨＧＦのＮ末端と相互作用することによってＨＧＦに結合する（非特許文献２２；非特許文献２３）。ＨＳＰＧ−ＨＧＦ相互作用の想定される役割としては、ＨＧＦバイオアベイラビリティー、生物学的活性およびオリゴマー形成の強化が挙げられる（非特許文献２１；非特許文献２４）。

ｃＭｅｔは、クラスＩＶタンパク質チロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーである。全長ｃＭｅｔ遺伝子は、ｃＭｅｔプロトオンコジーンとしてクローニングおよび同定された（非特許文献２５；非特許文献２６）。このｃＭｅｔレセプターは、最初に、単鎖の、部分的にグリコシル化された前駆体であるｐ１７０^{（ＭＥＴ）}（図１）として合成される（非特許文献２１；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。さらなるグリコシル化の際に、このタンパク質が、５０ｋＤａのα−サブユニット（残基１〜３０７）および１４５ｋＤａのβ−サブユニットからなる、ヘテロ二量体の１９０ｋＤａ成熟タンパク質（１３８５アミノ酸）に、タンパク質分解により切断される。このβ−サブユニットの細胞質内のチロシンキナーゼドメインは、シグナル伝達に関与する。

いくつかの異なるアプローチが、上記ＨＧＦ／ｃＭｅｔ相互作用のアンタゴニスト性の分子：例えば、ＮＫ１（Ｎ末端ドメイン＋クリングルドメイン１；非特許文献１９）、ＮＫ２（Ｎ末端ドメイン＋クリングルドメイン１およびクリングルドメイン２；非特許文献２９）、ＮＫ４（Ｎ末端ドメイン＋４つのクリングルドメイン；非特許文献３０）、抗ｃＭｅｔ ｍＡｂ（Ｄｏｄｇｅ，Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９８）、ならびに抗ＨＧＦ ｍＡｂ（非特許文献３１；これは本明細書中に参考として援用される）のような短縮型ＨＧＦタンパク質を得るために研究されている。

ＮＫ１およびＮＫ２は、ＨＧＦのそのレセプターとの結合と効率的に競合し得るが、所望されるような純粋なアンタゴニスト活性よりもむしろ部分的なアゴニスト活性を有することがインビトロで示されている（非特許文献３２；非特許文献３３）。より最近は、非特許文献３０が、ＮＫ４が、ヌードマウスモデルにおいて、継続的なＮＫ４の注入により、マウス肺腫瘍ＬＬＣの一次増殖（図２）および転移を部分的に阻害し得ることを実証した。原発腫瘍の部分的な増殖の阻害を得るためにＮＫ４が継続的に投与されなければならなかったという事実は、そのＮＫ４分子の潜在的に短い半減期および／または効力の欠如を示している。ＮＫ４と比較して、抗体を使用するアプローチは、その抗体の好ましい薬物動態および非常に大きい効力を有する抗体を得る可能性から、有利である。

別のアプローチとして、Ｄｏｄｇｅ（Ｍａｓｔｅｒ’ｓ Ｔｈｅｓｉｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９８）は、アンタゴニスト性の抗ｃＭｅｔモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成した。１つのｍＡｂである５Ｄ５は、ＥＬＩＳＡにおいて強力なアンタゴニスト活性を示したが、おそらく膜レセプターの二量体化に起因して、ｃＭｅｔ発現ＢＡＦ−３細胞の増殖応答を誘導した。非特許文献３４もまた、抗ｃＭｅｔ ｍＡｂのそのようなアゴニスト活性を報告した。非特許文献３５は、ファージディスプレイ法を使用して、マウス肝細胞増殖因子およびヒト肝細胞増殖因子に対するヒトＦａｂフラグメントの開発を行った。これらのＦａｂフラグメントは、単独で使用された場合は、ＨＧＦの活性に影響を有さなかった。抗ヒトＨＧＦ Ｆａｂフラグメントの１つがそのＦａｂフラグメント自体に結合された抗体と組み合わされた場合、それは、生物学的アッセイにおいてＨＧＦの活性を実際に強化する。

非特許文献３１は、３つの抗ＨＧＦ ｍＡｂ（これらの抗体は、インビトロでＨＧＦの分散活性を阻害するその抗体の能力に基づいて選択された）のカクテルの投与が、異種移植片ヌードマウスモデルにおいてヒト腫瘍の増殖を阻害することができる（図３）ことを実証した。非特許文献４５の著者らは、ＨＧＦの３つの異なる結合部位を認識する３つのｍＡｂが、インビボにおいてＨＧＦの生物活性を阻害するのに必要とされ：２つのｍＡｂはＨＧＦのｃＭｅｔへの結合を阻害し、１つのｍＡｂはＨＧＦのヘパリンへの結合を阻害する、と推定した。しかしながら、例えば、各抗体のいつくかの臨床的活性は独立して実証される必要があるため、３つの新規のｍＡｂを組み合わせた薬物を開発するのは、商業的理由および規制的理由から現実的ではない。
Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２年、１１９：６２９ ＺａｒｎｅｇａｒおよびＭｉｃｈａｌｏｐｏｕｌｏｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年、１２９：１１７７ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら，Ｃｉｂａ．Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．１９９７年、２１２：１９８ ＢｉｒｃｈｍｅｉｅｒおよびＧｈｅｒａｒｄｉ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８年、８：４０４ Ｘｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２００１年、１５８：１１１１ Ｊｅｆｆｅｒｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１９９６年、７４：５０５ ＣｏｍｏｇｌｉｏおよびＴｒｕｓｏｌｉｎｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００２年、１０９：８５７ Ｐｒａｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９１年、４９：３２３ Ｃｈａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９８８年、２：５９３ Ｗｅｉｄｎｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９３年、８：２２９ Ｄｅｒｋｓｅｎら、Ｂｌｏｏｄ、２００２年、９９：１４０５ Ｒｏｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４年、９１：４７３１ Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９７年、５７：５３９１ Ｇａｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年、２７６：４７２５７ Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ、１９８９年、３４２：４４０ Ｒｏｓｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４年、１２７：１７８３ Ｎａｌｄｉｎｉら，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９２年、１１：４８２５ Ｈａｒｔｍａｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２年、８９：１１５７４ Ｌｏｋｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３年、２６８：１７１４５ Ｎａｌｄｉｎｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９１年、６：５０１ Ｂａｒｄｅｌｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４年、３７：１０９ Ｓａｋａｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、２７２：９４５７ Ａｏｙａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７年、３６：１０２８６ Ｚｉｏｎｃｈｅｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５年、２７０：１６８７１ Ｃｏｏｐｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ、１９８４年、３１１：２９ Ｐａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８７年、８４：６３７９ Ｇｉｏｒｄａｎｏら，Ｎａｔｕｒｅ １９８９年、３３９：１５５ Ｇｉｏｒｄａｎｏら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９８９年、４：１３８３ Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１年、２５４：１３８２ Ｋｕｂａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００年、６０：６７３７ Ｃａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００１年、９８：７４４３ Ｃｉｏｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６年、２７１：１３１１０ Ｓｃｈｗａｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９６年、１３３：７０９ Ｐｒａｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１９９８年、１１１：２３７ Ｚａｃｃｏｌｏら，Ｅｕｒ．Ｊ．ｈｎｍｕｎｏｌ １９９７年、２７：６１８

従って、インビトロおよびインビボでＨＧＦの生物学的活性を遮断する単一のモノクローナル抗体に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性および他の必要性を満たす。

（発明の簡単な要旨）
１つの実施形態において、本発明は、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）に対する中和ｍＡｂを提供する。このｍＡｂは、少なくとも１つのＨＧＦの生物学的活性、好ましくは複数または全てのＨＧＦの生物学的活性を阻害する。このＨＧＦの生物学的活性としては、そのレセプターであるｃＭｅｔへの結合、Ｍａｒｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞のような細胞の分散の誘導、４ＭＢｒ−５サル上皮細胞および／または肝細胞および／またはＨＵＶＥＣの増殖の誘導、ならびに新脈管形成の誘導が挙げられる。この抗ＨＧＦ ｍＡｂは、単一の因子として使用された場合に、このような活性を阻害し得る。好ましい抗ＨＧＦ ｍＡｂは、マウスにおいてヒト腫瘍移植片の増殖を阻害し、最も好ましくは完全に阻害する。好ましくは、本発明のｍＡｂは、キメラ、ヒト化、ヒト様、またはヒトのものである。例示的な抗体は、Ｌ２Ｇ７ならびにそのキメラ形態およびヒト化形態である。そのような抗体を産生する細胞株もまた、提供される。別の実施形態において、中和抗ＨＧＦ抗体（例えば、キメラＬ２Ｇ７またはヒト化Ｌ２Ｇ７）を含む薬学的組成物が、提供される。第３の実施形態において、上記薬学的組成物は、癌または他の疾患を処置するために患者に投与される。

（発明の詳細な説明）
本発明は、中和抗ＨＧＦモノクローナル抗体、それらを含む薬学的組成物、および疾患の処置のためにそれらを使用する方法を提供する。

（１．抗体）
抗体は、非常に大きく、複雑な内部構造を有する複合分子（約１５０，０００の分子量または１３２０アミノ酸）である。天然の抗体分子は、同一な２対のポリペプチド鎖を含み、各対は、１つの軽鎖および１つの重鎖を有する。各軽鎖および重鎖は、順に、２つの領域：標的抗原への結合に関与する可変（「Ｖ」）領域、および免疫系の他の成分と相互作用する定常（「Ｃ」）領域、からなる。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、一緒に３次元空間に折り畳まれ、抗原（例えば、細胞の表面上のレセプター）に結合する可変領域を形成する。各軽鎖可変領域および重鎖可変領域内には、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短いセグメント（平均１０アミノ酸長）が存在する。抗体可変ドメインにおける６つのＣＤＲ（軽鎖由来の３つおよび重鎖由来の３つ）は、一緒に３次元空間に折り畳まれ、標的抗原上に固定する実際の抗体結合部位を形成する。そのＣＤＲの位置および長さは、正確に規定されている。Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３，１９８７を参照のこと。そのＣＤＲに含まれない可変領域部分は、フレームワークと呼ばれ、そのＣＤＲのための環境を形成する。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗体の単一分子種であり、それゆえ、動物（例えば、げっ歯類、ウサギまたはヤギ）に抗原を注入し、その動物から血清を抽出することによって産生されたポリクローナル抗体を包含しない。ヒト化抗体は、遺伝的に操作された（モノクローナル）抗体であり、この抗体において、マウス抗体（「ドナー抗体」、これはまたラット、ハムスターまたは他の類似種のものであり得る）由来のＣＤＲが、ヒト抗体（「アクセプター抗体」）上に移植されている。ヒト化抗体はまた、マウス抗体由来の完全未満のＣＤＲで作製され得る（例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２を参照のこと）。従って、ヒト化抗体は、ドナー抗体由来のＣＤＲ、ならびにヒト抗体由来の可変領域フレームワークおよび定常領域を有する抗体である。従って、代表的なヒト化抗体は、（ｉ）マウス抗体（例えばＬ２Ｇ７）由来の３つのＣＤＲ、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト定常領域を含む軽鎖、ならびに（ｉｉ）マウス抗体（例えば、Ｌ２Ｇ７）由来の３つのＣＤＲ、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト定常領域を含む重鎖、を含む。さらに、高結合能を維持するために、２つのさらなる構造エレメントのうちの少なくとも１つが利用され得る。米国特許第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号を参照のこと。これらの各々は、本明細書中に参考として援用され、ヒト抗体の構築のための詳細な指示を提供する。

第１の構造エレメントにおいて、上記ヒト化抗体の重鎖可変領域のフレームワークは、多くの公知のヒト抗体の中から適切にアクセプター抗体を選択することにより、ドナー抗体の重鎖可変領域のフレームワークと最大の配列同一性（６５％と９５％との間）を有するように選択される。配列同一性は、比較される抗体配列がＫａｂａｔナンバリングの慣習に従ってアライメントされて決定される。第２の構造エレメントにおいて、ヒト化抗体の構築の際に、ヒトアクセプター抗体のフレームワークにおける選択されたアミノ酸（ＣＤＲの外側）が、指定されるルールに従って、対応するドナー抗体由来のアミノ酸と置換される。具体的には、フレームワークにおいて置換されるアミノ酸は、上記ＣＤＲと相互作用するその能力に基づいて、選択される。例えば、その置換されるアミノ酸は、３次元空間で測定された場合に、ドナー抗体配列におけるＣＤＲに隣接したものであっても、ヒト化抗体におけるＣＤＲの４〜６オングストローム以内のものであってもよい。

キメラ抗体は、マウス（または、他のげっ歯類）抗体の可変領域がヒト抗体の定常領域と組み合わされた抗体であり；遺伝子操作を用いるその構築は、周知である。そのような抗体は、約３分の２がヒトでありながら、マウス抗体の結合特異性を保持する。マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体に存在する非ヒト配列の割合は、キメラ抗体の免疫原性は、マウス抗体とヒト化抗体との間の中間であることを示唆する。マウス抗体に対して低下した免疫原性を有し得る、他の型の遺伝子操作された抗体としては、ファージディスプレイ法（Ｄｏｗｅｒら，ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ，ＷＯ９２／２０７９１；およびＷｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２３：９２，１９９８，これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を使用するか、またはトランスジェニック動物（Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｗ０９３／１２２２７；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ Ｗ０９１／１０７４１、これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）を使用して作製されたヒト抗体が挙げられる。

本明細書中で使用される場合、用語「ヒト様」抗体とは、鎖の一方または両方のアミノ酸配列のかなりの部分（例えば、約５０％以上）がヒト免疫グロブリン遺伝子起源であるＭａｂをいう。従って、ヒト様抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を包含するが、これらに限定されない。本明細書中で使用される場合、「低下した免疫原性」抗体は、ヒト患者に投与された場合に、マウス抗体よりも有意に小さい免疫原性を有すると予測されるものである。そのような抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、ならびにＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープに寄与し得るマウス抗体における特定のアミノ酸（例えば、露出残基）を置換することによって作製された抗体（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）を包含する。本明細書中で使用される場合、「遺伝子操作」抗体は、その遺伝子が、組み換えＤＮＡ技術の助けで、非天然環境において構築されているかまたは非天然環境に置かれており（例えば、マウスにおけるヒト遺伝子またはバクテリオファージ上のヒト遺伝子）、それゆえ、例えば従来のハイブロドーマ技術で作製されたマウスｍＡｂを含まない抗体である。

ｍＡｂのエピトープは、そのｍＡｂが結合するその抗原の領域である。各々が抗原に対する他方の抗体の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、２つの抗体は、同一のエピトープまたはオーバーラップするエピトープに結合する。すなわち、一方の抗体の１×、１０×、５×、２０×または１００×過剰量は、競合する抗体を欠くコントロールと比較される競合結合アッセイにおいて測定される場合、他方の抗体の結合を、少なくとも５０％、好ましくは７５％、９０％または９９％までも阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０、これは、本明細書中に参考として援用される）。あるいは、一方の抗体の結合を減少または排除する、抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を減少または排除する場合、２つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または排除する、いくつかのアミノ酸変異が、他方の抗体の結合を減少または排除する場合、２つの抗体はオーバーラップするエピトープを有する。

（２．中和抗ＨＧＦ抗体）
ＨＧＦに結合するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（すなわち、抗ＨＧＦ抗体）は、１つ以上のＨＧＦの生物学的活性を部分的または完全に阻害する場合（すなわち、そのｍＡｂが単一の因子として使用された場合）、ＨＧＦを中和する、または中和性であると言われる。中和抗体が阻害し得るＨＧＦの生物学的特性の中でもとりわけ、ＨＧＦのｃＭｅｔレセプターに結合する能力、特定の細胞株（例えば、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞）の分散を引き起こすＨＧＦの能力、特定の細胞（肝細胞、４ＭＢｒ−５サル上皮細胞、および種々のヒト腫瘍細胞を含む）の増殖を刺激する（すなわち、マイトジェンである）ＨＧＦの能力；または、例えば鶏胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）に適用された場合、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）増殖もしくは管形成の刺激または血管の誘導による刺激により測定された場合の、新脈管形成を刺激するＨＧＦの能力、である。本発明の抗体は、好ましくは、ヒトＨＧＦに、すなわち、登録番号Ｄ９０３３４のＧｅｎＢａｎｋ配列によりコードされるタンパク質（参考として援用される）に、結合する。

０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌの濃度の本発明の中和ｍＡｂは、ＨＧＦの生物学的機能（例えば、増殖または分散の刺激）を、下記実施例に記載される方法または当該分野において公知の方法によってアッセイされた場合に、少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％または９５％または９９％までも、そして最も好ましくは約１００％（本質的には完全に）阻害する。活性のレベルがＨＧＦを欠くネガティブコントロールに対して誤差の範囲内にある場合に、阻害は完全であるとみなされる。代表的に、使用されるＨＧＦの量が、生物学的活性を完全に刺激するのにちょうど十分であるかまたは０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌである場合に、阻害の範囲が測定される。好ましくは、少なくとも５０％、７５％、９０％または９５％、または本質的に完全な阻害が、ＨＧＦに対する抗体のモル比が、０．５×、１×、２×、３×、５×または１０×の場合に達成される。好ましくは、上記ｍＡｂは、単一の因子として使用された場合には、中和性であり、すなわち上記生物学的活性を阻害するが、おそらく阻害を提供するためには２つのｍＡｂが一緒である必要がある。最も好ましくは、そのｍＡｂは、上に列挙された生物学的活性の１つだけではなく複数を中和する。そして、本明細書中の目的に対しては、単一の因子として使用され、ＨＧＦの全ての生物学的活性を中和して、「完全中和性（ｆｕｌｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）」と呼ばれ、そしてそのようなｍＡｂが最も好ましい。本発明のｍＡｂは、好ましくはＨＧＦに特異的である。すなわち、本発明のｍＡｂは、ＨＧＦに関連するタンパク質（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））に結合しないかまたは非常に低い程度（例えば、Ｋａが少なくとも１０倍未満）でしか結合しない。好ましい抗体は、ＨＧＦに対するアゴニスト活性を欠く。すなわち、その抗体は、ＨＧＦを保持する細胞を直接的には刺激せずに、ＨＧＦのｃＭｅｔとの相互作用を遮断する。本発明のｍＡｂは、代表的には、ＨＧＦについて少なくとも１０^７Ｍ^−１、好ましくは１０^８Ｍ^−１以上、そして最も好ましくは１０^９Ｍ^−１以上または１０^１０Ｍ^−１以上でさえある結合親和性（Ｋａ）を有する。

本発明のｍＡｂは、その天然の４量体形態（２本の軽鎖および２本の重鎖）の抗ＨＧＦ抗体を含み、任意の公知のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）、ならびにそのサブタイプ（すなわち、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、およびマウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂおよｂマウスＩｇＧ３）であり得る。本発明のｍＡｂはまた、抗体のフラグメント（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２）；二機能性ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５，１９８７）；単鎖抗体（Ｈｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９，１９８８；Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３，１９８８）；ならびに改変された定常領域を有する抗体（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号）を包含することを意味する。そのｍＡｂは、動物（例えば、マウス、ラット、ハムスターまたはニワトリ）起源であってもよいし、遺伝子操作されていてもよい。げっ歯類ｍＡｂは、当該分野において周知な標準的な方法により作製される。その方法は、腹腔内、静脈内、または足蹠内に適切なアジュバント中のＨＧＦで多重免疫化し、その後脾臓細胞またはリンパ節細胞を抽出して適切な不死化細胞株と融合させ、次いでＨＧＦに結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することを包含する（例えば、下記実施例を参照のこと）。上記の当該分野で公知の方法により作製されたキメラｍＡｂおよびヒト化ｍＡｂは、本発明の好ましい実施形態である。例えばファージディスプレイ法またはトランスジェニックマウス法によって作製されたヒト抗体もまた、好ましい（例えば、Ｄｏｗｅｒら，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ；上述）。より一般的には、本明細書中に規定されるような、ヒト様抗体、低下した免疫原性の抗体、および遺伝子操作された抗体は、全て好ましい。

本明細書中に記載された、上記中和抗ＨＧＦ ｍＡｂであるＬＩＨ４ｍＡｂ、Ｌ２Ｃ７ｍＡｂおよびＬ２Ｇ７ ｍＡｂは、本発明の例であり、Ｌ２Ｇ７が好ましい例である。これらのｍＡｂのいずれか（例えば、Ｌ２Ｇ７）と同一またはオーバーラップするエピトープを有する中和ｍＡｂは、他の例を提供する。Ｌ２Ｇ７のキメラ形態またはヒト化形態またはＬＧＦとのキメラ形態またはヒト化形態は、特に好ましい実施形態である。本明細書中に記載された少なくとも１つ（好ましくは全て）のインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて、ＨＧＦへの結合についてＬ２Ｇ７と競合し、ＨＧＦを中和するｍＡｂ（キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体を含む）もまた、好ましい。アミノ酸配列において（少なくともＣＤＲにおいて）、Ｌ２Ｇ７に９０％、９５％、９９％または１００％同一（Ｋａｂａｔの慣習に従う抗体配列のアライメントにより決定された）なｍＡｂが、本発明に包含される。好ましくは、このような抗体は、少数の機能的に重要でないアミノ酸置換（例えば、保存的置換）、欠失、または挿入により、Ｌ２Ｇ７とは異なる。好ましくは、そのような抗体は、Ｌ２Ｇ７の機能的特性を維持する。すなわち、そのような抗体は、本明細書中に記載される少なくとも１つ（そして好ましくは全て）のインビトロアッセイまたはインビボアッセイにおいて、ＨＧＦを中和する。アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類する目的のために、アミノ酸は、以下のようにグループ化され得る：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、メチオニン（ｍｅｔ）、アラニン（ａｌａ）、バリン（ｖａｌ）、ロイシン（ｌｅｕ）、イソロイシン（ｉｌｅ）；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：システイン（ｃｙｓ）、セリン（ｓｅｒ）、トレオニン（ｔｈｒ）；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：アスパラギン酸（ａｓｐ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）；グループＩＶ（塩基性側鎖）：アスパラギン（ａｓｎ）、グルタミン（ｇｌｎ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、リジン（ｌｙｓ）、アルギニン（ａｒｇ）；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：グリシン（ｇｌｙ）、プロリン（ｐｒｏ）；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：トリプトファン（ｔｒｐ）、チロシン（ｔｙｒ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）。保存的置換は、同一のクラス内のアミノ酸間の置換を包含する。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーと、別のメンバーとを交換することからなる。

本発明のネイティブなｍＡｂは、そのハイブリドーマから産生され得る。遺伝子操作されたｍＡｂ（例えば、キメラｍＡｂまたはヒト化ｍＡｂ）は、種々の当該分野で公知の方法により発現され得る。例えば、その軽鎖および軽鎖Ｖ領域をコードする遺伝子は、オーバーラップするオリゴヌクレオチドから合成され得、必要な制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ部位など）を提供する（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販される）発現ベクター内に、利用可能なＣ領域と一緒に挿入され得る。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。次いで、その発現ベクターは、種々の周知の方法（例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーション）を使用して、種々の哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯまたは非産生（ｎｏｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）メラノーマ（Ｓｐ２／０およびＮＳ０を含む））へトランスフェクションされ、そしてその抗体を発現する細胞が、適切な抗生物質セレクションにより選択される。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号を参照のこと。より大量の抗体が、その細胞を市販のバイオリアクター内で増殖させることにより、産生され得る。

一旦発現されると、本発明のｍＡｂまたは他の抗体は、当該分野で標準的な手順（例えば、精密濾過、限外濾過、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーもしくはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、および／または有機染料などに基づく他の形態のアフィニティークロマトグラフィー）に従って、精製され得る。薬学的な用途のためには、少なくとも約９０％または約９５％の均一性の実質的に純粋な抗体が好ましく、そして９８％または９９％またはそれより大きい均一性が最も好ましい。

（３．治療用途）
好ましい実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される抗体を含む薬学的処方物を提供する。すなわち、その抗体は、疾患の処置のための医薬の製造において使用され得る。その抗体の薬学的処方物（すなわち、医薬）は、生理学的に受容可能なキャリア中に、必要に応じて賦形剤または安定剤と一緒に、凍結乾燥形態または水溶液形態において、上記ｍＡｂを含有する。受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤は、用いられる用量または濃度でレシピエントに非毒性であり、代表的に５．０〜８．０（最も頻繁には、６．０〜７．０）のｐＨの緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または酢酸塩）；等張にするための塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）；抗酸化剤、保存剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水性ポリマー（例えば、ポリソルベート８０）、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、および当業者に公知の他の標準的な成分（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、１９８０）を含む。上記ｍＡｂは、代表的に、１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度で存在する。

本発明の抗体は、代表的には、所望されない混入物質から実質的に純粋である。これは、その抗体が、代表的には、少なくとも約５０％ ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、そして干渉タンパク質および混入物質を実質的に含まないことを意味する。好ましくは、その抗体は、少なくとも９０％ ｗ／ｗ純粋、９５％ ｗ／ｗ純粋、または９９％ ｗ／ｗ純粋である。非経口投与のための薬学的組成物は、通常無菌であり、実質的に等張であり、ＦＤＡまたは類似の団体のＧｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って調製される。

別の好ましい実施形態において、本発明は、疾患を有する患者を、薬学的処方物中の抗ＨＧＦ ｍＡｂを使用して処置する方法を提供する。薬学的処方物中に調製されたｍＡｂは、任意の適した経路（特に、静脈注射もしくはボーラス注射、筋肉内または皮下注射による非経口経路）によって、患者に投与され得る。静脈内注射は、わずか１５分間、より頻繁には３０分間、または１時間、２時間または３時間さえ、与えられ得る。上記ｍＡｂはまた、疾患の部位（例えば、腫瘍）の部位に直接的に注射されてもよいし、リポソームのような運搬因子内に被膜化されてもよい。与えられる用量は、処置される状態を軽減するのに十分（「治療的有効量」）であり、体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜５ｍｇ（例えば、１ｍｇ／ｋｇ、２ｋｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇ）であることが多いが、１０ｍｇ／ｋｇもの量であっても、１５ｍｇ／ｋｇもしくは２０ｍｇ／ｋｇでさえあってもよい。一定の単位用量（例えば５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇまたは１０００ｍｇ）がまた与えられてもよいし、用量は患者の表面積（例えば、１００ｍｇ／ｍ^２）に基づいて投与され得る。通常、１用量と８用量との間（例えば、１用量、２用量、３用量、４用量、５用量、６用量、７用量または８用量）が癌を処置するために投与されるが、１０用量、２０用量またはそれより多い用量が投与され得る。上記ｍＡｂは、そのｍＡｂの半減期（例えば、１週間、２週間、４週間、８週間、３〜６ヶ月間またはそれより長い）に依存して、毎日、週２回、毎週、隔週、毎月、または何らかの他の間隔で投与され得る。長期投与のような、反復過程の処置もまた可能である。疾患の（生化学的、組織学的、および／または臨床的）症状（その合併症およびその疾患の発症における中間の病理表現型を含む）を軽減するかまたは少なくとも部分的に停止させる、投与の用量および間隔のレジメンは、治療的に有効なレジメンといわれる。

本発明の薬学的組成物はまた、癌の危険性がある患者の予防においても使用され得る。そのような患者としては、発癌性因子（例えば、放射線または毒素）への曝露を受けた患者、および以前に癌の処置を受け、再発の危険がある患者が挙げられる。予防的用量は、上記危険性を排除するかまたは低下させ、重篤度を低下させ、またはその疾患（その疾患の生化学的、組織学的および／または臨床的症状、その合併症ならびにその疾患の発症の間に存在する中間の病理表現型を含む）の発症を遅延させるのに十分な量である。これらの対象の１つ以上に影響するのに有効な量および間隔における薬学的組成物の投与は、予防的に有効なレジメンといわれる。

本発明の抗ＨＧＦ ｍＡｂでの治療に特に感受性である疾患としては、子供または成人の、新脈管形成を必要とすることが既知であるかもしくはそう疑われる固形腫瘍、またはＨＧＦレベルの上昇に関連することが既知であるかもしくはそう疑われる固形腫瘍（例えば、卵巣癌、乳癌、肺癌（小細胞癌もしくは非小細胞癌）、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、肝臓癌、）頭頸部癌、メラノーマ、肉腫および脳腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫）が挙げられる。処置はまた、白血病またはリンパ腫を有する患者にも投与され得る。好ましい実施形態において、上記抗ＨＧＦ ｍＡｂは、他の抗癌治療と一緒に（すなわち、前、間または後に）と投与され得る。例えば、その抗ＨＧＦ ｍＡｂは、腫瘍学の分野の当業者に既知の任意の１つ以上の化学療法薬（例えば、タキソール（パクリタキセル）もしくはその誘導体、カルボプラチンもしくはシスプラチンのような白金化合物、ドキソルビシンのようなアントラサイクリン（ａｎｔｈｒｏｃｙｃｌｉｎｅ）、シクロホスファミドのようなアルキル化剤、５−フルオロウラシルのような代謝拮抗剤、またはエトポシド）と一緒に投与され得る。上記抗ＨＧＦ ｍＡｂは、２つ、３つ、またはそれより多いこれらの因子と組み合わせて、標準的な化学療法レジメン（例えば、乳癌および卵巣癌に対するタキソールおよびカルボプラチン）で投与され得る。抗ＨＧＦ ｍＡｂが一緒に投与され得る他の因子としては、モノクローナル抗体のような生物製剤（ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）、またはＥＧＦレセプターに対する抗体）、および小分子抗血管形成剤またはＥＧＦレセプターアンタゴニスト薬が挙げられる。さらに、その抗ＨＧＦ ｍＡｂは、放射線治療または手術と一緒に使用され得る。

抗ＨＧＦ ｍＡｂ抗体を含む処置（例えば、標準的な化学療法）は、これらの腫瘍（例えば、卵巣腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、脳腫瘍および結腸腫瘍、特に再発性または難治性の場合）を有する患者の、無増悪期間中央値（ｍｅｄｉａｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）または全体の生存時間を、抗ＨＧＦ ｍＡｂなしの同一の処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも３０％または４０％、好ましくは、５０％、６０％〜７０％または１００％でさえ、またはそれより長く、増加させ得る。さらに、またはあるいは、上記抗ＨＧＦ ｍＡｂを含む処置（例えば、標準的な化学療法）は、これらの腫瘍（例えば、卵巣腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、脳腫瘍および結腸腫瘍、特に再発性または難治性の場合）を有する患者の、完全反応割合、部分反応割合、または客観的反応割合（完全＋部分）を、抗ＨＧＦ ｍＡｂなしの同一の処置（例えば、化学療法）と比較して、少なくとも３０％または４０％、好ましくは、５０％、６０％〜７０％または１００％でさえ、増加させ得る。必要に応じて、処置は、腫瘍の浸潤または転移を阻害し得る。

代表的に、臨床試験（例えば、フェーズＩＩ試験、フェーズＩＩ／ＩＩＩ試験またはフェーズＩＩＩ試験）において、化学療法のみ（または、＋プラシーボ）を受けている患者のコントロール群に対して、化学療法＋上記抗ＨＧＦ ｍＡｂで処置された患者の上述の無増悪期間中央値または反応割合における増加は、統計的に有意（例えば、ｐ＝０．０５レベルまたは０．０１レベルまたは０．００１レベルでさえある）である。完全反応割合または部分反応割合は、癌に対する臨床試験において（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅおよび／またはＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎによって列挙または受理されているような）一般的に使用される客観的基準によって決定されることが、当業者によって理解される。

（４．他の方法）
本発明の抗ＨＧＦ ｍＡｂはまた、診断方法、予後方法および研究室方法における用途を見出し得る。それらは、腫瘍を有する患者の腫瘍中の、または血行中の、ＨＧＦのレベルを測定するために；そしてそれゆえその腫瘍の処置を追跡し、導くために、使用され得る。例えば、高レベルのＨＧＦに関する腫瘍は、抗ＨＧＦ ｍＡｂでの処置に特に感受性である。特定の実施形態において、そのｍＡｂは、例えば腫瘍生検標本において、もしくは血清において、または細胞培養物におけるＨＧＦ分泌細胞の培地上清において、ＨＧＦのレベルを測定するためのＥＬＩＳＡまたは放射免疫測定において使用され得る。異なるエピトープに結合する（すなわち、結合について競合しない）２つの抗ＨＧＦ ｍＡｂの使用は、ＨＧＦを検出するための感受性「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡの開発において特に有用である。種々のアッセイのために、そのｍＡｂは、蛍光分子、スピン標識分子、酵素またはラジオアイソタイプで標識化され得、ＨＧＦについてのアッセイを実施するための全ての必要な試薬を備えるキットの形態で提供され得る。他の用途においては、その抗ＨＧＦ ｍＡｂは、例えばアフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＧＦを精製するために使用され得る。

（１．抗ＨＧＦ ｍＡｂの生成）
ヒトＨＧＦに結合し、ヒトＨＧＦの活性を遮断するｍＡｂを生成するために、組み換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）を、最初に哺乳動物発現系において産生した。その組み換えヒトＨＧＦ（ｒＨＧＦ）またはｒＨＧＦ−Ｆｌａｇペプチド（ＨＧＦのＣ末端に結合された８アミノ酸残基のＦｌａｇ）をコードするｃＤＮＡを、ｐＩＮＤ誘導性発現ベクターにおいて構築した（Ｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６，１９９６）。次いでこれらのｃＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＥｃＲ−２９３ヒト腎臓線維芽細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にトランスフェクションした。ＨＧＦおよびＨＧＦ−Ｆｌａｇをそれぞれ分泌する、安定な細胞株であるＨＩ−Ｆ１１および２４．１を、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８および４００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で選択した。ＨＩ−Ｆ１１および２４．１を、グルタミンおよび抗生物質を含有する血清なしのＤＭＥＭにおいて、４ＭのＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４〜５日間処理することにより、ＨＧＦおよびＨＧＦ−Ｆｌａｇを分泌するように誘導した。１５，０００ｒｐｍで３０分間、４℃での遠心分離によって凝集体を除去後、培養上清中に分泌されたＨＧＦを、ＭＷ５０，０００のカットオフフィルターを備える膜限外濾過カートリッジを使用して、約１００倍に濃縮した［ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−５０ ｆｉｌｔｅｒ、続いてｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−５０ ｆｉｌｔｅｒ （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）］。そのような濃縮Ｈ１Ｆ１１培養上清は、約１００μｇ／ｍｌのＨＧＦおよび約１２０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する。

Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＭＰＬ−ＴＤＭ（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁された１〜２μｇの精製ｒＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）または１〜２μｇのｒＨＧＦ＋１〜２μｇのＢＳＡ（濃縮ＨＩ−Ｆ１１培養上清）で、１週間間隔で１０回以上、各後肢の足蹠において免疫化した。最後の１回の３日後、膝窩リンパ節細胞を、３５％ポリエチレングリコールを使用して、マウスミエローマ細胞であるＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９７）と融合させた。ハイブリドーマを、記載された通り（ＣｈｕｎｔｈａｒａｐａｉおよびＫｉｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：７６６，１９９７、これは、本明細書中に参考として援用される）、ＨＡＴ培地において選択した。その融合から１０日後に、ハイブリドーマ培養上清を、直接的ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡおよびＨＧＦ−Ｆｌａｇ捕捉ＥＬＩＳＡにおいて、スクリーニングした。後者のアッセイは、その直接的ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡを使用して選択された抗ＨＧＦ ｍＡｂの特異性をさらに確認するために、そして溶液相においてＨＧＦに結合し得るｍＡｂを選択するために、使用した。選択されたｍＡｂの遮断活性を、次いで、記載された通り（Ｊｅｆｆｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４４１７，１９９８）に、上記ＨＧＦ−Ｆｌａｇ／ｃＭｅｔ−Ｆｃ結合ＥＬＩＳＡおよび上記ＭＤＣＫ分散アッセイにおいて決定した。選択されたハイブリドーマを、限界希釈技術を使用して、２回クローニングした。ｍＡｂのアイソタイプを、アイソタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ）を使用して決定した。選択されたｍＡｂの腹水を採取し（ｒａｉｓｅ）、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（Ａ／Ｇ） ＩｇＧ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して精製した。ビオチン化したｍＡｂもまた、Ｐｉｅｒｃｅにより提供された指示書に従って、ＥＺ−ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎを使用して調製した。本明細書中に言及されたアッセイの各々は、以下により詳細に記載される。直接的ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡのために、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ；Ｎｕｎｃ）を、４℃で一晩、ＰＢＳ中に１：２のＨＧＦ／ＰＢＳ比で希釈された、ｒＨＧＦを含有する５０μｌ／ウェルのＨ１−Ｆ１培養上清でコーティングする。そのプレートを洗浄した後、非特異的結合部位を、２％スキムミルク含有ＰＢＳで、１時間室温（ＲＴ）でブロッキングする。そのプレートを洗浄した後、５０μｌ／ウェルの精製されたｍＡｂまたはハイブリドーマ培養上清を、各ウェルに１時間添加する。次いで、洗浄後にこのプレートを、５０μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌ ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧ，Ｃａｐｐｅｌ）と一緒に、１時間インキュベートする。結合したＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを、テトラメチルベンジジン基質（Ｓｉｇｍａ）の添加により検出する。その反応を、１ＮのＨ_２ＳＯ_４の添加によって停止させ、次いでそのプレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取る。洗浄を、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）において３回実施する。

ＨＧＦ−Ｆｌａｇ捕捉ＥＬＩＳＡのために、マイクロタイタープレートを、４℃にてＰＢＳ中で一晩、マウスＩｇＧ（ＧαＭＩｇＧ−Ｆｃ）のＦｃ部分に特異的な２μｇ／ｍｌのヤギ抗体の５０μｌ／ｍｌでコーティングし、２％スキムミルクで１時間室温でブロッキングする。洗浄後に、そのプレートを、５０μｌ／ウェルの精製ｍＡｂまたはハイブリドーマ培養上清と一緒に１時間インキュベートする。次いで、洗浄後に、プレートを、５０μｌ／ウェルのｒＨＧＦ−Ｆｌａｇ含有２４．１細胞培養上清と一緒にインキュベートする。次いで、洗浄後に、プレートを、１５μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧの存在下で、５０μｌ／ウェルのＨＲＰ−Ｍ２抗Ｆｌａｇ ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にインキュベートする。結合ＨＲＰ抗Ｆｌａｇ Ｍ２を、上に記載されたように、上記基質の添加によって検出する。洗浄を、洗浄緩衝液において３回実施する。

Ｌ１Ｈ４、Ｌ２Ｃ７およびＬ２Ｇ７と命名され、上に記載されたように濃縮ＨＩ−Ｆ１１培養上清中のｒＨＧＦで上記Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫化することによって生成されたハイブリドーマから得られ、上記直接的ｒＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡおよび上記ＨＧＦ−Ｆｌａｇ捕捉ＥＬＩＳＡの両方において結合を示した、少なくとも３つのｍＡｂを、さらなる研究のために選択した。次いで、これらのハイブリドーマを２回クローニングし、腹水をマウスにおいて標準的な方法により採取し、そしてｍＡｂをプロテインＧ／Ａカラムを使用して精製した。それらのアイソタイプを、アイソタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ）を使用して決定した。上記Ｌ２Ｇ７ハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に則って、２００３年４月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １５４９ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０８に、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２として寄託されている。これらの寄託物は、サンプルの譲渡のための最も最近の要求が管理機関により受理されてから少なくとも５年間、その寄託の日付から少なくとも３０年間、または関連する特許の法的強制力のある期間の間のいずれか最長の期間、公認された管理機関にて維持され、そして変異、非生存または破壊の事象の際に交換される。これらの細胞株の一般への利用可能性についての全ての制約は、その出願から、特許査定の際に無条件で取り除かれる。

一旦、インビトロでＨＧＦを中和し、そして／またはインビボで腫瘍の増殖を（例えば、完全に）阻害する、本明細書中に記載される所望の特性を有する、単一の、原型の（ａｒｃｈｔｙｐａｌ）抗ヒトＨＧＦ ｍＡｂ（例えば、Ｌ２Ｇ７）が単離されると、当業分野に公知の方法を用いることにより、類似の特性を有する他のｍＡｂを生成するのは容易である。例えば、マウスを、上に記載された通りにＨＧＦで免疫化し、ハイブリドーマを生産し、そして得られたｍＡｂを、ＨＧＦへの結合について原型のｍＡｂと競合する能力についてスクリーニングし得る。あるいは、Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９，１９９４（これは、本明細書中に参考として援用される）を、上記原型のｍＡｂ（例えば、Ｌ２Ｇ７）と同一のエピトープを有し、そしてそれゆえ類似の特性を有するｍＡｂの選抜を導くために、使用し得る。ファージディスプレイを使用して、その原型の抗体の第１の重鎖を、（好ましくはヒトの）軽鎖のレパートリーと対にしてＨＧＦ結合ｍＡｂを選択し、次いでその新しい軽鎖を、（好ましくはヒトの）重鎖のレパートリーと対にし、その原型のｍＡｂと同一のエピトープを有する（好ましくはヒト）ＨＧＦ結合ｍＡｂを選択する。

（２．インビトロでの抗ＨＧＦｍＡｂの特徴付け）
上記抗体の結合エピトープを、競合結合ＥＬＩＳＡによって部分的に特徴付けし、ここで１００×過剰の非標識ｍＡｂを、上記ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡにおける同一または別のビオチン化ｍＡｂの結合と競合させるために使用した。図４は、抗ＨＧＦ ｍＡｂであるＬ１Ｈ４およびＬ２Ｇ７の結合が、それら自体によってのみ阻害されたことを示し、このことは、これらが独特のエピトープを認識することを示唆する。Ｌ２Ｃ７の結合は、Ｌ２Ｃ７によって阻害されたが、Ｌ１Ｈ４によっては阻害されなかった。このことは、そのＬ２Ｃ７エピトープが、Ｌ２Ｇ７のエピトープとはオーバーラップしているが、Ｌ１Ｈ４のエピトープとはオーバーラップしていないことを示唆する。しかしながら、Ｌ２Ｃ７は、Ｌ２Ｇ７の結合を阻害することはできなかった。このことは、そのＬ２Ｃ７エピトープおよびＬ２Ｇ７エピトープはオーバーラップするが異なり、そして／またはＬ２Ｃ７の親和性は、Ｌ２Ｇ７の親和性よりもずっと小さいことを示唆する。Ｌ１Ｈ４、Ｌ２Ｃ７およびＬ２Ｇ７のエピトープは、それぞれＡ、ＢおよびＣと指定する。

上記３つの抗ＨＧＦ ｍＡｂの相対的結合能を、直接的ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡにおいて、精製された抗体を使用して測定した。ここで、ｒＨＧＦは、プレートに最初に結合される。このアッセイにおいて、Ｌ２Ｃ７およびＬ２Ｇ７は、Ｌ１Ｈ４よりもよく結合した（図５）。溶液中のｒＨＧＦ−Ｆｌａｇに結合するそのｍＡｂの能力もまた、上記ＨＧＦ−Ｆｌａｇ捕捉ＥＬＩＳＡを使用して、決定した。３つのｍＡｂ全てが、溶液相においてｒＨＧＦ−Ｆｌａｇを捕捉することができたが、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、他のものよりもより効率的であった（図６）。これらの結果は、その３つのｍＡｂの間でｍＡｂ Ｌ２Ｇ７がＨＧＦに対する最高の結合親和性を有することを示唆する。

ＨＧＦの生物学的活性のうちの１つは、そのレセプターであるｃＭｅｔに結合する能力であるので、ＨＧＦのｃＭＥＴへの結合を阻害するその抗ＨＧＦ ｍＡｂの能力をアッセイした。このアッセイのために、ｃＭｅｔ−Ｆｃを、最初に、ｐＤｉｓｐｌａｙ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、Ｍａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２６１６６，１９９２によって記載される通り、ヒトＩｇＧ１（残基２１６〜４４６）のＦｃ部分に連結されたｃＭｅｔの残基１〜９２９ＥＣＤをコードするｃＤＮＡで、ヒト線維芽２９３細胞をトランスフェクションすることによって産生した。マイクロタイタープレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ中のヒトＩｇＧ（ＧαＨＩｇＧ−Ｆｃ）のＦｃ部分に特異的な２μｇ／ｍｌの、ヤギ抗体５０μｌ／ウェルで、コーティングし、２％ＢＳＡで１時間室温でブロッキングする。そのプレートを洗浄後、ｃＭｅｔ−Ｆｃ ｃＤＮＡでトランスフェクションされた２９３の培養上清の５０μｌを、各ウェルに１時間室温で添加する。そのプレートを洗浄後、種々の濃度のｍＡｂと一緒にプレインキュベートされた、ｒＨＧＦ−Ｆｌａｇを含有する５０μｌ／ウェルの２４．１細胞培養上清を、１時間各ウェルに添加する。次いで洗浄後に、プレートを、ＨＲＰ−Ｍ２ 抗−Ｆｌａｇ ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５０μｌ／ウェルと一緒にインキュベートする。結合したＨＲＰ−抗Ｆｌａｇ Ｍ２を、上に記載された通り、上記基質の添加により検出する。洗浄は、洗浄緩衝液において３回実施する。

このＨＧＦ−Ｆｌａｇ／ｃＭｅｔ−Ｆｃ結合阻害アッセイにおいて、３つのｍＡｂ全てはいくらかの程度の阻害を示した一方で、Ｉｇコントロール抗体は示さなかった（図７）。１μｇ／ｍｌ以上のｍＡｂ Ｌ２Ｇ７および５０μｇ／ｍｌのｍＡｂ Ｌ１Ｈ４は、ｒＨＧＦ−ＦｌａｇのｃＭｅｔ−Ｆｃへの結合を根絶し；５０μｇ／ｍｌのｍＡｂ Ｌ２Ｃ７でさえ、８５％だけの阻害を与えた。それゆえ、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、他の抗体よりも、ｒＨＧＦ−ＦｌａｇのｃＭｅｔ−Ｆｃとの（そしてそれゆえ、おそらくＨＧＦの、そのレセプターであるｃＭｅｔとの）相互作用の阻害において、ずっと強力であった。このことは、ＨＧＦに対するより推定上のより大きな親和性と一致する。

ｃＭｅｔ−Ｆｃ／ＨＧＦ−Ｆｌａｇ結合ＥＬＩＳＡにおいて使用されるレセプタータンパク質は可溶性レセプタータンパク質であるので、その立体構造は、天然の膜結合レセプターの立体構造とはことなったものであるかもしれない。さらに、ＨＧＦは、ｃＭｅｔに加えてＨＳＰＧに結合し、ＨＳＰＧ−ＨＧＦ相互作用が種々のＨＧＦ活性を強化することが知られている。従って、可溶性ｃＭｅｔとのＨＧＦの相互作用を遮断するｍＡｂは、細胞上でのＨＧＦの生物学的活性を中和する能力を必ずしも有さないかもしれない。従って、選択された生物学的系において、ｍＡｂの遮断する活性をさらに確認することが重要である。ＨＧＦは、強力な分散因子であることが知られている。従って、上記抗ＨＧＦ ｍＡｂの中和活性をまた、記載された（Ｊｅｆｆｅｒｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４４１７，１９９８）通り、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＡＴＣＣから得たＭＤＣＫ細胞）分散アッセイを使用して決定した。５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭにおいて増殖したＭＤＣＫ細胞を、５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中のｍＡｂと一緒かまたはｍＡｂなしで、予め決定された濃度のｒＨＧＦの存在下で、１０^３細胞／１００μｌ／ウェルでプレーティングする。次いで、３７℃で５％ＣＯ_２中で２日間のインキュベート後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、２％ホルムアルデヒド中で１０分間室温で固定する。ＰＢＳでの洗浄後に、細胞を、室温で１０分間、５０％エタノール（ｖ／ｖ）中０．５％クリスタルバイオレットで染色する。分散活性を、顕微鏡検査により決定する。

上に記載された、ＨＧＦを分泌するＨＩ−Ｆ１１クローンの培養上清を、その分散アッセイにおけるＨＧＦの供給源として使用した。１：８０希釈もの少なさのＨＩ−Ｆ１１培養上清が、ＭＤＣＫ細胞の分散および増殖を誘導した。しかしながら、その分散アッセイは、１：２０希釈のＨＩ−Ｆ１１培養上清（約３μｇ／ｍｌ）を使用して実施した。１：５のＨＧＦ／ｍＡｂモル比のｍＡｂ Ｌ２Ｇ７でさえ、それ自体で、ＭＤＣＫのＨＧＦ誘導性分散を阻害し（図８）、最終的にｍＡｂ Ｌ２Ｇ７が確かに中和ｍＡｂであることを実証した。２０μｇ／ｍｌ以上のｍＡｂ Ｌ１Ｈ４もまた、ＨＧＦによって誘導されるＭＤＣＫの分散を中和し得た一方で、２０μｇ／ｍｌものｍＡｂ Ｌ２Ｃ７は、部分的な中和活性のみしか与えなかった（データは示さず）。

上記アッセイにおいて決定された、上記３つの抗ＨＧＦ抗体の種々の特徴を、表１にまとめる。

ＨＧＦは、線維芽増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むヘパリン結合増殖因子ファミリーのメンバーである。同様に、ＨＧＦは、プラスミノーゲンと約４０％の配列全体の類似性を有し（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ．３４２：４４０，１９８９）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＦ）と類似のドメイン構造を共有する（Ｗａｎｇら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５６：５４５，２００２）。従って、上記抗ＨＧＦ抗体の結合特異性が、決定されなければならない。これらのＨＧＦ関連タンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）への抗ＨＧＦ ｍＡｂの結合を、上に記載されたＨＧＦに対するＥＬＩＳＡに類似する、直接的結合ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７、ｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびｍＡｂ Ｌ１Ｈ４は、これらのタンパク質と有意には結合せず、このことは、ＨＧＦに対するそれらの特異性を実証している。

（３．腫瘍が促進するＨＧＦの生物学的活性を阻害する、抗ＨＧＦ ｍＡｂの能力）
ＨＧＦは、ＨＧＦが特定のヒト腫瘍の増殖および侵襲性において役割を演じていることを、有望にさせる多数の生物学的活性を有する。ＨＧＦのそのような活性のうちの１つは、肝細胞および他の上皮細胞に対する強力なマイトジェンである（Ｒｕｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８８：４１５，１９９１）。従って、その抗ＨＧＦ ｍＡｂの中和活性をさらに証明するために、４ＭＢｒ−５サル上皮細胞（ＡＴＣＣ）またはラット肝細胞のＨＧＦ誘導性増殖についての、そのｍＡｂの効果を決定する。ＧａｒｒｉｓｏｎおよびＨａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：４２６４，１９８５に記載される方法に従って、肝細胞を単離する。細胞を、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中に５×１０^４細胞／ｍｌで再懸濁し、種々の濃度のｍＡｂと一緒に予め決定された濃度のＨＧＦで刺激する。５％ＣＯ_２中における３７℃での２．５日間のインキュベート後、細胞増殖のレベルを、^３Ｈ−チミジンを４時間添加することによって決定した。細胞を、自動細胞回収器を使用して回収し、取り込まれた^３Ｈ−チミジンのレベルを、シンチレーションカウンターで決定する。十分な濃度において、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、その細胞のＨＧＦ誘導性増殖をほとんどまたは完全に阻害し得、ｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびＬ１４Ｈは、少なくとも部分的には増殖を阻害し得る。これらの抗体は、他の上皮細胞株のＨＧＦ誘導性増殖もまた阻害し得る。

例えば、ミンク肺Ｍｖ １ Ｌｕ細胞のＨＧＦ誘導性増殖についての上記Ｌ２Ｇ７の阻害活性が、決定された（Ｂｏｒｓｅｔら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８９：５９，１９９６）。１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭにおいて増殖した細胞を、ＥＤＴＡ／トリプシン（ｔｒｙｓｉｎ）での処理によって回収する。洗浄後、その細胞を、予め決定された濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）のＨＧＦを含み、種々の濃度のｍＡｂを含むかまたは含まず、血清を含まないＤＭＥＭ中に、５×１０^４細胞／ｍｌで再懸濁する。５％ＣＯ_２中における３７℃での１日間のインキュベート後、細胞増殖のレベルを、さらに２４時間１μＣｉの^３Ｈ−チミジンの添加によって決定する。細胞を、自動細胞回収器を使用してガラス繊維フィルター上に回収し、取り込まれた^３Ｈ−チミジンのレベルを、シンチレーションカウンターにおいて決定する。図９は、１００倍高いモル濃度のＬ２Ｇ７ ｍＡｂの添加が、Ｍｖ １ Ｌｕ細胞の増殖応答を完全に阻害することを示す。３倍高いｍＡｂ対ＨＧＦモル比のＬ２Ｇ７でさえ完全な阻害を示した一方で、コントロールのＩｇＧは、１００倍モル濃度過剰でさえ阻害を示さない。

ＨＧＦはまた、強力な新脈管形成因子であることも報告されており（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１９：６２９，１９９２；Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎら，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７９：１，２０００）、そして新脈管形成（新しい血管の形成）は、腫瘍の増殖には必須であると考えられている。従って、上記抗ＨＧＦ ｍＡｂの、ＨＧＦの脈管形成特性を阻害する能力は、３つのアッセイ：（ｉ）ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖、（ｉｉ）ＨＵＶＥＣの管形成、および（ｉｉｉ）鶏胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）上での新しい血管の発生、において示される。ＨＧＦは、新脈管形成においてＶＥＧＦと相乗作用することが示されている（Ｘｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１１１１，２００１）ので、これらのアッセイは、ＶＥＧＦの存在下および非存在下の両方において実施され得る。

上記ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを、改変を加えて記載された通り（Ｃｏｎｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１３２３，１９９０）に、実施する。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓから得たＨＵＶＥＣ細胞を、１０％ＦＣＳ＋Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓより提供される内皮細胞増殖補助剤を含有するＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＢＭ−２）において増殖させる。好ましくは、４継代〜７継代の細胞を、この研究において使用する。その細胞を、抗生物質、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０％ ＦＣＳ（アッセイ培地）を含有する、培地−１９９中に、１０^５細胞／ｍｌとなるように再懸濁する。ＨＵＶＥＣ細胞（５０μｌ／ウェル）を、３７℃で１時間、種々の濃度の抗ＨＧＦ ｍＡｂと一緒に、適した濃度のＨＧＦを含有するマイクロタイターウェルに添加する。５％ＣＯ_２中において３７℃で７２時間細胞をインキュベートした後、細胞増殖のレベルを、４時間での^３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定する。十分な濃度において、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、上記ＨＵＶＥＣのＨＧＦ誘導性増殖をほとんどまたは完全に阻害し、そしてｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびＬ１Ｈ４は、増殖を少なくとも部分的に阻害し得る。

あるいは、細胞増殖のレベルは、周知の比色定量ＭＴＴアッセイによって決定され得る。上記ＨＵＶＥＣ（１０^４細胞／１００μｌ／ウェル）を、２４時間血清を含まない培地中で増殖させ、次いで、種々の濃度のｍＡｂ Ｌ２Ｇ７を含む、（最適以下の量であると予め決定された）５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの１００μｌと一緒に７２時間インキュベートする。ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を、各ウェル（２０μｌ／培地２００μｌ）に４時間添加する。次いで、１ウェル当たり１００μｌの培地を回収し、１００μｌ／ウェルの酸性化されたイソプロピルアルコール（イソプロピル中０．０４Ｎ ＨＣｌ）と混合する。そのプレートを、５６０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーにおいて読み取る。最大応答％を、以下のように算出する：［ＨＧＦ＋ｍＡｂで処理された細胞のＯＤ−未処理細胞のＯＤ］／［ＨＧＦ処理された細胞のＯＤ−未処理細胞のＯＤ］×１００。図１０は、２倍モル濃度過剰のＬ２Ｇ７ ｍＡｂでさえ、ＨＧＦに応答してのＨＵＶＥＣの増殖をほとんど遮断することを示す。

上記内皮管アッセイを、基本的には記載された（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３４０８，２００１；Ｘｉｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：１１１１，２００１）通りに実施する。４継代〜７継代のＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を、１０％ＦＢＳおよび内皮細胞増殖補助剤を補充したＣｌｏｎｅｔｉｃｓ ＥＧＭ培地中で増殖させる。プレートを、製造者の指示書に従って、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃で３０分間コーティングし、その細胞を、ＨＧＦおよび種々の濃度の抗ＨＧＦ ｍＡｂを含む１×基本培地中に、３×１０^６細胞／ｍｌで播種する。管形成を、低倍率（１０×）で顕微鏡下で評価する。十分な濃度において、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、ＨＧＦ誘導性の内皮管形成をほとんどまたは完全に阻害し、そしてｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびＬ１Ｈ４は、少なくとも部分的にＨＧＦ誘導性の内皮管形成を阻害し得る。

上記鶏胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）を、基本的に記載された（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１，１９９２）通りに実施する。３日齢の鶏胚を、その殻から取り出し、３７℃において５％ＣＯ_２中でペトリ皿で増殖させる。７日後、種々の濃度の抗ＨＧＦ ｍＡｂを含むＨＧＦ含有乾燥メチルセルロースディスク（ｄｉｓｃ）を、そのＣＡＭ上に積み重ねる。このメチルセルロースディスクは、ＰＢＳ中１．５％メチルセルロース５μｌと、ｍＡｂとプレインキュベートした５μｌのＨＧＦとを混合することによって調製する。３日後、メチルセルロースディスクの周りの血管の発生を試験する。十分な濃度において、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、そのような血管形成をほとんどまたは完全に阻害し、そしてｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびＬ１Ｈ４は、少なくとも部分的に血管形成を阻害し得る。

ＨＧＦはまた、腫瘍の増殖を促進することが報告されている（ＣｏｍｏｇｌｉｏおよびＴｒｕｓｏｌｉｎｏ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：８５７，２００２）。抗ＨＧＦ抗体のこの活性を阻害する能力は、２つの工程において示される。第１に、多数の腫瘍細胞株を、ＨＧＦを分泌し、そしてＨＧＦに応答して増殖させるその能力について試験する。なぜなら、ＨＧＦは、いくつかのこれらの細胞に対するオートクリン増殖因子であり得るからである。これらの細胞株としては、ＨＧＦおよびｃＭｅｔを発現することが知られているヒト腫瘍細胞株のパネルが挙げられる（Ｋｏｏｃｈｅｋｐｏｕｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５３９１，１９９７；Ｗａｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５３：１０２３，２００１）。試験される具体的な細胞株としては、Ｕ−１１８神経膠腫、ＨＣＴ１１６結腸癌腫、Ａ５４９肺癌腫およびＡ４３１類表皮癌腫細胞（全てＡＴＣＣから入手可能）が挙げられる。一旦そのような腫瘍細胞株が同定されたら、これらの細胞のＨＧＦに対する増殖応答についての抗ＨＧＦ ｍＡｂの効果を、上に記載された方法と類似の方法を使用して、決定する。十分な濃度において、ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７は、これらの多くまたは全ての細胞株のＨＧＦ誘導性増殖をほとんどまたは完全に阻害し、ｍＡｂ Ｌ２Ｃ７およびＬ１Ｈ４は、少なくとも部分的に増殖を阻害し得る。

例えば、ヒトＨＣＴ１１６腫瘍細胞を、２００μｌのＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ中に、５×１０^３細胞／ウェルにて９６ウェルマイクロタイタープレートに播種する。３７℃での５％ＣＯ_２中２４時間のインキュベート後、細胞をＰＢＳで洗浄し、血清を含まないＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートする。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ中の１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ＋／−２０μｇ／ｍｌのｍＡｂと一緒に、さらに２０時間インキュベートする。コントロールとして、ＤＭＥＭのみまたはＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳにおいて増殖した細胞を含める。そのインキュベートの最後に、細胞増殖のレベルを、４時間の^３Ｈ−チミジンの取り込みにより決定する。３連で実施したそのような実験の結果を、図１１に示す。ＨＧＦは、上記ＨＣＴ１１６細胞の中程度の増殖を誘導し、これはＬ２Ｇ７抗体の添加により完全に排除された（しかし、より強力でないＬ１Ｈ４抗体では排除されなかった）。

上に記載された全てのアッセイにおいて、各抗ＨＧＦ抗体は、ＨＧＦの他のアンタゴニストなしで単独で使用された場合（すなわち、単一の因子として）、活性を中和または阻害するが、その抗体を他の抗ＨＧＦ抗体または他の活性因子と組み合わせて投与することによって、相加的または相乗的な効果が達成され得る。

（４．インビボで腫瘍の増殖を阻害する、抗ＨＧＦ ｍＡｂの能力）
抗ＨＧＦ抗体の、ヒト腫瘍増殖を阻害する能力を、免疫不全マウスまたは他のげっ歯類（例えば、ラット）における異種移植片モデルにおいて実証する。使用され得るマウスの免疫欠損株の、例示的であるが限定しない例は、ＣＤ−１ヌード、Ｎｕ／Ｎｕ、Ｂａｌｂ／ｃヌード、ＮＩＨ−ＩＩＩ（ＮＩＨ−ｂｇ−ｎｕ−ｘｉｄ ＢＲ）；ｓｃｉｄマウス（例えば、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ＳＣＩＤ（Ｃ．Ｂ−１７ ＳＣＩＤ）、Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ ｏｕｔｂｒｅｄ ＳＣＩＤおよびＳＣＩＤ Ｂｅｉｇｅのようなヌードマウス）；ＲＡＧ酵素不全マウス；ならびにヌードラットである。実験は、以前に記載された（Ｋｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１，１９９２，これは、本明細書中に参考として援用される）通りに実施する。完全ＤＭＥＭ培地中で増殖したヒト腫瘍細胞を、ＨＢＳＳ中に回収する。雌性免疫不全（例えば、胸腺欠損）ヌードマウス（４〜６週齢）に、背部領域に、０．２ｍｌのＨＢＳＳ中の代表的には５×１０^６細胞を、皮下注射する。腫瘍サイズが５０ｍｍ^３〜１００ｍｍ^３に達したときに、そのマウスを、無作為にグループ分けし、適切な量の抗ＨＧＦ ｍＡｂおよびコントロールｍＡｂ（代表的には、０．１ｍｇと１．０ｍｇとの間、例えば、０．５ｍｇ）を、１週間当たり１回、２回または３回、例えば０．１ｍｌの容量で、例えば１週間、２週間、３週間もしくは４週間、またはその実験の間、腹腔内に投与する。腫瘍サイズを、代表的には１週間に２回、２次元［長さ（ａ）および幅（ｂ）］で測定することにより、決定する。腫瘍容量を、Ｖ＝ａｂ^２／２に従って算出し、平均腫瘍容量±ＳＥＭとして表現する。各処置グループにおけるマウスの数は、少なくとも３匹、より頻繁には５匹と１０匹との間（例えば、７匹）である。統計的な分析を、例えばスチューデントｔ検定を使用して実施し得る。この実験のバリエーションにおいて、上記抗体の投与は、腫瘍細胞の注射と同時にか、または腫瘍細胞の注射の直ぐ後に開始する。その抗体の効果はまた、マウスの生存の延長または生存するマウスのパーセントの増加によっても、測定され得る。

ＨＧＦを分泌するかまたはＨＧＦに応答することが知られている種々の腫瘍細胞株（例えば、Ｕ１１８ヒトグリア芽細胞腫細胞、および／またはＨＣＴ１１６ヒト結腸腫瘍細胞）を、別個の実験において使用する。本発明の好ましい抗体（例えば、ヒト様抗体、低下した免疫原性の抗体、上記Ｌ２Ｇ７抗体ならびにそのキメラおよびヒト化形態、ならびにＬ２Ｇ７と同一のエピトープを有する抗体）は、単一の因子として使用された場合に、ある期間の後に、少なくとも２５％、おそらく４０％もしくは５０％、そして７５％もしくは９０％もしくはそれより多くほども、または完全にさえ、腫瘍増殖を阻害するか、あるいは、腫瘍の退行若しくは消失を引き起こす。注射した抗体に対して中和抗体応答を起こさない１種以上の免疫不全マウス株において試験した場合に、この阻害は、ＮＩＨ ＩＩＩ Ｂｅｉｇｅ／Ｎｕｄｅのような少なくとも１つのマウス株のＵ１１８のような少なくとも１つの腫瘍細胞株に対して起こるが、好ましくは、特定の型（例えば、神経膠腫）または任意の型の２つ、３つ、複数、多くまたは本質的に全てのＨＧＦ発現腫瘍細胞株に対して起こる。１つ以上の異種移植片モデルにおけるいくつかの好ましい抗体での処置は、５０％、７５％、９０％または本質的に全てのマウス（このマウスは、処置なしでは、その腫瘍の増殖のために死ぬかまたは屠殺される必要がある）の、無期限の生存を導く。

例えば、そのような実験を、ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で増殖し、ＨＢＳＳ中に回収されたＵ−１１８グリア芽細胞腫細胞を用いて実施した。雌性のＮＩＨ ＩＩＩ Ｂｅｉｇｅ／Ｎｕｄｅマウス（４〜６週齢）に、背部領域に、０．２ｍｌのＨＢＳＳ中１０^６細胞を皮下注射した。腫瘍サイズが約５０ｍｍ^３に達したときに、そのマウスを、各６匹のマウスの２グループに無作為にグループ分けし、２００μｇのＬ２Ｇ７ ｍＡｂ（処置グループ）または２００μｇのＰＢＳ（コントロールグループ）を、０．１ｍｌの容量で１週間に２回腹腔内に与えた。腫瘍サイズを、上に記載されたように、１週間に２回決定する。実験の終了時に、その腫瘍を切除および秤量する。図１２は、Ｌ２Ｇ７での処置が、腫瘍の増殖を完全に阻害したことを示す。

類似の腫瘍阻害実験を、Ａｓｈｋｅｎｉｚｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１５５，１９９９に記載されたように、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）またはＣＰＴ−１１（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）のような１種以上の化学療法剤（これらに対して、その腫瘍の型は応答性であると予想される）と組み合わせて抗ＨＧＦ抗体を投与して実施する。その抗体と化学療法薬との組み合わせは、どちらかの因子単独よりも、腫瘍増殖のより大きい阻害をもたらし得る。その効果は、相加的または相乗的であり得、増殖を強力（例えば、８０％または９０％またはそれより大きい）に阻害し得、または腫瘍の退行または消失さえ引き起こし得る。上記抗ＨＧＦ抗体はまた、別の増殖因子または血管形成因子（例えば、抗ＶＥＧＦ）に対する抗体と組み合わせて投与され得、そして相加的または相乗的な増殖阻害および／または腫瘍の退行もしくは消失が予想される。

本発明は、現在の好ましい実施形態を参照して説明されてきたが、種々の改変が、本発明から逸脱せずになされ得ることが、理解されるべきである。文脈からそうでないことが明白でない限り、本発明の任意の工程、要素、実施形態、特徴または局面は、任意の他のものと一緒に使用され得る。

引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願の各々が具体的かつ個別に、全ての目的のためにその全体が参考として援用されると示されたのと同程度に、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書中に援用される。

ＨＧＦおよびｃＭｅｔの概略モデル。 ＮＫ４がヌードマウスにおいてマウス肺癌ＬＬＣの一次成長を部分的に阻害することを示すグラフ（Ｋｕｂａら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：６７３７，２０００から）。ＮＫ４は、ヌードマウスにおける腫瘍移植皮下注射後４日目から１４日間継続的に注入された。 ３つの抗ＨＧＦ ｍＡｂのカクテルが、ヌードマウスにおいてヒト脳腫瘍Ｕ−１１８細胞の増殖を阻害するのに必要とされることを示すグラフ（Ｃａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：７４４３，２００１から）。Ｕ−１１８腫瘍細胞は、ヌードマウスに皮下注射で注射された。１日目から、抗ＨＧＦ ｍＡｂ Ａ−１、Ａ−５およびＡ−７またはｍＡｂ ７−２および７−３が、１回の注射当たり２００μｇで、１０週間に２回投与された。 競合結合ＥＬＩＳＡを使用するｍＡｂ Ｌ１Ｈ４、Ｌ２Ｃ７、Ｌ２Ｇ７の相対的結合エピトープの測定。プレートは、組み換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）でコーティングされ、スキムミルクでブロッキングされ、非標識ｍＡｂの１００×過剰量の存在下で最適以下の濃度のビオチン化ｍＡｂと一緒にインキュベートされた。ビオチン化ｍＡｂ結合は、ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎの添加によって検出された。 直接的ＨＧＦ結合ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合の、ｒＨＧＦへの抗ＨＧＦ ｍＡｂの結合。プレートは、ｒＨＧＦを含むＨＩ−Ｆ１１上清でコーティングされ、２％スキムミルクでブロッキングされ、ｍＡｂと一緒にインキュベートされた後にＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを添加した（上記実施例に記載される通り）。 抗ＨＧＦ ｍＡｂの、溶液中でｒＨＧＦ−Ｆｌａｇを捕捉する能力。抗ＨＧＦ ｍＡｂは、ヤギ抗マウスＩｇＧでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で捕捉された。次いでプレートは、２％スキムミルクでブロッキングされ、ｒＨＧＦ−Ｆｌａｇと一緒に、その後ＨＲＰ−Ｍ２抗Ｆｌａｇ ｍＡｂと一緒にインキュベートされた（上記実施例に記載される通り）。 捕捉ＥＬＩＳＡにおける、抗ＨＧＦ ｍＡｂによるｃＭｅｔ−ＦｃへのｒＨＧＦ−Ｆｌａｇ結合の阻害。ヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングされたプレート上で捕捉されたｃＭｅｔ−Ｆｃは、ｍＡｂと一緒に／ｍＡｂなしで、プレインキュベートされたＨＧＦ−Ｆｌａｇと一緒にインキュベートされる。その結合ｒＨＧＦ−Ｆｌａｇを、ＨＲＰ−Ｍ２抗Ｆｌａｇ ｍＡｂの添加によって検出した（上記実施例に記載される通り）。 抗ＨＧＦ ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７による、ＨＧＦ誘導性ＭＤＣＫ分散の中和。（Ａ）何の処理もしないコントロール。（Ｂ）ｒＨＧＦ＋ＩｇＧ。（Ｃ）ｒＨＧＦ＋ｍＡｂ Ｌ２Ｇ７。ＭＤＣＫ細胞は、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂの存在下で、１：２０希釈のＨ１−Ｆ１１培養上清（約３μｇ／ｍｌのＨＧＦ）と一緒にインキュベートされた。写真は、１００倍の倍率で撮影された。 Ｌ２Ｇ７ ｍＡｂによる、Ｍｖ １ ＬＵ細胞のＨＧＦ誘導性増殖の阻害。ＨＧＦに対するｍＡｂの過剰モル濃度倍数が、横軸上に示され、取り込まれたｃｐｍ×１０^−２が縦軸上に示される。データ点は、３連で得られた。 Ｌ２Ｇ７ ｍＡｂおよびコントロールのマウス抗体（ｍＩｇＧ）による、ＨＵＶＥＣのＨＧＦ誘導性増殖の阻害。データ点は、３連で得られた。 Ｌ２Ｇ７抗体およびＬ１Ｈ４抗体による、ＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞のＨＧＦ誘導性増殖の効果。データ点は、３連で得られた。 ＮＩＨ ＩＩＩ Ｂｅｉｇｅ／ヌードマウス（ｎ＝６）の群における、Ｕ−１１８腫瘍の増殖についての、Ｌ２Ｇ７ ｍＡｂまたはＰＢＳ（コントロール）での処置の効果。矢印は、注射を開始した時期を示す。（Ａ）腫瘍移植からの日数に対する腫瘍サイズ。（Ｂ）実験終了時における腫瘍質量。

Claims (13)

1. ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）への結合について、ハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２によって産生される抗体Ｌ２Ｇ７と競合し、ＨＧＦを中和し、そして単一の因子として使用された場合に、マウスにおいてヒト腫瘍移植片の増殖を阻害する、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）。
2. キメラである、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ヒト化されている、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
4. ＨＧＦのｃＭｅｔへの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
5. ＨＧＦ誘導性新脈管形成を阻害する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
6. ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ’）_２フラグメントまたは単鎖抗体である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
7. 少なくとも１０^８Ｍ^−１の結合親和性でＨＧＦに特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
8. キメラＬ２Ｇ７モノクローナル抗体またはヒト化Ｌ２Ｇ７モノクローナル抗体であって、Ｌ２Ｇ７はハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２によって産生されるマウス抗体である、抗体。
9. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生する、細胞株。
10. 生理学的に受容可能なキャリア中に、１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度でモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む薬学的組成物であって、該ｍＡｂは、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）への結合について、ハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２によって産生される抗体Ｌ２Ｇ７と競合し、ＨＧＦを中和し、そして単一の因子として使用された場合に、マウスにおいてヒト腫瘍移植片の増殖を阻害するものである、薬学的組成物。
11. ０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で、患者において癌を処置するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）への結合について、ハイブリドーマＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−５１６２によって産生される抗体Ｌ２Ｇ７と競合し、ＨＧＦを中和し、そして単一の因子として使用された場合に、マウスにおいてヒト腫瘍移植片の増殖を阻害するモノクローナル抗体を含む、薬学的組成物。
12. 前記癌はグリア芽細胞腫である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
13. 前記モノクローナル抗体が、キメラＬ２Ｇ７モノクローナル抗体またはヒト化Ｌ２Ｇ７モノクローナル抗体である、請求項１１に記載の薬学的組成物。

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