JP4431424B2

JP4431424B2 - Composition for promoting bone formation

Info

Publication number: JP4431424B2
Application number: JP2004060243A
Authority: JP
Inventors: 英征知地; 恵松本; 友子桑原; 敏夫平; 勉有塚; 裕人菊地
Original assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2004-03-04
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2010-03-17
Anticipated expiration: 2024-03-04
Also published as: JP2005247748A

Description

本発明は、骨形成を促進するための組成物に関し、具体的には有効成分としてフェノール性アミド化合物を含む組成物、例えば医薬品や食品、健康食品もしくは機能性食品、に関する。したがって本発明の組成物は、骨粗鬆症の治療又は予防に有用である。 The present invention relates to a composition for promoting bone formation, and specifically to a composition containing a phenolic amide compound as an active ingredient, such as a pharmaceutical product, food, health food or functional food. Therefore, the composition of the present invention is useful for the treatment or prevention of osteoporosis.

骨粗鬆症は、低骨量及び骨組織の老化に伴って発症する疾患であり、これが原因で骨が脆くなり骨折が起り易くなる。この疾患の90％以上が中高年に起こる退行性骨粗鬆症であり、特に女性では閉経後に出現し、男性に比べて重症化し易い。女性では閉経期の40〜50歳代から急激に骨量が減少し、60歳代で2人に１人、70歳以上で10人に7人が骨粗鬆症を起す状態にある。一方、男性では60歳過ぎから徐々に増え、70歳以上で10人に4人足らずである。現在わが国には、1,000万人以上の骨粗鬆症患者がいると推定されている。骨には蛋白質やリンなどとともに骨重量の約50％に相当するカルシウムが含まれているが、このカルシウムなどの量、即ち骨量は約40歳をピークに加齢とともに減少し、骨量が成人平均の約70％以下となるとき骨粗鬆症の症状が現れると言われている。 Osteoporosis is a disease that develops with low bone mass and aging of bone tissue. This causes bones to become brittle and easily cause fractures. More than 90% of the disease is degenerative osteoporosis that occurs in middle-aged and older, especially in women, which appears after menopause and is more severe than men. In women, bone mass suddenly decreases from the 40s to 50s in menopause, and 1 in 2 people in the 60s and 7 in 10 people over the age of 70 are in a state of osteoporosis. On the other hand, males gradually increase from over 60 years old, and less than 4 out of 10 people over 70 years old. Currently, it is estimated that there are more than 10 million osteoporosis patients in Japan. Bone contains calcium, which is equivalent to about 50% of the bone weight, together with protein, phosphorus, etc., but this amount of calcium, that is, the bone mass decreases with age, peaking at about 40 years old, and the bone mass It is said that the symptoms of osteoporosis appear when the adult average is about 70% or less.

骨の形成は、骨芽細胞と破骨細胞のバランスによって制御されており、これらの細胞群に、骨形成を促進する因子として女性ホルモン（エストロゲン）やビタミンDなど、骨破壊を促進する因子として副甲状腺ホルモンなどが、バランスよく影響しあって作用することが知られている。骨形成は本来、骨吸収に伴ってバランスをもって行われるものであり、破骨細胞は、骨芽細胞と骨吸収促進因子の存在下で形成され、骨芽細胞によってその一生が支配されている。このように、生体内では、多数のサイトカイン類や増殖因子が介在して骨芽細胞と破骨細胞とのバランスが保たれ骨の健康が維持されている。ひとたび代謝障害、内分泌障害、加齢などにより骨吸収と骨形成のバランスがくずれるとき、骨量が減少し、骨の内部構造が壊れ、脆弱性が亢進し、その結果、骨粗鬆症を発症する。 Bone formation is controlled by the balance of osteoblasts and osteoclasts, and these cell groups have factors that promote bone destruction such as female hormones (estrogens) and vitamin D as factors that promote bone formation. It is known that parathyroid hormones act in a balanced manner. Bone formation is originally performed in a balanced manner with bone resorption, and osteoclasts are formed in the presence of osteoblasts and a bone resorption promoting factor, and their life is governed by osteoblasts. As described above, in the living body, the balance between osteoblasts and osteoclasts is maintained through the intervening of many cytokines and growth factors, and bone health is maintained. Once the balance between bone resorption and bone formation is lost due to metabolic disorders, endocrine disorders, aging, etc., bone mass is reduced, bone internal structures are broken, and vulnerability is increased, resulting in osteoporosis.

骨芽細胞は、間葉組織からできた骨形成細胞であり、未分化間葉系細胞から前駆骨芽細胞、幼若骨芽細胞を経て成熟骨芽細胞へと分化し形成される。骨基質は骨芽細胞から形成され、骨芽細胞は骨細胞として骨基質の中に封入される。前駆細胞の段階から成熟細胞の段階の間にI型コラーゲン、アルカリホスファターゼ（ALP）、オステオネクチンが産生され、幼若骨芽細胞まで分化するとオステオポンチン、成熟細胞まで分化すると骨シアロタンパク（BSP）、オステオカルシン（BGP）がそれぞれ産生し始める（H. Komori, The Bone 12:49-59, 1998;非特許文献１）。骨芽細胞の分化過程で産生されるこれらのタンパクのレベルや活性は、骨形成の促進又は抑制の指標として用いることができる。実際、細胞内アルカリホスファターゼ活性は、骨芽細胞培養株を利用して骨形成促進物質候補をスクリーニングするための指標として使用されている（特開2003−155236；特許文献1）。一方、破骨細胞は、骨組織のみに存在し、高度に石灰化した骨組織を破壊、吸収する。その起源は単球・マクロファージ系の造血細胞に由来し、前駆細胞から前破骨細胞、破骨細胞、成熟破骨細胞へと分化誘導される。また、破骨細胞は、骨ミネラルを溶解する水素イオンと骨基質を分解するリソゾーム酵素を産生し、これらを骨表面との間に形成されたHowshipの吸収窩に分泌する。したがって、破骨細胞の骨吸収を選択的に阻害する物質は骨粗鬆症の臨床治療に使用可能であろう。 Osteoblasts are osteogenic cells made of mesenchymal tissue, and are differentiated from undifferentiated mesenchymal cells into precursor osteoblasts and young osteoblasts into mature osteoblasts. The bone matrix is formed from osteoblasts, which are encapsulated in the bone matrix as bone cells. Type I collagen, alkaline phosphatase (ALP), osteonectin is produced between the precursor cell stage and the mature cell stage, osteopontin when differentiated to young osteoblasts, bone sialoprotein (BSP) when differentiated to mature cells, Osteocalcin (BGP) begins to be produced (H. Komori, The Bone 12: 49-59, 1998; Non-Patent Document 1). The level and activity of these proteins produced during the differentiation process of osteoblasts can be used as an index for promoting or suppressing bone formation. In fact, intracellular alkaline phosphatase activity is used as an index for screening osteogenesis cell lines using osteoblast cultures (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-155236; Patent Document 1). On the other hand, osteoclasts exist only in bone tissue and destroy and absorb highly mineralized bone tissue. Its origin is derived from monocyte / macrophage hematopoietic cells, which are induced to differentiate from progenitor cells to pre-osteoclasts, osteoclasts, and mature osteoclasts. Osteoclasts also produce hydrogen ions that dissolve bone minerals and lysosomal enzymes that break down bone matrix and secrete these into the resorption pits of the Howship formed between the bone surface. Therefore, substances that selectively inhibit osteoclastic bone resorption could be used in the clinical treatment of osteoporosis.

骨粗鬆症の治療薬として現在使用されているものは、カルシウム剤（商品名アスパラCA、カルチコール、乳酸カルシウムなど）、ビタミンD剤（商品名アルファロール、ワンアルファ、ロカルトロール、ハイティクロールなど）、女性ホルモン剤（商品名エストリールなど）、イプリフラボン（商品名オステン、アスオストなど）、ビタミンK2製剤（例えばグラケーなど）、ビスホスホネート類（商品名ファサマックス、リセドロネート、チルドロネート、イバンドロネートなど）、などである。 Currently used as therapeutic agents for osteoporosis are calcium agents (trade names such as Aspara CA, Carticol, calcium lactate, etc.), vitamin D agents (trade names such as Alfalol, One Alpha, Locartrol, and Hyticrol), women. Hormonal agents (trade name Estoril, etc.), ipriflavone (trade names Osten, Asost, etc.), vitamin K2 preparations (eg, Graque), bisphosphonates (trade names Fasax, risedronate, tiludronate, ibandronate, etc.) .

女性ホルモン剤は、いわゆるエストロゲン製剤であるエストリオールである。女性の閉経後に急激な骨量の減少が起こるが、これは女性ホルモンの１つである卵胞ホルモン（エストロゲン）の分泌低下が大きな原因とされている。このため、女性ホルモン剤の投与によって骨粗鬆症の予防効果が期待できるわけである。しかし、このホルモン剤の投与によって子宮癌や乳癌などの癌、心筋梗塞などの血栓性疾患の危険性が増大することが知られている。 The female hormone agent is estriol, which is a so-called estrogen preparation. A rapid bone loss occurs after menopause in women, and this is mainly caused by a decrease in the secretion of follicular hormone (estrogen), one of the female hormones. For this reason, the prevention effect of osteoporosis can be expected by the administration of the female hormone agent. However, it is known that administration of this hormone agent increases the risk of cancer such as uterine cancer and breast cancer, and thrombotic diseases such as myocardial infarction.

イプリフラボンは、もともとアルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）という牧草に含まれるフラボノイド系動物成長因子の１つとして見出されたものであるが、骨吸収を直接抑制することに加えて、エストロゲンによるカルシトニン（骨吸収抑制ホルモン）分泌促進効果を増強することによって間接的に骨吸収を抑制し、これによって骨粗鬆症における疼痛を軽減し、骨量の減少を抑制する働きがある。しかし重大な副作用として、消化性潰瘍、胃腸出血が知られている。 Ipriflavone was originally found as one of the flavonoid animal growth factors contained in the grass called alfalfa (purple corn), but in addition to directly suppressing bone resorption, calcitonin (suppression of bone resorption) by estrogen Hormone) It indirectly suppresses bone resorption by enhancing the secretion promoting effect, thereby reducing pain in osteoporosis and suppressing bone loss. However, peptic ulcer and gastrointestinal bleeding are known as serious side effects.

上記の治療薬若しくは予防薬に加えて、骨形成促進剤を含む種々の骨粗鬆症治療剤が報告されている。例えば、特開2003−155236（特許文献1）には、プテロカルパン[（5αR, 11αR）-3-ヒドロキシ-9,10-ジメトキシプテロカルパン]が骨形成促進作用と抗動脈硬化作用を有することが開示されている。プテロカルパンはマメ科のアストラガラス属植物であるオウギに含まれるイソフラボン化合物である。特開2002−308771（特許文献2）には、ドロロキシフェンなどのエストロゲンアゴニスト/アンタゴニストと骨形成を促進し骨量を増加させる薬物（フッ化ナトリウム、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌物質など）との医薬混合物が開示されている。特開2001−253827（特許文献3）には、ポリホスホネート類（アレンドロネード、シマドロネードなど）及びスタチン類（シンバスタチン、ブラバスタチン、セリバスタチンなど）を含む、骨形成を促進及び/又は骨損失を予防及び/又はアテローム動脈硬化症を治療するための医薬組成物が開示されている。特開2000−191526（特許文献4）には、有効成分としてサポニン、ダイジン、ダイゼイン、ゲニスチン及びゲニスティン（イソフラボン類）を含む大豆の煮汁が骨形成促進及び骨粗鬆症予防効果があることが開示されている。特開平9−169665号（特許文献5）には、ホスホジエステラーゼIV阻害活性のあるキサンチン類が骨形成促進作用及び骨密度低下抑制作用をもつことが開示されている。特開平6−312930号（特許文献6）には、黄体ホルモン及び抗エストロゲン作用物質（エストラジオール誘導体、トリフェニルエチレン誘導体、ベンゾチオフェン誘導体など）が骨形成作用を有する、安全性の高い骨粗鬆症治療剤であることが開示されている。特開平5−17367号（特許文献7）には、単球-マクロファージコロニー形成刺激因子の骨粗鬆症治療効果が開示されている。 In addition to the above therapeutic or preventive agents, various osteoporosis therapeutic agents including osteogenesis promoters have been reported. For example, Japanese Patent Laid-Open No. 2003-155236 (Patent Document 1) states that pterocarpan [(5αR, 11αR) -3-hydroxy-9,10-dimethoxypterocarpan] has an osteogenesis promoting action and an anti-arteriosclerotic action. It is disclosed. Pterocarpan is an isoflavone compound contained in ogi which is an Astragrass plant of the leguminous family. JP 2002-308771 (Patent Document 2) describes an estrogen agonist / antagonist such as droloxifene and a drug that promotes bone formation and increases bone mass (sodium fluoride, parathyroid hormone, growth hormone or growth hormone secretory substance) Etc.) are disclosed. JP 2001-253827 (Patent Document 3) includes polyphosphonates (alendronade, cimadronade, etc.) and statins (simvastatin, bravastatin, cerivastatin, etc.) to promote bone formation and / or prevent bone loss And / or a pharmaceutical composition for treating atherosclerosis is disclosed. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-191526 (Patent Document 4) discloses that soybean soup containing saponin, daidzin, daidzein, genistin and genistein (isoflavones) as active ingredients has an effect of promoting bone formation and preventing osteoporosis. . Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-169665 (Patent Document 5) discloses that xanthines having phosphodiesterase IV inhibitory activity have a bone formation promoting action and a bone density reduction inhibiting action. JP-A-6-312930 (Patent Document 6) describes a highly safe osteoporosis therapeutic agent in which luteinizing hormones and antiestrogenic substances (estradiol derivatives, triphenylethylene derivatives, benzothiophene derivatives, etc.) have osteogenic action. It is disclosed that there is. JP-A-5-17367 (Patent Document 7) discloses the osteoporosis therapeutic effect of monocyte-macrophage colony-stimulating factor.

特開2003−155236JP2003-155236 特開2002−308771JP2002-308771 特開2001−253827JP2001-253827 特開2000−191526JP2000-191526 特開平9−169665号JP-A-9-169665 特開平6−312930号JP-A-6-312930 特開平5−17367号JP-A-5-17367 H. Komori, The Bone 12:49-59, 1998H. Komori, The Bone 12: 49-59, 1998

現在市販されている骨粗鬆症治療剤又は予防剤には、その有効成分の副作用が問題となる場合が少なくない。そこで、有効な骨形成促進効果をもつとともに、副作用のより軽減された安全性の高い化合物又は組成物が求められている。 In the osteoporosis therapeutic agent or preventive agent currently marketed, the side effect of the active ingredient often becomes a problem. Therefore, a highly safe compound or composition having an effective bone formation promoting effect and reduced side effects is desired.

本発明者らは、砂糖の原料である甜菜に含まれるポリフェノール化合物類（Hideyuki Chijiら、Agric. Biol. Chem., 48(6):1653-1654 (1984)）に注目し、それらの化合物に高い骨芽細胞分化促進効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors paid attention to polyphenol compounds (Hideyuki Chiji et al., Agric. Biol. Chem., 48 (6): 1653-1654 (1984)) contained in sugar beet, which is a raw material of sugar, and the compounds The present inventors have found that there is a high osteoblast differentiation promoting effect and have completed the present invention.

本発明は、下記の式１

[式中、Rは、H又はOR’（ R’はC₁〜C₄アルキルを表す。）である。]
の化合物もしくはその塩、又はそれらの混合物を含む、骨形成を促進するための組成物を提供する。 The present invention provides the following formula 1

[Wherein, R is H or OR ′ (R ′ represents C ₁ -C ₄ alkyl). ]
Or a salt thereof, or a mixture thereof, a composition for promoting bone formation is provided.

一つの実施態様において、上記化合物が、式1中RがHである化合物である。
別の実施態様において、上記化合物は、式１中RがOR’（R’はC₁〜C₃アルキルを表す。）である化合物である。
別の実施態様において、上記化合物は、式１中RがOCH₃又はOC₂H₅である化合物である。
別の実施態様において、上記化合物は、式１中RがOCH₃である化合物である。
別の実施態様において、上記混合物は、式１中RがHである化合物とRがOCH₃である化合物を含む。 In one embodiment, the compound is a compound in which R is H in formula 1.
In another embodiment, the compound is a compound in which R is OR ′ where R ′ represents C ₁ -C ₃ alkyl.
In another embodiment, the compound is a compound wherein R is OCH ₃ or OC ₂ H ₅ in Formula 1.
In another embodiment, the compound is the compound in which R is OCH ₃ in formula 1.
In another embodiment, the mixture comprises a compound of formula 1 wherein R is H and a compound wherein R is OCH ₃ .

別の実施態様において、上記化合物又は前記混合物が、甜菜の種子、根又は葉から得られるものである。
別の実施態様において、上記混合物が甜菜からの抽出物又は糖蜜である。
別の実施態様において、上記化合物が、化学合成によって得られるものである。
別の実施態様において、上記組成物が医薬品である。
別の実施態様において、上記医薬品が、骨粗鬆症の治療又は予防用である。
別の実施態様において、上記組成物が、食品である。
別の実施態様において、上記食品が、健康食品又は機能性食品である。
別の実施態様において、上記食品、健康食品又は機能性食品が骨粗鬆症の予防用である。 In another embodiment, the compound or mixture is obtained from sugar beet seeds, roots or leaves.
In another embodiment, the mixture is an extract from sugar beet or molasses.
In another embodiment, the compound is obtained by chemical synthesis.
In another embodiment, the composition is a pharmaceutical product.
In another embodiment, the medicament is for the treatment or prevention of osteoporosis.
In another embodiment, the composition is a food product.
In another embodiment, the food is a health food or a functional food.
In another embodiment, the food, health food or functional food is for the prevention of osteoporosis.

本発明で使用する用語は、下記の意味を有する。
上記式１のR’について、「C₁〜C₄アルキル」は、低級アルキルであるメチル(CH₃)、エチル(C₂H₅)、n-もしくはi-プロピル(C₃H₇)又はn-もしくはi-ブチル(C₄H₉)を意味する。また同様に、「C₁〜C₃アルキル」は、メチル、エチル又はn-もしくはi-プロピルを意味する。 The terms used in the present invention have the following meanings.
For R ′ in formula 1 above, “C ₁ -C ₄ alkyl” means lower alkyl methyl (CH ₃ ), ethyl (C ₂ H ₅ ), n- or i-propyl (C ₃ H ₇ ) or n -Or i-butyl (C ₄ H ₉ ). Similarly, “C ₁ -C ₃ alkyl” means methyl, ethyl or n- or i-propyl.

「塩」とは、式１の構造中のフェノール性水酸基がナトリウム又はカリウムなどの金属塩、あるいは脂肪族、芳香族、ヘテロ環式などのアミン類との塩を意味する。通常、医薬品で汎用されるような金属塩、アミン塩が好ましい。 “Salt” means a salt in which the phenolic hydroxyl group in the structure of Formula 1 is a metal salt such as sodium or potassium, or an amine such as aliphatic, aromatic or heterocyclic. Usually, metal salts and amine salts that are widely used in pharmaceuticals are preferred.

「混合物」とは、上記式１の化合物から選択される2以上の化合物を含む混合物を意味し、単なる精製化合物の混合物だけでなく、天然物又は化学合成からの精製途中で得られるような上記化合物を含む中間処理物であってもよい。ここで「中間処理物」とは、粗精製物、溶媒抽出物、クロマトグラフィーからの溶出物、又はこれらに類するものを意味するが、これらに限定されない。中間処理物中の上記化合物の含有率は、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、又は90%以上である。中間処理物は上記化合物以外の物質を含むことがあるが、そのような物質は人体に悪影響を及ぼさないものであるべきである。 “Mixture” means a mixture containing two or more compounds selected from the compounds of formula 1 above, and is not only a mixture of purified compounds, but also a natural product or a product obtained during purification from chemical synthesis. An intermediate treatment product containing a compound may be used. Here, the “intermediate treatment product” means a crude product, a solvent extract, an eluate from chromatography, or the like, but is not limited thereto. The content of the compound in the intermediate treatment product is 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more. The intermediate treatment product may contain substances other than the above compounds, but such substances should not adversely affect the human body.

「抽出物」とは、天然物、化学反応物、又はこれらの処理物を、水又は有機溶媒で抽出処理し、溶媒を除いた後の固体又は液体又はシロップを意味する。また、「糖蜜」とは、甜菜から砂糖を結晶化した後に残るシロップを指す。 The “extract” means a solid or liquid or syrup after a natural product, a chemical reaction product, or a processed product thereof is extracted with water or an organic solvent and the solvent is removed. The “molasses” refers to syrup remaining after sugar is crystallized from sugar beet.

「治療」又は「予防」とは、骨形成を促進することによって、骨粗鬆症の発症前後の骨量の減少や骨の脆弱性を有意に改善、緩和又は予防することを意味する。本発明により骨芽細胞の分化を促進することによって成熟骨芽細胞の形成が促進され、その結果、骨形成が促進されるとともに、骨形成と破骨細胞による骨吸収の不均衡が改善又は緩和される。 “Treatment” or “prevention” means to significantly improve, alleviate or prevent bone loss and bone vulnerability before and after the onset of osteoporosis by promoting bone formation. By promoting osteoblast differentiation according to the present invention, the formation of mature osteoblasts is promoted, and as a result, bone formation is promoted and the imbalance between bone formation and bone resorption by osteoclasts is improved or alleviated. Is done.

「医薬品」とは、治療又は予防を目的とした医薬組成物を意味する。本発明においては、この目的を達成するのに有効な量の上記式１の化合物が含有されているべきである。通常、医薬品は固体又は液体の賦形剤を含むとともに、必要に応じて崩壊剤、香味剤、遅延放出剤、滑沢剤、結合剤、着色剤などの添加剤を含むことができる。医薬品の形態は、錠剤、注射剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、徐放製剤などを含むが、これらに限定されない。 “Pharmaceutical” means a pharmaceutical composition intended for treatment or prevention. In the present invention, the compound of formula 1 should be contained in an amount effective to achieve this object. In general, pharmaceuticals contain solid or liquid excipients, and can contain additives such as disintegrants, flavoring agents, delayed release agents, lubricants, binders, and coloring agents as necessary. Examples of pharmaceutical forms include, but are not limited to, tablets, injections, capsules, granules, powders, fine granules, sustained release formulations and the like.

「食品」とは、業界等で日常的に使用される意味を有し、人間が食することができるすべての食料を指すが、好ましくは加工品である。たとえば菓子類、乳製品、穀類加工品などの加工食品に、本発明の式１の化合物又はその混合物を混入させることができる。また、「健康食品」及び「機能性食品」とは、業界で一般的に使用される意味を有し、骨粗鬆症の症状又は兆候を示す骨量の減少や骨の脆弱性を予防するために特別に処方された、医薬品又は一般の食品とは区別される食品の一種を指す。 “Food” has a meaning that is used routinely in the industry and the like, and refers to all foods that can be eaten by humans, but preferably processed products. For example, the compound of formula 1 of the present invention or a mixture thereof can be mixed into processed foods such as confectionery, dairy products, and processed cereal products. In addition, “health food” and “functional food” have the meanings commonly used in the industry and are specially used to prevent bone loss and bone fragility that show symptoms or signs of osteoporosis. It refers to a type of food that is prescribed in the above and is distinct from pharmaceuticals or general foods.

本発明により、イソフラボン類とは構造的に異なるタイプのフェノール性アミド化合物が高い骨芽細胞の分化促進活性を有することを初めて見出し、したがって骨形成の促進作用を有することから骨粗鬆症の治療又は予防に使用できる。 According to the present invention, a phenolic amide compound structurally different from isoflavones has been found for the first time to have a high osteoblast differentiation promoting activity, and therefore has an effect of promoting osteogenesis, thereby treating or preventing osteoporosis. Can be used.

本発明は、下記の式１

本発明で使用される式１の化合物は、天然物からの抽出又は化学合成によって製造することができる。なお、式１の構造式中アミドカルボニルに隣接する二重結合はトランス（trans）配置である。以下に、化学合成による製造及び天然物からの製造について説明する。 The compound of Formula 1 used in the present invention can be produced by extraction from natural products or chemical synthesis. In the structural formula of Formula 1, the double bond adjacent to amidecarbonyl is in a trans configuration. Hereinafter, production by chemical synthesis and production from natural products will be described.

化学合成による製造
上記式１の化合物は、例えば、下記式２

の化合物(Ferulic acid)と、下記式３

[式中、Rは、Hあるいは、OCH₃、OC₂H₅、O-n-C₃H₇、O-i-C₃H₇、O-n-C₄H₉、又はO-i-C₄H₉である。]
の化合物からアミド結合を形成させることによって合成できる。式2及び式3の化合物は市販品を利用するか、さもなくば当業者には公知の出発物質と反応法を組合わせて容易に合成することができるだろう。 Production by Chemical Synthesis The compound of the above formula 1 is, for example, the following formula 2

The compound (Ferulic acid) of the following formula 3

[Wherein, R is H, OCH ₃ , OC ₂ H ₅ , OnC ₃ H ₇ , OiC ₃ H ₇ , OnC ₄ H ₉ , or OiC ₄ H ₉ . ]
It can be synthesized by forming an amide bond from the above compound. The compounds of Formula 2 and Formula 3 are commercially available or can be easily synthesized by combining starting materials and reaction methods known to those skilled in the art.

通常、式2及び式3の化合物のフェノール性水酸基は、反応前に予めベンジルオキシカルボニル基、ベンジルオキシ基、ベンジル基などで保護されるのがよい。反応後、これらの保護基は、アルカリ処理などの公知の方法によって除去可能である。これら2つの化合物のアミド結合形成反応は、高温（例えば150〜200℃）で２つの化合物を直接加熱してアミド結合を形成する方法、式２の化合物を三塩化リン、五塩化リン又は塩化チオニルと処理して酸塩化物を形成し、式3の化合物のアミノ基との間でトリエチルアミンなどの弱塩基の存在下でアミド結合を形成する方法、式2の化合物のカルボキシル基をエチルクロロホルメートなどのアルキルクロロホルメートと反応させてカルボン酸無水物としたのち、式3の化合物と反応させてアミド結合を形成させる方法、式2の化合物をN,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）と反応させてアシルイソ尿素としたのち、式3の化合物と反応させてアミド結合を形成する方法、などで行うことができる。これらのアミド結合形成反応は、当業者には周知の反応であるが、例えば日本生化学会編、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、化学修飾とペプチド合成（東京化学同人）；Stanley R. SandlerとWolf Karo、Organic Functional Group Preparations Vol. I（Academic Press, New York（1968）；Hideyuki Chijiら、Agric. Biol. Chem., 48(6):1653-1654 (1984)に開示される方法を使用できる。 Usually, the phenolic hydroxyl group of the compounds of formulas 2 and 3 is preferably protected beforehand with a benzyloxycarbonyl group, benzyloxy group, benzyl group or the like before the reaction. After the reaction, these protecting groups can be removed by a known method such as alkali treatment. The amide bond forming reaction of these two compounds is a method in which two compounds are directly heated at high temperature (for example, 150 to 200 ° C.) to form an amide bond, and the compound of formula 2 is phosphorus trichloride, phosphorus pentachloride or thionyl chloride. To form an acid chloride and form an amide bond with the amino group of the compound of formula 3 in the presence of a weak base such as triethylamine, and the carboxyl group of the compound of formula 2 is converted to ethyl chloroformate. After reacting with alkyl chloroformate such as carboxylic acid anhydride, react with compound of formula 3 to form an amide bond, reacting compound of formula 2 with N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) The reaction can be carried out by a method of reacting with the compound of formula 3 to form an amide bond after the acylisourea is formed. These amide bond formation reactions are well known to those skilled in the art. For example, edited by the Japanese Biochemical Society, Biochemistry Experiment Course 1, Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis (Tokyo Chemical Dojin); Stanley R. Sandler and Wolf Karo, Organic Functional Group Preparations Vol. I (Academic Press, New York (1968); Hideyuki Chiji et al., Agric. Biol. Chem., 48 (6): 1653-1654 (1984). Can be used.

天然物からの製造
式１の化合物のうち、R基が-H及び-OCH₃である化合物（それぞれN-tans-feruloyltyramine（「Amide 2」）及びN-trans-feruloylhomovanillylamine（「Amide 1」）という）は、いわゆるサトウダイコン（sugar beet）と称する甜菜の種子、根及び葉から、本発明者の一人である知地英征らの方法（Agric. Biol. Chem., 48(6):1653-1654 (1984)）によって抽出、単離することができる。甜菜種子は粉砕後に、例えば、アセトン抽出、エタノール抽出、中和処理、ヘキサン抽出、水層の酢酸エチル抽出、イオン交換樹脂、シリカゲル等のカラムクロマトグラフィーによる酢酸エチル層の分離（シリカゲルクロマト溶離剤：ベンゼン-酢酸エチル-エタノール系）を順次実施することによって式１の上記2種類の化合物を混合物として得ることができ、これをさらに溶離剤を例えばクロロホルム-1%エタノールに替えてシリカゲルクロマトグラフィーに掛けることによってAmide１、ついでクロロホルム-2%エタノールからAmide 2をそれぞれ分離することができる。同様の又は類似の方法を用いて、甜菜の葉や根から目的の化合物を抽出、分離することができる。甜菜の根は、砂糖の原料であり、工業的に砂糖を結晶分離したあと糖蜜から分離できる。糖蜜は酵母の発酵原料、液体肥料、飼料添加物などに利用されているが、上記化合物の原料として使用できる。Amide１は、融点161℃、マススペクトルM+, m/z 343.1394、IRスペクトル3350〜3400cm^-1(OH、NH), 1660cm^-1(C=O)、NMRスペクトル（アセトン-d₆）δ2.82(2H, J=7Hz), 3.62(2H, J=7Hz), 3.86(3H), 3.90(3H), 5.54(1H), 5.58(1H), 6.14 (1H, J=16Hz), 7.56(1H, J=16Hz), 6.68-7.0(6H)の物性値を有する。Amide 2は、融点148℃、マススペクトルM+, m/z 313.1337、IRスペクトル3390cm^-1(OH、NH), 1660cm^-1(C=O)、NMRスペクトル（アセトン-d₆）δ2.76(2H), 3.54(2H), 6.52(1H, J=16Hz), 7.48 (1H, J=16Hz), 6.72-7.22(5H), 7.24(1H), 8.04 (1H), 8.22(1H)の物性値を有する。 Among the compounds of production formula 1 from natural products , compounds in which the R group is —H and —OCH ₃ (N-tans-feruloyltyramine (“Amide 2”) and N-trans-feruloylhomovanillylamine (“Amide 1”), respectively) ) From the seeds, roots and leaves of sugar beet called so-called sugar beet (sugar beet), the method of Eiji Chichi, one of the present inventors (Agric. Biol. Chem., 48 (6): 1653- 1654 (1984)). The sugar beet seeds are pulverized and then subjected to, for example, acetone extraction, ethanol extraction, neutralization, hexane extraction, ethyl acetate extraction of the aqueous layer, separation of the ethyl acetate layer by column chromatography such as ion exchange resin, silica gel (silica gel chromatography eluent: The above two compounds of formula 1 can be obtained as a mixture by sequentially carrying out (benzene-ethyl acetate-ethanol system), and this is further subjected to silica gel chromatography by changing the eluent to, for example, chloroform-1% ethanol. As a result, Amide 1 and then Amide 2 can be separated from chloroform-2% ethanol. The target compound can be extracted and separated from sugar beet leaves and roots using a similar or similar method. Sugar beet root is a raw material of sugar and can be separated from molasses after industrially separating the sugar into crystals. Molasses is used as a fermentation raw material for yeast, liquid fertilizer, feed additives, etc., but can be used as a raw material for the above compounds. Amide1 is the melting point 161 ° C., mass spectrum M +, m / z 343.1394, IR spectrum ^{3350~3400cm -1 (OH, NH),} 1660cm -1 (C = O), NMR spectrum (acetone -d ₆₎ δ2.82 ( 2H, J = 7Hz), 3.62 (2H, J = 7Hz), 3.86 (3H), 3.90 (3H), 5.54 (1H), 5.58 (1H), 6.14 (1H, J = 16Hz), 7.56 (1H, J = 16Hz), 6.68-7.0 (6H). Amide 2, the melting point 148 ° C., mass spectrum M +, m / z 313.1337, IR spectrum ^{3390cm -1 (OH, NH),} 1660cm -1 (C = O), NMR spectrum (acetone -d ₆₎ [delta] 2.76 (2H ), 3.54 (2H), 6.52 (1H, J = 16Hz), 7.48 (1H, J = 16Hz), 6.72-7.22 (5H), 7.24 (1H), 8.04 (1H), 8.22 (1H) Have.

式１の化合物の骨形成を促進する活性は、後述の実施例に記載するように、培養した2.0x10⁴cells/wellの骨芽細胞培養株MC3T3-E1に、培地中濃度0.1〜10.0μMとなるように該化合物を添加し4日間培養し、骨芽細胞の分化指標であるアルカリホスファターゼ（ALP）活性（特開2003-155236；特許文献1）と、細胞数の指標であるDNA量(C. LabarcaとK. Paigen, Analytical Biochemistry 102:344-352, 1980)を測定し、DNA量に対するALP活性を決定することによって実施できる。このALP活性が対照と比べて有意に高いほど、化合物の骨形成促進活性が高いことを示す。 The activity of promoting the bone formation of the compound of Formula 1 was determined by adding 2.0 × 10 ⁴ cells / well of osteoblast culture strain MC3T3-E1 to a culture medium concentration of 0.1 to 10.0 μM, as described in Examples below. The compound was added and cultured for 4 days. Alkaline phosphatase (ALP) activity, which is an osteoblast differentiation index (JP 2003-155236; Patent Document 1), and the amount of DNA (C Labarca and K. Paigen, Analytical Biochemistry 102: 344-352, 1980) and measuring the ALP activity relative to the amount of DNA. The higher this ALP activity compared to the control, the higher the osteogenesis promoting activity of the compound.

あるいは、本発明の組成物の有効成分である式１の化合物をラットなどの実験動物（病態モデル動物などを含む）に胃ゾンデの投与、または試験飼料の給餌によって4週間以上飼育し、動物の大腿骨の骨幹部及び骨幹端部組織の骨成分の変動をカルシウム量、アルカリホスファターゼ活性、DNA量を指標として測定することによって、骨形成促進効果を決定することができる。骨組織のカルシウム量は、骨組織を0.25Mショ糖溶液で洗浄し、100℃で6時間乾燥したのち、乾燥重量を測定し、濃硝酸を添加して24時間120℃で分解し、カルシウム量を原子吸光光度計で定量する。アルカリホスファターゼ活性は、骨組織を冷0.25Mショ糖溶液で洗浄後、6.5ｍMバルビタール緩衝液（ｐH7.4 ）中で破砕し、60秒間超音波処理、3000rpmで遠心し、上清画分の酵素活性を公知の方法(Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 1-2, Academic Press, New York, pp856-860, 1965)で測定する。DNA量は、骨組織を冷0.25Mショ糖溶液で洗浄し、水分除去後、0.1N水酸化ナトリウム溶液中で破砕し、抽出し、3000rpmで遠心し、その上清画分をDNA測定試料とし公知の方法(J. Biol. Chem. 214:39-77, 1955)で測定する。 Alternatively, the compound of the formula 1, which is an active ingredient of the composition of the present invention, is bred for 4 weeks or more by administering a gastric sonde or feeding a test feed to a laboratory animal such as a rat (including a disease model animal). The bone formation promoting effect can be determined by measuring changes in the bone components of the femoral diaphysis and metaphyseal tissue using the calcium content, alkaline phosphatase activity, and DNA content as indices. The amount of calcium in bone tissue is determined by washing the bone tissue with 0.25M sucrose solution and drying at 100 ° C for 6 hours, measuring the dry weight, adding concentrated nitric acid and decomposing at 120 ° C for 24 hours. Is quantified with an atomic absorption photometer. For alkaline phosphatase activity, bone tissue was washed with cold 0.25M sucrose solution, crushed in 6.5 mM barbital buffer (pH 7.4), sonicated for 60 seconds and centrifuged at 3000 rpm, and the supernatant fraction enzyme The activity is measured by a known method (Methods of Enzymatic Analysis, Vol. 1-2, Academic Press, New York, pp856-860, 1965). The amount of DNA was determined by washing bone tissue with cold 0.25M sucrose solution, removing water, crushing in 0.1N sodium hydroxide solution, extracting, centrifuging at 3000 rpm, and using the supernatant fraction as a DNA measurement sample. Measurement is performed by a known method (J. Biol. Chem. 214: 39-77, 1955).

後述の実施例4では、骨芽細胞培養株MC3T3-E1を用いるアッセイ系でAmide 1及びAmide 2のALP活性を測定し、その結果を示したが、Amide 1は対照の約2.5倍の最大ALP活性を、Amide 2は約2倍の最大ALP活性をそれぞれ示した(図1、図2)。特にAmide 1は、培地中濃度0.1μMで対照の約2.2倍、1.0μMで約2.5倍の活性を示し、Amide 2よりも低濃度で高い活性を有していた。これらの結果から、Amide 1及びAmide 2化合物が、骨芽細胞の分化を促進する活性、即ち骨形成を促進する作用又は機能、を有することが明らかになった。同様に、Amide 1及びAmide 2以外の化合物もまた、Amide 1及びAmide 2と類似のALP活性、骨形成促進作用をもつ。 In Example 4 described later, the ALP activity of Amide 1 and Amide 2 was measured in an assay system using an osteoblastic cell line MC3T3-E1, and the results were shown.Amide 1 is about 2.5 times the maximum ALP of the control. In terms of activity, Amide 2 exhibited about twice the maximum ALP activity (FIGS. 1 and 2). In particular, Amide 1 exhibited an activity that was about 2.2 times that of the control at a concentration of 0.1 μM in the medium and about 2.5 times that at 1.0 μM, and had a higher activity at a lower concentration than Amide 2. From these results, it was revealed that Amide 1 and Amide 2 compounds have an activity of promoting osteoblast differentiation, that is, an action or function of promoting osteogenesis. Similarly, compounds other than Amide 1 and Amide 2 also have ALP activity and osteogenesis promoting action similar to those of Amide 1 and Amide 2.

したがって、本発明は、上記式１の化合物類又はそれら2以上の化合物の混合物を含む、骨形成を促進するための組成物、具体的に医薬品(若しくは医薬組成物)あるいは食品、健康食品又は機能性食品、を提供する。 Accordingly, the present invention provides a composition for promoting bone formation, specifically a pharmaceutical (or pharmaceutical composition) or a food, health food or function, comprising the compounds of the above formula 1 or a mixture of two or more of them. Providing sex foods.

本発明の実施態様では、式１の化合物は、式1中RがHである化合物、式１中RがOR’（R’はC₁〜C₄アルキルを表す。）であるいずれかの化合物、式１中RがOR’（R’はC₁〜C₃アルキルを表す。）であるいずれかの化合物、式１中RがOCH₃又はOC₂H₅である化合物である。また別の実施態様では、2以上の上記化合物の混合物であってもよく、その1例は、式１中RがHである化合物とRがOCH₃である化合物を含む混合物である。これらの化合物又は混合物には、甜菜の種子、根又は葉から得られるものが包含され、より具体的には、甜菜からの抽出物又は糖蜜に由来するものである。また、上述したとおり、式1の化合物は、上記の方法などで化学合成されたものも包含され、適宜その2以上の化合物を組合わせて混合物とすることができる。 In an embodiment of the invention, the compound of formula 1 is a compound in which R is H in formula 1 and any compound in which R is OR ′ (R ′ represents C ₁ -C ₄ alkyl). In the formula 1, R is OR ′ (R ′ represents C ₁ -C ₃ alkyl), and in the formula 1, R is OCH ₃ or OC ₂ H ₅ . In another embodiment, it may be a mixture of two or more of the above compounds, one example of which is a mixture comprising a compound in which R is H and a compound in which R is OCH ₃ . These compounds or mixtures include those obtained from sugar beet seeds, roots or leaves, more specifically those derived from sugar beet extracts or molasses. In addition, as described above, the compound of formula 1 includes those chemically synthesized by the above-described method and the like, and a mixture of two or more compounds can be appropriately combined.

本発明の組成物を医薬品として使用する場合、その投与剤型としては、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、被覆錠剤、徐放製剤、カプセル剤、注射剤などが挙げられる。該医薬品は賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、着色剤、遅延放出剤などの添加剤を含むことができる。経口製剤の場合、賦形剤として、例えば乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、マンニトール、ソルビット、結晶セルロースなど、結合剤として、例えばポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマーなど、崩壊剤として、例えば澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなど、滑沢剤として、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油など、香味剤として、例えばココア末、ハッカ油、桂皮末などが使用できるが、これらに限定されない。必要により、徐放性又は腸溶性製剤とするためのコーティングを施すことができる。注射用製剤の場合には、ｐH調整剤、溶解剤、等張化剤、緩衝化剤などが使用されるが、これらに限定されない。 When the composition of the present invention is used as a pharmaceutical, examples of the dosage form include tablets, powders, fine granules, granules, coated tablets, sustained-release preparations, capsules, injections and the like. The medicinal product may contain additives such as excipients, if necessary, binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, coloring agents, delayed release agents and the like. In the case of oral preparations, excipients such as lactose, corn starch, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol, crystalline cellulose, etc., binders such as polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin , Shellac, polyvinylpyrrolidone, block copolymer, etc., as a disintegrating agent, such as starch, agar, gelatin powder, crystalline cellulose, calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, etc., as a lubricant, eg, magnesium stearate For example, cocoa powder, mint oil, cinnamon powder and the like can be used as flavoring agents such as talc, polyethylene glycol, silica and hydrogenated vegetable oil, but are not limited thereto. If necessary, a coating for obtaining a sustained release or enteric preparation can be applied. In the case of injectable preparations, pH adjusting agents, solubilizers, tonicity agents, buffering agents and the like are used, but are not limited thereto.

骨粗鬆症の治療又は予防を必要とする患者には、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、直腸内投与などの投与法を、患者の状態、年齢、性別などに応じて適宜選択される。有効成分の用量は、通常成人の場合1日あたり約0.1mg〜約5,000mgであり、この範囲に限定されないが、患者の状態、年齢、性別などに応じて適宜選択される。本発明で使用される化合物の中には甜菜に含有されるものもあり、このような化合物は低毒性であると考えられる。 For patients in need of treatment or prevention of osteoporosis, administration methods such as oral administration, intravenous administration, intraarterial administration, intramuscular administration, intraperitoneal administration, and rectal administration should be applied to the patient's condition, age, gender, etc. It is selected as appropriate. The dose of the active ingredient is usually about 0.1 mg to about 5,000 mg per day for an adult, and is not limited to this range, but is appropriately selected according to the patient's condition, age, sex and the like. Some of the compounds used in the present invention are contained in sugar beet, and such compounds are considered to have low toxicity.

本発明の組成物を食品、健康食品又は機能性食品として使用する場合、これらは骨粗鬆症の予防用として骨形成促進のために使用される。上述したとおり、たとえば菓子類、乳製品、穀類加工品などの加工食品に、本発明の化合物又はその混合物を、適当な賦型剤と一緒に、また必要に応じて香味剤、着色剤などの添加剤を加えて、混入させることができる。また、「健康食品」及び「機能性食品」の場合、たとえばゼラチンカプセル内に本発明の化合物又はその混合物を封入し、骨粗鬆症の症状又は兆候を示す骨量の減少や骨の脆弱性を予防するための、即ち骨形成促進のための、健康維持食品として使用することができる。有効成分の添加量は、通常成人の場合1日あたり約0.1mg〜約5,000mgに相当する量であるが、この範囲に限定されない。 When the composition of the present invention is used as a food, health food or functional food, these are used for promoting osteogenesis for the prevention of osteoporosis. As described above, for example, processed foods such as confectionery, dairy products, and processed cereal products, the compound of the present invention or a mixture thereof, together with an appropriate excipient, and if necessary, flavoring agents, coloring agents, etc. Additives can be added and mixed. In the case of “health food” and “functional food”, for example, the compound of the present invention or a mixture thereof is encapsulated in a gelatin capsule to prevent bone loss and bone vulnerability that show symptoms or signs of osteoporosis. Therefore, it can be used as a health maintenance food for promoting bone formation. The amount of the active ingredient added is usually an amount corresponding to about 0.1 mg to about 5,000 mg per day for an adult, but is not limited to this range.

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。 The following examples further illustrate the present invention.

N-trans-Feruloylhomovanillylamine（「Amide 1」）の合成方法
（1）4-Benzyloxy-3-methoxyphenethylamineの合成
四つ口フラスコ（500 ml容）に水素化リチウムアルミニウム6.08 g（160 mmol）を入れ、それにtetrahydrofuran（THF）280 mlを加え、窒素気流下で還流加熱した。そこに4-benzyloxy-3-methoxy-β-nitrostyrene 9.12g (32 mmol)のTHF溶液（120 ml）を滴下した。2時間還流加熱した後、反応液を室温まで冷却し、水を加えた。沈殿物をろ過し、ろ液にジエチルエーテルを加え、その有機溶媒層を分離し、2N水酸化ナトリウム水溶液、ついで水で洗浄した。溶媒を乾燥剤（硫酸マグネシウム）で乾燥後、減圧留去し、4-benzyloxy-3-methoxy-phenethylamine（黄色油状物5.27g、収率64.1%）を得た。 N-trans-Feruloylhomovanillylamine (“Amide 1”) Synthesis Method (1) 4-Benzyloxy-3-methoxyphenethylamine Synthesis Four-necked flask (500 ml) was charged with 6.08 g (160 mmol) of lithium aluminum hydride. 280 ml of reflux (THF) was added and heated under reflux under a nitrogen stream. Thereto was added dropwise a THF solution (120 ml) of 4-benzyloxy-3-methoxy-β-nitrostyrene 9.12 g (32 mmol). After heating at reflux for 2 hours, the reaction mixture was cooled to room temperature and water was added. The precipitate was filtered, diethyl ether was added to the filtrate, the organic solvent layer was separated, and washed with 2N aqueous sodium hydroxide and then with water. The solvent was dried with a desiccant (magnesium sulfate) and evaporated under reduced pressure to give 4-benzyloxy-3-methoxy-phenethylamine (yellow oil 5.27 g, yield 64.1%).

（2）N-(4-Benzyloxy-3-methoxyphenethyl)- ferulamide（N-trans-feruloyl-4-benzyloxy-3-methoxyphenethylamine）の合成
丸底フラスコ（300 ml）に4-benzyloxy-3-methoxy-phenethylamine 5.27g (20.5 mmol)を入れ、TFH130 mlに溶解し、そこにferulic acid(上記式2の化合物) 3.98 g (20.5 mmol)を加えた。室温で撹拌しながら1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 5.09 gのTFH (70 ml) 溶液を滴下した。室温で窒素気流下13時間撹拌し、出発物質の消失をTLCで確認の上、シリカゲルカラムで精製し、N-(4-benzyloxy-3-methoxyphenethyl)- ferulamide（黄色固体8.36g、収率94.2%）を得た。 (2) Synthesis of N- (4-Benzyloxy-3-methoxyphenethyl)-ferulamide (N-trans-feruloyl-4-benzyloxy-3-methoxyphenethylamine) in a 4-roundoxy flask (300 ml) with 4-benzyloxy-3-methoxy-phenethylamine 5.27 g (20.5 mmol) was added and dissolved in 130 ml of TFH, and ferulic acid (compound of formula 2 above) 3.98 g (20.5 mmol) was added thereto. While stirring at room temperature, a solution of 5.09 g of 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) in TFH (70 ml) was added dropwise. Stir at room temperature under a nitrogen stream for 13 hours, confirm the disappearance of the starting material by TLC, purify by silica gel column, N- (4-benzyloxy-3-methoxyphenethyl)-ferulamide (8.36 g yellow solid, yield 94.2% )

（3）N-trans-Feruloylhomovanillylamineの合成
四つ口フラスコ（200ml容）にN-(4-benzyloxy-3-methoxyphenethyl)- ferulamide 4 g (9.24 mmol)を入れ、それに塩酸23 ml（277 mmol）と酢酸 44 ml（769 mmol）を加え、40℃で反応させた。出発物質が消失したところで反応を止めて、反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出後、溶媒を減圧留去した。得られた褐色シラップ（8.36g、収率94.2%）をシリカゲルカラムで精製し、N-trans-feruloylhomovanillylamine（無色固体）を得た。
融点161℃；マススペクトルM+, m/z 343.1394；UVスペクトル220nm(ε21,900), 232nm(ε22,100), 290nm(ε20,000), 319nm(ε24,300)；IRスペクトル3350〜3400cm^-1(OH、NH), 1660cm^-1(C=O)；NMRスペクトル（アセトン-d₆）δ2.82(2H, J=7Hz), 3.62(2H, J=7Hz), 3.86(3H), 3.90(3H), 5.54(1H), 5.58(1H), 6.14 (1H, J=16Hz), 7.56(1H, J=16Hz), 6.68-7.0(6H)。 (3) Synthesis of N-trans-Feruloylhomovanillylamine N- (4-benzyloxy-3-methoxyphenethyl)-ferulamide 4 g (9.24 mmol) was placed in a four-necked flask (200 ml), and hydrochloric acid 23 ml (277 mmol) was added. 44 ml (769 mmol) of acetic acid was added and reacted at 40 ° C. The reaction was stopped when the starting material disappeared, water was added to the reaction mixture, and the mixture was extracted with ethyl acetate, and the solvent was evaporated under reduced pressure. The obtained brown syrup (8.36 g, yield 94.2%) was purified with a silica gel column to obtain N-trans-feruloylhomovanillylamine (colorless solid).
Melting point 161 ° C .; mass spectrum M +, m / z 343.1394; UV spectrum 220 nm (ε21,900), 232 nm (ε22,100), 290 nm (ε20,000), 319 nm (ε24,300); IR spectrum 3350-3400 cm ⁻¹ (OH, NH), 1660 cm ⁻¹ (C═O); NMR spectrum (acetone-d ₆ ) δ2.82 (2H, J = 7 Hz), 3.62 (2H, J = 7 Hz), 3.86 (3H), 3.90 ( 3H), 5.54 (1H), 5.58 (1H), 6.14 (1H, J = 16Hz), 7.56 (1H, J = 16Hz), 6.68-7.0 (6H).

N-trans-Feruloyltyramine（「Amide 2」）の合成
上記のAmide 1と同様の方法で、4-benzyloxyphenethylamineとferulic acidからN-trans-feruloyltyramineを合成した。
融点148℃；マススペクトルM+, m/z 313.1337；UV；スペクトル220nm(ε22,000), 292nm(ε16,300)；IRスペクトル3390cm^-1(OH、NH), 1660cm^-1(C=O)；NMRスペクトル（アセトン-d₆）δ2.76(2H), 3.54(2H), 6.52(1H, J=16Hz), 7.48 (1H, J=16Hz), 6.72-7.22(5H), 7.24(1H), 8.04 (1H), 8.22(1H)。 Synthesis of N-trans-Feruloyltyramine (“Amide 2”) N-trans-feruloyltyramine was synthesized from 4-benzyloxyphenethylamine and ferulic acid by the same method as Amide 1 described above.
Mp 148 ° C.; mass spectrum M +, m / z 313.1337; UV; spectrum 220nm (ε22,000), 292nm (ε16,300 ); IR spectrum ^{3390cm -1 (OH, NH),} 1660cm -1 (C = O); NMR spectrum (acetone-d ₆ ) δ2.76 (2H), 3.54 (2H), 6.52 (1H, J = 16Hz), 7.48 (1H, J = 16Hz), 6.72-7.22 (5H), 7.24 (1H), 8.04 (1H), 8.22 (1H).

甜菜種子からのAmide 1及びAmide 2の抽出分離
粉砕した甜菜種子3.35kgをアセトン5,000mlで3回抽出したのち、エタノール5,000mlで3回抽出した。抽出液を合わせて40℃で1,200mlまで減圧濃縮し、濃縮液を重炭酸水素ナトリウムで中和したのち、ヘキサン3,000mlで7回抽出しヘキサン層（油分）を除去した。水層を酢酸エチル3,000mlで6回抽出し、酢酸エチル層を40℃で減圧濃縮して褐色シロップ22.7gを得た。このうち20gをシリカゲルカラム（5.5x61cm）に供し、ベンゼン、酢酸エチル、エタノールの混合比を変えながら3,000mlずつ溶出し、フラクション4にAmide 1及びAmide 2を主成分として含む混合物4.39gを得た。この混合物を同様のシリカゲルカラムに供し、クロロホルム-1％エタノールで溶出しAmide 1（1.11ｇ）を回収し、ついでクロロホルム-２％エタノールで溶出しAmide 2（2.02ｇ）を回収した。 Extraction of Amide 1 and Amide 2 from sugar beet seeds 3.35 kg of sugar beet seeds that were separated and ground were extracted three times with 5,000 ml of acetone, and then three times with 5,000 ml of ethanol. The extracts were combined and concentrated under reduced pressure to 1,200 ml at 40 ° C., and the concentrate was neutralized with sodium bicarbonate and extracted seven times with 3,000 ml of hexane to remove the hexane layer (oil). The aqueous layer was extracted 6 times with 3,000 ml of ethyl acetate, and the ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure at 40 ° C. to obtain 22.7 g of a brown syrup. 20 g of this was applied to a silica gel column (5.5 x 61 cm), and 3,000 ml was eluted while changing the mixing ratio of benzene, ethyl acetate, and ethanol to obtain 4.39 g of a mixture containing Amide 1 and Amide 2 as main components in fraction 4. . This mixture was applied to the same silica gel column and eluted with chloroform-1% ethanol to recover Amide 1 (1.11 g), and then eluted with chloroform-2% ethanol to recover Amide 2 (2.02 g).

骨芽細胞株MC3T3-E1の分化に及ぼすAmide 1及びAmide 2の影響
(1)細胞培養
骨芽細胞株MC3T3-E1を10％仔牛胎児血清（FBS）を添加したα-MEM含有のプラスティックディッシュで３７℃のCO₂インキュベーターで培養した。３日おきにCa²⁺-，Mg²⁺- 非含有リン酸緩衝塩水（PBS）に0.02％EDTA、0.1％trypsinを加えたもので継代を行なった。実験には、2.0×10⁴cells/wellを10％FBS添加のα-MEM 1ｍlを含有した24 well plateでコンフルエントになるまで培養した。培地交換と同時に試験試料を培地中濃度が0.1〜10.0μMになるように添加し92時間培養した。 Effect of Amide 1 and Amide 2 on differentiation of osteoblast cell line MC3T3-E1
(1) Cell culture Osteoblast cell line MC3T3-E1 was cultured in a 37 ° C. CO ₂ incubator in an α-MEM-containing plastic dish supplemented with 10% fetal calf serum (FBS). Passage was performed every 3 days with Ca 2 ⁺ -, Mg ^{2+ -free} phosphate buffered saline (PBS) added with 0.02% EDTA and 0.1% trypsin. In the experiment, 2.0 × 10 ⁴ cells / well were cultured until they became confluent in a 24-well plate containing 1 ml of α-MEM supplemented with 10% FBS. Simultaneously with the medium exchange, the test sample was added so that the concentration in the medium was 0.1 to 10.0 μM and cultured for 92 hours.

(2)アルカリホスファターゼ（ALP）活性の測定
細胞培養後、細胞を0.25Mのショ糖溶液にて3回洗浄した。25℃にて50mM 炭酸塩緩衝液（pH 9.8）を添加し超音波処理後、フェニルリン酸を基質とする測定法に準じた富士ドライケムスライド(富士フィルム社製)を用いて測定した。 (2) Measurement of alkaline phosphatase (ALP) activity After cell culture, the cells were washed three times with a 0.25 M sucrose solution. After adding a 50 mM carbonate buffer solution (pH 9.8) at 25 ° C. and sonicating, measurement was performed using a Fuji Dry Chemslide (manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) according to a measurement method using phenylphosphate as a substrate.

(3)DNA量の測定
細胞DNA量はH33258法(C. LabarcaとK. Paigen, Analytical Biochemistry 102:344-352, 1980)を用いて測定した。この方法は、H33258(和光純薬工業社製)がDNAと結合し蛍光（458nm）物質を生成するという原理に基づく。細胞培養後、細胞にCa²⁺-，Mg²⁺- 非含有 PBSを加えて超音波破砕を行なった。細胞ホモジネオート液、緩衝液、H33258を加えて攪拌し励起波長Ex：356nm, 発光波長Em：458nmで蛍光分析を行なった。 (3) Measurement of DNA amount Cellular DNA amount was measured using the H33258 method (C. Labarca and K. Paigen, Analytical Biochemistry 102: 344-352, 1980). This method is based on the principle that H33258 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) binds to DNA to produce a fluorescent (458 nm) substance. After cell culture, Ca 2 ⁺ -, Mg ^{2+ -free} PBS was added to the cells and subjected to ultrasonic disruption. Cell homogene auto solution, buffer solution, and H33258 were added and stirred, and fluorescence analysis was performed at excitation wavelength Ex: 356 nm and emission wavelength Em: 458 nm.

(4)結果
骨芽細胞株MC3T3-E1の、DNA量(μg)あたりのALP活性に及ぼすAmide 1及びAmide 2の影響を図１及び図２に示した。図１から明らかなように、Amide 1は、0.1μMで対照（Amide１又はAmide２非含有）の約2.2倍のALP活性、1.0μM で約2.5倍のALP活性を示し、これ以上の濃度ではALP活性は頭打ちとなった。一方、Amide 2は、0.1μMで対照の約1.3倍のALP活性、1.0μM で約1.5倍のALP活性、10.0μM で約2.5倍のALP活性を示した。これらの結果から、Amide 1及びAmide 2化合物がともに、骨芽細胞の分化を促進する活性、即ち骨形成を促進する作用又は機能を有することが明らかになった。またAmide 1は、培地中濃度0.1μMで対照の約2.2倍、1.0μMで約2.5倍の活性を示したことから、Amide 2よりも低濃度で高い活性を有することが判明した。 (4) Results The effects of Amide 1 and Amide 2 on the ALP activity per DNA amount (μg) of the osteoblast cell line MC3T3-E1 are shown in FIG. 1 and FIG. As is clear from FIG. 1, Amide 1 shows about 2.2 times ALP activity at 0.1 μM compared to the control (without Amide 1 or Amide 2), about 2.5 times ALP activity at 1.0 μM, and ALP activity at higher concentrations. Became a peak. On the other hand, Amide 2 showed an ALP activity of about 1.3 times that of the control at 0.1 μM, an ALP activity of about 1.5 times at 1.0 μM, and an ALP activity of about 2.5 times at 10.0 μM. From these results, it became clear that both Amide 1 and Amide 2 compounds have an activity to promote osteoblast differentiation, that is, an action or function to promote bone formation. In addition, Amide 1 showed an activity of about 2.2 times that of the control at a concentration of 0.1 μM in the medium and about 2.5 times that at 1.0 μM, and thus it was found that Amide 1 had a higher activity at a lower concentration than Amide 2.

DNA量あたりのALP活性測定による、Amide 1の骨芽細胞の分化促進作用を示す。FIG. 2 shows Amide 1 osteoblast differentiation promoting action by measuring ALP activity per DNA amount. DNA量あたりのALP活性測定による、Amide 2の骨芽細胞の分化促進作用を示す。FIG. 2 shows Amide 2's osteoblast differentiation promoting effect by measuring ALP activity per DNA amount.

Claims

Equation 1 below

[Wherein, R is H or OR ′ (R ′ represents C ₁ -C ₄ alkyl). ]
Compound or a salt thereof, or a mixture thereof as an active ingredient, a pharmaceutical composition for promoting bone formation.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein R in formula 1 is H.

Wherein 1 R is OR '(R' represents. A C ₁ -C ₃ alkyl), pharmaceutical composition according to claim 1.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein R in formula 1 is OCH ₃ or OC ₂ H ₅ .

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein R in formula 1 is OCH ₃ .

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the mixture comprises a compound in which R is H in formula 1 and a compound in which R is OCH ₃ .

The pharmaceutical composition according to claim 1, 2, 5, or 6, wherein the compound or the mixture is obtained from sugar beet seeds, roots or leaves.

The pharmaceutical composition according to claim 7, wherein the mixture is obtained from an extract from sugar beet or molasses.

The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the compound is obtained by chemical synthesis.

The pharmaceutical composition according to any one of claims 1 to 9 , which is used for treatment or prevention of osteoporosis.