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JP4475561B2 - Ｃ型肝炎ウイルスワクチン - Google Patents

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Description
本明細書中で引用した文献は本発明に対する従来技術とは認められない。
世界の人口の約３％がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している（Ｗａｓｌｅｙら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２０：１−１６（２０００））。ＨＣＶに曝されると、まれに顕性急性疾患にかかるが、多くの場合ウイルスは肝炎症を引き起こす慢性感染となり、ゆっくりと肝不全や肝硬変に進行する（Ｉｗａｒｓｏｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１４：２０１−２０４（１９９４））。更に、疫学的調査から、ＨＣＶが肝細胞癌の発病において重要な役割をなしていることがわかった（Ｋｅｗ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１４：２１１−２２０（１９９４）；Ａｌｔｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，８５：１６８１−１６９５（１９９５））。
１９９２年にＨＣＶの血液スクリーニングがルーチンに実施されるまで、多くの患者は汚染されている血液、血液製剤または移植臓器にうっかり曝されたことにより感染していた。ＨＣＶの血液スクリーニングが実施されている地域では、ＨＣＶは主に感染血液に直接経皮的に暴露して、すなわち静脈薬の使用により感染している。まれな伝播方法には、周生期暴露、血液透析及びＨＣＶ感染者との性的接触が含まれる（Ａｌｔｅｒら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４１（８）：５５６−５６２（１９９９）；Ａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．，３１（補遺）：８８−９１（１９９９）；Ｓｅｍｉｎ，Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２０１：１−１６（２０００））。
ＨＣＶゲノムは、約３０００アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする一本鎖ＲＮＡ約９．５ｋｂから構成されている（Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：３６２−３６４（１９８９）；Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：３５９−３６２（１９８９）；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６５：１１０５−１１１３（１９９１））。ＨＣＶポリタンパク質は、Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの順でウイルスタンパク質を含む。
各ウイルスタンパク質は、ＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解により産生される。宿主細胞プロテアーゼは推定構造タンパク質Ｃ、Ｅ１、Ｅ２及びｐ７を放出し、アミノ酸８１０でＮＳ２のＮ末端を形成する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：２７３１−２７３４（１９９４）；Ｈｉｊｉｋａｔａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９０：１０７７３−１０７７７（１９９３））。
非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂは多分ウイルス複製機構を形成し、ポリタンパク質から放出される。ＮＳ２及びＮＳ３のＮ末端に関連する亜鉛依存性プロテアーゼはＮＳ２とＮＳ３の間の開裂に関与する（Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：１３８５−１３９５（１９９３）；Ｈｉｊｉｋａｔａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，９０：１０７７３−１０７７７（１９９３））。ＮＳ３のＮ末端ドメイン中に位置する別のセリンプロテアーゼはＮＳ３／ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ａ／ＮＳ４Ｂ、ＮＳ４Ｂ／ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ接合部でのタンパク質分解開裂に関与している（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：３８３５−３８４４（１９９３）；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０５８３−１０５８７（１９９３）；Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４０１７−４０２６（１９９３））。ＮＳ４ＡはＮＳ３活性に対するコファクターを与える（Ｆａｉｌｌａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：３７５３−３７６０（１９９４）；ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏらの米国特許第５，７３９，００２号明細書）。
ＮＳ５Ａはインターフェロン耐性を与える高リン酸化タンパク質である（ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏら，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２０（１）：６９−８３（２０００）；Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ，Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．，補遺１：４７−４８（１９９９））。
ＮＳ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを与える（ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏらの国際特許出願公開第９６／３７６１９号パンフレット；Ｂｅｈｒｅｎｓら，ＥＭＢＯ，１５：１２−２２（１９９６）；Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２４９：１０８−１１８（１９９８））。
本発明は、Ａｄ６ベクター、及び不活性ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ領域を含むＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする核酸に関する。前記核酸は、ＨＣＶに対するＨＣＶ特異的細胞性免疫（ＣＭＩ）応答を生じさせるために広範囲の抗原を与えるアデノベクターまたはＤＮＡプラスミドワクチンの成分として特に有用である。
ＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答は、ＨＣＶ抗原を認識する細胞毒性Ｔリンパ球及びＴヘルパー細胞の産生を指す。ＣＭＩ応答には非−ＨＣＶ特異的免疫効果も含まれ得る。
好ましい核酸は、配列番号１に実質的に類似し、配列番号１中に存在するＮＳ５Ｂ領域に実質的に類似する少なくとも１つのポリペプチドを産生するように自己プロセシングするのに十分なプロテアーゼ活性を有するＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。ＮＳ５Ｂに対応する産生されたポリペプチドは酵素的に不活性である。より好ましくは、ＨＣＶポリペプチドは配列番号１中に存在するＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ領域に実質的に類似するポリペプチドを産生するのに十分なプロテアーゼ活性を有する。
「実質的に類似の配列」とは、参照配列に対する同一性が少なくとも約６５％であることを示す。よって、例えば、配列番号１に実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドは配列番号１に対して少なくとも約６５％の全アミノ酸同一性を有する。
ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂに対応するポリペプチドは、配列番号１中の対応領域に対して少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性を有する。前記対応領域は、本明細書中ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂポリペプチドとも称される。
従って、本発明の第１態様は、配列番号１に実質的に類似のＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。コードされるポリペプチドは、酵素的に不活性なＮＳ５Ｂポリペプチドを産生するように自己プロセツシングするのに十分なプロテアーゼ活性を有する。
好ましい実施態様において、前記核酸は、所望ヒト細胞においてＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現し得る発現ベクターである。ヒト細胞内での発現は、ＨＣＶ感染を積極的に治療したり、ＨＣＶ感染に対して予防的に治療する治療用途を有する。
発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に適正な転写及びプロセシングのために調節要素を含む。任意に存在する調節要素には、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に元々関連している調節要素及び前記ヌクレオチド配列に元々関連していない外因性調節要素が含まれる。外因性プロモーターのような外因性調節要素はヒト細胞のような特定宿主における発現のために有用であり得る。機能的発現のために有用な調節要素の例には、プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位及びポリアデニル化シグナルが含まれる。
本発明の別の態様は、ヒト細胞において配列番号１に実質的に類似のＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現し得る遺伝子発現カセットを含む核酸に関する。前記ポリペプチドは、酵素的に不活性なＮＳ５Ｂタンパク質を産生するように自己プロセツシングし得る。前記遺伝子発現カセットは、少なくとも
ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的にカップリングしているプロモーター、
ｂ）前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている５’リボソーム結合部位、
ｃ）前記ヌクレオチド配列の３’末端に連結しているターミネーター、及び
ｄ）前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている３’ポリアデニル化シグナル
を含む。
「転写的にカップリング」とは、ヌクレオチド配列がプロモーターで結合しているＲＮＡポリメラーゼにより転写され得るようにプロモーターが位置づけられていることを指す。転写的カップリングでは、転写される配列がプロモーターに隣接している必要がない。
「機能的カップリング」とは、ヌクレオチド配列への効果を媒介し得る能力を指す。機能的カップリングでは、カップリングされる配列が相互に隣接している必要はない。ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている３’ポリアデニル化シグナルにより、転写ＲＮＡの開裂及びポリアデニル化が促進される。ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている５’リボソーム結合部位により、リボソーム結合が促進される。
好ましい実施態様では、核酸はＨＣＶを治療する治療用途に適したまたは治療用ベクターの作成における中間体として適したＤＮＡプラスミドベクターまたはアデノベクターである。ＨＣＶの治療には、ＨＣＶ感染の積極的治療及びＨＣＶ感染に対する予防的治療が含まれる。
本発明の別の態様は、（ａ）相同的組換え及び（ｂ）アデノベクターレスキューを含む方法により産生される、配列番号１に実質的に類似のポリペプチドを発現し得るＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットを含むアデノベクターである。相同組換え段階により、アデノウイルスゲノムプラスミドが生ずる。アデノベクターレスキュー段階により、アデノゲノムプラスミドからアデノベクターが生ずる。
本明細書に記載のアデノウイルスゲノムプラスミドは、Ｅ１領域及び場合によりＥ３領域が欠失されており、前記欠失領域の１つに遺伝子発現カセットが挿入されている組換えアデノウイルスゲノムを含む。組換えアデノウイルスゲノムは１つ以上のアデノウイルス血清タイプに実質的に類似の領域から構成されている。
本発明の別の態様は、配列番号４の核酸配列またはその誘導体からなるアデノベクターに関し、前記誘導体では配列番号４中に存在するＨＣＶポリタンパク質コード化配列が配列番号３、配列番号１０または配列番号１１のいずれかのＨＣＶポリタンパク質コード化配列で置換されている。
本発明の別の態様は、配列番号１に実質的に類似のＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含む培養組換え細胞に関する。前記組換え細胞は、ベクター構築方法において前記ポリペプチドをコードする核酸を複製するために使用されるような各種用途を有する。
本発明の別の態様は、配列番号１に実質的に類似のポリペプチドを発現し得るＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットを含むアデノベクターの作成方法に関する。前記方法は、（ａ）Ｅ１領域及びＥ３領域が欠失されており、前記欠失領域の１つに遺伝子発現カセットが挿入されている組換えアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスゲノムプラスミドを作成する段階、及び（ｂ）前記アデノウイルスゲノムプラスミドからアデノベクターをレスキューする段階を含む。
本発明の別の態様は、配列番号１に実質的に類似のＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現させるためのベクター及び医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。前記ベクターは患者における投与及びポリペプチド発現に適している。
「患者」は、ＨＣＶに感染し得る哺乳動物を指す。患者はＨＣＶに感染していてもいなくてもよい。患者の例はヒト及びチンパンジーである。
本発明の別の態様は、配列番号１に実質的に類似のＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現するベクターを有効量患者に投与することを含む患者の治療方法に関する。前記ベクターは患者における投与及びポリペプチド発現に適している。
治療を受ける患者はＨＣＶに感染していてもいなくてもよい。ＨＣＶ感染されている患者の場合、有効量はＨＣＶの複製能力の低下、ＨＣＶ負荷の低減、ウイルスクリアランスの上昇及び１つ以上のＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答の上昇という効果の１つ以上を達成するのに十分な量である。ＨＣＶに感染していない患者の場合、有効量はＨＣＶ感染に対するＨＣＶ特異的ＣＭＩ応答の１つ以上の成分を産生する能力の上昇、ＨＣＶ感染への感受性の低下及び感染ウイルスが慢性疾患に対する持続感染を樹立する能力の低下という効果の１つ以上を達成するのに十分な量である。
本発明の別の態様は、Ａｄ６領域及びＡｄ６中に存在しない領域を含む組換え核酸に関する。「組換え」核酸とは、元々相互に関連しない２つ以上の核酸領域が存在することを意味する。Ａｄ６組換え核酸はＡｄ６領域及びＡｄ６に非相同のポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを含むことが好ましい。
本発明の他の特徴及び作用効果は、本明細書に記載されている複数の実施例を含めた追加記載から明らかである。ここに提示した実施例は本発明を実施するのに有用な成分及び方法を例示している。これらの実施例は本発明を限定しない。本明細書の記載に基づいて、当業者は本発明を実施するのに有用な他の成分及び方法を同定、使用することができる。
本発明は、Ａｄ６ベクター、及び不活性ＮＳ５Ｂ領域を含むＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする核酸に関する。不活性ＮＳ５Ｂ領域を設けると、活性ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼによる副作用の可能性を低下させながらＮＳ５Ｂ抗原が供給される。本発明の核酸の使用には、ＨＣＶに対するＣＭＩ応答を生じさせるべく広範囲の抗原を与えるＨＣＶポリペプチドを細胞に導入するためのワクチン成分として及び前記ワクチン成分を作成するための中間体としての使用が含まれる。
適応細胞免疫応答は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ発現が偏在分布しているために身体中のＨＣＶ感染細胞中でウイルス抗原を認識するように、免疫記憶を誘導するように、及び免疫記憶を維持するように機能し得る。これらの機能は抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔヘルパー（Ｔｈ）及びＣＤ８＋ 細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に起因する。
特異的Ｔ細胞受容体を介して活性化すると、ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞は各種の免疫調節機能を実行し、その機能の多くはＴｈ１及びＴｈ２サイトカインにより媒介されている。ＨＣＶ特異的Ｔｈ細胞はＢ細胞の活性化及び分化、ウイルス特異的細胞毒性Ｔ細胞の誘導及び刺激を助ける。ＣＴＬと一緒になって、Ｔｈ細胞は数種のウイルスの複製及び遺伝子発現を抑制するＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−αも分泌し得る。更に、主要エフェクター細胞であるＴｈ細胞及びＣＴＬはウイルス感染細胞のアポトーシス及び溶解を誘導し得る。
ＨＣＶ特異的ＣＴＬは抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）によりプロセシングされる抗原から生ずる。抗原はｐＡＰＣ内で合成されたり、ｐＡＰＣに導入されることもある。ｐＡＰＣ内での抗原合成は抗原をコードする発現カセットを細胞に導入することにより生起され得る。
核酸ワクチンの好ましい投与ルートは筋肉内ルートである。筋肉内投与すると、核酸は体細胞及びｐＡＰＣへ導入、発現されるであろう。体細胞で産生されたＨＣＶ抗原はＭＨＣクラスＩ分子の関係での提示のためにｐＡＰＣに移動し得る（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６１７−６４８（１９９７））。
ｐＡＰＣはより長い抗原をプロテアソーム複合体の形態のより小さいペプチド抗原にプロセシングする。前記抗原は、ＭＨＣクラスＩタンパク質と結合するために小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に転座する。ＣＤ８＋ Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ８細胞表面タンパク質を介してクラス１ ＭＨＣに結合した抗原を認識する。
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする核酸をワクチン成分として使用すると、単一ベクターからＣＭＩ応答を発生し得る広範囲の抗原を産生できる。前記ポリペプチドは少なくともＮＳ５Ｂに対応する領域を生ずるように十分に自己プロセシングし得なければならない。好ましい核酸は、配列番号１中に存在するＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ領域に実質的に類似している各ＨＣＶポリペプチドを産生するように自己プロセシングするのに十分なプロテアーゼ活性を有し、配列番号１に実質的に類似のアミノ酸配列をコードする。
細胞中で自己プロセシングするのに十分なプロテアーゼ活性を有する配列番号１に実質的に類似のポリペプチドは、細胞に幾種のＨＣＶ株中に存在するＴ細胞エピトープを与える。プロテアーゼ活性はＮＳ３及びＮＳ３／ＮＳ４Ａタンパク質により与えられ、適当な開裂部位でＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを消化すると、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂに対応するポリペプチドを放出する。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂの自己プロセシングにより、天然に存在するＨＣＶポリペプチドに似ているポリペプチドが生ずる。
本明細書に記載されているガイダンスに基づいて、患者において有利な効果を達成するのに十分に強い免疫応答を生じ得る。ここに記載されているガイダンスには、ＨＣＶ配列選択、ベクター選択、ベクター作成、併用療法及び投与に関する情報が含まれている。
Ｉ． ＨＣＶ配列
多種多様の核酸配列が細胞にＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを供給するためのワクチン成分として、またはワクチン成分を作成するための中間体として使用され得る。適当な核酸配列を得るための出発点としては、不活性ＮＳ５Ｂを産生するように修飾された天然ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチド配列が好ましい。
ＣＭＩ応答を生ずるようにＨＣＶ非構造抗原を与えるＨＣＶ核酸配列の使用は、Ｃｈｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：１１３６−１１４４（１９９９）；Ｐａｌｉａｒｄらの国際特許出願公開第０１／３０８１２号パンフレット（本発明に対する従来技術とは認められない）及びＣｏｉｔらの国際特許出願公開第０１／３８３６０号パンフレット（本発明に対する従来技術とは認められない）に記載されている。前記文献は、例えば不活性ＮＳ５Ｂを産生するように自己プロセシングするポリペプチドもＨＣＶ配列とデリバリーベヒクルの特定組合せも全く記載していない。
ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチド配列への修飾は、コード化核酸を改変することによりなされ得る。欠失、挿入及び置換が生ずるように改変を実施し得る。
小さな修飾はＮＳ５Ｂ中で本質的に複製のためにモチーフを標的することにより不活性ポリメラーゼを生ずるようになされ得る。ＮＳ５Ｂ活性にとって重要なモチーフ及び不活性ＮＳ５Ｂを産生するようになされ得る修飾の例は、Ｌｏｈｍａｎｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：８４１６−８４２６（１９９７）及びＫｏｌｙｋｈａｌｏｖら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：２０４６−２０５１（２０００）に記載されている。
ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチド配列に修飾を加えるときに考慮すべき別の要因には、自己プロセシングする能力の維持及びＴ細胞抗原の維持が含まれる。ＨＣＶポリペプチドの自己プロセシング能力は、大体機能性ＮＳ３プロテアーゼにより決定される。ＮＳ３活性プロテアーゼ活性を維持する修飾は、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ３に対するコファクターとして作用するＮＳ４Ａ、及びＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチド内に存在するＮＳ３プロテアーゼ認識部位を考慮して得られ得る。
広範囲のＴ細胞応答を誘発し得るポリペプチドを産生するために天然ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチド配列に対して各種修飾が加えられ得る。広範囲のＴ細胞応答を誘発するポリペプチドの能力に影響を及ぼす因子には、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞抗原領域の保存または導入、各種ＨＣＶ単離物におけるＴ細胞抗原領域の優勢が含まれる。
天然ＨＣＶ単離物の多数の例が当業界で公知である。ＨＣＶ単離物は１つ以上のサブタイプを含む以下の６つの主遺伝子型に分類され得る：ＨＣＶ−１／（１ａ，１ｂ，１ｃ）、ＨＣＶ−２／（２ａ，２ｂ，２ｃ）、ＨＣＶ−３／（３ａ，３ｂ，１０ｃ）、ＨＣＶ−４／（４ａ）、ＨＣＶ−５／（５ａ）及びＨＣＶ−６／（６ａ，６ｂ，７ｂ，８ｂ，９ｂ，１１ａ）（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６９３−７１２（２００１））。ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−Ｎ、ＨＣＶ−Ｈのような特定ＨＣＶ配列の例はＧｅｎＢａｎｋに寄託されており、複数の文献に記載されている（例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１３４１−１３４７（１９９７）参照）。
ＨＣＶ Ｔ細胞抗原は、例えば経験的実験により同定され得る。Ｔ細胞抗原を同定する１つの方法は、長ポリペプチドから一連の重複短ペプチドを作成し、その後ポジティブクローンについて感染患者からのＴ細胞集団をスクリーニングすることを含む。ポジティブクローンは特定ペプチドにより活性化／初期化される。ペプチド活性を測定するためにＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色及びバルクＣＴＬアッセイのような方法を用いることができる。こうして同定されたペプチドは各病原のＴ細胞エピトープを表すと見做され得る。
各種ＨＣＶ単離物由来のＨＣＶ Ｔ細胞抗原領域は、例えば２つ以上の天然配列由来の領域を含むハイブリッドＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを作成することにより１つの配列に導入され得る。前記ハイブリッドは追加の修飾を含み得、この修飾がＨＣＶ ＣＭＩ応答を生ずるポリペプチドの能力を低下させないことが好ましい。
自己プロセシングし、ＣＭＩ応答を生じさせる修飾Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドの能力は、本明細書に記載されている方法または当業界で公知の方法により測定され得る。その方法には、ＨＩＶ特異的ＣＭＩ応答を測定するためのＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ、ＩＦＮγ−細胞内染色及びバルクＣＴＬアッセイの使用が含まれる。
（Ａ） Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ配列
配列番号１は、好ましいＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ配列を規定する。配列番号１は、数種のＨＣＶ単離物中に存在する多数のＨＣＶ特異的Ｔ細胞抗原を含む。配列番号１はＨＣＶ ＢＫ株ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５８３３５）のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ部分に類似している。
配列番号１において、ＭＨＣクラスＩ分子による認識のために重要なアンカー位置は保存されているか、またはＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ部分中の２０個の公知Ｔ細胞エピトープのうちの１８個の保存的置換を表す。残りの２個の公知Ｔ細胞エピトープのうち、１個のエピトープは異なるＨＬＡスーパータイプにより認識され得る配列番号１中の非保存的アンカー置換を有し、１個のエピトープは保存されない１つのアンカー残基を有する。ＨＣＶ Ｔ細胞エピトープはＣｈｉｓａｒｉら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４２：２９９−３２５（２０００）及びＬｅｃｈｎｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，９：１４９９−１５１２（２０００）に記載されている。
ＨＣＶ ＢＫ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂヌクレオチド配列と配列番号１の違いとして、配列番号１中には５’末端にメチオニンが導入されており、修飾ＮＳ５Ｂ活性部位残基が存在していることが挙げられる。修飾により、ＧｌｙＡｓｐＡｓｐをＡｌａＡｌａＧｌｙ（残基１７１１〜１７１３）で置換するとＮＳ５Ｂが不活化される。
コードされるＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドが配列番号１に実質的に類似のアミノ酸配列を有していることが好ましい。別の実施態様では、コードされるＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドは配列番号１に対して少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸同一性を有しているか、または配列番号１と１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９または１〜２０アミノ酸だけ異なっている。
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドと配列番号１のアミノ酸の違いは、２つの配列が異なるアミノ酸修飾の最低数を調べることにより計算される。アミノ酸修飾は欠失、付加、置換またはその組合せであり得る。
アミノ酸配列同一性は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、配列アラインメントを作成する当業界で公知の方法により測定される。アミノ酸同一性は、同一アミノ酸を有するアライン残基対の数をカウントすることにより前記アラインメントから算出される。
配列同一性の測定方法には、Ｇ．Ｄ．Ｓｃｈｕｌｅｒ，「生命情報科学：遺伝子及びタンパク質の分析に対する実践ガイド(Bioinformatics: A Pracitical Guide to the Analysis of Genes and Proteins)」，Ａ．Ｄ．Ｂａｘｅｖａｎｉｓ及びＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｅｔｔｅ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１年）発行；Ｙｏｎａら，「生命情報科学：配列、構造及びデータバンク(Bioinformatiacs: Sequence, structure and databanks)」，Ｄ．Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＷ．Ｔａｙｌｏｒ編，オックスフォード大学出版（２０００年）発行；及び「生命情報科学：配列及びゲノム分析(Bioinformatics: Sequence and Genome analysis)」，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｕｎｔ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）発行に記載されているものが含まれる。アミノ酸配列同一性を測定するための方法は、ＧＡＰ（ウィスコンシン・パッケージ バージョン１０．２；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０（１９９０））及びＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編，１８３：６３−９８（１９９０））のような公表されているコンピュータープログラムで体系化される。
本発明の実施態様において、２つのポリペプチド間の配列同一性はＧＡＰプログラム（ウィスコンシン・パッケージ バージョン１０．２；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））を用いて測定される。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアラインメント方法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０））を利用している。ＧＡＰは２つの配列間の全ての可能性あるアラインメント及びギャップ位置を考察し、マッチド残基の数を最大限とする一方ギャップの数及び大きさを最小限とするグローバルアラインメントを作成する。シンボルマッチの値を割り当てるためにスコアリングマトリックスを用いる。加えて、アラインメントへのギャップの挿入を制限するためにはギャップ作成ペナルテイー及びギャップ延長ペナルティーが必要である。ＧＡＰを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトプログラムパラメーターは、ＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））アミノ酸スコアリングマトリックス（ＭＡＴｒｉｘ＝ｂｌｏｓｕｍ６２．ｃｍｐ）、ギャップ作成パラメーター（ＧＡＰｗｅｉｇｈｔ＝８）及びギャップ延長パラメーター（ＬＥＮｇｔｈｗｅｉｇｈｔ＝２）である。
全長に亘って配列番号１に実質的に類似していることに加えてより好ましいＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドは、配列番号１中に存在する対応領域に対して実質的に類似の各ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ領域を生ずる。配列番号１中の対応領域は、Ｍｅｔ−ＮＳ３アミノ酸１〜６３２、ＮＳ４Ａアミノ酸６３３〜６８６、ＮＳ４Ｂアミノ酸６８７〜９４７、ＮＳ５Ａアミノ酸９４８〜１３９４及びＮＳ５Ｂアミノ酸１３９５〜１９８５である。
別の実施態様では、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／またはＮＳ５Ｂ領域は配列番号１の対応領域に対して少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸同一性を有しているか、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９または１〜２０アミノ酸だけ異なっている。
好ましくは、配列番号１に対するアミノ酸修飾はＴ細胞抗原領域の全てまたは殆どを維持している。天然アミノ酸の違いは異なるアミノ酸側鎖（Ｒ基）による。Ｒ基はアミノ酸の諸特性、例えば物理的サイズ、電荷及び疎水性に影響を及ぼす。アミノ酸は以下のように複数のグループに分類され得る：中性で疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン）；中性で極性（グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、アスパラギン及びグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニン及びヒスチジン）；及び酸性（アスパラギン酸及びグルタミン酸）。
通常、アミノ酸を置換するときには類似の特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。特定グループ内でアミノ酸を置換する、例えばロイシンをバリン、リシンをアルギニン、グルタミンをアスパラギンで置換することはポリペプチド３次構造を変化させない良好な候補である。
特定のアミノ酸配列及び公知の遺伝子コードの縮重から出発して、多種多様のコード化核酸配列を得ることができる。遺伝子コードの縮重は、殆どすべてのアミノ酸がヌクレオチドトリプレット、すなわちコドンのいろいろな組合せによりコードされるために生ずる。特定コドンの特定アミノ酸への翻訳は当業界で公知である（例えば、Ｌｅｗｉｎ，ＧＥＮＥＳ ＩＶ，ｐ．１１９，オックスフォード大学出版（１９９０年）発行参照）。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドン ＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ；
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドン ＵＧＣ，ＵＧＵ；
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドン ＧＡＣ，ＧＡＵ；
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドン ＧＡＡ，ＧＡＧ；
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドン ＵＵＣ，ＵＵＵ；
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドン ＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ；
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドン ＣＡＣ，ＣＡＵ；
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドン ＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ；
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドン ＡＡＡ，ＡＡＧ；
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドン ＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ；
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドン ＡＵＧ；
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドン ＡＡＣ，ＡＡＵ；
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドン ＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ；
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドン ＣＡＡ，ＣＡＧ；
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドン ＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ；
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドン ＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ；
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドン ＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ；
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドン ＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ；
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドン ＵＣＧ；及び
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドン ＵＡＣ，ＵＡＵ。
核酸配列は、宿主における発現を強化しようとして最適化され得る。考慮すべき要因子には、Ｇ：Ｃ含量、好ましいコドン及び抑制性第２構造の回避が含まれる。これらの要因は特定宿主での高い発現を有する核酸配列を得るべくいろいろな方法で組合され得る（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの国際特許出願公開第９７／４７３５８号パンフレット参照）。
特定配列が特定宿主において高い発現を有する能力には幾つかの経験的実験を要する。前記実験には見込みのある核酸配列の発現を測定し、所要により前記配列を変化させることが含まれる。
（Ｂ） コード化ヌクレオチド配列
配列番号２及び３は、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ配列をコードするヌクレオチド配列の２つの例を規定する。配列番号２のコード配列は、天然に存在するＨＣＶ−ＢＫ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５８３３５）のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ領域に類似している（９９．４％ヌクレオチド配列同一性）。配列番号３は配列番号２のコドン最適化バージョンである。配列番号２及び３は７８．３％のヌクレオチド配列同一性を有する。
ＨＣＶ−ＢＫ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５８３３５）と配列番号２の違いとして、配列番号２がリボソーム結合部位、ＡＴＧメチオニンコドン、修飾ＮＳ５Ｂ触媒ドメインをコードする領域、ＴＡＡＡストップコドン及び更に３０個のヌクレオチドの違いが挙げられる。修飾触媒ドメインはＧｌｙＡｓｐＡｓｐではなくＡｌａＡｌａＧｌｙ（残基１７１１〜１７１３）をコードして、ＮＳ５Ｂを不活化する。
ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号２コード領域に実質的に類似している。別の実施態様において、ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２コード領域に対して少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているか、または配列番号２と１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０ヌクレオチドだけ異なっている。
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードする配列と配列番号２コード領域のヌクレオチドの違いは、２つの配列が異なるヌクレオチド修飾の最低数を調べることにより計算される。ヌクレオチド修飾は欠失、付加、置換またはその組合せであり得る。
ヌクレオチド配列同一性は、１つの配列のヌクレオチド配列を第２配列のヌクレオチド配列と比較し、配列アラインメントを作成する当業界で公知の方法により測定される。配列同一性は、アラインさせた同一ヌクレオチドを有する位置の数をカウントすることにより前記アラインメントから算出される。
２つのポリヌクレオチド間のヌクレオチド配列同一性の測定方法には、Ｓｃｈｕｌｅｒ，「生命情報科学：遺伝子及びタンパク質の分析に対する実践ガイド(Bioinformatics: A Pracitical Guide to the Analysis of Genes and Proteins)」，Ａ．Ｄ．Ｂａｘｅｖａｎｉｓ及びＢ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｅｔｔｅ編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００１年）発行；Ｙｏｎａら，「生命情報科学：配列、構造及びデーターバンク(Bioinformatiacs: Sequence, structure and databanks)」，Ｄ．Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＷ．Ｔａｙｌｏｒ編，オックスフォード大学出版（２０００年）発行；及び「生命情報科学：配列及びゲノム分析(Bioinformatics: Sequence and Genome analysis)」，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｕｎｔ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）発行に記載されているものが含まれる。ヌクレオチド配列同一性を測定するための方法は、ＧＡＰ（ウィスコンシン・パッケージ バージョン１０．２；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０（１９９０））及びＦＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．Ｐｅｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編，１８３：６３−９８（１９９０））のような公表されているコンピュータープログラムで体系化される。
本発明の実施態様において、２つのポリヌクレオチド間の配列同一性はＧＡＰプログラム（ウィスコンシン・パッケージ バージョン１０．２；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））を適用して測定される。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｃｈのアラインメント方法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０））を利用している。ＧＡＰは２つの配列間の全ての考えられるアラインメント及びギャップ位置を考察し、マッチド残基の数を最大限とする一方ギャップの数及び大きさを最小限とするグローバルアラインメントを形成する。シンボルマッチの値を割り当てるためにスコアリングマトリックスを用いる。加えて、アラインメントへのギャップの挿入を制限するためにはギャップ作成ペナルテイー及びギャップ延長ペナルティーが必要である。ＧＡＰを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトプログラムパラメーターは、ｎｗｓｇａｐｄａ．ｃｍｐスコアリングマトリックス（ＭＡＴｒｉｘ＝ｎｗｓｇａｐｄａ．ｃｍｐ）、ギャップ作成パラメーター（ＧＡＰｗｅｉｇｈｔ＝５０）及びギャップ延長パラメーター（ＬＥＮｇｔｈｗｅｉｇｈｔ＝３）である。
全長に亘って実質的に類似していることに加えてより好ましいＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂヌクレオチド配列により、配列番号２中に存在する対応領域に対して実質的に類似の各ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ領域が生ずる。配列番号２中の対応領域は、Ｍｅｔ−ＮＳ３ヌクレオチド７〜１９０２、ＮＳ４Ａヌクレオチド１９０３〜２０６４、ＮＳ４Ｂヌクレオチド２０６５〜２８４７、ＮＳ５Ａヌクレオチド２８４８〜４１８８及びＮＳ５Ｂヌクレオチド４１８９〜５６６１である。
別の実施態様では、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ及び／またはＮＳ５Ｂコード化領域は配列番号２中の対応領域に対して少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有しているか、または配列番号２と１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のヌクレオチドだけ異なっている。
（Ｃ） 遺伝子発現カセット
遺伝子発現カセットはポリペプチド発現に必要な要素を含んでいる。「ポリペプチド」はサイズを限定せず、タンパク質も含む。遺伝子発現カセット中に存在する調節要素は、通常（ａ）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的にカップリングされているプロモーター、（ｂ）ヌクレオチド配列に機能的にカップリングされている５’リボソーム結合部位、（ｃ）ヌクレオチド配列の３’末端に結合されているターミネーター、及び（ｄ）ヌクレオチド配列に機能的にカップリングされている３’ポリアデニル化シグナルを含む。遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングを強化または調節するのに有用な追加の調節要素を存在させてもよい。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにより認識され、下流領域の転写を媒介する遺伝子要素である。好ましいプロモーターは、転写レベルを向上させる強プロモーターである。強プロモーターの例は、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）及びイントロンＡを有するＣＭＶである（Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：３９７９−３９８６（１９９１））。プロモーターの別の例には、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターやβ−アクチンプロモーターのような天然プロモーター；並びに合成筋肉特異的プロモーターやキメラ筋肉特異的／ＣＭＶプロモーターのような人工プロモーターが含まれる（Ｌｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２４１−２４５（１９９９）；Ｈａｇｓｔｒｏｍら，Ｂｌｏｏｄ，９５：２５３６−２５４２（２０００））。
リボソーム結合部位は開始コドンにまたはその近くに位置している。好ましいリボソーム結合部位の例には、ＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ＣＣＧＣＣＡＵＧＧ及びＡＣＣＡＵＧＧ（ここで、ＡＵＧは開始コドンである）が含まれる（Ｋｏｚａｋ，Ｃｅｌｌ，４４：２８３−２９２（１９８６））。リボソーム結合部位の別の例はＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１２）である。
ポリアデニル化シグナルは、転写ＲＮＡの開裂及びポリ（Ａ）テールのＲＮＡへの付加に関与する。高級真核生物中のポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化付加部位から約１１〜３０ヌクレオチドにＡＡＵＡＡＡ配列を含む。このＡＡＵＡＡＡ配列はＲＮＡ開裂のシグナル化に関与する（Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，ニューヨークに所在のオックスフォード大学出版（１９９０年）出版）。ポリ（Ａ）テールはｍＲＮＡプロセシングにとって重要である。
遺伝子発現カセットの一部として使用され得るポリアデニル化シグナルは、最低の家兎β−グロビンポリアデニル化シグナル及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＧＨ）を含む（Ｘｕら，Ｇｅｎｅ，２７２：１４９−１５６（２００１）；Ｐｏｓｔらの米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を含む。更なる例には合成ポリアデニル化シグナル（ＳＰＡ及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが含まれる。ＳＰＡ配列は、ＡＡＵＡＡＡＡＧＡＵＣＵＵＵＡＵＵＵＵＣＡＵＵＡＧＡＵＣＵＧＵＧＵＧＵＵＧＧＵＵＵＵＵＵＧＵＧＵＧ（配列番号１３）である。
存在し得る遺伝子発現またはポリペプチドプロセシングを強化または調節するのに有用な追加の調節要素の例にはエンハンサー、リーダー配列及びオペレーターが含まれる。エンハンサー領域は転写を向上させる。エンハンサー領域の例にはＣＭＶエンハンサー及びＳＶ４０エンハンサーが含まれる（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−３０（１９９５）；Ｘｕら，Ｇｅｎｅ．２７２：１４９−１５６（２００１））。エンハンサー領域はプロモーターに関連し得る。
リーダー配列はポリペプチドをプロテオソームに指向させるポリペプチド上のアミノ酸領域である。リーダー配列をコードする核酸は構造遺伝子の５’であり、構造遺伝子に沿って転写される。リーダー配列の例はｔＰＡである。
遺伝子発現を調節するためにオペレーター配列を使用し得る。例えば、Ｔｅｔオペレーター配列を遺伝子発現を抑制するために使用し得る。
ＩＩ． 治療用ベクター
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする核酸は、治療投与のために適したベクターを用いて患者に導入され得る。許容できない副作用を引き起こすことなく核酸を標的細胞にデリバーするベクターが適当であり得る。
細胞発現は、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを用いて達成される。遺伝子発現カセットは、有利な効果が得られるように標的細胞内で十分量の核酸を産生、プロセシングするために調節要素を含む。
治療用途に使用され得るベクターの例には、第１世代及び第２世代アデノベクター、ヘルパー依存性アデノベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、αウイルスベクター、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスベクター及びプラスミドベクターが含まれる（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６（１９９７）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの米国特許第６，１５６，５８８号明細書；Ｊｏｈｎｓｔｏｎらの国際特許出願公開第９５／３２７３３号パンフレット）。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを患者に導入するための好ましいベクターは第１世代アデノウイルスベクター及びプラスミドＤＮＡベクターである。
（Ａ） 第１世代アデノウイルスベクター
遺伝子発現カセットを発現するための第１世代アデノベクターは、Ｅ１及び場合によりＥ３欠失組換えアデノウイルスゲノム中に発現カセットを含む。Ｅ１領域の欠失はアデノウイルスの複製に必要な要素を除去するのに十分に大きい。
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現するための第１世代アデノベクターはＥ１及びＥ３欠失組換えアデノウイルスゲノムを含む。Ｅ１領域の欠失はアデノウイルスの複製に必要な要素を除去するのに十分に大きい。Ｅ１及びＥ３領域の欠失の組合せは、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする遺伝子発現カセットを収容するのに十分な大きさである。
アデノウイルスは両端に逆方向末端反復を有する二本鎖線状ゲノムを有する。ウイルス複製中、ゲノムはウイルスカプシド内部にパッケージされてビリオンを形成する。ウイルスはウイルス結合及びその後の内部移行によりその標的細胞に進入する（Ｈｉｔｔら，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６（１９９７））。
アデノベクターは、ヒトまたは動物中に見られるような各種アデノウイルス血清型をベースとしている。動物アデノウイルスの例にはウシ、ブタ、チンパンジー、マウス、イヌ及びトリが含まれる（ＣＥＬＯ）。好ましいアデノベクターはヒト血清型、より好ましくはグループＢ、ＣまたはＤ血清型をベースとしている。ヒトアデノウイルスグループＢ、Ｃ、ＤまたはＥ血清型の例には、タイプ２（“Ａｄ２”）、４（“Ａｄ４”）、５（“Ａｄ５”）、６（“Ａｄ６”）、２４（“Ａｄ２４”）、２６（“Ａｄ２６”）、３４（“Ａｄ３４”）及び３５（“Ａｄ３５”）が含まれる。アデノベクターは１つのアデノウイルスに由来する領域または２つ以上のアデノウイルスに由来する領域を含み得る。
別の実施態様において、アデノベクターはＡｄ５、Ａｄ６またはその組合せをベースとする。Ａｄ５はＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８６：２８０−２８５（１９９２）に記載されている。Ａｄ６は図７Ａ〜７Ｎに記載されている。Ａｄ５領域を含むＡｄ６ベースのベクターは以下の実施例に記載されている。
アデノベクターにおいてＥ１及びＥ３領域は完全に除去されていなくてもよい。むしろ、イントランスに供給されるＥ１タンパク質の非存在下でベクター複製を無能とするのに十分な量のＥ１領域が除去されている。Ｅ１欠失、またはＥ１欠失とＥ３欠失の組合せは遺伝子発現カセットを収容するのに十分な大きさである。
Ｅ１欠失はＡｄ５の塩基対約３４２〜塩基対約３５２３または他のアデノウイルスの対応領域から得られ得る。好ましくは、欠失領域はＡｄ５の塩基対約４５０〜塩基対約３５１１の領域または他のアデノウイルスの対応領域の除去を含む。塩基対約３４１から始まる大きなＥ１領域が欠失されるとウイルスパッケージングを促進する要素が除去される。
Ｅ３欠失はＡｄ５の塩基対約２７８６５〜塩基対約３０９９５または他のアデノウイルスの対応領域から得られ得る。好ましくは、欠失領域はＡｄ５の塩基対約２８１３４〜塩基対約３０８１７の領域または他のアデノウイルスの対応領域の除去を含む。
Ｅ１領域及び場合によりＥ３領域の欠失の組合せは、遺伝子発現カセットを含む組換えゲノムの全サイズが野生型アデノウイルスゲノムの約１０５％を越えない程度に十分に大きくなければならない。例えば、組換えアデノウイルスＡｄ５ゲノムが約１０５％を越える大きさになるとゲノムは不安定になる（Ｂｅｔｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：５９１１−５９２１（１９９３））。
好ましくは、遺伝子発現カセットを含む組換えアデノウイルスゲノムの大きさは野生型アデノウイルスゲノムの大きさの約８５％〜約１０５％である。別の実施態様では、発現カセットを含む組換えアデノウイルスゲノムの大きさは野生型アデノゲノムの大きさの約１００％〜約１０５．２％、または１００％である。
Ｅ１及びＥ３欠失を有するアデノウイルスゲノムに約７５００ｋｂが挿入され得る。欠失なしの場合、Ａｄ５ゲノムは３５，９３５塩基対であり、Ａｄ６ゲノムは３５，７５９塩基対である。
第１世代アデノベクターは、Ｅ１遺伝子産物をイントランスに供給することにより複製され得る。Ｅ１遺伝子産物はイントランスに、例えばアデノウイルスＥ１領域で形質転換させた細胞株を用いることにより供給され得る。アデノウイルスＥ１領域で形質転換させた細胞または細胞株の例はＨＥＫ ２９３細胞、９１１細胞、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞及びトランスフェクトした一次ヒトアミノサイト細胞である（Ｇｒａｈａｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：５９−７２（１９７７）；Ｓｃｈｉｅｄｎｅｒら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１１：２１０５−２１１６（２０００）；Ｆａｌｌａｕｘら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：１９０９−１９１７（１９９８）；Ｂｏｕｔらの米国特許第６，０３３，９０８号明細書）。
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットは、欠失Ｅ１領域または欠失Ｅ３領域に対応する領域で組換えアデノベクターゲノムに挿入されなければならない。発現カセットは平行または逆平行方位を有し得る。平行方位では、挿入遺伝子の転写方向は欠失Ｅ１またはＥ３領域と同じ方向である。逆平行方位転写では、逆鎖は鋳型として作用し、転写方向は逆方向である。
本発明の実施態様では、アデノベクターはＥ１欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有する。前記ベクターは、
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ｅ１平行またはＥ１逆平行方位の遺伝子発現カセット、
ｃ）前記発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｄ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｅ）前記第３領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域、及び
ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域
を含む。
本発明の別の実施態様では、アデノベクターはＥ３欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有する。前記ベクターは、
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｃ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｄ）前記第３領域に連結した、Ｅ３平行またはＥ３逆平行方位の遺伝子発現カセット、
ｅ）前記遺伝子発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域、及び
ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域
を含む。
アデノウイルス領域に関する好ましい別の実施態様では、
（１）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ５に対応する；
（２）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ６に対応する；
（３）第１領域はＡｄ５に対応し、第２領域はＡｄ５に対応し、第３領域はＡｄ６に対応し、第４領域はＡｄ６に対応し、第５領域はＡｄ５に対応する。
（Ｂ） ＤＮＡプラスミドベクター
ＤＮＡワクチンプラスミドは遺伝子発現カセットと共に複製及び好ましくはベクター選択を容易とする要素を含む。好ましい要素は非哺乳動物細胞における複製及び選択マーカーを与える。前記ベクターは、ヒト細胞における複製またはヒト核酸への組込みを与える要素を含むべきではない。
選択マーカーにより、マーカーを含む核酸の選択が容易となる。好ましい選択マーカーは抗生物質耐性を付与するものである。抗生物質選択遺伝子の例には、アンピシリン、ネオマイシン及びカナマイシンに対する耐性をコードする核酸が含まれる。
好適なＤＮＡワクチンベクターは細菌性複製起点及び選択マーカーを含むプラスミドから作成され得る。高い収率を与える細菌性複製起点にはＣｏｌＥ１プラスミド誘導の細菌性複製起点が含まれる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：６１７−６４８（１９９７））。
細菌性複製起点及び選択マーカーを存在させると、大腸菌のような細菌株においてＤＮＡベクターが産生され得る。選択マーカーはＤＮＡベクターを含まない細菌を除去するために使用される。
ＩＩＩ． Ａｄ６組換え核酸
Ａｄ６組換え核酸は、配列番号８中に存在するＡｄ６領域に実質的に類似するＡｄ６領域及びＡｄ６核酸中に存在しない領域を含む。Ａｄ６領域を含む組換え核酸は、別のＡｄ６領域の産生において、Ａｄ６ベースのベクターの作成における中間体として、または組換え遺伝子のデリバリー用ベクターとしてのように各種用途を有する。
図９に示すように、Ａｄ６のゲノム構成はＡｄ５のゲノム構成に非常に類似している。Ａｄ５とＡｄ６のホモロジーは約９８％である。
別の実施態様において、Ａｄ６組換え核酸はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４に実質的に類似しているヌクレオチド領域またはその組合せを含む。Ａｄ６領域に実質的に類似の核酸領域は少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％のヌクレオチド配列同一性を有するか、または１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１３、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１７、１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５または１〜５０個のヌクレオチドだけ異なっている。実質的に類似の核酸配列を調べるための方法及び実施態様は上記セクションＩ．Ｂ．に記載されている。
好ましくは、組換えＡｄ６核酸はＡｄ６中に存在しないポリペプチドをコードする発現カセットを含む。発現カセットの例には、ＨＣＶ領域をコードする発現カセット及び別のタイプのポリペプチドをコードする発現カセットが含まれる。
別のタイプのアデノウイルスベクターは、異なる量の第１世代及び第２世代アデノベクターのようなＡｄ６を導入して作成され得る。上記セクションＩＩ．Ａ．に記載したように、第１世代アデノベクターはＥ１を欠き、Ｅ１をイントランスに供給したときに複製し得る。
第２世代アデノベクターは第１世代ベクターよりも小さいアデノウイルスベクターを含み、アデノウイルスタンパク質を供給するヘルパーベクター及び／または補充細胞株と一緒に使用され得る。第２世代アデノベクターは複数の文献、例えばＲｕｓｅｌｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：２５７３−２６０４（２０００）；Ｈｉｔｔら，「遺伝子導入のためのヒトＡｄベクター(Human Ad vectors for Gene
Transfer)」，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４０，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ発行に記載されている。
本発明の実施態様では、Ａｄ６組換え核酸はＥ１をイントランスに供給したときに複製し得るＥ１を欠くアデノウイルスベクターである。発現カセットは欠失Ｅ１領域及び／または欠失Ｅ３領域に挿入され得る。
欠失Ｅ１領域に発現カセットを有するＡｄ６ベースのアデノウイルスベクターの例は、
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ｅ１平行またはＥ１逆平行方位の遺伝子発現カセット、
ｃ）前記発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｄ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｅ）場合によっては存在する、前記第３領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約２８１３４〜塩基対約３０８１７またはＡｄ６に対応する塩基対約２８１５７〜塩基対約３０７８８の第４アデノウイルス領域、
ｆ）第４領域が存在するときにはその第４領域に連結し、第４領域が存在しないときには第３領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第５アデノウイルス領域、及び
ｇ）前記第５領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第６アデノウイルス領域
を含むかまたはこれらから構成されるが、少なくとも１つのＡｄ６領域は存在する。
本発明の別の実施態様では、全ての領域がＡｄ６に由来する；第１及び第２を除く全ての領域がＡｄ６に由来する；第２、第３，第４及び第５領域から選択される１〜４個の領域がＡｄ６に由来する。
欠失Ｅ３領域に発現カセットを有するＡｄ６ベースのアデノウイルスベクターの例は、
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｃ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｄ）前記第３領域に連結した、Ｅ３平行またはＥ３逆平行方位の遺伝子発現カセット、
ｅ）前記遺伝子発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域、及び
ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域、
を含むかまたはこれらから構成されるが、少なくとも１つのＡｄ６領域は存在する。
本発明の別の実施態様では、全ての領域がＡｄ６に由来する；第１及び第２を除く全ての領域がＡｄ６に由来する；第２、第３，第４及び第５領域から選択される１〜４個の領域がＡｄ６に由来する。
ＩＶ． ベクター作成
ベクターは、制限酵素の使用、核酸ライゲーションや相同組換えを含むような組換え核酸方法を用いて作成され得る。組換え核酸方法は当業界で公知である（Ａｕｓｕｂｅｌ，「分子生物学における現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ（１９８７−１９９８年）発行；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング，実験マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行）。
中間体ベクターは治療ベクターを引き出すために、または発現カセットまたはその一部を１つのベクターから他のベクターに移動させるために使用される。中間体ベクターの例には、アデノウイルスゲノムプラスミド及びシャトルベクターが含まれる。
中間体ベクター中の有用な要素には、複製起点、選択マーカー、相同組換え領域及び便利な制限部位が含まれる。便利な制限部位は核酸配列のクローニングまたは遊離を促進するために使用され得る。
相同組換え領域は、別の核酸分子中の標的領域に相同な核酸領域である。相同領域は、標的領域に挿入される核酸配列に隣接している。別の実施態様では、相同領域は好ましくは約１５０〜６００ヌクレオチド長、または約１００〜５００ヌクレオチド長である。
本発明の実施態様は、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセット、選択マーカー、細菌性複製起点、第１アデノウイルス相同領域、及びＥ１領域に挿入またはＥ１領域を置換するために発現カセットを標的する第２アデノウイルス相同領域を含むシャトルベクターに関する。第１及び第２相同領域は発現カセットに隣接している。第１相同領域は、塩基対約４〜４５０の野生型アデノウイルス領域の少なくとも右端（３’端）に実質的に相同な少なくとも約１００塩基対を含む。第２相同領域は、塩基対約３５１１〜５７９２のＡｄ５の少なくとも左端（５’端）または他のアデノウイルス由来の対応領域に実質的に相同な少なくとも約１００塩基対を含む。
「実質的に相同な」は、標的領域と特異的に組み換えるのに十分に相同度を指す。別の実施態様では、実質的に相同とは少なくとも８５％、少なくとも９５％または１００％の配列同一性を指す。配列同一性は上記セクションＩ．Ｂ．に記載されているように計算され得る。
アデノベクターを産生するための１つの方法は、発現カセットを含むアデノウイルスゲノムプラスミドの作成を含む。プレアデノウイルスは、所望の相補(complimenting)細胞株での複製に必要な全てのアデノウイルス配列を含む。その後、プレアデノウイルスプラスミドを制限酵素で消化してウイルスＩＴＲを放出し、ウイルスレスキューのために相補細胞株にトランスフェクトする。ＩＴＲは複製が生ずるようにプラスミド配列から放出されなければならない。アデノベクターレスキューの結果、発現カセットを含むアデノベクターが生ずる。
（Ａ）アデノウイルスゲノムプラスミド
アデノウイルスゲノムプラスミドは、長いプラスミド（コスミドであってもよい）内にアデノベクター配列を含む。長いプラスミドは、プラスミドを産生及び維持するために使用される手順に応じて真核または細菌細胞における増殖及び選択を促進するような追加要素を含み得る。アデノウイルスゲノムプラスミドを産生するための方法には、シャトルベクター及び相同組換えの使用を含む技術及び遺伝子発現カセットのアデノウイルスコスミドへの挿入を含む技術が含まれる（Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−３０（１９９５）；Ｄａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１７０７−１７１４（２０００））。
アデノウイルスゲノムプラスミドがＥ１またはＥ３欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有していることが好ましい。本発明の実施態様では、アデノウイルスゲノムプラスミドは、Ｅ１欠失領域に挿入された遺伝子発現カセット、複製起点、選択マーカー及び組換えアデノウイルス領域を含み、前記組換えアデノウイルス領域は
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ｅ１平行またはＥ１逆平行方位の遺伝子発現カセット、
ｃ）前記発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｄ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｅ）前記第３領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域、
ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域、及び
ｇ）場合によっては存在する、所望アデノベクターの全サイズを考慮してより小さなインサートのために存在し得る、Ａｄ５またはＡｄ６中に存在するＥ３領域の全部または一部に対応するＥ３領域
から構成される。
本発明の別の実施態様では、組換えアデノウイルスゲノムプラスミドはＥ３欠失領域に挿入された遺伝子発現カセットを有する。前記ベクターは複製起点、選択マーカー、並びに
ａ）Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域、
ｂ）前記第１領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域、
ｃ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域、
ｄ）前記第３領域に連結した、Ｅ３平行またはＥ３逆平行方位の前記遺伝子発現カセット、
ｅ）前記遺伝子発現カセットに連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域、及び
ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域
を含む。
存在するアデノウイルス領域に関する別の実施態様では
（１）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ５に対応する；
（２）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ６に対応する；
（３）第１領域はＡｄ５に対応し、第２領域はＡｄ５に対応し、第３領域はＡｄ６に対応し、第４領域はＡｄ６に対応し、第５領域はＡｄ５に対応する。
本発明の実施態様は、アデノウイルスゲノムプラスミドを産生するための相同組換え段階及びアデノウイルスレスキュー段階を含むアデノベクターの作成方法に関する。前記相同組換え段階は、アデノウイルス相同領域に隣接してＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットを含むシャトルベクターの使用を含む。前記アデノウイルス相同領域により、発現カセットはＥ１またはＥ３欠失領域に標的される。
アデノウイルスゲノムプラスミドの産生に関する本発明の実施態様では、遺伝子発現カセットを、Ａｄ５またはＡｄ６のいずれかに対応する塩基対約１〜塩基対約４５０の第１アデノウイルス領域；前記第１領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３５１１〜塩基対約５５４８またはＡｄ６に対応する塩基対約３５０８〜塩基対約５５４１の第２アデノウイルス領域；前記第２領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約５５４９〜塩基対約２８１３３またはＡｄ６に対応する塩基対約５５４２〜塩基対約２８１５６の第３アデノウイルス領域；前記第３領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３０８１８〜塩基対約３３９６６またはＡｄ６に対応する塩基対約３０７８９〜塩基対約３３７８４の第４アデノウイルス領域；及び前記第４領域に連結した、Ａｄ５に対応する塩基対約３３９６７〜塩基対約３５９３５またはＡｄ６に対応する塩基対約３３７８５〜塩基対約３５７５９の第５アデノウイルス領域からなるベクターに挿入する。アデノウイルスゲノムプラスミドは複製起点及び選択マーカーを含んでいなければならず、Ａｄ５またはＡｄ６ Ｅ３領域の全部または一部を含んでいてもよい。
存在するアデノウイルス領域に関する別の実施態様では、
（１）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ５に対応する；
（２）第１、第２、第３、第４及び第５領域はＡｄ６に対応する；
（３）第１領域はＡｄ５に対応し、第２領域はＡｄ５に対応し、第３領域はＡｄ６に対応し、第４領域はＡｄ６に対応し、第５領域はＡｄ５に対応する。
（Ｂ） アデノベクターレスキュー
アデノベクターは、当業界で公知であるかまたは本明細書に記載されている方法を用いて組換えアデノウイルスゲノムプラスミドからレスキューされ得る。当業界で公知のアデノウイルスレスキューの方法の例は、Ｈｉｔｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１３−３０（１９９５）及びＤａｎｔｈｉｎｎｅら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：１７０７−１７１４（２０００）に記載されている。
本明細書に記載されているアデノベクターをレスキューするための好ましい方法はアデノウイルス複製のブーストが含まれる。ブースティングアデノウイルス複製は、例えばＥ２タンパク質（ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質）のようなアデノウイルス機能及びＥ４ｏｒｆ６を別のプラスミドに供給することにより実施され得る。以下の実施例１０には、コドン最適化Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットを含むアデノベクターをレスキューするためのアデノウイルス複製のブーストを例示している。
Ｖ． 部分最適化ＨＣＶコード配列
ＨＣＶポリタンパク質コード化核酸の部分最適化により、ヒトでの発現のために最適化されるコドンの量は完全最適化に比して少なくなる。全目的は、最適化コドンを有するＨＣＶポリタンパク質コード化核酸を含むアデノベクターの作成を促進しながら、コドン最適化のために高い発現という効果を与えることである。
ＨＣＶポリタンパク質コード化配列を完全最適化すると、各アミノ酸について最も頻繁に見られるヒトコドンが与えられる。完全最適化は、当業界で公知のコドン頻度表及びＢＬＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥプログラム（ウィスコンシンパッケージ バージョン１０；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））を用いて実施され得る。
部分最適化は、存在する全ＨＣＶポリタンパク質コード化配列（例えば、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）または存在する１つ以上の局部領域に対して実施され得る。別の実施態様では、存在する全ＨＣＶコード化ポリタンパク質のＧＣ含量は少なくとも約６５％以下であり、１つ以上の局部領域のＧＣ含量は約７０％以下である。
局部領域はＨＣＶコード化核酸中に存在する領域であり、サイズは異なり得る。例えば、局部領域は約６０、約７０、約８０、約９０または約１００ヌクレオチド長であり得る。
部分最適化は、最初天然に存在する配列に基づいて部分的に最適化されるＨＣＶコード化ポリタンパク質配列を構築することにより達成され得る。或いは、最適化ＨＣＶコード化配列は部分最適化配列を作成するために比較に基づいて使用され得る。
ＶＩ． ＨＣＶ併用治療
ＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂワクチンは単独で患者を治療するために使用され得、他のＨＣＶ治療薬と一緒に使用され得、及び他のタイプの疾患を標的とする物質と一緒に使用され得る。追加の治療には、ＨＣＶ及びＨＣＶ感染患者に広く蔓延している疾患を治療するための追加の治療薬が含まれる。他のタイプの疾患を標的とする物質にはＨＩＶ及びＨＢＶに対するワクチンが含まれる。
ＨＣＶを治療するための追加の治療薬にはワクチン及び非ワクチンが含まれる（Ｚｅｉｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ，１０：１４５７−１４６９（２００１））。追加のＨＣＶワクタンの例には、ＨＣＶコア抗原及びＨＣＶ Ｅ１、Ｅ２またはｐ７領域に対する免疫応答を引き出すように設計されたワクチンが含まれる。ワクチン成分は天然に存在するＨＣＶポリペプチド、ＨＣＶミモトープポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸であり得る。
ＨＣＶミモトープポリペプチドはＨＣＶエピトープを含むが、天然に存在するＨＣＶ抗原とは異なる配列を有する。ＨＣＶミモトープは天然に存在するＨＣＶ抗原に融合され得る。一般的なミモトープの作成方法及び各種ＨＣＶミモトープはＦｅｌｉｃｉらの米国特許第５，９９４，０８３号明細書及びＮｉｃｏｓｉａらの国際特許出願公開第９９／６０１３２号パンフレットに記載されている。
ＶＩＩ． 医薬投与
ＨＣＶワクチンは、当業界で公知の方法を用い、本明細書に記載されているガイダンスを用いて処方、患者に投与される。医薬投与の一般的ガイドラインは、例えばいずれも援用により本明細書に含まれるとするＭｏｄｅｒｎ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ，Ｋｕｒｓｔａｋ編，Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄ．Ｃｏ．（１９９４年）発行；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（１９９０年）発行；及びＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，第２版，Ｂａｎｋｅｒ及びＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９０年）発行に記載されている。
ＨＣＶワクチンは、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、皮膚を介する圧痕または鼻のような各種ルートにより投与され得る。好ましいルートは筋肉内である。
筋肉内投与は各種方法を用いて、例えば１つ以上の電気パルスと共に又は電気パルスなしで注射により実施され得る。電気媒介導入は液性及び細胞免疫応答の両方を刺激することにより遺伝免疫化を助けることができる。
ワクチン注射は各種方法を用いて、例えば針及び無針注射システムを用いることにより実施され得る。無針注射システムの例はジェット注射デバイスである（Ｄｏｎｎｅｌｌｙらの国際特許出願公開第９９／５２４６３号パンフレット）。
（Ａ） 電気媒介導入
電気媒介導入、すなわち遺伝子エレクトロトランスファー（ＧＥＴ）は、核酸注射後適当な電気パルスをデリバリーすることにより実施され得る（Ｍａｔｈｉｅｓｅｎの国際特許出願公開第９８／４３７０２号パンフレット参照）。プラスミド注射及びエレクトロポレーションはステンレス針を用いて実施され得る。針は２つ、３つまたはそれ以上の複雑なパターンで使用され得る。１つの構成では、針を、機械的支持体であり且つ適当なケーブルを用いて電場発生装置に針をつなげるプリント基板上にはんだ付けされている。
電気刺激は電気パルスの形態で加えられる。パルスは各種形態（スクエア、シヌソイド、三角、指数関数的減衰）及び各種極性（正または負極の単極性、双極性）を有し得る。パルスは定電圧または定電流方式でデリバリーされ得る。
ＨＣＶを含む核酸ワクチン及び他の核酸ワクチンを患者に導入するために多種多様な電気治療パターンが使用され得る。電気治療の可能なパターンには、
（治療１） パルス長０．２ｍｓｅｃ／フェーズ、周波数１０００Ｈｚ、定電圧モード、４５ボルト／フェーズ、浮動電流で１秒おきにデリバリーされる１０００スクェア双極性パルス１０列、
（治療２） パルス長２ｍｓｅｃ／フェーズ、周波数１００Ｈｚ、定電流モード、１００ｍＡ／フェーズ、浮動電圧で１秒おきにデリバリーされる１０００スクェア双極性パルス２列、
（治療３） 約２ｍｓｅｃ／フェーズのパルス長で全部で３秒間の双極性パルス２列（組織に流れる実際の電流は約５０ｍＡに固定されている）
が含まれる。
電気パルスは電場発生装置を介してデリバリーされる。好適な発生装置は、共通シャシに組み立てられ、駆動プログラムを実行するポータブルＰＣにより駆動される３つの独立したハードウェア部品から構成され得る。ソフトウェアは基本的及び補助持機能を管理する。前記デバイスの部品は、（１）マイクロプロセッサーにより駆動する信号発生器、（２）電力増幅器及び（３）デジタルオシロスコープである。
信号発生器は、ソフトウェアのコントロール下で所定範囲の任意の周波数及び形状を有する信号を発する。同一ソフトウェアはデリバリーされる波形に対する対話式エディタを有する。前記発生器はデジタル制御の限流デバイス（最大電流出力を制御するための安全機構）である。電力増幅器は発生したシグナルを±１５０Ｖまで増幅させ得る。オシロスコープはデジタル式であり、増幅器によりデリバリーされる電流及び電圧の両方をサンプリングし得る。
（Ｂ） 薬用担体
医薬的に許容され得る担体により、ワクチンの貯蔵及びワクチンの被験者への投与が容易となる。医薬的に許容され得る担体の例は本明細書に記載されている。別の医薬的に許容され得る担体は当業界で公知である。
医薬的に許容され得る担体は各種成分、例えば緩衝液、通常生理食塩液、リン酸緩衝食塩液、スクロース、塩及びポリソルベートを含み得る。医薬的に許容され得る担体の例は次の通りである：２．５〜１０ｍＭ トリス緩衝液、好ましくは約５ｍＭ トリス緩衝液；２５〜１００ｍＭ ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ ＮａＣｌ；２．５〜１０％ スクロース、好ましくは約５％ スクロース；０．０１〜２ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び０．００１〜０．０１％ ポリソルベート８０（植物由来）。ｐＨは好ましくは約７．０〜９．０、より好ましくは約８．０である。担体の特定例は、ｐＨ８．０で５ｍＭ トリス、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％ スクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．００５％ ポリソルベート８０を含む。
（Ｃ） 投薬レジメ
好適な投与レジメは、特定ワクチンの効力及び諸要因（例えば、患者の年齢、体重、性別及び医学的状態；投与ルート；所望効果；及び投与回数）を考慮して決定され得る。特定ワクチンの効力は各種因子、例えば細胞において発現、プロセシングされ、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ複合体の関係で提示されるポリペプチドを産生する特定ワクチンの能力に依存する。
患者に投与されるＨＣＶコード化核酸は、アデノベクターのようなウイルスベクター及びＤＮＡプラスミドワクチンを含めた各種タイプのベクターの一部であり得る。ＤＮＡプラスミドの投与に関する別の実施態様では、約０．１〜１０ｍｇのプラスミドが患者に投与され、約１〜５ｍｇのプラスミドが患者に投与される。ウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスベクターの投与に関する別の実施態様では、約１０５〜１０１１ウイルス粒子が患者に投与され、約１０７〜１０１０ウイルス粒子が患者に投与される。
ウイルスベクターワクチン及びＤＮＡプラスミドワクチンは単独で投与してもよく、または初期及び追加投与レジメの一部であってもよい。混合方式の初期及び追加接種としては、ＤＮＡワクチンを初期接種した後ウイルスベクターワクチンを追加接種したり、ウイルスベクターワクチンを初期接種した後ＤＮＡワクチンを追加接種することが挙げられる。
初回接種を複数回、例えば約２〜４回またはそれ以上実施してもよい。初回接種と追加接種の間の期間は通常約４ヶ月〜１年の範囲で変更可能であるが、他の時間枠を使用してもよい。ＤＮＡワクチンを用いる初回接種レジメの使用は、ヒトが既に抗−アデノウイルス免疫応答を示している状況において好ましいことがある。
本発明の実施態様では、１×１０７〜１〜１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１〜１０１１アデノベクター粒子を筋肉組織に直接投与する。初回ワクチン接種後、アデノベクターまたはＤＮＡワクチンを用いて追加接種する。
本発明の別の実施態様では、初回接種をＤＮＡワクチンを用いて筋肉組織に直接実施する。初回接種後、アデノベクターまたはＤＮＡワクチンを用いて追加接種する。
免疫応答をブーストするためにインターロイキン−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＰ１０、Ｍｉｇ−１のような物質を同時投与することができる。前記物質はタンパク質として、または核酸ベクターを用いて同時投与され得る。
（Ｄ） 非相同初回−追加接種
非相同初回−追加接種は、初回接種のために１タイプのウイルスベクター、追加接種のために別のタイプのウイルスベクターを使用することを含む混合方式である。非相同初回−追加接種では、異なるアデノウイルス血清型をベースとするベクターのような関連ベクター及びより遠縁のウイルス（例えば、アデノウイルス及びポックスウイルス）を使用し得る。マウスをマラリアから防御するためにポックスウイルス及びアデノウイルスベクターを使用することはＧｉｌｂｅｒｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０：１０３９−１０４５（２００２）に記載されている。
初回接種及び追加接種に関する別の実施態様では、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂのような所望の抗原を発現する以下のタイプのベクターを使用する。すなわち、Ａｄ５ベクター後Ａｄ６ベクター；Ａｄ６ベクター後Ａｄ５ベクター；Ａｄ５ベクター後ポックスウイルスベクター；ポックスウイルスベクター後Ａｄ５ベクター；Ａｄ６ベクター後ポックスウイルスベクター後；ポックスウイルスベクター後Ａｄ６ベクター。
初回接種と追加接種の間の期間は通常約４ヶ月〜１年の範囲で変更可能であるが、他の時間枠を使用してもよい。少なくとも時間枠は免疫学的に安静させるのに十分でなければならない。１つの実施態様では、この安静は少なくとも６ヶ月である。初回接種には１つのタイプのベクターを用いる複数回（例えば、２〜４回）の初回接種が含まれ得る。
ポックスウイルスベクター中に存在する発現カセットは、当該ポックスウイルスまたは別のポックスウイルスメンバーに生まれつきであるかまたはそれから誘導されるプロモーターを含んでいなければならない。ワクシニアウイルス、修飾ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス、アライグマポックスウイルス、修飾ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ、カナリアポックスウイルス（例えば、ＡＬＶＡＣ）、トリポックスウイルス、ウシポックスウイルス及びＮＹＶＡＣをベースとするベクターを含めた各種タイプのポックスウイルスベースのベクターを構築、使用するための諸戦略が当業界で公知である（Ｍｏｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：２５−３８（１９８２）；Ｅａｒｌら，「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」，Ａｕｓｕｂｅｌら編，ニューヨークのＧｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１年）発行，１６．１６．１−１６．１６．７；Ｃｈｉｌｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４（２）：６２５−９（１９９０）；Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８８：２１７−２３２（１９９２）；米国特許第４，６０３，１１２号明細書、同第４，７２２，８４８号明細書、同第４，７６９，３３０号明細書、同第５，１１０，５８７号明細書、同第５，１７４，９９３号明細書、同第５，１８５，１４６号明細書、同第５，２６６，３１３号明細書、同第５，５０５，９４１号明細書、同第５，８６３，５４２号明細書及び同第５，９４２，２３５号明細書）。
（Ｅ） アジュバント
ＨＣＶワクチンはアジュバントと一緒に処方され得る。アジュバントはＤＮＡプラスミドワクチンのために特に有用である。アジュバントの例はミョウバン、ＡｌＰＯ４、アルヒドロゲル、リピド−Ａ及びその誘導体または変異体、フロインド不完全アジュバント、中性レポソーム、ワクチン及びサイトカインを含むリポソーム、ノニオン性ブロックコポリマー及びケモカインである。
ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）及びポリオキシルプロピレン（ＰＯＰ）を含むノニオン性ブロックポリマー、例えばＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーがアジユバントとして使用され得る（Ｎｅｗｍａｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｏｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１５：８９−１４２（１９９８））。核酸の免疫応答はノニオン性ブロックコポリマーとアニオン性界面活性剤を併用して強化され得る。
アジュバント処方物の特定例は、ＣＲＬ−１００５（ＣｙｔＲｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）、ＤＮＡ及びベンジルアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）を含むものである。前記処方物は、ＰＢＳ中にプラスミドＤＮＡを含む冷（＜５℃）溶液に純粋なポリマーをポジティブ置換ビペットを用いて添加することにより調製され得る。次いで、前記溶液を撹拌して、ポリマーを可溶化する。ポリマーが完全溶解したら、ポリマーの曇点（から６−７℃）以下の温度で透明な溶液が得られる。次いで、ＰＢＳ中に溶解したＢＡＫの希溶液をゆっくり添加することにより約４ｍＭ ＢＡＫをＰＢＳ中ＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５溶液に添加する。ポリマー及びＢＡＫ添加前の初期ＤＮＡ濃度は約６ｍｇ／ｍｌであり、最終濃度は約５ｍｇ／ｍｌである。ＢＡＫを添加後、処方物を十分に撹拌し、その間に温度は〜２℃から曇点以上に上昇する。次いで、処方物を氷上に置いて、温度を曇点以下に下げる。その後、処方物を撹拌すると、温度は〜２℃から曇点以上に上昇する。動的光散乱により測定して処方物の粒径が約２００〜５００ｎｍに達するまで温度を〜２℃から曇点以上に上昇させながら冷却及び混合を数回繰り返す。次いで、溶液が透明になるまで処方物を氷上に保存した後、−７０℃で保存する。使用前に、処方物を室温まで融解させる。
（Ｆ） ワクチン貯蔵
アデノベクター及びＤＮＡワクチンは各種タイプの緩衝液を用いて貯蔵され得る。例えば、以下の実施例９に記載の緩衝液Ａ１０５をベクター貯蔵のために使用し得る。
ＤＮＡの貯蔵は、微量金属イオンを除去またはキレート化することにより向上され得る。ＤＮＡワクチンの安定性を向上させるためにコハク酸やリンゴ酸のような試薬及びキレート剤を使用し得る。キレート剤の例には、複数のホスフェートリガンド及びＥＤＴＡが含まれる。ＤＮＡプラスミドのダメージを遊離ラジカル生成から保護するために非還元性フリーラジカルスカベンジャー（例えば、エタノールまたはグリセロール）の配合も有用であり得る。更に、緩衝液タイプ、ｐＨ、塩濃度、露光及びバイアルを作成するために使用される滅菌方法のタイプをＤＮＡワクチンの安定性を最適化するために処方物中で調節してもよい。
以下、本発明の各種要件を更に説明するために実施例を提示する。これらの実施例は本発明を実施するために有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
（実施例１）
Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセット
ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードする各種遺伝子発現カセットを１ｂサブタイプＨＣＶ ＢＫ株をベースとして構築した。コードされる配列は、（１）活性ＮＳ５Ｂ配列（“ＮＳ”）、（２）不活性ＮＳ５Ｂ配列（“ＮＳｍｕｔ”）、または（３）不活性ＮＳ５Ｂ配列を有するコドン最適化配列（“ＮＳＯＰＴｍｕｔ”）を有していた。前記発現カセットはＣＭＶプロモーター／エンハンサー及びＢＧＨポリアデニル化シグナルも含んでいた。
ＮＳヌクレオチド配列（配列番号５）はＨＣＶ ＢＫ株（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５８３３５）と５９５２個のヌクレオチド中３０個のみ異なっている。ＮＳアミノ酸配列（配列番号６）は対応の１ｂ遺伝子型ＨＣＶ ＢＫ株と１９８４個のアミノ酸中７個のみ異なっている。翻訳を開始するために、ＡＴＧコドンがＮＳ配列の５’末端に存在している。ＴＧＡ終止配列がＮＳ配列の３’末端に存在している。
ＮＳｍｕｔヌクレオチド配列（配列番号２，図２）はＮＳ配列に類似している。ＮＳｍｕｔとＮＳの違いとして、ＮＳｍｕｔが改変ＮＳ５Ｂ触媒部位、５’末端に最適リボソーム結合部位及び３’末端にＴＡＡＡ終止配列を有していることが挙げられる。ＮＳ５Ｂの改変はアミノ酸１７１１〜１７１３をコードする塩基５１３８〜５１４６を含む。この改変の結果、アミノ酸ＧｌｙＡｓｐＡｓｐがＡｌａＡｌａＧｌｙに変化し、不活性形態ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＮＳ５Ｂが生ずる。
ＮＳＯＰＴｍｕｔ配列（配列番号３，図３）をＮＳｍｕｔによりコードされるアミノ酸配列をベースとして設計した。ＮＳｍｕｔアミノ酸配列をＧＣＧ（ウィスコンシンパッケージ バージョン１０；ウィスコンシン州マディソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））ＢＬＡＣＫＴＲＡＮＳＬＡＴＥプログラムを用いてヌクレオチド配列に逆翻訳した。各アミノ酸が対応する最も頻繁に見られるヒトコドンによりコードされるＮＳＯＰＴｍｕｔヌクレオチド配列を作成するために、パラメーターとして最もありそうなヌクレオチド配列の作成を選択し、翻訳スキームとしてＧＣＧパッケージ内で利用可能な高発現ヒト遺伝子のコドン出現頻度表（ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ）を特定して前記プログラムを実行した。
（実施例２）
ＮＳ、ＮＳｍｕｔまたはＮＳＯＰＴｍｕｔ配列を有するｐＶ１Ｊｎｓプラスミドの作成
ＮＳ配列、ＮＳｍｕｔ配列またはＮＳＯＰＴｍｕｔ配列のいずれかを含むｐＶ１Ｊｎｓプラスミドを以下のように作成し、特徴づけた。
ＮＳ配列を有するｐＶ１Ｊｎｓプラスミド
ＨＣＶ ＢＫタイプ株由来のコード領域Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ及びコード領域Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ（Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４０１７−４０２６（１９９３））をｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、それぞれｐｃＤ３−５ａ及びｐｃＤ３−５ｂを作成した。ＰｃＤ３−５ＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウ充填で平滑末端化し、その後ＸｂａＩで消化して、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａのコード領域に対応する断片を作成した。この断片をｐＶ１Ｊｎｓ−ｐｏｌｙにクローン化し、ＢｇｌＩＩで消化し、クレノウ充填で平滑末端化し、その後ＸｂａＩで消化して、ｐＶ１ＪｎｓＮＳ３−５Ａを作成した。
ｐＶ１Ｊｎｓ−ｐｏｌｙは、ＸｂａＩ、ＰｍｅＩ、ＰａｃＩに対する認識部位を含むポリリンカーをユニークＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩ制限部位に挿入することにより修飾したｐＶ１ＪｎｓＡプラスミド（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２：７７７−７８３（１９９３））の誘導体である。ＮＳ配列を有するｐＶ１Ｊｎｓ（ｐＶ１ＪｎｓＮＳ３−５Ｂ）は、ＸｂａＩ及びＮｏｔＩ消化で直線化したｐＶ１ＪＮ３−５Ａと約２００ｂｐのＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂコード領域及び約６０ｂｐのＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むＰＣＲ断片とを同時形質転換させる細菌株ＢＪ５１８３への相同組換えにより得られた。生じたプラスミドをｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳと称する。
ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳは以下のように要約され得る：
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１〜１８８１、
追加 ＡＧＣＴＴ、
次に Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列（配列番号５）、
次に ｗｔ ＴＧＡストップ、
追加 ＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧ（配列番号１４）、
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１９１２〜４９０９。
ＮＳｍｕｔ配列を有するｐＶ１Ｊｎｓプラスミド
Ｖ１ＪｎｓＮＳ３−５Ａを、完全コザック配列の付加によりＮＳ３コード配列の５’において修飾した。プラスミド（Ｖ１ＪＮＳ３−５Ａコザック）は、ＡｆｌＩＩ消化により直線化したＶ１ＪＮＳ３−５Ａと、イントロンＡの近位部分、制限部位ＢｇｌＩＩ、完全コザック翻訳開始配列及びＮＳ３コード配列の一部を含むＰＣＲ断片とを同時形質転換させる細菌株ＢＪ５１８３への相同組換えにより得られた。
生じたプラスミド（Ｖ１ＪＮＳ３−５Ａコザック）をＸｂａＩ消化により直線化し、約２００ｂｐのＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ変異配列、強翻訳停止ＴＡＡＡ及び約６０ｂｐのＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むＰＣＲ断片と共に細菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換した。増幅のために使用されるオリゴヌクレオチドにより変異を導入した２２ｂｐ重複断片を２つ組合せることによりＰＣＲ断片を得た。生じたプラスミドをｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳｍｕｔと称する。
ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳｍｕｔは以下のように要約され得る：
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１〜１８８２、
次に コザックＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ（ｍｕｔ）ＴＡＡＡ配列（配列番号２）、
追加 ＴＣＴＡＧＡ、
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１９２５〜４９０９。
ＮＳＯＰＴｍｕｔ配列を有するｐＶ１Ｊｎｓプラスミド
酵素活性を阻害するための変異ＮＳ５Ｂ、完全コザック翻訳開始配列及び強翻訳停止を有するヒトコドン最適化合成遺伝子（ＮＳＯＰＴｍｕｔ）を遺伝子の５’及び３’末端に存在するＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限部位で消化した。次いで、遺伝子をｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドのポリリンカー中に存在するＢｇｌＩＩ及びＳａｌＩ制限部位にクローン化して、ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔを作成した。
ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔは以下のように要約され得る：
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１〜１８８１、
追加 Ｃ、
次に コザックＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ（ｏｐｔｍｕｔ）ＴＡＡＡ配列（配列番号３）、
追加 ＴＴＴＡＡＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１５）、
塩基 ｐＶ１ＪｎｓＡの１９０５〜４９０９。
プラスミドの特徴づけ
Ｌ−グルタミン（最終４ｍＭ）を補充した１０％ ＦＣＳ／ＤＭＥＭにおいて増殖させたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによりＨＣＶ ＮＳタンパク質の発現を試験した。トランスフェクションの２４時間前に、トランスフェクション日に９０〜９５％集密度に達するまで細胞を直径３５ｍｍの６ウェルにおいて平板培養した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００試薬を用いて、ラウス肉腫ウイルスプロモーターの制御下で４０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（非飽和ＤＮＡ量として前もって測定）を１００ｎｇのルシフェラーゼリポーター遺伝子を含むｐＲＳＶ−Ｌｕｃプラスミドと同時トランスフェクトした。細胞をＣＯ２インキュベーター中３７℃において４８時間保持した。
細胞抽出物を１％ トリトン／ＴＥＮ緩衝液中で調製した。この抽出物をルシフェラーゼ活性について正規化し、１０％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲル上で連続希釈で流した。タンパク質をニトロセルロースに移し、発現強度及び適正なタンパク質分解開裂を評価するためにＮＳ３、ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂに対する抗体を用いてアッセイした。偽トランスフェクトした細胞をネガティブコントロールとして用いた。ｐＶ１ＪｎｓＮＳ、ｐＶ１ＪｎｓＮＳｍｕｔ及びｐＶ１ＪｎｓＮＳＯＰＴｍｕｔを試験した代表的な実験の結果を図１２に示す。
（実施例３）
プラスミドＤＮＡベクターを用いるマウス免疫化
抗−ＨＣＶ免疫応答を誘発する可能性を評価するために、各種マウス株にＤＮＡプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳ、ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳｍｕｔ及びｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔを注射した。２種の株（Ｂａｌｂ／Ｃ及びＣ５７Ｂｌａｃｋ６，Ｎ＝９−１０）に対してＤＮＡ（２５または５０μｇ）を筋肉内注射した後電気パルスを加えた。各動物に対して３週間間隔で２回投与した。
Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスにおいてＮＳ３タンパク質に対して誘発された体液性免疫応答を投与後の２つの血清中で細菌発現したＮＳ３プロテアーゼドメインに対するＥＬＩＳＡにより測定した。試験抗原に対して特異的な抗体が３つのすべてのベクターを用いて免疫化した動物で検出され、幾何平均（相乗平均）力価（ＧＭＴ）は９４０００〜１３３０００であった（表１〜３）。
Figure 0004475561
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３週間間隔でプラスミドＤＮＡ（２５μｇ）を２回筋肉内注射して免疫化したＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウスにおいてＴ細胞応答を調べた。定量ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを実施して、ＮＳ３−ＭＳ５Ｂ配列を包含する１０残基が重複している２０ｍｅｒペプチドの５プールに応答してＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数を測定した。特異的ＣＤ８＋応答を、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスの場合にはＣＤ８＋エピトープを包含する２０ｍｅｒペプチド（ｐｅｐ１４８０）を用いて同一アッセイにより分析した。
ＩＦＮγを抗原特異的に分泌する細胞を標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて検出した。３週間間隔でプラスミドＤＮＡ（５０μｇ）を２回筋肉内注射して免疫化したＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウスにおけるＴ細胞応答を、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列を包含する１０残基が重複している２０ｍｅｒペプチドの５プールに応答してＩＦＮγを分泌するＴ細胞の数を測定する同一のＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
免疫化マウスから脾臓細胞を作成し、Ｒ１０培地（１０％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５０μＭ ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁した。マルチスクリーン９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのカタログ番号ＭＡＩＰＳ４５１０；マサチューセッツ州アッシュビー・ロード・ベッドフォードに所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を精製ラット抗−マウスＩＦＮ−γ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎのカタログ番号１８１８１Ｄ；カリフォルニア州サンジェゴに所在のＰｈａｒｍｉＭｉｎｇｅｎ）で被覆した。一晩インキュベート後、プレートをＰＢＳ １×／０．００５％ ツイーンで洗浄し、Ｒ１０培地（２５０μｌ／ウェル）でブロックした。
免疫化マウスから脾細胞を作成し、２．５×１０５／ウエルまたは５×１０５／ウエルの密度で１０μＭ ペプチドの存在または非存在下で２４時間インキュベートした。十分洗浄（ＰＢＳ １×／０．００５％ ツイーン）した後、ビオチニル化ラット抗−マウスＩＦＮγ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎのカタログ番号１８１１２Ｄ；カリフォルニア州サンディェゴに所在のＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を添加し、４℃において一晩インキュベートした。展開のために、ストレプトアビジン−ＡＫＰ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎのカタログ番号１３０４３Ｅ；カリフォルニア州サンジェゴに所在のＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）及び１−Ｓｔｅｐ（商標）ＮＢＴ−ＢＣＩＰ展開溶液（Ｐｉｅｒｃｅのカタログ番号３４０４２；イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅ）を添加した。
ＨＣＶ ＢＫ株ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂの全配列を包含する２０ｍｅｒ重複ペプチドのプールを用いて、ＨＣＶ特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞を明らかとした。同様に、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスの場合には、ＣＤ８応答を検出するためにＣＤ８＋エピトープを包含する１つの２０ｍｅｒペプチドを用いた。プラスミドベクターｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳ、ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳｍｕｔ及びｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ（２５〜５０μｇ）を２回注射して免疫化したＣ５７Ｂｌａｃｋ６及びＢａｌｂ／Ｃマウス（Ｎ＝９−１０）のグループの代表的データーを図１３Ａ及び１３Ｂに示す。
（実施例４）
アカゲサルの免疫化
７．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ１００５、０．６ｍＭ ベンザルコニウムクロリド中のプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ（５ｍｇ）を筋肉内注射することによりアカゲザル（Ｎ＝３）を免疫化した。各動物の三角筋に０及び４週目に２回注射した。
ＣＭＩをＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによりいろいろな時間に測定した。このアッセイはＨＣＶ抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を測定し、ヒト、アカゲザル、マウス及びラットのような各種哺乳動物に対して使用され得る。
特定ペプチド及びペプチドプールを使用すると、ＣＴＬ細胞毒性アッセイ、インターフェロン−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びインターフェロン−γ細胞内染色アッセイにおける抗原提示を単純化し得る。各種ＨＣＶタンパク質（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂ）のアミノ酸配列をベースとするペプチドを、ＨＣＶ ＤＮＡ、アデノウイルスベクターワクチン接種したアカゲザル及びＨＣＶ感染ヒトにおける免疫応答を調べるために上記アッセイで使用するために作成した。各ペプチドは、１０アミノ酸で埋め合わされる重複２０ｍｅｒである。大プールのペプチドはＨＣＶタンパク質に対する全応答を検出するために使用され得、小プールのペプチド及び各ペプチドは応答のエピトープ特異性を規定するために使用され得る。
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりＨＣＶ特異的Ｔリンパ球応答が定量測定される。ＰＢＭＣを連続希釈し、抗−アカゲザルＩＦＮ−γ抗体（ＭＤ−１ Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ）を被覆したマイクロプレートウェルに置く。これらをＨＣＶペプチドプールと２０時間培養すると、前駆体細胞の再刺激及びＩＦＮ−γの分泌が生じる。細胞を洗浄すると、細胞が存在している濃厚域に抗体被覆ウェルに結合した分泌ＩＦＮが残る。捕捉ＩＦＮはビオチニル化抗−アカゲザルＩＦＮ抗体（デテクターＡｂ Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ）及びアルカリホスファターゼコンジュゲートストレプトアビジン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ １３０４３Ｅ）を順次用いて検出する。不溶性アルカリホスファターゼ基質を添加すると、ウェル中の細胞が存在する場所に暗いスポットが生じ、ＩＦＮ−γを分泌したＴ細胞毎に１つのスポットが残る。
ウェルあたりのスポットの数は抗原特異的Ｔ細胞の前駆体頻度に直接関連している。γ−インターフェロンが最も一般的であり、活性化Ｔリンパ球により合成、分泌される最も豊富なサイトカインの１つであるので、これを（特定の抗−γインターフェロンモノクローナル抗体を用いる）本アッセイで可視化されるサイトカインとして選択した。このアッセイでは、１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数をペプチド抗原の存在及び非存在（培地コントロール）下でサンプル毎に測定する。２つの材料を投与後のＰＢＭＣについてのアカゲザルからのデーターを表４に示す。
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（実施例５）
Ａｄ６プリアデノウイルスプラスミドの構築
Ａｄ６プレアデノウイルスプラスミドを以下のように得た。
ｐＡｄ６ Ｅ１−Ｅ３＋プレアデノウイルスプラスミドの構築
第１世代Ａｄ６ベクターを作成するために使用され得るＡｄ６ベースのプレアデノウイルスプラスミドを、Ａｄ５とＡｄ６間の広い配列同一性（約９８％）を利用するかまたはＡｄ６領域のみを含めて構築した。ｗｔＡｄ６配列を細菌プラスミドにクローン化するために相同組換えを使用した。
Ａｄ５領域及びＡｄ６領域を含む細菌プラスミドとしてｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋を回収するために使用される一般的方法を図１０に示す。ＢＪ５１８３細菌を精製ｗｔＡｄ６ウイルスＤＮＡ及びＡｄ５ ＩＴＲカセットと称される第２ＤＮＡ断片を用いて同時形質転換すると、相同組換えによりウイルスゲノムが回付(circularization)した。ＩＴＲカセットは、細菌性複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により分離されるＡｄ５ゲノムの右端（ｂｐ３３７９８〜３５９３５）及び左端（ｂｐ１〜３４１及びｂｐ３５２５〜５７６７）由来の配列を含む。ＩＴＲカセットはＡｄ５ ３４２〜３５２４のＥ１配列の欠失を含む。ＩＴＲカセット中のＡｄ５配列により、組換えが起こり得る精製Ａｄ６ウイルスＤＮＡと相同な領域が生ずる。
可能性あるクローンを制限分析によりスクリーニングし、１つのクローンをｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋として選択した。次いで、このクローンを完全に配列分析した。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋は、ｂｐ１〜３４１及びｂｐ３５２５〜５５４８のＡｄ５配列、Ａｄ６ ｂｐ５５４２〜３３７８４、Ａｄ５ ｂｐ３３９６７〜３５９３５を含む（ｂｐの数はＡｄ５及びＡｄ６のｗｔ配列を指す）。ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋は、血清型特異性を構成する全てのＡｄ６ビリオン構造タンパク質に対するコード配列を含んでいる。
Ａｄ６領域を含む細菌プラスミドとしてｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋を回収するために使用される一般的方法を図１１に示す。ＢＪ５１８３細菌を精製ｗｔ Ａｄ６ウイルスＤＮＡ及びＡｄ６ ＩＴＲカセットと称される第２ＤＮＡ断片を用いて同時形質転換すると、相同組換えによりウイルスゲノムが回付した。ＩＴＲカセットは、細菌性複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により分離されるＡｄ６ゲノムの右端（ｂｐ３５４６０〜３５７５９）及び左端（ｂｐ１〜４５０及びｂｐ３５０８〜３８０７）由来の配列を含んでいる。これら３つのセグメントをＰＣＲにより作成し、ｐＮＥＢ１９３に順次クローン化して、ｐＮＥＢＡｄ６−３（ＩＴＲカセット）を作成した。このＩＴＲカセットはＡｄ５ ４５１〜３５０７のＥ１配列の欠失を含む。ＩＴＲカセット中のＡｄ６配列により、組換えが起こり得る精製Ａｄ６ウイルスＤＮＡと相同な領域が生ずる。
ｐＡｄ６ Ｅ１−Ｅ３−プレアデノウイルスプラスミドの構築
Ａ５領域を含み、Ｅ３領域が欠失しているＡｄ６ベースのベクターを、Ａｄ５領域を含むｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋から始めて構築した。Ｅ３領域（Ａｄ６ ｂｐ２５８７１〜３１１９２）を含むｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋のＡ ５３２２ｂｐサブ断片をｐＡＢＳ．３にサブクローン化して、ｐＡＢＳＡｄ６Ｅ３を作成した。その後、このプラスミドにおいて３つのＥ３を欠失させて、３つの新しいプラスミドｐＡＢＳＡｄ６Ｅ３（１．８Ｋｂ）（Ａｄ６ ｂｐ２８６０２〜３０４４０欠失）、ｐＡＢＳＡｄ６Ｅ３（２．３Ｋｂ）（Ａｄ６ ｂｐ２８１５７〜３０４３７欠失）及びｐＡＢＳＡｄ６Ｅ３（２．６Ｋｂ）（Ａｄ６ ｂｐ２８１５７〜３０７８８欠失）を作成した。次いで、ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３＋に３つのＥ３欠失部を逆置換するために細菌組換えを使用して、Ａｄ６ゲノムプラスミドｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−１．８Ｋｂ、ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−２．３Ｋｂ及びｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−２．６Ｋｂを作成した。
（実施例６）
ＮＳ配列を有するＡｄ５ゲノムプラスミドの作成
コード領域ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａを含むｐｃＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＸｍｕＩ及びＮｒｕＩ制限部位で消化し、ＣＭＶプロモーター、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａコード領域及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＤｅｌＥ１ ＳｐａのユニークＥｃｏｒＶ制限部位にクローン化して、Ｓｖａ３−５Ａベクターを作成した。
コード領域ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂを含むｐｃＤＮＡ３プラスミドをＸｍｎＩ及びＥｃｏｒＩで消化（部分消化）し、ＮＳ５Ａの一部、ＮＳ５Ｂ遺伝子及びＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むＤＮＡ断片をＳｖａ３−５Ａベクターにクローン化し、ＥｃｏｒＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、クレノウで平滑末端化して、Ｓｖａ３−５Ｂベクターを作成した。
Ｓｖａ３−５Ｂベクターは最後に消化したＳｓｐＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉ制限部位であり、アデノウイルス配列に隣接している発現カセット（ＣＭＶプロモーター，ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂコード領域及びＢＧＨポリアデニル化シグナル）を含むＤＮＡ断片をｐＡｄ５ＨＶＯ（Ｅ１−，Ｅ３）ＣｌａＩ直線化ゲノムプラスミドと共に細菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換して、ｐＡｄ５ＨＶＯＮＳを作成した。ｐＡｄ５ＨＶＯはＡｄ ｂｐ１〜３４１、ｂｐ３５２５〜２８１３３及びｂｐ３０８１８〜３５９３５を含んでいる。
（実施例７）
ＮＳｍｕｔ配列を有するアデノウイルスゲノムプラスミドの作成
ＮＳ−ｍｕｔ配列を含むアデノウイルスゲノムプラスミドをＡｄ５またはＡｄ６バックグラウンドで作成した。Ａｄ６バックグラウンドは塩基１〜４５０、３５１１〜５５４８及び３３９６７〜３５９３５でＡｄ５領域を含んでいた。
ｐＶ１ＪＮ３−５ＡコザックをＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で消化し、コザック配列及びＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａをコードする配列を含むＤＮＡ断片をＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ消化ポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトルベクターにクローン化した。生じたベクターをｓｈＮＳ３−５Ａコザックと称した。
ポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１はＢｇｌＩＩ、ＰｍｅＩ、ＳｗａＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩに対する認識部位を含むポリリンカーをＣＭＶプロモーターの下流に存在するユニークＢｇｌＩＩ制限部位に挿入することにより修飾したＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）の誘導体である。ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、ｂｐ４５１〜３５１０のＥ１配列を欠失させたｂｐ１〜５７９２のＡｄ５配列を含む。ヒトＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリアデニル化シグナルをそれらを分離するユニークＢｇｌＩＩ部位とＥ１平行方位のＥ１欠失部に挿入した。
酵素活性を阻害するように変異させた、３’末端に強翻訳停止を有するＮＳ５Ｂ断片をアセンブリＰＣＲにより得、相同組換えによりｓｈＮＳ３−５Ａコザックベクターに挿入して、ポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１ＮＳｍｕｔを作成した。ポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１ＮＳｍｕｔでは、ＮＳ−ｍｕｔコード配列はＣＭＶプロモーターの制御下にあり、ＢＧＨポリアデニル化シグナルは下流に存在している。
遺伝子発現カセット及び相同組換えし得るアデノウイルス配列を含む隣接領域をＰａｃＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉ制限酵素を用いる消化により切り出し、ｐＡｄ５ＨＶＯ（Ｅ１−，Ｅ３−）またはｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−２．６Ｋｂ ＣｌａＩ直線化ゲノムプラスミドと共に細菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換して、それぞれｐＡｄ５ＨＶＯＮＳｍｕｔ及びｐＡｄ６Ｅ１−，Ｅ３−ＮＳｍｕｔを作成した。
ｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−２．６Ｋｂは、Ａｄ５ ｂｐ１〜３４１及びｂｐ３５２５〜５５４８、Ａｄ６ ｂｐ５５４２〜２８１５７及びｂｐ ３０７８８〜３３７８４、Ａｄ５ ｂｐ３３９６７〜３５９３５を含んでいる（ｂｐの数はＡｄ５及びＡｄ６の両方に対するｗｔ配列を指す）。いずれのプラスミドでも、ウイルスＩＴＲは細菌性複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミド配列により連結されている。
（実施例８）
ＮＳＯＰＴｍｕｔを有するアデノウイルスゲノムプラスミドの作成
ｐＣＲＢｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した配列番号３のヒトコドン−最適化合成遺伝子（ＮＳＯＰＴｍｕｔ）をＢａｍＨ１及びＳａｌＩ制限酵素で消化し、シャトルベクターポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１中に存在するＢｇｌＩＶ及びＳａｌＩ制限部位にクローン化した。生じたクローン（ポリｐＭＲＫｐｄｅｌＥ１ＮＳＯＰＴｍｕｔ）をＰａｃＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉ制限酵素で消化し、ｐＡｄ５ＨＶＯ（Ｅ１−，Ｅ３−）またはｐＡｄ６Ｅ１−Ｅ３−２．６Ｋｂ ＣｌａＩ直線化ゲノムプラスミドと共に細菌株ＢＪ５１８３に同時形質転換して、それぞれｐＡｄ５ＨＶＯＮＳＯＰＴｍｕｔ及びｐＡｄ６Ｅ１−，Ｅ３−ＮＳＯＰＴｍｕｔを作成した。
（実施例９）
アデノウイルスベクターのレスキュー及び増幅
アデノベクターをＰｅｒ．６細胞においてレスキューした。Ｐｅｒ．Ｃ６を、Ｌ−グルタミン（最終４ｍＭ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（最終１００Ｕ／ｍｌ）及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を補充した１０％ ＦＣＳ／ＤＭＥＭにおいて増殖した。感染後、細胞を５％ ウマ血清（ＨＳ）を補充した同一培地において維持した。ウイルスレスキューのために、２．５×１０６個のＰｅｒ．Ｃ６を６ｃｍΦペトリ皿において平板培養した。
平板培養から２４時間後、ＰａｃＩ直線化アデノウイルスＤＮＡ（１０μｇ）を用いてリン酸カルシウム法により細胞をトランスフェクトした。ＤＮＡ沈殿を細胞上に４時間放置した。培地を除去し、５％ ＨＳ／ＤＭＥＭを添加した。
細胞変性効果が目に見えるまで（１週間）細胞をＣＯ２インキュベーター中で維持した。細胞及び上清を回収し、凍結／融解サイクル（液体窒素／３７℃の水浴）に３回かけた。ライセートを−４℃において３０００ｒｐｍで２０分間遠心し、回収した上清（細胞上に１回通したウイルスを含有する細胞ライセートに対応；Ｐ１）を１０ｃｍΦペトリ皿において８０〜９０％集密度のＰｅｒ．Ｃ６を感染させるために１ｍｌ／皿の量で使用した。感染させた細胞を細胞変性効果が目に見えるまでインキュベートし、細胞及び上清を回収し、ライセートを上記したように作成した（Ｐ２）。
２×１５ｃｍΦペトリ皿を感染させるためにＰ２ライセート（４ｍｌ）を使用した。この感染から回収したライセート（Ｐ３）を大きなウイルス調製物に対する出発点として使用されるウイルスストックとして複数のアリコートで−８０℃において保存した。この場合、２×１５ｃｍΦペトリ皿を感染させるためには１ｍｌのストックで十分であり、生じたライセート（Ｐ４）を大規模感染のためのペトリ皿の感染用に使用した。
ＦＣＳを含まない培地で希釈し、１０ｍｌ／皿の量で３０×１５ｃｍΦペトリ皿（８０〜９０％集密度のＰｅｒ．Ｃ６を含む）を感染させるために使用したＰ４ライセートから更なる増幅物を得た。細胞をＣＯ２インキュベーター中で２０分ごとに緩やかに混合しながら１時間インキュベートした。１２ｍｌ／皿の５％ ＨＳ／ＤＭＥＭを添加し、細胞変性効果が目に見えるまで（約４８時間）細胞をインキュベートした。
細胞及び上清を集め、４℃において２０００ｒｐｍで２０分間遠心した。ペレットを０．１Ｍ トリス（ｐＨ８．０）（１５ｍｌ）中に再懸濁した。細胞を凍結／融解サイクル（液体窒素／３７℃の水浴）に３回かけて溶解した。２Ｍ ＭｇＣｌ２（１５０μｌ）及びＤＮＡｓｅ（１０ｍｌの２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ジチオトレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、５０％ グリセロール中１０ｍｇ ウシ膵デオキシリボヌクレアーゼＩ）（７５μｌ）を添加した。水浴において３７℃において１時間インキュベート（１５分毎に撹拌）した後、ライセートを４℃において４０００ｒｐｍで１５分間遠心した。回収した上清を直ちにＣｓＣｌ勾配にかけた。
ＣｓＣｌ勾配は、ＳＷ４０無菌チューブにおいて次のように作成した：
１．５ｄ ＣｓＣｌ（０．５ｍｌ）、
１．３５ｄ ＣｓＣｌ（３ｍｌ）、
１．２５ｄ ＣｓＣｌ（３ｍｌ）、
ウイルス上清（５ｍｌ／チューブ）を適用した。
所要により、チューブの上部に０．１Ｍ トリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）を満たした。チューブを−１０℃においてローターＳＷ４０を用いて３５０００ｒｐｍで１時間遠心した。（１．２５／１．３５インターフェースに位置する）ウイルスバンドを注射器により集めた。
ウイルスを新しいＳＷ４０無菌チューブに移し、１．３５ｄ ＣｓＣｌをチューブの上部に満たした。１０℃においてローターＳＷ４０において３５０００ｒｐｍで２４時間遠心後、ウイルスをできるだけ少量で集め、緩衝液Ａ １０５（５ｍＭ トリス，５％ スクロース，７５ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．００５％ ポリソルベート８０（ｐＨ８．０））に対して徹底的に透析した。透析後、グリセロールを最終１０％まで添加し、ウイルスを−８０℃において複数のアリコートで保存した。
（実施例１０）
強化アデノベクターレスキュー
ＨＣＶ ＮＳＯＰＴｍｕｔ導入遺伝子を有する第１世代Ａｄ５及びＡｄ６ベクターはレスキューしがたいことが判明した。レスキュー過程の考えられる障害はアデノウイルスの複製機構のための最適以下鋳型であるプラスミドＤＮＡの複製が効率的でないことに起因するであろう。ベクターのＥ１領域に挿入された導入遺伝子の非常に高いＧ−Ｃ含量に関連して、（通常ウイルスＤＮＡ中に存在する）ＤＮＡの５’末端に連結している末端タンパク質が不在であるために、プラスミド誘導アデノウイルスの複製速度が実質的に低減し得る。
Ａｄベクターをレスキューするためのより効率的で再現性の手順を確立するために、ｔｅｔ−誘導性プロモーターの制御下で全てのＥ２タンパク質（ポリメラーゼ、プレ末端タンパク質及びＤＮＡ結合タンパク質）及びＥ４ ｏｒｆ６を含む発現ベクター（ｐＥ２；図１９）を用いた。ＰｅｒＣ６及び２９３にｐＥ２及び一般的なプレアデノプラスミドをトランスフェクトすることにより、Ａｄ ＤＮＡ複製が非常に向上し、完全な感染性アデノウイルス粒子がより効率的に生じる。
プラスミド構築
ｐＥ２はクローニングベクターｐＢＩ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）をベースとし、細胞培養においてエピソームを複製し、選択するために２つの要素、すなわち（１）ＥＢＮＡ−１を発現させるときに細胞サイクルと同期してプラスミドを複製できるＥＢＶ−ＯｒｉＰ（ＥＢＶ［ｎｔ］７４２１−８０４２）領域及び（２）形質転換した細胞をポジティブ選択し得るハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）耐性遺伝子を加えた。アデノウイルス遺伝子Ｅ２ａ及びｂ及びＥ４−Ｏｒｆ６に対する２つの転写単位を構築し、下記するようにｐＥ２において合わせた。
Ａｄ５−ポリメラーゼＣｌａＩ／ＳｐｈＩ断片及びＡｄ５−ｐＴＰ Ａｃｃ６５／ＥｃｏＲＶ断片をｐＶａｃ−Ｐｏｌ及びｐＶａｃ−ｐＴＰ（Ｓｔｕｎｎｅｍｂｅｒｇら，ＮＡＲ，１６：２４３１−２４４４（１９８８））から得た。両断片にクレノウを充填し、ｐＢＩのＳａｌＩ（充填）及びＥｃｏＲＶ部位にクローン化して、それぞれｐＢＩ−Ｐｏｌ／ｐＴＰを得た。
ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＥＢＶ−ＯｒｉＰ要素をまずｐＪＣ１３−１（Ｃｈｕｎｇら，Ｃｅｌｌ，７４（３）：５０５−１４（１９９３））のＢａｍＨＩ部位にクローン化することにより２つのトリβ−グロビン隔離体ダイマー内に挿入した。次いで、ｐＪＣ１３−ＯｒｉＰ由来のＨＳ４−ＯｒｉＰ断片をｐＳＡ１ｍｖ（ｔｋ−Ｈｙｇｒｏ−Ｂ耐性遺伝子発現カセット及びＡｄ５複製起点を含むプラスミド）内部にクローン化した。ここで、ＩＴＲを頭−尾ジャンクションとして配置し、ｐＦＧ１４０（Ｇｒａｈａｎ，ＥＭＢＯ Ｊ．，３：２９１７−２９２２（１９８４））から５’−ＴＣＧＡＡＴＣＧＡＴＡＣＧＣＧＡＡＣＣＴＡＣＧＣ−３’（配列番号１６）及び５’−ＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＣＧＣＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＧＴＣ−３’（配列番号１７）のプライマーを用いてＰＣＲにより得た。こうして、ｐＭＶＨＳ４Ｏｒｉｐを作成した。次いで、隔離Ｏｒｉｐ、Ａｄ５ ＩＴＲジャンクション及びｔｋ−ＨｙｇｒｏＢカセットを含むｐＭＶＨＳ４Ｏｒｉｐ由来のＤＮＡ断片をＡｓｅＩ／ＡａｔＩＩ制限ｐＢＩ−Ｐｏｌ／ｐＴＰに挿入して、ｐＢＩ−Ｐｏｌ／ｐＴＰＨＳ４を作成した。
Ａｄ５−Ｏｒｆ６及びＡｄ５−ＤＢＰを発現する第２転写単位を構築するために、ＰＣＲにより得たＥ４ｏｒｆ６（Ａｄ５［ｎｔ］３３１９３−３４０７７）をまずｐＢＩベクターに挿入して、ｐＢＩ−Ｏｒｆ６を作成した。その後、ＤＢＰコーディングＤＮＡ配列（Ａｄ５［ｎｔ］２２４４３−２４０３２）をｐＢＩ−Ｏｒｆ６に挿入して、第２の双方向的Ｔｅｔ調節発現ベクター（ｐＢＩ−ＤＢＰ／Ｅ４Ｏｒｆ６）を得た。ｐＢＩ中に存在するオリジナルのポリＡシグナルをＢＧＨ及びＳＶ４０ポリＡで置換した。
次いで、頭−尾ジャンクションで配置したＡｄｅｎｏ５−ＩＴＲ及びプラスミドｐＳＡ−１ｍｖから得たハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入することによりｐＢＩ−ＤＢＰ／Ｅ４ｏｒｆ６を修飾した。次いで、この新しいプラスミドｐＢＩ−ＤＢＰ／Ｅ４ｏｒｆ６シャトルをドナープラスミドとして使用して、第２ｔｅｔ−調節転写単位を、ｐＥ２を保有する大腸菌株ＢＪ５１８３を用いる相同組換えによりｐＢＩ−Ｐｏｌ／ｐＴＰＨＳ４に挿入した。
細胞株、トランスフェクション及びウイルス増幅
ＰｅｒＣ６細胞を、１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及び２ｍＭ グルタミンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。
全ての一時的トランスフェクションをリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者が指示するように用いて実施した。６ｃｍプレートにおいて平板培養した９０％集密度のＰＥＲＣ．６（商標）をＡｄ５／６ＮＳＯＰＴｍｕｔプレアデノプラスミド（３．５μｇ）でトランスフェクトし、ＰａｃＩを単独でまたはｐＥ２（５μｇ）＋ｐＵＨＤ５２．１（１μｇ）の組合せで用いて消化した。ｐＵＨＤ５２．１は逆ｔｅｔトランスアクティベーター２（ｒｔＴＡ２）（Ｕｒｌｉｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７（１４）：７９６３−７９６８（２０００））に対する発現ベクターである。トランスフェクション時に、ｐＥ２発現を活性化するために、細胞を１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下で培養した。トランスフェクションから７日後、細胞を回収し、細胞ライセートを凍結／融解サイクルを３回実施して得た。細胞ライセート（２ｍｌ）を使用して、第２のＰｅｒＣ６の６ｃｍ皿を感染させた。感染細胞を、完全ＣＰＥが観察されるまで培養した後、回収した。ウイルスを上記したように５回連続継代した後、ＣｓＣｌ勾配で精製した。精製ウイルスのＤＮＡ構造をエンドヌクレアーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動分析によりコントロールし、元のプレアデノプラスミド制限パターンと比較した。
（実施例１１）
ＨＣＶポリタンパク質コード化核酸の部分最適化
ヒト宿主での発現のために最適化したコドンを含むアデノベクターの作成を促進するためにＨＣＶポリタンパク質コード化核酸の部分最適化を実施した。総合的目的は、ＨＣＶポリタンパク質をコードするアデノベクターの作成を促進しながらコドン最適化により高い発現を与えることであった。
ヒト宿主での発現のために最適化したコドンを含むＨＣＶタンパク質をコードするアデノベクターを作成する際に幾つかの困難を経験した。最適化配列（配列番号３）を含むアデノベクターは、非最適化配列（配列番号２）を含むアデノベクターよりも合成及びレスキューが困難であることが判明した。
配列番号３を含むアデノベクターを作成する際の困難は高いＧＣ含量に起因していた。特に厄介な領域はＮＳＯＰＴｍｕｔ（配列番号３）の約Ｎｏ．３９００の領域である。
アデノベクター中での使用を容易とするために最適化ＨＣＶコード化核酸配列の別のバージョンを設計した。ＮＳＯＰＴｍｕｔと比較して、コード化ポリタンパク質及びそれぞれの開裂産物の発現を改善するように高レベルのコドン最適化を維持しながら低い全ＧＣ含量を有し、連続Ｇ’ｓ及びＣ’ｓの潜在的に問題のモチーフの存在が低下／解消するように別のバージョンを設計した。
コドンを次善に最適化した配列の作成の出発点はＮＳＯＰＴｍｕｔヌクレオチド配列のコード領域（配列番号３の塩基７〜５９６１）である。コドン使用頻度の値（各アミノ酸につき１．０の全値に正規化した）をウィスコンシン・パッケージ バージョン１０．３（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｉｎｃ．が１００％出資の子会社のＡｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．）で販売しているファイルｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄから得た。
局部及び全ＧＣ含量を低減するために、各アミノ酸毎に好ましいコドン置換を規定している表を手動で作成した。各アミノ酸について、１）最も一般的なコドンに比較して低いＧＣ含量及び２）比較的に多く観察されるコドン使用頻度（ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄに定義されている）を有するコドンを置換コドンとして選択した。例えば、Ａｒｇの場合、最高頻度のコドンはＣＧＣである。Ａｒｇをコードする他の５つの代替コドン（ＣＧＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＴ、ＧＧＡ）のうち、３つ（ＡＧＧ、ＣＧＴ、ＣＧＡ）は１塩基により、１つ（ＡＧＡ）は２塩基により、１つ（ＣＧＧ）は０塩基によりＧＣ含量を低減させる。ＡＧＡコドンはｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄに比較的低使用頻度（０．１）としてリストされているので、ＣＧＣを置換するコドンとして０．１８の相対頻度を有するＡＧＧが選択された。他のアミノ酸に対するコドン置換を確立するために同様の基準が適用され、表５に示すリストが作成された。以下の最適化手順で適用されるパラメーターは、生じる配列が十分に改善されたコドン使用（各アミノ酸について）を維持し、（全体及び保存Ｇ’ｓ及び／またはＣ’ｓの局部ストレッチの形態の）ＧＣ含量が減少するように実験的に決定された。
部分最適化ＨＣＶコード化配列の２つの例は配列番号１０及び配列番号１１である。配列番号１０は全体的に部分最適化されているＨＣＶコード化配列である。配列番号１１は部分最適化されている領域を除いてコドン使用について完全に最適化されているＨＣＶコード化配列である。
コドン最適化は以下の手順を用いて実施した：
段階１）
インプット完全最適化ＮＳＯＰＴｍｕｔ配列のコード領域を、各サイクル後１コドンだけスライディングウィンドをシフトする３コドン（９塩基）のスライディングウィンドを用いて分析した。５個以上の連続Ｇ’ｓ及び／またはＣ’ｓを含むストレッチを前記ウィンドで検出したときにはいつも、以下の置換ルールを適用した。Ｌｅｔ Ｎは既に実施したコドン置換の数を示す。Ｎが奇数のときにはウインド中の中間コドンを表５に特定したコドンで置換する。Ｎが偶数のときにはウィンドの第３末端コドンをｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄのようなコドン最適化表に特定されているコドンで置換する。ＬｅｕまたはＶａｌが第２または第３コドンに存在しているときには、非常に低い相対コドン使用頻度（例えば、ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ参照）のＬｅｕまたはＶａｌコドンが導入されないようにいずれの置換も適用しない。以下のサイクルで、シフトしたウインドの分析を以前のサイクルの置換を含む配列に適用した。
３コドンウインド中の中間及び末端コドンの交互置換は、実験的に（手順後の最終配列から判断して）ＧＣ含量を低減させながら最適化コドン使用の全体維持をより満足させることが判明した。しかしながら、通常、正確な置換戦略は分析されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に依存し、実験的に決定されるであろう。
段階２）
段階１）で実施した全てのコドン置換を含む配列を２１コドン（６３塩基）長のスライディングウィンドを用いて更に分析した。調節可能なパラメーターに従ってウィンド中の全ＧＣ含量を測定した。ウィンド中のＧＣ含量が７０％以上ならば、以下のコドン置換戦略を適用した。このウィンドでは、アミノ酸Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒのコドンを表５に示すコドンで置換する。この組のアミノ酸に対する置換の限定は、ａ）置換コドンがｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄにおける許容されるぐらい高い使用頻度を有している、及びｂ）置換コドンについてＧＵＴＧ中の平均全ヒトコドン使用は最も高頻度くらい高いという事実により考えられた。以下のサイクルでは、シフトしたウインドの分析を以前のサイクルの置換を含む配列に適用される。
各アミノ酸につきＧＣ含量の全低減と高いコドン最適化の維持を妥協することにより閾値７０％を実験的に決定した。段階１）と同様に、正確な置換戦略（アミノ酸の選択及びＧＣ含量閾値）は分析されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列に依存し、実験的に決定されるであろう。
段階３）
次いで、段階１）及び２）により作成した配列を手動で編集し、追加コドンを以下の基準に従って変化させた。２１コドンのウィンドにおいてなお７０％以上のＧＣ含量を有している領域を手動で試験して、数個のコドンを表５に示すスキームに従って再び置換した。
有用な制限部位を与えるため、相補鎖上の存在するオープンリーデイングフレームを除去するため、相同組換え領域を付加するために、コザックシグナルを付加するため及びターミネーターを付加するために以下の段階を実施した。これらの段階は段階４〜７である。
段階４）
その後制限酵素のサブセットを用いてクローニングできるように、段階３で作成した配列を特定の制限部位（ＢｇｌＩＩ、ＰｍｅＩ及びＸｂａＩ）の不在及び唯一のＳｔｕＩ部位の存在について試験した。２つの部位（ＢｇｌＩＩに対する１部位及びＳｔｕＩに対する１部位）を各認識部位の一部であるコドンを置換することにより配列から除去した。
段階５）
次いで、段階１）〜４）により作成した配列をその後修飾ＮＳＯＰＴｍｕｔ配列を（相同組換えにより）作成できるように修飾した。段階１）〜４）から得た配列では、塩基３５５６〜３７５５を含むセグメント及び塩基４４５６〜４６５６を含むセグメントをＮＳＯＰＴｍｕｔ由来の対応配列により置換した。相同組換えによりＮＳＯＰＴｍｕｔ中の問題の領域（Ｎｏ．３９００あたり）を置換するために配列番号１０の塩基３３５６〜４６５６を含むセグメントを使用して、配列番号１１の配列を有するＮＳＯＰＴｍｕｔの変異体を得ることができる。
段階６）
段階１）〜５）で得た配列の分析から、相補鎖上の完全断片にほぼ広がっている可能性あるオープンリーディングフレームが示された。センス鎖からすべてのコドンＣＴＡ及びＴＴＡ（Ｌｅｕ）とＴＣＡ（Ｓｅｒ）を除去すると、相補鎖上の１つのリーディングフレームの１つ中の全てのストップコドンが有効的に除去された。この相補鎖オープンリーディングフレームの転写及びその後のタンパク質への翻訳の可能性は非常に少ないが、センス鎖上でコードされる配列の転写及びその後の翻訳との可能性ある干渉を避けるためにＳｅｒに対するＴＣＡコドンをほぼ５００塩基毎にセンス上に導入した。相同組換えを実施するために段階５）で導入したセグメントに変化を加えなかった。Ｓｅｒに対するＴＣＡコドンはＬｅｕに対するＣＴＡ及びＴＴＡよりも好ましかった。なぜならば、ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄにおいてＣＴＡ（０．０２）及びＴＴＡ（０．０３）に比してＴＣＡ（０．０５）は比較的により高い相対頻度であるからである。更に、ＣＵＴＧからの平均ヒトコドン使用ではＴＣＡが好ましかった（ＣＴＡ及びＴＴＡの０．０７に対して０．１４）。
段階７）
最終段階では、最適化内部リボソームエントリー部位（コザックシグナル）を作成するためにＧＣＣＡＣＣを配列の５’末端に付加し、３’にＴＡＡＡストップシグナルを付加した。ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔの翻訳特性の開始を維持するために、コドン領域の最初の８コドンをＮＳＯＰＴｍｕｔ配列と同一に維持した。生じた配列を再びＢｇｌＩＩ、ＰｍｅＩ及びＸｂａＩ認識部位の不在及び唯一のＳｔｕＩ部位の存在についてチェックした。
ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔ配列（配列番号１０）は、ＮＳＯＰＴｍｕｔ（７０．３％）に比して全体的に低いＧＣ含量（６３．５％）を有しており、コドン使用最適化の十分に最適なレベルを維持している。ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔのヌクレオチド同一性はＮＳｍｕｔに対して７７．２％であった。
Figure 0004475561
（実施例１２）
ウイルス特徴づけ
アデノベクターを、（ａ）物理的粒子／ｍｌの測定、（ｂ）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイの実行、及び（ｃ）ＨｅＬａ細胞の感染後のタンパク質発現のチェックにより特徴づけた。
（ａ）物理的粒子の測定
ＣｓＣｌ精製ウイルスを０．１％ ＳＤＳ ＰＢＳで１／１０及び１／１００希釈した。コントロールとして、緩衝液Ａ１０５を使用した。これらの希釈物を５５℃において１０分間インキュベートした。チューブを軽く回転させた後、２６０ｎｍでＯＤを測定した。ウイルス粒子の量を、１ＯＤ２６０ｎｍ＝１．１×１０１２物理的粒子／ｍｌに従って計算した。結果は典型的には５×１０１１〜１×１０１２物理的粒子／ｍｌであった。
（ｂ）ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイ
ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイをアデノベクターゲノムの定量（Ｑ−ＰＣＲ粒子／ｍｌ）のために使用した。ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００−配列デテクターを用いて実施した。反応をアデノウイルス骨格に対して特異的なプローブ（最終２００μＭで）及びオリゴヌクレオチド（最終２００ｎＭで）の存在下で最終５０μｌ容量で実施した。ウイルスを０．１％ ＳＤＳ ＰＢＳで１／１０希釈し、５５℃において１０分間インキュベートした。チューブを軽く回転させた後、連続１／１０希釈物（水中）を調製した。１０−３、１０−５及び１０−７希釈物１０μｌをＰＣＲアッセイの鋳型として使用した。
各サンプル中に存在する粒子の量を、同一実験で作成した標準曲線に基づいて計算した。結果は典型的には１×１０１２〜３×１０１２Ｑ−ＰＣＲ粒子／ｍｌであった。
（ｃ）ＨＣＶ非構造タンパク質の発現
ＨＣＶ ＮＳタンパク質の発現をＨｅＬａ細胞を感染させることにより試験した。１．５×１０６細胞／皿（１０ｃｍΦペトリ皿）の感染前日に細胞を平板培養した。５０、２５０及び１２５０ｐｐ／細胞のｍ．ｏ．ｉ．に対応する異なる量のＣｓＣｌ精製ウイルスを最終容量５ｍｌまで培地（ＦＣＳ非含有）で希釈した。希釈ウイルスを細胞に添加し、ＣＯ２インキュベーター中３７℃において１時間インキュベートした（２０分毎にやさしく混合）。５％ ＨＳ−ＤＭＥＭ（５ｍｌ）を添加し、細胞を３７℃で４８時間インキュベートした。
１％ トリトン／ＴＥＮ緩衝液中で細胞抽出物を調製した。この抽出物を１０％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲル上に流し、ニトロセルロースにブロットし、ＮＳ３、ＮＳ５ａ及びＮＳ５ｂに対する抗体を用いてアッセイして、適正なポリタンパク質開裂をチェックした。偽感染細胞をネガティブコントロールとして使用した。Ａｄ５−ＮＳ、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ、ＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ及びＭＲＫＡｄ６−ＮＳＯＰＴｍｕｔを試験した代表的な実験の結果を図１４に示す。
（実施例１３）
各種ＮＳカセットをコードするアデノベクターを用いるマウス免疫化
アデノベクターＡｄ５−ＮＳ、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ、ＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ及びＭＲＫＡｄ６−ＮＳＯＰＴｍｕｔをＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウス株に注射して、抗−ＨＣＶ免疫応答を誘発する可能性を評価した。動物群（Ｎ＝９−１０）には１０９ｐｐのＣｓＣｌ精製ウイルスを筋肉内注射した。各動物に対して３週間間隔で２回投与した。
ＮＳ３タンパク質に対する体液性免疫応答をＣ５７Ｂｌａｃｋ６免疫化マウスからの投与後の２つの血清中で細菌発現させたＮＳ３プロテアーゼドメインに対してＥＬＩＳＡにより測定した。試験した抗原に対して特異的な抗体が１００〜４６０００の幾何平均（相乗平均）力価（ＧＭＴ）で検出された（表６、７、８及び９）。
Figure 0004475561
Figure 0004475561
Figure 0004475561
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Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスにおけるＴ細胞応答を、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ配列を包含する１０残基が重複している２０ｍｅｒペプチドの５プール（Ｆ〜Ｌ＋Ｍの名称）に応じてＩＦＮγを分泌するＴ細胞をの数を測定する定量ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスにおいて誘導される特異的ＣＤ８−応答を、Ｃ５７Ｂｌａｃｋ６マウスではＣＤ８＋エピトープを包含する２０ｍｅｒペプチド（ｐｅｐ１４８０）を用いて同一アッセイにより分析した。抗原特異的にＩＦＮγを分泌する細胞を標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを用いて検出した。
脾臓細胞、脾細胞及びペプチドを上記実施例３に記載されているように産生し、処理した。ベクターＡｄ５−ＮＳ、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ及びＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔの１０９ウイルス粒子を２回注射して免疫化したＣ５７Ｂｌａｃｋ６マウスの群（Ｎ＝９−１０）からの代表的データーを図１５に示す。
（実施例１４）
アデノベクターを用いるアカゲザルの免疫化
アカゲザル（Ｎ＝３−４）を、ＣｓＣｌ精製Ａｄ５−ＮＳ、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ、ＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔまたはＭＲＫＡｄ６−ＮＳＯＰＴｍｕｔウイルスを筋肉内注射することにより免疫化した。各動物の三角筋に１０１１または１０１０ｖｐを０及び４週目に２回投与した。
ＣＭＩを、ａ）ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ（上記実施例３参照）、ｂ）ＩＦＮ−γ ＩＣＳ及びｃ）バルクＣＴＬアッセイにより異なる時間に測定した。これらのアッセイはＨＣＶ抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔリンパ球応答を測定し、ヒト、アカゲザル、マウス及びラットを含めた各種哺乳動物に対して使用され得る。
特異的ペプチドまたはペプチドのプールの使用は、ＣＴＬ細胞毒性アッセイ、インターフェロン−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びインターフェロン−γ細胞内染色アッセイにおける抗原提示を単純化し得る。各種ＨＣＶタンパク質（コア、Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ）のアミノ酸配列をベースとするペプチドを、ＨＣＶ ＤＮＡ、アデノウイルスベクターワクチン接種アカゲザル及びＨＣＶ感染ヒトにおける免疫応答を調べるための上記アッセイに使用するために作成した。各ペプチドは１０アミノ酸で埋め合わされる重複２０ｍｅｒである。大プールのペプチドをＨＣＶタンパク質に対する全応答を検出するために使用することができ、小プールのペプチド及び各ペプチドは応答のエピトープ特異性を規定するために使用し得る。
ＩＦＮ−γ ＩＣＳ
ＩＦＮ−γ ＩＣＳのために、Ｒ１０（１０％ ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ培地）（１ｍｌ）中の２×１０６ＰＢＭＣをペプチドプール抗原で刺激した。各ペプチドの最終濃度は２μｇ／ｍｌであった。細胞をＣＯ２インキュベーター中３７℃において１時間インキュベートした後、可溶性サイトカインの分泌を抑えるためにＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａを１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。細胞を３７℃において更に１４〜１６時間インキュベートした。
刺激を、共刺激抗体のＣＤ２８及びＣＤ４９ｄ（抗−ヒトＣＤ２８ ＢＤ３４０９７５及び抗−ヒトＣＤ４９ｄ ＢＤ３４０９７６）の存在下で実施した。インキュベート後、細胞を表面抗原に対する蛍光色素−コンジュゲート抗体の抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８（ＣＤ３−ＡＰＣ Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＡＰＳ０３０１、ＣＤ４−ＰＥ ＢＤ３４５７６９、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ ＢＤ３４５７７４）で染色した。
細胞内サイトカインを検出するために、細胞をＦＡＣＳ透過化緩衝液２（ＢＤ３４０９７３）２×最終濃度で処理した。固定し、透過化した後、細胞をヒトＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γＦＩＴＣに対する抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ ＡＨＣ４３３８）とインキュベートした。
細胞をＰＢＳ中の１％ ホルムアルデヒド中に再懸濁し、２４時間以内にＦＡＣＳで分析した。４色ＦＡＣＳ分析を２つのレーザーを備えたＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて実施した。ＣＤ３、ＣＤ８ポジティブ集団をカップリングしたＦｏｒｗａｒｄ対Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒプロットにおいてリンパ球集団のゲーティングを得た。少なくとも３０００事象のゲートが得られた。ポジティブ細胞を１０６リンパ球に対するＩＦＮ−γ発現細胞の数として表した。
１０１０または１０１１ｖｐの各種アデノベクターを１回または２回注射後の免疫化サルからのＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＦＮ−γ ＩＣＳデーターを図１６Ａ〜１６Ｄ、１７Ａ及び１７Ｂに示す。
バルクＣＴＬアッセイ
Ｔリンパ球の識別エフェクター機能は、この細胞集団のサブセットの適切なＭＨＣ−関連抗原ペプチドを示す細胞を直接溶解する能力である。この細胞毒性活性は、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球に最も頻繁に関係している。
記憶Ｔ細胞の抗原再刺激及び増大を与えるように、ＰＢＭＣサンプルにインビトロでＨＣＶ抗原を発現する組換えワクチンウイルスを約１４日間感染させた。ペプチド抗原プールで処置した自己Ｂ細胞系に対する細胞毒性を試験した。
培養物の溶解機能は、ＣＴＬエフェクター細胞との４時間インキュベーション中に標的細胞から遊離したクロムより生じた特異的溶解の％として測定する。特異的細胞毒性を測定し、無関係抗原または賦形剤処理Ｂ細胞系と比較した。このアッセイは半定量的であり、ＣＴＬ応答がワクチンにより誘発されるかどうかを調べるための好ましい手段である。１０１１ｖｐ／投与のアデノベクターＡｄ５−ＮＳ、ＭＲＫＡｄ−ＮＳｍｕｔ及びＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔで免疫化したサルからの２回注射後のデーターを図１８Ａ〜１８Ｆに示す。
他の実施態様も請求の範囲内である。幾つかの実施態様を説明、例示してきたが、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく各種修飾を加え得ることができる。
配列番号１を示す。 配列番号１を示す。 配列番号２を示す。配列番号２は、配列番号１をコードするヌクレオチド配列と共に最適化内部リボソームエントリー部位及びＴＡＡＡ終止を規定する。ヌクレオチド１〜６は最適化内部リボソームエントリー部位を規定する。ヌクレオチド７〜５９６１はＮｏｓ．５１３７〜５１４５にヌクレオチドを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードし、アミノ酸Ｎｏ．１７１１〜１７１３にＮＳ５Ｂを不活性とするＡｌａＡｌａＧＬｙ配列を規定する。ヌクレオチド５９６２〜５９６５はＴＡＡＡ終止を規定する。 配列番号２を示す。配列番号２は、配列番号１をコードするヌクレオチド配列と共に最適化内部リボソームエントリー部位及びＴＡＡＡ終止を規定する。ヌクレオチド１〜６は最適化内部リボソームエントリー部位を規定する。ヌクレオチド７〜５９６１はＮｏｓ．５１３７〜５１４５にヌクレオチドを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードし、アミノ酸Ｎｏ．１７１１〜１７１３にＮＳ５Ｂを不活性とするＡｌａＡｌａＧＬｙ配列を規定する。ヌクレオチド５９６２〜５９６５はＴＡＡＡ終止を規定する。 配列番号２を示す。配列番号２は、配列番号１をコードするヌクレオチド配列と共に最適化内部リボソームエントリー部位及びＴＡＡＡ終止を規定する。ヌクレオチド１〜６は最適化内部リボソームエントリー部位を規定する。ヌクレオチド７〜５９６１はＮｏｓ．５１３７〜５１４５にヌクレオチドを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードし、アミノ酸Ｎｏ．１７１１〜１７１３にＮＳ５Ｂを不活性とするＡｌａＡｌａＧＬｙ配列を規定する。ヌクレオチド５９６２〜５９６５はＴＡＡＡ終止を規定する。 配列番号２を示す。配列番号２は、配列番号１をコードするヌクレオチド配列と共に最適化内部リボソームエントリー部位及びＴＡＡＡ終止を規定する。ヌクレオチド１〜６は最適化内部リボソームエントリー部位を規定する。ヌクレオチド７〜５９６１はＮｏｓ．５１３７〜５１４５にヌクレオチドを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードし、アミノ酸Ｎｏ．１７１１〜１７１３にＮＳ５Ｂを不活性とするＡｌａＡｌａＧＬｙ配列を規定する。ヌクレオチド５９６２〜５９６５はＴＡＡＡ終止を規定する。 配列番号３を示す。配列番号３は配列番号２のコドン最適化バージョンである。ヌクレオチド７〜５９６１がＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードする。 配列番号３を示す。配列番号３は配列番号２のコドン最適化バージョンである。ヌクレオチド７〜５９６１がＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードする。 配列番号３を示す。配列番号３は配列番号２のコドン最適化バージョンである。ヌクレオチド７〜５９６１がＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードする。 配列番号３を示す。配列番号３は配列番号２のコドン最適化バージョンである。ヌクレオチド７〜５９６１がＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂペリペプチドをコードする。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 ＭＲＫ Ａｄ６−ＮＳｍｕｔ（配列番号４）を示す。配列番号４は配列番号１のポリペプチドが配列番号２によりコードされる発現カセットを含むアデノベクターである。塩基対１〜４５０はＡｄ５ ｂｐ１−４５０に対応し、塩基対４６２〜１２５２はヒトＣＭＶプロモーターに対応し、塩基対１２５８〜１２６７はコザック配列に対応し、塩基対１２６４〜７２２２はＮＳ遺伝子に対応し、塩基対７２３１〜７４５１はＢＧＨポリアデニル化シグナルに対応し、塩基対７４６９〜９５０６はＡｄ５塩基対３５１１−５５４８に対応し、塩基対９５０７〜３２１２１はＡｄ６塩基対５５４２−２８１５６に対応し、塩基対３２１２２〜３５１１７はＡｄ６塩基対３０７８９−３３７８４に対応し、塩基対３５１１８〜３７０８９はＡｄ５塩基対３３９６７−３５９３５に対応する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 配列番号５及び６を示す。配列番号５は活性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを有するＨＣＶ Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードする。配列番号６はポリペプチドのアミノ酸配列を規定する。 ｐＶ１ＪｎｓＡの核酸配列（配列番号７）を規定する。 ｐＶ１ＪｎｓＡの核酸配列（配列番号７）を規定する。 ｐＶ１ＪｎｓＡの核酸配列（配列番号７）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの核酸配列（配列番号８）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ５ゲノムの核酸配列（配列番号９）を規定する。 Ａｄ６ゲノムの各種領域を示す。線状（３５７５９ｂｐ）ｄｓ ＤＮＡゲノムを２つの平行線で示し、１００地図単位に分けられている。転写単位をゲノム中の位置及び方位に関して示す。初期遺伝子（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ／Ｂ、Ｅ３及びＥ４）を灰色矢印で示す。黒色矢印で示す後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）は主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から生ずる転写物の選択的スプライシングにより産生され、いずれもその５’末端に三連リーダー（１、２、３）を含む。Ｅ１領域は約１．０〜１１．５地図単位に位置し、Ｅ２領域は７５．０〜１１．５地図単位に位置し、Ｅ３領域は７６．１〜８６．７地図単位に位置し、Ｅ４領域は９９．５〜９１．２地図単位に位置している。主要後期転写単位は１６．０〜９１．２地図単位に位置している。 Ａｄ６領域及びＡｄ５領域を含むｐＡｄＥ１−Ｅ３＋を回収するための相同組換えを示す。 Ａｄ６領域を含むｐＡｄＥ１−Ｅ３＋を回収するための相同組換えを示す。 各種ＨＣＶ ＮＳカセットを発現するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした２９３細胞からの全細胞抽出物に対するウェスタンブロットを示す。成熟ＮＳ３及びＮＳ５Ａ産物を特異的抗体で検出した。“ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳ”は、Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドが配列番号５によりコードされ、配列番号５が配列番号７の塩基１８８１〜１９１２に挿入されているｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドを指す。“ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳｍｕｔ”は配列番号２が配列番号７の塩基１８８２〜１９２５に挿入されているｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドを指す。“ｐＶ１Ｊｎｓ−ＮＳＯＰＴｍｕｔ”は配列番号３が配列番号７の塩基１８８１〜１９０５に挿入されているｐＶ１ＪｎｓＡプラスミドを指す。 Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウス（Ａ）及びＢａｌｂＣマウス（Ｂ）において２５μｇ及び５０μｇの各種ＨＣＶ ＮＳカセットをコードするプラスミドＤＮＡの２回注射及び遺伝子エレクトロトランスファー（ＧＥＴ）により誘導したＴ細胞応答をＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウス（Ａ）及びＢａｌｂＣマウス（Ｂ）において２５μｇ及び５０μｇの各種ＨＣＶ ＮＳカセットをコードするプラスミドＤＮＡの２回注射及び遺伝子エレクトロトランスファー（ＧＥＴ）により誘導したＴ細胞応答をＩＦＮγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 ＨｅＬａ細胞の感染時の各種アデノベクターからのタンパク質発現を示す。ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔは、Ａｄ５ゲノムが塩基対４５１〜３５１０のＥ１欠失、塩基対２８１３４〜３０８１７のＥ３欠失を有し、配列番号４の塩基対４５１〜７４６８のＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ発現カセットがＮｏ．４５０〜３５１１に挿入されているＡｄ５配列（配列番号９）をベースとするアデノベクターである。Ａｄ５−ＮＳは、塩基対３４２〜３５２３のＥ１欠失及び塩基対２８１３４〜３０８１７のＥ３欠失を有するＡｄ５骨格をベースとし、配列番号５からのＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂをコードする発現カセットを含むアデノベクターである。“ＭＲＫＡｄ６−ＮＳＯＰＴｍｕｔ”は、配列番号４の塩基１２５８〜７２２２が配列番号３で置換されている修飾配列番号４を有するアデノベクターを指す。 Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウスにおいて１０９ｖｐの各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をＩＮＦγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを１回または２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をＩＮＦγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを１回または２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をＩＮＦγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを１回または２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をＩＮＦγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを１回または２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をＩＮＦγＥＬＩｓｐｏｔにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを２回注射することにより誘導したＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をＩＮＦγＩＣＳにより示す。 アカゲザルにおいて１０１０ｖｐ（Ａ）または１０１１ｖｐ（Ｂ）の各種ＨＣＶ非構造遺伝子カセットを含むアデノベクターを２回注射することにより誘導したＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をＩＮＦγＩＣＳにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 アカゲザルにおいて１０１１ｖｐのＡｄ５−ＮＳ（Ａ）、ＭＲＫＡｄ５−ＮＳｍｕｔ（Ｂ）またはＭＲＫＡｄ６−ＮＳｍｕｔ（Ｃ）を２回注射することにより誘導したＴ細胞応答をバルクＣＴＬアッセイにより示す。 プラスミドｐＥ２を示す。 部分コドン最適化配列ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔ（配列番号１０）を示す。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドのコード配列は塩基７〜５９６１である。 部分コドン最適化配列ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔ（配列番号１０）を示す。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドのコード配列は塩基７〜５９６１である。 部分コドン最適化配列ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔ（配列番号１０）を示す。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドのコード配列は塩基７〜５９６１である。 部分コドン最適化配列ＮＳｓｕｂｏｐｔｍｕｔ（配列番号１０）を示す。Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドのコード配列は塩基７〜５９６１である。

Claims (23)

  1. Ｍｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む核酸ワクチンであって、前記ポリペプチドはＮＳ５Ｂタンパク質を産生するように自己プロセシングするのに十分なプロテアーゼ活性を有しており、前記ＮＳ５Ｂタンパク質は酵素的に不活性であり、且つ該ポリペプチドは配列番号１から成るか、配列番号１に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドから成り、また前記核酸はヒト細胞において前記ヌクレオチド配列から前記ポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする、前記核酸ワクチン。
  2. ヒト細胞においてＭｅｔ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂポリペプチドを発現し得る遺伝子発現カセットを含む核酸ワクチンであって、前記ポリペプチドはＮＳ５Ｂタンパク質を産生するように自己プロセシングし得、前記ＮＳ５Ｂタンパク質は酵素的に不活性であり、前記発現カセットが
    ａ）前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に転写的にカップリングしているプロモーター、
    ｂ）前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている５’リボソーム結合部位、
    ｃ）前記ヌクレオチド配列の３’末端に連結しているターミネーター、及び
    ｄ）前記ヌクレオチド配列に機能的にカップリングしている３’ポリアデニル化シグナル
    を含むことを特徴とし、但し、前記ポリペプチドは配列番号１から成るか、配列番号１に対して９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドから成り、また前記核酸ワクチンの核酸はヒト細胞において前記ヌクレオチド配列から前記ポリペプチドを発現し得る発現ベクターであることを特徴とする、前記核酸ワクチン。
  3. 前記ヌクレオチド配列が配列番号２のコード配列に対して９０％以上の配列同一性を有することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の核酸ワクチン。
  4. 前記核酸がヒトに投与するのに適したプラスミドであり、更に原核複製起点及び選択マーカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第２項又は第３項に記載の核酸ワクチン。
  5. 前記核酸がアデノベクターであることを特徴とする請求の範囲第２項又は第３項に記載の核酸ワクチン。
  6. 前記アデノベクターが、
    ａ）配列番号９に示す核酸配列を有するＡｄ５または配列番号８に示す核酸配列を有するＡｄ６のいずれかの塩基対１〜塩基対４５０に対応する第１アデノウイルス領域、
    ｂ）前記第１領域に連結した、Ｅ１平行またはＥ１逆平行方位の前記遺伝子発現カセット、
    ｃ）前記発現カセットに連結した、Ａｄ５の塩基対３５１１〜塩基対５５４８に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３５０８〜塩基対５５４１に対応する第２アデノウイルス領域、
    ｄ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５の塩基対５５４９〜塩基対２８１３３に対応するか、またはＡｄ６の塩基対５５４２〜塩基対２８１５６に対応する第３アデノウイルス領域、
    ｅ）前記第３領域に連結した、Ａｄ５の塩基対３０８１８〜塩基対３３９６６に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３０７８９〜塩基対３３７８４に対応する第４アデノウイルス領域、及び
    ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５の塩基対３３９６７〜塩基対３５９３５に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３３７８５〜塩基対３５７５９に対応する第５アデノウイルス領域
    から成ることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の核酸ワクチン。
  7. 前記発現カセットがＥ１逆平行方位にあることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の核酸ワクチン。
  8. 前記アデノベクターが、
    ａ）配列番号９に示す核酸配列を有するＡｄ５または配列番号８に示す核酸配列を有するＡｄ６のいずれかの塩基対１〜塩基対４５０に対応する第１アデノウイルス領域、
    ｂ）前記第１領域に連結した、Ａｄ５の塩基対３５１１〜塩基対５５４８に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３５０８〜塩基対５５４１に対応する第２アデノウイルス領域、
    ｃ）前記第２領域に連結した、Ａｄ５の塩基対５５４９〜塩基対２８１３３に対応するか、またはＡｄ６の塩基対５５４２〜塩基対２８１５６に対応する第３アデノウイルス領域、
    ｄ）前記第３領域に連結した、Ｅ３平行またはＥ３逆平行方位の前記遺伝子発現カセット
    ｅ）前記遺伝子発現カセットに連結した、Ａｄ５の塩基対３０８１８〜塩基対３３９６６に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３０７８９〜塩基対３３７８４に対応する第４アデノウイルス領域、及び
    ｆ）前記第４領域に連結した、Ａｄ５の塩基対３３９６７〜塩基対３５９３５に対応するか、またはＡｄ６の塩基対３３７８５〜塩基対３５７５９に対応する第５アデノウイルス領域
    から成ることを特徴とする請求の範囲第５項に記載の核酸ワクチン。
  9. 前記第１領域がＡｄ５に対応し、前記第２領域がＡｄ５に対応し、前記第３領域がＡｄ５に対応し、前記第４領域がＡｄ５に対応し、前記第５領域がＡｄ５に対応することを特徴とする請求の範囲第６項、第７項又は第８項に記載の核酸ワクチン。
  10. 前記第１領域がＡｄ５またはＡｄ６に対応し、前記第２領域がＡｄ５またはＡｄ６に対応し、前記第３領域がＡｄ６に対応し、前記第４領域がＡｄ６に対応し、前記第５領域がＡｄ５またはＡｄ６に対応することを特徴とする請求の範囲第６項、第７項又は第８項に記載の核酸ワクチン。
  11. 前記プロモーターがヒト前初期サイトメガロウイルスプロモーターであり、前記５’−リボソーム結合部位が配列番号１２からなり、前記３’ポリアデニル化がＢＧＨポリアデニル化シグナルであることを特徴とする請求の範囲第２項〜第１０項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  12. 前記ポリペプチドが、配列番号１から成る請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  13. 前記ポリペプチドが、配列番号１と１〜２０アミノ酸残基で異なる、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  14. 前記ポリペプチドが、配列番号１と１〜５アミノ酸残基で異なる、請求の範囲第１３項に記載の核酸ワクチン。
  15. 前記ヌクレオチド配列が配列番号２のコード配列である、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  16. 前記ヌクレオチド配列が配列番号３のコード配列である、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  17. 前記ヌクレオチド配列が配列番号１０のコード配列である、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  18. 前記ヌクレオチド配列が配列番号１１のコード配列である、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  19. 前記ヌクレオチド配列が配列番号２のコード配列であるか、配列番号２に対して１〜５０ヌクレオチドで異なる、請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記載の核酸ワクチン。
  20. 前記ヌクレオチド配列が配列番号４のヌクレオチド配列と９０％以上の配列同一性を有するか、またはその誘導体であり、前記誘導体が配列番号４中に存在するＨＣＶポリタンパク質コード化配列が配列番号３、配列番号１０または配列番号１１のいずれかのＨＣＶポリタンパク質コード化配列で置換されたものであり、但し前記配列番号４中に存在するＨＣＶポリタンパク質コード化配列が配列番号４の塩基対１２６４〜塩基対７２２２であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の核酸ワクチン。
  21. 配列番号４の核酸配列またはその誘導体であり、前記誘導体が配列番号４中に存在するＨＣＶポリタンパク質コード化配列が配列番号３、配列番号１０または配列番号１１のいずれかのＨＣＶポリタンパク質コード化配列で置換されたものであり、但し前記配列番号４中に存在するＨＣＶポリタンパク質コード化配列が配列番号４の塩基対１２６４〜塩基対７２２２であることを特徴とするアデノベクター。
  22. 請求の範囲第１項〜第２１項のいずれか１項に記載の核酸ワクチンまたはアデノベクター及び医薬的に許容され得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
  23. ヒトの患者を治療するために用いられる請求の範囲第２２項に記載の医薬組成物。
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