JP4544498B2

JP4544498B2 - Biological sample analysis apparatus and method

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Publication number: JP4544498B2
Application number: JP2000582799A
Authority: JP
Inventors: ピーター・リー
Original assignee: SQI Diagnostics Systems Inc
Current assignee: SQI Diagnostics Systems Inc
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2010-09-15
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: WO2000029847A3; WO2000029847A2; EP1131632A2; TW468046B; JP2002530648A; AU1144000A; BR9915406A

Description

【０００１】
技術分野
本発明は、ミクロスフェア等の適切な微小粒子と、被分析物特異標識化法（analyte specific labeling）とを用い、血液等の生物学的サンプルから、血漿等の流体成分を分離する装置に関する。本発明は、また、生物流体中に存在する被分析物（analyte）の量を定量的に決定する装置および方法に関する。さらに、本発明は、注意点検定方法（point−of−care assay method）および装置を用い、生物流体サンプル中に存在する一以上の被分析物を測定する定量的検定方法および装置に関する。このサンプルは、一以上の微生物を試験する目的で調製された懸濁液であっても良い。この試験結果は、適切な解析装置を用いて解析することもでき、また、この検定試験結果をデジタル送信システムを用いて送信し、データのさらに詳細な評価を行なうこともできる。
【０００２】
背景技術
現在では、流体中の被分析物を測定する単一ステップ検定法（one step assay）には多数の例がある。ごく普通の検定法は妊娠試験装置のものであり、この場合には、尿サンプルを試験パッドに接触させることで、毛細管流により、尿が吸着性（bibulous）クロマトグラフィ片に沿って移動し、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（HCG：human chorionic gonadotropin）と、吸着性クロマトグラフィ片に含まれる試薬との反応により、ＨＣＧの存在が、通常、着色した線として現われることにより検出される。これは、クロマトグラフィ・検定法の一例である。
【０００３】
１９９８年６月１６日発行の米国特許第５，７６６，９６１号および１９９８年６月２３日発行の米国特許第５，７７０，４６０号の名称は、いずれも、「単一ステップ側流（lateral flow）非吸着性検定法」である。ここで、「非吸着性（non−bibulous）側流」とは、流体中に溶解されるか又は分散された全ての成分が、永久にトラップさたり又は濾過されるのではなく、安定化膜の横手方向での乱れが比較的少ない流れを形成しながら、実質的に同じ速度で移動することを意味する。これは、クロマトグラフィの構成において起こるような、一以上の成分を吸着するか又は吸収する能力を有する材料において一以上の成分が選択的に保持される現象とは異なる。この単一ステップ・検定法では、サンプル（問題とする被分析物を含み得るもの）が「サンプル収集ゾーン」に収集され、そこから「標識化ゾーン」へと流れる。ここで、サンプルが特定の結合試薬（binding reagent）と接触し、被分析物分子に検出可能分子（「検定標識」）が結合される。次いで「捕捉ゾーン」へと流れ、ここで、検出可能分子（visible moieties）と結合した被分析物分子が捕捉される。
【０００４】
１９９６年６月３０日発行の米国特許第５，５４０，８８８号「流体移送検定装置」には、生化学診断検定装置が記載されている。これは、多孔質材料で形成された２つの流体流路を備え、この流路の端に流体を同時に接触させると、毛細管流によって流体が共通の場所に移送される。これらの流路はある位置で相互に連結し、その先は、電気的ブリッジ回路に類似した配置を有する。この回路の分岐の流水抵抗を選択することにより、ブリッジ全体における流れを制御できる。
【０００５】
１９９４年４月５日発行の米国特許第５，３００，７７９号「毛細管流装置」には、流路を規定する装置を用い、試薬と混合されたサンプル中に存在する被分析物を測定する方法および装置が記載されている。結合反応による特定の結合が、流量、流動媒質の光パターン、光吸収、または光散乱、の変化を生じさせ、これにより、問題とする被分析物の測定が可能となる。
【０００６】
１９９２年５月５日発行の米国特許第５，１１０，７２４号「マルチ被分析物装置」には、一滴の血液サンプル中に存在する多数の被分析物の検定を行なう検定装置が記載されている。サンプル流体が移送部位に移動する際に血漿から血球を分離するための濾過および分配用基質を通過する血液サンプルの毛細管流によって、ディスペンサが、微小体積の血液サンプルを多数の移送部位に分配する。この装置の試験板には多数の吸収材パッドが設けてあり、各パッドには、選択された被分析物の検出に使用される試薬成分が含まれている。この試験板は、パッドの露出表面領域がその関連するサンプル移送部位に接触する場所である移送位置に向かう方向およびそれから離れる方向で、ディスペンサ上に取付けられている。これは、サンプル流体を、これらの位置から支持体上のパッドへと同時に移送するためである。
【０００７】
米国特許第５，０３９，６１７号「活性化部分的トロンボプラスチン時間測定用毛細管流装置および方法」には、全血サンプルに対する活性化部分的トロンボプラスチン時間（APTT：activated partial thromboplastin time）の測定が記載されている。この方法では、ＡＰＴＴ分析を行なうための試薬を入れた毛細管にサンプルを付着させ、この毛細管内の血液の流れが停止するまでの凝血時間を測定する。これは、凝血に基づいた危険度評価の一例である。
【０００８】
米国特許第４，７５３，７７６号「フィルタおよびこのフィルタから延びる毛細管流経路を備えた血液分離装置」には、赤血球から血漿を分離する方法が記載されている。この方法を用いた装置においては、フィルタから反応領域へ血漿を移動させる駆動力は、管状の毛細管による毛細管力である。フィルタは、特定の特性を有する微細グラスファイバ・フィルタの中から選択される。
【０００９】
１９９２年４月４日発行の米国特許第５，１３５，７１９号「フィルタおよびこのフィルタから延びる毛細管流経路を備えた血液分離装置」には、同様の発明が記載されており、前記グラスファイバ・フィルタは、０．１０〜７．０μmの直径を有するファイバから製造される。
【００１０】
１９８４年５月８日発行の米国特許第４，４４７，５４６号「毛細管中に光ファイバを設けた蛍光イムノ検定法」には、抗原抗体複合体の一成分（たとえば、抗体）の単層が固定されていると共に、軸方向に配置された光ファイバを備えた、微細な直径を有する短い毛細管が記載されている。
【００１１】
１９９７年３月１１日発行の米国特許第５，６１０，０７７号「特異結合検定を実施する方法および装置」には、公知の、抗原抗体結合検定法が記載されている。この方法では、被分析物（試験を行なうべき対象物質）を含む可能性のあるサンプル（ａ）が、試験を行なうべき対象物質に結合する抗体（ｂ）を固体支持体上に固定したもの、および、検出可能なマーカーに共役する、試験を行なうべき対象物質に対する抗体（ｃ）と混合され、その結果、試験を行なうべき対象物質に結合する抗体（ｂ）と（ｃ）との間の複合体が形成され、これにより、マーカーが固定され、検出される。
【００１２】
１９９０年６月２４日発行の米国特許第４，９４３，５２２号「側流非吸着性膜検定手順」には、「指示薬ゾーン（indicator zone）」に固定された結合対の一成分を有する多孔質膜である試験基体を使用する、イムノ検定等の、特異結合対検定を実施する方法および装置が記載されている。サンプルを付着させると、横手方向に揃って指示薬ゾーンを通過し、サンプル中に被分析物が存在すれば、固定された特異結合成分と複合体を形成し検出される。新しい検出方法では、観察可能な粒子を複合体中に捕捉する方法を用いる。たとえば、複合体の検出のための観察可能粒子として、血液中の血球を用いる。
【００１３】
全血サンプルから赤血球を分離する方法の一例は、１９９２年６月２日発行の米国特許第５，１１８，４２８号「全血サンプルから赤血球を分離する方法」に見られる。この方法では、酸を含んだ溶液と混合した全血サンプルから赤血球を分離する。すなわち、酸溶液との混合の後に、濾過、遠心分離、またはデカンテーションにより、結合した赤血球を除去し、実質的に赤血球を含まない血清サンプルないし血漿サンプルを得る。
【００１４】
米国特許第５，０７３，４８４号「定量分析装置および方法」では、流路に沿って間隔を空けて配置したいくつかの反応物含有反応ゾーンを備えた流体流路に沿って被分析物が測定される。反応ゾーンにおける被分析物、反応物、または所定の生成物、を検出する検出手段が用いられ、反応の起こったゾーンの数が、流体中の被分析物の量を示す。
１９８６年７月１６日発行の米国特許第５，５３６，４７０号「全血中の被分析物を決定するための試験担体」では、血液サンプル付着操作側からは、検出側にある赤血球へのアクセスはできない。分析反応の結果、検出側で、光学的に検出可能な変化が起こる。
【００１５】
被分析物の測定または検出を行なう現在の単一ステップ・検定法における重大な欠点は、これらの方法では、定量的結果ではなく定性的結果しか得られないことである。すなわち、被分析物が存在するか否かを決定することはできるが、サンプル中に存在する被分析物の実際の量や濃度を知ることができない。本発明に係る検定法では、決定可能な体積で試験が行なえれば、定量的結果が得られる。従来の方法では、流体が試験片を流れ去らねばならないので、反復試験において試験サンプルの正確な体積を再現性良く特定することができなかった。
【００１６】
クロマトグラフィ片およびグラスファイバ片を使用する従来の方法では、試験片内でタンパク質および標識を移動させるために、最初に大きな体積の生物流体を必要とする。特に、生物流体が血液であって、最初にこの血液サンプルから血漿を分離せねばならない場合には、このことが当てはまる。本発明に係る装置および方法の利点は、一以上の被分析物を分析する際にも、非常に少量の流体サンプルで充分であることである。さらに、本発明に係る検定方法および装置では、試験体積を一定に維持することができ、したがって、反復試験において、複数サンプル間または同一サンプル内で直接比較できる定量的データが得られるという利点を有する。
【００１７】
流体サンプルの検定中に全血からの血漿の分離が行なわれることも、本発明に係る検定装置および方法の利点である。つまり、サンプルの検定に先立って血液から血球成分を分離する必要がない。よって、患者による処置の現場での検定法の利用を可能にするという著しい利点が存する。たとえば、患者のベッドのそばで、または診察室において、患者自身がこれを行なうことが可能となる。本発明の好適な実施例においては、本発明の検定装置および方法により、一以上の流体サンプルに対する一以上の診断的検定または予後的検定に適した、総合的注意点器具（generic point−of−care platform）が得られる。
【００１８】
発明の概要
本発明の態様によれば、生物学的サンプルの流体成分を分離する方法が与えられる。一つの実施例では、生物学的サンプルはミクロスフェアのグループと接触して置かれ、および流体成分は流体部分がミクロスフェアを通して流れながら毛細管作用によってサンプルから分離する。好ましい実施例では、ミクロスフェアは規定された直径または大きさである。他の実施例では不均一な大きさおよび／または形状の粒子が、ミクロスフェアを使用する代わりに流体部分を生物学的サンプルから分離するために使用できる。
【００１９】
本発明の態様によれば、注意点（point−of−care）検定方法および装置を使用して流体サンプル中の一つ以上の被分析物を測定する定量検定方法および装置が設けられる。検定および装置は患者自身が枕もとでまたは医局で使用するように設計される。検査結果は適当な分析器を使用して分析され、そして随意的に検定検査結果は地域外（off−site）の専門家によって更なるデータの評価を行うために、デジタル伝送システムによって伝送される。
【００２０】
ミクロスフェアまたは他の粒子は、流体部分を非流体部分から抽出するまたは区画するための動的フィルタとして作用する。ビーズは分離ステップの間運動を示すので、チャンネルは過渡的（transient）であろう。従って、迅速な一時的毛細管抽出は、ミクロスフェアまたは粒子間の間隙空間によって形成された過渡毛細管チャンネルによって作られた動的毛細管フィルタによる。
【００２１】
本発明の態様によれば、時宜を得た方法で血液を含む小容量の生物学的流体を検査する検定方法および携帯用検定装置が設けられる。本発明の別の態様によれば、生物学的流体のサンプルを検査する方法および装置が設けられている。この態様では、一貫した容量の生物学的流体サンプルが一つ以上の被分析物について検査され、検査から得られるデータは収集および、例えば特別な病状に関係するデータベース中への編集に使用される。最後に、収集されたデータは神経網アルゴリズムを訓練するために使用できる。次に、このアルゴリズムは所定の検査対象の個々の検査結果に基づく診断および／または予後徴候情報を提供するために使用できる。
【００２２】
血液の検定に関する本発明の別の態様によれば、血液の細胞質成分は、ミクロスフェアビーズに血液全体を露出させることにより、細胞質成分ではなく血漿を毛細管作用によってミクロスフェアビーズ間に形成された空間を通過させることにより、血漿から分離される。本発明は細胞を血液中の血漿から分離することに限定されず、より広い適用を含む。ミクロスフェアビーズは生物学的流体の細胞質成分から流体成分を分離するために使用できる。ミクロスフェアビーズは流体フィルタとして効果的に作用している。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、サンプル中の血液から血漿を分離する装置が提供されている。この装置は接触する関係（abutting relation）に配置され、かつその間に複数の毛細管チャンネルを形成する複数のミクロスフェアを有し、それによってミクロスフェアが血液サンプルと流体連通状態に配置された時、血液サンプルの細胞質および血漿成分は接触ミクロスフェア間の間隙空間によって形成された毛細管チャンネルを通る血漿成分の毛細管流によって分離される。
【００２４】
本発明の別の態様によれば、この装置は、複数の小ミクロスフェアのグループを有する。各小ミクロスフェアは、それぞれ異なる標識（label）で含浸され、かつ大ミクロスフェアの別のゾーン中で大ミクロスフェアとともに散在する。ミクロスフェアは実質的に同じ直径でよく、またはミクロスフェアは異なる直径でも良い。選択されるミクロスフェアの大きさは、サンプルの粘度、または除去若しくは分離することを望む成分の大きさに基づく。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によれば、ミクロスフェアは流体透過物質（fluid−permeable material）中に包まれ（bundled）、またはミクロスフェアはミクロスフェアを通過する流体、例えば血漿の表面張力によって接触する関係に維持される。本発明のさらに別の態様によれば、単にミクロスフェアとしても知られるミクロスフェアビーズは装置の表面で乾燥される。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、この装置は流体入口に近接してサンプル棚（sample shelf）を有し、ミクロスフェアはサンプル棚に配置される。
【００２７】
本発明のさらに別の態様によれば、この装置は、複数の小ミクロスフェアを有し、該小ミクロスフェアが大ミクロスフェア間の間隙空間を占有（occupy）し、かつ大ミクロスフェア間の間隙空間を通して流体が流れる時、流体中に標識を放出するように、複数の大ミクロスフェアが散在する少なくとも一つの標識で含浸される。それぞれ異なる標識で含浸されかつ大ミクロスフェアの別のゾーンの中で大ミクロスフェアが散在する複数の小ミクロスフェアがあってもよい。代案として、小ミクロスフェアは移動性があり、流体が大ミクロスフェアによって形成された毛細管チャンネルに沿って通過する時、流体によって前方へ搬送されるようにしてもよい。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、この装置は、検定結果と関連される患者識別情報、例えばバーコードリーダによって読むことのできるバーコードを含む表示器（indicator）を有する。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、流体を生物学的サンプルから分離する方法が与えられる。サンプルは流体成分と非流体成分であり、方法は次のステップを含む。すなわち、
（ａ）サンプルを、接触する関係に配置されかつその間に毛細管チャンネルを構成するように接続する複数の間隙空間を形成する複数のミクロスフェアと流体連通状態に持ち込み、および
（ｂ）毛細管チャンネル通る流体成分の毛細管流れによって流体成分が分離される際に流体成分を収集する。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、毛細管距離だけ離隔配置された第一および第二対向表面によって規定された毛細管チャンバからなり、流体入口と毛細管チャンバー内部に配置された少なくとも一つの試薬を有する装置を利用して検定を行う方法が設けられ、次のステップを有する。すなわち、
（ａ）流体サンプルが毛細管作用によって毛細管チャンバー内部に引き込まれ、そして試薬と反応するように流体サンプルを流体入口と流体連通状態に導き、および
（ｂ）試薬が流体サンプル中の被分析物に結合（bind）するか否かを決定するために試薬を分析する。
【００３１】
本発明の別の態様によれば、方法はさらにサンプルに結合する試薬の割合を決定するために試薬を分析するステップを有する。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、方法はさらに一つ以上の流体サンプルについての複数の検定を行う複数の毛細管チャンバーを有する。本発明の別の態様によれば、検査結果はコンピュータデータベースに記録され、およびさらに一つ以上の選択された障害のプロフィールを生成するために、訓練された神経網アルゴリズムに適用できる。検定はさらに、データの統計的有意性を決定するためにデータに対して受信者動作特性検定（receiver operating characteristic analysis）を適用するステップを有する。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、芯すなわち毛細管が流体サンプルを毛細管チャンバーから除去するために流体サンプルと流体連通状態に持ち込まれる。
本発明の別の態様によれば、ミクロスフェアは生物学的流体中の流体成分から細胞質成分を、例えば血液全体から血漿を分離するために使用される。流体成分はクロマトグラフィ検査片で検査できる。さらに本発明のミクロスフェアビーズは標準のクロマトグラフィ検定において濾過装置に加えて標識装置（labeling device）として使用できる。
【００３４】
規定された形状と大きさの均一なミクロスフェアを使用する、ここに記述された本発明の総ての態様によれば、ミクロスフェアはさらに以下に記述されるように異なる大きさ、および／または形状の不均一な粒子によって置換することができるであろう。例えば珪砂はポリスチレンミクロスフェアビーズと置き換えるために使用できるであろう。他の適当な粒子は本記述の恩恵を受ける当業者に知られているものでもよい。
【００３５】
この好ましい実施例の他のおよび更なる詳細は図面と共に以下に記述される好ましい実施例の詳細な説明に記述される。
【００３６】
本発明を図示する目的で、図面に現在の好ましい形式が示されている。本発明は示された詳細な配置と手段に限定されることを意図していない。本発明は添付図面を参照して詳細に記述され、各図において同一符号は同一部分を示す。
【００３７】
好ましい実施例の詳細な説明
本発明は、ミクロスフェアビーズまたは他の適当な粒子を使用して生物学的サンプルから流体成分を分離する方法に関する。本発明はさらに、生物学的流体サンプル中の被分析物の有無を分析する装置と方法に関する。本発明はまた、一つの態様において生物学的流体サンプル中に存在する一つ以上の被分析物を精密に計量することに関する。一方、本発明はまた定量的結果でない、定性的結果も同様に提供できる。本発明はさらに検査結果を説明でき、さらに人間または動物が蒙るであろう、または将来蒙る見込みのあるある医療状態を特定するために使用できる検定に関する。本発明はさらに、本発明に規定される検査検定の結果が、将来ある状態または病状を展開する人間または動物の蓋然性を予測するために使用できる予後徴候検定技術に関する。これらの色々な実施例がここに詳細に記述される。
【００３８】
ここに記述される好ましい実施例は人間の生物学的サンプルの検査に関して記述されるが、このような検定と方法論は他の動物の生物学的サンプルを検定するためにも等しく使用できるであろう、ということが良く理解される。特に本発明は、明白に獣医学業務に適用性を有するであろう。さらにこの明細書で使用される用語流体サンプルは、懸濁液や流体の流れおよび／または毛細管作用によって分離できる流体部分を有する他のサンプルを含むように広く解釈されることを意図している。
【００３９】
対象の被分析物を含む流体成分と非流体成分を有する生物学的流体サンプルにおいて、本発明は次の何れかを単独で、または組合せて測定するために使用できる。
ａ）サンプル中の被分析物の存在
ｂ）サンプル中の被分析物の不存在
ｃ）サンプル中の被分析物の濃度
ｄ）サンプル中の被分析物の全量。
【００４０】
本発明の検定方法と装置によって測定できる適切な被分析物は、それに限らないが次のものを含む。すなわち、酵素、蛋白質、バクテリア、ウイルス、抗原、抗体、免疫グロブリン、薬物、およびホルモン。他の適切な被分析物も当業者に公知である。本発明の検定と装置は、性能強化薬物（performance enhancing drug）または他の街上薬物（street drug）のような人間の生物学的サンプルにおける乱用薬物（drug of abuse）の検出と測定のために有用である。
【００４１】
ある生物学的サンプルは最初に細胞質成分を分離しなくても検定できるが、しかしながら例えば血液の場合、細胞質成分は検定を邪魔する。検定前に細胞質成分を除去することが必要であるまたは好ましい生物学的サンプルの場合には、先ず流体成分を細胞質成分から分離することが必要である。例えば血液の場合、血液の細胞質成分が血漿中に存在する被分析物の検査を邪魔しないように、全血液から血漿を分離することが必要である。
【００４２】
驚くべきことに、生物学的サンプルの流体成分は、サンプルをミクロスフェアビーズの群（grouping）に適用（apply）することにより、その非流体成分から分離できることが本発明で認識された。サンプルが適用された時、流体成分はミクロスフェアビーズ間に流れ、それによってそれを簡単かつ効果的な方法で細胞質成分から分離する。ビーズが群を形成した時に、流体成分がビーズ間に形成される空間を通して毛細管作用により移動する際に、ビーズは、流体成分を非流体成分から分離する手段として作用する。従って、血液の場合、血漿は血液サンプル中の細胞から分離される。驚くべきことに、ミクロスフェアは全血液から血漿を迅速にかつ効果的に分離し尽くす能力を有することが、本発明で認識された。
【００４３】
この特許出願の目的にために、ビーズ間の空間は“間隙空間（interstitial spaces）”または“細孔（pores）”と呼ばれる。流体は一つの間隙空間から次の間隙空間へ毛細管作用によって流れると信じられる。
【００４４】
本発明では、ビーズ間の間隙空間を通過する流体の流れは、ビーズ間の空間によって形成されるチャンネルに沿う流れに喩えられる。流体が“毛細管”作用によってビーズ間に流れると思われるので、チャンネルは“毛細管”チャンネルと言われる。
【００４５】
ミクロスフェアが群を形成すると、小さな空間すなわち間隙空間がミクロスフェアビーズ間に形成される。ミクロスフェアビーズ間に形成される空間の大きさは、ミクロスフェアの曲率半径の関数である。本発明の目的のために、曲率半径はミクロスフェアの直径と同じである。ミクロスフェアビーズの大きさとビーズ間に形成される細孔の大きさとの間の関係を理解するために、細孔直径に対するミクロスフェア直径の比は略１から０．４であることが知られている。血漿を全血液から分離し尽くす場合、４μｍの細孔の大きさが最適であると考えられる。従ってこの特別な実施例についてのビーズの大きさは、１０μｍであるべきである。このことは容易な流体の流れを生じ（従ってより速い流体の流れ）、一方細胞は依然として細孔を通過することを妨げられる。ビーズ間に形成された小さな空間は、流体が存在する時ある毛細管現象を与える。
【００４６】
驚くべきことに、ここに教示されるように、本発明の原理に従って非均一な大きさおよび形状の粒子も同様に作用することが発見された。非均一粒子の特定の例が、以下の例７に記述される。ミクロスフェアビーズに関する以下の記述は、シリカおよび他の同等物のような他の類似の分離粒子の使用にもまた適用できる原理を教示することが理解される。
【００４７】
本発明において、血液中の赤血球および白血球はビーズの片側に留まり、一方血液サンプルの血漿部分は、ビーズ間に形成された間隙空間または細孔に沿う毛細管作用によってビーズを通過するので、ミクロスフェアの使用は、血漿を全血液から分離するための効果的なかつ廉価な手段である。本発明で観察された毛細管作用は、流体を前方に引き出すためにミクロスフェアによって流体上に作用する表面張力に関係すると考えられる。流体はミクロスフェア間を前方に引き出されるので、そのことはミクロスフェア領域に存在する如何なる試薬にも移動性を与える追加の利点を提供する。例えばミクロスフェア層は、二次抗体または別の検出分子で含浸されるであろう。
【００４８】
ミクロスフェアビーズは流体フィルタとして効果的に作用し、そしてそれなりに単純な流体濾過、分離、または区分が必要な検定における如何なる点においても使用できる。ミクロスフェアは毛細管作用によって流体成分を非流体成分から濾過し、分離し、または区分（partition）するように作用すると信じられているので、ミクロスフェアフィルタは毛細管フィルタと呼ぶことができ、この用語がその目的のためにここで使用される。毛細管フィルタは、流体成分の区分の間に顕微鏡下で移動するのが見られるという意味において動的フィルタ（dynamic filter）である。あるビーズは移動し、他は静止したままであるが、ビーズの全体的な移動は顕微鏡的に観察される。ビーズの移動によってある毛細管チャンネルは閉じ、他は開くであろうということが期待される。この意味において、毛細管チャンネルは過渡的であろう。ビーズと粒子間の間隙空間はまた、流体区分の間ビーズまたは粒子の移動によって同じ過渡状態を示すことが期待される。
【００４９】
ミクロスフェアは、例えば吸収または結合（coupling）によってそれらに結合（bound）される被分析物特定抗体（analyte specific antibodies）を有することができるであろう。血漿を含む流体はミクロスフェアによって形成された毛細管チャンネルを通過するので、被分析物はミクロスフェア上に含まれる二次抗体に移動性を持たせ、次いでバイオチップ中に含まれる一次抗体と反応するであろう。しかしながらミクロスフェアは単に細胞質成分を流体成分から分離するように作用するのみで、ミクロスフェアは抗体によって標識される必要はない。
【００５０】
先行技術は、サンプル中に存在する細胞または他の物質から邪魔されることなく、流体部分に検査を実施するために、クロマトグラフ用紙または他の繊維状材料を使用し、細胞質成分から生物学的サンプルの流体成分を運び出し（wick）ていた。本発明のミクロスフェアはクロマトグラフ用紙に存在するファイバーによる制約なしに改良された流体の流れを提供するので、それは先行技術に対する利点を提供する。ミクロスフェアは、抗体または他の適当な標識のような蛋白質の結合のために優れた表面を与える、ということにさらに利点を提供する。
【００５１】
流体成分を分離するために使用されるミクロスフェアビーズの大きさは、サンプルの粘度に基づいて変えることができる。より大ビーズはビーズ間のより速い流体の流れのためにより高粘度のサンプルに使用するべきである。また、異なる色のビーズは、それらが標識として使用されかつ被分析物に結合する時、ビーズの視覚化を促進するために使用できる。結合ビーズはまた、分光計によるその後の検出のために如何なる結合被分析物の密度も増加するのに役立つ。ビーズの正規パターンはまた、回折の差（diffraction difference）が結合ビーズの検出と測定用に使用できることを意味する。
【００５２】
生物学的サンプルは、ビーズの上部またはビーズの側部に適用することができる。
【００５３】
好ましい実施例では、登録商標Ｂａｎｇ’ｓの下で販売されるもののような乳濁液（latex）ミクロスフェアビーズが使用される。ビーズは、流体懸濁液の状態で供給される。ビーズは使用時に湿潤状態か乾燥状態に維持できる。ビーズが流体成分を分離する限り、ガラスを含めて他のタイプのビーズも本発明で使用できるであろう。
【００５４】
流体成分を生物学的サンプルから素早く分離するためにミクロスフェアビーズを使用することは、サンプル中に存在する被分析物を検出し計量する検定に組み込むことができる。
【００５５】
本発明の一つの態様によれば、ミクロスフェアビーズを使用して流体サンプルを生物学的サンプルから分離する方法が、流体サンプル中に存在するであろう一つ以上の被分析物を分析するための１ステップ検定（one−step assay）に組み込まれる。検定は規定容積のチャンバーと関連して実施される。好ましい実施例では、チャンバーは流体サンプルを分離するミクロスフェアビーズと、サンプル中の被分析物を検出しおよび/または測定する検出手段とを有する。検出手段は、サンプル中の被分析物を検出する色々な既知の方法の何れからも引き出すことができる。例えば被分析物は、被分析物に特有の抗体または抗原のような検出蛋白質を使用して認識できる。被分析物が検出蛋白質に結合する時、それは密度を変え、そして測定できる。代案として、検出蛋白質は検出できる別の標識に結合できる。例えば検出蛋白質は検出分子が被分析物に結合した時に密度が増加し、このことが検出または測定されるように、小さなビーズに付着してもよい。他の適当な標識は、金のような金属、蛍光標識、化学的標識または比色標識を含むであろう。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、本発明は血液のような生物学的サンプルの検定に使用する小さなチップまたはカセットの形態でに注意点（point−of−care）診断または予後徴候（prognostic）検査に関係する。本発明は、本発明によって教示される単純な検定用の“バイオチップ”と呼ばれる小さくコンパクトな検定装置を教示する。
【００５７】
本発明の装置において、血液、尿、唾液または他の生物学的流体の液滴中に存在する被分析物の定量的測定が測定できる特定の容積を規定するために、二つのキャリア表面（carrier surface）を組み合せている。好ましい実施例において、問題の表面はカバーガラスと顕微鏡スライドであるが、本発明はこれらの特定の実施例にのみ限定されることを意図するものではない。本発明の重要な態様は、流体サンプルが毛細管作用によって規定の容積の空間に入るという事実である。したがって、規定された空間はここでは毛細管チャンバーとして参照される。顕微鏡スライドとカバーガラスの場合、毛細管チャンバーはカバーガラスと底面とスライドの上面との間の空間の容積である。
【００５８】
本発明の好ましい実施例によれば、プレートすなわちスライド間に存在する流体の量は、スライド間の空間の容積によって決定される。従ってある場合には、数マイクロリットルの非常に小さな容積の精密検査を考慮する小さな検査システムが設計できる。
【００５９】
サンプル中の被分析物の濃度を定量的に測定しおよび一つの検査からの検査結果を別のものと比較するために、検定が実施される毎に流体サンプルの同一検査容積を有することが有利である。この方法で、被分析物測定は変動容積についての調整をする必要なしに直接評価できる。被分析物の濃度または量は、困難を伴わずにおよび検査毎に同一性をもって直接評価できる。本発明のバイオチップのチャンバーは、その規定の容積を提供する。
【００６０】
本発明の一つの態様によれば、被分析物の測定が実施される流体容積は標準化される。本発明の別の態様によれば、針を通して管状の血液を採ることによってのみ可能な大容積を必要とするよりも、例えば指の突き刺しからの滴状の血液のみでこれらの検査を実施できることは最も実際的であるので、非常に小さな血液容積中の血液細胞から血漿を分離する方法が与えられる。
【００６１】
好ましい実施例では、バイオチップ検査装置は決定可能な容積のチャンバーを有する。チャンバーは第一および第二対向キャリア表面で規定される。表面は、それらが毛細管作用によって二つの表面間に流体が流れるのに十分狭い距離だけ分離されるように置かれる。チャンバーは、それが規定空間を形成するような規定容積を有する。チャンバーは、流体サンプルを流入させる一つ以上の流体入口個所を有する。この明細書において、流体が毛細管作用によって流入するので、チャンバーはまた毛細管チャンバーとして参照される。
【００６２】
本発明の目的のために、互いに接合された二つのキャリア表面のこの配置は“バイオチップ”と呼ばれるが、またカセットまたはカートリッジとしても知られるであろう。
【００６３】
意図は、標準化できるコンパクトな携帯用検査システムを提供することである。特に好ましい実施例において、例えば底部表面は顕微鏡スライドであり、上部表面は顕微鏡カバーガラスである。顕微鏡スライドおよびカバーガラスは容易に入手でき、従って有用なキャリア表面である。別の例では、二つの顕微鏡スライドの一方を他方の上に載置できる。その中に流体が毛細管作用によって流入する決定可能な容積の規定空間がある限り、如何なるプレートでもよい。
【００６４】
毛細管チャンバー中に入ると、流体サンプルは、二つの表面の端部およびエッジでの表面張力により保持される。装置は、小さな大きさで携帯可能であり、それは分析器に挿入することができ、そして被分析物と検出分子間の反応生成物は分析器を使用して測定される。ある好ましい実施例を記述する目的で、キャリア表面はプレートと呼ばれる。しかしながら本発明は平坦なプレートのみに限定されない。同様に蛋白質、抗原および他の検出分子を結合できる総てのタイプの表面は、本発明の範囲であると考えられる。特にキャリア表面の組成は、それに限定されないがガラス、プラスチックおよび金属を含む。
【００６５】
本発明の好ましい実施例では、生物学的サンプルの液滴は顕微鏡スライドの上部表面に置かれ、毛細管チャンバーに入る前にサンプルの細胞質成分はミクロスフェアビーズの群を通る流体成分の移動によって除去される。例えば血液の場合血漿はビーズ間の間隙空間によって形成された毛細管チャンネルを通しての移動により血液の細胞質成分から分離され、次いで流体は被分析物がチャンバー中の試薬とその中で反応する検査チャンバーに入り、反応生成物はサンプル中に存在する被分析物の測定である。
【００６６】
流体が一旦規定空間に入ると、それはキャリア表面の内面に存在する一つ以上の試薬に曝される。試薬は従って毛細管チャンバー内に曝され、および究極的に毛細管チャンバーを充満する流体サンプル中に存在するであろう一つ以上の被分析物と反応するために利用できる。試薬は標識がつけられ、流体サンプル中に存在する被分析物の量はサンプル中の被分析物の、チャンバー内の試薬との相互作用から生じる反応生成物に基づいて測定される。検査結果は次いでサンプル中に存在する被分析物の量を決定するために標準較正と比較される。本発明の好ましい実施例において、試薬は好ましくは蛋白質印刷によってキャリア表面に付着される一つ以上の被分析物特定抗体である。
【００６７】
あるいは、別の実施例では、抗原がキャリア表面の内面に存在し、サンプル中の抗原特定抗体の量が測定される。キャリア表面に結合された時、蛋白質または他の検出分子は、規定の空間内に突出し、そこでサンプル中の被分析物と反応できる。キャリア表面の内面に存在する検出分子は、当業者によって知られる色々な方法の何れか一つで表面に結合してもよい。
【００６８】
検出分子はコートされ、印刷され、または別に当業者に良く知られた色々な技術の一つを使用して一方または他方のプレートに結合される。免疫学的検定法についての数多くの技術が当業者に知られており、および例えばC.P.PriceおよびD.J.Newman eds.（StocktonPress）著“Principles and Practice of Immunology”（1997）に記述されており、この文書はここに参考文献としてこの特許出願に組み込まれ、かつここに全文詳述されるようにその一部とされる。
【００６９】
二つのプレート間の距離は、血漿のような流体を毛細管作用によって二つのプレート間に効果的に引き込み、および流体を規定容積中に保持するプレートの能力によってのみ制限される。使用されるプレートの大きさはまた、検査の望ましい容積のような実際上の考慮によって決められるであろう。より大きい表面積のプレートはより大きい容積を生じるであろう。
【００７０】
本発明によれば、血液の液滴のような流体サンプルは二つのプレートの一つのエッジに置かれ、そしてプレート間に規定される空間に引き込まれる。流体サンプルは、当業者に知られている多数の手段によって、二つのプレートのエッジに対して引き込まれるであろう。その最も単純な形態では、サンプルは、エッジに直接接触させられ、流体サンプルの部分が規定容積の空間を完全に充填するように空間中に引き込まれる。例えば患者の指をプレートに接触させることによるなど。適切な定量的分析が実施できるように、サンプルは常に規定容積を完全に満たしていることが本検定では重要である。標準化モデルでは、容積は一つのバイオチップと他のバイオチップとで一定であるであろう。
【００７１】
別の好ましい実施例では、プレートは流体サンプルが容易に除去できるように互いに結合される。例えば流体流入点と反対側に端部において結合される。
【００７２】
別の例では、二つのプレート間の空間はレーンに分割され、各レーンの容積は同様に知られるであろう。この取り組みにより多重検査が単一サンプルについて為されるであろう。
【００７３】
血漿蛋白質を測定することが望まれる血液サンプルを扱う時、細胞から血漿を分離することが必要である。本発明では、検査結果は最初から終わりまで短時間フレームで、好ましくは１から３０分のオーダーで利用できるようにすることが望ましい。本発明の利点は、血液サンプルから血漿を分離するためにミクロスフェアビーズを使用することにより、例えばガラス繊維またはクロマトグラフ片を使用して生じるであろう遅延が排除されるので、流体サンプルが先行技術の検定よりも短時間に検査チャンバーに入る、ということである。遠心力装置のような煩わしい設備は、細胞分離に必要ではない。その総ては、注意点（point−of−case）で実施される検査を促進する。
【００７４】
本発明のバイオチップ装置は色々な検定が一つのサンプルについて実施されるようにするので、本発明は先行技術を越える更なる利点を有する。このことは検査結果が得られるスピードを促進し、検査に必要なサンプルの量を最小にする。
【００７５】
被分析物特定抗体（analyte−specific antibodies）それ自身は、このような検定の技術における当業者に既知の色々な標識の何れか一つで標識することができる。好ましい標識の例は、蛍光標識、比色性標識、別のミクロスフェア、金粒子または如何なる高コントラスト分子をも含む。他の標識は、標識の存在が検出できる限り適切であろう。同様に検査ビーズよりも小さい直径を有するミクロスフェアビーズは、小ビーズが流体サンプル（例えば血漿）の移動によって大ビーズを通して流通させられるように、使用できる。小さなビーズはそれに応じて標識することができる。
【００７６】
被分析物を含む流体サンプルが二つのプレート間の規定空間に入る時、更なる抗体抗原反応が生じるであろう。本発明では、上部プレート、例えばカバーガラスは流体と接触する表面上に結合された被分析物特定試薬を有する。本発明の好ましい実施例では、被分析物特定試薬は蛋白質プリンタを使用してキャリアプレートの内側表面上に印刷される。適切な蛋白質印刷装置は市場で良く知られている。これらはインクジェット、スプレイ、ピエゾ電気またはバブルジェット蛋白質プリンタを含む。ピエゾ電気プリンタが好ましい。被分析物特定試薬は、一般的に蛋白質である検出分子として作用する。これらの分子はガラス、金属およびプラスチック表面に付着する。好ましい表面は、ポリスチレンまたはポリプロピレンを含む。このような印刷装置の使用は、異なる“レーン”が規定され、および異なる被分析物が単一流体サンプルを使用して同時に評価できるように、色々な異なる被分析物特定検出分子をプレートまたはカバーガラス上に印刷させる本発明において有利である。追加の背景および較正レーンが同じ検査チャンバー内に設けられる。
【００７７】
被分析物が被分析物特定検出分子と反応した後、測定可能反応生成物が作られるであろう。比色性、または蛍光性、または他の反応生成物が適当な分光計または読取り器に接続された他の適当な検出器を使用して読むことができるように、バイオチップキャリア表面は無色または透明であることが好ましい。被分析物および被分析物特定検出分子が互いに反応する時、反応レーンの密度に変化が生じる。本発明の好ましい実施例では、密度の変化はサンプル中に存在する被分析物の量を決定するために測定される。背景雑音を低減し、従って検定感度を増加するために、マスクが本発明の好ましい実施例によって設けられる。図１を参照して、マスク３２はプレート上のレーン２６、２８および３０に対応する開口部３６、３８および４０を除いて、不透明材料で作られる。マスクはレーン自身のみが読み込まれることができるように、上部プレート１０上にきちんと適合するように設計される。マスクの使用は背景雑音の量を低減し、およびレーン中の密度変化を読む時基準線の値を設定する利点を有する。
【００７８】
本発明の好ましい態様では、バイオチップは、例えば被分析物が標識された抗体と反応した後に色の変化を読む携帯用スペクトロメータによって読まれるように設計される。スペクトロメータはまた使用される検査試薬によって密度、膜厚、質量吸着または回折の変化を読むことが出来るであろう。分析器例えばスペクトロメータが、一旦必要なデータ計算を実施したならば、結果は電話線を通じて、または携帯電話または他のコンピュータネットワークシステムによってデジタル伝送により伝送可能である。あるいは抗体／被分析物反応間に生じる変化は、もし無線周波数センサーがバイオチップ検出システムに組み込まれるならば、無線周波数の変化によって検出または測定できる。
【００７９】
図１に戻って、本発明のバイオチップの好ましい実施例が略式分解透視図で図示されている。二つのキャリアプレート１０および１２が設けられる。二つのプレートは参照番号１４で示されるようにその間に固定容積を規定する。その上に生物学的サンプル１８が適用できる適用ゾーン（application zone）１６として作用する棚を提供するために、下部プレート１２は上部プレート１０よりも長くしてもよい。棚は本発明に必須ではないが、サンプルがミクロスフェアビーズによって分離される場所を提供する。ビーズはプレートの境界内部の毛細管チャンバー１４の入口に置くことができ、かつサンプルは毛細管作用によってチャンバーに入るバイオチップのエッジに適用されるであろう、ということが可能ある。
【００８０】
また、適用ゾーン１６は、標識ゾーン２２を含みまたは含まなくて良いミクロスフェアビーズ２０の収集（collection）が付着されている。ミクロスフェアビーズ２０は流体透過物質を使用してグループ化されまたは束ねることができる。図１および２を簡略するために、ミクロスフェアビーズ２０および標識ゾーン２２が別々の規定領域として図示されている。しかしながらミクロスフェアビーズは自分自身に標識を担うことができる。この実施例は、二つのゾーンはミクロスフェアビーズが二つの役割、すなわち流体の分離と、流体がそこに曝される標識の表示とを果たすように、一つに集められている。
【００８１】
一つ以上の大きさのミクロスフェアビーズが存在していてもよい。一つの実施例では、小ミクロスフェアは大ビーズによって形成される間隙空間中に横たわることができるであろう。小ビーズはそれがビーズを通過しながら被分析物に結合するであろう二次標識を着けることができるであろう。標識は流体中の被分析物に結合するか、あるいは小ビーズに取り付けられた標識は流体中の被分析物に付着するであろうし、および小ビーズは次いで流体と共に毛細管チャンバー内へ移行するであろう。同時に流体サンプル中の如何なる細胞質成分もミクロスフェアビーズフィルタを通過しないであろう。
【００８２】
患者ＩＤは、それがバイオチップ上の検査検出区域を邪魔しないまたは被分析物がキャリアプレート表面に結合された物質との反応後にバイオチップの読取りを邪魔しない限り、プレート１０または１２の何れに添付されても良い。プレート１０および１２は無色および／または透明であることが好ましい。
【００８３】
三つの検出区域２６、２８、３０、すなわち較正印刷ゾーン２６、検出器印刷ゾーン２８および基準線印刷ゾーン３０がキャリアプレート１０の内面に印刷される。三つの検出区域またはゾーンは、一つのバイオチップがどのように設立されるかを図示するため、例示のためのみに描かれている。しかしながら色々なレーンが存在でき、および較正および／または背景に示されるレーンの数は検査される物により変えることができる。
【００８４】
検査は、三つのレーンにのみ限定されない。色々なレーンが規定できる。本発明の好ましい実施例では、三つのレーンが背景読取りの評価とバイオチップの較正を行うために一つのプレート上に印刷される。背景および較正検出ゾーンは総て同じバイオチップ上に置かれる必要はない、ということが理解される。検査被分析物と同じ検定中のサンプルキャリアプレート上に背景と較正読取りを為すことが有利であり、それによって検査結果の変動を低減する。
【００８５】
背景マスク３２は、随意的に設けられる。マスクはコートされたまたは印刷された検出ゾーン／レーンを阻止することなしに、キャリアプレート１０の外側表面を覆うように設計される。従って、開口部３６、３８および４０は、例えば検査結果を読取る時背景の邪魔を低減するためにマスク中に存在する。背景マスクは、上部プレートの内側表面上に識別される検出ゾーン２６、２８および３０に対応する開口部３６、３８および４０を備えて不透明材料で作られる。マスクの開口部４０は、試薬が存在しないプレート１０の一部に開口部４０が曝される限り、図示されるように対応検査ゾーン３０を有する必要はない。
【００８６】
図１は抗体／標識ゾーン２２およびミクロスフェア２０の両方を図示するが、これらの両ゾーンは、実施しようと選択する検査のタイプによって随意的である。流体サンプル１８が適用ゾーン１６に適用される時、二つのプレート１０と１２が最初に出会うエッジ３４にそれが到達する前に、それは抗体／標識ゾーン２２（もし存在するならば）、およびミクロスフェアビーズゾーン２０（もし存在するならば）を通して流れる。図１の略式図において、ミクロスフェアビーズとエッジ３４によって識別される流体流入点間にギャップがある。本発明のこの配置は動作するであろうが、もしミクロスフェアビーズゾーン２０および／または標識ゾーンがキャリアプレート１０のエッジ３４に接触するならば、それは最も好ましいであろう。このような構成の一つの例が図５および６に図示されている。この構成は流体サンプルが移行する最小の距離を与え、さらにこれは検査用に必要な流体サンプルの量を最小にし、そして例１により詳細に記述される。
【００８７】
流体サンプルは、エッジ３４の下で既知の容積を規定するチャンバー１４中に引き込まれる。流体サンプルは、適用ゾーン１６に沿ってミクロスフェアと標識ゾーンを通過し、そしてチャンバー１４を完全に充填するために十分な容積であるべきである。本発明のバイオチップは、血液の単一液滴が検査用に十分なサンプルの大きさとなり得るように、小さな大きさに縮尺できる。多くの寸法がここに教示される原理に基づいて構成することが可能である。１ｃｍ×３ｃｍの寸法は便利な大きさの装置を作るが、為されるべき検査の性質は最適チップの大きさを指示するであろう。図１に図示されるように、棚部分１６は底部プレート上に伸長する。この棚部分上に生物学的サンプルが適用できる。他の実施例では、例えば顕微鏡スライドに保持された検査部分は大きいであろうが、スライド上に位置する検査検定物それ自身は非常に小さい。検定は約１マイクロリットル程に小さいサンプル流体容積を容れるように小型化できる。
【００８８】
図２は、図１に参照したものと同じ要素を図示する線２−２に沿って取られた断面である。図２Ａは、流体がチャンバーから除去されるように装置の端部が開放できることを図示する線線２Ａ−２Ａに沿った、図２の端部の立面図である。ある人は、例えば全サンプルについて検査したいと望む場合、流体をチャンバーから除去することを望むかもしれない。適当な芯材料が開口端部に適用され、該芯により流体が引き出され、追加の流体がチャンバーに入る。このことは、連続的または不連続的プロセスのどちらでもできる。
【００８９】
図１、２および２Ａの総てに、プレート１０および１２を互いに保持する一つの方法である接着材５８のスポットが図示されている。接着材５８は、本発明の別の実施例である図６にもまた図示されている。
【００９０】
図７および７Ａは、１ステップ検定での分離のミクロスフェア方法の別の使用を図示する。この実施例において、ミクロスフェアはクロマトグラフィ紙と共に使用される。生物学的サンプル１８は、ミクロスフェアスライド５２’のような表面上に置かれる。それは、（図示されるように）ミクロスフェアビーズ５０上に直接またはその傍に置くことができる。サンプルの流体成分は次いでビーズ５０を通して流れ、サンプル１８中に存在する非流体成分から分離する。ビーズは標識パッド６２と接触するガラス繊維フィルタパッド６０に接触し、またはその間近かに位置する。標識パッド６２は、通常流体サンプル中の被分析物を標識するために当該標識で含浸されたガラス繊維パッドである。流体は、フィルタ６０と標識パッド６２を通して流れる。流体中に存在する如何なる被分析物もそれが標識パッドを通して流れる時、標識されるであろう。流体は次いでニトロセルロースクロマトグラフィ片６４中に流れ、そこで検査結果が通常ニトロセルロース片上の色彩の変化または帯として読取られる。代案として、ミクロスフェア５０はフィルタとして使用されるのでガラス繊維フィルタ６０は完全に削除できる（図示せず）。
【００９１】
最後に図７Ａに図示されるように、ガラス繊維パッド６２はミクロスフェアビーズ６６で置換できる。この場合ビーズ６６はフィルタとしてではなく標識のソースとして作用し、およびガラス繊維フィルタ６０’はそれぞれビーズ５０および６６の二組の間のスペーサとして役立つ。流体成分の濾過が必要でない適用について、ミクロスフェア６６は、ミクロスフェアフィルタ５０またはガラス繊維フィルタ６０’を必要とせずに流体中に存在する被分析物に直接標識するために使用できる。
【００９２】
図７および７Ａは、ここに教示した本発明のミクロスフェアビーズ技術を使用して現行の検定方法論が如何に変更できるかを図示する。
【００９３】
本発明の検定装置および技術は、それらが流体サンプルの多くの種類の小さな容積について使用できるという点で非常に有用である。記述は特定的に蛋白質を参照したが、標識システムがシステムにおいてマーカーの検出と測定用に案出できる限り、他のマーカーの如何なる数も適当であろう。例えば本発明は、バクテリア、ウィスル、菌類、または他の感染有機体のような微生物を測定および／または検出するために使用できるであろう。本発明のバイオチップ装置は標準値の表が構成できるように、検定のタイプおよび被分析物のタイプについて較正できる。本発明の検定システムは、患者システム中の特別のホルモンのレベルまたは薬剤の量さえも検出でき、およびこの標準化データは与えられた個々についての診断および／または予後徴候決定を行うために使用できる。
【００９４】
標準値の表が一旦構成されると、データは通常の作業および患者の医療的経歴、現在の健康状態および検査結果に基づいて構成されたデータベースで修正される。随意的にデータはモデム、インターネット、ケーブル線、電話線、人工衛星または他の同様な技術を経由したコンピュータネットワーク上のデジタル伝送システムによって伝送できる。これらのデータベースは現在の患者検査結果と診断を評価し、および与えられた個人についてのある健康成果を予測する神経網アルゴリズムの開発に使用できる。神経網アルゴリズムの一つの例が以下の例３に見出され、およびサンプル受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）が図８に図示されている。
【００９５】
適用された神経網についてのアルゴリズムの開発は、評価対象の医療状態の機能であろう。患者データの大量の量は、最初に信頼性のある予測成果を有するために蓄積されなければならないであろう。神経網は、本発明の標準化検定を使用して診断的または予後徴候的な被分析物の濃縮を認識するように訓練できる。データおよびアルゴリズムは、読取り器からの印刷出力が検査結果を提供するのと同時に特別の診断または予後徴候も識別するように、読取り器例えばスペクトロメータ中に置かれた電子チップでエンコードされる。神経網アルゴリズムにおいて、診断または予後徴候はデータ点の数が増加するにつれて最適化されるであろう。患者データが多い程予測および／または診断結果は大きな確実性でなされるであろう。パーセント確実性は計算でき、かつ設けられた分析器に備えられた電子メモリーチップ中に貯えられたデータベースとの比較による測定データの分析に基づいて、医師または技師に与えることができる。現在の技術は検査結果を印刷出力する時点で、読取り器自身で実際の標準曲線を表示することが可能である。
【００９６】
スペクトロメータの使用に加え、および本発明の別の態様に従って、バイオチップはキャリアプレート１０に組み込まれた無線周波数センサーを有する。一つ以上の検出区域で反応が起きる時、無線周波数に測定可能な変化が生じ、適当な無線周波数変化検出装置を使用して無線周波数のこの変化を検出することにより反応の有無またはさらにその程度が測定でき、または検出できる。
【００９７】
本発明では同じバイオチップ上で一つより多い検査が同時に進行でき、従って診断または予後徴候の確実性が改善できる。マーカーの数が増加する程、測定の確実性も増加する。
【００９８】
本発明のバイオチップ／カセットの使用の多くの例の一つは、患者の血液の液滴を使用して末梢血管疾患を示す血液蛋白を測定することである。
【００９９】
ミクロスフェアは、サンプルの流体部分が非流体部分から分離されながら、分離／濾過ステップの間、光学顕微鏡の下で観察された。ミクロスフェアのあるものは運動しており、他のものは静止したままであることが観察された。分離は動的であり分離中のビーズまたは粒子の作用は、動的毛細管作用である。流体部分の分離または抽出は、瞬時である。
【０１００】
本発明はまた、ここに記述されたミクロスフェアビーズ以外の小さな粒子にも適用可能である。特に本発明の分離技術はまた、例えば砂粒のようなシリカ系粒子を含む不均一粒子を使用しても、仮にこれらの粒子が以下の例７に示されるように必ずしも球形でなくまた均一な大きさでなくとも作動する。
【０１０１】
ここに記述された例に示されるように、不均一および／または非球形粒子またはビーズを使用する適当な分離／濾過が達成できる。不均一性は分離を幾分遅くさせるので分離を効率低くさせるが、少なくとも定性的検定については依然として効果的な分離が達成される。
【０１０２】
例えば砂粒を使用する例７において、例４、５および６に記述されたミクロスフェアビーズを使用した分離と同じ時限でより僅かの有機体しかサンプルから分離されないので、分離は同じように効率的に発生するようには思われない。しかしながら有機体は成功裏に分離され、かつそれに応じてさらに検査できまたは検定できる。シリカまたは他の同様な粒子の使用はそれらが廉価でありかつ未開発および開発途上国で容易に入手できるのでミクロスフェアビーズに対して有利である。
【０１０３】
本発明の検定および装置は、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７、サルモネラ、リステリア、クラミジアおよび他のバクテリアおよびウィルスのような微生物のようなある生物学的サンプル中の有害かつ病原性のバクテリアの存在を識別するのに特に有用である。例えば本発明の検定は、ある病原菌について食品サンプルを検査するために使用できる。それらはまた、感染病の診断用に人間用または獣医学薬剤に使用できるであろう。
【０１０４】
本発明で教示された方法論によって起きる動的分離が、図９−１８と例４−７に図示されている。
【０１０５】
この例から、本発明のミクロスフェアビーズは一般に粒子現象に一般化でき、および本発明は球形ビーズに限定されない。むしろそれはバイオチップ上のフィルタに砂粒を使用して、図７に図示されるような不均一な大きさと形状の粒子を含む。珪砂は市場で購入できるミクロスフェアビーズよりもかなり廉価な選択であろうし、従ってこの技術のより広い使用を行わせるであろう、ということが期待される。珪砂を使用するバクテリアの分離は、例えば同じ時間フレーム内により少ないバクテリアしか分離されずそれ程効率的ではなかったが、それは多くの用途に十分である。
【０１０６】
シリカ型粒子の使用の別の利点は、シリカは蛋白質と核酸を選択的に結合することがこの技術分野で知られていることである。シリカ系分離粒子はある蛋白質および／または核酸配置機構を案出するために使用できるであろう。
【０１０７】
例４−７の総てにおいて分離は殆ど瞬間的であり、粒子の大きさの制限は、隔離しようと望むバクテリア、微生物または他の被分析物によって制限された。当業者は、サンプル中に存在するバクテリアの種類に基づいて粒子のどの大きさを選択するかを知るであろう、ということが期待される。もしバクテリアが未知であるならば、当業者は予想される期待の大きさに基づいて粒子の大きさを取り上げ、そして上記のように一般に０．４から１の比に従ってビーズの大きさを選択するであろう。
【０１０８】
本発明の好ましい実施例の更なる詳細は、それが添付特許請求の範囲を限定するものではない、と理解される以下の例に図示される。
【０１０９】
実施例１：血漿流の確認、およびヒト全血からの血漿の分離
図３〜６に模式的に示すように、１０μmラテックス・ミクロスフェア・ビーズ（バング（Bang：登録商標）製）５０を約１５マイクロリットルだけスライドグラス５２に滴下し、乾燥させた。カバーグラス５４をスライドグラスに当て、その端で、スライドグラスに沿って、乾燥ビーズを押し寄せた。これにより、乾燥ビーズがスライドグラスから離れると共に、乾燥ビーズの集合体が反り返って湾曲部５６が生じた。このカバーグラスを、その端がこの「湾曲部」に接触した状態で、スライドグラスに載せた（図５、６に示す）。このカバーグラスの一端が乾燥ビーズの湾曲部の端に平行な状態で、整然と固定されると共に、この端は開放状態に保たれた。これは、流体が、ビーズ部分を通過し、カバーグラスとスライドグラスとの間に形成された毛細チャンバ内に流れることができるようにするためである。カバーグラスを、カバーグラスの角５８で、マニキュア液により接着し、スライドグラスに対し確実に固定した。カバーグラスは、毛細管作用が起こることを意図していない部分で固定したので、カバーグラスの下を流体が自由に流れることができる状態であった。
【０１１０】
２０マイクロリットルのヒト全血１８を、残っている５〜１０マイクロリットルのミクロスフェア・ビーズに載せた。つまり、ヒト全血サンプルを、湾曲部を構成していないビーズの残余部分の上に載せ、血漿成分を、毛細管作用によりミクロスフェア・ビーズの湾曲部を通して自由に移動させ、カバーグラスとスライドグラスとの間に形成された空間（毛細チャンバ）内に流入させた。この効果を双眼光学顕微鏡で観察した。血液サンプルをビーズに付着させると直ちに、血漿が全血から分離し始メータ。湾曲部が血漿に浸潤されるにつれ、カバーグラスとスライドグラスとの間の毛細管作用により、純粋かつ透明で血球を含まない血漿が、カバーグラスの下に形成されたカバーグラスとスライドグラスとの間の空間内に引き込まれた。このチャンバが、計算可能な所定の体積を有する既知の空間を形成するのである。
【０１１１】
これにより、ミクロスフェア・ビーズが、容易かつ効果的に全血から血漿を分離し、ミクロスフェア・ビーズの間に形成された毛細管チャネルを通して毛細管チャンバ内に導き得ることが判る。
【０１１２】
実施例２：クロマトグラフィ片と組合せたミクロスフェア分離
ヒト全血サンプル中の被分析物の検定に関して、この実施例（図７に模式的に示す）では、ヒト全血の血液サンプルからの血漿のミクロスフェア分離の使用法を説明する。血漿は、ラテックス・ミクロスフェア・ビーズ（バング（Ｂａｎｇ：登録商標）製）５０を用いて分離され、次いで、標準のニトロセルロース・クロマトグラフィ片に導かれた。
【０１１３】
従来技術において赤血球を保持するために普通に使用されるグラスファイバ・パッドに、約２０マイクロリットルの１０μmラテックス・ビーズを載せた。１滴（約６０マイクロリットル）のヒト血液を、ラテックス・ミクロスフェアに接触する状態で表面５２’に載せた。グラスファイバ・パッド６０は、実効的にビーズ５０と標識パッド６４との間のスペーサとして機能すると同時に、第２のフィルタとしても利用され得る。グラスファイバ・フィルタ６０は、完全に取り除いても良く、その場合には、ミクロスフェア・ビーズ５０が直接に標識パッド６４に接触する（図示しない）。
【０１１４】
血液が、堆積したビーズを浸潤し、約２分以内に透明な血漿がニトロセルロース・クロマトグラフィ片に達する。これは肉眼および顕微鏡により観察された。この実施例から、血液からの血漿のミクロスフェア分離法が、標準のニトロセルロース・クロマトグラフィ片と共に使用できることが判る。したがって、明らかに、本方法は、このようなクロマトグラフィ片を用いた試験法において血液から血漿を分離するための有用な方法である。
【０１１５】
別の実施例を図７Ａに示す。この場合には、試験装置の標識領域として、グラスファイバ標識パッド６２に代えてミクロスフェア・ビーズ６６を用いる。グラスファイバ・フィルタ・パッド６０’は、２組のビーズ５０および６６の間のスペーサとして使用される。
【０１１６】
実施例３：ニューラル・ネットワークによるマーカー解析
ニューラル・ネットワークは、被分析物ベクトルａ＝ａ（ａ１，ａ２，…，ａｎ）を入力とし、０と１との間の値を出力する数学関数Ｎ（Ｗ，ａ）である。加重パラメータＷは、トレーニング期間中に、トレーニング・パターン｛ｐ＝（ｂ１，ｂ２，…，ｂｎ，Ｔ）｝を用いて調節する。ここで、ｂ１，…，ｂｎはトレーニング用タンパク質ベクトルであり、Ｔは目標出力値である。凝血試験の場合には、Ｔは、凝血に対して１であり、非凝血に対して０である。
【０１１７】
パラメータＷは、新たな試験データに対する良好な性能を維持しながら誤差

が最小となるように調節する。
【０１１８】
ネットワークのトレーニングが完了すれば、試験データを分類するためにネットワーク遮断値（network cutoff）Cを選択する。試験ベクトルａ、所与の遮断値C、目標出力Ｔに対する試験結果をＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）とする。
｛１（Ｎ（ａ）＞Ｃの場合）
ＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝｛
｛０（その他の場合）
この場合、試験の感度および特異度（specificity）を分析することができる。
Ｔ＝１かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝１の場合は真および正（True Positive）
Ｔ＝０かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝１の場合は偽および正（False Positive）
Ｔ＝０かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝０の場合は真および負（True Negative）
Ｔ＝１かつＴＳＴ（Ｃ，ｂ，Ｔ）＝０の場合は偽および負（False Negative）
感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）
特異度＝ＴＮ／（ＴＮ＋ＦＰ）
様々な遮断値に対して感度と１−特異度との関係をプロットすれば、ＲＯＣ（receiver operator characteristic）曲線が得られる。
【０１１９】
ニューラル・ネットワーク
一組のトレーニング・パターン｛ｐ＝（Ｉ１，Ｉ２，…，Ｉ１，ＴＡＲ）｝から始める。ここで、Ｉｊは入力値、ＴＡＲは目標値（ＴＡＲ＝０またはＴＡＲ＝１）である。そうして、目標値に近い値を出力するようにニューラル・ネットワークをトレーニングする。
【０１２０】
ニューラル・ネットワークは３層を備える。つまり、第１の入力層、第２の背後層（hidden layer）、第３の出力層である。
【図表１】
入力層背後層出力層

【０１２１】
ニューロンは一組の加重｛ｗ（ｉ，ｊ，ｋ）｝によって接続されている。たとえば、ｗ（１，２，４）は、第１層の２番目のニューロンを第２層の４番目のニューロンに接続する。
【０１２２】
各パターンについて、各ニューロンに対する活性化度（activation）と称される数字を割り当てる。これは、発火（firing）する確率（provability）の指標となる。活性化度は以下のように、再帰的に定義される。
｛Ｉｊ（ｉ＝１の場合）
ａ（ｉ，ｊ）＝｛
｛１/（１＋exp（−sum（ｋ）｛ｗ（ｉ−１，ｋ，ｊ）ａ（ｉ−１，ｋ）｝））
【０１２３】
誤差は、
ＥＲＭＳ＝ＳＱＲＴ｛ｓｕｍ｛（ｔ−ａ（２，１））＾２｝｝
として計算される。ここで、和（sum）は、すべてのパターンに渡って取る。
【０１２４】
加重は，新たなデータに対して良好な性能を維持しながらＥＲＭＳが最小となるように調節する。
【０１２５】
【図表２】

【０１２６】
実施例４：ヨーグルトからの乳酸桿菌の分離
乳酸桿菌（Lactobocillus）を含む約１０マイクロリットルのヨーグルトを本発明に係る検定装置（本明細書中では「バイオチップ」と称する）に載せた。バイオチップ上に分離用ビーズが存在しない場合には、図９に示したように、視野中に固体粒子が観察された（ヨーグルト中に存在する乳酸桿菌の他に）。分離前には、視野中に数個の細菌だけが見られた（図９）。
【０１２７】
これに対し、図１０に示したように、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作では、サンプルから細菌が良好に分離された。図９に見られた固体粒子が、全く見られない。分離後には、分離された流体部分には細菌だけが見られる（図１０）。分離はほぼ瞬間的に行なわれた。ミクロスフェア・ビーズにより、ヨーグルト中の固体粒子の残余部分からの細菌の単離が迅速かつ容易に行なわれ、分離された細菌のさらに詳細な試験が可能となった。これにより、サンプル中に存在する細菌の型の決定が可能となる。たとえば、細菌または微生物の型を決定する特定の抗原試験によって、細菌またはその他の微生物の型が決定できる。
【０１２８】
直径１０μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作によっても、図１１に示したように同様な結果が得られた。図１１では、一視野あたりの細菌数は少ないが、同様に、ヨーグルトからの細菌の分離が有効に行なわれている。
【０１２９】
実施例５：パン懸濁液からの大腸菌の分離
本実施例では、本発明に係る方法および装置を用いて、パン懸濁液から大腸菌（E. coli）がうまく分離された。
【０１３０】
最初に、パンとＮａＣｌの混合物を調製した。重量２００ｍｇのパンを用いた。このパンに、１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を５００マイクロリットルだけ加えて反復混合することでパン懸濁液を調製した。大腸菌（ＤＨ５α株）を１００マイクロリットルだけパン懸濁液に加えた。懸濁液を再び撹拌して大腸菌／パン懸濁液を調製した。１００マイクロリットルの大腸菌／パン懸濁液を「バイオチップ」に載せると、ほぼ瞬時にして、ミクロスフェア・ビーズが作用して、細菌を含む流体成分がサンプルから分離された。しかも、懸濁液からの固体粒子の混入はなかった。図１２に、分離前の大腸菌／パン懸濁液の典型的な視野を示す。図１３には、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いた分離操作によって得られた流体部分で細菌が良好に分離されている様子を示す。分離状況は良好であった。
【０１３１】
実施例６：牛糞からの細菌の分離
本実施例では、本発明に係る方法および装置を用いて、牛糞から細菌が分離された。５００ｍｇの牛糞に１５０ｍＭのＮａＣｌ溶液を５００マイクロリットルだけ加えて混合することで懸濁液を調製した。５マイクロリットルの懸濁液サンプルを分離用に使用し、バイオチップに載せた。分離前（図１４）および分離後（図１５、１６）の顕微鏡写真を示す。本実施例の分離操作は、直径１５μmのミクロスフェア・ビーズを用いて行なった。サンプルを「バイオチップ」に載せると、ほぼ瞬時にして、ミクロスフェア・ビーズにより、細菌を含む流体成分が分離された。これにより、分離された細菌を詳細な同定のために染色することができる。直径１５μmのビーズを用いても（図１５）、また、直径１０μmのビーズを用いても（図１６）、良好に分離された。
【０１３２】
実施例７：砂のシリカ粒子を用いた分離
本実施例では、市販されている標準のポリスチレン・ビーズに加えて、他のタイプの粒子を試験した。シリコーン・ベースの粒子の安定性を試験するために、ミクロスフェア・ビーズを砂粒子（珪砂）で代替した。３つの試験を行なった。すなわち、牛糞、大腸菌／パン懸濁液、血液、である。珪砂を水と混合してスラリーとし、バイオチップに塗布した。バイオチップ上の砂粒子の大きさは、１ｍｍのスケールとの比較から知ることができる（図１７）。
【０１３３】
図１８の牛糞、および図１９の大腸菌／パン懸濁液に関しては、図に示したように良好に分離されはしたが、しかし、濾過用にポリスチレン・ビーズを用いた上述の実施例５、６での実験ほどに良好でははなかった。この粒子を用いた場合に分離が良好ではなかったことの原因は、多分、粒子サイズおよび形状の不均一と考えられる。しかし、砂粒子／珪砂の使用でも未だ明瞭に分離されるので、これがポリスチレン・ビーズの使用に対する可能な代替方法であることは明らかである。
【０１３４】
全血をバイオチップに付着させ、珪砂粒子を通して濾過した。この場合には、粒子サイズが大きいために（直径１０μmのミクロスフェア・ビーズと比較して）、赤血球が濾過粒子を通過した。均一な血液スメア（smear）が得られた。
【０１３５】
日常的に用いられている実験例をこれ以上説明しなくとも、当業者ならば、上に詳しく述べた本発明の実施例と同様な多数の例を、認識し、確認することができると考えられる。そのような同様の例は、以下に掲げる請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置の実施形態の概略分解斜視図。
【図２】図１に示す好ましい実施形態の１Ａ−１Ａ線長手方向断面図。
【図２Ａ】図２に示す装置の２Ａ−２Ａから見た端面立面図。
【図３】例１に記載された実施形態の側面図で、カールを形成するのを開始するときのビードに対するカバースリップを示す。
【図４】例１に記載された実施形態の側面図で、形成後のカールを示す。
【図５】顕微鏡スライド上のビードに対するカバースリップの位置を示す。
【図６】例１に記載された実施形態の平面図。
【図７】例２に記載された実施形態の側面図で、標識パッド変体を示す。
【図７Ａ】例２に記載された他の実施形態の側面図で、標識パッドのミクロスフェアビードとの置換を示す。
【図８】ニューラルネットワークのリスク分析テストに対する予想されたテスト結果のＲＯＣ曲線の一例を示す。
【図９】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された未分離のヨーグルトの外観を示す。
【図１０】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図９に示すヨーグルトの流体部分を示す。
【図１１】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１０マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図９に示すヨーグルトの流体部分を示す。
【図１２】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された未分離の大腸菌とパンの懸濁液の外観を示す。
【図１３】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１２に示す大腸菌／パン懸濁液の流体部分を示す。
【図１４】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、バイオチップの棚に塗布された乳牛の糞便の外観を示す。
【図１５】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１５マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【図１６】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、１０マイクロメータの径を有するミクロスフェアビードを使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【図１７】光倍率顕微鏡を使用して撮られた顕微鏡写真で、バイオチップに棚に塗布されたスケールが１ｍｍのシリカサンドを示す。
【図１８】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、シリカサンド粒子を使用して分離した後の図１２に示す大腸菌／パン懸濁液の流体部分を示す。
【図１９】光倍率顕微鏡を使用して倍率４００ｘで撮られた顕微鏡写真で、シリカサンド粒子を使用して分離した後の図１４に示す乳牛の糞便の流体部分を示す。
【符号の説明】
１０上部プレート
１２下部プレート
１４毛細管チャンバー
１６適用ゾーン
１８生物学的サンプル
２０ミクロスフェアビーズ
２２標識ゾーン[0001]
Technical field
The present invention relates to an apparatus for separating a fluid component such as plasma from a biological sample such as blood using appropriate microparticles such as microspheres and an analyte specific labeling method. The invention also relates to an apparatus and method for quantitatively determining the amount of analyte present in a biological fluid. The present invention further relates to a quantitative assay method and apparatus for measuring one or more analytes present in a biological fluid sample using a point-of-care assay method and apparatus. The sample may be a suspension prepared for the purpose of testing one or more microorganisms. This test result can be analyzed using an appropriate analyzer, or the test result can be transmitted using a digital transmission system for further detailed evaluation of the data.
[0002]
Background art
Currently, there are many examples of one step assays that measure analytes in fluids. The most common assay is that of a pregnancy test device, where the urine is moved along a bibulous chromatographic piece by capillary flow by contacting the urine sample with the test pad, and human The presence of HCG is usually detected by appearing as a colored line by reaction of human chorionic gonadotropin (HCG) with the reagent contained in the adsorptive chromatographic strip. This is an example of a chromatography and assay method.
[0003]
The names of US Pat. No. 5,766,961 issued on June 16, 1998 and US Pat. No. 5,770,460 issued on June 23, 1998 are both “single step lateral flow”. flow) non-adsorbability assay. Here, “non-bibulous sidestream” means that all components dissolved or dispersed in the fluid are not trapped or filtered permanently, but are stabilized membranes. Means that they move at substantially the same speed while forming a flow with relatively little disturbance in the transverse direction. This differs from the phenomenon where one or more components are selectively retained in a material that adsorbs or has the ability to absorb one or more components, as occurs in chromatographic configurations. In this single-step assay, a sample (which may contain the analyte of interest) is collected in a “sample collection zone” and flows from there to a “labeling zone”. Here, the sample comes into contact with a specific binding reagent, and a detectable molecule (“assay label”) is bound to the analyte molecule. It then flows to the “capture zone” where the analyte molecules bound to the visible moieties are captured.
[0004]
U.S. Pat. No. 5,540,888 “Fluid Transfer Assay Device” issued June 30, 1996 describes a biochemical diagnostic assay device. This comprises two fluid flow paths formed of a porous material, and when the fluid is brought into contact with the ends of the flow paths simultaneously, the fluid is transferred to a common location by capillary flow. These flow paths are connected to each other at a certain position, and have a configuration similar to that of an electrical bridge circuit. By selecting the flow resistance of the branch of this circuit, the flow in the entire bridge can be controlled.
[0005]
US Pat. No. 5,300,779 “Capillary Flow Device” issued on April 5, 1994 uses a device that defines a flow path to measure an analyte present in a sample mixed with a reagent. Methods and apparatus are described. Specific binding due to the binding reaction causes a change in flow rate, light pattern of the fluid medium, light absorption, or light scattering, which allows the analyte of interest to be measured.
[0006]
US Pat. No. 5,110,724, “Multi-Analyte Device”, issued May 5, 1992, describes an assay device for assaying a large number of analytes present in a drop of blood sample. Yes. As the sample fluid moves to the transfer site, the dispenser distributes a small volume of blood sample to a number of transfer sites by capillary flow of the blood sample through a filtration and distribution substrate to separate blood cells from the plasma. The test plate of this apparatus is provided with a number of absorbent pads, each containing a reagent component that is used to detect the selected analyte. The test plate is mounted on the dispenser in a direction toward and away from the transfer position where the exposed surface area of the pad contacts the associated sample transfer site. This is because sample fluid is transferred simultaneously from these locations to the pad on the support.
[0007]
US Pat. No. 5,039,617 “Capillary flow apparatus and method for measuring activated partial thromboplastin time” describes the measurement of activated partial thromboplastin time (APTT) on whole blood samples. ing. In this method, a sample is attached to a capillary tube containing a reagent for performing APTT analysis, and the clotting time until the blood flow in the capillary tube stops is measured. This is an example of risk assessment based on blood clots.
[0008]
U.S. Pat. No. 4,753,776 “Blood Separation Device with Filter and Capillary Flow Path Extending from the Filter” describes a method for separating plasma from red blood cells. In the apparatus using this method, the driving force for moving the plasma from the filter to the reaction region is a capillary force generated by a tubular capillary. The filter is selected from among fine glass fiber filters having specific characteristics.
[0009]
US Pat. No. 5,135,719 issued April 4, 1992 “Blood Separation Device with Filter and Capillary Flow Path Extending from the Filter” describes a similar invention, wherein the glass fiber The filter is manufactured from a fiber having a diameter of 0.10 to 7.0 μm.
[0010]
U.S. Pat. No. 4,447,546 issued on May 8, 1984 “Fluorescence immunoassay with optical fiber in capillary tube” includes a single layer of an antigen-antibody complex (eg, antibody). A short capillary with a fine diameter is described which is fixed and has an optical fiber arranged axially.
[0011]
A known antigen-antibody binding assay is described in US Pat. No. 5,610,077 issued on Mar. 11, 1997, “Method and apparatus for carrying out specific binding assay”. In this method, a sample (a) that may contain an analyte (a target substance to be tested) has an antibody (b) that binds to the target substance to be tested immobilized on a solid support, And a conjugate between the antibody (b) and (c) that is conjugated to the detectable marker and that is mixed with the antibody (c) to the target substance to be tested and thus binds to the target substance to be tested. A body is formed, whereby the marker is fixed and detected.
[0012]
US Pat. No. 4,943,522, issued June 24, 1990, “Side-Flow Non-Adsorbable Membrane Assay Procedure” describes a porous material having one component of a binding pair fixed in an “indicator zone”. A method and apparatus for performing a specific binding pair assay, such as an immunoassay, using a test substrate that is a membrane is described. When the sample is attached, it passes through the indicator zone in the lateral direction, and if an analyte is present in the sample, it forms a complex with the fixed specific binding component and is detected. New detection methods use a method of capturing observable particles in the complex. For example, blood cells in blood are used as observable particles for complex detection.
[0013]
An example of a method for separating red blood cells from a whole blood sample can be found in US Pat. No. 5,118,428, “Method for separating red blood cells from a whole blood sample” issued June 2, 1992. In this method, red blood cells are separated from a whole blood sample mixed with an acid-containing solution. That is, after mixing with an acid solution, bound red blood cells are removed by filtration, centrifugation, or decantation to obtain a serum sample or plasma sample substantially free of red blood cells.
[0014]
In US Pat. No. 5,073,484 “Quantitative Analytical Apparatus and Method”, an analyte is placed along a fluid flow path with several reactant-containing reaction zones spaced along the flow path. Measured. Detection means are used to detect an analyte, reactant, or a predetermined product in the reaction zone, and the number of zones in which the reaction has occurred indicates the amount of analyte in the fluid.
In U.S. Pat. No. 5,536,470 issued July 16, 1986, “Test Carrier for Determining Analyte in Whole Blood”, the blood sample attachment operation side is directed to the red blood cells on the detection side. Access is not possible. As a result of the analytical reaction, an optically detectable change occurs on the detection side.
[0015]
A significant disadvantage of current single-step assay methods for measuring or detecting analytes is that these methods yield only qualitative results rather than quantitative results. That is, it can be determined whether or not an analyte is present, but the actual amount or concentration of the analyte present in the sample cannot be known. In the assay method according to the present invention, if the test can be performed with a determinable volume, a quantitative result can be obtained. In the conventional method, since the fluid has to flow away from the test piece, the exact volume of the test sample cannot be identified with good reproducibility in repeated tests.
[0016]
Conventional methods using chromatographic pieces and glass fiber pieces initially require a large volume of biofluid to move proteins and labels within the test piece. This is especially true if the biological fluid is blood and plasma must first be separated from the blood sample. An advantage of the apparatus and method according to the present invention is that a very small fluid sample is sufficient when analyzing one or more analytes. Furthermore, the assay method and apparatus according to the present invention has the advantage that the test volume can be kept constant, thus providing quantitative data that can be directly compared between multiple samples or within the same sample in repeated tests. .
[0017]
It is also an advantage of the assay device and method according to the present invention that the separation of plasma from whole blood takes place during the assay of the fluid sample. That is, it is not necessary to separate blood cell components from blood prior to sample testing. Thus, there is a significant advantage that allows the use of the assay in the field of treatment by the patient. For example, the patient himself can do this by the patient's bed or in the examination room. In a preferred embodiment of the present invention, the assay device and method of the present invention provides a generic point-of-approach suitable for one or more diagnostic or prognostic assays for one or more fluid samples. care platform).
[0018]
Summary of the Invention
According to an aspect of the invention, a method is provided for separating fluid components of a biological sample. In one embodiment, the biological sample is placed in contact with a group of microspheres and the fluid component is separated from the sample by capillary action while the fluid portion flows through the microsphere. In a preferred embodiment, the microspheres are a defined diameter or size. In other embodiments, non-uniformly sized and / or shaped particles can be used to separate the fluid portion from the biological sample instead of using microspheres.
[0019]
In accordance with aspects of the present invention, a quantitative assay method and apparatus is provided for measuring one or more analytes in a fluid sample using a point-of-care assay method and apparatus. The assay and device is designed to be used by the patient himself at the bedside or in a medical office. The test results are analyzed using a suitable analyzer, and optionally the test results are transmitted by a digital transmission system for further data evaluation by off-site specialists. .
[0020]
Microspheres or other particles act as a dynamic filter to extract or partition the fluid portion from the non-fluid portion. Since the beads exhibit movement during the separation step, the channel will be transient. Thus, rapid temporary capillary extraction is due to a dynamic capillary filter created by transient capillary channels formed by microspheres or interstitial spaces between particles.
[0021]
According to an aspect of the present invention, there is provided an assay method and a portable assay device for testing a small volume of biological fluid containing blood in a timely manner. In accordance with another aspect of the present invention, a method and apparatus for examining a sample of biological fluid is provided. In this embodiment, a consistent volume of biological fluid sample is tested for one or more analytes and the data obtained from the test is used for collection and editing, for example, into a database related to a particular medical condition. . Finally, the collected data can be used to train neural network algorithms. The algorithm can then be used to provide diagnostic and / or prognostic information based on individual test results for a given test subject.
[0022]
According to another aspect of the invention relating to the assay of blood, the cytoplasmic component of the blood is the space formed between the microsphere beads by capillary action instead of the cytoplasmic component by exposing the whole blood to the microsphere beads. Is separated from the plasma. The present invention is not limited to separating cells from plasma in blood, but includes broader applications. Microsphere beads can be used to separate fluid components from the cytoplasmic components of biological fluids. The microsphere beads are effectively acting as a fluid filter.
[0023]
According to another aspect of the invention, an apparatus for separating plasma from blood in a sample is provided. The device has a plurality of microspheres disposed in abutting relation and forming a plurality of capillary channels therebetween, whereby when the microspheres are placed in fluid communication with the blood sample, the blood The cytoplasm and plasma components of the sample are separated by a capillary flow of plasma components through the capillary channel formed by the interstitial space between the contact microspheres.
[0024]
According to another aspect of the invention, the device has a plurality of groups of small microspheres. Each small microsphere is impregnated with a different label and interspersed with the large microspheres in different zones of the large microsphere. The microspheres can be substantially the same diameter, or the microspheres can be different diameters. The size of the microspheres selected is based on the viscosity of the sample or the size of the component that it is desired to remove or separate.
[0025]
According to yet another aspect of the invention, the microspheres are bundled in a fluid-permeable material, or the microspheres are contacted by the surface tension of a fluid that passes through the microsphere, eg, plasma. Maintained in relationship. According to yet another aspect of the present invention, microsphere beads, also known simply as microspheres, are dried on the surface of the device.
[0026]
According to another aspect of the invention, the device has a sample shelf proximate to the fluid inlet and the microspheres are disposed on the sample shelf.
[0027]
According to yet another aspect of the invention, the apparatus has a plurality of small microspheres, the small microspheres occupy the interstices between the large microspheres, and the gap between the large microspheres. As the fluid flows through the space, a plurality of large microspheres are impregnated with at least one interspersed so as to release the label into the fluid. There may be a plurality of small microspheres, each impregnated with a different label and interspersed with large microspheres in different zones of the large microsphere. Alternatively, the small microspheres are mobile and may be transported forward by the fluid as it passes along the capillary channel formed by the large microsphere.
[0028]
In accordance with another aspect of the invention, the device has an indicator that includes patient identification information associated with the assay results, eg, a bar code that can be read by a bar code reader.
[0029]
In accordance with another aspect of the present invention, a method for separating fluid from a biological sample is provided. The sample is a fluid component and a non-fluid component, and the method includes the following steps. That is,
(A) bringing the sample into fluid communication with a plurality of microspheres arranged in contact relationship and forming a plurality of interstitial spaces connecting therebetween to form a capillary channel; and
(B) collecting fluid components as they are separated by capillary flow of fluid components through the capillary channel;
[0030]
According to another aspect of the invention, an apparatus comprising a capillary chamber defined by first and second opposing surfaces spaced apart by a capillary distance and having a fluid inlet and at least one reagent disposed within the capillary chamber. A method for performing an examination using the method is provided, and has the following steps. That is,
(A) directing the fluid sample into fluid communication with the fluid inlet so that the fluid sample is drawn into the capillary chamber by capillary action and reacts with the reagent; and
(B) Analyze the reagent to determine whether the reagent binds to the analyte in the fluid sample.
[0031]
According to another aspect of the invention, the method further comprises analyzing the reagent to determine the proportion of the reagent that binds to the sample.
[0032]
According to another aspect of the invention, the method further comprises a plurality of capillary chambers for performing a plurality of assays on one or more fluid samples. According to another aspect of the invention, test results are recorded in a computer database and can be applied to a trained neural network algorithm to further generate one or more selected fault profiles. The test further comprises applying a receiver operating characteristic analysis to the data to determine the statistical significance of the data.
[0033]
According to another aspect of the invention, a wick or capillary is brought into fluid communication with the fluid sample to remove the fluid sample from the capillary chamber.
According to another aspect of the invention, the microspheres are used to separate cytoplasmic components from fluid components in biological fluids, such as plasma from whole blood. The fluid component can be examined with a chromatographic test strip. Furthermore, the microsphere beads of the present invention can be used as a labeling device in addition to a filtration device in standard chromatographic assays.
[0034]
In accordance with all aspects of the invention described herein using uniform microspheres of defined shape and size, the microspheres may be of different sizes and / or as described further below, and / or It could be replaced by non-uniformly shaped particles. For example, silica sand could be used to replace polystyrene microsphere beads. Other suitable particles may be those known to those skilled in the art who benefit from the present description.
[0035]
Other and further details of this preferred embodiment are set forth in the detailed description of the preferred embodiment described below in conjunction with the drawings.
[0036]
For the purpose of illustrating the invention, there is shown in the drawings a presently preferred form. The present invention is not intended to be limited to the detailed arrangement and instrumentalities shown. The present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, wherein like reference numerals designate like parts throughout the several views.
[0037]
Detailed Description of the Preferred Embodiment
The present invention relates to a method for separating fluid components from a biological sample using microsphere beads or other suitable particles. The invention further relates to an apparatus and method for analyzing the presence or absence of an analyte in a biological fluid sample. The invention also relates to precisely metering one or more analytes present in a biological fluid sample in one embodiment. On the other hand, the present invention can also provide qualitative results as well as non-quantitative results. The present invention further relates to assays that can describe test results and that can be used to identify medical conditions that humans or animals will or will have in the future. The present invention further relates to a prognostic sign test technique in which the results of a test test defined in the present invention can be used to predict the probability of a human or animal developing a certain condition or medical condition in the future. These various embodiments are now described in detail.
[0038]
Although the preferred embodiment described herein is described with respect to testing human biological samples, such assays and methodologies could equally be used to test biological samples from other animals. Is well understood. In particular, the present invention will obviously have applicability in veterinary practice. Furthermore, as used herein, the term fluid sample is intended to be broadly interpreted to include other samples having fluid portions that can be separated by suspension or fluid flow and / or capillary action.
[0039]
In biological fluid samples having a fluid component that includes the analyte of interest and a non-fluid component, the present invention can be used to measure any of the following, alone or in combination.
a) Presence of the analyte in the sample
b) Absence of analyte in the sample
c) Analyte concentration in the sample
d) The total amount of analyte in the sample.
[0040]
Suitable analytes that can be measured by the assay method and apparatus of the present invention include, but are not limited to: That is, enzymes, proteins, bacteria, viruses, antigens, antibodies, immunoglobulins, drugs, and hormones. Other suitable analytes are known to those skilled in the art. The assay and device of the present invention is for the detection and measurement of drug of abuse in human biological samples such as performance enhancing drugs or other street drugs. Useful.
[0041]
Some biological samples can be assayed without first separating the cytoplasmic component, but in the case of blood, for example, the cytoplasmic component interferes with the assay. In the case of biological samples where it is necessary to remove the cytoplasmic component prior to the assay or for the preferred biological sample, it is first necessary to separate the fluid component from the cytoplasmic component. For example, in the case of blood, it is necessary to separate the plasma from the whole blood so that the cytoplasmic component of the blood does not interfere with the examination of the analyte present in the plasma.
[0042]
Surprisingly, it has been recognized in the present invention that the fluid component of a biological sample can be separated from its non-fluid component by applying the sample to a grouping of microsphere beads. When the sample is applied, the fluid component flows between the microsphere beads, thereby separating it from the cytoplasmic component in a simple and effective manner. When the beads form a group, the beads act as a means to separate the fluid components from the non-fluid components as they move by capillary action through the space formed between the beads. Thus, in the case of blood, plasma is separated from cells in the blood sample. Surprisingly, it has been recognized in the present invention that microspheres have the ability to quickly and effectively separate plasma from whole blood.
[0043]
For the purposes of this patent application, the spaces between the beads are called “interstitial spaces” or “pores”. It is believed that fluid flows by capillary action from one gap space to the next.
[0044]
In the present invention, the flow of fluid passing through the interstitial space between beads is likened to the flow along the channel formed by the space between beads. A channel is referred to as a “capillary” channel because the fluid appears to flow between the beads by a “capillary” action.
[0045]
When the microspheres form a group, a small space or interstitial space is formed between the microsphere beads. The size of the space formed between the microsphere beads is a function of the radius of curvature of the microsphere. For the purposes of the present invention, the radius of curvature is the same as the diameter of the microsphere. In order to understand the relationship between the size of the microsphere beads and the size of the pores formed between the beads, the ratio of the microsphere diameter to the pore diameter is known to be approximately 1 to 0.4. Yes. When plasma is completely separated from whole blood, a pore size of 4 μm is considered optimal. Therefore, the bead size for this particular embodiment should be 10 μm. This results in easy fluid flow (and thus faster fluid flow), while the cells are still prevented from passing through the pores. The small space formed between the beads gives some capillary action when fluid is present.
[0046]
Surprisingly, it has been discovered that non-uniformly sized and shaped particles work as well in accordance with the principles of the present invention, as taught herein. A specific example of non-uniform particles is described in Example 7 below. It will be appreciated that the following description of microsphere beads teaches principles that are also applicable to the use of other similar separated particles such as silica and other equivalents.
[0047]
In the present invention, red blood cells and white blood cells in the blood remain on one side of the bead, while the plasma portion of the blood sample passes through the bead by capillary action along the interstitial spaces or pores formed between the beads. Use is an effective and inexpensive means for separating plasma from whole blood. The capillary action observed in the present invention is believed to be related to the surface tension acting on the fluid by the microspheres to draw the fluid forward. Since the fluid is drawn forward between the microspheres, it provides the additional advantage of imparting mobility to any reagent present in the microsphere region. For example, the microsphere layer will be impregnated with a secondary antibody or another detection molecule.
[0048]
The microsphere beads act effectively as a fluid filter and can be used at any point in the assay where simple fluid filtration, separation, or partitioning is required. Since microspheres are believed to act by capillary action to filter, separate, or partition fluid components from non-fluid components, microsphere filters can be referred to as capillary filters, and the term Used here for that purpose. Capillary filters are dynamic filters in the sense that they are seen moving under a microscope during the segmentation of fluid components. Some beads move and others remain stationary, but the overall movement of the beads is observed microscopically. It is expected that the movement of the beads will close some capillary channels and others will open. In this sense, the capillary channel will be transient. The interstitial space between the bead and particle is also expected to exhibit the same transient due to the movement of the bead or particle during the fluid segment.
[0049]
The microspheres could have analyte specific antibodies bound to them, for example by absorption or coupling. Since fluid containing plasma passes through the capillary channel formed by the microspheres, the analyte has mobility to the secondary antibody contained on the microsphere and then reacts with the primary antibody contained in the biochip. Will. However, the microspheres simply act to separate the cytoplasmic component from the fluid component and the microsphere need not be labeled with the antibody.
[0050]
The prior art uses chromatographic paper or other fibrous material to perform biological tests from a cytoplasmic component to perform a test on a fluid portion without being disturbed by cells or other substances present in the sample. The fluid component of the sample was wicked. It provides an advantage over the prior art because the microspheres of the present invention provide improved fluid flow without the constraints due to fibers present in chromatographic paper. Microspheres offer the additional advantage of providing an excellent surface for the binding of proteins such as antibodies or other suitable labels.
[0051]
The size of the microsphere beads used to separate the fluid components can vary based on the viscosity of the sample. Larger beads should be used for higher viscosity samples for faster fluid flow between beads. Also, different colored beads can be used to facilitate bead visualization when they are used as labels and bind to analytes. The bound beads also serve to increase the density of any bound analyte for subsequent detection by the spectrometer. The regular pattern of beads also means that a diffraction difference can be used for detection and measurement of bound beads.
[0052]
The biological sample can be applied to the top of the bead or to the side of the bead.
[0053]
In a preferred embodiment, latex microsphere beads such as those sold under the trademark Bang's are used. The beads are supplied in a fluid suspension. The beads can be kept wet or dry during use. Other types of beads, including glass, could be used with the present invention so long as the beads separate fluid components.
[0054]
Using microsphere beads to quickly separate fluid components from a biological sample can be incorporated into an assay that detects and measures the analyte present in the sample.
[0055]
According to one aspect of the invention, a method for separating a fluid sample from a biological sample using microsphere beads is for analyzing one or more analytes that may be present in the fluid sample. In one-step assay. The assay is performed in conjunction with a defined volume chamber. In a preferred embodiment, the chamber has microsphere beads that separate the fluid sample and detection means for detecting and / or measuring the analyte in the sample. The detection means can be derived from any of a variety of known methods for detecting an analyte in a sample. For example, the analyte can be recognized using a detection protein such as an antibody or antigen specific to the analyte. When the analyte binds to the detection protein, it can change density and measure. Alternatively, the detection protein can be bound to another label that can be detected. For example, the detection protein may be attached to a small bead so that the density increases when the detection molecule binds to the analyte and this is detected or measured. Other suitable labels will include metals such as gold, fluorescent labels, chemical labels or colorimetric labels.
[0056]
According to one embodiment of the invention, the invention is a point-of-care diagnostic or prognostic in the form of a small chip or cassette used for the assay of biological samples such as blood. Related to inspection. The present invention teaches a small and compact assay device called a “biochip” for simple assays taught by the present invention.
[0057]
In the device of the present invention, two carrier surfaces (carriers) are used to define a specific volume from which a quantitative measurement of an analyte present in a droplet of blood, urine, saliva or other biological fluid can be measured. surface). In preferred embodiments, the surfaces in question are cover slips and microscope slides, but the invention is not intended to be limited to these specific embodiments only. An important aspect of the present invention is the fact that a fluid sample enters a defined volume of space by capillary action. Therefore, the defined space is referred to herein as a capillary chamber. In the case of a microscope slide and a cover glass, the capillary chamber is the volume of space between the cover glass, the bottom surface, and the top surface of the slide.
[0058]
According to a preferred embodiment of the present invention, the amount of fluid present between the plates or slides is determined by the volume of the space between the slides. Thus, in some cases, a small inspection system can be designed that takes into account a very small volume close inspection of a few microliters.
[0059]
It is advantageous to have the same test volume of the fluid sample each time an assay is performed to quantitatively measure the concentration of the analyte in the sample and compare the test results from one test with another It is. In this way, the analyte measurement can be evaluated directly without having to make adjustments for the variable volume. The concentration or amount of the analyte can be directly assessed without difficulty and with the same identity from test to test. The biochip chamber of the present invention provides its defined volume.
[0060]
According to one aspect of the invention, the fluid volume in which the analyte measurement is performed is standardized. According to another aspect of the present invention, it is possible to carry out these tests only with a drop of blood, for example from a finger stick, rather than requiring a large volume only possible by taking tubular blood through a needle. As the most practical, a method is provided for separating plasma from blood cells in a very small blood volume.
[0061]
In a preferred embodiment, the biochip testing device has a determinable volume chamber. The chamber is defined by first and second opposing carrier surfaces. The surfaces are placed so that they are separated by a narrow enough distance for fluid to flow between the two surfaces by capillary action. The chamber has a defined volume such that it forms a defined space. The chamber has one or more fluid inlet locations for receiving a fluid sample. In this specification, the chamber is also referred to as a capillary chamber because the fluid flows in by capillary action.
[0062]
For the purposes of the present invention, this arrangement of two carrier surfaces joined together is called a “biochip”, but will also be known as a cassette or cartridge.
[0063]
The intent is to provide a compact portable inspection system that can be standardized. In a particularly preferred embodiment, for example, the bottom surface is a microscope slide and the top surface is a microscope cover glass. Microscope slides and cover slips are readily available and are therefore useful carrier surfaces. In another example, one of the two microscope slides can be placed on the other. Any plate can be used, as long as it has a determinable volume defined space through which the fluid flows by capillary action.
[0064]
Upon entering the capillary chamber, the fluid sample is held by surface tension at the ends and edges of the two surfaces. The device is portable in small size, it can be inserted into the analyzer, and the reaction products between the analyte and the detection molecule are measured using the analyzer. For purposes of describing certain preferred embodiments, the carrier surface is referred to as a plate. However, the present invention is not limited to only flat plates. Similarly, all types of surfaces capable of binding proteins, antigens and other detection molecules are considered within the scope of the present invention. In particular, the composition of the carrier surface includes but is not limited to glass, plastic and metal.
[0065]
In a preferred embodiment of the present invention, a biological sample droplet is placed on the upper surface of the microscope slide, and the cytoplasmic component of the sample is removed by the movement of fluid components through the group of microsphere beads before entering the capillary chamber. The For example, in the case of blood, plasma is separated from the cytoplasmic components of the blood by movement through capillary channels formed by the interstitial spaces between the beads, and the fluid then enters the test chamber where the analyte reacts with the reagents in the chamber. The reaction product is a measurement of the analyte present in the sample.
[0066]
Once the fluid enters the defined space, it is exposed to one or more reagents present on the inner surface of the carrier surface. Reagents are thus exposed to the capillary chamber and are available to react with one or more analytes that will ultimately be present in the fluid sample that fills the capillary chamber. The reagent is labeled and the amount of analyte present in the fluid sample is measured based on the reaction product resulting from the interaction of the analyte in the sample with the reagent in the chamber. The test results are then compared to a standard calibration to determine the amount of analyte present in the sample. In a preferred embodiment of the invention, the reagent is preferably one or more analyte specific antibodies that are attached to the carrier surface by protein printing.
[0067]
Alternatively, in another embodiment, the antigen is present on the inner surface of the carrier surface and the amount of antigen specific antibody in the sample is measured. When bound to the carrier surface, proteins or other detection molecules protrude into the defined space where they can react with the analyte in the sample. Detection molecules present on the inner surface of the carrier surface may be bound to the surface in any one of a variety of ways known by those skilled in the art.
[0068]
The detection molecules are coated, printed, or otherwise bound to one or the other plate using one of a variety of techniques well known to those skilled in the art. Numerous techniques for immunoassays are known to those skilled in the art and are described, for example, in “Principles and Practice of Immunology” (1997) by CPPrice and DJ Newman eds. (StocktonPress), which is here Are incorporated by reference into this patent application and are incorporated herein by reference in their entirety.
[0069]
The distance between the two plates is limited only by the plate's ability to effectively draw fluid, such as plasma, between the two plates by capillary action and hold the fluid in a defined volume. The size of the plate used will also be determined by practical considerations such as the desired volume of inspection. Larger surface area plates will produce larger volumes.
[0070]
According to the present invention, a fluid sample, such as a blood drop, is placed on one edge of two plates and drawn into a space defined between the plates. The fluid sample will be drawn against the edges of the two plates by a number of means known to those skilled in the art. In its simplest form, the sample is brought into direct contact with the edge and drawn into the space such that a portion of the fluid sample completely fills the defined volume of space. For example, by bringing the patient's finger into contact with the plate. It is important for this assay that the sample always completely fills the specified volume so that appropriate quantitative analysis can be performed. In a standardized model, the volume will be constant from one biochip to another.
[0071]
In another preferred embodiment, the plates are coupled together so that the fluid sample can be easily removed. For example, it is coupled at the end opposite to the fluid inflow point.
[0072]
In another example, the space between two plates will be divided into lanes, and the volume of each lane will be known as well. This approach will result in multiple tests on a single sample.
[0073]
When dealing with blood samples where it is desired to measure plasma protein, it is necessary to separate the plasma from the cells. In the present invention, it is desirable that the test results be available in a short frame from the beginning to the end, preferably on the order of 1 to 30 minutes. An advantage of the present invention is that the use of microsphere beads to separate plasma from a blood sample eliminates the delay that would occur, for example, using glass fiber or chromatographic strips, so that the fluid sample is preceded. It means that the inspection chamber is entered in a shorter time than the technical verification. Troublesome equipment such as a centrifugal device is not necessary for cell separation. All of which facilitate testing performed at point-of-case.
[0074]
Since the biochip device of the present invention allows various assays to be performed on a single sample, the present invention has further advantages over the prior art. This facilitates the speed with which test results are obtained and minimizes the amount of sample required for testing.
[0075]
Analyte-specific antibodies themselves can be labeled with any one of a variety of labels known to those skilled in the art of such assays. Examples of preferred labels include fluorescent labels, colorimetric labels, other microspheres, gold particles or any high contrast molecule. Other labels will be appropriate as long as the presence of the label can be detected. Similarly, microsphere beads having a smaller diameter than the test beads can be used such that the small beads are passed through the large beads by movement of a fluid sample (eg, plasma). Small beads can be labeled accordingly.
[0076]
When the fluid sample containing the analyte enters the defined space between the two plates, further antibody-antigen reaction will occur. In the present invention, the top plate, eg, a cover glass, has an analyte specific reagent bound on a surface that contacts the fluid. In a preferred embodiment of the invention, the analyte specific reagent is printed on the inner surface of the carrier plate using a protein printer. Appropriate protein printing equipment is well known in the market. These include ink jet, spray, piezoelectric or bubble jet protein printers. A piezoelectric printer is preferred. The analyte identifying reagent generally acts as a detection molecule that is a protein. These molecules attach to glass, metal and plastic surfaces. Preferred surfaces include polystyrene or polypropylene. The use of such a printing device plates or covers a variety of different analyte-specific detection molecules so that different “lanes” are defined and different analytes can be evaluated simultaneously using a single fluid sample. It is advantageous in the present invention for printing on glass. Additional background and calibration lanes are provided in the same inspection chamber.
[0077]
After the analyte has reacted with the analyte specific detection molecule, a measurable reaction product will be created. The biochip carrier surface is colorless or colorless so that colorimetric, or fluorescent, or other reaction products can be read using a suitable spectrometer or other suitable detector connected to a reader. It is preferably transparent. When the analyte and the analyte specific detection molecule react with each other, a change occurs in the density of the reaction lane. In the preferred embodiment of the invention, the change in density is measured to determine the amount of analyte present in the sample. In order to reduce background noise and thus increase assay sensitivity, a mask is provided according to a preferred embodiment of the present invention. Referring to FIG. 1, mask 32 is made of an opaque material except for

openings

36, 38 and 40 corresponding to

lanes

26, 28 and 30 on the plate. The mask is designed to fit properly on the top plate 10 so that only the lane itself can be read. The use of a mask has the advantage of reducing the amount of background noise and setting a baseline value when reading density changes in the lane.
[0078]
In a preferred embodiment of the invention, the biochip is designed to be read by a portable spectrometer that reads the color change after the analyte has reacted with the labeled antibody, for example. The spectrometer will also be able to read changes in density, film thickness, mass adsorption or diffraction depending on the test reagent used. Once an analyzer, such as a spectrometer, has performed the necessary data calculations, the results can be transmitted digitally over a telephone line or by a mobile phone or other computer network system. Alternatively, changes that occur between antibody / analyte reactions can be detected or measured by changes in radio frequency if a radio frequency sensor is incorporated into the biochip detection system.
[0079]
Returning to FIG. 1, a preferred embodiment of the biochip of the present invention is illustrated in schematic exploded perspective view. Two

carrier plates

10 and 12 are provided. The two plates define a fixed volume between them as indicated by reference numeral 14. The lower plate 12 may be longer than the upper plate 10 to provide a shelf that acts as an application zone 16 over which the biological sample 18 can be applied. The shelf is not essential to the present invention, but provides a place where samples are separated by microsphere beads. It is possible that the beads can be placed at the entrance of the capillary chamber 14 within the boundary of the plate, and that the sample will be applied to the edge of the biochip that enters the chamber by capillary action.
[0080]
The application zone 16 is also attached with a collection of microsphere beads 20 that may or may not include a labeling zone 22. The microsphere beads 20 can be grouped or bundled using a fluid permeable material. To simplify FIGS. 1 and 2, the microsphere beads 20 and the label zone 22 are illustrated as separate defined areas. However, microsphere beads can bear their own label. In this embodiment, the two zones are grouped together so that the microsphere beads serve two roles: separation of the fluid and indication of the label to which the fluid is exposed.
[0081]
One or more sized microsphere beads may be present. In one example, small microspheres could lie in the interstitial space formed by large beads. The small bead could carry a secondary label that would bind to the analyte as it passed through the bead. The label will bind to the analyte in the fluid, or the label attached to the small bead will adhere to the analyte in the fluid, and the small bead will then migrate with the fluid into the capillary chamber. Let's go. At the same time, no cytoplasmic components in the fluid sample will pass through the microsphere bead filter.
[0082]
The patient ID is attached to either

plate

10 or 12 as long as it does not interfere with the test detection area on the biochip or the analyte does not interfere with the biochip reading after reaction with the substance bound to the carrier plate surface. May be.

Plates

10 and 12 are preferably colorless and / or transparent.
[0083]
Three

detection areas

26, 28, 30 are printed on the inner surface of the carrier plate 10, namely the calibration printing zone 26, the detector printing zone 28 and the reference line printing zone 30. Three detection zones or zones are drawn for illustration only to illustrate how a single biochip is established. However, various lanes can exist and the number of lanes shown in the calibration and / or background can vary depending on what is being examined.
[0084]
The inspection is not limited to only three lanes. Various lanes can be defined. In the preferred embodiment of the present invention, three lanes are printed on one plate for background reading evaluation and biochip calibration. It will be appreciated that the background and calibration detection zones need not all be on the same biochip. It is advantageous to have a background and calibration reading on the same sample carrier plate that is being assayed as the test analyte, thereby reducing variations in test results.
[0085]
A background mask 32 is optionally provided. The mask is designed to cover the outer surface of the carrier plate 10 without blocking the coated or printed detection zones / lanes. Thus,

openings

36, 38 and 40 are present in the mask to reduce background interference, for example when reading inspection results. The background mask is made of an opaque material with

openings

36, 38 and 40 corresponding to the

detection zones

26, 28 and 30 identified on the inner surface of the top plate. The mask opening 40 need not have a corresponding test zone 30 as shown, as long as the opening 40 is exposed to a portion of the plate 10 where no reagent is present.
[0086]
FIG. 1 illustrates both the antibody / label zone 22 and the microsphere 20, both of which are optional depending on the type of test selected to be performed. When the fluid sample 18 is applied to the application zone 16, it reaches the edge 34 where the two

plates

10 and 12 first meet before it reaches the antibody / label zone 22 (if present), and the microspheres. Flow through bead zone 20 (if present). In the schematic diagram of FIG. 1, there is a gap between the microsphere beads and the fluid entry point identified by the edge 34. This arrangement of the present invention will work, but it would be most preferred if the microsphere bead zone 20 and / or the label zone contacts the edge 34 of the carrier plate 10. One example of such a configuration is illustrated in FIGS. This configuration provides the minimum distance traveled by the fluid sample, which further minimizes the amount of fluid sample required for testing and is described in more detail in Example 1.
[0087]
A fluid sample is drawn into the chamber 14 that defines a known volume under the edge 34. The fluid sample should pass through the microsphere and label zone along the application zone 16 and be of sufficient volume to completely fill the chamber 14. The biochip of the present invention can be scaled to a small size so that a single droplet of blood can be of sufficient sample size for testing. Many dimensions can be constructed based on the principles taught herein. The dimensions of 1 cm x 3 cm make a convenient sized device, but the nature of the inspection to be done will dictate the optimum chip size. As illustrated in FIG. 1, the shelf portion 16 extends over the bottom plate. A biological sample can be applied on the shelf portion. In other embodiments, for example, the test portion held on the microscope slide may be large, but the test assay itself located on the slide is very small. The assay can be miniaturized to accommodate a sample fluid volume as small as about 1 microliter.
[0088]
FIG. 2 is a cross section taken along line 2-2 illustrating the same elements as referenced in FIG. 2A is an elevational view of the end of FIG. 2 along line 2A-2A illustrating that the end of the device can be opened so that fluid is removed from the chamber. Some people may want to remove fluid from the chamber, for example, if they want to test all samples. A suitable core material is applied to the open end, fluid is drawn by the core, and additional fluid enters the chamber. This can be either a continuous or discontinuous process.
[0089]
1, 2 and 2A all illustrate spots of adhesive 58, which is one way of holding

plates

10 and 12 together. The adhesive 58 is also illustrated in FIG. 6, which is another embodiment of the present invention.
[0090]
Figures 7 and 7A illustrate another use of the microsphere method of separation in a one-step assay. In this example, microspheres are used with chromatographic paper. Biological sample 18 is placed on a surface such as microsphere slide 52 '. It can be placed directly on or near the microsphere beads 50 (as shown). The fluid component of the sample then flows through the beads 50 and separates from the non-fluid components present in the sample 18. The beads are in contact with or in close proximity to the glass fiber filter pad 60 that contacts the marking pad 62. The label pad 62 is a glass fiber pad impregnated with the label to label an analyte in a normal fluid sample. The fluid flows through the filter 60 and the sign pad 62. Any analyte present in the fluid will be labeled as it flows through the label pad. The fluid then flows into the nitrocellulose chromatographic piece 64 where the test results are usually read as a color change or band on the nitrocellulose piece. Alternatively, since the microsphere 50 is used as a filter, the glass fiber filter 60 can be completely removed (not shown).
[0091]
Finally, as illustrated in FIG. 7A, the glass fiber pad 62 can be replaced with microsphere beads 66. In this case, the bead 66 acts as a source of label rather than as a filter, and the glass fiber filter 60 'serves as a spacer between the two sets of

beads

50 and 66, respectively. For applications where fluid component filtration is not required, the microsphere 66 can be used to directly label analytes present in the fluid without the need for the microsphere filter 50 or the glass fiber filter 60 '.
[0092]
Figures 7 and 7A illustrate how current assay methodologies can be modified using the inventive microsphere bead technology taught herein.
[0093]
The assay devices and techniques of the present invention are very useful in that they can be used for many types of small volumes of fluid samples. Although the description specifically refers to proteins, any number of other markers would be appropriate as long as the labeling system can be devised for marker detection and measurement in the system. For example, the present invention could be used to measure and / or detect microorganisms such as bacteria, viruses, fungi, or other infectious organisms. The biochip device of the present invention can be calibrated for assay type and analyte type so that a table of standard values can be constructed. The assay system of the present invention can detect the level of particular hormones or even the amount of drug in a patient system, and this standardized data can be used to make diagnostics and / or prognostic signs for a given individual.
[0094]
Once the table of standard values is constructed, the data is modified in a database constructed based on normal work and the patient's medical history, current health status and test results. Optionally, the data can be transmitted by a digital transmission system on a computer network via a modem, the Internet, cable lines, telephone lines, satellites or other similar technologies. These databases can be used to develop neural network algorithms that evaluate current patient test results and diagnoses and predict certain health outcomes for a given individual. One example of a neural network algorithm is found in Example 3 below, and a sample receiver operating characteristic curve (ROC) is illustrated in FIG.
[0095]
The development of an algorithm for the applied neural network will be a function of the medical condition being evaluated. A large amount of patient data would have to be accumulated in order to have a reliable predictive outcome initially. The neural network can be trained to recognize diagnostic or prognostic analyte enrichment using the standardized assay of the present invention. Data and algorithms are encoded on an electronic chip placed in a reader, such as a spectrometer, so that the printed output from the reader provides test results and also identifies special diagnostic or prognostic signs. In a neural network algorithm, diagnostic or prognostic signs will be optimized as the number of data points increases. The more patient data the more predictive and / or diagnostic results will be made with greater certainty. Percent certainty can be calculated and given to the physician or technician based on the analysis of the measured data by comparison with a database stored in an electronic memory chip provided in the analyzer provided. Current technology allows the reader to display the actual standard curve at the time of printing out the test results.
[0096]
In addition to using a spectrometer, and in accordance with another aspect of the present invention, the biochip has a radio frequency sensor incorporated into the carrier plate 10. When a reaction occurs in one or more detection zones, there is a measurable change in radio frequency, and the presence or absence of the reaction is detected by detecting this change in radio frequency using an appropriate radio frequency change detector. Can be measured or detected.
[0097]
In the present invention, more than one test can proceed simultaneously on the same biochip, thus improving the certainty of diagnosis or prognostic signs. As the number of markers increases, the certainty of the measurement also increases.
[0098]
One of the many examples of use of the biochip / cassette of the present invention is to measure blood proteins indicative of peripheral vascular disease using a drop of blood from a patient.
[0099]
The microspheres were observed under a light microscope during the separation / filtration step while the fluid portion of the sample was separated from the non-fluid portion. It was observed that some microspheres were in motion and others remained stationary. Separation is dynamic and the action of the beads or particles during separation is a dynamic capillary action. The separation or extraction of the fluid part is instantaneous.
[0100]
The present invention is also applicable to small particles other than the microsphere beads described herein. In particular, the separation technique of the present invention is also able to use non-uniform particles including silica-based particles such as sand particles, and these particles are not necessarily spherical and have a uniform size as shown in Example 7 below. Otherwise it works.
[0101]
As shown in the examples described herein, suitable separation / filtration using heterogeneous and / or non-spherical particles or beads can be achieved. Heterogeneity slows the separation somewhat and makes it less efficient, but at least for qualitative assays, effective separation is still achieved.
[0102]
For example, in Example 7 using, for example, sand grains, the separation is equally efficient because less organisms are separated from the sample in the same time period as the separation using the microsphere beads described in Examples 4, 5 and 6. Does not seem to occur. However, the organism is successfully separated and can be further examined or assayed accordingly. The use of silica or other similar particles is advantageous for microsphere beads because they are inexpensive and readily available in undeveloped and developing countries.
[0103]
The assay and apparatus of the present invention identifies the presence of harmful and pathogenic bacteria in certain biological samples such as microorganisms such as E. coli strain O157: H7, Salmonella, Listeria, Chlamydia and other bacteria and viruses. It is particularly useful for. For example, the assay of the present invention can be used to test food samples for certain pathogens. They could also be used in human or veterinary medicine for the diagnosis of infectious diseases.
[0104]
The dynamic separation caused by the methodology taught in the present invention is illustrated in FIGS. 9-18 and Examples 4-7.
[0105]
From this example, the microsphere beads of the present invention can generally be generalized to particle phenomena, and the present invention is not limited to spherical beads. Rather, it uses particles of sand in the filter on the biochip and contains particles of non-uniform size and shape as illustrated in FIG. It is expected that quartz sand will be a much cheaper choice than microsphere beads available on the market and thus will allow wider use of this technology. Separation of bacteria using quartz sand has been less efficient, for example, with fewer bacteria being isolated within the same time frame, but it is sufficient for many applications.
[0106]
Another advantage of using silica-type particles is that silica is known in the art to selectively bind proteins and nucleic acids. Silica-based separation particles could be used to devise certain protein and / or nucleic acid arrangement mechanisms.
[0107]
In all of Examples 4-7, the separation was almost instantaneous and the particle size limitation was limited by the bacteria, microorganisms or other analytes that were desired to be isolated. It is expected that one skilled in the art will know what size of particle to select based on the type of bacteria present in the sample. If the bacterium is unknown, one skilled in the art will pick the particle size based on the expected expected size, and select the bead size generally according to a ratio of 0.4 to 1 as described above Will.
[0108]
Further details of the preferred embodiments of the present invention are illustrated in the following examples, which are understood to not limit the scope of the appended claims.
[0109]
Example 1: Confirmation of plasma flow and separation of plasma from human whole blood
As schematically shown in FIGS. 3 to 6, about 15 microliters of 10 μm latex microsphere beads (manufactured by Bang (registered trademark)) 50 were dropped onto a slide glass 52 and dried. The cover glass 54 was put on the slide glass, and the dried beads were pushed along the slide glass at the end. As a result, the dried beads moved away from the slide glass, and the aggregate of the dried beads was warped to generate the curved portion 56. The cover glass was placed on a slide glass with its end in contact with the “curved portion” (shown in FIGS. 5 and 6). The cover glass was fixed in an orderly manner with one end of the cover glass parallel to the end of the curved portion of the dried bead, and the end was kept open. This is to allow fluid to flow through the bead portion and into the capillary chamber formed between the cover glass and the slide glass. The cover glass was adhered with nail polish at the corner 58 of the cover glass and securely fixed to the slide glass. Since the cover glass was fixed at a portion where the capillary action was not intended to occur, the fluid could flow freely under the cover glass.
[0110]
20 microliters of human whole blood 18 was placed on the remaining 5-10 microliter microsphere beads. In other words, a human whole blood sample is placed on the remaining part of the bead that does not constitute the curved part, and the plasma component is freely moved through the curved part of the microsphere bead by capillary action. It was made to flow in the space (capillary chamber) formed between the two. This effect was observed with a binocular optical microscope. As soon as the blood sample is attached to the beads, the plasma separates from the whole blood and begins. As the bend is infiltrated into the plasma, the capillary action between the cover glass and the slide glass causes a pure, transparent, blood-free plasma to flow between the cover glass and the slide glass formed under the cover glass. Was drawn into the space. This chamber forms a known space with a predetermined volume that can be calculated.
[0111]
This shows that the microsphere beads can easily and effectively separate plasma from whole blood and be directed into the capillary chamber through capillary channels formed between the microsphere beads.
[0112]
Example 2: Microsphere separation in combination with chromatographic strips
Regarding the assay of analytes in human whole blood samples, this example (shown schematically in FIG. 7) illustrates the use of plasma microsphere separation from human whole blood blood samples. Plasma was separated using latex microsphere beads (Bang®) 50 and then directed to standard nitrocellulose chromatography strips.
[0113]
Approximately 20 microliters of 10 μm latex beads were placed on a glass fiber pad commonly used to hold red blood cells in the prior art. One drop (about 60 microliters) of human blood was placed on the surface 52 'in contact with the latex microspheres. The glass fiber pad 60 effectively functions as a spacer between the bead 50 and the marker pad 64, and can also be used as a second filter. The glass fiber filter 60 may be completely removed, in which case the microsphere beads 50 directly contact the marker pad 64 (not shown).
[0114]
Blood infiltrates the deposited beads and clear plasma reaches the nitrocellulose chromatography strip within about 2 minutes. This was observed with the naked eye and under a microscope. From this example, it can be seen that the microsphere separation method of plasma from blood can be used with standard nitrocellulose chromatography strips. Clearly, therefore, this method is a useful method for separating plasma from blood in such a test method using chromatographic strips.
[0115]
Another example is shown in FIG. 7A. In this case, microsphere beads 66 are used in place of the glass fiber labeling pad 62 as the labeling area of the test apparatus. The glass fiber filter pad 60 ′ is used as a spacer between the two sets of

beads

50 and 66.
[0116]
Example 3: Marker analysis by neural network
The neural network is a mathematical function N (W, a) that receives an analyte vector a = a (a1, a2,..., An) and outputs a value between 0 and 1. The weighting parameter W is adjusted using the training pattern {p = (b1, b2,..., Bn, T)} during the training period. Here, b1,..., Bn are training protein vectors, and T is a target output value. In the case of a clotting test, T is 1 for clotting and 0 for non-clotting.
[0117]
Parameter W is an error while maintaining good performance for new test data

Adjust so that is minimized.
[0118]
Once network training is complete, select network cutoff C to classify the test data. The test result for the test vector a, the given cutoff value C, and the target output T is TST (C, b, T).
{1 (when N (a)> C)
TST (C, b, T) = {
{0 (other cases)
In this case, the sensitivity and specificity of the test can be analyzed.
True and positive (True Positive) when T = 1 and TST (C, b, T) = 1
False and positive (False Positive) when T = 0 and TST (C, b, T) = 1
True and negative (True Negative) when T = 0 and TST (C, b, T) = 0
False and negative (False Negative) when T = 1 and TST (C, b, T) = 0
Sensitivity = TP / (TP + FN)
Specificity = TN / (TN + FP)
If the relationship between sensitivity and 1-specificity is plotted against various cutoff values, a ROC (receiver operator characteristic) curve is obtained.
[0119]
neural network
Start with a set of training patterns {p = (I1, I2,..., I1, TAR)}. Here, Ij is an input value, and TAR is a target value (TAR = 0 or TAR = 1). Thus, the neural network is trained to output a value close to the target value.
[0120]
The neural network has three layers. That is, the first input layer, the second hidden layer, and the third output layer.
[Chart 1]
Input layer Back layer Output layer

[0121]
Neurons are connected by a set of weights {w (i, j, k)}. For example, w (1,2,4) connects the second neuron in the first layer to the fourth neuron in the second layer.
[0122]
For each pattern, a number called activation for each neuron is assigned. This is an indicator of the probability of firing. The degree of activation is defined recursively as follows.
{Ij (when i = 1)
a (i, j) = {
{1 / (1 + exp (-sum (k) {w (i-1, k, j) a (i-1, k)}))
[0123]
The error is
ERMS = SQRT {sum {(ta (2,1)) ^ 2}}
Is calculated as Here, the sum is taken over all patterns.
[0124]
The weighting is adjusted to minimize ERMS while maintaining good performance for new data.
[0125]
[Chart 2]

[0126]
Example 4: Isolation of lactobacilli from yogurt
About 10 microliters of yogurt containing Lactobocillus was placed on the assay device according to the present invention (referred to herein as “biochip”). In the absence of separation beads on the biochip, solid particles were observed in the field of view (in addition to lactobacilli present in yogurt), as shown in FIG. Prior to separation, only a few bacteria were seen in the field of view (FIG. 9).
[0127]
On the other hand, as shown in FIG. 10, in the separation operation using microsphere beads having a diameter of 15 μm, bacteria were well separated from the sample. The solid particles seen in FIG. 9 are not seen at all. After separation, only bacteria are seen in the separated fluid part (FIG. 10). Separation took place almost instantaneously. Microsphere beads allowed for quick and easy isolation of bacteria from the remainder of the solid particles in yogurt, allowing for more detailed testing of the isolated bacteria. This allows the determination of the type of bacteria present in the sample. For example, the type of bacteria or other microorganism can be determined by a specific antigen test that determines the type of bacteria or microorganism.
[0128]
Similar results were obtained by separation using microsphere beads having a diameter of 10 μm as shown in FIG. In FIG. 11, the number of bacteria per visual field is small, but similarly, bacteria are effectively separated from yogurt.
[0129]
Example 5: Separation of E. coli from bread suspension
In this example, E. coli was successfully separated from bread suspension using the method and apparatus according to the present invention.
[0130]
First, a mixture of bread and NaCl was prepared. A 200 mg pan was used. A pan suspension was prepared by adding 500 microliters of 150 mM NaCl solution to the pan and mixing it repeatedly. Only 100 microliters of E. coli (DH5α strain) was added to the pan suspension. The suspension was stirred again to prepare an E. coli / bread suspension. When 100 microliters of E. coli / bread suspension was placed on the “biochip”, the microsphere beads acted almost instantaneously to separate the fluid components including bacteria from the sample. Moreover, no solid particles were mixed from the suspension. FIG. 12 shows a typical field of view of the E. coli / bread suspension prior to separation. FIG. 13 shows how bacteria are well separated in the fluid portion obtained by the separation operation using microsphere beads having a diameter of 15 μm. The separation situation was good.
[0131]
Example 6: Separation of bacteria from cow dung
In this example, bacteria were isolated from cow dung using the method and apparatus according to the present invention. A suspension was prepared by adding 500 microliters of a 150 mM NaCl solution to 500 mg of cow dung and mixing. A 5 microliter suspension sample was used for separation and placed on a biochip. The micrographs before separation (FIG. 14) and after separation (FIGS. 15 and 16) are shown. The separation operation of this example was performed using microsphere beads having a diameter of 15 μm. When the sample was placed on the “biochip”, fluid components including bacteria were separated by microsphere beads almost instantaneously. Thereby, the separated bacteria can be stained for detailed identification. Even when beads having a diameter of 15 μm were used (FIG. 15) and beads having a diameter of 10 μm were used (FIG. 16), separation was excellent.
[0132]
Example 7: Separation of sand using silica particles
In this example, in addition to commercially available standard polystyrene beads, other types of particles were tested. In order to test the stability of silicone-based particles, the microsphere beads were replaced with sand particles (silica sand). Three tests were performed. That is, cow dung, E. coli / bread suspension, blood. Silica sand was mixed with water to form a slurry and applied to the biochip. The size of the sand particles on the biochip can be known from comparison with a 1 mm scale (FIG. 17).
[0133]
The cow dung of FIG. 18 and the E. coli / bread suspension of FIG. 19 were well separated as shown, but the above Examples 5, 6 using polystyrene beads for filtration. It was not as good as the experiment at. The cause of the poor separation when using these particles is probably due to non-uniform particle size and shape. However, it is clear that this is a possible alternative to the use of polystyrene beads, since the use of sand particles / silica sand is still clearly separated.
[0134]
Whole blood was attached to the biochip and filtered through silica sand particles. In this case, due to the large particle size (as compared to 10 μm diameter microsphere beads), red blood cells passed through the filtered particles. A uniform blood smear was obtained.
[0135]
Without further explanation of experimental examples used on a daily basis, those skilled in the art will be able to recognize and confirm a number of examples similar to the embodiments of the present invention described in detail above. It is done. Such similar examples are intended to be encompassed by the following claims.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic exploded perspective view of an embodiment of an apparatus of the present invention.
FIG. 2 is a longitudinal sectional view taken along the line 1A-1A of the preferred embodiment shown in FIG.
2A is an end elevational view of the device shown in FIG. 2 as viewed from 2A-2A.
FIG. 3 is a side view of the embodiment described in Example 1, showing the cover slip for the bead when it begins to form a curl.
4 is a side view of the embodiment described in Example 1, showing the curl after formation. FIG.
FIG. 5 shows the position of the coverslip relative to the bead on the microscope slide.
6 is a plan view of the embodiment described in Example 1. FIG.
7 is a side view of the embodiment described in Example 2 showing a marker pad variant. FIG.
7A is a side view of another embodiment described in Example 2 showing the replacement of a marker pad with a microsphere bead. FIG.
FIG. 8 shows an example ROC curve of expected test results for a neural network risk analysis test.
FIG. 9 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light magnification microscope and shows the appearance of unseparated yogurt applied to a biochip shelf.
FIG. 10 is a photomicrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope and showing the fluid portion of the yogurt shown in FIG. 9 after separation using a microsphere bead having a diameter of 15 micrometers.
FIG. 11 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope and showing the fluid portion of the yogurt shown in FIG. 9 after separation using a microsphere bead having a diameter of 10 micrometers.
FIG. 12 is a photomicrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope, showing the appearance of unseparated Escherichia coli and bread suspension applied to a biochip shelf.
FIG. 13 is a photomicrograph taken at 400 × magnification using a light magnification microscope of the E. coli / pan suspension shown in FIG. 12 after separation using a microsphere bead having a diameter of 15 micrometers. The fluid part is shown.
FIG. 14 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope, showing the appearance of dairy cow feces applied to a biochip shelf.
FIG. 15 is a photomicrograph taken at 400 × magnification using a light magnification microscope showing the fluid portion of the stool of the cow shown in FIG. 14 after separation using a microsphere bead having a diameter of 15 micrometers. Show.
FIG. 16 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope and shows the fluid portion of the stool of the cow shown in FIG. 14 after separation using a microsphere bead having a diameter of 10 micrometers. Show.
FIG. 17 is a photomicrograph taken using a light magnification microscope showing silica sand with a scale of 1 mm applied to a shelf on a biochip.
FIG. 18 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope, showing the fluid portion of the E. coli / pan suspension shown in FIG. 12 after separation using silica sand particles.
FIG. 19 is a micrograph taken at 400 × magnification using a light power microscope, showing the fluid portion of the dairy cow stool shown in FIG. 14 after separation using silica sand particles.
[Explanation of symbols]
10 Upper plate
12 Lower plate
14 Capillary chamber
16 Applicable zone
18 Biological samples
20 Microsphere beads
22 sign zone

Claims

In an apparatus for separating a fluid from a biological sample having a fluid component and a non-fluid component,
A plurality of microspheres are arranged in an abutting relation to form interstitial spaces between the microspheres,
This allows the interstitial space to continuously form a plurality of capillary channels when the microspheres are placed in fluid communication with the biological sample,
The non-fluid component is separated from the fluid component by capillary flow of the fluid component through the capillary channel;
A plurality of small microspheres are interspersed between a plurality of large microspheres, the plurality of large microspheres are arranged in a substantially contacting relationship, and a gap space is formed between the large microspheres. Continuously forming a plurality of capillary channels, the plurality of small microspheres occupying the interstitial space formed by the large microspheres, and can move through the capillary channels and pass through the capillary channels. An apparatus for separating fluid from a biological sample that is sufficiently small in size to be carried forward by the fluid component to flow in the flow .

The apparatus of claim 1 , wherein the small microspheres are labeled with at least one label.

The apparatus according to claim 2 , wherein the label is selected from the group consisting of a radioactive label, a fluorescent label, a metal, a protein, a peptide, an antigen, and an antibody.

3. The apparatus of claim 2 , wherein the biological sample includes an analyte, the label is an antibody, and has a single specificity that directs to the analyte.

The plurality of small microspheres further comprises a plurality of groups of microspheres, each group impregnate with a different label, each group interspersed between the large microspheres in a separate zone of the large microsphere The apparatus of claim 1 .

The apparatus of claim 1, wherein the size of the microsphere is selected according to the viscosity of the sample.

The apparatus of claim 1, wherein the microspheres are bundled in a fluid-permeable material.

The apparatus of claim 1, wherein the microspheres are maintained in contact relationship by surface tension of the fluid or by drying the microspheres.

The apparatus of claim 1, comprising fluid-conveying means for transporting the sample and in fluid communication with the microspheres.

The device according to any one of claims 1 to 9 , wherein the biological sample is blood and the fluid component is plasma.

In an assay device for analyzing a biological sample having a fluid component and a non-fluid component,
At least one chamber formed by first and second opposing surfaces separated by a distance such that the fluid component is drawn into the chamber by capillary action through at least one fluid inlet. distance der is, has at least one reagent and (reagent) at least one fluid inlet and disposed in the chamber fluid is drawn, whereby said fluid inlet fluidly fluid sample is communicated is At least one chamber drawn by capillary action and substantially filled with a predetermined volume of fluid sample ;
A plurality of microspheres are arranged in an abutting relation with the plurality of microspheres, and interstitial spaces are formed between the microspheres so that the gap spaces are connected to each other. Forming a capillary channel, the microspheres being arranged in fluid communication with the fluid inlet to the chamber, a plurality of small microspheres interspersed between a plurality of large microspheres, The fairs are arranged in a substantially contacting relationship, a gap space is formed between them, the gap spaces connect to form a plurality of capillary channels, and the plurality of small microspheres are substantially sized. Occupies an interstitial space formed by small and large microspheres, moves through the capillary channel, and passes through the capillary channel. As it flows, it becomes from a dynamic capillary filters to be carried forward by the fluid component (dynamic capillary filter),
Thus, when the microspheres are placed in fluid communication with the biological sample, the non-fluid component is sampled by capillary flow of the sample fluid component through the interstitial space of the contacting microsphere. been separated from components, prior SL is drawn into the fluid inlet, the assay device for analyzing a biological sample of said capillary chamber and to fill with fluid.

The assay device according to claim 11 , further comprising a fluid transport unit configured to transport the sample and fluidly communicate with the microsphere.

The assay device of claim 11 , comprising a sample shelf proximate to the fluid inlet, wherein the microspheres are disposed on the sample shelf.

Before SL plurality of small microspheres assay device of claim 11 being attached at least one label.

12. The assay device of claim 11 , comprising a plurality of groups of microspheres, each group being impregnate with a different label and interspersed with the large microspheres in a separate zone of the large microsphere.

The assay device according to claim 11 , wherein the reagent is disposed on a piece attached to an inner surface of the capillary chamber.

The assay device according to claim 16 , wherein the reagent comprises at least one antibody printed or coated on the inner surface of the capillary chamber.

The assay device according to claim 11 , wherein a plurality of reagents are arranged in the capillary chamber to perform a plurality of assays on the fluid sample.

19. The assay device according to claim 18 , wherein the reagent comprises a protein, an antibody, a nucleic acid, a lipid, a steroid, a heterocyclic compound, a drug, or a combination thereof.

The assay device of claim 11 , wherein a plurality of capillary chambers are provided for performing a plurality of assays on one or more fluid samples.

The assay device according to claim 11 , further comprising an analyzer for detecting a ratio of a reagent that binds to an analyte of the fluid sample.

The calibration apparatus according to claim 21 , further comprising a calibration strip for setting a reference line for calibration of the analyzer.

The test apparatus according to claim 21 , further comprising an indicator including patient identification information associated with the result of the test.

24. The verification device according to claim 23 , wherein the indicator comprises a barcode, and the analyzer comprises a barcode reader.

The calibration apparatus according to claim 21 , wherein the analyzer is a spectrometer.

The test apparatus according to claim 21 , wherein the analyzer is capable of digitally transmitting data via a digital transmission system.

The assay device according to claim 21 , further comprising a mask covering a biochip, the mask being transported over the reagent and making a portion of the biochip surrounding the reagent opaque.

Using a device according to claim 1, a method for separating a biological sample or et fluid components having a fluid component and a non-fluid component,
(A) disposed in contacting relationship with a plurality of microspheres, a gap space is formed between the microspheres, so as to form a hair capillary channel multiple the interstitial space is continuous, the sample Fluidly communicating with the plurality of microspheres;
(B) a step of collecting the fluid component when separated from the non-fluid components by the flow of fluid component wherein said fluid component through pre-mute capillary channel,
Separating a fluid component from a non-fluid component of a biological sample comprising:

30. The method of claim 28 , wherein the biological sample is blood and the fluid component is plasma.

Before SL plurality of small microspheres are impregnated with at least one label, as it flows plasma through the gap spacing between the large microspheres, according to claim 28 or 29 wherein the labeled so as to release plasma the method of.

30. A method according to claim 28 or 29 , wherein a plurality of groups of small microspheres impregnated with different labels are interspersed with the large microspheres in the separation zone of the large microsphere.

32. A method according to any of claims 28 to 31, wherein the microspheres are bundled with a fluid impermeable material.

32. A method according to any one of claims 28 to 31 wherein the microspheres are maintained in contact relation by surface tension of the plasma or by drying the microspheres.

34. A method according to any of claims 28 to 33 , wherein a fluid delivery means is provided for fluidly communicating the biological sample with the microspheres.

In how you analyzed using a device according to claim 11,
(A) Fluid component is drawn into the hair capillary chamber by a hair capillary action, to react with the reagent, the steps for communicating a fluid sample with a fluid component and a non-fluid component fluid inlet in fluid,
(B) analyzing the reagent to determine whether the reagent has bound to an analyte in the fluid sample;
A method of performing a test consisting of

The method of claim 35 further comprising the step of analyzing the reagent to determine the percentage of reagent that binds (bind) before hexa amplifier Le.

38. The method of claim 36 , further comprising determining a volume of fluid sample that substantially fills the capillary chamber from a known volume of the capillary chamber.

36. The method of claim 35 , wherein the biological sample is blood and the fluid component is plasma.

36. The method of claim 35 , wherein the reagent is disposed on a piece attached to the inner surface of the capillary chamber.

40. The method of claim 39 , wherein the reagent comprises a selected antibody printed on the inner surface of the capillary chamber.

40. The method of claim 39 , wherein a plurality of reagents are disposed in the capillary chamber to perform a plurality of assays on the fluid sample.

42. The method of claim 41 , wherein the reagent comprises a protein and an antibody.

42. The method of claim 41 , wherein the reagent comprises a protein, antibody, nucleic acid, lipid, steroid, heterocyclic compound, drug, or combinations thereof.

36. The method of claim 35 , wherein a plurality of capillary chambers are provided for performing a plurality of assays on one or more fluid samples.

36. The method of claim 35 , further comprising calibrating the analyzer using a calibration strip imprinted on a biochip to set a baseline.

36. The method according to claim 35 , further comprising associating a result of the test with patient identification information included in an indicator attached to the test device .

The method of claim 46 , wherein the indicator comprises a barcode.

36. The method of claim 35 , further comprising recording the results of the test in a computer database.

49. The method of claim 48 , further comprising compiling data from a plurality of tests in the database.

To generate a profile of one or more selected abnormal (disorder), The method of claim 48, further comprising the step of applying a neural network Argo squirrel beam on the data.

50. The method of claim 49 , further comprising applying a receiver operating characteristic analysis to the data to determine statistical significance of the data.

52. The method of claim 50 , further comprising applying receiver operating characteristic analysis to the data to determine statistical significance of the data.

Removing the fluid sample from the capillary chamber after a desired time interval prior to analyzing the reagent to determine whether the reagent has bound to an analyte in the fluid sample; 36. The method of claim 35 , comprising:

54. The method of claim 53 , wherein a wick or capillary is in fluid communication with the fluid sample to remove the fluid sample from the capillary chamber.

In a method for detecting an analyte in a fluid component of a biological sample having a fluid component and a non-fluid component,
(A) The biological sample is composed of a plurality of microspheres, and the plurality of microspheres are arranged in an abutting relation to form an interstitial space between the microspheres. Te, successively the interstitial space dynamic capillary filter fluidly communicated to form the hair capillary channel multiple and, interspersed a plurality of small microspheres between a plurality of large microspheres, the plurality of large The microspheres are arranged in a substantially contacting relationship so that gap spaces are formed between the large microspheres so that the gap spaces continuously form a plurality of capillary channels. Occupies the interstitial space formed by the large microspheres, can move through the capillary channel, and flows through the capillary channel A size sufficiently small as carried forward by the fluid components, and separating the fluid components from the non-fluid components,
(B) detecting an analyte in the fluid component when the analyte is present;
(C) fluidly communicating the fluid component with the nitrocellulose chromatography strip for separation on the nitrocellulose chromatography strip;
Analytical method consisting of

Fluidly communicating the fluid component with a piece of nitrocellulose impregnate with an analyte specific label that binds to an analyte present in the fluid component of the sample. 56. The method of claim 55 , wherein the analyte is detected in step (b).

The fluid component is fluidly coupled with a second group of microspheres impregnate with an analyte specific label that binds to an analyte present in the fluid component of the sample. 56. The method of claim 55 , wherein the analyte is detected in step (b) by communicating.