JP4485051B2

JP4485051B2 - 上皮細胞増殖因子としてのヘレグリンの用途

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Publication number: JP4485051B2
Application number: JP2000530226A
Authority: JP
Inventors: スリウコウスキー，マーク; ケーン，ジェフリー・エー
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレイテッド; ユニバーシティーオブアイオワリサーチファウンデーション
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-03
Publication date: 2010-06-16
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: EP1053009A2; EP1510579B1; US20020042087A1; DK1510579T3; ATE276756T1; EP1053009B1; ATE438720T1; DE69941228D1; JP2002509076A; EP1510579A3; CA2318857C; ES2229679T3; DE69920405T2; AU2581599A; EP1510579A2; WO1999039729A3; CA2318857A1; DE69920405D1; WO1999039729A2; ES2329467T3

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４リガンド、特にヘレグリンポリペプチドの上皮細胞増殖因子としての用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＥＲ（ＥｒｂＢ）ファミリーは、サブクラスＩ受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーに属し、３種類の別個の受容体、すなわちＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４よりなる。このＥｒｂＢファミリーに対するリガンドは、タンパク質のヘレグリン（ＨＲＧ）であって、少なくとも１５の別個のイソ型を有する、多ドメイン含有タンパク質である。
【０００３】
細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの形質導入は、部分的には、様々な細胞性タンパク質のリン酸化によって調節されている。タンパク質チロシンキナーゼは、この過程を触媒する酵素である。受容体タンパク質チロシンキナーゼは、細胞内基質の、リガンドで刺激されるチロシンリン酸化を介して細胞増殖を指図すると考えられる。増殖因子受容体タンパク質であるクラスＩサブファミリーのチロシンキナーゼは、ｅｒｂＢ１遺伝子がコードする１７０ｋＤａの表皮増殖因子受容体（ＥＦＧＲ）を包含する。ｅｒｂＢ１は、ヒトの悪性腫瘍にその原因として関与している。特に、この遺伝子の発現の増大は、より活動的な、胸部、膀胱、肺及び胃の癌腫で観察されている。
【０００４】
クラスＩサブファミリーの第二のメンバーであるｐ１８５^neuは、本来は、化学処理されたラットの神経芽細胞腫からの形質転換遺伝子の産物として特定された。ｎｅｕ遺伝子（ｅｒｂＢ２及びＨＥＲ２とも呼ばれる）は、１８５ｋＤａの受容体タンパク質チロシンキナーゼをコードする。ヒトＨＥＲ２遺伝子の増幅及び／又は過剰発現は、乳癌及び卵巣癌の劣悪な予後と相関する〔Slamon et al., Science 235:177-182 (1987)；及びSlamon et al., Science 244:707-712 (1989)〕。ＨＥＲ２の過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸及び膀胱の癌腫を包含する、その他の癌腫と相関している。したがって、Slamonら〔米国特許第４，９６８，６０３号明細書〕は、腫瘍細胞におけるＨＥＲ２遺伝子の増幅又は発現を決定するための様々な診断アッセイを記載かつクレームしている。Slamonらは、腫瘍細胞におけるＨＥＲ２癌遺伝子の多数の遺伝子コピーの存在は、疾病が原発腫瘍部位を越えて転移する可能性がより高く、そのため、疾病が、そうでない場合に他の診断要因が示すよりも積極的な処置を必要とすることを示すことを発見した。Slamonらは、ＨＥＲ２遺伝子増幅試験は、リンパ腺の状態の判定とともに、非常に改良された予後の活用を与えるとの結論に達した。
【０００５】
それ以外の、ｅｒｂＢ３又はＨＥＲ３と呼ばれる関連遺伝子も、記載されている。米国特許第５，１８３，８８４号明細書；Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9193-9197 (1989)；ヨーロッパ特許願第４４４，９６１Ａ１号公報；及びKraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2900-2904 (1993)を参照されたい。Krausら（1989）は、ｅｒｂＢ３ｍＲＮＡの顕著に上昇したレベルが、一定のヒト乳腺腫瘍細胞系に存在し、ｅｒｂＢ３は、ｅｒｂＢ１及びｅｒｂＢ２と同様に、ヒトの悪性腫瘍でも役割を果たし得ることを示した。また、Krausら（1993）は、キメラのＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３受容体のＥｒｂＢ３触媒ドメインのＥＧＦ依存性活性化は、トランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞に増殖性応答を招くことを示した。これは、現在では、ＮＩＨ−３Ｔ３における内在性ＥｒｂＢ１又はＥｒｂＢ２の結果であると考えられている。更に、これらの研究者は、いくつかのヒト乳腺腫瘍細胞系が、定常状態のＥｒｂＢ３チロシンリン酸化の有意な上昇を示すことを立証して、この受容体がヒトの悪性腫瘍に役割を果たすことを更に示した。癌におけるｅｒｂＢ３の役割は、他の研究者によって探求されている。それは、乳房〔Lemoine et al., Br. J. Cancer 66:1116-1121 (1992)〕、胃腸〔Poller et al., J. Pathol. 168:275-280 (1992)；Rajkumer et al., J. Pathol. 170:271-278 (1993)；及びSanidas et al., Int. J. Cancer 54:935-940 (1993)〕及び膵臓癌〔Lemoine et al., J. Pathol. 168:269-273 (1992)；及びFriess et al., Clinical Cancer Research 1:1413-1420 (1995)〕で過剰発現されることが見出されている。
【０００６】
増殖因子受容体タンパク質チロシンキナーゼというクラスＩサブファミリーは、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４受容体も包含するよう更に拡張されている。ヨーロッパ特許願第５９９，２７４号公報；Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993)；及びPlowman et al., Nature 366:473-475 (1993)を参照されたい。Plowmanらは、増大したＨＥＲ４発現は、胸部腺癌を包含する上皮起源の一定の癌腫に密接に相関することを見出した。ヒトの新生物状態（特に乳癌）の検出のための、ＨＥＲ４発現を評価する診断法は、ヨーロッパ特許願第５９９，２７４号公報に記載されている。
【０００７】
ＨＥＲ２癌遺伝子の活性化因子の探求は、ヘレグリンポリペプチドファミリーの発見へと導いた。これらのタンパク質は、Orr-Urtregerら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1867-1871 (1993)〕がヒト第８染色体の短腕にマップされる、一つの遺伝子の別のスプライシングに起因すると思われる。
【０００８】
Holmesらは、ＨＥＲ２受容体に対する一群のポリペプチド活性化因子を単離かつクローニングし、ヘレグリン−αα（ＨＲＧ−α）、ヘレグリン−β１（ＨＲＧ−β１）、ヘレグリン−β２（ＨＲＧ−β２）、ヘレグリン−β２様（ＨＲＧ−β２様）及びヘレグリン−β３（ＨＲＧ−β３）と称した。Holmes et al., Science 256:1205-1210 (1992)；国際公開特許第９２／２０７９８号公報；及び米国特許第５，３６７，０６０号明細書を参照されたい。４５ｋＤａポリペプチドであるＨＲＧ−αは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１というヒト乳癌細胞系の調製培地から精製された。これらの研究者は、精製ヘレグリンポリペプチドがＭＣＦ７乳房腫瘍細胞のＨＥＲ２受容体のチロシンリン酸化を活性化できることを立証した。更に、ヘレグリンポリペプチドのＳＫ−ＢＲ−３細胞（高レベルのＨＥＲ２受容体を発現する）に対する分裂促進活性が示された。ＥＧＦファミリーに属する他の増殖因子と同様に、可溶性ＨＲＧポリペプチドは、膜結合前駆体（プロＨＲＧと呼ばれる）から派生すると思われ、タンパク質分解によって処理されて、４５ｋＤａ可溶形態を遊離する。これらのプロＨＲＧは、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。
【０００９】
ヘレグリン類は、最初の２１３アミノ酸残基が実質的に同一ではあるが、Ｃ末端部分が異なる二つの変種ＥＧＦ様ドメインに基づいて、主要な二型、すなわちα及びβに分類される。それでも、これらのＥＧＦ様ドメインは、それに含まれる６個のシステイン残基の間隔が同一である。アミノ酸配列の比較に基づき、Holmesらは、ＥＧＦ様ドメイン内の第１と第６とのシステイン間で、ＨＲＧは、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）と４５％類似し、アンフィレグリン（ＡＲ）と３５％同一であり、ＴＧＦ−αと３２％同一であり、ＥＧＦと２７％同一であることを見出した。
【００１０】
４４kDのneu分化因子（ＮＤＦ）は、ヒトＨＲＧのラット等価体であって、Pelesら〔Cell, 69:205-216 (1992)〕；及びWenら〔Cell, 69:559-572 (1992)〕が最初に記載した。ＨＲＧポリペプチドと同様に、ＮＤＦは、免疫グロブリン（Ｉｇ）相同性ドメイン、及びその後にＥＧＦ様ドメインを有し、Ｎ末端シグナルペプチドを欠く。その後、Wenら〔Mol. Cell. Biol., 14(3):1909-1919 (1994)〕は、「徹底的なクローニング」を実施して、ＮＤＦファミリーを拡張した。この研究は、６種類の別個の繊維芽細胞性プロＮＤＦを明らかにした。Holmesらの命名法を採用すると、ＮＤＦは、ＥＧＦ様ドメインの配列に基づいて、α又はβポリペプチドのいずれかに分類される。イソ型１〜４は、（ＥＧＦ様ドメインと膜貫通ドメインとの間の）可変的な膜上伸展部に基づいて特徴付けられる。また、可変長の細胞質ドメインを有するイソ型ａ、ｂ及びｃが記載されている。これらの研究者は、異なるＮＤＦイソ型が、別のスプライシングによって生成され、別個の組織特異的な機能を演じるとの結論に達している。ＮＤＦに関しては、ヨーロッパ特許第５０５１４８号；国際公開特許第９３／２２４２４号；及び国際公開特許第９４／２８１３３号公報を参照されたい。
【００１１】
Fallsら〔Cell, 72:801-815 (1993)〕は、ヘレグリンファミリーのもう一つのメンバーを記載して、アセチルコリン受容体誘導活性（ＡＲＩＡ）ポリペプチドと呼んでいる。ニワトリ由来ＡＲＩＡポリペプチドは、筋アセチルコリン受容体の合成を刺激する。国際公開特許第９４／０８００７号公報も参照されたい。ＡＲＩＡは、β型のヘレグリンであり、ＨＲＧα及びＨＲＧβ１〜β３のＩｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインとの間の、糖鎖形成部位に富むスペーサー領域全体を欠く。
【００１２】
Marcionniら〔Nature, 362:312-318 (1993)〕は、いくつかのウシ由来タンパク質を特定して、グリア細胞増殖因子（ＧＧＦ）と呼んでいる。これらのＧＧＦは、上記のその他のヘレグリンタンパク質とともに、Ｉｇ様ドメイン及びＥＧＦ様ドメインを共有するが、アミノ末端クリングルドメインも有する。ＧＧＦは、一般的には、Ｉｇ様ドメインとＥＧＦ様ドメインとの間に完全な糖鎖形成されたスペーサー領域を保有しない。ＣＧＦのうち一つのみ、すなわちＧＧＦIIがＮ末端シグナルペプチドを有したにすぎない。ＧＧＦ及びその用途に言及している、国際公開特許第９２／１８６２７号；第９４／００１４０号；第９４／０４５６０号；第９４／２６２９８号；及び第９５／３２７２４号公報も参照されたい。
【００１３】
Hoらは、J. Biol. Chem. 270(4): 14523-14532 (1995)で、感覚及び運動性ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）と呼ばれる、ヘレグリンファミリーのもう一つのメンバーを記載している。このタンパク質は、別個のＮ末端ドメインを除いた他のすべてのヘレグリンポリペプチドに特徴的なＥＧＦ様ドメインを有する。ＳＭＤＦと他のヘレグリンポリペプチドとの間の主な構造的差異は、ＳＭＤＦにおけるＩｇ様ドメイン、及び他のすべてのヘレグリンポリペプチドに特徴的な「グリコ」スペーサーの欠如である。ＳＭＤＦのもう一つの特徴は、Ｎ末端近くの疎水性アミノ酸の二つの伸張部の存在である。
【００１４】
ヘレグリンポリペプチドは、ＨＥＲ２受容体を活性化できるそれらの能力に基づいて特定された最初のものであったが〔Holmes et al., 前掲〕、neuを発現する一定の卵巣細胞、及びneuをトランスフェクションされた繊維芽細胞は、ＮＤＦとは結合若しくは架橋せず、ＮＤＦに応答して、チロシンリン酸化を受けることもなかった〔Peles et al., EMBO J. 12:961-971 (1993)〕。これは、完全なヘレグリン応答性を与えるには、もう一つの細胞性成分が必要であることを示していた。Carrawayらは、その後、ＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞に結合した¹²⁵Ｉ−ｒＨＲＧβ１_177-244が、ウシｅｒｂＢ３で安定的にトランスフェクションされるが、トランスフェクションされなかった親細胞には結合しないことを立証した。上記により、彼等は、ＥｒｂＢ３は、ＨＲＧの受容体であり、内在性チロシン残基のリン酸化はもとより、両受容体を発現する細胞でのＥｒｂＢ２受容体のリン酸化も仲介するとの結論に達した〔Carraway et al., J. Biol. Chem. 269(19):14303-14306 (1994)〕。Sliwkowskiら〔J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665 (1994)〕は、ＨＥＲ３のみでトランスフェクションされた細胞は、ヘレグリンに対する低い親和力を示すが、ＨＥＲ２とＨＥＲ３との双方でトランスフェクションされた細胞は、より高い親和力を示すことを見出した。
【００１５】
この所見は、以前にKokaiら〔Cell 58:287-292 (1989)〕；Sternら〔EMBO J. 7:995-1001 (1988)〕；及びKingら〔4:13-18 (1989)〕が記載した、「受容体クロストーキング」と相関する。これらの研究者は、ＥＧＦＲとのＥＧＦの結合は、ＥＧＦＲキナーゼドメインの活性化、及びｐ１８５^HER2の交差リン酸化を招くことを見出した。これは、リガンド誘導受容体ヘテロ二量体化、及びヘテロ二量体内での受容体の同時交差リン酸化の結果であると考えられる〔Wada et al., Cell 61:1339-1347 (1990)〕。
【００１６】
Plowmanと彼の同僚は、同様に、ｐ１８５^HER4／ｐ１８５^HER2活性化を研究した。彼等は、ｐ１８５^HER2のみ、ｐ１８５^HER4のみ、又は２受容体をともにヒトＴリンパ球で発現させ、ヘレグリンが、両受容体を発現する細胞内では、ｐ１８５^HER4のチロシンリン酸化を刺激できるが、ｐ１８５^HER2のリン酸化のみ刺激できたにすぎないことを立証した〔Plowman et al., Nature 336:473-475 (1993)〕。
【００１７】
ヘレグリンの生物学的役割は、いくつかのグループが研究している。例えば、Fallsら（上記に考察）は、ＡＲＩＡが、筋管分化に役割を果たすこと、すなわち、運動性ニューロンのシナプス後筋細胞内の神経伝達物質受容体の合成及び濃度に影響を与えることを見出した。Corfas及びFischbachは、ＡＲＩＡが、ニワトリの筋におけるナトリウムチャンネルの数も増加させることを立証した〔Corfas & Fischbach, J. Neuroscience, 13(5):2118-2125 (1993)〕。ＧＧＦIIは、亜集密的静止状態のヒト筋芽細胞に対して分裂促進性であること、及びＧＧＦIIの持続的存在下でのクローン性ヒト筋芽細胞の分化は、分化の６日後に、より多くの数の筋管を生じることも示されている〔Sklar et al., J. Cell Biochem., Abst. W462, 18D, 540 (1994)〕。１９９４年１１月２４日に刊行された国際公開特許第９４／２６２９８号公報も参照されたい。
【００１８】
Holmesら〔前掲〕は、ＨＲＧが、乳腺細胞系（例えばＳＫ−ＢＲ−３及びＭＣＦ−７）に対して分裂促進効果を発揮することを見出した。シュワン細胞に対するＧＧＦの分裂促進活性も報告されている。例えば、Brockes et al., J. Biol. Chem., 255(18):8374-8377 (1980)；Lemke & Brockes, J. Neurosci., 4:75-83 (1984)；Brockes et al., Ann. Neurol., 20(3):317-322 (1986)；Brockes, J., Methods in Enzym., 147:217-225 (1987)；及びMarchionni et al.前掲を参照されたい。シュワン細胞は、ニューロンの軸索の周囲に髄鞘を与え、それによって個々の神経繊維を形成する、重要なグリア細胞を構成する。したがって、シュワン細胞が、末梢神経の発生、機能及び再生に重要な役割を果たすことは明白である。治療の立場からのこの形態の意味するものは、Leviら〔J. Neuroscience 14(3):1309-1319 (1994)〕が扱っている。Leviらは、損傷した脊椎の部域に移植できると思われる、ヒトシュワン細胞を含む細胞プロテーゼの構成の可能性を考察している。シュワン細胞をex vivoで培養する方法が記載されている。国際公開特許第９４／００１４０及びLi et al., J. Neuroscience 16(6):2012-2019 (1996)を参照されたい。
【００１９】
Pinkas-Kramarskiらは、ＮＤＦが、ラットの胚及び成体の脳内のニューロンやグリア細胞、並びにラット脳細胞の初代培養で発現されると思われることを見出し、それが、星状細胞の生存及び成熟因子として作用し得ると示唆した〔Pinkas-Kramarski et al., PNAS, USA 91:9387-9391 (1994)〕。Meyer及びBirchmeier〔PNAS, USA 91:1064-1068 (1994)〕は、in situハイブリダイゼーション及びＲＮアーゼ防護の実験を用いて、マウス胚形成の際や周産期動物でのヘレグリンの発現を分析した。Meyer et al., Development 124(18):3575-3586 (1997)を参照されたい。これらの著者は、この分子の発現に基づいて、ヘレグリンは、in vivoで、間充織及びニューロン性因子としての役割を果たすとの結論に達した。同様に、Danilenkoら〔Abstract 3101, FASEB 8(4-5):A535 (1994)〕；Danilenkoら〔Journal of Clinical Investigation 95(2):842-851 (1995)〕は、ＮＤＦとＨＥＲ２受容体との相互作用は、創傷修復の際の表皮移動及び分化を指示するのに重要であることを見出した。
【００２０】
Ramら〔Journal of Cellular Physiology 163:589-596 (1995)〕は、不死化したヒト乳腺上皮細胞系統であるＭＣＦ−１０Ａに対する、ＮＤＦの分裂促進活性を評価した。Danilenkoら〔J. Clin. Invest. 95:842-851 (1995)〕は、ＮＤＦが、切開性の深い部分肥厚創傷修復のin vivoモデルでの表皮移動に影響を及ぼすか否かを調べた。対照創傷と対比したｒｈＮＤＦ−α₂処置創傷で、基底及び基底上ケラチノサイトの増殖には、統計的有意差が皆無であったと報告されている。Marikovskyら〔Oncogene, 10:1403-1411 (1995)〕は、異数性ＢＡＬＢ／ＭＫ連続ケラチノサイト細胞系の増殖応答を調べ、表皮ケラチノサイトに対するＮＤＦのα及びβイソ型の効果を評価した。
【００２１】
新規タンパク質の構造と機能との関係は、利用できる様々な突然変異分析手法のいずれを用いても調べることができる。そのような手法の例は、アラニン走査突然変異誘発、及びファージミドディスプレイを包含する。アラニン走査は、タンパク質又はタンパク質ドメイン中の活性残基（すなわち、タンパク質の機能に有意な効果を有する残基）を特定するのに用いることができる。例えば、Cunningham及びWellsは、アラニン走査を用いて、ヒト成長ホルモン中の、その受容体と結合するのに重要である残基を特定した〔Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989)〕。アラニン走査では、走査しようとするタンパク質又はドメインをコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、連続する残基がアラニンに変換されるタンパク質又はドメインをコードする、一連のベクターを生成するよう突然変異誘発を実施する。コードされるタンパク質又はドメインは、これらのベクターから発現され、そうして、アラニン置換変種の活性を試験して、変化した活性を有するものを特定する。活性の変化は、アラニン置換の位置の残基が活性残基であることを示す。
【００２２】
ファージミドディスプレイは、非常に多くの変種ポリペプチドを特定の結合活性についてスクリーニングするのを可能にするために開発された。Smith及びParmleyは、外来ペプチドが、ｆｄファージの遺伝子IIIに短い遺伝子フラグメントを挿入することによって、繊維状ファージの表面に効率的に「ディスプレイされる」ことができることを立証した〔Smith, Science 228:1315-1317 (1985)；Parmley & Smith, Gene 73:305-318 (1985)〕。遺伝子IIIコートタンパク質は、ファージ粒子の一端に約５コピーで存在する。改変されたファージは、遺伝子IIIコートタンパク質に融合した外来ペプチドをディスプレイするため、「融合ファージ」と名付けられた。ファージ粒子は、それぞれ約５コピーの融合タンパク質をディスプレイするため、このモードのファージディスプレイは、「多価ディスプレイ」と名付けられた。
【００２３】
Scottら及び Cwirlaらは、融合ファージライブラリーが、「パンニング」として知られる連続親和性選別によって、スクリーニングできることを示した〔Scott et al., Science 249:386-390 (1990)；Cwirla et al., PNAS USA 87:6378-6382 (1990)〕。しかし、高親和性融合ファージを選別するための初期の努力は、おそらくファージ粒子の多価性のために失敗した。この問題は、「一価」ファージディスプレイシステムの開発によって解決されたが、ここでは、融合タンパク質は、ファージミドから低レベルで発現され、ヘルパーファージが、大過剰量の野生型コートタンパク質を与える〔Bass et al., Proteins 8:309-314 (1990)；Lowman et al., Biochem., 30:10832-10838 (1991)〕。一価ファージディスプレイは、問題の標的に高親和力で結合するものを単離するために、非常に多くの変種ポリペプチドを生成かつスクリーニングするのに用いることができる。
【００２４】
米国では、毎年約５０，０００人の幼児が、１．５kg未満の出生時体重で誕生する。これら非常に少い出生時体重の幼児の約３分の２は、出生直後に呼吸困難として表明される、肺の未成熟の証拠を有する。これらの幼児の大多数は、人工呼吸を必要とする。不充分な肺界面活性剤生産はもとより、肺の構造的未成熟によっても生じる呼吸困難症候群が、これらの成熟前に生まれた新生児に認められる呼吸困難の原因である。肺の気液界面から全身的循環への効率的な酸素輸送を与えるには、充分に発達した肺胞が必要である。界面活性剤タンパク質は、低い肺容積での肺胞表面の張力を低下させ、肺胞の崩壊を防ぐのに決定的に重要である。
【００２５】
呼吸困難症候群、及び未成熟な肺の発達、及び低い肺界面活性剤生産に付随するその他の疾病を治療する方法に対して、必要性が存在し続けている。
【００２６】
発明の要約
一般的には、本発明の目的は、組織の損傷又は傷害の修復及び治癒を促進する目的で、上皮細胞の増殖及び発達を誘導する方法を提供することである。
【００２７】
上記により、本発明の一つの目的は、そのような治療を要する患者、専らヒトの患者における呼吸困難を治療する方法を提供することである。更に一つの目的は、肺上皮細胞の増殖及び発達を誘導する方法を提供することである。更に一つの目的は、肺胞での酸素輸送の欠陥を有する身体の肺における、肺界面活性剤タンパク質Ａの生産を増大させる方法を提供することである。本発明は、呼吸困難を有する幼児／新生児はもとより、肺の傷害又は損傷による肺機能の劣化を有する若年及び成年をも処置するのに役立つ。
【００２８】
本発明の一態様では、これらの目的、並びに上皮細胞の損傷及び傷害に付随する状態を処置するという、より広い目的は、そのような処置を必要とする患者に、有効量のヘレグリンリガンド、好ましくはそのポリペプチド又はフラグメントを投与することによって達成されることが、今では発見されている。これらのヘレグリン（ＨＲＧ）ポリペプチドは、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３、並びにこれらのファミリーのメンバーに対して産生した抗体と交差反応し、かつ／又は下記に定義されるとおり、実質的に相同であり、そのＮ末端及びＣ末端フラグメントのようなＨＲＧ変種を包含する、その他のＨＲＧポリペプチドを包含する。好適なＨＲＧは、図１Ａ〜１Ｄに開示され、その上ＨＲＧ−αと称されるリガンドである。その他の好適なＨＲＧは、図２Ａ〜２Ｅに開示され、ＨＲＧ−β１と称されるリガンド；図３Ａ〜３Ｅに開示され、ＨＲＧ−β２と称されるリガンド；並びに図４Ａ〜４Ｃに開示され、ＨＲＧ−β３と称されるリガンドである。
【００２９】
もう一つの態様では、本発明は、本発明の目的を達成するために、ＨＲＧアゴニスト抗体を投与する方法を提供する。この実施態様では、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、又はそのフラグメント（in vitroの方法によって合成されてもよい）を、（組換え発現、又はin vitroでのペプチジル結合によって）免疫原性ポリペプチドに融合させ、次いで、この融合ポリペプチドを用いて、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３エピトープに対する抗体を産生する。アゴニスト抗体は、感作した動物の血清から回収する。これに代えて、モノクローナル抗体を、in vitroで細胞からか、又はin vivoで感作した動物から慣用の方式で調製する。望みであれば、アゴニスト抗体は、抗体、又は抗体フラグメントのファージライブラリーから、ファージディスプレイ選別によって得てよい。定型的なスクリーニングによって特定される好適な抗体は、受容体には結合するが、ＥＧＦのような他のいかなる公知リガンドとも実質的に交差反応せず、ＨＥＲ受容体のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４を活性化することになる。加えて、ＨＲＧファミリーの個々のファミリーメンバー、例えばＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３に特異的に結合することができる、それらのアゴニストである抗体を選んでよい。
【００３０】
一般的には、本発明は、上皮細胞、特に管上皮や繊毛上皮の細胞の成長及び増殖を刺激することによって、上皮細胞の傷害を再生及び／又は修復する方法である。上皮細胞は、多くの種類の外傷、例えば外科的切開又は切除、化学物質又は煙の吸入若しくは吸引による傷害、化学的又は生化学的な潰瘍形成、ウイルス又は細菌の感染等々によって損傷され得る。本発明の方法によって影響され得る上皮細胞は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４を発現するいかなる上皮細胞も包含するが；適切な細胞は、例えば肺、胃粘膜、子宮内膜、輸卵管、乳腺、膵臓、唾液腺等々に位置する。本発明の方法は、上皮細胞の成長及び増殖を刺激して、器官の細胞障壁を修復かつ再確立し、影響された組織が正常な生理学的機能を一層速やかに発達させるのを可能にする。例えば、肺上皮細胞は、煙の吸入によって損傷されて、肺気腫を招く。本発明の方法による肺細胞の処置は、肺上皮細胞の障壁層を再生し、酸素付加を向上させ、感染に対する障壁の発達を加速する。同様に、胃酸の吸引による細胞損傷は、本発明の方法によって、上皮細胞の再生を促進するよう処置することができる。
【００３１】
したがって、本発明の一実施態様は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４受容体を発現する肺上皮細胞を、有効量のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４活性化リガンドに接触させることによって、肺上皮細胞の増殖及び発達を誘導する方法である。
【００３２】
もう一つの実施態様は、有効量のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４活性化リガンドを、それを必要とする患者に投与することによって、患者の肺界面活性剤プロテインＡを増加させる方法である。
【００３３】
もう一つの実施態様は、有効量のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４活性化リガンドを、それを必要とする患者に投与することによって、呼吸困難を処置する方法である。
【００３４】
もう一つの実施態様は、有効量のＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４活性化リガンドを、それを必要とする患者に投与することによって、肺気腫を処置する方法である。
【００３５】
好適実施態様の詳細な説明
ＨＲＧリガンド、特にそのポリペプチド、及びアゴニスト抗体は、自己リン酸化の際に、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ４受容体、又はそれらの組合せに対する親和性を有し、それらを刺激する。ＨＲＧリガンドの定義には、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３及びＨＲＧ−β２様に加え、ＨＲＧ−α又はＨＲＧ−β１との実質的なアミノ酸配列相同性を有する、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ４受容体に結合するその他のポリペプチドが包含される。そのような更なるポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／若しくはＨＥＲ４受容体に結合するポリペプチドリガンドのファミリーとして、ＨＲＧの定義に属する。
【００３６】
ヘレグリンポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４受容体に様々な親和力で結合する。一般的には、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４受容体が、高い親和力で結合する。ＨＥＲ２とＨＥＲ３、及びＨＥＲ２とＨＥＲ４のヘテロ二量体化が、その後の、上記の受容体交差リン酸化とともに生じることも、公知である。本発明では、ヘレグリンタンパク質が、個々の受容体分子又は受容体二量体と作用し合い、かつ結合する結果、受容体リン酸化が誘導されるときに、上皮細胞の成長及び／又は増殖が誘導される。したがって、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はそれらの組合せの結合及び活性化は、受容体の活性化及び生物学的機能に必要な、単量体の受容体、及び二量体の受容体の形態を包含するいかなる形態の受容体の活性化も包含するものとする。二量体の受容体の形態は、下記に、例えば、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ２／ＨＥＲ４及びＨＥＲ３／ＨＥＲ４と称されることがある。
【００３７】
Ｉ．定義
一般に、説明、実施例及びクレームに用いられたときの下記の語句は、示した定義を有する。
【００３８】
「ヘレグリン」（ＨＲＧ）リガンドは、本明細書では、自然に生じるＨＲＧポリペプチドの生物学的特性を有する、単離されたいかなるリガンド、好ましくはポリペプチド配列でもあると定義される。本発明の対象範囲内のリガンドは、上記に特定されたＮＤＦ、ＡＲＩＡ及びＧＧＦの増殖因子のヘレグリンタンパク質はもとより、本明細書で詳細に考察されるＳＭＤＦ及びＨＲＧポリペプチドも包含する。これらの単離されたＮＤＦ、ＡＲＩＡ及びＧＧＦヘレグリンは、当技術で周知である。ＨＲＧは、図１Ａ〜１Ｄ、２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｅ、４Ａ〜４Ｃ、５Ａ〜５Ｄ、６Ａ〜６Ｃ、７Ａ〜７Ｃ及び８に示したポリペプチド、並びにそれらの哺乳動物の類似体を包含する。包含されるのは、１９９８年１月２２日に刊行された国際公開特許第９８／０２５４１号公報に記載されたγ−ＨＲＧ；１９９８年８月１３日に刊行された国際公開特許第９８／３５０３６号公報に記載された変種；及び１９９８年６月２３日に付与された米国特許第５，７７０，５６７号明細書（国際公開特許第９６／１５２４４号公報）に記載されたＳＭＤＦ変種である。これらの出願は、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの変種は、場合により、当技術に公知のアラニン走査及びファージディスプレイの手法とともに、下記に記載された方法によって調製することができる〔Cunningham & Wells, Science 244:1081-85 (1989)；Bass et al., Proteins 8:309-14 (1990)；Lowman et al., Biochem., 30:10832-38 (1991)〕。
【００３９】
用語「正常な」上皮細胞は、形質転換されていない、すなわち癌性でないか、及び／又は不死化されていない上皮細胞を意味する。更に、正常な上皮細胞は、好ましくは、異数体ではない。異数性は、細胞の核が染色体の半数体の正確な倍数を含まずに、一本以上の染色体が、残りより大きいか、又は小さい数で存在するときに存在する。本発明の対象範囲外に属する、形質転換された細胞の代表的な特性は、免疫欠損させたマウス（ヌードマウス）に移植したとき、腫瘍を形成できる能力、懸濁液、又は寒天のような半固形培地中で増殖できる能力、コロニー又はフォーカスへと細胞の積み重なりを可能にする、接触阻害の喪失、増殖因子又は血清への依存性の喪失、細胞が増殖を阻害されたときの細胞死、及びアクチン繊維の崩壊を包含する。本発明に具体的に包含されるのは、マウスに腫瘍を形成せず、プラスチック又はガラスに付着して増殖せず（足場依存性である）、接触阻害を示し、ホルモン及び増殖因子を含有する血清を必要とし、血清の欠如によって増殖が停止された場合に生存可能に存続し、充分に組織化されたアクチン繊維を有するような、正常な上皮細胞である。正常な上皮細胞は、好ましくは、培養された細胞ではないが、哺乳動物組織から単離された、形質転換されていない、不死化されていない上皮細胞も、本発明に適する。これらの上皮細胞は、単離された上皮細胞サンプルの成長及び／又は増殖を誘導するために、すなわちサンプルを拡大するために、ヘレグリンの存在下で数世代（約１０又は５０世代までさえ）培養してよい。そうして、拡大されたサンプルを、上皮細胞組織を再増殖する目的で、哺乳動物に再導入することができる（再上皮化）。これは、組織傷害又は損傷を修復するのに特に役立つ。
【００４０】
「上皮」細胞は、器官の自由表面（角質、粘膜又は獎膜性の）を被覆するか、又は動物体の管若しくは体腔を裏打ちする、細胞性で非脈管性の層に位置する細胞である。肺上皮細胞は、気管支上皮細胞、第II型細胞及びクララ細胞を包含する。本明細書に用いられる限りでの用語「上皮細胞」は、上皮内の上皮細胞の、当技術に認められた定義と整合する。例えば、Taber′s Encyclopedic Medical Dictionary, Edition 12 (1973) F.A. Davis Company, publisherを参照されたい。
【００４１】
本明細書の目的での「生物学的特性」は、ＨＲＧ配列が（その未変性であるか、又は変性した席次構造であるかに拘わらず）直接又は間接的に果たす、in vivoでの生物学的若しくは抗原性機能又は活性を意味する。生物学的機能は、受容体結合、いかなる酵素活性又は酵素調節活性、いかなる担体結合活性、いかなるホルモン活性、細胞外基質若しくは細胞表面分子への細胞の付着を促進又は阻害する、いかなる活性、或いはいかなる構造的役割も包含する。しかし、生物学的機能は、抗原機能、すなわち、自然に生じるＨＲＧポリペプチドに対して誘導された抗体と交差反応できる、エピトープ又は抗原部位の保有を包含しない。
【００４２】
「生物学的に活性である」ＨＲＧは、本明細書では、ＨＲＧ配列の生物学的機能を共有し、その上、抗原機能を保有してよい（が、必ずしも必要ではない）ポリペプチドとして定義される。ＨＲＧの公知の主要な効果は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４に結合する定性的な生物学的活性を有する結果、受容体チロシンキナーゼの活性を生じるリガンドポリペプチド（「活性化リガンド」）としてのそれである。活性化リガンドについての一試験は、下記のＨＲＧチロシン自己リン酸化アッセイである。この用語が本明細書に用いられる限りでのＨＲＧの範囲内には、本明細書で説明されるとおりの完全なヒトＨＲＧの、翻訳された成熟アミノ酸配列を有するＨＲＧ；脱グリコシルされたか、又は糖鎖未形成であるＨＲＧ誘導体；ＨＲＧ配列のアミノ酸配列の変種；及びＨＲＧに共通する生物学的特性を示すことができる、ＨＲＧ誘導体が包含される。未変性ＨＥＲは、膜に結合したポリペプチドである、可溶性形態、例えば、機能的な膜貫通ドメインを欠く形態のそれも、この定義に包含される。特に、ＨＲＧ配列の、約Ｓ２１６から約Ａ２２７までのいかなる残基にもＮ末端を、また約Ｋ２６８からほぼＲ２８６までのいかなる残基にもＣ末端を有するポリペプチドフラグメント、及び図６Ａ〜Ｃに示した相同配列が包含され、以下、すべてのＨＲＧについて、集合的に増殖因子ドメイン（ＧＦＤ）と称することにする。
【００４３】
「抗原的に活性である」ＨＲＧは、ＨＲＧの抗原機能を保有し、その上、生物学的機能を保有してよい（が、必ずしも必要ではない）ポリペプチドとして定義される。
【００４４】
好適実施態様では、抗原的に活性であるＨＲＧは、自然に生じるＨＲＧ配列に対して産生した抗体に、少なくとも約１０^-9L／Mの親和力で結合するポリペプチドである。通常、このポリペプチドは、少なくとも約１０^-8L／Mの親和力で結合する。最も好ましくは、抗原的活性ＨＲＧは、その未変性の席次構造でのＨＲＧの一つに対して産生した抗体に結合する、ポリペプチドである。未変性の席次構造でのＨＲＧは、一般的には、例えば非還元性、非変性性のサイズ決定用ゲル上での移動によって決定されたとおりの、ＨＲＧの三次元構造を実質的に改変する、カオトロピック作用因子、熱その他の処理によって変性されていない、天然に見出されるとおりのＨＲＧである。この決定に用いられる抗体は、フロイント完全アジュバント中で、ウサギでない種から未変性ＨＲＧを配合し、この配合物を皮下注射し、抗ＨＲＧ抗体の力価がプラトーに達するまで、配合物の腹腔内注射によって免疫応答を追加刺激することによって誘導した、ウサギポリクローナル抗体であってよい。
【００４５】
通常、生物学的又は抗原的活性ＨＲＧは、与えられたＨＲＧ配列との７５％以上、より好ましくは８０％以上、はるかに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上のアミノ酸配列同一性を有すると思われる。あるＨＲＧに関しての同一性又は相同性は、本明細書では、必要ならば、配列を整合させ、ギャップを導入して、最高の相同性の百分率を達成し、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換も斟酌しなかった後の、図６Ａ〜６ＣのＨＲＧ中のＨＲＧ残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。ＨＲＧ配列のＮ末端、Ｃ末端又は内部のいかなる延長、欠失又は挿入も、相同性に影響するとして解してはならない。
【００４６】
したがって、本発明の主題である、生物学的活性及び抗原的活性ＨＲＧポリペプチドは、それぞれ、ＨＲＧ配列全体；ＨＲＧ配列からの少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０又は４０アミノ酸残基の連続的配列；アミノ酸残基がＨＲＧ配列に対してか、又はその中にＮ末端若しくはＣ末端で挿入された、ＨＲＧ配列のアミノ酸配列変種、或いは上記に定義されたとおりのそのフラグメント；もう一つの残基で置換された、上記に定義されたとおりのＨＲＧ配列のアミノ酸配列変種、又はそのフラグメントを包含する。ＨＲＧポリペプチドは、例えば、部位指向性又はＰＣＲ突然変異誘発によって、あらかじめ決定された突然変異を含むもの、及びウサギ、ラット、ブタ、ヒトでない霊長類、ウマ、マウス及びヒツジのＨＲＧのような他の動物種のＨＲＧポリペプチド、並びに前記及びヒトの配列の対立遺伝子、その他の自然に生じる変種；ＨＲＧ又はそのフラグメントが、自然に生じるアミノ酸以外の部分（例えば酵素又は放射性同位元素のような検出できる部分）との置換、化学的、酵素的その他適切な手段で共有結合により改変されている、上記に定義されたとおりのＨＲＧ誘導体、又はそのフラグメント；ＨＲＧの糖鎖形成変種（適切なアミノ酸の欠失、挿入または置換による、いかなる糖鎖形成部位の挿入、又はいかなる糖鎖形成部位の欠失）；並びにＨＲＧの可溶性形態、例えばＨＲＧ−ＧＦＤ、又は機能的膜貫通ドメインを欠くそれらを包含する。
【００４７】
「単離された」は、その天然の環境の構成要素から特定され、かつ分離及び／又は回収されたリガンド、例えばＨＲＧを意味する。その天然の環境の混入構成要素は、ＨＲＧに対する診断又は治療の用途に干渉するような材料であり、タンパク質、ホルモンその他の物質を包含し得る。好適実施態様では、ＨＲＧは、（１）ローリー法その他の確認されたタンパク質決定法によって決定された限りで、９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超のタンパク質まで、（２）本明細書の受理日の時点で市販される商業的に入手できる最良のアミノ酸シークエンス装置の使用によって、Ｎ末端又は内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに充分な程度まで、或いは（３）クーマシーブルー、又は好ましくは銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製されることになる。単離されたＨＲＧは、ＨＲＧの天然の環境の少なくとも一つの構成要素が存在しないことになるため、組換え細胞内のin situでのＨＲＧを包含する。単離ＨＲＧは、そのような状況でのＨＲＧが供給源のポリペプチドを欠くことになるため、もう一つの種の組換え細胞培養体中の一つの種からのＨＲＧを包含する。しかし、通常は、単離ＨＲＧは、少なくとも一つの精製工程によって調製されることになる。
【００４８】
本発明によれば、ＨＲＧ核酸は、生物学的又は抗原的に活性なＨＲＧをコードする１０塩基より多くを含むＲＮＡ又はＤＮＡであり、そのようなＨＲＧをコードする核酸配列に相補的であるか、又はそのようなＨＲＧをコードする核酸配列とハイブリダイズし、そして緊縮条件下でそれと安定的に結合して存続する。
【００４９】
好ましくは、ＨＲＧ核酸は、７５％以上、より好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、はるかに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性をＨＲＧ配列と共有するポリペプチドをコードする。好ましくは、ハイブリダイズするＨＲＧ核酸は、２０以上、より好ましくは約４０以上、最も好ましくは約９０以上の塩基を有する。
【００５０】
単離されたＨＲＧ核酸は、ＨＲＧ核酸の天然の供給源に通常付随する、少なくとも１種類の包有核酸から特定かつ分離される核酸を包含する。したがって、単離ＨＲＧ核酸は、それが自然界に見出される以外の形態又は態様で存在する。しかし、単離ＨＲＧコーディング核酸は、核酸が、天然の細胞のそれとは異なる染色体の位置に存在するか、又は別途自然界に見出されるそれと異なるＤＮＡ配列に挟まれている、ＨＲＧを通常発現する細胞内のＨＲＧ核酸を包含する。核酸コーディングＨＲＧ、特にＨＲＧコーディング配列の、他の公知のＤＮＡ配列とハイブリダイズしない部分は、特定のハイブリダイゼーションアッセイに用い得る。「緊縮条件（stringent condition）」は、（１）洗浄のために、低いイオン強度、及び温度、例えば、５０℃で、０．０１５MＮａＣｌ／０．００１５Mクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ₄を用いるか；（２）ハイブリダイゼーションの際に、ホルムアミドのような変性剤、例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミンとともに５０％（容量／容量）のホルムアミド、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０mMＮａＣｌとともにpH６．５の５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、７５mMクエン酸ナトリウムを用いるか；又は（３）４２℃で、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５MＮａＣｌ、０．０７５Mのクエン酸ナトリウム）、５０mMのリン酸ナトリウム（pH６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０g／ml）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを用い、４２℃で、０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで洗浄するそれである。
【００５１】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物体内の作動可能に結合したコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーターー、場合によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、及びおそらくは、その他の未だに僅かに理解されているにすぎない配列を包含する。真核生物は、プロモーターー、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーーを利用することが知られている。
【００５２】
核酸は、もう一つの核酸配列と作動可能な関係に置かれたときに、「作動可能に結合され」る。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現されるならば、そのポリペプチドに対するＤＮＡに作動可能に結合され；プロモーターー又はエンハンサーーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コーディング配列に作動可能に結合され；或いはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように定置されるならば、コーディング配列に作動可能に結合される。一般に、「作動可能に結合された」は、結合されるＤＮＡ配列が隣接し、分泌リーダーの場合は、隣接し、かつ読み取りの位相にあることを意味する。しかし、エンハンサーーは、隣接する必要はない。結合は、好都合な制限部位での結合を伴う。そのような部位が存在しないならば、慣用の実施に従って、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーを用いる。
【００５３】
「外因性の」要素は、本明細書では、細胞に対して外来的であるか、又は細胞に対して相同であるが、宿主細胞の核酸内の、該要素が通常は見出されない位置にある核酸配列を意味すると定義される。
【００５４】
本明細書に用いられる限りで、表現「細胞」、「細胞系」及び「細胞培養（体）」は、互換的に用いられ、そのような指定はすべて、子孫を包含する。したがって、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代の対象細胞、及び継代の数に関りなく、それから派生した培養体を包含する。また、故意又は偶然の突然変異により、すべての子孫は、ＤＮＡの内容が厳密に同一でなくともよいと理解される。初めに形質転換された細胞でスクリーニングされたのと同じ機能又は生物学的活性を有する、突然変異種の子孫は包含される。それは、明確な指定が意図される文脈から明らかであると思われる。
【００５５】
「プラスミド」は、大文字及び／又は数字が先行及び／又は後続する、小文字の「ｐ」によって指定される。本明細書中の出発プラスミドは、市販であるか、無制限の形で公然と入手可能であるか、又はそのような入手できるプラスミドから、刊行された手順に従って構築することができる。加えて、他の
等価のプラスミドが当技術に公知であり、当業者には明白であると思われる。
【００５６】
ＤＮＡの「制限酵素消化」は、ＤＮＡの一定の位置でのみ作用するにすぎない酵素による、ＤＮＡの触媒性切断を意味する。そのような酵素は、制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、それぞれがそれに特異的である部位は、制限部位と呼ばれる。本明細書で用いられる様々な制限酵素は、市販であり、それらの反応条件、補助因子、その他の要件は、酵素供給者が確立したとおりに用いられる。制限酵素は、一般的には、それぞれの制限酵素が初めて得られた微生物を表す、その他の文字が後続する一つの大文字と、次いで個々の酵素を指定する数字とで構成される略号によって指定される。一般に、プラスミド又はＤＮＡフラグメント約１mgを、緩衝液約２０ml中の酵素約１〜２単位とともに用いる。個々の制限酵素に適した緩衝液及び基質は、製造業者によって指定される。通常、３７℃で約１時間のインキュベーションが用いられるが、供給者の指示に従って変動し得る。インキュベーション後、フェノール及びクロロホルムによる抽出によって、タンパク質又はポリペプチドを除去し、消化された核酸を、エタノールによる沈澱によって、水性画分から回収する。制限酵素による消化の後に、細菌のアルカリホスファターゼ加水分解による、末端５′リン酸の加水分解を実施して、ＤＮＡフラグメントの二つの制限切断末端が、「環化」するか、又は制限部位でのもう一つのＤＮＡフラグメントの挿入を阻止するような閉じられたループを形成するのを防いでもよい。別途記述のない限り、プラスミドの消化は、５′末端の脱リン酸化が後続しない。脱リン酸化のための手順及び試薬は、Sambrookら〔Molecular Cloning: A Laboratory Manual New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989〕のセクション１．５６〜１．６１に記載されたとおり、慣用的である。
【００５７】
ＤＮＡの与えられたフラグメントの、制限消化からの「回収」又は「単離」は、電気泳動によるポリアクリルアミド又はアガロース上の消化物の分離、その移動度と、既知分子量のマーカーＤＮＡフラグメントのそれとの比較による、問題のフラグメントの特定、望みのフラグメントを含有するゲル切片の取出し、及びＤＮＡからのゲルの分離を意味する。この手順は、一般的に公知である。例えばLawn et al., Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 (1981)、及びGoeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)を参照されたい。
【００５８】
「ノーザン分析」は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡフラグメント、ｃＤＮＡ若しくはそのフラグメント、又はＲＮＡフラグメントのような既知のプローブとハイブリダイズするＲＮＡ配列を特定するのに用いられる方法である。³²Ｐのような放射性同位元素でか、ビオチン化によってか、又は酵素でプローブを標識化する。分析しようとするＲＮＡは、通常、Sambrookら〔前掲〕のセクション７．３９〜７．５２に記載されたそれのような、当業者に周知の標準的手法を用いて、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロース、ナイロンその他の適切な膜に移転し、プローブとハイブリダイズさせる。
【００５９】
「ライゲーション」は、二つの核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を形成する工程を意味する。ＤＮＡフラグメントを一緒にライゲーションするには、ＤＮＡフラグメントの末端が、互いに適合性でなければならない。ある場合には、末端は、エンドヌクレアーゼ消化後に直ちに適合性となる。しかし、初めに、エンドヌクレアーゼ消化後に一般的に形成される、食違いのある末端を、平滑末端に変換して、結合に適合性にさせるのが必要なことがある。末端を平滑化するには、ＤＮＡを、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下、適切な緩衝液中で、１５℃で少なくとも１５分間、約１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理する。次いで、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱によって、ＤＮＡを精製する。一緒にライゲーションしようとするＤＮＡフラグメントは、ほぼ等M量で溶液に入れる。溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、及びＤＮＡ０．５mgあたり約１０単位でＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼも、含有する。ＤＮＡをベクター内にライゲーションしようとするならば、初めに、ベクターを、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線状化する。次いで、線状化したフラグメントを、細菌アルカリホスファターゼ、又は子ウシ腸ホスファターゼで処理して、ライゲーション工程中の自己ライゲーションを防ぐ。
【００６０】
細胞からのＤＮＡの「調製」は、プラスミドＤＮＡを宿主細胞の培養体から単離することを意味する。ＤＮＡ調製に一般的に用いられる方法は、Sambrookら〔前掲〕のセクション１．２５〜１．３３に記載された、大規模及び小規模プラスミド調製である。ＤＮＡを調製した後、Sambrookら〔前掲〕のセクション１．４０に記載されたそれのような、当技術に周知の方法によって、精製することができる。
【００６１】
「オリゴヌクレオチド」は、１９８８年５月４日に刊行されたヨーロッパ特許第２６６，０３２号公報に記載されたような固相手法を用いるか、又はFrochler et al., Nucl. Acids Res. 14:5399-5407 (1986)が記載したとおりの、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホン酸という中間体を介する（ホスホトリエステル、亜リン酸塩又はアミドリン酸塩化学のような）公知の方法によって化学的に合成される、短鎖長、一本鎖又は二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。次いで、ポリアクリルアミドゲル上で精製する。
【００６２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」という手法は、本明細書に用いられる限りでは、一般に、核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の一片の微小量を、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号明細書に記載されたとおりに増幅する手順を意味する。一般に、問題の領域、又はそれを越える領域の末端からの配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーが設計できるよう、利用できるようにする必要があり；これらのプライマーは、増幅しようとするテンプレートの対面する鎖と配列が同一であるか、又はそれに類似することになる。二つのプライマーの５′末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端に符合し得る。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージ又はプラスミド等々を増幅するのに用いることができる。一般的には、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol., 51:263 (1987)；Erlich,, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1969) を参照されたい。本明細書に用いられる限りで、ＰＣＲは、公知の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）をプライマーとして用いることを含む、核酸の試験サンプルを増幅する、核酸ポリメラーゼ反応法の一つであるが、唯一ではない例であると考えられ；核酸ポリメラーゼを用いて、核酸の特定の一片を増幅若しくは生成するか、又は特定の核酸と相補的である、核酸の特定の一片を増幅若しくは生成する。
【００６３】
ＨＲＧリガンドの存在又は生物活性を検出するための「ＨＲＧチロシン自己リン酸化アッセイ」は、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３受容体の精製を評価するのに用いることができる。このアッセイは、ＥＧＦと、そのＥＧＦ受容体自己リン酸化の刺激との類推において、受容体に特異的なリガンドは、受容体の自己リン酸化を刺激するであろうという仮定に基づく。Sadich et al., Anal. Biochem. 235:207-214 (1996)を参照されたい。高レベルのｐ１８５^HER2受容体を有するが、無視できるレベルのヒトＥＧＦ受容体を有するＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞又はＭＣＦ７細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection, Rockville, Md）から得て（ＡＴＣＣ第HTB-131号）、１０％の子ウシ血清を含むＤＭＥＭ／ＨａｍｓＦ１２（１：１）培地での組織培養で維持した。アッセイ用に、細胞を、トリプシン処理し、２４穴のディッシュ（Costar）に１５０，０００細胞／ウェルで播種した。血清含有培地で終夜インキュベーションした後、細胞を無血清培地に２〜１８時間置いてから、アッセイに付した。１００μｌのアリコートの試験サンプルを、各ウェルに加えた。細胞を、３７℃で５〜３０分間（典型的には３０分間）インキュベーションし、培地を除去した。各ウェル内の細胞をＳＤＳゲル変性用緩衝液（SEPROSOL, Enpotech, Inc.）１００μlで処理し、プレートを１００℃で５分間加熱して、細胞を溶解し、タンパク質を変性させた。各ウェルからのアリコートを、５〜２０％の勾配のＳＤＳゲル（NOVEX, Encinitas, CA）上で、製造業者の指示に従って、電気泳動した。色素先端がゲルの下部に達した後、電気泳動を終結し、ＰＶＤＦ膜（PROBLOTT, ABI）をゲルに乗せ、タンパク質を、ブロッティングチャンバー（BioRad）内で、２００mAで３０〜６０分間ゲルから膜へとトランスファーした。ブロッティングの後、膜、０．１％トゥイーン２０の洗剤緩衝液を５％ＢＳＡとともに含有するトリス緩衝生理食塩水とともに２〜１８時間インキュベーションして、非特異的結合を遮断し、次いで、マウス抗ホスホチロシン抗体（Upstate Biological Inc., N.Y.）で処理した。その後、膜のブロットを、アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギ抗マウス抗体で処理した。Promega社のPROTOBLOTシステムを用いて、ゲルを現象した。膜を染色した後、各サンプルレーンのｐ１８５^HER2に相当するバンドの密度を、マッキントッシュのコンピュータに取り付けたHewlett Packard社のSCANJET Plusスキャナーで定量した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の１細胞あたりの受容体の数は、これらの実験条件下では、ｐ１８５^HER2受容体タンパク質が、標識化されている主要のタンパク質であるようなそれである。
【００６４】
「タンパク質ミクロシークエンシング」は、下記の手順に基づいて遂行した。最終ＨＰＬＣ工程からのタンパク質を、１２０ＡのＰＴＨアミノ酸分析装置を装備したモデル４７０ＡというApplied Biosystems社の気相シークエンサーによる、自動化されたエドマン分解によって直接にか、又は様々な化学物質もしくは酵素による消化後にかのいずれかでシークエンスした。ＰＴＨアミノ酸は、CHROMPERFECTデータシステム（Justice Innovations, Palo Alto, CA）を用いて組み込んだ。配列の解釈は、記載のとおり〔Henzel et al., J. Chromatography 404:41-52 (1987)〕、ＶＡＸ１１／７８５というDigital Equipment Corporation社のコンピュータで実施した。ある場合には、ＨＰＬＣ画分のアリコートを、５〜２０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、ＰＤＶＦ膜（PROBLOTT, ABI, Foster City, CA）にエレクトロトランスファーし、クーマシーブリリアントブルーで染色した〔Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035-10038〕。特定のタンパク質を、ブロットから切り出して、Ｎ末端シークエンスに付した。内部タンパク質シークエンスするため、ＨＰＬＣ画分を減圧下で乾燥し（SPEEDVAC）、適切な緩衝液で再懸濁し、臭化シアン、リシン特異酵素のLys-C（Wako Chemicals, Richmond, VA）又はAsp-N（Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind）で消化した。消化の後、得られたペプチドを、混合物としてシークエンスしたか、又は０．１％ＴＦＡ中のプロパノール勾配で展開するＣ４カラムでのＨＰＬＣによって分離してから、上記のとおりシークエンスした。
【００６５】
「抗体（Ａｂ）」及び「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、抗原特異性を欠くその他の抗体様分子との双方を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、またミエローマによって高レベルで生産される。
【００６６】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、それぞれ単一の抗原結合部位を有する、二つの同一の抗原結合性フラグメントと、その名称が、容易に結晶化できることを反映する、残余の「Ｆｃ」フラグメントとを生じる。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋結合できる、Ｆ（ａｂ′）₂フラグメントを生じる。
【００６７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を有する、最小限の抗体フラグメントである。この領域は、緊密に非共有結合で会合した、一つのＨ鎖と、一つのＬ鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの三つの超可変領域が作用し合って、Ｖ_H−Ｖ_L二量体の表面に抗原結合部位を画定するのは、この立体配置においてである。集合的には、６個の超可変領域が、抗原結合特異性を抗体に賦与する。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３個の超可変領域のみを含むにすぎない、Ｆvの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和力でではあるが、抗原を認識し、かつそれに結合できる能力を有する。
【００６８】
Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖の定常ドメイン、及びＨ鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も有する。Ｆａｂ′フラグメントは、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体のヒンジ領域からの一つ又はそれ以上のシステインを包含する、いくつかの残基の付加があることが、Ｆａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ′−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有する、Ｆａｂ′の呼称である。Ｆ（ａｂ′）₂抗体フラグメントは、本来は、１対のＦａｂ′フラグメントとして生産され、それらの間のヒンジとなるシステインを有する。抗体フラグメントのその他の化学的カップリングも公知である。
【００６９】
いかなる脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「Ｌ鎖」も、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、二つの明確に区別される種類のうち一方に割り振ることができる。
【００７０】
Ｈ鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り振ることができる。免疫グロブリンの５大クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、そのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に更に区分し得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応するＨ鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
【００７１】
本明細書での用語「抗体」は、より広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を包含）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び望みの生物学的活性を示す限りでの抗体フラグメントを網羅する。
【００７２】
「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合又は可変ドメインを含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）₂及びＦｖフラグメント；ダイアボディー；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を包含する。
【００７３】
本明細書に用いられる限りでの、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質である抗体の集団から得られた抗体を意味する。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、僅かな量で存在し得る、天然に生じ得る突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であって、単一の抗原性部位に対して方向付けられる。更に、代表的には異なる決定基（エピトープ）に対して方向付けられた異なる抗体を包含する、慣用の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して方向付けられる。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるような、抗体の性質を示し、いかなる特定の方法による抗体の生産を要求するとも解してはならない。例えば、本発明に従って用いようとするモノクローナル抗体は、Kohlerら〔Nature 256:495 (1975)〕が最初に記載したハイブリドーマ法によって製造してよいか、又は組換えDNA法によって製造してよい〔米国特許第4,816,567号明細書を参照されたい〕。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された手法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００７４】
モノクローナル抗体は、本明細書では、Ｈ鎖及び／又はＬ鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一若しくは相同であるが、該鎖の残余は、もう一つの種に由来する抗体、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体はもとより、望みの生物学的活性をそれが示す限り、そのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一若しくは相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特定して包含する〔米国特許第4,816,567号明細書；及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)〕。
【００７５】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を有する、キメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域が、マウス、ラット、ウサギ、又はヒトでない霊長類のような種（供与者抗体）からの、望みの特異性、親和力及び容量を有する超領域で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基で置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、受容者抗体又は供与者抗体には見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能を更に洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべて、又は実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲのすべて、又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のそれである、少なくとも一つ、代表的には二つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになる。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（ＦＣ）の少なくとも１部分、代表的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むことになる。それ以上の詳細については、Jounes et al., Nature 321:522-525 (1986)；Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【００７６】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_H及びＶ_Lドメインを含むが、ここで、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが、抗原結合のために望みの構造を形成するのを可能にする、ポリペプチドリンカーをＶ_H及びＶ_Lドメイン間に含む。ｓＦｖの総説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg & Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)中のPluckthunを参照されたい。
【００７７】
用語「ダイアボディー」は、二つの抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを意味し、該フラグメントは、Ｌ鎖可変ドメイン（Ｖ_L）に結合したＨ鎖可変ドメイン（Ｖ_H）を、同じポリペプチド鎖（Ｖ_H−Ｖ_L）中に含む。同じ鎖の二つのドメイン間の対合を可能にするには短かすぎるリンカーを用いることによって、ドメインは、もう一つの鎖の相補的ドメインと強いて対合させられ、二つの抗原結合部位を生じる。ダイアボディーは、例えばヨーロッパ特許第４０４，０９７号公報；国際公開特許第９３／１１１６１号公報；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に、より充分に記載されている。
【００７８】
本出願の全体を通して用いられるときの表現「線状抗体」は、Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。略述すると、これらの抗体は、１対の抗原結合領域を形成する、１対の縦列Ｆｄセグメント（Ｖ_H−Ｃ_H１−Ｖ_H−Ｃ_H１）を含む。線状抗体は、二重特異性又は単一特異性であることができる。
【００７９】
II. ＨＲＧ配列の使用と調製
Ｈ．変異体を含むＨＲＧ配列の調製
ＨＲＧ配列を調製する上で利用されるべき系は、選択された特定のＨＲＧ配列によって左右されることになる。この配列が充分に小さい場合は、ＨＲＧは in vitro ポリペプチド合成方法によって調製されうる。しかしながら最も一般的には、ＨＲＧは、以下で記述する宿主ベクター系を用いた組換え型細胞培養の中で調製されることになる。適切なＨＲＧとしては、生物学的に活性で抗原的に活性なあらゆるＨＲＧが含まれる。
【００８０】
一般に、哺乳動物の宿主細胞が利用され、かかる宿主は、正常な要領でＨＲＧプレプロ配列を処理するための翻訳後系を含んでいてもいなくてもよい。宿主細胞がかかる系を含有している場合には、培養からＨＲＧ−ＧＦＤといったような天然サブドメインフラグメントを回収することが可能となる。含有しない場合には、必要とされる酵素で宿主を形質転換するか又は in vitro 方法でそれらを供給することによって、適切な処理を達成することができる。しかしながら、ＨＲＧ−ＧＦＤといったようなＨＲＧ配列のフラグメントを産生することしか望まない場合には、選択されたＨＲＧについての完全なプレプロ又は構造遺伝子で細胞を形質転換する必要はない。例えば、ＨＲＧ−ＧＦＤをコードするＤＮＡの５′末端に開始コドンが連結され、このＤＮＡは、宿主細胞を形質転換するために使用され、産物は直接Ｍet Ｎ末端形態として発現される（所望する場合、外来性Ｍetをin vitroで又は内在性Ｎ末端デメチオニラーゼにより除去することができる）。代替的には、ＨＲＧ−ＧＦＤは、宿主細胞により認識されたシグナル配列との融合として発現され、これは、以下でさらに記述するように成熟ＨＲＧ−ＧＦＤを処理し分泌する。未変性ＨＲＧ−ＧＦＤ配列のアミノ酸配列変異体も同じ要領で産生される。
【００８１】
ＨＲＧ−ＧＦＤ配列の第１のＮ末端残基と第１のＮ末端成熟残基の間にある、ＨＲＧ−ＮＴＤと呼ばれるＨＲＧ配列は、少なくとも部分的に、従来通りでないシグナル配列として又はユニークな生物活性をもつＨＲＧ−ＧＦＤのための正常に循環する担体／前駆物質として機能することができる。ＨＲＧ−ＮＴＤは、全長分子と同じ要領で産生されるが、停止コドンがＨＲＧ−ＮＴＤのＣ末端にあるようなＤＮＡの発現から産生される。さらに、ＨＲＧ変異体は、ＧＦＤ及びＮＴＤドメインの両方共がその適正な方向にあるものの、 in vivo でのＮＴＤ−ＧＦＤ接合部位のタンパク質分解分割を阻害又は防止するＧＦＤ−ＮＴＤ分割部位（配列ＶＫＣ内にある）におけるアミノ配の挿入、欠失又は置換を含むタンパク質をコードするＤＮＡから発現され、ここでＧＦＤ−コーディング配列の３′末端に停止コドンが位置づけされている。このグループの変異体（ＨＲＧ−ＮＴＤＸＧＦＤと呼ばれる）の例においては、（１）ＮＴＤ−ＧＦＤジョイニング配列ＶＫＣの中に見られるリシン残基は、欠失されているか又は（好ましくは）ヒスチジル、アラニル、トレオニル又はセリルといったようなアルギニル以外のもう１つの残基により置換されており、（２）停止コドンがシステイニル又はトレオニル（ＨＲＧ−αについて）又はグルタミニル（ＨＲＧ−βについて）の代りにＲＣＴ又はＲＣＱの配列に導入される。
【００８２】
ｐ１８５^HER2に対する結合親和力をもつ好ましいＨＲＧ−αリガンドには、図１Ａ〜Ｄのアミノ酸２２６〜２６５が含まれている。このＨＲＧ−αリガンドにはさらに、アミノ酸２２６に先行する付加的な１〜２０個のアミノ酸とアミノ酸２６５に続く１〜２０個のアミノ酸が含むことができる。ｐ１８５^HER2に対する結合親和力をもつ好ましいＨＲＧ−βリガンドには、図２Ａ〜Ｅのアミノ酸２２６〜２６５が含まれる。このＨＲＧ−βリガンドは、アミノ酸２２６に先行する付加的な１〜２０個のアミノ酸とアミノ酸２６５に続く１〜２０個のアミノ酸を含むことができる。
【００８３】
以上で指摘したように、本発明に従って調製されるべきその他のＨＲＧ配列は、ＧＦＤのものである。これらは in vitro で合成されるか又は、組換え型細胞培養の中で産生される。これらは、酵母又は E. coliの中で、上述のとおりＨＲＧ−非相同シグナルの制御下での分泌によって、最も廉価に産生されるが、ｔＰＡ、ＵＫ又は分泌されたウイルスタンパク質のもののような哺乳動物のタンパク質シグナルを使用する哺乳動物細胞内での調製も同様に考慮されている。ＧＦＤは、未変性ＨＲＧの配列であってもよいし或いは、以下で記述するようにその変異体であってもよい。ＧＦＤ配列には、ＥＧＦファミリーのメンバーからの単数又は複数の残基がＧＦＤ配列内又はその上に置換されているような配列が含まれる。
【００８４】
付加的なＨＲＧは、ＧＦＤ及びＧＦＤのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端の間の配列（後者はＣ末端分割ドメイン又はＣＴＣと呼ばれる）を含有するＨＲＧである。この変異体（ＨＲＧ−ＧＦＤ−ＣＴＣ）においては、ＤＮＡ開始コドンは、ＨＲＧ非相同シグナル配列の５′末端に存在するか又はＧＦＤコーディング領域の５′末端に隣接して存在し、最初の約１〜３個の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）残基又は最初の約１〜２個の膜貫通領域残基のうちの１つに代って停止コドンが見い出される。さらに、一部のＨＲＧ−ＧＦＤ−ＣＴＣ変異体においては、コドンは、置換、挿入又は欠失によりＧＦＤ−ＣＴＣタンパク質分解部位の中で修飾される。ＧＦＤ−ＣＴＣタンパク質分解部位は、ＧＦＤＣ末端残基及びこの残基からＮ末端の約５個の残基及びＣ末端の５残基を含有するドメインである。Ｍｅｔ−２２７末端及びＶａｌ−２２９末端ＨＲＧ−α−ＧＦＤは生物学的に活性であることが知られている。ＨＲＧ−α−ＧＦＤに対するＣ末端は、Ｍｅｔ−２２７、Ｌｙｓ−２２８、Ｖａｌ−２２９、Ｇｌｎ−２３０、Ａｓｎ−２３１又はＧｌｎ−２３２であってよく、ＨＲＧ−β−ＧＦＤについてはＭｅｔ−２２６、Ａｌａ−２２７、Ｓｅｒ−２２８、Ｐｈｅ−２２９、Ｔｒｐ−２３０又はＬｙｓ２３１／Ｓｅｒ２３１であってよい。未変性Ｃ末端は、Ｃ末端シークエンスによって容易に決定されるが、ＧＦＤ配列が所望の活性を有するかぎり、ＨＲＧ−ＧＦＤが未変性端末を有することは重要なことではない。ＨＲＧ−ＧＦＤ−ＣＴＣ変異体のいくつかの実施形態においては、ＣＴＣ内のアミノ酸変更は、 in vitro でタンパク質分解に堪えＨＲＧ−ＧＦＤの生成の原因となるプロテアーゼを阻害するその能力についてスクリーニングされる。
【００８５】
ＨＲＧ−ＥＣＤ変異体は、ＨＲＧ−ＧＦＤ−ＣＴＣ変異体と同じ位置に停止コドンを与えることによって作られる。ＨＲＧ−ＥＣＤは、例えばＣＴＣ−タンパク質分解部位の修飾を含有するＧＦＤ−ＣＴＣ変異体といったそのサブフラグメントに関連して上述した変異体のうちのいずれか１つ以上のものを含むことができる。
【００８６】
より長いＨＲＧポリペプチドを調製することが望まれしかも与えられたＨＲＧの５′又は３′末端が本書で記述されていない場合、欠如しているドメインがより完全なＨＲＧ核酸の相同領域により供給されているような核酸を調製することが必要となるかもしれない。代替的には、欠如しているドメインは、図に開示されているＤＮＡ又はそのフラグメントを用いてライブラリを探査することによって得ることができる。
【００８７】
Ａ．ヘレグリンをコードするＤＮＡの分離
ＨＲＧをコードするＤＮＡは、ＨＲＧｍＲＮＡを有しそれを検出可能なレベルで発現すると考えられている組織から調製されたあらゆるｃＤＮＡライブラリから得ることができる。かくして、ＨＲＧ−α遺伝子はゲノムライブラリーから得ることができる。その他のＨＲＧ例えば、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、又はＨＲＧ−β３のコーディング遺伝子分離のために類似の手順を使用することもできる。
【００８８】
問題の遺伝子またはそれによってコードされるタンパク質を同定するように設計されたプローブでライブラリをスクリーニングする。ｃＤＮＡ発現ライブラリについては、適切なプローブとしては、ＨＲＧ−αを認識しこれに特異的に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体、同じ又は異なる種からのＨＲＧ−α ｃＤＮＡの既知の又は疑いのある部分をコードする約２０〜８０塩基の長さのオリゴヌクレオチド；及び又は、同じ又は類似の遺伝子をコードする相補的又は相同なｃＤＮＡ又はそのフラグメントが内含される。ゲノムＤＮＡライブラリをスクリーニングするための適切なプローブとしては、オリゴヌクレオチド；同じ又は類似の遺伝子をコードするｃＤＮＡ又はそのフラグメント；及び／又は相同なゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントが含まれる。選択されたプローブでのｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook et al.,前出の第１０〜１２章で記述しているような標準的手順を用いて行なうことができる。
【００８９】
ＨＲＧ−αをコードする遺伝子を分離する代替的手段は、Sambrook et al.(前出) の第１４節で記述されているようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することである。この方法には、ＨＲＧ−αにハイブリッド形成することになるオリゴヌクレオチドプローブの使用が必要とされる。オリゴヌクレオチドの選択のための戦略が以下に記述されている。
【００９０】
問題の遺伝子を得るためのもう１つの代替的方法は、Engels et al. の中で記述されている方法の1 つを用いてそれを化学的に合成することにある。（Agnew, Chem. Int. Ed. Engl.,２８：７１６−７３４，１９８９）。これらの方法としては、リン酸トリエステル法、亜リン酸法、亜リン酸アミダイト法、及びＨ−ホスホネート法、ＰＣＲ及びその他のオートプライマー法及び固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法は、遺伝子の核酸配列全体がわかっている場合、又はコーディングストランドに対し相補的な核酸の配列が利用可能である場合に使用でき、又代替的には、標的アミノ酸がわかっている場合には、各々のアミノ酸残基について既知の及び好ましいコーディング残基を使用して潜在的核酸配列を推測することができる。
【００９１】
本発明を実践する好ましい方法は、さまざまな組織、好ましくはヒトの乳房、結腸、唾液腺、胎盤、胎児、脳及びガン腫細胞系統からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするため入念に選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用することにある。ヘレグリン様のリガンドをコードするＤＮＡのその他の生物供給源としては、その他の哺乳動物及び鳥類がある。好ましい哺乳動物としては、ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス及びげっ歯類といったような目の構メンバーがある。
【００９２】
プローブとしては選択されたオリゴヌクレオチドは、偽陽性が最小限におさえられるよう充分な長さと充分な明確さをもっていなくてはならない。実際のヌクレオチド配列は例えば、ＨＲＧ−αの保存された又は高度相同性をもつヌクレオチド配列又は領域に基づくものでありうる。オリゴヌクレオチドは、単数又は複数の位置で縮重していてよい。縮重したオリゴヌクレオチドの使用は、その種における好ましいコドン利用が知られていない種からライブラリがスクリーニングされる場合に特に重要でありうる。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされつつあるライブラリ内でのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションの時点でそれを検出できるような形で標識されなくてはならない。好ましい標識方法は、当該技術分野において周知のとおり、オリゴヌクレオチドを放射能標識するべくポリヌクレオチドキナーゼと共に³²Ｐで標識されたＡＴＰを使用することである。しかしながら、オリゴヌクレオチドの標識にはビオチン化又は酵素標識を含む（ただしこれに限られるわけではない）、にはその他の方法を使用することも可能である。
【００９３】
特に有利なのは、全長ポリペプチドをコードするＨＲＧ−α核酸である。いくつかの好ましい実施形態においては、核酸配列には、未変性ＨＲＧ−αシグナル配列が内含されている。全てのタンパク質コーディング配列をもつ核酸は、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすること、又必要な場合には前駆物質を検出するため前出のSambrook et al. の７.７９節で記述されているような従来のプライマー拡張手順を用いかつｃＤＮＡに逆転写されていない可能性のあるｍＲＮＡの中間体を処理することによって得られる。
【００９４】
図１Ａ〜１ＤのＨＲＧ−αをコードするＤＮＡは、以上で記述されている方法を利用するハイブリダイゼーションを介してその他の動物種から類似のリガンドをコードするＤＮＡを分離するために使用できる。好ましい動物は哺乳動物、特にウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌ及びげっ歯類、そしてより特定的にはラット、マウス及びウサギである。
【００９５】
Ｂ．ヘレグリンのアミノ酸配列変異体
ＨＲＧのアミノ酸配列変異体は、所望するＨＲＧポリペプチドの in vitro 合成によってか又はＨＲＧＤＮＡ内への適切なヌクレオチド変異の導入によって調製される。かかる変異体は、例えば、ヒトＨＲＧ配列について示されたアミノ酸配列内の残基からの欠失、又はその挿入又は置換を内含する。最終構築物が所望の特性を有することを条件として、最終構築物にたどりつくよう、欠失、挿入及び置換のあらゆる組合せを行なうことができる。本発明の範囲から除外されているのは、先行技術に比べて新規性がなく明瞭でないＨＲＧ変異体又はポリペプチド配列である。アミノ酸の変更は同様に、グリコシル化部位の数又は位置の変更、膜固着特性の変化、未変性ＨＲＧのリーダ配列の挿入、欠失又はその他の形での影響によるＨＲＧの細胞内位置の変化、又はタンパク質分解分割に対するその感受性の修正といったように、ＨＲＧ−αの翻訳後のプロセスを変えることもできる。
【００９６】
ＨＲＧ配列は、いくらかのＨＲＧフラグメントを作り出すようにタンパク質分解により処理されうる。ＨＲＧ−αのＨＲＧ−ＧＦＤ配列は全てＨＲＧ−αシステイン２２６とシステイン２６５との間のアミノ酸配列を含む。ＨＲＧ−αフラグメントのアミノ末端は、アラニン１とシステイン２２６との間の、好ましくはアルギニン、リシン、バリン又はメチオニンに隣接した、そして最も好ましくはメチオニン４５とセリン４６との間での任意のペプチド結合の切断の結果として得ることができる。ＨＲＧ−αフラグメントのカルボキシ末端は、システイン２６５の間の、好ましくはアルギニン、リシン、バリン又はメチオニンに隣接した、そして最も好ましくはリシン２７２とバリン２７３との間、リシン２７８とアラニン２７９との間、又はリシン２８５とアルギニン２８６との間の任意のペプチド結合の切断の結果として得ることができる。かかるタンパク質分解処理の結果得られたＨＲＧ−αリガントは、好ましいリガンドである。
【００９７】
ＨＲＧ−β−ＧＦＤは、ＨＲＧ−α−ＧＦＤについて上述したものと相似である。各々のＨＲＧ−β−ＧＦＤは、図２Ａ〜Ｅのシステイン２１２からシステイン２５１までのポリペプチドセグメントを含有する。ＨＲＧ−β１フラグメントのアミノ末端は、アラニン１とシステイン２１２との間の、好ましくは、アルギニン、リシン、バリン又はメチオニンに隣接した、そして最も好ましくはメチオニン３１とセリン３２との間の任意のペプチド結合の切断の結果として得ることができる。ＨＲＧ−β１フラグメントのカルボキシ末端は、図２Ａ〜２Ｅのシステイン２５１の間の、好ましくはアルギニン、リシン、バリン又はメチオニンに隣接した、そして好ましはバリン２５５とメチオニン２５６との間、リシン２６１とヒスチジン２６２との間、リシン２７６とアラニン２７７との間又はリシン３０１とトリオニン３０２との間の任意のペプチド結合の切断の結果として得ることができる。このようなタンパク質の分解処理の結果として得られるＨＲＧ−β１リガンドは、好ましいリガンドの中に入る。同様にして、図３Ａ〜３Ｅに基づくＨＲＧ−β２の及び図４Ａ〜４Ｃに基づくＨＲＧ−β３の好ましいフラグメントリガンドを産生するための処理は、好ましくはアルギニン、リシン、バリン又はメチオニンに隣接した、図３Ａ〜３Ｅ及び４Ａ〜４ＣのＨＲＧ配列の分割によって達成することができる。
【００９８】
ＨＲＧのアミノ酸配列変異体を設計するにあたっては、突然変異部位の場所及び突然変異の性質は、変更すべきＨＲＧ特性によって左右されることになる。突然変異のための部位は、個別に又は順次、例えば（１）まずは保存的アミノ酸選択そして次に達成された結果に応じてのより極端な選択による置換、（２）標的残基の欠失又は（３）位置された部位に隣接するその他のレセプターリガンドの残基の挿入、によって修正することができる。
【００９９】
突然変異誘発のための好ましい部位であるＨＲＧポリペプチドのいくつかの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham and Wells（Science 244: 1081-1085, 1989）によって記述されているように「アラニン走査型突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基のうちの１つの残基又はそのグループが同定され（例えば arg, asp, his, lys 及び glu といったような荷電した残基）、細胞内又は外の周辺水性環境とアミノ酸の相互作用に影響を及ぼすべく中性の又は陰に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）によって置換される。置換に対する機能的感応性を示すこれらのドメインは次に、置換部位における又は置換部位に対するさらなる又はその他の変異体の導入によって改良される。かくして、アミノ酸配列の変更を導入するための部位は予め定められるものの、突然変異自体の性質は、予め定められる必要はない。例えば、一定の与えられた部位における突然変異の遂行を最適化するために、標的コドン又は領域において ala 走査又は無作為突然変異誘発を行なうことができ、発現されたＨＲＧ変異体は、所望する活性の最適な組合わせのためにスクリーニングされる。
【０１００】
アミノ酸配列変異体の構築には２つの主要な変数が存在する：すなわち突然変異部位の位置と突然変異の種類である。これらはＨＲＧ配列からの変異体であり、天然に見られない変異体又は対立遺伝子のいずれかに到達するべくＤＮＡを突然変異させることによって作られた予め定められた突然変異体形態又は自然に存在する対立遺伝子（ＨＲＧＤＮＡの操作を必要としないと思われるもの）を表わすことがある。一般に、選択される突然変異の場所及び性質は、改変すべきＨＲＧ特性によって左右されることになる。明らかに、例えば既知のレセプターリガンドへとＨＲＧを変換するような変更は、本発明の範囲内には含まれず、又、先行技術に比べて新規性がなく明瞭でないその他のあらゆるＨＲＧ変異体又はポリペプチド配列も含まれない。
【０１０１】
アミノ酸配列の欠失は一般に、約１〜３０残基、より好ましくは約１〜１０残基の範囲に及び；標準的には約１〜５残基が隣接している。ＨＲＧの活性を修正するべくその他のＥＧＦファミリーと低い相同性をもつ領域内に欠失を導入することもできる。その他のＥＧＦファミリーの配列との実質的相同性をもつ部域内のＨＲＧからの欠失は、ＨＲＧの生物活性をより有意な形で修正する確率がさらに高いものと思われる。連続する欠失の数は、例えばシステイン交叉結合、ベータプリーツシート又はアルファヘリックスといった影響を受けたドメインのＨＲＧの三次構造を保存するように選択されることになる。
【０１０２】
アミノ酸配列の挿入には、長さが１〜１００以上の残基を含むポリペプチドに至るアミノ酸及び／又はカルボキシル末端融合、ならびに１以上のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入（すなわちＨＲＧ配列内の挿入）は一般に、約１〜１０個の残基、より好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の残基という範囲に及ぶことができる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を伴うＨＲＧ（細菌の組換え型細胞培養内の直接的ＨＲＧ発現の人為現象）、及び組換え型宿主細胞からの成熟ＨＲＧの分泌を促進するためのＨＲＧのＮ末端に対する非相同Ｎ末端シグナル配列の融合、が含まれる。かかるシグナル配列は一般に、意図された宿主細胞種から得られ、従ってこの種と相同となる。適切な配列としては、E. coli についてのＳＴＩ１、ｔＰＡ又は１ｐｐ、酵母についてのアルファ因子及び哺乳動物細胞についてのヘルペスｇＤといったウイルスシグナルが含まれる。
【０１０３】
ＨＲＧのその他の挿入変異体には、E. coli trp 遺伝子座によってコードされる酵素又はベータラクタマーゼといったような細菌性ポリペプチド、又は酵母タンパク質、ウシ血清アルブミン及び走化性ポリペプチドといった免疫原性ポリペプチドのＨＲＧのＮ末端又はＣ末端に対する融合が内含される。１９８９年４月６日に公示されたＷＯ８９／０２９２２号中に記述されているように、免疫グロブリン定常領域（又はその他の免疫グロブリン領域）といった長い半減期をもつタンパク質、アルブミン又はフェリチンとＨＲＧ−ＥＣＤのＣ末端融合が考慮されている。
【０１０４】
もう１つの変異体グループはアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ＨＲＧ分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その代りに異なる残基が挿入されている。置換による突然変異誘発にとって最も有利な部位としては、ＨＲＧの活性部位として同定された部位、及びさまざまな種からのＨＲＧリガンド中に発見されたアミノ酸が、側鎖のかさ、電荷及び／又は疎水性に関して実質的に異なっているような部位が含まれる。増殖因子として生物活性をもつＨＲＧ−ＧＦＤの適当なサブドメインは、特に、ＥＧＦ活性をもつことがわかっているＥＧＦサブ配列に対する相似に基づいて約グリシン２１８〜バリン２２６（ＨＲＧ−α）及びグリシン２１８〜リシン２２８／セリン２２８（ＨＲＧ−β）の配列内にあるＣ末端セグメントである。
【０１０５】
その他の有利な部位は、さまざまな種から得られたＨＲＧ様のリガンドの特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、ＨＲＧの生物活性にとって重要なものでありうる。これらの部位、特に少なくとも３つの同一に保存されたその他の部位の配列内に入る部位は、比較的保存的な形で置換される。このような保存的置換は、「好ましい置換」という見出しの下で表１内に示されている。かかる置換が生物活性の変化という結果をもたらす場合には、表１で置換例と称され、アミノ酸のクラスを参考にして以下でさらに記述されているようなより実質的な変更が導入され、産物はスクリーニングされる。
【０１０６】
【表１】

【０１０７】
ＨＲＧの機能又は免疫学的同一性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート又はらせんの高次構造としての置換の領域内のポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性又は（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するその効果において著しく異なる置換を選択することによって達成される。自然に存在する残基は、共通の側鎖の物性に基づいてグループに分けられる：すなわち
１）疎水性：ノルロイシン、met, ala, val, leu, ile ；
２）中性親水性： cys, ser, thr；
３）酸性： asp, glu ；
４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基： gly, pro ；及び
６）芳香族： trp, tyr, phe.
【０１０８】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの構メンバーともう１つのものとの変換を誘発する。かかる置換済み残基は、その他のレセプターリガンドと相同であるＨＲＧの領域内に、又より好ましくは分子の非相同領域内に導入され得る。
【０１０９】
本発明の一実施形態においては、分子内に存在する単数又は複数のプロテアーゼ切断部位を不活性化することが望ましい。これらの部位は、コード化されたアミノ酸配列の検査により同定される。プロテアーゼ切断部位が同定された場合、これらは、ターゲディングされた残基をもう１つの残基、好ましくはグルタミンといった塩基性残基又はセリンといった親水性残基で置換することによって；又は残基を欠失させることによって、；又は残基の直後にプロリル残基を挿入することによって、タンパク質分解による切断に対し不活性なものにされる。
【０１１０】
もう１つの実施形態においては、シグナル配列の開始メチオニル残基以外のあらゆるメチオニル残基又は各々のこのようなメチオニル残基に対しＮ末端又はＣ末端で約３個の残基以内にあるあらゆる残基は、もう１つの残基（好ましくは表１に従う）により置換されるか又は欠失させられる。代替的には、かかる部位に隣接して約１〜３個の残基が挿入される。
【０１１１】
ＨＲＧの適切な高次構造を維持することに関与していないあらゆるシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善させ異常な架橋を防ぐため、一般にはセリンで置換され得る。
【０１１２】
置換、欠失若しくは挿入又はフラグメントとしての使用に特に適した部位には、図１Ａ〜１ＤのＨＲＧ−αのＮ末端から番号づけした形で、以下のものが含まれる：
１）４２〜４３、６４〜６５、１５１〜１５２にあるセリン・グリシンジペプチドにおける潜在的なグリコサミノグリカン付加部位；
２）位置１６４、１７０、２０８及び４３７、部位（ＮＤＳ）１６４〜１６６、（ＮＩＴ）１７０〜１７２、（ＮＴＳ）２０８〜２１０及びＮＴＳ（６０９〜６１１）における潜在的なアスパラギン連結されるグリコシル化；
３）２０９−２１８におけるセリン及びトレオニンクラスター内での潜在的Ｏ−グリコシル化。
４）２２６、２３４、２４０、２５４、２５６及び２６５におけるシステイン；
５）２８７〜３０９における膜貫通ドメイン；
６）システイン２２６及び２４０によって線引きされたループ１；
７）システイン２３４及び２５４によって線引きされたループ２；
８）システイン２５６及び２６５によって線引きされたループ３；及び
９）２〜３、８〜９、２３〜２４、３３〜３４、３６〜３７、４５〜４６、４８〜４９、６２〜６３、６６〜６７、８６〜８７、１１０〜１１１、１２３〜１２４、１３４〜１３５、１４２〜１４３、２７２〜２７３、２７８〜２７９及び２８５〜２８６における潜在的プロテアーゼ処理部位。
【０１１３】
ＨＲＧ−β１における類似領域は、その配列を参照することによって決定できる。相似のＨＲＧ−β１アミノ酸は、ＨＲＧ−αについて上述したとおりに突然変異又は修飾を受けることができる。ＨＲＧ−β２内の類似領域も同様にその配列を参照することで決定できる。類似のＨＲＧ−β２アミノ酸は、ＨＲＧ−α又はＨＲＧ−β１について以上で論述したように突然変異又は修飾を受けることができる。ＨＲＧ−β３内の相似領域は、その配列を参照することで決定できる。さらに、相似のＨＲＧ−β３アミノ酸は、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１又はＨＲＧ−β２について上述したように突然変異又は修飾を受けることができる。
【０１１４】
もう１つのＨＲＧ変異体は γ−ＨＲＧ（又はガンマ−ヘレグリン）である。γ−ＨＲＧは、配列番号１１をもつ未変性配列γ−ＨＲＧの少なくとも１つの生物学的特性を有するあらゆるポリペプチド配列である。この変異体の生物学的特性は、上述したＨＲＧについてのものと同じである。この変異体は、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞といった未変性γ−ＨＲＧ供給源から又はもう１つの動物種といったようなもう１つの供給源から分離されたポリペプチドのみならず、組換え型又は合成方法によって調製されたポリペプチドをも包含する。これは同様に、機能的誘導体、対立変異体、自然に存在するイソ型タンパク質及びその類似体を含めた変異体形態をも内含している。時として、γ−ＨＲＧは、哺乳動物から分離された内在性γ−ＨＲＧポリペプチドを意味する「未変性γ−ＨＲＧ」である。γ−ＨＲＧは同様に、それが未変性γ−ＨＲＧ（例えば図７Ａ〜７Ｃに示されているヒトγ−ＨＲＧ）と同じアミノ酸配列を有するかぎりにおいて、「未変性配列γ−ＨＲＧ」であることができる。未変性配列のアミノ酸配列変異体は、未変性配列ＤＮＡ内に適切なヌクレオチド変化を導入することによって又は所望するポリペプチドの in vitro 合成によって調製される。かかる変異体は、例えば、その他のＨＲＧについて以上で一般的に記述したように、図７Ａ〜７Ｃ内でヒトタンパク質について示されたアミノ酸配列内の残基からの欠失、又はその挿入又は置換を内含している。最終構築物が所望の特性を有することを条件として、最終構築物に到達するべく欠失、挿入及び置換のあらゆる組合せが行なわれる。アミノ酸の変化は、０連結されるグリコシル化部位の数又は位置の変更といったように、未変性配列の翻訳後のプロセスを変化させることもできる。
【０１１５】
もう１つの変異体は、ＷＯ９６／１５２４４で記述されているように調製されうる図８にその核酸及びアミノ酸配列が示されている（配列番号１３及び１４）感覚ニューロン及び運動ニューロン由来の因子（ＳＭＤＦ）と呼ばれるポリペプチドである。本発明のＳＭＤＦポリペプチドは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３レセプターに結合し上述のＨＲＧポリペプチドと類似の要領で上皮細胞の増殖及び分化を刺激するという特性を示す。未変性配列ＳＭＤＦのアミノ酸配列の変異体は、未変性配列ＳＭＤＦＤＮＡ内に適当なヌクレオチド変更を導入することによって、又は、その他のＨＲＧについて以上で一般的に考察された所望のＳＭＤＦポリペプチドの in vitro 合成によって調製される。かかる変異体は、例えば図８内でヒトＳＭＤＦについて示されたアミノ酸配列内の残基からの欠失、又はその挿入又は置換を内含している。最終構築物が所望の特性を有することを条件として最終構築物に到達するべく欠失、挿入及び置換のあらゆる組合せが行なわれる。アミノ酸の変化は、０連結されたグリコシル化部位の数又は位置の変更といったような、未変性配列ＳＭＤＦの翻訳後のプロセスを変化させることができる。
【０１１６】
付加的な変異体には、変異体が、以下のものの中から選択された６４５アミノ酸の未変性ヒトヘレグリン−β１の残基に対応する選択された残基におけるアミノ酸置換を有するポリペプチドが内含される：
【０１１７】
S177, H178, L179, V180, K181, E184, E186,
K187, T188, V191, N192, G193, G194, E195,
M198, V199, K200, D201, N204, P205, S206,
R207, Y208, L209, K211, P213, N214, E215,
T217, G218, D219, Q222, N223, Y224, S228, 及び F229.

【０１１８】
この実施態様の変形形態においては、アミノ酸置換は、選択された残基に対応する表皮増殖因子（ＥＧＦ）残基での選択された残基の置換ではない。
【０１１９】
その他のヘレグリン−β変異体には以下の中から選択されたアミノ酸置換が内含される：
【０１２０】
S177W; H178S, E, R, 又は A; V180Q, I 又は E;
K181P 又は A; A183G; E184V, W, K, R, G,又は N;
K185E, S, Q, 又は G; E186R; K187E 又は A; T188Q;
E195Q; F197Y; M198R 又は K; K200R; D201T 又は I;
P205T 又は Y; S206K, H, G, P, 又は R; R207Y;
Y208R 又は L; L209M 又は G; K211R; R213S, T, N, 又は K;
N214L, K, S, 又は E; F216M; N223H 又は W; 及び M226I.

【０１２１】
この実施形態の変形形態においては、ヘレグリン変異体は、このグループの中から選択されたアミノ酸置換のセットを内含する。アミノ酸置換セットを有する本発明のいくつかのヘレグリン変異体は、ＨＥＲ４レセプター親和力の増大も同様に伴って、ＨＥＲ３レセプター親和力の少なくとも５０倍の増大を示す。特異的変異体としては、以下のものが含まれる：
【０１２２】
A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
A183D, E184K, K185S, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198K, K200R, D201I, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
P205Y, S206R, R207Y, Y208R, L209M, M226I;
P205T, S206H, R207Y, Y208R, L209M;
P205T, S206K, R207Y, Y208R, L209G;
N223W, M226I;
N223H, M226I;
S177W, H178E, K181P, A183G, E184W, K185D, E186R, K187E, T188G, M226I;
P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, M226I;
F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I; 及び
A183G, K185E, E186R, K187E, T188G, F197Y, M198R, D201T, P205Y, S206G, R207Y, Y208L, L209M, N223H, M226I;

【０１２３】
本書に開示されているアミノ酸置換のうち単数又は複数のものを内含することに加えて、ヘレグリン変異体は、アミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、少なくとも１つのアミノ酸の欠失又は化学的修飾といったような単数又は複数のその他の修飾を有することができる。例えば、本発明は、フラグメントであるヘレグリンを提供する。この実施形態の変形形態においては、フラグメントは、約残基１７５から約残基２３０まで拡がるヒトヘレグリン−β１の一部分（すなわちＥＧＦ様のドメイン）に対応する残基を内含する。例えば、フラグメントは、残基１７７から残基２４４まで拡がることができ、又、組換え技術によって調製され得る（ｒＨＲＧβ１−１７７〜２４４）。
【０１２４】
ＨＲＧのアミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、当該技術分野において既知のさまざまな方法によって調製される。これらの方法には（自然に存在するアミノ酸配列変異体の場合の）天然供給源からの分離又は、ＨＲＧの以前に調製された変異体又は非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発による調製が含まれるが、これらに制限されるわけではない。これらの技術は、ＨＲＧ核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はＨＲＧ核酸に相補的な核酸を利用することができる。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、ＨＲＧＤＮＡの置換、欠失、及び挿入変異体を調製するための好ましい方法である。この技術は、Adelman et al., ＤＮＡ．２：１８３（１９８３）により記述されているように当該技術分野において周知のものである。簡単に言うと、ＨＲＧＤＮＡは、鋳型が、ＨＲＧの不変のすなわち未変性のＤＮＡ配列を含有するプラスミド又はバクテリアオファージの１本鎖形態であるような、ＤＮＡ鋳型に対する所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって変性させる。ハイブリダイゼーションの後、かくしてオリゴヌクレオチドプライマーを取込みＨＲＧＤＮＡ内の選択された変性についてコードすることになる鋳型が第２の相補的ストランド全体を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。
【０１２６】
一般には、長さが少なくとも２５ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドが用いられる。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異についてコードするヌクレオチドのいずれかの例で鋳型に完全に相補的である１２〜１５個のヌクレオチドを有することになる。こうして、オリゴヌクレオチドは、確実に１本鎖ＤＮＡ鋳型分子に対し適切にハイブリッド形成することになる。オリゴヌクレオチドは、Crea et al. により記述されたもののような（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:5765, 1978）当該技術分野において既知の技術を用いて容易に合成される。
【０１２７】
１本鎖ＤＮＡ鋳型は同様に、標準的技術を用いて２本鎖プラスミド（又はその他の）ＤＮＡを変性させることによって生成できる。
【０１２８】
（例えば、アミノ酸配列変異体を生成するために）未変性ＤＮＡ配列を変化させる目的で、オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で１本鎖鋳型にハイブリッド形成される。通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントであるＤＮＡ重合用酵素が、次に、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いて鋳型の相補的ストランドを合成するために付加される。かくして、ＤＮＡの１つのストランドがＨＲＧの突然変異された形態をコードしかつその他のストランド（もとの鋳型）がＨＲＧの未変性の、不変の配列をコードするような形で、ヘテロ２本鎖分子が形成される。このヘテロ２本鎖分子は次に、通常は E. coli JM 101といったような原核生物である適切な宿主細胞へと形質転換される。細胞は、増殖させられた後、アガロース平板上にプレーティングされ、突然変異を受けたＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するべく³²Ｐ−リン酸塩で放射能標識付けされたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングされる。次に、突然変異を受けた領域は除去され、一般に適切な宿主の形質転換のために標準的に利用されるタイプの発現ベクターである、タンパク質再生のための適切なベクターの中に入れられる。
【０１２９】
以上で記述した方法は、プラスミドの両方のストランドが突然変異を含む、ホモ２本鎖分子が作り出されるような形で修正することが可能である。修正は、以下のとおりである：すなわち、上述のように、１本鎖オリゴヌクレオチドを１本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、(Amersham Corporation から入手することができる）ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオ−デオキシリボシトシンと組合わせる。この混合物を、鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加した時点で、突然変異を受けた塩基を除く鋳型と同一のＤＮＡストランドが生成される。さらにこの新しいＤＮＡストランドは、ｄＣＴＰの代りにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含有することになり、これはそれを制限エンドヌクレアーゼ消化から保護するのに役立つ。２本鎖ヘテロ２本鎖分子の鋳型ストランドが適切な制限酵素でニックされた後、鋳型ストランドを突然変異誘発されるべき部位を含む領域を通って、Ｅxo IIIヌクレアーゼ又はもう１つの適切なヌクレアーゼを用いて消化させることができる。このとき、部分的にのみ１本鎖にされている分子を残すべく反応を停止させる。次に全４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全２本鎖ＤＮＡホモ２本鎖分子を形成させる。このホモ２本鎖分子は次に、以上で記述したように、E. coli JM 101といったような適切な宿主細胞の中へ形質転換させることができる。
【０１３０】
置換すべき複数のアミノ酸を伴うＨＲＧ突然変異体をコードするＤＮＡは、複数の方法のうちの１つで生成できる。アミノ酸がポリペプチド鎖の中で密に互いに近接して位置する場合、これらは、所望のアミノ酸置換の全てについてコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異され得る。しかしながらアミノ酸が互いに一定の距離をおいて位置する（約１０個以上のアミノ酸によって分離されている）場合には、所望する変更の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはさらに困難である。その代り、２つの代替的方法のうちの１つを利用することができる。
【０１３１】
第１の方法では、置換されるべき各アミノ酸について、別々のオリゴヌクレオチドが生成される。このとき、オリゴヌクレオチドは、１本鎖鋳型のＤＮＡに同時にアニールされ、鋳型から合成されるＤＮＡの第２のストランドは所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。
【０１３２】
代替的方法には、所望の突然変異体を産生するべく２つ以上の突然変異誘発ラウンドが関与する。第１ラウンドは、単一の突然変異体について記述されている通りである：すなわち、鋳型には野生型ＤＮＡが用いられ、第１の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドがこの鋳型にアニールされ、次にヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子が生成されている。第２の突然変異誘発ラウンドは、鋳型として第１ラウンドの突然変異誘発で産生された突然変異を受けたＤＮＡを利用する。かくしてこの鋳型はすでに単数又は複数の突然変異を含んでいる。付加的な所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは次にこの鋳型にアニールされ、結果として得られたＤＮＡストランドはこのとき、第１及び第２の両方の突然変異誘発ラウンドからの突然変異をコードする。結果として得られたこのＤＮＡは、第３ラウンドの突然変異誘発の中で鋳型として使用されることができ、それ以降も同様である。
【０１３３】
ＰＣＲ突然変異誘発は同様に、ＨＲＧのアミノ酸変異体を作るのにも適している。以下の論述は、ＤＮＡに関するものであるが、この技術がＲＮＡでも応用できるということがわかる。ＰＣＲ技術は一般に以下の手順を基準にしている（Erlich, 前出、R.Higuchi による章、ｐ６１〜７０参照）。少量の鋳型ＤＮＡが、ＰＣＲにおける開始材料として使用されるとき、鋳型ＤＮＡ内の対応する領域とは配列がすこし異なっているプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なっている位置でのみ鋳型配列と異なっている特異的ＤＮＡフラグメントを比較的大量に生成することが可能である。プラスミドＤＮＡ内に突然変異を導入するために、プライマーの１つは、突然変異の位置にオーバラップし突然変異を含むように設計される；その他のプライマーの配列は、プラスミドの相対するストランドの配列の伸長と同一でなくてはならないが、この配列は、プラスミドＤＮＡに沿ったどこにでも位置され得る。しかしながら、第２のプライマーの配列が第１のものから２００ヌクレオチド以内に位置され、かくして最終的にプライマーと境界を接するＤＮＡの増幅された領域を容易にシークエンスできるようになっていることが好ましい。以上で記述したようなもののようなプライマー対を用いたＰＣＲ増幅は、鋳型のコピーが幾分か誤りを生じやすい作業であることから、プライマーにより特定される突然変異の位置そして可能であればその他の位置で異なっているＤＮＡフラグメントの個体群を結果としてもたらす。
【０１３４】
鋳型対生成物材料の比率がきわめて低い場合、大部分の産物ＤＮＡフラグメントは所望の突然変異を取込む。この生成物材料は、標準的なＤＮＡ技術を用いてＰＣＲ鋳型として役立ったプラスミド内の対応する領域に置き換わるように使用される。別々の位置での突然変異は、突然変異体の第２のプライマーを使用すること又は、異なる突然変異体プライマーで第２のＰＣＲを実施し、結果として得られたＰＣＲフラグメントを３（又はそれ以上）部分連結において同時にベクターフラグメントに連結することのいずれかによって同時に導入され得る。
【０１３５】
ＰＣＲ突然変異誘発の特異的例においては、鋳型プラスミドＤＮＡ（１mg）が、増幅されるべき領域の外側のプラスミドＤＮＡ内にユニークな認識部位をもつ制限エンドヌクレアーゼでの消化によって線形化される。この材料のうち１００ngが、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸を含有し（Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA から得られる）ＧＥＮＥＡＭＰキット内に内含されているＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に添加され、又２５pmole の各々のオリゴヌクレオチドが最終容量５０mlとなるまで添加される。反応混合物には３５mlの鉱油が上に入れられる。反応を１００℃で５分間変性させ、短時間氷上に置き、次に鉱油層の下に、１mlのThermus aquaticus (Taq) ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ml，Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA から購入したもの）を添加する。その後、反応混合物を、以下の要領でプログラムされたＤＮＡサーマルサイクラー（Perkin-Elmer Cetusから購入されたもの) の中に挿入する：
５５℃で２分
７２℃で３０秒、次に以下のもの１９サイクル；
９４℃で３０秒、
５５℃で３０秒、そして
７２℃で３０秒、
【０１３６】
プログラムが終了した時点で、反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水相を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（50: 50: vol）で抽出し、エタノールで沈降させ、ＤＮＡを標準的手順で回収する。この材料をその後、ベクター内への挿入のため適切な処理に付す。
【０１３７】
変異体を調製するためのもう１つの方法すなわちカセット突然変異誘発は、Wells et al.,(Gene, 34: 315, 1985）により記述された技術に基づくものである。出発材料は、突然変異すべきＨＲＧＤＮＡを含むプラスミド（又はその他のベクター）である。突然変異すべきＨＲＧＤＮＡ内のコドンを同定する。同定された突然変異部位の各々の側にユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位がなくてはならない。このような制限部位が全く存在しない場合、ＨＲＧＤＮＡ内の適切な場所に導入するべく上述のオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発方法を用いて、これらを生成することができる。プラスミド内に制限部位が導入された後、このプラスミドをこれらの部位で切断してそれを線形化する。制限部位間のＤＮＡの配列をコードするものの所望の突然変異を含む２本鎖オリゴヌクレオチドを、標準的手順を用いて合成する。２本のストランドは別々に合成され、次に標準的技術を用いて一緒にハイブリッド形成される。この２本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、それを直接プラスミドに連結させることができるように、線形化されたプラスミドの端部と相容性のある３′及び５′末端をもつように設計される。このプラスミドはこのとき、突然変異を受けたＨＲＧＤＮＡ配列を含有する。
【０１３８】
Ｃ．クローニングビヒクル内へのＤＮＡの挿入
未変性又は変異体ＨＲＧをコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のため、複製可能なベクター内に挿入する。数多くのベクターが利用可能であり、適切なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅のために使用されるか又はＤＮＡ発現のために使用されるべきものか、２）ベクター内に挿入されるべきＤＮＡのサイズ、及び３）ベクターを用いて形質転換すべき宿主細胞、に依存することになる。各々のベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅又はＤＮＡの発現）及びそれが相容性をもつ宿主細胞に応じてさまざまな成分を含んでいる。ベクターの成分としては一般に、シグナル配列、複製起点、単数又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター及び転写終結配列のうちの単数又は複数のものが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１３９】
（ｉ）シグナル配列成分
一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいし、或いは又、ベクターの中に挿入されるＨＲＧＤＮＡの一部分であってもよい。未変性ＨＲＧＤＮＡは、従来のシグナル構造が明らかではないものの、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３レセプターに結合する成熟ＨＲＧポリペプチドリガンドを形成するべくポリペプチドの翻訳後プロセシング中に分割されるポリペプチドのアミノ末端（ＨＲＧをコードするＤＮＡの５′末端）においてシグナル配列をコードするものと考えられている。未変性ＨＲＧは、細胞から分泌されるものの、ポリペプチドのカルボキシル末端領域内に細胞質領域及び膜貫通ドメインを含有していることから、膜の中に収容された状態にとどまる。かくして、可溶型の分泌されたＨＲＧにおいては、膜貫通ドメインを内含する分子のカルボキシル末端ドメインは、通常欠失させられている。この切形変異体ＨＲＧポリペプチドは、切形変異体をコードするＤＮＡが宿主により認識されるシグナル配列をコードすることを条件として、細胞から分泌されてよい。
【０１４０】
本発明のＨＲＧは、直接的のみならず、非相同ポリペプチド、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ及び／又はＣ末端に特異的分割部位を有するその他のポリペプチドとの融合としても発現され得る。
一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよいし、又、ベクターの中に挿入されるＨＲＧＤＮＡの一部であってもよい。本発明の範囲内に含まれるのは、欠失させられ非相同シグナル配列で置換された未変性シグナル配列を伴うＨＲＧである。選択される非相同シグナル配列は、宿主細胞によって認識され処理され、すなわちシグナルペプチダーゼにより分割されるものでなくてはならない。未変性ＨＲＧシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物の宿主細胞については、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンIIリーダーというグループの中から選択された原核シグナル配列により置換される。酵母分泌については、未変性ＨＲＧシグナル配列は、酵母インベルターゼ、アルファ因子又は酸ホスフォターゼリーダーにより置換され得る。哺乳動物細胞発現においては、未変性シグナル配列は充分なものであるが、その他の哺乳動物シグナル配列も適切でありうる。
【０１４１】
（ii) 複製起点成分
発現及びクローニングベクターはどちらも、一般に、単数又は複数の選択された宿主細胞内でベクターが複製できるようにする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主の染色体ＤＮＡとは独立してベクターが複数できるようにするものであり、複数起点又は自動的に複製する配列を内含する。このような配列は、さまざまな細菌、酵母及びウイルスについて周知のものである。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大部分のグラム陰性菌に適しており、２ｍプラスミド起点は酵母に適しており、さまざまなウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）が、哺乳動物細胞内でのクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物の発現ベクターには必要とされない（ＳＶ４０起点は標準的に、それが初期プロモーターを含んでいるというだけの理由で使用することができる）。
【０１４２】
大部分の発現ベクターは「シャトル」ベクターである。すなわちこれらは少なくとも１つのクラスの生体の中で複製できるが、発現のためもう１つの生体内にトランスフェクションすることができる。例えば、E. Coli の中で１つのベクターがクローンされ、その後、この同じベクターは、たとえそれが宿主細胞の染色体とは独立して複製する能力をもたなくても、発現のため酵母又は哺乳動物細胞内にトランスフェクションされる。
【０１４３】
ＤＮＡは同様に、宿主ゲノム内への挿入よっても増幅され得る。これは、例えば、BacillusのゲノムＤＮＡ内に見い出される配列と相補的であるＤＮＡ配列をベクター内に含み入れることによって、Bacillus種を用いて容易に達成される。このベクターでの Bacillusのトランスフェクションは、ゲノムでの相同性組換え及びＨＲＧＤＮＡの挿入を結果としてもたらす。しかしながら、ＨＲＧをコードするゲノムＤＮＡの回収は、ＨＲＧＤＮＡを切除するのに制限酵素消化が必要とされるため、外因的に複製されたベクターのものよりもさらに複雑である。ＤＮＡは、ＰＣＲにより増幅し、いかなる複製成分もなく宿主細胞内に直接トランスフェクションされうる。
【０１４４】
（iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいなくてはならない。この遺伝子は、選択培地内で増殖させられた形質転換済み宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は培地内で存続しなくなる。標準的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリンといった抗生物質又はその他の毒素に対する耐性を付与する、（ｂ）栄養素要求性欠損を補足する又は（ｃ）例えば Bacilliに対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子といった、複合培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０１４５】
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を阻止するために薬物が利用される。非相同遺伝子でうまく形質転換されるような細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を発現し、かくして選択体制を生き延びる。かかる優性選択の例では、ネオマイシン（Southern et al., J. Molec. Appl. Genet. 1; 327, 1982）、マイコフェノール酸（Mulligan et al., Science209; 1422, 1980）又はハイグロマイシン（Sugden et al., Mol. Cell. Biol. 5;410-413, 1985）の薬物が使用される。以上に記した３つの例は、それぞれ適切な薬物Ｇ４１８又はネオマイシン（ゲネテイシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する耐性を伝達すべく真核制御下で細菌遺伝子を利用する。
【０１４６】
哺乳動物細胞のための適切な選択可能マーカーのもう１つの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）又はチミジンキナーゼといったようなＨＲＧ核酸を取り込むための応答能をもつ細胞の同定を可能にするマーカーである。哺乳動物の細胞形質転換体は、マーカーを取り込むことにより形質転換体のみが生きのびるように、特異的に適応する淘汰圧の下に置かれる。淘汰圧は、培地内の選択作用物質の濃度がうまく変えられ、それにより選択遺伝子及びＨＲＧをコードするＤＮＡの両方の増幅を導くような条件下で、形質転換体を培養することによって加えられる。増幅というのは、増殖にとって決定的なタンパク質の産生のために要求度の高い遺伝子を、組換え細胞の連続する世代の染色体内で連繋して反復させるプロセスである。増加した量のＨＲＧが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１４７】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞はまず最初に、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキセート（Ｍtx）を含有する培地内で全ての形質転換体を培養することによって同定される。野生型ＤＨＦＲが利用される場合に適切な宿主細胞は、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77; 4216, 1980 によって記述されているように調製し増殖させた、ＤＨＦＲ活性が決失したチャイニーズハムスターー卵巣（ＣＨＯ）細胞系統である。形質転換された細胞は次に、増大したレベルのメトトレキセートに暴露される。こうして、ＤＨＦＲ遺伝子の多重コピー、そしてそれと同時に、ＨＲＧをコードするＤＮＡといったような発現ベクターを含むその他のＤＮＡの多重コピーの合成が導かれる。この増幅技術は、例えばＭtxに対する高い耐性をもつ突然変異体ＤＨＦＲ遺伝子が利用される場合（ＥＰ１１７，０６０）に内在性ＤＨＦＲの存在にもかかわらず、例えばＡＴＣＣ No.ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１といったその他の点で適切なあらゆる宿主と共に使用することができる。代替的には、ＨＲＧ、野生型ＤＨＦＲタンパク質及びもう１つの選択可能マーカー例えばアミノグリコシド３′ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８といったような選択可能マーカーのための選択作用物質を含有する培地内での細胞増殖によって選択することもできる（米国特許第４,９６５,１９９号参照）。
【０１４８】
酵母内で使用するのに適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７の中に存在する trp１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282; 39, 1979; Kingsman et al., Gene, 7; 141, 1979; 又は Tschemper et al., G10; 157, 1980)。 trp１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ No.４４０７６又はＰＥＰ４−１（Jones, Genetics, 85: 12, 1977）といったように、トリプトファンの中で増殖する能力が欠如している酵母の突然変異体菌株のための選択マーカーを提供する。このとき、酵母宿主細胞ゲノム内の trp１病巣の存在は、トリプトファンの不在下での増殖によるトランスフェクションを検出するための有効な環境を提供する。同様にして、Leu２欠損酵母菌株（ＡＴＣＣ２０,６２２又は３８,６２６）は、Leu２遺伝子を担持する既知のプラスミドによって補完される。
【０１４９】
（iv) プロモーター成分
発現及びクローンベクターは通常、宿主生体により認識されＨＲＧ核酸に作動可能な形で連結されているプロモーターを含有する。プロモーターは、それらが作動可能に連結されているＨＲＧといったような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子（一般には約１００〜１０００bp）の開始コドンに対し上流側（５′）に位置する未翻訳の配列である。かかるプロモーターは、標準的に、誘発性と構成性という２つのクラスに入る。誘発性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養素の有無又は温度変化に応答してそれらの制御下でのＤＮＡからの転写レベルの増大を開始するプロモーターである。現時点で、さまざまな潜在的宿主細胞によって認識される数多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列をベクター内に挿入することによって、ＨＲＧをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。未変性ＨＲＧプロモーター配列及び数多くの非相同プロモーターの両方を用いてＨＲＧＤＮＡの増幅及び／又は発現を導くことができる。しかしながら、未変性ＨＲＧプロモーターに比べて多くの転写量及び発現されたＨＲＧのより高い収量を一般に可能にすることから、非変性プロモーターが好ましい。
【０１５０】
原核細胞宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、ｂ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature, 275: 615, 1978; 及び Goeddel et al., Nature 281; 544, 1979）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8; 4057, 1980及び EP 36,776）、ｔＰＡ（U.S. 5,641,655）及び tacプロモーターといったようなハイブリッドプロモーター（deBoer et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 80; 21-25, 1983）が含まれる。しかしながら、その他の既知の細菌プロモーターも適している。それらのヌクレオチド配列はすでに公表されており、従って、当業者であれば、必要とされるあらゆる制限部位を供給するべくリンカー又はアダプターを用いてＨＲＧをコードするＤＮＡに対しこれらを作動可能に連結することが可能となっている（Siebenlist et al., Cell 20; 269, 1980）。細菌系内で使用するためのプロモーターは同様に一般に、ＨＲＧをコードするＤＮＡに作動可能に結合されたシャイン−ダルガーノ（S.D.) 配列を含むことになる。
【０１５１】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーター配列としては、３−ホスフォグリセレートキナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255; 2073, 1980）又はその他の解糖酵素（Hess et al., J. Adv. Erzyme Reg 7: 149, 1968; 及び Holland. Biochemistry 17; 4900, 1978）例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒト３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼに対するプロモーターが含まれる。
【０１５２】
増殖条件によって制御された転写という付加的な利点をもつ誘発可能なプロモーターであるその他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ及びマルトース及びガラクトースの利用に反応し得る酵素のためのプロモーター領域である。酵母の発現において使用するための適切なベクター及びプロモーターについてはさらに Hitzeman et al., EP 73,657A．に記述されている。酵母エンハンサーは同様に、酵母プロモーターと合わせた形でも有利に使用される。
【０１５３】
真核生物について、プロモーター配列が知られている。事実上全ての真核遺伝子が、転写が開始される部位から上流側約２５〜３０塩基のところにあるＡＴリッチな領域を有している。多くの遺伝子の転写開始点から上流側７０〜８０塩基のところに見られるもう１つの配列は、Ｘが任意のヌクレオチドでありうるＣＸＣＡＡＴ領域である。大部分の真核遺伝子の３′末端には、コーディング配列の３′末端に対するポリＡ尾部の付加のためのシグナルでありうるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列全てが哺乳動物発現ベクター内に適切に挿入される。
【０１５４】
哺乳動物宿主細胞内のベクターからのＨＲＧ遺伝子転写は、そのプロモーターが宿主細胞系と相容性をもつものであることを条件としてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（UK 2,211,504，１９８９年７月５日公示）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥類サルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）といったようなウイルスのゲノムから、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターといった非相同な哺乳動物プロモーターから、熱ショックプロモーターから、及びＨＲＧ配列と通常関連するプロモーターから得られたプロモーターによって制御されうる。
【０１５５】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、同様にＳＶ４０ウイルス複製起点を含むＳＶ４０制限フラグメントとして都合よく得られる（Fiers et al., Nature, 273: 113(1978); Mulligan 及び Berg, Science, 209; 1422-1427(1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:7398-7402 (1981)ヒトサイトメガロウイルスの中間初期プロモーターは、便利にも、HindIII E 制限断片として得られる（Greenaway et al., Gene, 18:355-360(1982))。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして用いて哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現するための系については、ＵＳ４,４１９,４４６中で開示されている。この系の修飾については、ＵＳ４６０１,９７８に記述されている。同様に、サルの細胞内で免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡを発現することに関する Gray et al., Nature, 295; 503-508(1982)；単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞内のヒトｂ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関する Reyes et al., Nature, 297; 598-601(1982)；培養されたマウス及びウサギ細胞の中でのヒトインターフェロンｂ１遺伝子の発現に関する Canaani 及び Berg, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 79; 5166-5170 (1982)；及びラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして用いたＣＶ−１サル腎細胞、ニワトリ胚線維芽細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞及びマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞内での細菌ＣＡＴ配列の発現に関する Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79; 6777-6781 (1982)も同様に参照のこと。
【０１５６】
（ｖ）エンハンサー因子成分
高等真核生物による本発明のＨＲＧをコードするＤＮＡの転写は往々にしてベクター内へのエンハンサー配列の挿入によって増大させられる。エンハンサーは、その転写を増大させるべくプロモーター上に作用する通常約１０〜３００bpのＤＮＡのシス作用性因子である。エンハンサーは、イントロン内（Banerji et al., Cell, 33; 729, 1983）内ならびにコーディング配列自体（Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4; 1293, 1984）の中で転写単位まで５′(Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78; 993, 1981）及び３′(Lusky et al., Mol. Cell Bio.,3: 1108, 1983）のところに見い出されて比較的向き及び位置とは独立したものである。哺乳動物遺伝子からの数多くのエンハンサーが現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテイン及びインシュリン）。しかしながら標準的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されることになる。その例としては、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー（bp１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及び真核プロモーターの活性化のための増強要素上のアデノウイルスエンハンサー（Yaniv, Nature, 297: 17-18(1982)も同様に参照のこと）。エンハンサーは、ＨＲＧＤＮＡに対する位置５′又は３′においてベクター内にスプライスされ得るか、好ましくはプロモーターから５′の部位に位置設定される。
【０１５７】
（vi）転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又はその他の多細胞生体からの有核細胞）の中で用いられる発現ベクターは、同様に、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含むことになる。かかる配列は一般に、真核又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５′及び場合によっては３′の未翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ＨＲＧをコードするｍＲＮＡの未翻訳部分の中でポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。３′未翻訳領域は同様に、転写終結部位をも内含する。
【０１５８】
以上に列挙された成分のうちの単数又は複数のもの、所望のコーディング及び制御配列を含む適切なベクターの構築には、標準的な連結技術が利用される。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片は、分割され、調製されかつ必要なプラスミドを生成するために所望の形態に再度連結される。
【０１５９】
構築されたプラスミドの中で適正な配列を確認することを目的とした分析のために E. Coli ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換するべく連結混合物が用いられ、該当する場合、成功した形質転換体がアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって選択される。形質転換体からのプラスミドが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析されかつ／又は、Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309(1981)の方法又は Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499(1980) の方法によってシークエンスされる。
【０１６０】
本発明の実施において特に有用であるのは、ＨＲＧをコードするＤＮＡの哺乳動物細胞内の一過的発現を提供する発現ベクターである。一般に、過渡的発現には、宿主細胞が発現ベクターの数多くのコピーを蓄積し、その結果、順番に発現ベクターによりコードされた所望のポリペプチドを高レベルで合成するような形で、宿主細胞内で効率良く複製することのできる発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクター及び宿主細胞を含む過渡的発現系は、クローンされたＤＮＡによってコードされたポリペプチドの便利な正の同定ならびに、所望の生物学的又は生理学的特性についてかかるポリペプチドを迅速にスクリーニングすることを可能にする。かくして、過渡的発現系は、本発明において、ＨＲＧ様活性をもつＨＲＧの変異体及び類似体を同定する目的で特に有用である。かかる過渡的発現系についてはＵＳ５,０２４,９３９において記述されている。
【０１６１】
組換え型脊椎動物細胞培養内でのＨＲＧの合成への適合に適したその他の方法、ベクター及び宿主細胞については Gething et al., Nature 293: 620-625, 1981; Mantei et al., Nature, 281: 40-46, 1979; Levinson et al., EP 117,060 and EP 117,058 の中で記述されている。ＨＲＧの哺乳動物細胞培養発現のための特に有用な発現プラスミドは、ｐＲＫ５（欧州公報３０７,２４７号）である。
【０１６２】
Ｄ．宿主細胞の選択と形質転換
本書のベクターをクローニング又は発現するための適切な宿主細胞は、原核生物、酵母又は上述の高等真核生物細胞である。適切な原核細胞としては、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物例えば E. Coli, B. subtilis といった Bacillis, P. aeruginosaといった Pseudomonas種、Salmonella typhimurium 又は Serratia marcescans が含まれる。１つの好ましい E. Coli クローン宿主は、E. coli ２９４（ＡＴＣＣ３１,４４６）であるが、E. coli B、 E. coli x１７７６（ＡＴＣＣ３１,５３７）及び E. Coli Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７,３２５）といったようなその他の菌株も適している。これらの例は、制限的な意味のない例示目的のものである。好ましくは宿主細胞は、最少量のタンパク質分解酵素を分泌しなくてはならない。代替的には、 in vitro のクローン方法、例えばＰＣＲ又はその他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【０１６３】
原核生物に加えて糸状真菌又は酵母といった真核微生物もＨＲＧをコードするベクターのための適切な宿主である。Saccharomyces cerevisiae 又は一般的なパン酵母が、下等真核宿主微生物の中でも最も一般的に使用されている。しかしながら、Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140(1981); EP 139,383、 published May 2,1985）、Kluyveromyces hosts(U.S.S.N. 4,943,529）例えば K. lactis (Louvencourt et al, J. Bacteriol., 737 (1983);K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, 及び K. marxianus, yarrowia (EP 402,226);Pichia pastoris (EP 183,070), Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278(1988);Candida. Trichoderma reesia(EP244,234);Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263(1979)、及び糸状真菌例えば Neurospora, Penicillium, Tolypocladium（ＷＯ９１/００３５７，１９９１年１月１０日公示）。及び Aspergillus 宿主、例えば Anidulans (Ballance et al., Biochem, Biophys. Res. Commun., 112: 284-289(1983); Tilburn et al., Gene. 26:205-221(1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81: 1470-1474(1984)及び A. niger (Kelly 及び Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985))といったような数多くのその他の属、種及び菌株が一般に入手可能であり、ここでは有用である。
【０１６４】
グリコシル化されたＨＲＧポリペプチドの発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。かかる宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動の能力をもつ。原則として、脊椎動物又は無脊椎動物のいずれの培養からのものであれ、任意の高等真核細胞培養が実行可能である。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が含まれる。Spodoptera frugiperda(毛虫)、Aedes aegypti （蚊）、Aedes albopictus (蚊) 、Drosophila melanogaster(ミバエ）及び Bombyx mori宿主細胞といったような宿主からの数多くのバキュロウイルス菌株及び変異体及び対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されてきている Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55(1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow, J.K. et al., 編，第８巻中 (Plenum Publishing, 1986)、pp. 277-279; 及び Maeda et al., Nature, 315; 592-594(1985)。例えば Autographa california ＮＰＶのＬ−１変異体及び Bombyx mori ＮＰＶのＢｍ−５菌株などのさまざまなこのようなウイルス菌株が一般に入手可能であり、特に Spodoplera frugiperda 細胞のトランスフェクションのために、本発明に従った、ここでいうウイルスとしてかかるウイルスを使用することができる。
【０１６５】
宿主として、綿花、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養を利用することができる。標準的には、植物細胞は、ＨＲＧＤＮＡを含むように予め操作された細菌 Agrobacterium tumefaciens の或る種の菌株とのインキュベーションによりトランスフェクションされる。A.tumefaciens との植物細胞培養のインキュベーションの間、ＨＲＧをコードするＤＮＡは、それがトランスフェクションを受け適切な条件下でＨＲＧＤＮＡを発現することになるような形で、植物細胞に移送される。さらに、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列（Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:561(1982))といったような植物細胞と相容性ある調節及びシグナル配列も利用可能である。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流側領域から単離されたＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡ含有植物組織の中で植物発現可能遺伝子の転写レベルを活性化又は増大させる能力をもつ（１９８９年６月２１日発行のＥＰ３２１，１９６参照）。
【０１６６】
しかしながら、最も有利なのは脊椎動物細胞においてであり、近年、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖が日常的手順となってきた（Tissue Culuture, Academic Press. Kruse 及び Patterson, editors(1973))．有用な哺乳動物宿主細胞系統の例としては、ＳＶ４０による形質転換を受けたサルの腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎系統（２９３又は懸濁培養における増殖のためサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59, 1977）；初生ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub 及び Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.77: 4216(1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251(1980)；サル腎細胞（ＣＶＩＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカサバンナモンキー腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸ガン細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Hep Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳ガン（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68(1982)）；ＭＲＣ５細胞：ＦＳ４細胞及びヒト肝ガン細胞系統（ＨｅｐＧ２）がある。好ましい宿主細胞はヒト胚腎２９３及びチャイニーズハムスターの卵巣細胞である。
【０１６７】
宿主細胞は、トランスフェクションされ、好ましくは本発明の上述の発現又はクローンベクターを用いて形質転換され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切な形で修飾された従来の栄養培地の中で培養される。
【０１６８】
トランスフェクションとは、いずれかのコーディング配列が実際に発現されているか否かとは無関係の、宿主細胞による発現ベクターの取り込みのことである。例えばＣａＰＯ₄及び電気穿孔法といった数多くのトランスフェクション方法が当業者にとって既知のものである。このベクターの働きを表わす何かが宿主細胞内で生じた時点で、トランスフェクションの成功が認められる。
【０１６９】
形質転換というのは、染色体外要素として又は染色体組込みにより、ＤＮＡが複製可能となるように生体の中にＤＮＡを導入することを意味する。使用される宿主細胞に応じて、かかる細胞に適切な標準的技術を用いて形質転換が行なわれる。前出の Sambrook et al., の第１.８２節で記述されているように、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理が一般に、原核生物又は実質的な細胞壁バリヤを含むその他の細胞のために使用される。Shaw et al., Gene. 23: 315(1983)及びＷＯ８９/０５８５９（１９８９年６月２９日公示）によって記述されているように、或る種の植物細胞のトランスフェクションのために、Agrobacterium tumefaciens での感染が用いられる。かかる細胞壁の無い哺乳動物細胞については、Sambrook et al. 前出の第１６、３０−１６、３７節に記述されているリン酸カルシウム沈降法が好まれる。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の全体的様相については、１９８３年８月１６日に発行されたＵ.Ｓ.４,３９９,２１６中で Axel によって記述されている。酵母内へのトランスフェクションは標準的に、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977) 及び Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)の方法に従って実施される。しかしながら、核注入、電気穿孔法は又はプロトプラスト融合によるものといったように細胞内にＤＮＡを導入するためのその他の方法も使用することも可能である。
【０１７０】
Ｅ．宿主細胞の培養
本発明のＨＲＧポリペプチドを産生するのに使用される原核細胞は、Sambrook et al.,前出に全体的に記述されているような適切な培地内で培養される。
【０１７１】
本発明のＨＲＧを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、さまざまな培地の中で培養することができる。Ham's F10(Sigma)、最少必須培地（(MEM)、Sigma)、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma)、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma)が宿主細胞の培養に適している。さらに、宿主細胞のための培地として、Ham 及び Wallace. Meth. Enz., 58:44(1979)、Barnes及び Sato, Anal. Biochem., 102:255(1980)、U.S. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 又は 4,560,655; WO90/03430; WO87/00195; U.S. Pat.Re.30.985 又は U.S. 5,122,469; の中で記述されている培地のうちのいずれでも使用することができる。これらの培地のいずれも必要に応じて、ホルモン及び／又はその他の増殖因子（例えばインシュリン、トランスフェリン又は表皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシムウ及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン製剤）、微量元素（マイクロM範囲内の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）及びグルコース又は同等のエネルギー源で補足され得る。その他の任意の必要な補足物も、当業者にとって既知であると思われる適切な濃度で内含され得る。温度、pHなどといった培養条件は、発現のために選択された宿主細胞について以前に使用されたものであり、当業者にとっては明らかであろう。
【０１７２】
この開示で言及されている宿主細胞は in vitro 培養中の細胞ならびに宿主動物の体内にある細胞を包含する。
【０１７３】
さらに、本発明のＨＲＧを、相同性組換えによってか又は、現在当該分野で使用されているＨＲＧをコードするＤＮＡをすでに含有する細胞内に導入された制御要素を利用した組換え型産出方法を用いて産出することも可能であることが考えられている。例えば、強力なプロモーター／エンハンサー要素、サプレッサー、又は外因性転写モジュレータ要素が、所望のＨＲＧをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすのに充分な近接性及び向きで、意図された宿主細胞のゲノム内に挿入される。制御要素は、本発明のＨＲＧをコードしないが、ＤＮＡは、宿主細胞ゲノム内に存在する。次に本発明のＨＲＧを作る細胞について、又は望みに応じて増大又は減少される発現レベルについてスクリーニングが行なわれる。
【０１７４】
Ｆ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅及び／又は発現は、本書に提供されている配列に基づいて適切に標識づけされたプローブを用いて、例えば従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量するためのノーザンブロット法（Thomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77; 5201-5205(1980)、ドットブロット法（ＤＮＡ解析）、又は in sith ハイブリダイゼーションによって直接サンプル内で測定することができる。さまざまな標識を利用することができるが、最も一般的には、放射性同位元素、特に³²Ｐが使用される。しかしながら、ポリヌクレオチド内への導入のためにビオチン修飾されたヌクレオチドを用いることといったようなその他の技術も同様に利用可能である。このとき、ビオチンは、放射性核種、蛍光剤、酵素などといったさまざまな標識で標識づけされうる抗体又はアビジンに結合するための部位として役立つ。代替的には、ＤＮＡ２本鎖分子、ＲＮＡ２本鎖分子、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖分子又はＤＮＡ−タンパク質２本鎖分子を含めた特定の２本鎖分子を認識できる抗体を利用することができる。抗体自体標識づけすることができ、２本鎖分子が表面に結合されている場合検定を行なうことができ、かくして表面上での２本鎖分子の形成の時点で、２本鎖分子に結合した抗体の存在を検出することができるようになっている。
【０１７５】
代替的には、遺伝子産物の発現を直接定量するべく、組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定といったような免疫学的方法により、遺伝子発現を測定することができる。免疫組織化学的染色技術により、酵素標識、螢光標識、発光標識などのように標識が通常視覚的に検出可能であるような、結合された遺伝子産物に特定的な標識づけされた抗体との反応が続く、脱水及び固定によって標準的に細胞標本が調製される。本発明で使用するのに適した特に感受性の高い染色技術は、Hsu et al., Am. J. Clin. Path,75; 734-738(1980)によって記述されている。
【０１７６】
免疫組織化学的染色及び／又は標本流体の検定にとって有用な抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、あらゆる哺乳動物中で調製され得る。適切には、抗体は、未変性ＨＲＧポリペプチドに対してか又は、以下でさらに詳述するように本書で提供されているＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して調製され得る。
【０１７７】
Ｇ．ヘレグリンポリペプチドの精製
ＨＲＧは、細胞膜画分から回収される。代替的には、タンパク質分解により分割されたか又は切断された、発現した可溶性ＨＲＧフラグメント又はサブドメインが、可溶性ポリペプチドとして培地から回収される。ＨＲＧは、分泌シグナル無しで直接発現されたとき宿主細胞溶解産物から回収される。
【０１７８】
ＨＲＧがヒト由来のもの以外の組換え型細胞内で発現された時点で、ＨＲＧは、ヒト由来のタンパク質又はポリペプチドを全く含まない状態にある。しかしながら、ＨＲＧに関して実質的に相同である調製物を得るためには、組換え型細胞タンパク質又はポリペプチドからＨＲＧを精製することが望ましい。第１段階として、培地又は溶解産物を遠心分離に付して、粒状の細胞破片を除去する。次に、膜及び可溶性タンパク質分画を分離させる。ＨＲＧが膜結合されているか否かに応じて可溶性タンパク質分画（プロテアーゼの存在が必要）及び培養溶解産物の膜分画の両方から、ＨＲＧを精製する。以下の手順は、適切な精製手順の一例である：イムノアフィニティ又はイオン交換カラム上の分画化；エタノール沈降法；逆相ＨＰＬＣ；シリカ、へパリンセファロース又はＤＥＡＥといったカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降法；及び例えばＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−７５を用いたゲルろ過。
【０１７９】
残基が欠失、挿入又は置換されたＨＲＧ変異体は、変異によってひき起こされた特性の何らかの実質的変化を考慮に入れて、未変性ＨＲＧと同じ要領で回収される。例えば、細菌又はウイルス抗原といったもう１つのタンパク質又はポリペプチドとのＨＲＧ融合の調製が精製を容易にする。すなわち抗原に対する抗体を含有するイムノアフィニティカラムを、融合体を吸着させるべく使用することができる。少なくとも１つの残りの免疫エピトープに結合させることによってＨＲＧ変異体を吸収するためにウサギポリクローナル抗ＨＲＧカラムといったようなイムノアフィニティカラムを利用することができる。フェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）といったようなプロテアーゼ阻害物質も同様に、精製中のタンパク質分解による分解を阻害するために有用であり得、又、付随的な汚染物質の増殖を防ぐため抗生物質を内含させることもできる。当業者であれば、未変性ＨＲＧに適した精製方法には、ＨＲＧ変異体の性質の変化を考慮に入れるため又は組換え型細胞培養の発現時点で修飾が必要となる可能性があるということがわかるだろう。
【０１８０】
Ｈ．ＨＲＣの共有結合修飾
本発明の範囲内には、ＨＲＧポリペプチドの共有結合修飾が含まれる。未変性ＨＲＧ及びＨＲＧのアミノ酸配列変異体は両方共、任意に共有結合修飾される。本発明の範囲内に含まれる共有結合修飾の１つのタイプは、ＨＲＧポリペプチドフラグメントである。ＨＲＧ−ＧＤＦといったような、最高約４０個のアミノ酸残基をもつＨＲＧフラグメントは、化学合成によってか、又は全長ＨＲＧポリペプチド又はＨＲＧ変異体ポリペプチドの酵素的又は化学的切断によって適切に調製される。ＨＲＧ又はそのフラグメントのその他のタイプの共有結合修飾は、選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応する能力をもつ有機誘導体化剤と、ＨＲＧ又はそのフラグメントの標的アミノ酸残基を反応させることによって、分子内に導入される。
【０１８１】
システイニル残基は、最も一般的に、クロロ酢酸又はクロロアセタミドといったα−ハロアセテート（及び対応するアミン）と反応させられ、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を提供する。システイニル残基もまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ビリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸塩、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１８２】
ヒスチジル残基は、pH５．５〜７.０でジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化されるが、これは、この作用物質がヒスチジル側鎖に対し比較的特定的なものであるからである。パラブロモフェナシルブロミドも同様に有用である；この反応は好ましくは、pH６.０で０.１Ｍのカコジル酸ナトリウム内で実施される。
【０１８３】
リジニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又はその他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの作用物質での誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果をもつ。ａ−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適切な試薬としては、ピコリニミド酸メチルといったイミドエステル、リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルフォン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びトランスアミナーゼを触媒とするグリオキレートとの反応が含まれる。
【０１８４】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含む、単数又は複数の従来の試薬との反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のpKaが高いことを理由としてアルカリ性条件下で反応を行なう必要がある。さらに、これらの試薬は、リシン基ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応することができる。
【０１８５】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香ファミリージアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応により、チロシル残基の中にスペクトル標識を導入する上で特に有利なものとして実行することができる。最も一般的には、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成するために、Ｎ−アセチルイミジゾル及びテトラニトロメタンが用いられる。放射性免疫測定法において使用するための標識づけされたタンパク質を調製するため¹²⁵Ｉ又は¹³¹Ｉを用いてチロシル残基がヨウ素化され、ここで上述のクロラミンＴ法が適している。
【０１８６】
カルボキシル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ′−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ′)との反応により選択的に修飾される。なお式中Ｒ及びＲ′は、１−クロロヘキシル−３−（２−Mクオリニル−４−エチル）カルボイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドといったような異なるアルキル基である。さらにアスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換される。
【０１８７】
抗−ＨＲＧ抗体を精製するための方法の中で使用するためのＨＲＧを非水溶性の支持体マトクリス又は表面に架橋させるため及びその逆のために、２官能作用物質での誘導体化が有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３′−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）といったようなジスクシニミジルエステルを含むホモ２官能イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンといったような２官能マレイミドが含まれる。メチル−３−（（Ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミデートといった誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成する能力をもつ光活性化可能な中間体を生み出す。代替的には、タンパク質固定化のためには、Ｕ．Ｓ．３,９６９,２８７；３,６９１,０１６；４,１９５,１２８；４,２４７,６４２；４,２２９,５３７；及び４,３３０,４４０の中で記述されている反応性基質及び臭化シアノゲンで活性化された炭水化物といったような反応性非水溶性マトリクスが利用される。
【０１８８】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、頻繁に、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基まで脱アミドされる。代替的には、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミドされる。これらの残基の両方の形態が、本発明の範囲内に入る。
【０１８９】
その他の修飾には、プロリン及びリシンのヒドロオキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T.E.Ceighton：Proteins：Structure and Molecular Properties、W.H.Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)、Ｎ末端アミンのアセチル化及びいずれかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１９０】
ＨＲＧは任意には、ＨＲＧに対し非相同なポリペプチドと融合させられる。非相同ポリペプチドは、任意には、Ｍ１３遺伝子III 又は遺伝子 VIII タンパク質といったファージコートタンパク質の中に見い出されるようなアンカー配列である。これらの非相同ポリペプチドは、ＨＲＧポリペプチドに対し側鎖を通して又は末端残基を通して共有結合によって結合され得る。
【０１９１】
ＨＲＧは同様に、その未変性グリコシル化パターンを変えることによっても、共有結合修飾されうる。これらの実施形態における単数又は複数の炭水化物置換基は、一定の与えられた部位で単糖成分を付加、除去又は変異させることによって、又はグリコシル化部位を付加又は欠失するようにＨＲＧ内の残基を修飾することによって、修飾される。
【０１９２】
ポリペプチドのグリコシル化は、標準的にはＮ連結又はＯ連結のいずれかを受けている。Ｎ連結されたというのは、アスパラギン残基の側鎖に対する炭水化物の付着を意味する。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるものとして、トリペプチド配列、つまりアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニンは、アスパラギン側鎖に対する炭水化物半分の酵素的付着のための認識配列である。かくして、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ連結されたグリコシル化というのは、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも同様に使用できるものの、最も一般的にはセリン又はトレオニンであるヒドロキシアミノ酸に対する、Ｎアセチルガラクトースアミン、ガラクトース又はキシロースといった糖のうちの１つの付着のことを意味する。
【０１９３】
グリコシル化部位は、（Ｎ連結されたグリコシル化部位については）上述のトリペプチド配列のうち単数又は複数のものを含むべくそのアミノ酸配列を変化させることによってＨＲＧに付加される。この変化は、（Ｏ連結されたグリコシル化部位については）ＨＲＧに対して単数又は複数のセリン又はトレオニン残基を付加するか又は置換することによっても加えることができる。簡易的には、好ましくは、ＨＲＧは、ＤＮＡレベルでの変更、特に、所望のアミノ酸へと翻訳されるコドンを生じさせるように、予め選択された塩基においてＨＲＧをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、変化させる。
【０１９４】
ＨＲＧに対するグリコシドの化学的又は酵素的結合は、炭水化物置換基の数を増大させる。これらの手順は、Ｎ及びＯ連結されたグリコシル化の能力をもつ宿主細胞内でのポリペプチドの産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基例えばシステイン基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、トレオニン又はヒドロキシプロリン基、（ｅ）芳香ファミリー基、例えばフェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公示されたＷＯ８７/０５３３０及び Aplin 及び Wriston (CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306(1981)）中で記述されている。
【０１９５】
ＨＲＧ上に存在する炭水化物部分も同様に、化学的又は酵素的に除去される。化学的脱グリコシル化には、化合物トリフルオロメタンスルフォン酸又はそれと等価の化合物に対するポリペプチドの暴露が必要とされる。この処理は結果として、ポリペプチドを無傷の状態に残しながら、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除く全ての又は大部分の糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化については Hakimuddin et al.(Arch. Biochem. Biophys., 259・52(1987)）及び Edge et al.(Anal. Biochem.,118;131(1981)）によって記述されている。炭水化物部分は、Thotakura et al.(Meth, Enzymol.,138;350(1987)によって記述されているようにさまざまなエンド及びエキソグリコシダーゼによりＨＲＧから除去される。
【０１９６】
グリコシル化は同様に、Duskin et al.(J. Biol. Chem. 257;3105(1982)）によって記述されているようにツニカマイシンによって抑制される。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシドリンケージの形成を遮断する。
【０１９７】
ＨＲＧは同様に、Ｕ．Ｓ．４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２又は４，１７９，３３７に記述されている要領で、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンといったさまざまな非タンパク様の重合体にＨＲＧをリンクさせることによっても修飾され得る。
【０１９８】
非膜結合ＨＲＧの in vivo 循環半減期を延長させる１つの好ましい方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といったような、半減期の延長を付与する重合体にそれを接合させることにある。（Maxfield, et al, Polymer 16, 505-509(1975): Bailey, F.E., et al, in Nonionic Surfactants (Schick, M. J., ed.) pp. 794-821, 1967); (Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem. 252, 3582-3586, 1977; Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys. 7, 175-186, 1984); (Katre, N. V. et al., Prov. Natl. Acad. Sci., 84, 1487-1491, 1987;Goodson, R. et al., Bio Technology, 8, 343-346, 1990)。ＰＥＧに対する接合は、免疫原性及び毒性を低減させたものとして報告されてきた（Abuchowski, A. et al., J. Biol. Chem., 252, 3578-3581, 1977）。
【０１９９】
ＨＲＧは、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）内、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）内又はマイクロエマルジョン内に捕獲されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第１６版、Osol, A., Ed.,(１９８０）の中で開示されている。
【０２００】
当業者であれば、意図された目的のために最適な変異体を選択する目的で変異体スクリーニングを行なうことができるだろう。例えば、所定の抗原又はＨＥＲ２レセプターに対する親和力の変化といったようなＨＲＧの免疫学的特性の変化は、未変性ＨＲＧ（特に未変性ＨＲＧ−ＧＦＤ）といったような標準又は対照を用いた競合タイプのイムノアッセイによって測定される。酸化還元又は熱安定性、疎水性、タンパク質分解による分解に対する感受性、組換え型細胞培養又は血漿中の安定性又は担体との又は多重体への凝集傾向といったようなタンパク質又はポリペプチドの特性のその他の潜在的修飾は、当該技術分野において周知の方法によって検定される。
【０２０１】
Ｉ．ヘレグリン抗体の調製
本発明の抗体は、日常的スクリーニングによって得られ、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びその断片を内含する。
【０２０２】
ポリクローナル抗体は好ましくは、関連する抗原及びアジュバントを多数回皮下（sc）又は腹腔内（ip）注入することによって、動物の体内で発生させられる。例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシニミドエステル（システイン残基を通しての接合）、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（リシン残基を通して）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ₂又はＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ¹は異なるアルキル基である）といった２官能性又は誘導体化剤を用いて、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン又はダイズトリプシン阻害物質といったような、免疫化されるべき種の中で免疫原性であるタンパク質に対し、関連する抗原を接合させることが有利であり得る。
【０２０３】
動物を、例えば３体積のフロイント完全アジュバントと１００μg又は５μgのタンパク質又は接合体（それぞれウサギとマウスについて）を組合わせ多数の部位において皮肉に溶液を注入することによって、抗原、免疫原性接合体又は誘導体に対し免疫化させる。１カ月後、多数の部位での皮下注入によりフロイント完全アジュバント内のペプチド又は接合体を当初の量の１/５〜１/10 の量だけ用いて動物を追加免疫に付す。７〜１４日後に、動物から採血し、血清を抗体力価について検定する。力価が安定状態に入るまで動物を追加免疫に付す。好ましくは、同じ抗原のものではあるものの異なるタンパク質に対してかつ/又は異なる架橋試薬を通して接合された接合体を用いて、動物に追加免疫を施す。接合体は同様に、タンパク質融合体として組換え型細胞培養の中で作ることもできる。同じく、ミョウバンといったような凝集剤を使用して免疫応答を増強させることも適当である。
【０２０４】
モノクローナル抗体は、kohler et al, Nature, ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法を用いて作ることもできるし、或いは又組換えＤＮＡ法（米国特許第４,８１６,５６７号）によって作ることもできる。
【０２０５】
ハイブリドーマ方法においては、マウス又はハムスターーやマカクモンキーといったその他の適切な宿主動物を、免疫感作のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生する能力をもつリンパ球を惹起するために、上述のように免疫感作する。代替的には、リンパ球を in vitro で免疫感作することもできる。リンパ球は、次にポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice；p59〜103（Academic Press, 1986）。
【０２０６】
かくして調製されたハイブリドーマ細胞は、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は存続を阻害する単数又は複数の物質を好ましくは含有する、適切な培地内で播種され増殖させられる。例えば、親骨髄腫細胞に酵素ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠如している場合には、ハイブリドーマのための培地は標準的にヒポキサンチンアミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を内含することになり、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０２０７】
好ましい骨髄種細胞は、効果的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支援し、ＨＡＴ培地といったような培地に対する感受性の細胞である。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞系統は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califormia, ＵＳＡから入手可能なＭＯＰ−２１及びＭ.Ｃ.−１１マウス腫瘍及び American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞から誘導されたもののようなマウスの骨髄腫系統である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系統もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記述されてきた（Kozbor, J. Immunol., 133:300)(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techiques and Applications pp51〜63（Marcel Dekker, Inc., New York., 1987)）．
【０２０８】
ハイブリドーマ細胞が中で増殖しつつある培地を、抗原に対し導かれたモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）といったような in vitro 結合検定又は免疫沈降法によって測定する。
【０２０９】
モノクローナル抗体の結合親和力は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220(1980)の Scatchard分析によって測定され得る。
【０２１０】
所望の特異性、親和力及び／又は活性をもつ抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定した後、希釈手順を制限することによってクローンをサブクローニングして、標準的方法で増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice、 p59〜103(Academic Press1986))。この目的のために適した培地としては例えば、Ｄ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらにハイブリドーマ細胞を、１匹の動物中で腹水腫瘍として in vivo で増殖させることが可能である。
【０２１１】
サブクローンによって分泌モノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気球動法、透析、又はアフィニティクロマトグラフィといったような従来の免疫グロブリン精製手順により、培地、腹水又は血清から適切に分離される。
【０２１２】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離及びシークエンスされる（例えば、モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力をもつオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター内に入れることができ、これらのベクターは次に、組換え型宿主細胞内でモノクローナル抗体を合成させるべく E. coli細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞といったような宿主細胞内にトランスフェクションされる。以下では、抗体の組換え型産生について詳述する。
【０２１３】
抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を、ＨＥＲ２/ＨＥＲ３レセプターに結合する抗体について培養上清をスクリーニングすることによって同定する。これは可溶性レセプター調製物を用いる従来の免疫検定によってか又は細胞結合型レセプター及び標識された候補の抗体を用いるＦＡＣＳによって定型的に達成される。アゴニスト抗体は、好ましくは、上述したＨＲＧチロシン自己リン酸化検定における自己リン酸化を刺激する抗体である。
【０２１４】
ハイブリッド細胞系統は、細胞培地内で in vitro 培養状態に維持され得る。本発明の細胞系統は、ヒポキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地中の連続的細胞系統を含む組成物の中で選択されかつ／又は維持され得る。実際には、ハイブリドーマ細胞系統がひとたび確立されると、これを栄養的に適切な種々の培地上に維持することができる。その上、ハイブリッド細胞系統は、液体窒素下での凍結及び貯蔵を含め、あらゆる数の従来の方法で貯蔵及び保存することができる。凍結された細胞系統は、モノクローナル抗体の合成及び分泌の再開により、無限に再生及び培養させることができる。分泌された抗体は、沈降、イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどといった従来の方法により組織培養上清から回収される。本書で記述した抗体は同様に、場合によっては、例えばエタノール又はポリエチレングリコール沈降手段といったようにこれまでプールされた血漿からこれらの免疫グロブリンを精製するのに使用されてきたＩｇＧ又はＩｇＭの精製のための従来の方法によって、ハイブリドーマ細胞培養からも回収される。
【０２１５】
ヒト抗体を使用することができ、これが好ましい。かかる抗体は、ヒトハイブリドーマを使用することにより得られる（Cote et al., モノクローナル抗体とガン療法 Alan R. Liss, p.７７（１９８５））。マウス抗ＨＥＲ２/ＨＥＲ３可変領域及び適当な生物活性（例えばヒト補体を活性化しＡＤＣＣを媒介する能力）をもつヒト定常領域を含有するキメラ抗体（Cabilly et al., U.S.4,816,567, Morrison et al., Proc. Natl, Acad. Sci., 81:6851(1984); Neuberger et al., Nature 312: 604(1984); Takeda et al. Nature 314; 452(1985))が、従来のＣＤＲ移植方法（Riechmann et al., Nature 332: 333-327(1988); EP0328404A1; EP02394000 A2)により産生させるヒト化抗体と同様、本発明の範囲内に入る。
【０２１６】
モノクローナル抗体の生成をバイパスする抗体分子（Ｆab又は可変領域断片）の抗原結合領域の組換え型ＤＮＡバージョンを作り出すための技術も同様に、本発明の実施の中に包含されている。免疫感作された対象から採取された免疫系細胞から抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を抽出し、これらを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転写し、ｃＤＮＡを細菌発現系内にクローニングし、所望の結合特性について選択する。Scripps/Stratagene法では、発現されたＦabタンパク質を（細菌細胞膜と細胞壁の間の）細胞膜周辺腔まで移動させるか又は分泌されるようにするリーダー配列を含有するバクテリオファージラムダベクター系が使用される。所望の特性をもつレセプターと結合するものを同定するために、多数の機能的Ｆab フラグメントを迅速に生成しスクリーニングすることが可能である。代替的には、Hoogenboom, Tibtech February 1997(vol.15); Neri et al., Cell Biophysics 27; 47-61(1995); Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12; 433-55(1994)；及び Soderlind et al., Immunol. Rev. 130; 109-124(1992)の中で記述されている、ファージディスプレイ技術及びその中で記述されている参考文献ならびに Lowman et al. Biochem. 30: 10832-10838(1991) の中で記述されている１価のファージディスプレイ技術によって、抗体を調製することが可能である。
【０２１７】
２．ヘレグリン及びアゴニスト抗体の治療的組成物、投与及び利用
ＨＲＧは、本発明におてい、例えば肺上皮細胞増殖すなわち上皮細胞増殖、分裂及び分化を誘発し、肺細胞による界面活性プロテインＡの産生を増大させるために使用されている。これらの効果は、本発明の方法により、組織損傷に付随する疾患状態、例えば、慢性気管支炎、気腫、ぜん息といったようなその亜型を含めた慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；新生児呼吸困難症候群、胎便誤えん症候群、新生児の慢性肺疾患、先天性横隔膜ヘルニア、などを含む新生児肺疾患；煙又は化学物質の吸入、吸引、放射線に起因する肺炎、臨溺死、膵のう胞性繊維症を含む急性肺損傷；及び外科的創傷及び切除術に付随する損傷、潰瘍、病巣及び組織引裂を含むその他の上皮細胞外傷を治療することを可能にしている。
【０２１８】
本発明の方法を用いた治療のための好ましい療法は、ＣＯＰＤの治療である。ＣＯＰＤは、せき、たん、呼吸困難、気流制限及び気体交換機能障害により特徴づけられる一連の慢性炎症性の呼吸器系統疾患である。ＣＯＰＤは、高齢者に一般的なものであり、肺機能が漸進的に衰弱するというパターンを呈する。標準的には、患者は、濃厚なたん及び付随する気体交換の劣化を伴うせきにまで悪化する、透明なたんを伴う慢性のせき症状を示すことになる。これらの病状は、心臓疾患そして死に至ることが多い。ＣＯＰＤを患う多くの人が、気腫と共に気管支炎を有する。本発明は、ＣＯＰＤ患者における肺破壊プロセスを止め、減速させかつ／又は逆行させることから、きわめて重要である。この作用において、本発明の方法は、症状は治療されるものの根底にある肺細胞の組織及び機能の破壊は治療されないＣＯＰＤ用の標準的治療とはきわめて異なるものである。
【０２１９】
しかしながら、本発明の方法は、ＣＯＰＤといった肺疾患の治療のためのその他の療法と組合わせたり、それらと共に投与することができるものである。例えば、本発明の方法は、臭化イプラトロピウム（Boehringer Ingleheim から入手可能なＡＴＲＯＶＥＮＴ）又はチオトロピウムといったような抗コリン作動性気管支拡張剤、アルブテロール（Schering から入手可能なＰＲＯＶＥＮＴＩＬ）又はサルメテロールといったようなβアドレナリン作動性レセプターアゴニスト、プレドニゾンといったステロイド、レチノイン酸、ホスホジエステラーゼ阻害物質、エンドテリンアンタゴニスト、メタロプロテイナーゼ阻害物質、エラスターゼ阻害物質、遊離ラジカル阻害物質、セリンプロテイナーゼ阻害物質、好中性エラスターゼ阻害物質、肺界面活性剤組成物例えばベラクタント（Ross Labs から入手可能なＳＵＲＶＡＮＴＡ）、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、増殖ホルモン又はその他のタンパク質増殖因子など又はそれらの組合せの投与と合わせて使用することができる。ＨＲＧ及び付加的化合物の相対的量は、患者の個々の症状を考慮して医師が容易に決定できる。これらの組成物及びその中の成分の相対的量は、患者の特定的ニーズに対処すべく必要に応じて変更され、肺機能についての従来の物理化学的及び医学的テストを用いて監視され調製されることになる。
【０２２０】
ＨＲＧ又はアゴニスト抗体の治療向け製剤は、所望の純度をもつＨＲＧタンパク質を生理学的に受容可能な任意の担体、賦形材又は安定化剤（Remington's Phamaceutical Sciences. 前出）と混合することによって、凍結乾燥されたケーキ又は水溶性液の形で貯蔵向けに調製される。受容可能な担体、賦形材又は安定化剤は、利用される用量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸といった緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンといったようなタンパク質；ポリビニルピロリドンといった親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンといったアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡといったキレート化剤；マンニトール又はソルビトールといった糖アルコール；ナトリウムといった塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といった非イオン性界面活性剤を内含する。
【０２２１】
in vitro 投与に使用すべきＨＲＧ又はアゴニスト抗体は、無菌でなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、無菌ろ過膜を通してろ過することによって容易に達成される。ＨＲＧ又は抗体は、通常は、凍結乾燥形態又は溶液の形で貯蔵されることになる。
【０２２２】
治療用ＨＲＧ又は抗体組成物は、無菌の出入り口をもつ容器、例えば皮下注射針で穴あけできるストッパーを有する静脈内溶液用袋又はバイアルの中に入れられる。
【０２２３】
ＨＲＧ又は抗体投与の経路は、既知の方法例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉、眼内、動脈内経路、又は鼻又は肺への粉末又は液体エアゾル投与、又は病変内経路によるか又は以下に記すような徐放システムによる注入又は輸注といった、既知の方法に従ったものである。ＨＲＧリガンドは、輸注又は静脈内ボーラスによって連続的に投与され得る。
【０２２４】
ＨＲＧ、ＨＲＧ変異体又は断片及びアゴニスト抗体は、既知の技術を用いて噴霧乾燥又は噴霧凍練乾燥させることができる（Yeo et al, Biotech. and Bioeng., 41: 341-346(1993)； Gombotz et al., ＰＣＴ/ＵＳ９０/０２４２１）．
【０２２５】
徐放性調製物の適切な例としては、タンパク質を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリクスがあり、これらのマトリクスは、成形品例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態をとる。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及び Langer, Chem., Tech., 12: 98-105(1982)によって記述されているようなポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）又はポリビニルアルコール））、ポリラクチド（U.S. 3,773,919、EP 58,481）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−Ｌ−グルタメートの共重合体（Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、非分解性エチレン酢酸ビニル（Langer et al.,前出）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸共重合体と酢酸ロイプロリドから成る注入可能なマイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（ＥＰ．１３３，９８８）が含まれる。エチレン酢酸ビニルや乳酸−グリコール酸は１００日以上の間分子を放出することができるが、いくつかのヒドロゲルはそれより短期間、タンパク質を放出する。カプセル化されたタンパク質が長時間体内にとどまっている場合、これらのタンパク質は、３７℃での水分に対する露呈の結果として、変性又は凝集し、その結果、生物活性が喪失したり、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて、タンパク質の安定化のために合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオスルフィド相互交換を通しての分子間シグナル配列結合形であることがわかった場合、安定化は、スルフヒドリル残基に修正し、酸性溶液から凍結乾燥させ、含水量を制御し、適切な添加剤を用い、特異的重合体マトリクス組成物を開発することによって達成することができる。
【０２２６】
徐放性ＨＲＧ又は抗体組成物は、同様に、リポソームに捕獲されたＨＲＧ又は抗体をも内含する。ＨＲＧ又は抗体を含有するリポソームはそれ自体既知の方法によって調製される：DE3,218,121;Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 3688-3692(1985); Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.77: 4030-4034(1980); EP52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641:日本特許出願８３−１１８００８；U.S.4,485,045 及び4,544,545；及びEP 102,324。通常リポソームは、脂質含有量が約３０mol％コレステロールより多い小さな（約２００〜８００オングストローム）単一層タイプのものであり、選択された割合は、最適なＨＲＧ療法のために調製される。循環時間が増強されたリポソームについては、米国特許第５,０１３,５３６号に開示されている。
【０２２７】
治療用に利用すべきＨＲＧ又は抗体の有効量は、例えば、治療目的、投与経路及び患者の状態によって左右される。同様に、ＨＲＧポリペプチドの量は一般にアゴニスト抗体の量より少なくなる。従って、セラピストは最適な治療効果を得るために必要とされるように、用量を滴定し投与経路を修正することが必要であろう。標準的な一日の用量は、上述の要因に応じて約１μg/kg〜約１mg/kgの範囲内であり、最高で１００mg/kgであると考えられる。標準的には、臨床医は、所望の効果を達成する用量に達するまでＨＲＧ又は抗体を投与することになる。この療法の進捗は、例えば界面活性プロテインＡ産生といった従来の検定により容易に監視される。
【０２２８】
さらにもう１つの実施形態においては、当該技術分野において周知の技術（生検など）を用いて正常な上皮細胞標本を得るため、哺乳動物組織から上皮細胞を得るか又は分離することができる。この標本は、このとき、標本中での上皮細胞の成長及び／又は増殖を誘発し、それにより初代上皮細胞の個体群を拡大させる目的でヘレグリンタンパク質で処置され得る。標準的には、ヘレグリンは、 in vitro 上皮細胞培養に対し、約０.１〜約１００nM好ましくは１〜５０nMの濃度で添加されることになる。所望する場合には、初代上皮細胞は、上皮細胞個体群を充分に拡大させる目的で数世代にわたり、 in vitro で培養されうる。上皮細胞は、以上で論述したとおり、哺乳動物の細胞培養に適した条件下で培養される。拡大後、拡大した標本は、哺乳動物組織を再度上皮形成させる目的で、哺乳動物の体内に再導入される。例えば、損傷を受けた肺組織をより迅速に再上皮形成させかくして肺機能を再度確立するために、気腫又は慢性閉塞性肺疾患を患う患者から分離した肺上皮細胞を獲得し、拡大させ、肺の中に再導入することが可能である。拡大された細胞は、当該技術分野において周知の方法を用いて吸引又は挿管により肺の中に再導入することができる。
【０２２９】
ＨＲＧ−α又はＨＲＧ全般に関して本書に記述した方法及び手順は、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２及びＨＲＧ−β３といったその他のＨＲＧ及びその変異体、ならびに抗体に対しても同様に適用可能である。以下の例は、制限的な意味のない例として提供されている。
【０２３０】
【実施例】
実施例１−ヘレグリンの調製
（ａ）米国特許第５，３６７，０６０に記載されているように、ヘレグリンＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β２様、およびＨＲＧ−β３を単離し、クローン化し、発現させて、細胞培養培地から単離した。
（ｂ）ＳＭＤＦポリペプチドを、ＷＯ９６／１５２４４に記載されているように調製した。
（ｃ）γ−ＨＲＧポリペプチドを、以下に記載するように調製して特徴づけた。
試薬類：前述のごとく（Sliwcowski et al. J. Biol. Chem. 269: 14661-14665(1994)）、ＨＲＧβ１_(177-244)のＥＧＦ様ドメインをＥ．ｃｏｉｌ中で発現させ、精製し、放射性ヨウ素化した。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体２Ｃ４および４Ｄ５は、すでに別に記載されている（Fendly et al. Cancer Reserch 50: 1550-1558(1990)）。
【０２３１】
ＨＥＲ３およびＨＥＲ４−免疫アドへジン：独自のＭｌＩ部位をヒトＩｇＧのＨ鎖を発現するプラスミドの免役グロブリンのヒンジドメインをコードする部分に組み込んだ。ＭｌＩ部位を、ＨＥＲ発現プラスミドのセットの、これらのレセプターーのＥＣＤ／ＴＭ接合部をコードする部分にも組み込んだ。全ての突然変異はＫｕｎｋｅｌ法（Kunkel,T., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:488(1985)）を用いて行われた。ＭｌＩ部位は、適当なＨＥＲ−ＩｇＧ融合構築物を作るのに用いられた。種々のＨＥＲ−ＩｇＧキメラの融合接合部は：ＨＥＲ２については、Ｅ⁶⁴⁶ _HER2−（ＴＲ）−ＤＫＴＨ²²⁴ _VH；ＨＥＲ３については、Ｌ⁶³⁶ _HER3−（ＴＲ）−ＤＫＴＨ²²⁴ _VH；ＨＥＲ４については、Ｇ⁶⁴⁰ _HER4−（ＴＲ）−ＤＫＴＨ²²⁴ _VHである。保存されたＴＲ配列は、ＭｌＩ部位よりもたらされている。最終発現構築物は、真核生物での発現がＣＭＶプロモーターーによって駆動される、ｐＲＫ型プラスミド骨格（backbone）（Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10(1990)）に挿入した。
【０２３２】
in vitro実験のためのタンパク質を得るため、標準的なリン酸カルシウム法を用いて、適当な発現プラスミドを付着ＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクションした（Gorman et al., supra and Huang et al., Nucleic Acids Res. 18:937-947(1990)。血清含有培地を、トランスフェクション後１５時間後に血清なしの培地と置換して、トランスフェクションされた細胞を５〜７日インキュベートした。結果として生じたならし培地を回収し、プロテインＡカラム（１mlファルマシアＨｉＴｒａｐ）に通した。精製したＩｇＧ融合体を、０．１Ｍクエン酸（pH４．２）で１ＭトリスpH９．０を含むカラムの中で溶出した。溶出したタンパク質を続いてＰＢＳに対して透析し、Centri-prep-30フィルター（Amicon）を用いて濃縮した。グリセロールを、最終濃度が２５％となるように添加して、この材料を−２０℃で保管した。材料の濃度を、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡによって測定した。
【０２３３】
細胞培養：ヒト乳癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ７を、Ａmerican Type Culture Collectionから得て、１０％非働化ＦＢＳ、２mMグルタミンおよび１０％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した、F12Hamおよび Dullbecco改変 Eagle培地(DMEM)の５０：５０混合物中に保持した。
【０２３４】
ｃＤＮＡライブラリーの作成および特徴づけ：全ＲＮＡをＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞から、グアニジンイソチオシアナート−セシウムクロリド法（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)）を用いて精製した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、製造元の推奨のとおりにオリゴ（ｄＴ）ダイナビーズ（ＤＹＮＡＬ）を用いて単離した。第１および第２鎖の合成は、Gibco BRLのｃＤＮＡ合成キットを用いて行った。AmershamのｃＤＮＡクローニングシステムを用いた場合には、λｇｔ１０組換えｃＤＮＡを作成した。In vitroでのパッケージングを、GigapackIIパッケージングエキストラクト（Stratagene）を用いて行った。PstI-XhoIのＨＲＧβ３ｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１４４〜６１８）をランダムプライミングによって標識し、１×１０⁶個のプラークをスクリーニングした。陽性クローンを、第２および第３のスクリーニングによって確認および精製した。ファージＤＮＡを、ＢａｍＨＩ断片として単離し、pBluescriptSK^-の、対応する部位にサブクローニングした。クローン５をSequence version 2.0 ＤＮＡシーケンスキット（United States Biochemicals社）を用いて完全にシーケンスした。両鎖ともシーケンスした。
【０２３５】
細菌発現系：クローン５のｃＤＮＡ断片（ヌクレオチド１６９０〜２７２２）をｐＥＴ−３２ＴＲＸ融合ベクター（Novagen）にサブクローニングした。このBglII-BglII断片を、ｐＥＴ３２ａプラスミドのBamHI部位に挿入した。Ｅ．ｃｏｉｌにおけるｔｒｘγ−ＨＲＧ（アミノ酸４５５〜７６８）タンパク質の発現は、製造元の推奨のとおりに誘導した。
【０２３６】
組換えγ−ＨＲＧの精製：ｔｒｘγ−ＨＲＧを発現しているＥ．ｃｏｉｌ細胞を回収し、５０mMのＴｒｉｓＨＣｌ（pH８）に９ml／ｇで懸濁した。リゾチームを、最終濃度が０．２mg／mlになるように添加し、溶液を氷上で１時間攪拌した。ＤnaseＩ（１０μg／μl）およびＭｇＣｌ₂（４mM）を添加した。次に、溶液を３０分間音波処理した後、細胞ペレットを回収した。ペレット画分を、１／１０量の１MＮａ₂ＳＯ₃および１／１０量の０．２MＮａ₂Ｓ₄Ｏ₆を添加して亜硫酸分解した。反応は、室温で１．５時間進行させ、タンパク質を（登録商標）High Load Superdex ７５実験等級カラム（Pharmacia）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーで精製した。リフォールディング再生を、１mMシステインを添加して開始させ、１０mMメチオニンを抗酸化剤として添加し、室温で一晩インキュベートした。タンパク質濃度を、量的アミノ酸解析によって測定した。
【０２３７】
ノーザンおよびサザンハイブリダイゼーション：全ＲＮＡを、Chomczynski et al.（Anal. Biochem. 162: 156-159(1987)）の方法によって単離した。ポリ（Ａ）⁺を、オリゴｄ（Ｔ）セルロースカラム（Qiagen）を製造元の推奨のとおりに用いて単離した。ＲＮＡを、０．８％ホルムアルデヒド／１％アガロースゲルで変性およびサイズ分画し、ナイロンメンブレン（Hybond, Amersham社）上にトランスファーした。ＲＮＡを、ＵＶ固定した（UV Stratalinker、Stratagene社）。プレハイブリダイゼーションを、４２℃で、５０％ホルムアミド／１％ＳＤＳ／１MＮａＣｌ、１０％デキストラン硫酸および１００μg／ml ニシン精子ＤＮＡ中で少なくとも２時間行った。ＨＲＧβ３のＥＧＦ様ドメインに対する相補的配列を有する制限酵素断片、またはγ−ＨＲＧの独自の配列（ヌクレオチド１２３８〜１８６８）をコードしているＫｐｎＩ−ＡｖａIIｃＤＮＡ断片、を用いたｃＤＮＡプローブを、ランダムプライミング（Prime-It II、 Stratagene社）によって放射線標識した。ハイブリダイゼーションを、４２℃の、³²Ｐ標識した断片を含む同じ溶液中で１６時間行った。ブロットを、２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳで、室温で数回洗浄し、同じ溶液で６５℃で２０分間洗浄して、最後に０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで室温で１５分間洗浄した。ブロットを空気乾燥し、増強スクリーンと一緒に（登録商標）Du Pont Reflectionフィルムに−８０℃で７〜４０時間露光した。脾臓、胸腺、前立腺、睾丸、卵巣、小腸、結腸、末梢血白血球、心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓および膵臓のポリ（Ａ）+２μgを含む、ヒト多組織ノーザンブロット（Clontech社）を、放射線標識したγ−ＨＲＧｃＤＮＡプローブ（ヌクレオチド８４１〜１４４７）と、製造元の推奨のとおりにハイブリダイズさせた。
【０２３８】
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ゲノムＤＮＡを、Sambrook et al（上記）に記載されたように単離した。ＤＮＡを、異なる制限酵素で消化し、トランスファー前に０．２５NのＨＣｌで処理して、ナイロンメンブレン（Hybond, Amersham社）上にトランスファーした。γ−ＨＲＧのＢｇｌII−ＮｄｅＩｃＤＮＡ断片も、ランダムプライミングによって放射線標識して、ハイブリダイゼーションプローブとして用いた。プレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／０．７５％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸および１００μg／mlニシン精子ＤＮＡ中で、６８℃で４時間行ない、放射線標識したプローブとのハイブリダーゼーションを一晩行った。０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６８℃の洗浄工程を加えたのを除いて、ノーザンブロットに対するのと同じ洗浄条件を用い、検出は上述したとおりに行った。
【０２３９】
¹²⁵Ｉ−ＨＲＧ結合アッセイ：結合アッセイを、Ｎｕｎｃ分割切断ストリップウェル中で行った。プレートを、４℃で、カルボン酸バッファー（pH９．６）中のヒツジ抗ヒト抗体（Boehringer mannheim）５μg／ml１００μlでコートした。プレートを、洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ１００μlで３０分間ブロックした。バッファーを除去し、それぞれのウエルを、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中のＩｇＧ融合タンパク質１５ngで、激しく振とうしながら１．５時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、拮抗的結合を、激しい振とう下において種々の量のγ−ＨＲＧおよび¹²⁵Ｉ−ＨＲＧβ１を加えることにより行った。１．５〜２時間インキュベーションした後、ウェルを洗浄バッファーで３回洗浄し、排液して、個々のウェルを１００シリーズIso Data γ−カウンターで計数した。
【０２４０】
チロシンリン酸化アッセイ：ＭＣＦ７細胞を、２４ウェルプレートに１×１０⁵個／ウェルで、ＦＢＳ１０％を含むＦ１２／ＤＭＥＭ中で培養した。４８時間後、細胞を、無血清のＦ１２／ＤＭＥＭで洗浄し、６時間血清飢餓状態にした。種々の濃度の、細菌に発現させた切断されたγ−ＨＲＧ（すなわち、ｔｒｘγ−ＨＲＧ０pM、２２pM、６６pM、２００pMおよび６００pM）またはＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の未精製調製培地を、結合バッファー（Ｆ１２／ＤＭＥＭ中にＢＳＡ０．１％）中に調製して、それぞれのウエルに添加した。室温で８分間のインキュベーションの後、培地を注意深く吸引し、反応を、１００μlのサンプルバッファー（ＳＤＳ５％、２−メルカプトエタノール０．２５％、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌpH６．８２５mM）を添加して中止した。それぞれのサンプルの２０μlを、４〜１２％のグラジエントゲル（Novex）中で分画し、ニトロセルロースメンブレン上に電気泳動的にトランスファーした。抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、ＵＢＩ社、１μg／mlで使用）免疫ブロットを現像し、分子量１８０kDaまでの顕著な反応性バンドを、反射型濃度計で計量した。
【０２４１】
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の調製培地の生産および特徴づけ
細胞を、Ｔ１７５フラスコ中に播種し、集密度が７０〜８０％に達するまで（２．５×１０⁷個／フラスコまで）培養した。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、無血清のＦ１２／ＤＭＥＭ倍地中で３〜４日培養した。その後、培地を回収し、ＹＭ１０Ｄｉａｆｌｏ限外ろ過膜（Amicon）と一緒に限外ろ過細胞を用いてろ過および濃縮した。γ−ＨＲＧを、非還元条件下でのウエスタンブロット解析により、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞の調製培地中に可視化した。γ−ＨＲＧを、Ｃ４逆相カラムを用いて部分的に精製した。全長ＨＲＧβ１を発現するＣＨＯ（レーン１）および準純粋γ−ＨＲＧを発現するＣＨＯ（レーン２）を電気泳動し、ブロットにＨＥＲ２／ＨＥＲ４ＩｇＧヘテロダイマーをプローブとして結合させウエスタンブロットを現像した。部分的に精製した上清を含むレーンでは６４kDaまでのバンドが見られ、それに対し、全長ＨＲＧβ１を発現したＣＨＯでは４５kDaタンパク質として移動した。
【０２４２】
クリスタルバイオレットでの細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞系統を、９６ウエルプレートに、以下の密度：ＭＤＡ−ＭＢ−１７５については２×１０⁴個／ウエルおよびＳＫ−ＢＲ−３については１×１０⁴個／ウェルで培養した。培地は、ＦＢＳ１％を含有し、細胞を、２時間付着させた。モノクローナル抗体、免疫接着剤（１０μg／ml）または培地のみ、を添加し、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。免疫接着を中和するため、γＨＲＧβ１_177-244を最終濃度１nMまたは１００nMで添加し、細胞を４日間インキュベートした。単層をＰＢＳで洗浄し、０．５％クリスタルバイオレットで染色／固定した。プレートを風乾し、染料を、エタノール中の０．１Mクエン酸ナトリウム（pH４．２）（５０：５０）に溶出し、吸光度を５４０nmで測定した。
【０２４３】
γ−ＨＲＧの単離およびシークエンス
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞中でのヘレグリン転写を特徴づけるため、この細胞系統由来のｍＲＮＡで、λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリを構築した。ライブラリを、ＥＧＦ様ドメインおよびＨＲＧβ３のＮ末端配列に相当するｃＤＮＡプローブでスクリーニングした。種々のクローンを同定した。全長ｃＤＮＡを含むことが明らかとなったクローンの１つを単離してシークエンスした。図７Ａ〜７Ｄは、γ−ＨＲＧのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。２３０３bpの単一オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド３３４位のＡＴＧコドンで始まる。この開始コドンは、潜在的転写開始部位として知られる１つのヌクレオチド配列上にある（Kozak, Nucleic Acid Research 15:8125-8148(1987)）。数個の終止コドンを、開始コドンの上流に発見した。ヌクレオチド２６３７の終止コドンＴＡＧは、３′非コード配列の後ろにあり、これは他のＨＲＧアイソフォーム配列と同じであり、Ａ−リッチ領域の後ろにあるポリアデニル化シグナルを含んでいる。オープンリーディングフレームは、計算分子量８４．２kDaの、７６８アミノ酸残基のタンパク質をコードしている。
【０２４４】
（ｄ）最小ＥＧＦ様ドメイン（ＨＲＧ−β１１７７−２２８）に相当する残基を含むＨＲＧ−β１変異体の選択を、１価ファージディスプレイを用いて行った。これらの変異体については、残基番号も、最小ＥＧＦ様ドメインにおける残基位置に基づいて、括弧内に示した（すなわち、ＨＲＧ−β１ＥＧＦ１−５２）。
【０２４５】
ＨＲＧ−β１ＥＧＦの変異体を調製し、Bass et alの方法（Proteins 8:309-314(1990)）により、１価ファージディスプレイを用いて、ＨＥＲ−３−Ｉｇへの結合のために選択した。以下で詳細を述べるとおり、ＨＲＧ−β１ＥＧＦファージミドベクターを調製した（ここで、ＨＲＧ−β１ＥＧＦは、Ｍ１３コートタンパクｐIIIのＣ末端断片に融合した）。終止コドンを、このベクターの任意に選択した部位に導入するため、Kunkel突然変異誘発を施した。この工程は、出発ベクターが野生型ポリペプチドを発現することができないことを確実にするものである。ライブラリーごとの４から６残基の延長は、直鎖形式で、６個のシステイン、すなわちPhe１８９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦＰｈｅ１３）および２個の最もＣ末端の残基を除いて、任意抽出した。Ｐｈｅ１８９は、変更しなかった、なぜならこの残基がＥＧＦおよびＴＧＦ−αにおいて芳香ファミリー残基として保存され、Ｔｙｒ２０８（ＨＲＧ−β１ＥＧＦＴｙｒ３２）と共に積み重ね相互作用を形成していたからである（Jacobsen et al., Biochemistry 35:3402-17(1996)。こうして、ＨＲＧ−β１ＥＧＦを、Ａ〜Ｅ、Ｇ、ＨおよびＩの８つのライブラリに変えた。
【０２４６】
ＨＲＧ−β１２０２〜２０９（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２６〜３３）を変換したライブラリーＥは、３残基の欠損を含んでいた。ＨＲＧ−β１ＥＧＦの第２と第３のβ−シートの間の異常ターンに相当する欠損した領域、および同等のアミノ酸はＥＧＦおよびＴＧＦ−αには存在しない。ＨＲＧ８のＨＲＧ−β１２０２〜２０４（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２６〜２８）が欠失したＨＲＧ−β１コントロール変異体（ＨＲＧ６３）は、野生型のそれと同様の親和性でＨＥＲ−３−Ｉｇに結合した。
【０２４７】
追加のライブラリ（Ｆ）を、ＨＲＧ−β１１７８、１８０、１９８および２００（ＨＲＧ−β１ＥＧＦ２、４、２２、および２４）を含む第１および第２のβ−シートからの側鎖を含む表面パッチを任意に抽出するように作製した。
【０２４８】
出発ベクター中の選択された部位は、ＨＲＧ−β１ＥＧＦライブラリを作製するためのKunkel突然変異誘発によって任意抽出した。突然変異したＨＲＧ−β１ＥＧＦを提示するファージは、厳格に、それぞれのファージ粒子が１コピー以上の突然変異したＨＲＧ−β１ＥＧＦを提示しているという、条件のライブラリから作成した（Bass et al., 上記、を参照）。これらのファージを、ＥＬＩＳＡプレート上に固定したＨＥＲ−３−Ｉｇに対する結合（選り分け）について選択した。結合したファージを、溶出し、挿入の別の回のための新しいファージを津作成するために用いた宿主細胞を再感染するために用いた。次に、それぞれのライブラリから選択されたファージからの１２種のクローンをシークエンスした。
【０２４９】
【表２】

【０２５０】
【表３】

【０２５１】
【表４】

【０２５２】
【表５】

【０２５３】
【表６】

【０２５４】
【表７】

【０２５５】
実施例２胚性ラット肺におけるＨＥＲ２／ＨＥＲ３の発現
ラット肺を、発生学的日（Ｅ）１６、１８、２０のラット胚および出生前日（Ｐ）７、１４日および成体から小さく切片化した。単離した肺組織を標準プロテアーゼ阻害バッファー中でホモジナイズし、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）に付し、ニトロセルロースにブロットして特異的抗体（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４−Santa Cruz Biological社、San Jose, CA. およびＨＲＧ、３Ｇ１１、Genentech社）で化学発光技術を用いて同定した。
【０２５６】
ブロットの解析は、ＨＥＲ２が、子宮内の発生を通して高レベルで発現しており、Ｅ１８にピークになり、出生後により低い成体レベルまで減少することを示した。ＨＥＲ３の発現は、Ｅ１８にピークになり、出生後により低い成体レベルまで減少した。ＨＥＲ４は、肺の発生の間のどの時点でも同定されなかった。ＨＲＧのプロフォームは、おそらくＥ１６に現れ（７５kDaのタンパク質）、Ｅ１８にピークになり、その後、成体では低いレベルに減少するのであろう。これらのデータは、ＨＥＲ／ＨＲＧ系は、肺の発生の間に発生学的に調節され、活性レセプターーは、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロダイマーであることを示唆している。レセプターーが発現のピークとなる期間（Ｅ１８）は、ラット肺発生の小管期（１９〜２０日）と隣り合う、偽腺期（１３〜１８日）を表している。偽腺期の間、肺上皮細胞の増殖は、他のどの時期よりも多い。小管期の間に、分化は、タイプＩの肺胞上皮細胞およびタイプII（界面活性物質産生）肺胞上皮細胞の出現と共に始まる。このことは、どちらかの又は両方の過程における、ＨＲＧ／ＨＥＲ相互作用に対する１つの役割を示している。
【０２５７】
実施例３ヒト胎児肺におけるＨＥＲ２／ＨＥＲ３の発生
ヒト胎児肺を中３ヶ月（１７〜２２週）から得た。肺組織を、無血清の Weymouth培地の空気液体界面で３７℃で加湿した５％ＣＯ₂雰囲気中で培養した。組織を０日（組織を入れた日）および培養開始後１〜４日（Ｄ）（Ｄ１〜Ｄ４）に回収し、標準プロテアーゼ阻害バッファー中でホモジナイズし、等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）に付し、ニトロセルロースにブロットして特異的抗体で同定した。
【０２５８】
ＨＥＲ２は、Ｄ０に発現し、in vitro培養の間に発現レベルにおいて増加した。ＨＥＲ３は、Ｄ０では検出できないレベルの低さで現れ、in vitro培養の間に発現レベルにおいて増加した。ＨＥＲ４は、肺発生のいずれの時期にも同定されなかった。ＨＲＧは、Ｄ０では同定されず、しかしながら、Ｄ１〜Ｄ２に７５，０００Daのタンパク質として同定され、培養期間をとおして発現量が増加し続けた。このヒト生体外培養モデルは、通常の肺発生プログラムの部分を、培養の５日以上反復した。発生は、気腔の形成に伴う上皮細胞増殖、および分化の生起の両方と共に急速に起こる。これらのデータは、ＨＥＲ／ＨＲＧ系も、in vitroヒト肺発生の間に調節されることを示している。第３期は、ヒト肺発生における後期偽分泌期（４２〜１１２日）および小管期を表す。ラットでのように、偽分泌段階の間に、上皮細胞増殖および将来の気道の形成が起こる。小管段階の間に上皮の分化が起こる。
【０２５９】
実施例４ヒト肺におけるＨＥＲ２およびＨＥＲ３の発現
ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、肺発生の間、肺上皮において排他的に発現する。中三期ヒト肺を、上記概説のように培養した。組織を毎日回収し、すばやく凍結し、５ミクロンの切片に切断した。切片を、スライドガラス上に設置し、標準ＡＢＣ法を用いて免疫組織化学的に解析した。ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４を、上述した特異的抗体を用いて同定した。
【０２６０】
コントロールとして、肺組織を、Ｄ０およびＤ５において関連性のない抗体で染色し、非染色を検出した。Ｄ０において、肺は相対的に形成されていなかった。組織の大半は間葉細胞であった。初期空腔が発生していた。Ｄ５には、間葉組織が薄くなり、空腔を大きくするために必要とされる肺上皮の増殖と共に、空間が明瞭に識別可能であった。
【０２６１】
Ｄ０およびＤ５に染色したＨＥＲ２を用いて、ＨＥＲ２が、Ｄ０肺組織上に、肺上皮組織の至るところに一様に現れるということを確立した。間葉細胞においては発現がみられなかった。Ｄ５までに、ＨＥＲ２はまだ均一であり、肺上皮に制限されていた。
【０２６２】
Ｄ０およびＤ５でのＨＥＲ３染色コントロールを用いたことで、ＨＥＲ３は、Ｄ０肺組織中で識別可能であった。染色は、ＨＥＲ２に比較して少なく、均一ではなく、ＨＥＲ３レセプターーを発現している特異的な上皮領域があることを示唆した。Ｄ５までに、発現は、肺上皮をとおしてより均一にはなったが、あきらかに均一ではなかった。発現は、なおも上皮に特異的であった。
【０２６３】
実施例５ｒＨＲＧβ１_177-244の調製
ＥＧＦ様ドメイン断片ＨＲＧ-β1 177-244を、ベクターｐＨＬ８９（Holmes et al., Science 256: 1205-1210(1992) に記載）から、突出末端を含むＮｓｉＩ／ＸｂａＩを有するプライマーで、ＰＣＲによって増幅した。断片を、ファージミド提示ベクターｐａｍ−ｇ３に、ｐＨＲＧ２−ｇ３（１７７−２２４）構築物を作製するのと同じ部位の制限切断−結合により、挿入した。ｐａｍ−ｇ３は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のファージ提示のために設計され、Lowman et al., Biochemistry 30: 10832-10838(1991) に記載された、ｐｈＧＨａｍ−ｇ３の誘導体である。ｐａｍ−ｇ３は、ｐｈＧＨａｍ−ｇ３に存在するｈＧＨ遺伝子を除去し、クローニングに用いる制限部位で切断する空間を提供する、詰め込み断片と置換することにより産生する。ＨＲＧ−β１断片をｐIIIの残基２４７位に接着した。
【０２６４】
上述の構築物から発現したＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメインは、構築物の名前に現れている「ｐ」および「−ｇ３」を除去することにより称する。すなわち、ｐＨＲＧ２−ｇ３構築物から発現したＨＲＧ−β１ＥＧＦ様ドメインを、「ＨＲＧ２」と称する。
【０２６５】
ドメインは、Bass et al., Proteins 8:309-314(1990)に記載されたように、ｐIII融合タンパクとして、１価でファージ上に提示される。
【０２６６】
同様に、変異体ＨＲＧ−β１_147-227、ＨＲＧ−β１_147-244、およびＨＲＧ−β１_177-227を調製し、上述のように発現させた。
【０２６７】
実施例６ｒＨＲＧβ１_177-244は促進された肺発生を引き起こす
外因性のｒＨＲＧβ１_177-244は、in vitroで促進された肺発生を引き起こす。発現したＨＥＲ２／ＨＥＲ３レセプターーが機能しているか、およびin vitroでの肺発生の間のＨＲＧ刺激の役割を調べるため、ｒＨＲＧβ１_177-244をin vitro培養に１０nMで添加した。組織をＤ５で回収し、すばやく凍結して、解析のために５ミクロンの切片に切断した。
【０２６８】
その形態は、未処理の標本と比べて、大いに異なっていた。上皮が、顕著に増殖していた。通常は単層細胞で覆われている空腔が、今や２〜３の細胞の厚みを持っていた。その変化は、より高い濃度へのより大きな上皮細胞反応に依存する量である。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３は、なおも上皮細胞だけにおいて識別可能だった。
【０２６９】
実施例７ヒト肺分化
ヒト肺上皮細胞の分化は、ＨＲＧ処理の後に起こる。分化は、界面活性タンパク質Ａ（ＳＰＡ）産生によって測定した。すべての切片を、ＳＰＡについて染色した。ＳＰＡについて染料で染色したヒト肺外植片は、前肺胞管の上皮細胞中に集中していた。１０nMＨＲＧに暴露したヒト肺外植片は、ＳＰＡ産生の効果を示した。分化コントロールとして、ある外植片を１mMジブチリルｃＡＭＰにさらした。ネガティブコントロールもまた施した。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンに含まれる、ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）について推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を示す。ＨＲＧ−αの開始メチオニン（Ｍｅｔ）は、第４５位にある。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンに含まれる、ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）について推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を示す。ＨＲＧ−αの開始メチオニン（Ｍｅｔ）は、第４５位にある。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンに含まれる、ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）について推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を示す。ＨＲＧ−αの開始メチオニン（Ｍｅｔ）は、第４５位にある。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンに含まれる、ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）について推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）を示す。ＨＲＧ−αの開始メチオニン（Ｍｅｔ）は、第４５位にある。
【図２Ａ】図２Ａは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンの可能なコーディング配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を示す。開始ＭｅｔはＭ３１である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンの可能なコーディング配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を示す。開始ＭｅｔはＭ３１である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンの可能なコーディング配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を示す。開始ＭｅｔはＭ３１である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンの可能なコーディング配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を示す。開始ＭｅｔはＭ３１である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＨＲＧ−β１について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンの可能なコーディング配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：３）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）を示す。開始ＭｅｔはＭ３１である。
【図３Ａ】ＨＲＧ−β２について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。
【図３Ｂ】ＨＲＧ−β２について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。
【図３Ｃ】ＨＲＧ−β２について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。
【図３Ｄ】ＨＲＧ−β２について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。
【図３Ｅ】ＨＲＧ−β２について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を示す。
【図４Ａ】ＨＲＧ−β３について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）を示す。
【図４Ｂ】ＨＲＧ−β３について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）を示す。
【図４Ｃ】ＨＲＧ−β３について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）を示す。
【図５Ａ】ＨＲＧ−β２様タンパク質について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）を示す。
【図５Ｂ】ＨＲＧ−β２様タンパク質について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）を示す。
【図５Ｃ】ＨＲＧ−β２様タンパク質について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）を示す。
【図５Ｄ】ＨＲＧ−β２様タンパク質について米国特許第５，３６７，０６０号明細書により得られたクローンのヌクレオチド配列の、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：９）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）を示す。
【図６Ａ】降順でのいくつかの公知ヘレグリンα、β１、β２、β２様及びβ３のアミノ酸相同性の比較を示し、そしてこれらの形態のＨＲＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、９及び７）を特徴付ける、アミノ酸の挿入、欠失及び置換を示す。
【図６Ｂ】降順でのいくつかの公知ヘレグリンα、β１、β２、β２様及びβ３のアミノ酸相同性の比較を示し、そしてこれらの形態のＨＲＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、９及び７）を特徴付ける、アミノ酸の挿入、欠失及び置換を示す。
【図６Ｃ】降順でのいくつかの公知ヘレグリンα、β１、β２、β２様及びβ３のアミノ酸相同性の比較を示し、そしてこれらの形態のＨＲＧ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３、５、９及び７）を特徴付ける、アミノ酸の挿入、欠失及び置換を示す。
【図７Ａ】米国特許願第０８／８９１，８４５号明細書に記載のとおり得られたγ−ＨＲＧの、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を示す。疎水性領域には、下線を施す。ＥＧＦ様ドメインは、影を付け、ＥＧＦ様ドメイン内のシステイン残基を、丸で囲む。Ｎ結合糖鎖形成部位は、核酸配列の上に（）でマークした。
【図７Ｂ】米国特許願第０８／８９１，８４５号明細書に記載のとおり得られたγ−ＨＲＧの、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を示す。疎水性領域には、下線を施す。ＥＧＦ様ドメインは、影を付け、ＥＧＦ様ドメイン内のシステイン残基を、丸で囲む。Ｎ結合糖鎖形成部位は、核酸配列の上に（）でマークした。
【図７Ｃ】米国特許願第０８／８９１，８４５号明細書に記載のとおり得られたγ−ＨＲＧの、推測されたアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）、及びｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１２）を示す。疎水性領域には、下線を施す。ＥＧＦ様ドメインは、影を付け、ＥＧＦ様ドメイン内のシステイン残基を、丸で囲む。Ｎ結合糖鎖形成部位は、核酸配列の上に（）でマークした。
【図８Ａ】米国特許願第０８／３３９，５１７号明細書に記載のとおり得られたＳＭＤＦのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、及びアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）を示す。ＥＧＦ様ドメイン、並びに非極性及び非荷電ドメイン（すなわち「非極性Ｉ」は、約４８〜６２位の残基からなり「非極性II」は、約７６〜１００位の残基からなる）に、下線を施す。ＥＧＦ様ドメイン内、及びユニークＮ末端ドメインの「システインノット」（「ＮＴＤ−ｃｙｓノット」）内のシステインを、四角で囲む。停止コドンを、文字「Ｏ」で示す。
【図８Ｂ】米国特許願第０８／３３９，５１７号明細書に記載のとおり得られたＳＭＤＦのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）、及びアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）を示す。ＥＧＦ様ドメイン、並びに非極性及び非荷電ドメイン（すなわち「非極性Ｉ」は、約４８〜６２位の残基からなり「非極性II」は、約７６〜１００位の残基からなる）に、下線を施す。ＥＧＦ様ドメイン内、及びユニークＮ末端ドメインの「システインノット」（「ＮＴＤ−ｃｙｓノット」）内のシステインを、四角で囲む。停止コドンを、文字「Ｏ」で示す。
【配列表】