JP4463525B2

JP4463525B2 - 減感作療法用剤

Info

Publication number: JP4463525B2
Application number: JP2003363362A
Authority: JP
Inventors: 裕史大野; 智常峰; 康浩伊佐; 秀樹山村
Original assignee: Biofermin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Biofermin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-10-23
Filing date: 2003-10-23
Publication date: 2010-05-19
Anticipated expiration: 2023-10-23
Also published as: JP2005126365A

Description

本発明は、ビフィズス菌を使用する減感作療法用剤に関する。

免疫は、自己に対する異物、例えばウィルスや病原細菌などを排除する生体防御システムであり、この免疫機構により様々な外界異物に対し影響を受けずに動物は生存している。しかし、本来生体防御を目的としている免疫が生体に危害を及ぼす場合にアレルギーと呼ばれている。空気中の塵、ダニ、花粉または食物など一般には害がないと考えられるものに対して免疫が異常反応し、花粉症や喘息、アトピー性皮膚炎などが発症する。例えば、花粉が体内（鼻）に侵入すると、これを異物（いわゆる抗原）とみなし、抗原提示細胞さらにＴリンパ球が働き、最終的にＢリンパ球がこの花粉抗原に対して抗体（Ｉｇ；免疫グロブリン）を作る。その抗体のタイプはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭで、これらが抗体のほとんどを占めることがわかっている。これらの抗体は、感染・生体防御に関わる重要な抗体であるが、種々の要因で鼻に侵入した花粉に対し、Ｂリンパ球がアレルギーの原因となるＩｇＥというタイプの抗体を産生することがある。このＩｇＥが肥満細胞の表面に結合した状態(肥満細胞が花粉抗原に感作された状態：感作肥満細胞ともいう。)となり、この状態で再度花粉が鼻に侵入すると、鼻組織にある感作肥満細胞上で花粉抗原とＩｇＥが結合し、肥満細胞はヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターを細胞外に放出し、血管や他の組織で炎症を誘発する。この炎症がくしゃみ、鼻水および鼻づまりのような鼻炎症状を呈することになる。
花粉症や喘息、アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は今や増加の一途をたどり、国民病ともいわれ、遺伝的要因（アレルギーの家族暦）以外に環境要因、食生活の変化も複雑に絡み合い、低年齢化や難治療化が進んでいるといわれている。

現在アレルギー疾患の治療は、対症療法、すなわちアレルギー症状を軽減するものであり、例えば花粉症であれば花粉を吸入することにより発現するくしゃみ、鼻水、鼻づまり、喘息であれば呼吸困難などの症状に種々の薬剤が使用され、ある程度アレルギー疾患をコントロールすることが可能となってきている。しかし、これらはあくまでも対症療法であって、アレルギー疾患そのものを治癒させる根治療法ではない。このため花粉症の場合、花粉飛散時期には毎年薬剤を使用し続ける必要があり、アレルギー発症の低年齢化を考慮するときわめて長期間の薬剤療法を受けることになりかねない。このため、根治療法が望まれる。上記したように、アレルギーの発症にはＩｇＥが深く関与し、上述のアレルギー疾患の根治療法としては、ＩｇＥを産生させないか、その働きを抑制することが必要である。

現在アレルギー疾患の根治療法としては、減感作療法がある。減感作療法には抗原に依存した特異的減感作療法と非特異的減感作療法とがある。特異的減感作療法は、アレルギーをおこさない程度の微量のアレルゲン（抗原）もしくは抗原の一部を注射し、その抗原に対して寛容できる生体に変調を与えるものである。より具体的に、例えば花粉症の特異的減感作療法について説明すると、原因物質（花粉）が体内に入ることにより、抗原特異的ＩｇＥ産生低下、抗原特異的ＩｇＥの免疫細胞への結合を遮断する抗体の産生、肥満細胞の特異抗原に対する反応性の低下、Ｔｈ２サイトカイン産生の低下、局所Ｔｈ１タイプのサイトカインの増加などが生じるとされている。しかし、根本の作用反応部位や機構については不明であり、何らかの免疫寛容が関与しているとされている。
一方、非特異的減感作療法は、抗原が特定されない場合、複数の抗原に感作されている場合に有効な減感作療法と考えられている。古くより、ヒスタグロブリン製剤や金製剤が使用されているが、アレルギー疾患はヘルパーＴリンパ球のうちＴｈ２細胞の応答が異常亢進している状態であることから、それを制御するためＴｈ２細胞と拮抗関係にあるＴｈ１細胞の応答を強化することにより、そのバランス（一般にＴｈ１／Ｔｈ２バランスと呼ばれている。）を調整する治療が近年試みられている。例えばＴｈ１型反応を強く誘導するＢＣＧやＴｈ１サイトカインであるインターフェロンγやインターロイキン１２など投与することによる治療が試みられている（副作用などの問題より好ましいものではないと考えられている。）。一方、抗原非特異的ヒト化抗ＩｇＥ（オマリズマブ）は非特異的ＩｇＥを減少させることにより、ある程度の効果が示されている。

近年フィンランドの医師グループが、遺伝的にアレルギー疾患の可能性のある妊婦に乳酸菌を投与し、さらに出産した乳児にも乳酸菌を投与すると、その乳幼児のアレルギー疾患の発症率が５０％程度抑制されたと報告している（非特許文献１参照。）。
また、アレルギー疾患を発症している乳幼児の糞便の菌叢を調べると、ビフィズス菌などの乳酸菌が減少しているとの報告があり、アレルギー疾患の発症に乳酸菌の関連が指摘されている（非特許文献２参照。）。

ビフィドバクテリウム属に属する菌とアレルギーとの関係についても報告があり、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティスおよびビフィドバクテリウム・ブレーベが、ＩｇＥおよびＩｇＧ産生を抑制することから抗アレルギー剤および醗酵食品として有用であることが記載されている（特許文献１参照。）。
エンテロコッカス・フェカーリスおよびラクトバチルス・ロイテリーは、ヒスタミン遊離抑制効果を示し、ＰＣＡ反応においても抑制効果を示し、さらに遅延型過敏反応である接触皮膚炎反応において炎症を抑制したことから、Ｉ型アレルギーおよびＩＶ型アレルギーに有用であることが記載されている（特許文献２参照。）。
また、ビフィズス菌にアシドフィルス菌を配合したものを内服するとアレルギーの予防と改善治療において有用であることも報告されている（特許文献３参照。）。
しかし、上記乳酸菌については、ＩｇＧ産生を抑制することなくＩｇＥ産生を選択的に抑制する旨の記載は認められない。
特開平１０−３０９１７８号公報特開２０００−９５６９７号公報特開２０００−８６５２４号公報カリオマキエム（ＫａｌｌｉｏｍａｋｉＭ）他５名、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）２００１年４月、７；３５７（９２６２）、ｐ．１０７６−１０７９オーウェハンドエーシー（ＯｕｗｅｈａｎｄＡＣ）他４名、ザジャーナルオブアレルギーアンドクリニカルイムノロジー（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆａｌｌｅｒｇｙａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２００１年７月、第１０８巻（１）、ｐ．１４４−１４５

本発明は、アレルギーに対する減感作療法用剤、特に非特異的減感作療法用剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく、数十種類の乳酸菌株についてその免疫細胞に対する作用を指標にスクリーニングした。すなわち、従来のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを指標としたスクリーニング法により、ヘルパーＴ細胞のバランスをＴｈ１型に傾ける作用がある乳酸菌株のスクリーニングを行った。その結果、Ｔｈ１細胞への刺激が強いと考えられるエンテロコッカス・フェカーリスを得た。一方、エンテロコッカス・フェカーリスとは異なり、Ｔｈ１細胞への刺激が非常に弱かったビフィドバクテリウム属に属するある種の株にも非常に興味がもたれた。そこで、これら２菌株について動物のＩｇＥ並びにＩｇＧ産生に及ぼす影響を検討したところ、ビフィドバクテリウム属に属するある種の株が感染防御に関わるＩｇＧの産生を抑制することなく、ＩｇＥ産生を抑制するとの知見を得た。本発明者らは、さらに研究を重ねた結果、このビフィドバクテリウム属に属するある種の株は、経口投与によってもＩｇＧの産生を抑制することなく、ＩｇＥ産生を選択的に抑制することを明らかにし、アレルゲンの種類に関係なく、アレルギー現象を抑制する作用があることを見出した。この菌はビフィドバクテリウム属に属することから、非常に安全性が高い菌と考えられ、医薬としてのみでなく、食品としても日常的に摂取することができる。本発明は、これら知見に基づき完成されたものである。

すなわち、本発明は、
（１）ＩｇＧ産生を抑制せずＩｇＥの産生を選択的に抑制するビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌を含むことを特徴とするアレルギー疾患に対する減感作療法用剤、
（２）ビフィドバクテリウム属に属する菌がビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）である上記（１）に記載の減感作療法用剤、
（３）ビフィドバクテリウム・ビフィダムがビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１であることを特徴とする上記（２）に記載の減感作療法用剤、
（４）減感作療法が非特異的減感作療法である上記（１）または（２）に記載の減感作療法用剤、および
（５）アレルギー疾患がアレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーから選択される疾患である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の減感作療法用剤、
に関する。

本発明の減感作療法用剤は、ＩｇＧ産生を抑制しないので本発明の減感作療法用剤を摂取してもＩｇＧが減少することもなく、ＩｇＥ産生を選択的に抑制することができる。このため、本発明の減感作療法用剤の摂取を継続することによりアレルギー既往のある患者は減感作状態に置かれることになり、スギ花粉などの抗原の侵入により発現する花粉症、並びにアレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎（接触性皮膚炎を含む。）、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーなどの発症を抑制できる。
また、本発明の減感作療法用剤は、アレルゲンを特定できないアレルギー患者の減感作にも有用である。そのため、種々のアレルゲンに基づくアレルギー疾患の予防・治療のために摂取することができる。
さらに、新たなアレルゲンに対するアレルギー反応も予防できる。本発明の減感作療法用剤は安全で副作用もなく、健康の維持増進を目的として長期間にわたり、安全に摂取することができる。

上記「ＩｇＧ産生を抑制せずＩｇＥの産生を選択的に抑制する」とは、生体中のＩｇＧの産生を抑制することなく、またＩｇＧサブクラスの産生比率、特にＩｇＧ１やＩｇＧ２ａの産生比率に影響を与えることなく、ＩｇＥの産生を選択的に抑制することをいうが、ＩｇＥ産生を選択的に抑制することに留まらず、さらに細胞（特に肥満細胞）がＩｇＥと細胞表面で結合、すなわち感作されることを抑制することも包含するものである。

本発明において用いるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）が好ましく、特にビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１株が好ましい。これらの菌体は、例えばＡＴＣＣもしくはＩＦＯなどの機関や財団法人日本ビフィズス菌センターなどから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。

また、本発明に用いるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌には、ＩｇＥ産生抑制活性を喪失していない限りにおいて、これらの菌の処理物も包含される。これら菌の処理物とは、ビフィドバクテリウム属に属する菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などによる破砕液、該菌体の培養液もしくは培養上清、それらを濾過ないし遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素もしくは機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理もしくは塩析処理などして得られるタンパク質複合体（タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など）やペプチド複合体（ペプチド、糖ペプチド等）なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物またはこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液もしくは培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも本発明における該処理物に含まれる。ビフィドバクテリウム属に属する菌は生菌体のみならず死菌体も本発明における該処理物に含まれる。前記死菌体は、例えば、酵素処理、約１００℃程度の熱をかける加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより得ることができる。処理方法は、従来充分に確立されているので、本発明においてもそれに従ってよい。

本発明の減感作療法用剤に含まれるビフィドバクテリウム属に属する菌の含有量は、菌の種類や処理の方法により異なるので、一概には言えないが、例えば、ビフィドバクテリウム属に属する菌がビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１である場合、本発明にかかる減感作療法用剤は当該菌を０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ｄａｙ程度含有することが好ましい。

本発明にかかる減感作療法用剤は、医薬として用いることができる。医薬として用いる場合には、ビフィドバクテリウム属に属する菌をそのまま投与してもよいが、一般的には、ビフィドバクテリウム属に属する菌と製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。前記医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤（糖衣錠もしくは腸溶錠などのコーティング錠または多層錠を含む。）、散剤もしくは顆粒剤などの経口固形製剤の形態をとっていてもよいし、経口液体製剤の形態をとっていてもよいし、注射剤や点滴剤、坐剤、噴霧剤もしくは外用剤などの非経口製剤の形態をとっていてもよい。これら製剤は、公知の方法に従って製造することが可能である。

具体的には、経口投与に適する液体製剤の製造には、例えば、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ゴマ油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などを用いることができる。溶媒または分散媒としては、例えば、水もしくはアルコール、またはそれらの混合物など、公知の経口投与可能な媒体が用いられる。
また、カプセル剤、錠剤、散剤または顆粒剤などの経口固形製剤の製造には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。

非経口投与に適する製剤のうち注射剤や点滴剤などの血管内投与用製剤は、好ましくは体液と等張の水性媒体を用いて調製することができる。例えば、注射剤は、注射用蒸留水、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩溶液とブドウ糖溶液の混合物から選ばれる水性媒体を用い、常法に従って適当な助剤とともに溶液、懸濁液または分散液として調製することができる。腸内投与のための坐剤は、例えばカカオ脂、水素化脂肪または水素化カルボン酸などの担体を用いて調製することができる。噴霧剤は、口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ本発明の医薬の有効成分を微細な粒子として分散させて吸収を促進することのできる担体を用いて調製することができる。このような担体として、例えば、乳糖またはグリセリンなどを用いることができる。その他、エアロゾルやドライパウダーなどの形態の製剤に調製することもできる。
上述のような非経口用製剤の製造には、例えば、希釈剤、香料、防腐剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤などから選択される１または２以上の製剤用添加物を用いることができる。
また、本発明の減感作療法用剤は、本発明の目的に反しない限り他の薬効成分を含有させることもできる。

本発明の減感作療法用剤の投与経路、投与量および投与頻度は特に限定されず、患者の年齢および体重、症状などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。なかでも、投与経路としては経口投与が好ましい。また、例えば、本発明に係る医薬の投与量は、経口投与の場合、ビフィドバクテリウム属に属する菌の投与量が成人一日あたり約０．０１ｍｇ〜１０ｇ程度となるように選択することが好ましい。また、本発明に係る医薬を皮内もしくは皮下投与する場合は、ビフィドバクテリウム属に属する菌が約０．０１μｇ〜１０ｍｇ程度となるように選択することが好ましい。しかし、投与量はこれらに限定されることはない。

本発明に係る減感作療法用剤は、医薬のみならず、例えば、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、育児用粉乳またはドリンク剤などの飲食品として使用してもよい。食品として用いられる場合には、顆粒、錠菓、ガム、キャンディ、ゼリーまたは飲料等の形で提供されうる。本発明に係る減感作療法用剤を食品として用いる場合、ビフィドバクテリウム属に属する菌の含有量は、食品の形態などに応じて適宜選択することが可能である。本発明にかかる食品が、例えばビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１を含有する食品の場合、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１が菌数で約１．０×１０^５個／ｇ以上、好ましくは約１．０×１０^６〜１．０×１０^１２個／ｇ程度含有されていることが好ましい。

本発明に係る減感作療法用剤は、ヒトのみならずヒト以外の哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジもしくはヤギ等の家畜、イヌやネコ等のペット動物、その他マウス、ラット、ウサギ、サル等）に対しても適用できる。すなわち、本発明に係る減感作療法用剤は、動物薬として用いることもできるし、また飼料などに混合して用いることもできる。

以下に実験例および製剤例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、実施例で使用する各略号の意味は、次のとおりである。
ＥＦ−ＪＣＭ：エンテロコッカス・フェカーリスＪＣＭ８７２６株
ＢＢＧ９−１：ビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１株
ＯＶＡ：卵白アルブミン
ＩＬ−１２：インターロイキン−１２
ＩＦＮ−γ：インターフェロンガンマ
ＶＦ：ビフィズス菌試験用液状培地（１）（日本薬局方外医薬品規格）
２−ＭＥ：２−メルカプトエタノール
ＰＢＳ：リン酸緩衝化生理食塩水
ＲＰＭＩ１６４０：ＲＰＭＩ−１６４０メディウム
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＨＲＰ：ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）
ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法
ＴＭＢ：３，３’５，５’−テトラメチルベンジディン
ＰＣＡ：受動的感作皮膚アナフィラキシー
％は特にことわりのない限り質量％である。

ＢＢＧ９−１の凍結保存菌株を３７℃で２４時間静置培養後、ＶＦにこの培養菌液をＶＦ１００に対し１の割合（容量比）で接種し、３７℃で１８時間静置培養した。培養菌液を遠心分離（２５００ｒｐｍ×２０分間）し、得られた菌体を精製水で３回洗浄後、適量の精製水を加えて１０分間沸騰水浴中で加熱処理し、死菌体を調製した。この溶液を精製水で２回洗浄後、凍結乾燥を行った。得られた乾燥菌体をＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、５５μＭ２−ＭＥおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを含む。）を用いて種々の濃度に再懸濁し、試料溶液Ａとした。

ＥＦ−ＪＣＭの凍結保存菌株を３７℃で２４時間静置培養後、ＶＦにこの培養菌液をＶＦ１００に対し１の割合（容量比）で接種し、３７℃で１８時間静置培養した。ついで、上記と同一の方法で乾燥菌体を得た。得られた乾燥菌体を上記ＲＰＭＩ１６４０を用いて種々の濃度に再懸濁し、試料溶液Ｂとした。

動物への免疫は、４週齢ＢＡＬＢ／ｃ系雄性マウスを用い、１μｇのＯＶＡおよび２ｍｇのＡｌ（ＯＨ）_３を腹腔内投与することにより１次免疫し、さらに１週間後に同様の方法で２次免疫した。２次免疫の２週間後に、マウスをエーテル麻酔下、頚動脈より放血致死させ脾臓を摘出した。摘出した脾臓をすりつきガラスで軽く圧迫しながら脾臓細胞を押し出し、ナイロンメッシュ（２００メッシュ）で濾過後、遠心分離した。得られた細胞に、溶血液（塩化アンモニウム０．７４７ｇ、トリスアミノメタン０．２０６ｇ、蒸留水１００ｍＬ、ｐＨ７．４）を加えて２分間氷中にて溶血させた。ハンクス液で３回洗浄後、ＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＣＳ、５５μＭ２−ＭＥおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシンを含む。）を加えて８×１０^６細胞／ｍＬになるように細胞浮遊液を調製した。この細胞浮遊液１００μＬと試料溶液Ａまたは試料溶液Ｂ１００μＬを９６ウェルマイクロプレートで混合し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下２４時間培養後にＩＬ−１２産生量を、７２時間培養後にＩＦＮ−γ産生量を測定した。なお、ＩＬ−１２はＭｏｕｓｅＴｏｔａｌＩＬ−１２ＥＬＩＳＡＫｉｔ（ＥＮＤＯＧＥＮ社）を、ＩＦＮ−γはＭｏｕｓｅＩＦＮ−γ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ社）を用いて測定した。

その結果を図１および２に示す。ＥＦ−ＪＣＭは濃度に依存してＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの産生を増強するのに対し、ＢＢＧ９−１はこれらの産生にほとんど影響を及ぼさないことがわかった。

動物への免疫は、実施例１と同様に行った。実験群はＢＢＧ９−１投与群、ＥＦ−ＪＣＭ投与群および対照群の３群とし、各群の動物数は８匹とした。
また、ＢＢＧ９−１菌液およびＥＦ−ＪＣＭ菌液の調製は以下のように行った。すなわち、ＢＢＧ９−１およびＥＦ−ＪＣＭの凍結保存菌株を３７℃で２４時間静置培養後、ＶＦにこの培養菌液をＶＦ１００に対して１の割合（容量比）で接種し、３７℃で１８時間静置培養した。得られた培養菌液を遠心分離し、生理食塩水で３回洗浄後、液中の生存菌数が１ｍＬあたり５×１０^１０個となるよう生理食塩水に懸濁し、これをＢＢＧ９−１菌液あるいはＥＦ−ＪＣＭ菌液とした。
上記で得られた各菌液は１次免疫の１週間前から２次免疫まで１日１回１４日間連続強制経口投与した。投与液量は０．２ｍＬ／動物とした。対照群には同じスケジュールで菌液のかわりに同量の生理食塩水を強制経口投与した。採血は２次免疫終了３週間後に頚動脈より行い、得られた血液から遠心分離により血清を分取した。この血清中の総ＩｇＥをマウスＩｇＥ測定キット（森永生化学研究所）により測定した。また、ＯＶＡ特異的ＩｇＥおよびＩｇＧの測定を以下のように行った。

（ＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定）
１００μｇ／ｍＬに調製したＯＶＡを９６ウェル・イムノプレートに１００μＬ添加し、４℃で一晩静置することによりＯＶＡを固相化した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、洗浄溶液という。）で各ウェルを３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した後、血清を５０μＬ添加攪拌後、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、１μｇ／ｍＬのビオチン標識ラット抗−マウスＩｇＥを１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、１０００倍希釈したアビジン−ＨＲＰを１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍを１００μＬ添加し、室温で３０分放置した。１Ｎ硫酸溶液を１００μＬ加えて反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を求めた。

（ＯＶＡ特異的ＩｇＧの測定）
１００μｇ／ｍＬに調製したＯＶＡを９６ウェル・イムノプレートに１００μＬ添加し、４℃で一晩静置することによりＯＶＡを固相化した。洗浄溶液で各ウェルを３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した後、血清を５０μＬ添加攪拌後、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、５００倍希釈したＨＲＰ標識ラット抗−マウスＩｇＧを１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍを１００μＬ添加し、室温で３０分放置した。１Ｎ硫酸溶液を１００μＬ加えて反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ量を求めた。

その結果を図３〜５に示す。ＥＦ−ＪＣＭはＩｇＥ産生を抑制する傾向にあるのに対し、ＢＢＧ９−１はＩｇＥ産生を有意に抑制することがわかった。また、ＥＦ−ＪＣＭはＯＶＡ特異的ＩｇＥ産生およびＯＶＡ特異的ＩｇＧ産生をともに抑制するのに対し、ＢＢＧ９−１はＯＶＡ特異的ＩｇＧ産生を抑制することなく、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ産生を選択的に有意に抑制することが分かった。

動物への免疫、試料の投与および血清の分取は実施例２と同様に行った。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の測定およびＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの測定は以下のように行った。

（ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１の測定）
１００μｇ／ｍＬに調製したＯＶＡを９６ウェル・イムノプレートに１００μＬ添加し、４℃で一晩静置することによりＯＶＡを固相化した。洗浄溶液で各ウェルを３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した後、血清を５０μＬ添加攪拌後、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、５００倍希釈したＨＲＰ標識ラット抗マウスＩｇＧ１を１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍを１００μＬ添加し、室温で３０分放置した。１Ｎ硫酸溶液を１００μＬ加えて反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１量を求めた。

（ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの測定）
１００μｇ／ｍＬに調製したＯＶＡを９６ウェル・イムノプレートに１００μＬ添加し、４℃で一晩静置することによりＯＶＡを固相化した。洗浄溶液で各ウェルを３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを２００μＬ加え、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で３回洗浄した後、血清を５０μＬ添加攪拌後、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、５００００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａを１００μＬ添加し、３７℃で１時間放置した。各ウェルを洗浄溶液で４回洗浄した後、ＴＭＢＭｉｃｒｏｗｅｌｌＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅＳｙｓｔｅｍを１００μＬ添加し、室温で３０分放置した。１Ｎ硫酸溶液を１００μＬ加えて反応を停止し、４５０ｎｍでの吸光度を測定し、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ量を求めた。得られたＯＶＡ特異的ＩｇＧ１量をＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ量で除したものをＯＶＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比とした。

その結果を表１に示す。ＥＦ−ＪＣＭはＯＶＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を低下させるのに対し、ＢＢＧ９−１はＯＶＡ特異的ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比に影響しないことが分かった。

本発明の減感作療法用剤は、ＩｇＧ産生を抑制することなく、ＩｇＥの産生を抑制することがわかった。

本発明の減感作療法用剤は、ＩｇＧ産生を抑制しないので本発明の減感作療法用剤を摂取してもＩｇＧが減少することもなく、ＩｇＥ産生を選択的に抑制することができるので、長期間にわたり、安全に摂取することによりアレルギー既往のある患者を減感作状態におくことができ、アレルゲンが特定できる患者のみならず、アレルゲンを特定できないアレルギー患者の減感作にも有用である。

実施例１において測定されたインターロイキン１２（ＩＬ−１２）の産生量を示す。実施例１において測定されたインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の産生量を示す。実施例２において測定されたマウス血清中の総ＩｇＥ量を示す。図中、＊＊はコントロールに対する有意差（ｐ＞０．０１）を示す。実施例２において測定されたマウス血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ量を示す。図中、＊はコントロールに対する有意差（ｐ＞０．０５）を示す。実施例２において測定されたマウス血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ量を示す。

Claims

ＩｇＧ産生を抑制せずＩｇＥの産生を選択的に抑制するビフィドバクテリウム・ビフィダムＧ９−１株を含むことを特徴とするアレルギー疾患に対する減感作療法用剤。
減感作療法が非特異的減感作療法である請求項１に記載の減感作療法用剤。
アレルギー疾患がアレルギー性鼻炎、花粉症、気管支喘息、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎および食物アレルギーから選択される疾患である請求項１または２に記載の減感作療法用剤。