JP4547272B2

JP4547272B2 - イムノクロマトグラフィー用試験具

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Publication number: JP4547272B2
Application number: JP2005005383A
Authority: JP
Inventors: 昌子安岐; 慎也永井; 紀幸斉藤; 毅一口
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2005-01-12
Filing date: 2005-01-12
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2025-01-12
Also published as: US7427511B2; US20060154241A1; CN1808118A; JP2006194687A; EP1826566B1; CN100523814C; EP1826566A1; ATE426811T1; DE602006005896D1

Description

本発明は、イムノクロマトグラフィー用試験具に関する。

血液、血清、咽頭拭い液などの体液を検体として用いて、簡易に各種疾患の検査を行う方法してイムノクロマトグラフィーを用いる方法がある。

まず、図６を用いて、従来のイムノクロマトグラフィー用試験具について説明する。（例えば、特許文献１参照。）。

従来のイムノクロマトグラフィー用試験具は、粘着シート５１上に、試料添加用部材５３と、含浸部材５５と、クロマト用膜担体５７と、吸収用部材５９を備える。含浸部材５５には、ラテックス粒子で標識された抗体が含浸されており、この抗体は、測定対象の抗原と結合して複合体を形成する。クロマト用膜担体５７は、ライン状の捕捉部位５７Ａを備え、この部位には、測定対象の抗原と結合する抗体が担持されている。

ここで、イムノクロマトグラフィーの原理を簡単に説明する。まず、体液などの検体を展開溶媒に希釈して調製した試料を試料添加用部材５３に滴下すると、この試料は、毛管現象により、含浸部材５５に移動する。含浸部材５５では、ラテックス粒子で標識された抗体が展開溶媒に溶出する。試料中に測定対象となる抗原が含まれる場合は、抗原抗体反応により、この抗原と上記抗体とが結合して複合体が形成される。次に、試料は、毛管現象により、クロマト用膜担体５７の捕捉部位５７Ａに移動する。捕捉部位５７Ａでは、抗原抗体反応により、上記抗原が、捕捉部位５７Ａに担持されている抗体に捕捉される。上記抗原は、ラテックス粒子で標識された抗体と複合体を形成しているので、捕捉部位５７Ａには、ラテックス粒子の色がライン状に現れる。この有色のラインを目視することにより、検体中の測定対象の存在の有無を確認する。

検体中の測定対象は通常はインフルエンザ、ＨＢｓ抗原など微量な物質の検出に用いられるため高感度化が求められている。また、これらイムノクロマトグラフィーを用いた検査はベッドサイドでの検査や被験者を待合室などで待機させている間に行われるので、迅速に検査結果を得る必要がある。
特開２００３−３４４４０６号公報

しかし、従来の試験具では、標識保持部材から標識物質の溶出が遅く、判定結果が得られるのに時間がかかるといった問題点があった。

本発明は係る事情に鑑みてなされたものであり、迅速に判定結果が得られるイムノクロマトグラフィー用試験具を提供するものである。

本発明の実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験具は、試料添加用部材と、試料中の測定対象と抗原抗体反応する標識物質を保持する標識保持部材と、標識保持部材から試料の展開方向に間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗体反応する固定化用物質が固定された判定部を有するクロマト用膜担体と、を備え、試料添加用部材が標識保持部材を覆ってクロマト用膜担体と接触するように配置されていることを特徴とする。

本発明の発明者らは、標識保持部材から試料の展開方向に間隔を介して配置されたクロマト用膜担体を備え、試料添加用部材が標識保持部材を覆ってクロマト用膜担体と接触するように配置されることにより、標識保持部材からの標識物質の溶出速度が高まり、その結果、高感度でかつ迅速に判定結果が得られるイムノクロマトグラフィー用試験具を提供できることを見出した。

本発明によれば、標識保持部材からの標識物質の溶出速度が高まるので、イムノクロマトグラフィーの判定結果を迅速に得ることができる。

以下、本発明の実施形態を図面を用いて説明する。図面は、説明の便宜のために用いられるものであり、本発明の範囲は、図面に示す実施形態に限定されない。
１．第１の実施形態
図１は、本発明の第１の実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。このイムノクロマトグラフィー用試験具は、表面に粘着層を有するプラスチック板からなる基材１上に、レーヨンの不織布からなる試料添加用部材３と、グラスファイバーの不織布からなる標識保持部材５と、レーヨンの不織布からなる展開用部材７と、ニトロセルロースの多孔体からなるクロマト用膜担体９と、セルロースの不織布からなる吸収部材１１とを備える。標識保持部材５は、試料添加用部材３に接触して配置され、試料中の測定対象と抗原抗体反応する標識物質を保持する。クロマト用膜担体９は、標識保持部材と間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗体反応する固定化用物質が固定された判定部を有する。展開用部材７は、標識保持部材５およびクロマト用膜担体９と接触するように配置されている。吸収部材１１は、クロマト用膜担体９と接触するように配置されている。

クロマト用膜担体９には、上流側から順に、ライン状の第１判定部９Ａ、第２判定部９Ｂ及び対照部９Ｃが形成され、標識保持部材５には、第１標識物質、第２標識物質及び対照用標識物質が保持されている。第１判定部９Ａ、第２判定部９Ｂ及び対照部９Ｃには、固定化用物質として、それぞれ、抗インフルエンザＡ抗体、抗インフルエンザＢ抗体（以下、それぞれ「抗ＦｌｕＡ抗体」、「抗ＦｌｕＢ抗体」とする。）、ビオチンが固定されている。第１標識物質及び第２標識物質は、それぞれ、青色ラテックス粒子で標識された抗ＦｌｕＡ抗体及び抗ＦｌｕＢ抗体であり、対照用標識物質は、赤色ラテックス粒子で標識されたアビジンである。抗ＦｌｕＡ抗体及び抗ＦｌｕＢ抗体は、それぞれ、第１測定対象であるインフルエンザＡ型ウィルス及び第２測定対象であるインフルエンザＢ型ウィルス（以下、それぞれ「ＦｌｕＡウイルス」、「ＦｌｕＢウイルス」とする。）と抗原抗体反応により結合する。

抗ＦｌｕＡ抗体を例にとると、試料中にＦｌｕＡウイルスが含まれていると、標識保持部材５にある標識された抗ＦｌｕＡ抗体は、ＦｌｕＡウイルスの所定部位を認識して、抗原抗体反応により結合して複合体を形成する。次に、クロマト用膜担体９にある抗ＦｌｕＡ抗体は、ＦｌｕＡウイルスの別の部位を認識して複合体を捕捉する。複合体が捕捉されると、第１判定部９Ａには青色のラインが現れ、ＦｌｕＡウイルスの存在が目視により確認される。

また、アビジンは、クロマト用膜担体９にある抗ＦｌｕＡ抗体、抗ＦｌｕＢ抗体には捕捉されないが、ビオチンと特異的に結合するので、対照部９Ｃに固定されたビオチンに捕捉される。アビジンが捕捉されると、対照部９Ｃには赤色のラインが現れ、アビジンが対照部９Ｃに到達したことが目視される。対照部９Ｃは、第１判定部９Ａ及び第２判定部９Ｂの下流に設けられるので、赤色のラインを確認することにより、試料が第１判定部９Ａ及び第２判定部９Ｂを通過したことが確認される。

本発明の試験具を用いるとイムノクロマトグラフィーの判定結果を迅速に得ることができる。その原理を以下、説明する。

患者の鼻腔吸引液などの検体を展開溶媒に希釈して調製した試料を試料添加用部材３に滴下すると、この試料は、毛管現象により、標識保持部材５、展開用部材７、クロマト用膜担体９、吸収部材１１を順次移動する。試料が、標識保持部材５を通過する際に、標識保持部材５に保持されている標識物質が展開溶媒に溶出する。本発明は、標識保持部材５とクロマト用膜担体９の間に、展開用部材７を設けることによって、この溶出の速度を速めるものである。

ここで、図２を用いて、展開用部材７がある場合（図２（ａ））とない場合（図２（ｂ））の試料展開速度を比較する。図２（ａ）、（ｂ）は、それぞれ本発明の試験具、従来の試験具に対応する。図２（ａ）、（ｂ）において、試料添加用部材３、標識保持部材５、展開用部材７は、レーヨンやグラスファイバーの不織布からなるので、これらの部材では、試料が素早く吸収され、試料の展開速度が速い。一方、クロマト用膜担体９は、ニトロセルロースの多孔体からなるので、クロマト用膜担体９では、試料の吸収が遅く、試料の展開速度が遅い。図２（ａ）、（ｂ）の矢印の太さは、各部材での試料の展開速度を模式的に示している。

まず、図２（ｂ）を参照すると、試料添加用部材３に滴下された試料は、試料添加用部材３及び標識保持部材５内で素早く展開するが、クロマト用膜担体９に到達した時点で展開速度が遅くなる。クロマト用膜担体９での試料の展開速度が遅いので、試料が標識保持部材５内で停滞する。

次に、図２（ａ）を参照すると、試料添加用部材３に滴下された試料は、試料添加用部材３及び標識保持部材５内で素早く展開し、さらに、展開用部材７内で素早く展開する。このため、標識保持部材５内で試料が停滞しない（すなわち、標識保持部材５内で試料が素早く移動する）。標識保持部材５内で試料が素早く移動するので、標識保持部材５に保持されている標識物質が展開溶媒に素早く溶出する（この状況は、少なくとも、展開用部材７が十分に試料で満たされるまで続く。）。標識物質の溶出が速いので、判定部にラインが現れるのが早くなる。従って、本実施形態の試験具を用いるとイムノクロマトグラフィーの判定結果を迅速に得ることができる。

ここまで、特定の実施形態を例にとって説明してきたが、本発明は、この実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。

検出物質は抗原抗体反応を生じる物質であれば特に限定されず、細菌、原生生物や真菌などの細胞、ウイルス、タンパク質、多糖類などが挙げられる。例えば、前記インフルエンザウイルスのほか、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マイコプラズマニューモニエ、ロタウイルス、カルシウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、重症急性呼吸器症候群の病原ウイルス、大腸菌、スタフィロコッカスアウレウス、ストレプトコッカスニューモニエ、ストレプトコッカスピヨゲネス、マラリア原虫、その他、消化器系疾患、中枢神経系疾患、出血熱等の様々な疾患の病原体、これらの代謝産物、癌胎児性抗原やシフラなどの腫瘍マーカー、ホルモンなどが例示される。

基材１は、試料添加用部材３や標識保持部材５などの上記部材を適切に配置するためのものであり、プラスチック以外にも紙やガラスなど種々の材質のものを用いることができる。試料添加用部材３は、レーヨン以外にも、グラスファイバー又はセルロースファイバーなどの種々の素材で形成することができる。標識保持部材５は、グラスファイバー以外にも、セルロースファイバーなどの種々の素材で形成することができる。展開用部材７は、レーヨン以外にも、グラスファイバー又はセルロースファイバーなどの種々の素材で形成することができる。クロマト用膜担体９は、ニトロセルロース以外にも、ナイロン（例えば、カルボキシル基やアルキル基を置換基として有してもよいアミノ基が導入された修飾ナイロン）、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテートなどの種々の素材で形成することができる。吸収部材１１は、セルロース以外にも、グラスファイバーなどの種々の素材で形成することができる。試料添加用部材３、標識保持部材５、展開用部材７、クロマト用膜担体９及び吸収部材１１には、不織布又は多孔体以外にも、毛管現象により試料を展開可能な種々の構造のものを用いることができる。

クロマト用膜担体９は、判定部を１つだけ備えてもよく、２つ以上備えてもよい。また、クロマト用膜担体９は、対照部を備えなくてもよい。また、判定部・対照部は、ライン状でなくてもよく、例えば島状に形成してもよい。標識保持部材５は、標識物質を１種だけ保持してもよく、２種以上保持してもよい。また、標識保持部材５は、対照用標識物質を保持しなくてもよい。標識物質は、青や赤以外のラテックス粒子や、金などの金属コロイド、色素分子などで標識されてもよい。また、標識物質は、蛍光粒子、磁気粒子などで標識されてもよい。この場合、対象物質の有無は目視確認できないとしても、蛍光・磁力などを測定することにより、対象物質の有無を確認することができる。標識物質が２種以上ある場合、各標識物質は、互いに異なる色に標識されても、同じ色に標識されてもよい。さらに標識物質及び対照用標識物質は、互いに異なる色に標識されても、同じ色に標識されてもよい。

固定化用物質及び標識物質には、種々の抗体又は抗原を用いることができる。すなわち、測定対象が抗原である場合、固定化用物質及び標識物質は、この抗原と抗原抗体反応する抗体を用い、測定対象が抗体である場合、固定化用物質及び標識物質は、この抗体と抗原抗体反応する抗原を用いる。

対照部の固定化用物質がアビジンであり、対照用標識物質がビオチンであってもよい。さらに、対照部の固定化用物質と対照用標識物質は、ビオチンとアビジンの組み合わせ以外であってもよい。例えば、抗原抗体反応により結合する組み合わせであってもよい。例えば、対照用標識物質に抗原を用い、対照部の固定化用物質にこの抗原と抗原抗体反応する抗体を用いる。この逆であってもよい。対照用標識物質には、測定対象や判定部の固定化用物質と抗原抗体反応しないものを用いる。

２．第２の実施形態
図３は、本発明の第２の実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。この試験具は、第１の実施形態と比べて、展開用部材７を有しない点と、試料添加用部材３が標識保持部材５を覆ってクロマト用膜担体９と接触するように配置されている点が異なっている。これ以外の点は、第１の実施形態と共通している。

第２の実施形態では、試料添加用部材３の上流部３ａが、第１の実施形態の試料添加用部材３の役割を担い、下流部３ｃが、第１の実施形態の展開用部材７の役割を担う。すなわち、第１の実施形態と同様の試料を試料添加用部材３の上流部３ａに滴下すると、この試料は、毛管現象により、標識保持部材５、試料添加用部材３の下流部３ｂ、クロマト用膜担体９、吸収部材１１を順次移動する。試料添加用部材３の下流部３ｂが展開用部材７と同様の機能を発揮するので、標識保持部材５内で試料が素早く移動し、標識保持部材５に保持されている標識物質が展開溶媒に素早く溶出する。標識物質の溶出が速いので、判定部にラインが現れるのが早くなる。従って、本実施形態の試験具を用いるとイムノクロマトグラフィーの判定結果を迅速に得ることができる。

以下、本発明の実施例１について説明する。

１．イムノクロマトグラフィー用試験具（アッセイストリップ）の調製
以下の方法に従って、クロマト用のクロマト用膜担体、標識保持部材を調製し、さらにこれらを用いて、イムノクロマトグラフィー用試験具を調製した。

１−１．クロマト用膜担体の調製
図４（クロマト用膜担体の平面図）に示すように、ニトロセルロースメンブレンからなるクロマト用膜担体９の第１判定部９Ａ、第２判定部９Ｂ及び対照部９Ｃに、抗体塗布機（ＢｉｏＤｏｔ社）を用いて、それぞれ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で２．０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように希釈した抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体、及びビオチンＢＳＡを塗布し、５０℃で３０分間乾燥させた。

乾燥後のクロマト用膜担体９をブロッキング液（ＢＳＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、洗浄液（ＳＤＳを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄し、４０℃、１２０分間乾燥させ、クロマト用膜担体９を調製した。

１−２．標識保持部材の調製
抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に懸濁し、抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。

抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体を青色着色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．３μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子を調製した。

ストレプトアビジンを赤色ポリスチレンラテックス粒子（粒径０．１９μｍ）に感作し、分散用緩衝液（ＢＳＡ及びシュークロースを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、ストレプトアビジン感作ラテックス粒子を調製した。

上記抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子、抗インフルエンザＢ型モノクローナル抗体感作ラテックス粒子及びストレプトアビジン感作ラテックス粒子を混合し、混合ラテックスをグラスファイバー製パッドに添加（８３２μＬ／３００ｍｍ×５ｍｍ）後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識保持部材を調製した。

１−３．各部材の基材への貼り付け、裁断
ここで、図５（ａ）〜（ｃ）を用いて、各部材の基材への貼り付け方法について説明する。図５（ａ）は、標識保持部材５の右端とクロマト用膜担体９の左端の距離が−３ｍｍ（すなわち、両者が３ｍｍ重なっている。）の場合であり、図５（ｂ）は、標識保持部材５の右端とクロマト用膜担体９の左端の距離が０ｍｍ（すなわち、両者の端が同じ位置にある。）の場合であり、図５（ｃ）は、標識保持部材５の右端とクロマト用膜担体９の左端の距離が３，５，１０，２０ｍｍの場合を示す。それぞれの場合での各部材の幅（試料が流れる方向の長さ）は、表１に示す。

まず、バッキングシートからなる基材１に、図５（ａ）〜（ｃ）に示すように、上記１−１で調製したクロマト用膜担体９、上記１−２で調製した標識保持部材５、不織布（セルロース９０％、レーヨン１０％）からなる試料添加用部材３、不織布（セルロース）からなる吸収部材１１を貼り合せた。次に、試料添加用部材３と吸収部材１１をそれぞれ図示のように覆う透明シール１３，１５を貼った。最後に、裁断機（ＢｉｏＤｏｔ社）にて５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマトグラフィー用試験具を調製した。

２．試験
次に、上記方法で調製した図５の試験具を用いて、測定対象の検出にかかる時間について試験を行った。

（１）まず、Ａ型インフルエンザウイルス（培養ウイルス）Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９を生理食塩水にて１６０倍に希釈した（希釈後のウイルス濃度１．８×１０⁶ＦＦＵ／ｍＬ）。次に、Ｂ型インフルエンザウイルス（培養ウイルス）Ｂ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／９７を生理食塩水にて８０倍に希釈した（希釈後のウイルス濃度３．５×１０⁵ＦＦＵ／ｍＬ）。なお、ＦＦＵ（focus forming unit）とは、細胞に感染したウイルスを免疫染色することによって確認できるウイルス感染細胞数から算出されたウイルス数を表す単位である。

（２）次に、検体抽出試薬（０．３ｗ／ｖ％ＮＰ−４０（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を含むリン酸緩衝液ｐＨ７．３）８００μＬに、（１）で希釈したＡ型インフルエンザウイルスを１５０μＬ加え、混合し、Ａ型混合試料を調製した。同様に、検体抽出試薬８００μＬに、（１）で希釈したＢ型インフルエンザウイルスを１５０μＬ加え、混合し、Ｂ型混合試料を調製した。

（３）次に、（２）で調製したＡ型混合試料及びＢ型混合試料を別々の試験管に２００μＬ採った。
（４）次に、（３）の試験管に上記方法で調製した図５の試験具を入れた。
（５）次に、試験具を試験管に入れたまま、しばらく放置し、次に示す項目について測定を行った。その結果を表２に示す。なお、以下の測定項目において、ＢｉｏＤｏｔ社のＴＳＲ３０００メンブレンストリップリーダーで測定したラインの強度が０．０１５以上０．０３未満のものを１＋、０．０３以上０．０８未満のものを２＋、０．０８以上のものを３＋となるような目視判定見本を作製し、試験具に現れたライン強度を該目視判定見本と比較することにより判定を行った。
（ａ）バックグラウンドがクリアになるまでの時間（ＢＧ Clear）
（ｂ）ラテックスが標識保持部材から溶出完了するまでの時間（溶出時間）
（ｃ）対照部９Ｃのライン強度が３＋になるまでの時間
（ｄ）第１判定部９Ａのライン強度が１＋になるまでの時間
（ｅ）第１判定部９Ａのライン強度が２＋になるまでの時間
（ｆ）第２判定部９Ｂのライン強度が１＋になるまでの時間
（ｇ）第２判定部９Ｂのライン強度が２＋になるまでの時間
（ｈ）設定判定時間（試験具を入れてから１０分後）の第１判定部９Ａ及び第２判定部９Ｂの目視スコア
（ｉ）設定判定時間以降のバックグラウンド及び感度の上昇の有無

３．考察
表２を参照すると、以下のことが分かる。
（１）標識保持部材５とクロマト用膜担体９の間隔を開けるほど、バックグランドがクリアになるまでの時間が早くなった。
（２）標識保持部材５とクロマト用膜担体９の間隔を開けるほど、ラテックスが標識保持材５から溶出完了するまでの時間が早くなった。
（３）標識保持部材５とクロマト用膜担体９の間隔を開けるほど、対照部９Ｃ、第１判定部９Ａ、第２判定部９Ｂのライン出現時間が早くなった。
（４）標識保持部材５とクロマト用膜担体９の間隔を開けるほど、設定判定時間（１０分後）以降のバックグラウンドの上昇及び感度の上昇がなくなり、５ｍｍ以上間隔を開けることで設定時間内に設定感度まで各ラインのシグナルの上昇が完了した。
以上より、本発明の試験具を用いると、迅速に判定結果が得られることが実験的に確認された。

本発明の第１の実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。（ａ）展開用部材がある場合と（２）ない場合の試料展開速度を比較のための図である。本発明の第１の実施形態のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。本発明の実施例１のクロマト用膜担体の平面図である。本発明の実施例１のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。従来のイムノクロマトグラフィー用試験具の断面図である。

符号の説明

１：基材３：試料添加用部材５：標識保持部材７：展開用部材９：クロマト用膜担体９Ａ：第１判定部９Ｂ：第２判定部９Ｃ：対照部１１：吸収部材１３，１５：透明シール

Claims

試料添加用部材と、試料中の測定対象と抗原抗体反応する標識物質を保持する標識保持部材と、標識保持部材から試料の展開方向に間隔を介して配置され、測定対象と抗原抗体反応する固定化用物質が固定された判定部を有するクロマト用膜担体とを備え、試料添加用部材が標識保持部材を覆ってクロマト用膜担体と接触するように配置されていることを特徴とするイムノクロマトグラフィー用試験具。
試料添加部材がクロマト用膜担体より試料の展開速度が速い材料で構成された請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具
試料添加用部材が不織布である請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。
試料添加用部材がレーヨンまたはグラスファイバーからなり、クロマト用膜担体がニトロセルロースである請求項１に記載のイムノクロマトグラフィー用試験具。