JP4465291B2

JP4465291B2 - 多層分析要素及びその製造方法

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Publication number: JP4465291B2
Application number: JP2005081297A
Authority: JP
Inventors: 義彦阿部
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2005-03-22
Filing date: 2005-03-22
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2025-03-22
Also published as: JP2006266705A

Description

本発明は、臨床検査、食品検査又は環境分析等に用いられる多層分析要素、およびその製造方法に関する。

臨床検査、食品検査及び環境分析の分野では、迅速・簡便に検体を処理する要求が年々高くなっており、そのニーズに応えた乾式分析素子が汎用されている。乾式分析要素の中で、血液の受容、展開、拡散を行わせる展開層には、特開昭５５−１６４３５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報、特開昭６０−２２２７６９号公報等に代表されるように、繊維質多孔性材料が用いられてきた。

この繊維質多孔性材料は、液体試料点着時の展開が速く、製造時の取り扱い性にも優れている。また、全血のような粘性のある試料に対しても適用性があり、広く使用されている。しかし、この分野では、より高い精度（再現性）での測定が要求されるようになってきており、繊維質多孔性材料（布展開層）では、いくつか不具合がでてきている。その一つが、布自身のロット変動の問題である。通常、布展開層には、織物と編物があるが、その織り方、編み方にロット間差及びロット内差が見つかっている。

具体的には、単位面積当たりの編目数、単位面積当たりの重量、厚みなどである。また、中間工程で、材料の洗浄工程があるが、その洗浄の程度により、布の親水性にロット間差、ロット内差がある。さらに、布展開層は、平滑ではないため、積層方式で、十分な接着力を確保して製造しようとすると、下層に展開層を食い込ませざるを得ない。これにより下層は乱れており、より高い精度での測定に対しては、好ましくない。また布は下層に布を接着する際に、その構造上伸びやすく、空隙体積の変化を起こしやすい。そのために液体試料点着時の展開面積が変化しやすく、ロット内差及び高精度測定が達成できない原因となっている。また近年、より少ない試料で測定することが望まれているが、布展開層では、試料液量を少なくしていくと、編目の影響による反射光量のバラツキが顕著になり、さらに展開層を接着する際の下層の不均一な乱れのために高精度の測定ができなくなる問題がある。

特許第２５１４０８７号公報に代表される、非繊維性の多孔性膜を有する乾式分析素子では、展開層の非繊維質多孔性材料に、親水性高分子を含有させることが記載されているが、含有させる高分子剤やその作製方法によって、性能（特に液量依存性）が悪く、実質的ではない。

特開昭５５−１６４３５６号公報特開昭５７−６６３５９号公報特開昭６０−２２２７６９号公報特許第２５１４０８７号公報

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明の目的は、展開層として多孔性膜を有する多層分析要素において、よりシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が大きく、液量依存性を受けない安定な性能を有する多層分析要素、及びその製造方法を提供することである。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、機能層と非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層が積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、非繊維性多孔膜中に水溶性ポリマーを機能層と相互作用することなく含め、さらに該水溶性ポリマーの塗布量を１．５〜１０ｇ／ｍ²とすることによって、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層が、この順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素において、非繊維性多孔膜中に水溶性ポリマーが機能層と相互作用することなく含まれており、かつ該水溶性ポリマーの塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²である液体試料分析用多層分析要素が提供される。

好ましくは、水溶性ポリマーの塗布量は１．５〜５．０ｇ／ｍ²である。
好ましくは、水溶性ポリマーは、ポリビニルピロリドン又はその誘導体、セルロースエーテル、アルギン酸又はアルギン酸誘導体、ポリビニルアルコール又はその誘導体、ポリアクリル酸又はその誘導体、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、水溶性多糖類又はその誘導体、又はこれらの混合物である。

好ましくは、非繊維性多孔膜は、６，６−ナイロン、６−ナイロン、アクリレート共重合体、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、セルロースアシレート、セルロースアシレートの鹸化物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリフルオロカーボネート、ポリプロピレン、ポリベンズイミダゾール、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の鹸化物、ポリビニルアルコール、またはこれらの混合物である。
さらに好ましくは、非繊維性多孔膜はポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロースアシレート、６，６−ナイロン、又は６−ナイロンである。

好ましくは、本発明の液体試料分析用多層分析要素は、非繊維性多孔膜を機能層の上にラミネートした後に、水溶性ポリマーを塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²となるように非繊維性多孔膜に塗布することにより製造されるものである。

本発明の別の側面によれば、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層が、この順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素の製造方法において、非繊維性多孔膜を機能層の上にラミネートした後に、水溶性ポリマーを塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²となるように非繊維性多孔膜に塗布することを含む、上記の製造方法が提供される。

本発明の多層分析要素においては、非繊維性多孔膜中に水溶性ポリマーが機能層と相互作用することなく含まれ、かつ該水溶性ポリマーの塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²とすることによって、液量依存性が改良された多層分析要素を提供することが可能になった。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の液体試料分析用多層分析要素は、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層が、この順に積層一体化されたものであり、非繊維性多孔膜中に水溶性ポリマーが機能層と相互作用することなく含まれており、かつ該水溶性ポリマーの塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²であることを特徴とする。

本発明の液体試料分析用多層分析要素においては、多孔性液体試料展開層として用いる非繊維性多孔膜中に、水溶性ポリマーが機能層と相互作用することなく含まれている。このような構成を採用することにより、非繊維性多孔膜内における検体の拡散速度が実質的に一定になっている。この手段として、非繊維性多孔膜中に水溶性ポリマーを均一に分散させたものを下層（機能層）と相互作用することなくラミネートするか、又は、非繊維性多孔膜を機能層の上にラミネートした後に、下層と相互作用することなく水溶性高分子を非繊維性多孔膜中に含浸させることができる。

また、水溶性ポリマーの塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ²であり、さらに好ましくは１．５〜５．０ｇ／ｍ²である。水溶性ポリマーの塗布量が１．５ｇ／ｍ²未満の場合は、液量依存性が大きくなり安定した測定を行うことができなくなる。また、水溶性ポリマーの塗布量が１０ｇ／ｍ²より大きい場合は、試料の展開速度が遅くなるため測定が困難となる。

展開層に分散させるポリマーとしては、水溶性ポリマーであれば、特に限定されない。例えば、カルボキシメチルセルロースやメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロースエーテル、アルギン酸及びアルギン酸誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、ポリアクリル酸及びその誘導体、ポリエチレングリコールやポリエチレンオキシド、水溶性多糖類及びその誘導体、等が挙げられる。また、これらの共重合体でもよいし、これらを混合して用いてもよい。

水不透過性平面支持体としては、従来公知の乾式分析要素に用いられている水不透過性の支持体を用いることができる。水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲のフィルムもしくはシート状の支持体を挙げることができる。

支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる接着層と支持体との接着を強固なものにすることができる。また、下塗層の代りに、支持体の表面を物理的あるいは化学的な活性化処理を施して接着力の向上を図ってもよい。

本発明の多層分析要素は、少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を含む。多孔性液体試料展開層は、水性の検体に含有されている成分を実質的に偏在させることなしに平面的に拡げ、単位面積当りほぼ一定量の割合で、機能層に供給する機能を有する層である。

多孔性液体試料展開層は、１層だけに限定する必要はなく、２層以上の非繊維性多孔膜を部分的に配置された接着剤により接着された積層物を用いることができる。また、少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層は特開昭５７−６６３５９に開示の物理的活性化処理、好ましくはグロー放電処理またはコロナ放電処理を非繊維性多孔膜の少なくとも片面に施すか、あるいは特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の界面活性剤含浸処理、好ましくはノニオン性界面活性剤含浸処理、または親水性ポリマー含浸処理等の親水化処理、またはこれらの処理工程の二つ以上の組合せを逐次実施することにより非繊維性多孔膜を親水化し、下側（支持体に近い側）の機能層との接着力の強化、または展開面積のコントロールをすることができる。更に、目的とする検出反応を行うための試薬、該検出反応を促進するための試薬、あるいは干渉・妨害反応を低減又は阻止する為の各種試薬、もしくはこれらの試薬の一部を含ませることができる。

本発明における多孔性液体試料展開層は、非繊維性多孔膜からなるものである。好ましくは、非繊維性多孔膜は有機高分子からなる多孔膜である。上記した有機高分子からなる多孔膜は、対称性膜又は非対称性膜の何れも使用することができる。非対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは２．０以上であり、対称性多孔膜の場合、非対称率は好ましくは２．０未満である。本明細書で言う非対称性多孔膜とは、一方の表面の平均孔径が他方の表面の平均孔径よりも大きい多孔膜のことであり、非対称率とは、大きい方の平均孔径を小さい方の平均孔径で割った値のことである。

有機高分子からなる多孔膜の好ましい具体例としては、６，６−ナイロン、６−ナイロン、アクリレート共重合体、ポリアクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリル共重合体、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリウレタン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、セルロースアシレート、セルロースアシレートの鹸化物、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエチレン、ポリエチレンクロロトリフルオロエチレン共重合体、ポリエチレンテトラフルオロエチレン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオライド、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリフルオロカーボネート、ポリプロピレン、ポリベンズイミダゾール、ポリメタクリル酸メチル、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体の鹸化物、ポリビニルアルコール、またはこれらの混合物などが挙げられる。

上記の中でも、６，６−ナイロン、６−ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホンとポリスルホンの混合物、セルロースアシレート、セルロースアシレートの鹸化物、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリエステルカーボネート、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、またはこれらの混合物がさらに好ましい。

さらに好ましくは、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロースアシレート、６，６−ナイロン、又は６−ナイロンであり、特に好ましくはポリスルホン、又はポリエーテルスルホンであり、最も好ましくはポリスルホンである。

非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層の厚さ、孔径、空隙率、透水速度、白色度などに特に制限は無いが、厚さについては５０〜５００μｍ、好ましくは５０〜３５０μｍ、更に好ましくは８０〜２００μｍであることが望ましい。孔径については好ましくは０．００１〜１００μｍ、更に好ましくは０．１〜５０μｍ程度の平均孔径を有するものが望ましい。空隙率については好ましくは５０〜９５％、更に好ましくは６０〜９０％が望ましい。また透水速度については２５℃で１Ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が好ましくは非繊維性多孔膜１ｃｍ²当たり１分間に１〜５０００ｍｌ、更に好ましくは５〜２０００ｍｌであることが望ましい。また、白色度については、乾燥時の表面反射吸光度（ＯＤｒ）が０．５以下であることが望ましい。更に好ましくは、０．３以下であることが望ましい。白色度が低い方がＯＤｒのダイナミックレンジが取れるようになり、有利となる。

本発明の液体試料分析用多層分析要素の構成例としては、（１）透明支持体上に、1または複数の機能層が設けられ、さらに該機能層の上に多孔性液体試料展開層が設けられている液体試料分析用多層分析要素、並びに、（２）透明支持体上に、１または複数の機能層が設けられ、さらに機能層の上に、試料分析用の試薬を含有する多孔性液体試料展開層が設けられている液体試料分析用多層分析要素、が挙げられる。即ち、本発明における多孔性液体試料展開層は、試料分析用の試薬を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。但し、展開層である多孔膜は、アナライトフリーであることが必要である。

また、多孔性液体試料展開層が試薬を含有する場合、予め多孔膜を試薬溶液に浸漬後、乾燥させることにより試薬含有膜を作製できる。また、別法として多孔膜上に試薬溶液を塗布後乾燥させることにより試薬含有非繊維性多孔膜を作製できるが、特に手段は限定されない。

本発明の多層分析要素は、少なくとも１つの機能層を含む。機能層の数は１以上であれば特に限定されず、１層でもよいし、２層以上の複数の層とすることもできる。

機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制・促進させる中間層、内因性物質を除去する除去層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、血球と血漿を分離する分離層、分析対象物と反応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。

本発明の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分（例：媒染剤）を含有する検出層などを設けることができる。

（試薬層）
試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。

試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭６０−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。

試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。

試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。

本発明の多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。
例えば、アンモニア（被験物質がアンモニア又はアンモニア生成物質である場合）を分析する場合には、呈色性アンモニア指示薬として、ロイコシアニン染料、ニトロ置換ロイコ染料およびロイコフタレイン染料のようなロイコ染料（米国再発行特許第３０２６７号明細書または特公昭５８−１９０６２号公報記載）：ブロムフェノールブルー、ブロムクレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、キノリンブルーおよびロゾール酸のようなｐＨ指示薬（共立出版(株)、化学大辞典、第１０巻６３〜６５頁参照）：トリアリールメタン系染料前駆体: ロイコベンジリデン色素（特開昭５５−３７９号および特開昭５６−１４５２７３号各公報に記載）：ジアゾニウム塩とアゾ染料カプラー：塩基漂白可能染料等を用いることができる。バインダーの重量に対する呈色性アンモニア指示薬の配合量は約１〜２０重量％の範囲内であることが好ましい。

被験物質であるアンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬は、酵素または酵素を含有する試薬であることが好ましく、被験物質であるアンモニア生成物質の種類に応じて、分析に適した酵素を選択して用いることができる。上記試薬として酵素を用いる場合には、その酵素の特異性からアンモニア生成物質と試薬の組み合わせが決定される。アンモニア生成物質と試薬としての酵素の組合せの具体例としては、尿素：ウレアーゼ、クレアチニン：クレアチニンデイミナーゼ、アミノ酸：アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸：アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸：アンモニアリアーゼ、アミン：アミンオキシダーゼ、ジアミン：アミンオキシダーゼ、グルコースおよびホスホアミダート：ホスホアミダートヘキソースホスホトランスフェラーゼ、ＡＤＰ：カルバミン酸塩キナーゼおよび燐酸カルバモル、酸アミド：アミドヒドロラーゼ、ヌクレオ塩基：ヌクレオ塩基デアミナーゼ、ヌクレオシド／ヌクレオシドデアミナーゼ、ヌクレオチド：ヌクレオチドデアミナーゼ、グアニン：グアナーゼ等を挙げることができる。アンモニアを分析する場合の試薬層に用いることができるアルカリ性緩衝剤としては、ｐＨが７．０〜１２．０、好ましくは７.５〜１１.５の範囲の緩衝剤を用いることができる。

アンモニアを分析する場合の試薬層には、アンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬、アルカリ性緩衝剤およびフィルム形成能を有する親水性ポリマーバインダー以外にも必要に応じて湿潤剤、バインダー架橋剤（硬化剤）、安定剤、重金属イオントラップ剤(錯化剤)等を含有させることができる。重金属イオントラップ剤は、酵素活性を阻害するような重金属イオンをマスキングするために使用されるものである。重金属イオントラップ剤の具体例としては、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、ＥＤＴＡ・４Ｎａ、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸のようなコンプレクサン（ｃｏｍｐｌｅｘａｎｅ）を挙げることができる。

グルコース測定試薬組成物の例としては、米国特許３，９９２，１５８；特開昭５４−２６７９３；特開昭５９−２０８５３；特開昭５９−４６８５４；特開昭５９−５４９６２等に記載のグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、１，７−ジヒドロキシナフタレンを含む改良Ｔｒｉｎｄｅｒ試薬組成物がある。

（光遮蔽層）
前記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反射性（これらを合わせて光遮蔽性という。）を有する微粒子が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、後述する展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。

光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チタン微粒子である。

被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合して用いることができる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。また光遮蔽層を設ける代りに、前述の展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。

（接着層）
試薬層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を介して、展開層を接着し積層するために接着層を設けてもよい。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤しているときに展開層を接着することができ、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層の製造に用いることができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１０μｍの範囲である。

なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることができる。

（吸水層）
本発明の多層分析要素には、支持体と試薬層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液体成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層に使用されるもののなかから選択することができる。吸水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、特に前述のゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚さは約３μｍから約１００μｍ、好ましくは約５μｍから約３０μｍの範囲、被覆量では約３ｇ／ｍ²から約１００ｇ／ｍ²、好ましくは約５ｇ／ｍ²から約３０ｇ／ｍ²の範囲である。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることができる。

（検出層）
検出層は、一般に、被検成分の存在下で生成した色素等が拡散し、支持体を通して光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層は、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言い、この点で検出層とは区別される。

試薬層、吸水層、接着層、展開層等には界面活性剤を含有させることができる。その例としてノニオン性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤の具体例として、ｐ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ｐ−ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ−ノニルフェノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。ノニオン性界面活性剤を展開層に含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層又は吸水層に含有させることにより、分析操作時に水性液体試料中の水が試薬層または吸水層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層との液体接触が迅速に、かつ実質的に一様になる。

非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を試薬層、吸水層または接着層等の機能層にラミネートするには特開昭５５−１６４３５６、特開昭５７−６６３５９等に開示の方法に従うことができる。すなわち、試薬層、吸水層または接着層等の機能層が塗布後未乾燥のうちに、または乾燥後の機能層に水、界面活性剤を含む水溶液、界面活性剤と親水性ポリマーを含む水溶液、界面活性剤を含む有機溶媒、界面活性剤、または親水性ポリマー、有機溶媒を含有する水溶液等をワイヤーバー塗布装置及びダイを用いた塗布装置等で実質的に均一に供給する。供給量は、１．０〜５０．０ｇ／ｍ²が好ましく、更に好ましくは１０．０〜３０．０ｇ／ｍ²である。機能層は、供給された水溶液又は、有機溶媒により、膨潤または一部溶解され、ついで非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層を膨潤または溶解している機能層の上に実質的に均一に軽く圧力をかけながらラミネートし、一体化する。機能層の膨潤または溶解に際しては、赤外線ヒーター等の輻射熱の照射による加温、支持体にヒーターを接触させ加温する方法等を用いることができる。

上記の方法にてラミネートされた分析要素における多孔膜と支持体の密着力は、１ｃｍ幅のストリップ状の分析要素から多孔膜を剥がす力が、３．０ｇ以上であることが好ましい。更に好ましくは、１０．０ｇである。密着量が弱いと、次の加工工程において、剥がれ落ちるなどのトラブルの原因となる。

本発明の多層分析要素が対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液；あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等）中の特定成分を分析することができる。例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、グルコース、尿素、ピリルビン、コレステロール、タンパク質、酵素（例えば、乳酸脱水素酵素、ＣＰＫ（クレアチンキナーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）等の血中酵素）などを分析することができる。

本発明の多層分析要素は、公知の方法により調製することができる。溶血試薬は塗布または含浸される試薬水溶液に予め加えておけばよい。他の方法としては、単独又は界面活性剤・展開面積制御のための親水性ポリマーなどを含む水溶液、有機溶媒（エタノール、メタノールなど）溶液又は水−有機溶媒混合液溶液を展開層の上から塗布して含浸させることもできる。これを用いた被験物質の分析も公知の方法に従って行なうことができる。

例えば、本発明の多層分析要素は、一辺約５ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、特公昭５７−２８３３３１号公報（対応米国特許４，１６９，７５１）、実開昭５６−１４２４５４号公報（対応米国特許４，３８７，９９０）、特開昭５７−６３４５２号公報、実開昭５８−３２３５０号公報、特表昭５８−５０１１４４号公報（対応国際公:ＷＯ０８３／００３９１）等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることができ、これは製造，包装，輸送，保存，測定操作等の観点で好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに収めて用いたり、又は小片を開口のある容器内に収めて用いたり、又は小片を開口カードに貼付または収めて用いたり、あるいは裁断した小片をそのまま用いることなどもできる。こうして、１枚または２枚以上の小片を収めた容器は、項目名やロット番号、キャリブレーションなどの情報を有することができる。これらの情報は、例えば、ＩＣ、磁気やバーコードなどを用いることができ、ハードウェア上で簡便に読み取り、自動化に有用である。

本発明の多層分析要素は、例えば約２μＬ〜約３０μＬ、好ましくは４μＬ〜１５μＬの範囲の水性液体試料液を、多孔性液体試料展開層に点着する。点着した多層分析要素を約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。多層分析要素内の発色又は変色を支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。

測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。

本発明の多層分析要素は、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１: 高温で乾燥させた分析要素の作製
ゼラチン下塗りされている１８０μｍのポリエチレンテレフタレ−ト無色透明平滑なフィルムに下記組成の水溶液（ｐＨ＝7.0）を、乾燥後の厚さが14μｍになるように塗布し乾燥した。
界面活性剤 11.63 g/m²
ゼラチン 16.34 g/m²
ここで、界面活性剤は、ポリオキシ（２−ヒドロキシ）プロピレンノニルフェニルエーテル（Surfactant 10G、オーリン社製）を用いた。次に上記フィルム上に約３０ｇ／ｍ２の供給量で水を全面に供給して湿潤させた後、ポリスルフォン多孔膜ＨＳ２００（「富士写真フィルム社」製）をラミネートした。

上記の多孔膜上に下記組成の水溶液を、塗布・乾燥した。
ヒドロキシプロピルセルロース 3.9 g/m²
界面活性剤 0.62 g/m²

比較例１：比較的低温にて乾燥させた分析要素の作製
下層は実施例１と全く同一の処方で、塗布した。
オーバーコート水溶液を下記処方量にて、塗布・乾燥した。
ヒドロキシプロピルセルロース 1.2 g/m²
界面活性剤 0.62 g/m²

比較例２：比較的低温にて乾燥させた分析要素の作製
下層は実施例１と全く同一の処方で、塗布した。
オーバーコート水溶液を下記処方量にて、塗布・乾燥した。
ヒドロキシプロピルセルロース 13.9 g/m²
界面活性剤 0.62 g/m²

上記の実施例１、比較例１及び２の一体型多層分析要素を12mmX13mm四方のチップに切断し、マウント部材に収納して分析要素を作製した。

実施例１、並びに比較例１及び２で作製した作製した分析要素に、下記構造式の赤色色素（富士写真フィルム社）の3レベルの異なる濃度（0,0.2,0.4,0.8mg/ml)の7%ＢＳＡ水溶液10μLを滴下して、540ｎｍODを測定した。

測定は、37℃でインキュベートしながら、前記540nmの波長について、6分間実施した。図１にその時の展開の様子を示す。実施例1に比べ、比較例1は展開速度は速いものの展開部分と非展開分の境界が不鮮明である。また、比較例2は、実施例1や比較例1に比べ展開速度が非常に遅く、円形の展開が得られないことがわかる。

次に、実施例１と比較例１で作成したスライドを用いて、液量依存性を検討した。液量は、8μL〜11μLまで変化させ、10μL点着時の値を100として、各液量時の変化率をプロットした。検体は、前記赤色色素0.4ｍｇ/dLのBSA溶液を用いた。結果を図２に示す。なお、比較例2で作成したスライドは展開が遅く、測定できなかった。上記の結果より、実施例で作成した分析素子は10μL±1μLの変化に対して±5%以内の変動であるのに対して、比較例１で作成した分析素子は±5%以上の変動が起きることが分かった.。

図１は、実施例及び比較例の分析要素に赤色色素のＢＳＡ水溶液を滴下した時の展開の様子を示す。図２は、実施例１と比較例１で作成した分析要素を用いて液量依存性を検討した結果を示す。

Claims

水不透過性平面支持体、少なくとも１つの試薬層を含む機能層、及び少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層からなる液体試料分析用多層分析要素であって、水不透過性平面支持体の片面上に、少なくとも１つの機能層と少なくとも１つの非繊維性多孔膜からなる多孔性液体試料展開層が、この順に積層一体化された液体試料分析用多層分析要素の製造方法において、非繊維性多孔膜がポリスルホン、ポリエーテルスルホンまたはこれらの混合物であり、非繊維性多孔膜を機能層の上にラミネートした後に、ヒドロキシプロピルセルロースを塗布量が１．５〜１０ｇ／ｍ^２となるように非繊維性多孔膜に塗布することを含む、上記の製造方法。
該ヒドロキシプロピルセルロースの塗布量が１．５〜５．０ｇ／ｍ^２である、請求項１に記載の方法。