JP4452850B2 - 照明された試料の波長に依存する特徴的な特性値を光学的に把握するための方法および装置構成 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光顕微鏡法、特にレーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法および装置構成に関するものである。

それと共に、作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。
少数の広域スペクトル色素帯の検出から完全なスペクトルの同時記録へと移行することにより、空間的部分構造または動力学的過程に関連して殆どが分析面又は機能面からなされる試料特性の確認、分離、分類において新たな可能性が開けてくる。

それにより、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重蛍光団を含む試料の同時検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。加えて、色素の放射スペクトル帯域の部分的なずれを検出し、空間構造を分類することも可能である。データ記録率は本装置構成によって低下するということはない。

生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の一つに蛍光顕微鏡法（文献：ポーリー「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、プレーナム・プレス１９５５年）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。

色素分子は、入射した一定エネルギーを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に一光子吸収と称される（図１ａ）。色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放射下での移行が最も重要である。放射される光子の波長はストークス変位のため励起放射に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光光線の励起光線からの分離を可能にする。

蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放射から分離し別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。

高いエネルギーを持つ一光子による色素分子の励起（一光子吸収）のほかに、より小さいエネルギーを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギー総和は高エネルギー光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：コリー、キノ；「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミー・プレス１９９６年）。しかし、色素放射はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合、放射スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放射に比較するとその波長は短い。励起光線を放射光線から分離するのは一光子吸収の場合と同じ方法で行う。

以下に公知技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２［Ｌ１］）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４モジュールから成っている： 光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡。これらのモジュールは以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。

プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起には、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光線は光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。それに続き、レーザビームはファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。

光源で生成されたレーザビームは、対物レンズ（２）を通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。試料に焦点を当てｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上滞留時間は、多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。

蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦平面（試料）およびその上・下にある平面から放射された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦平面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で焦点を結ぶ。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学解像度を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。

多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用は省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。

多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置構成では、さらに一つのデスキャン検出が行われるが、しかしこの場合では対物レンズのひとみは検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。

３次元照明による像のうち、対応の一光子吸収もしくは多光子吸収と接続している二検出器の装置構成によって、対物レンズの焦平面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料３次元像が生み出される。

したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放射特性に合せたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。

生医学応用においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、又は放射特性（スペクトル）に基づき、別々に検出されている。その場合、複数色素の蛍光に対する追加分割が副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）によって行われ、個々の色素放射検出が別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行われる。

当装置構成では検出及び励起の際、新たな色素特性に対してフレキシブルに適応することが利用者にとって可能でない。従って、それぞれの（新しい）色素について、新しいダイクロイック・ビームスプリッタおよびブロックフィルタが用意されねばならない。ＤＥ……に基づく装置構成では、蛍光は１基のプリズムによってスペクトル分割される。本方法はダイクロイック・フィルタを有する前記装置構成とは、使用フィルタの特性曲線を調節できる点が異なるだけであるが、しかしそのほか、点像検出器当たり１色素の放射帯域が記録されるというのも好ましいことである。

２つの色素の放射スペクトルが重なり合うと、従来の検出装置では限界がある。２つの色素の間で重ね書きを避けるため、スペクトル検出領域を制限しなければならない。両色素が重なり合う領域はこのため単純に切除され、検出されない。これによって検出ユニットの効率が悪化する。同じ信号対雑音比は励起電力を高めることでしか得られず、それによってプレパラートを損なうこととなる。それゆえ、今日では最大で６種の色素探子が同時に使用されている。そうでないと、放射帯域が強く重なり合っているために色素分離できないからである。

これまで色素は、その吸収特性またはその放射特性が互いに異なるように変形されてきた。
図３ａ）はさまざまな典型的色素の放射スペクトルを示したものである。放射信号が波長の関数で描かれている。１ないし４とナンバリングされた色素間で放射スペクトルの位置および形が異なっているのが認められる。しかし、これらの色素は多くの場合生体プレパラートにとって有毒である。したがって、生体プレパラート内における合胞体の進化については検査不可能である。９０年代末には、天然界の色素である、いわゆる蛍光蛋白質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＴＯＰＡＳ、ＧＦＴ、ＲＦＰ）が発見された（クローンテク社、米国）。

これらの色素は試料への影響の少ないことで際立っている。したがって、それらは生体プレパラート内の細胞領域への標識付けに特に適している。しかし、色素の放射特性がごく僅かしか異なっていないという欠点がある。

図３ｂ）は波長に依存する放射信号を色素ＧＦＰ、トパーズ、ＧＦＴおよびシアンＦＰについて示したものである。
従来の方法では、ＣＦＰおよびＲＦＰだけが変化した吸収特性に基づき他のものと効果的に区別し得よう。つまり逐次撮像の場合である。色素ＧＦＰおよびＧＦＴの分離は従来手段ではまったく不可能であろう。

２つの蛋白質の位置決定をするためのさらに別な方法では、両蛋白質は異なった色素で標識付けされる。但し、第１色素の放射スペクトルは第２色素の吸収スペクトルと重り合うものとする。続いて第１の色素は然るべき波長によって励起され、蛍光を発する。双方の分子が互いに非常に近くに（＜１０ｎｍ）ある場合、第１色素の放射ビームは第２色素に吸収されて、そのため第１色素は放射されず、続いて第２色素が放射される。

図３ｄ）は、文献に蛍光共鳴エネルギー伝送（ＦＲＥＴ）と称されているこの経過のエネルギー準位図を示している（文献：ファンほか；生物物理学雑誌、Ｖ７６、１９９９年５月、２４１２２４２０ページ）。この方法で両色素の放射ビームを検出し、両検出器信号の比を決定すると、両分子相互間の距離を決定することができる。

さらに、生物プレパラート中に存在する色素の放射スペクトルが色素キュベット内で測定された放射スペクトルと区別できることが公知になっている。
図３ｃ）は、色素の放射スペクトルが色素の置かれている環境に依存することを示している。図には、放射信号が波長の関数で描かれている。

波長のずれは数１０ｎｍにもなることがある。この波長ずれの環境への依存性に関しては、より詳しい検査はこれまで知られていない。それは、この種の検査が現状技術の方法では、できるにしても困難だからである。

確かに、今日では分光計がＬＳＭと結合した形でも使用されている。この場合、点像検出器の代わりとして、従来型で殆どが高解像度を持つ分光計が使用されている（特許ディクソンほかＵＳ ５，１９２，９８０）。しかし、これらは放射スペクトルを逐一記録するか、ある領域について平均した形で記録するだけである。すなわち、これは一種の分光分析である。

別の装置構成では色素蛍光の寿命が測定される。ここでもまた、問題は環境の如何ということに結論づけられるが、完全な像を記録するには、長いデータ受信時間を要することになる。それゆえ、この方法は生プレパラートの検査には、制限された形でしか使用できない。

蛍光顕微鏡法のまた別な適用例では、特に生物プレパラート中のイオン濃度（たとえばＣａ^＋、Ｋ^＋、Ｍｇ^２＋、Ｚｎ^＋、…）の測定に用いられている。それには、特別な色素や、またはイオン濃度に依存してスペクトルのずれる色素配合（たとえば、フラ、インド、フルオ；モレキュラー・プローブズ社）が使用される。

図４ａ）はカルシウムイオンの濃度に依存するインド１の放射スペクトルを示している。
図４ｂ）はフルオ３とフラ赤色素との組み合わせの場合で、カルシウムイオン濃度に依存する放射スペクトルの例を示している。これらの特殊色素は放射率識別色素と称される。

図４ａ）に示した二つの蛍光領域を検出して、両強度の比率を出すと、対応のイオン濃度を導き出すことができる。多くの場合この測定によって生命プレパラート中のイオン濃度の動的変化が分析されるが、それには１ミリ秒以内の時間分割が要求される。

以上より、本発明の対象とするのは、フレキシブルでプログラミング自由な新しい検出方法ということになる。これらの方法は、解析的顕微鏡法システムと同様に像作成システムでも使用できなければならない。それゆえ、これらの方法を使用する際にはデータ採用率が悪化してはならない。

顕微鏡システムとしては、生物プレパラートを２００ｎｍまでの光学解像度で３次元検査するためのレーザ走査型顕微鏡や、表面を解像度１０ｎｍまでの高解像度で検査するための走査型近視野顕微鏡のような像作成システムがある。
分子濃度の定量測定用、および分子拡散測定用の蛍光相関顕微鏡もある。さらに、蛍光検出に基づく色素検査の方法も含まれる。

上記システムではいずれも、プレパラートに特殊な標識付けをするために蛍光色素が使用される。これらの設定目標は特許請求項に基づく方法および装置構成により解決される。

本発明によれば、部分的に、または完全に重なり合う色素でさえも分離させることが可能であり、しかも従来技術の上記短所、制約が回避もしくは克服される。それにより、自然界の蛍光蛋白質を使用した多重蛍光記録が可能である。さらに、この方法によれば、検査対象であるプレパラート中の環境偏差に基づく波長のずれが極めて効率的に測定できる。

フレキシブルな検出方法の背景には、スペクトル分割された蛍光検出がある。その場合では、放射光を走査モジュール内または顕微鏡内（多光子吸収の場合）でメインカラー・スプリッタ（ＭＤＢ）により励起光から分割する。

それに続いて配置されている検出器ユニットの構成図を図５に示してある。
試料から出た光は、共焦点検出の場合では、結像レンズ系ＰＯ、さらには絞り（ピンホール）ＰＨを通って焦点を結び、それによって焦点外に生じる蛍光が遮断される。ノンデスキャン検出の場合には絞りは不要である。

この場合では光は角分散素子ＤＩによってそのスペクトル成分へ分解される。角分散素子としてはプリズム、格子および音響光学素子が使用される。分散素子によってそのスペクトル成分へ分割された光は、続いてライン検出器ＤＥ上へ結像される。つまり、このライン検出器ＤＥは波長に依存する放射信号を測定し、これを電気信号Ｓ（ ）へ変換する。加えて、検出ユニットには励起波長を抑制するための線型フィルタを直列接続することもできる。

図５にブロック接続図で示した検出器ユニットを光学的ビーム光路として用いた場合の考え得る実施態様を図６に示している。
本構造は本質的にはサーニー・ターナー構造に基づくものである。共焦点検出の場合、試料からの光Ｌは、ピンホールレンズ系ＰＯにより共焦点絞りＰＨを通り集束される。ノンデスキャン検出で多光子吸収の場合には、この絞りは不要である。

第１の結像鏡Ｓ１は蛍光を視準する。続いて光は線形格子Ｇ、たとえばミリ当たり線数６５１本を有する格子上に当たる。格子は光をその波長に応じてさまざまな方向に偏向させる。第２の結像鏡Ｓ２はスペクトル分割された個々の波長成分を、対応ライン検出器ＤＥのチャネル上へ集束させる。

浜松製作所のＨ７２６０ライン二次電子増倍管を使用するのが特に好ましい。当検出器は３２チャネル型で高感度を有する。上記実施態様の自由なスペクトル領域は約３５０ｎｍである。自由なスペクトル領域はこの装置構成ではライン検出器の３２チャネルに均等に配分されるので、光学的解像度は約１０ｎｍとなる。したがって、この装置構成は分光測定には限定的にしか適さない。しかしながら、これを結像システムに使用するのは有利である。これは、検出スペクトル帯域が相対的に広く、検出チャネルごとの信号が比較的大きいからである。自由なスペクトル領域の移動は、加えて、たとえば格子をねじることによっても行なえる。

また別な実施態様として、マトリクス検出器（たとえばＣＣＤ、…）の使用を伴う例もある。この場合、ある座標において、分散素子によりさまざまな波長成分へ分割が行われる。マトリクス検出器上に留まっている方向に、走査像の完全なライン（または隙間）が結像さる。この実施態様は、ライン・スキャナ（文献：コリー、キノ；「共焦点光学顕微鏡法と関連画像システム」；アカデミック・プレス１９９６年）の構成時には特に有利である。

構造原理は本質的には図２記載のＬＳＭに準じている。但し、点焦点でなくて１本の線を焦点に結像させ、検査試料を１方向にのみ走査する。このような構造の場合、共焦点絞りとしては、孔絞りの代りにスリット絞りを用いる。多格子吸収を利用するノンデスキャン検出もこの装置構成によって行われる。ここでも共焦点絞りは省くことができる。

以下に、図６に示した装置構成における、すなわち点スキャナにおける測定アルゴリズムについて記述する。但し、本アルゴリズムはラインスキャナの装置構成に対して制限なく適用できる。

図３および図４から明らかなように、個々の色素は放射スペクトルの位置および形が異なっている。アルゴリズム（図７）は像ポイントごとに重心位置もしくは像ポイントで検出される放射信号の最大値を決定する。

以下に、有利であり実施可能な重心決定法をより詳しく記述する。たとえば補間適合法等、重心もしくは最大値の別な決定法は、無条件に本発明の一部である。その場合、ライン検出器によって検出されるチャネルごとの信号（左のダイヤグラム）に、較正関数（右のダイヤグラム）を掛け合わせる。すなわちどのチャネルもある一定の加重を持つことになる。

図７の左のダイヤグラムは測定された放射信号を、信号の検出されたチャネルの番号毎に表わしている。右のダイヤグラムには当該加重関数例が、個別チャネルについてチャネル番号別に挙げてある。

加重されたチャネルあたりの個別信号を合算し、加重されていない個別信号の総和（総合信号）で割る。それによって、放射スペクトルひいては励起色素の重心位置を表わす特徴量としての信号が得られる（図８ａ）。この信号は以下位置信号と呼ぶ。

図８ａは検出された放射スペクトルの重心位置もしくは最大値の位置に依存する位置信号を示している。
位置信号を測定することによって、さまざまな色素をそれらの放射スペクトルの位置および種類に基づいて区別することができる。さらに、たとえばある色素を使用すれば、環境に依存している放射スペクトルの波長ずれを測定することができる。

像ポイントに同時にいくつかの色素が存在するならば、ある色素と他の色素との相対濃度に応じて次式で表わされる重心位置の一次連結関係が成り立つ：
位置＝^ｎΣ_ｋＰｏｓ_ｋＣ_ｋ
ここでＰｏｓ_ｋは色素の特徴的な重心位置、Ｃ_ｋは色素濃度、ｎは当該像点で同時励起されている色素数である。したがって、本アルゴリズムはイオン濃度も決定でき、ＦＲＥＴ信号の検出に使用できる。加えて、２つ以上の色素の部分的重なりを分析することも可能である（コロカリゼーション測定）。

図８ｂには、２色素（たとえばフルオ３とフラ赤、モレキュラー・プローブズ社）または２つの特徴的放射帯域を有する１色素（たとえばインド、モレキュラー・プローブズ社）使用時のイオン濃度に依存する信号が描かれている。それはイオン濃度に依存した位置信号を表わすものである。

すでに言及したように、位置信号は、放射スペクトルの重心位置の位置尺度である。すなわち、カラーコード化された強度像を計算するためのマスクとしても利用することができる。

本アルゴリズムは図９に図示されている。その場合、第１段階としてマスク（すなわち位置信号）を対応のルックアップ・データと掛け合わせる。ルックアップ・データは放射スペクトル重心位置の別になされた色分類を含んでいる。続いて、この乗算の結果を強度値（総合信号）と掛け合わせ、つまり色の明度を実際の蛍光強度に適合させる。ルックアップ・データの選択によってはそれぞれ、色マスクされた強度像（離散的色分布）を、すなわち画素ごとに１つの色素が存在する強度像を作り出すことも、または個別像ポイントの合成による混合色の強度像を１つの像として作り出すこともできる。

本方法の決定的な長所は、どの色素も蛍光全体（総合信号）が放射スペクトルの重なり度に依存せず検出でき、それにもかかわらず色素がなお（位置信号によって）分離した状態のまま表示できるという点にある。したがって、強く重なり合っている色素（図３ｃ）を特に効果的に検出することができる。

図６の構成によるアルゴリズムの実施はデジタルでもアナログでも行うことができる。両方の装置構成を以下に詳細に記述する。総合信号および位置信号をデジタルで計算するための装置構成は図１０に図示されている。この場合、多チャネルＰＭＴの陽極に流れる電流は、それぞれ第１増幅器Ａ（電流／電圧変換器として接続されている）によって電圧に変換され、増幅される。電圧は積分器Ｉに導かれ、そこで当該時間（たとえば画素上滞留時間）だけ信号が積分される。

迅速に値を求めるため、積分器Ｉの後に、単純な比較器として次のようなスイッチング閾値を有す比較器Ｋを、即ち閾値を超えたときにデジタル出力信号を発するか、またはウィンドウ比較器として形成されていて、入力信号がスイッチング閾値の上限と下限との間にあるか、または入力信号がスイッチング閾値の外（下または上）にあれば、デジタル出力信号を発するという比較器Ｋを配置させることができる。比較器もしくはウィンドウ比較器の装置構成は、積分器の前にすることも後にすることもできる。積分器なしの接続装置構成（いわゆる増幅モード）も同様に考え得る。

増幅器モードでの装置構成の場合、比較器Ｋは然るべき基準に適合させて装置構成する。比較器Ｋの出力は直接アクティブなチャネルに接続する（オンライン）スイッチ・レジスタＲｅｇの制御信号として用いられるか、またはアクティブなチャネルを個別選択するために（オフライン）、その時の状態が付属連結器Ｖを通じてコンピュータに伝えられる。積分器Ｉの出力信号は後続のＡ／Ｄ変換のため、レベル適合用の別な増幅器Ａ１へ直接導かれる。ＡＤ変換された値は適当なデータ伝送装置を通じて、図７および９に従って位置信号および総合信号の計算を実行するコンピュータＰＣ（またはデジタル信号プロセッサＤＳＰ）へ伝送される。

図１１には、図１０の装置構成と等価のアナログデータ処理に基づく装置構成が描かれている。この場合、個々のチャネルの信号は増幅器によって電圧信号に変換される。続いて、個々の電圧信号は積分器Ｉ内で画素上滞留時間だけ積分される。

積分器の後に、積分された信号と基準信号との比較を行なう比較器Ｋが設置されている。
積分された信号が比較器閾値より小さい場合、当該個別チャネル内では蛍光信号は測定されていないか、または測定された信号があまりにも小さくなりすぎる。このような場合では、個別チャネルの信号加工は続行すべきでない。当チャネルが総信号に寄与しているのは雑音成分だけだからである。比較器はこのような場合Ｒｅｇを通じてスイッチＳを操作し、個別チャネルは実測されている画素に対して遮断される。すなわち比較器とスイッチとの組み合わせによって、実測像ポイントにとって重要なスペクトル領域が自動的に選択される。

続いて、積分された電圧信号はここでも抵抗Ｒを介して電流に変換される。したがって、どの個別チャネルでも、個別チャネルに到来する蛍光の強度に依存して電流を生成する。それに続く位置では、互いに隣接した個別チャネルはすべて、それらの間にある別の抵抗Ｒ１に接続されている。

検出器の列の上端および下端に発生する全電流も、やはり電流／電圧変換器Ａ１によって電圧に変換される。上端および下端での電圧ＥｏおよびＥｕは、逆方向の直線で加重された個別チャネルの信号の総和に相当する。上端および下端での両信号は、続いて加算増幅器ＳＶによって合計される。このようにして生じた信号は、全測定蛍光の総合信号に相当する。この総合信号および上端における信号または下端における信号（破線で表示）はアナログ除算器に導かれ、位置信号を出力する。

総合信号および位置信号は、続いてそれぞれ１基のアナログ・デジタル変換器によってデジタル信号に変換され、コンピュータまたはＤＳＰによって追処理される。但しその場合、上および下の信号は何の制限もなく変換でき、コンピュータ処理することもできる。この場合では、コンピュータが総合信号および位置信号を決定することになる。どちらの場合も図９のアルゴリズムをコンピュータで実行する。

しかし、図９のアルゴリズムを図１１の接続で実施することもできる。これについては、以下に３つの可能性をより詳しく説明する。
第１の装置構成では、隣接する個々の検出チャネル間に存在する抵抗（Ｒ１）を変更させ、ルックアップ・データを用いて乗算を行う。残りの接続は当初の設定のままとする。

第２の装置構成では、増幅器Ａ１内でルックアップ・データにより乗算する。その場合、増幅器Ａ１を可変の非線型特性曲線を用いて作動させる。第３の装置構成（デジタル検出（図１０に従う）およびアナログ検出（図１１に従う））では、個別検出チャネルの入力信号は、以下によって操作し、もしくは歪ませる：
それは、（Ａ）における増幅の変更、（Ｉ）における積分時間の変更、積分器の前の付加オフセット入力および・または光子計数装置によって計数される光子によるデジタルな影響の付与である。３方法はすべて任意相互に組み合わせることもできる。

人工産物を避けるため、蛍光測定の際には、試料から後方散乱する励起光を抑制するか、または少なくとも、放射の最大より小さいかまたは同じ系列量になるように弱める必要がある。それには、上記の付加線形フィルタまたは然るべく最適化したメインカラー・スプリッタ（ＭＤＢ）を、光学的減衰用として使用することができる。励起レーザビームのスペクトル帯域は個別チャネルによって検出される帯域幅よりはるかに狭いから、後方散乱した、もしくは反射した励起ビームも、対応の個別チャネルを図１１のスイッチによって所期設定どおり遮断することができる。

図１１の装置構成は図１０の装置構成に対していくつかの長所を持つ。最も目立つ長所は、単に２チャネルのみをデジタルデータに変換してコンピュータに送り込むだけでよいことである。これにより、コンピュータによって処理すべきデータ率は最小化される。このことは、極めて迅速に経過する動力学的過程が記録できるように、たとえば５０画像以上を５１２×５１２画素および１２ビット画素階調で検出する実時間顕微鏡法に本方法を適用した場合に特に重要である。また、この方法を利用すれば、使用されるライン検出器（マトリクス検出器）の個別チャネル数、従ってまた、検出可能なスペクトル領域の広さおよび・またはスペクトルセンサの分光分解能に関しては制限がない。

さらに、図１０に示された装置では、変換可能な信号レベルは遥かに低い。それにより、信号対雑音比の想定値は小さくなる。
上記の評価アルゴリズム転換のための両装置構成では、個別チャネル信号の検出に積分器スイッチングが使用された。また、光子計数も個別チャネル内で制限を受けることなく行うことができる。しかし、図１０に示された装置構成は、画像追加加工のために、位置信号のほかに完全なスペクトル情報さえ提供できるという長所を持っている。本発明はそれゆえ両装置構成の組み合せをも含んでいる。

図１２は、図１０および図１１に示された装置構成による測定結果である。
図１２ａには分光計で測定した使用色素ＧＦＰ、ＣＦＰおよびＤＩの放射スペクトルが描かれている。色素の励起は波長４８８ｎｍを有するアルゴンレーザにより行なった。これらの色素は以下では、特に生物プレパラートの特定領域に持ち込んだ。

図１２ｂは全３色素が存在する試料片上を走査した際の位置信号のヒストグラムを示している。３色素がそれらの特徴的な位置信号を持つ、３つの最大値がヒストグラムに明瞭に認め得る。３色素の位置関係は次表に掲げた通りである。

色素 ＣＦＰ ＧＦＰ ＤＩ
位置信号（相対的波長シフト） １４ ３０ ８０
従って、色素は本発明に基づく装置構成により簡単に分離できるはずである。加えて、色素内のさまざまな局部的環境に基づく局部的波長ずれが認められる。これはヒストグラムでは個別色素の最大値幅に表われる。

図１３ａは総合信号から形成された強度像を示している。
図１３ｂには、位置信号から形成された対応像が描かれている。
この像は放射スペクトルの対応する重心を表わしている。さまざまに染められた細胞核（一部はＧＦＰで、一部はＣＦＰで着色されている）およびＤＩで着色された細胞枠組みが明瞭に区別できる。

図１３ｃは、図９のアルゴリズムに対応して計算及びカラーコード化された強度像を示している。さまざまな色素が付加した個別領域が、カラーコード化により分離されている。分離は、像を３つのＲＧＢチャネル中で表示することによって明瞭化する。

比較のため、現状技術に基づく検出によって測定した像も図１３ｄに示している。この場合異なる色素の蛍光信号が互いに重ね書きされるのを避けるため、検出は極端に狭いスペクトル帯域内でしか行わなかった。

このように検出帯域が非常に狭隘化したことによって、試料から放射される蛍光信号のほんの一部分しか測定できなかった。像をできる限り同じ信号対雑音比に保つには、励起電力を何倍にも大きくしなければならない。

このことから、本発明に基づく装置構成は現状技術に基づく装置構成に比べ高い効率を持っているのが明らかである。そのほか、ＣＦＰもしくはＧＦＰが堆積する領域は、両色素の放射スペクトルが重り合っているので分離し得ないということもある。このことは、この細胞領域が黄色に着色されていることに、もしくは２つの画像チャネル（ＲおよびＧ）内領域における二重現象に現れている。

ａ）一光子吸収、ｂ）多光子吸収 公知のＬＳＭ構築 典型的なスペクトルａ）色素、ｂ）蛍光蛋白質、ｃ）波長のずれ・環境に依存、ｄ） ＦＲＥＴ 比率測定のための典型的なスペクトル、ａ）１色素と放射率、ｂ）２色素とイオンに依存する信号 検出器ユニット／光学系のブロック構成図 検出器ユニット／光学系の構成例 放射スペクトルの位置を決定するためのアルゴリズム 位置信号の典型的な経過、ａ）放射スペクトルの位置に依存する、ｂ）イオン濃度に依存する いくつかの色素を使用したときのカラーコード化された強度像を作り出すためのアルゴリズム デジタル測定するためのエレクトロニクス構成例 アナログ信号測定するためのエレクトロニクス構成例 ａ）色素スペクトル、ｂ） ａ）の放射スペクトルシフトのヒストグラム 色素を分離するための実験、ａ）総合強度像、ｂ）波長シフトの像、ｃ）展開強度像、ｄ）現状技術に基づく従来型検出器による強度像

符号の説明

ＰＯ 結像レンズ系
ＤＩ 角分散素子
ＤＥ ライン検出器
Ｓ（ ） 電気信号
ＰＨ 共焦点絞り
Ａ 第１増幅器
Ｉ 積分器
Ｋ 比較器
Ｖ 付属連結器
Ｒｅｇ スイッチ・レジスタ
ＤＳＰ デジタル信号プロセッサ
ＰＣ コンピュータ
Ｓ スイッチ
Ａ 電流／電圧変換器
ＳＶ 加算増幅器
Ｓ１ 第１の結像鏡
Ｇ 線形格子
Ｓ２ 第２の結像鏡

Claims (87)

1. 照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性値、主として蛍光、ルミネセンス、りん光、酵素で活性化した光の放射、及び酵素で活性化した蛍光のいずれか１つについての特に放射及び吸収のいずれかに関する特性値の光学的把握方法において、
   放射光線又は吸収光線のいずれかについてスペクトル重心及び最大値のうちの少なくとも一つの位置を測定し、前記スペクトル重心及び前記最大値のうちの少なくとも一つの位置と、前記スペクトル重心及び最大値のうちの少なくとも一つの位置に対応する色分類を含むデータとを合成し、複数の検出チャネルの加算信号を生成し、合成結果と前記加算信号とを乗算して強度画像を生成する、照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性値の光学的把握方法。
2. さまざまな色素の区別のため、及び複数色素の同時使用の場合に画像点における局部的色素組成の測定のため、及び色素の結合している局部周辺に依存する放射スペクトルの局部シフトの測定のため、及び放射率識別色素に基づくイオン濃度測定のためのいずれか１つのために、蛍光クロム放射光線の重心及び最大値の測定のいずれかを行なう、請求項１に記載の方法。
3. さまざまな色素の区別のため、及び複数色素の同時使用の場合に画像点における局部的色素組成の測定のため、及び色素の結合している局部周辺に依存する吸収スペクトルの局部シフトの測定のため、及び色素吸収比に基づくイオン濃度測定のためのうちいずれか１つのために、反射又は透過された蛍光クロム励起光線の重心及び最大値の測定のいずれかを行なう、請求項１に記載の方法。
4. 試料の放射光線を分散素子により分割し、少なくとも一つの方向において場所的分解を伴った検出を行なう、請求項３に記載の方法。
5. 吸収度測定のため、試料から反射した、又は試料を透過した光線を分散素子によって分割し、少なくとも一つの方向において場所的分解を伴った検出を行なう、請求項４に記載の方法。
6. 前記複数の検出チャネル間のスペクトル加重計算、複数検出チャネルにおける検出チャネル信号の総和計算及び検出チャネルの総和計算を行なう、請求項５に記載の方法。
7. 検出チャネルと前記加重計算で用いられる加重曲線とを掛け合わせることによって検出チャネルの信号を加重計算し、対象チャネルの総和計算によって総合信号を算出し、加重信号の総和を総合信号で割ることによって位置信号を算出する、請求項６に記載の方法。
8. 加重曲線が直線である、請求項７に記載の方法。
9. 検出チャネルの信号を変換してデジタルで読み出しさせ、加重及び総和計算をコンピュータによりデジタルで行なう、請求項８に記載の方法。
10. アナログデータの加工による加重計算及び総和計算を抵抗縦続により行なう、請求項９に記載の方法。
11. 抵抗の調整が可能である、請求項１０に記載の方法。
12. 加重曲線が調整可能である、請求項１１に記載の方法。
13. 検出チャネルの信号が入力信号の非直線性歪みによって影響される、請求項１２に記載の方法。
14. 積分パラメータに影響を与える、請求項１３に記載の方法。
15. 増幅器の特性線に影響を与える、請求項１４に記載の方法。
16. 位置信号及び総合信号をアナログで求め、変換してデジタルで読み出しする、請求項１５に記載の方法。
17. 加重方向が逆向きの加重曲線で加重計算した個別チャネルの信号総和に相当する上方信号と下方信号を読み出し、デジタル変換してコンピュータに送り込む、請求項１６に記載の方法。
18. 画像の形成に位置信号と総合信号が使用される、請求項１７に記載の方法。
19. カラーコード化された蛍光画像が形成される、請求項１８に記載の方法。
20. 別な画像によりオーバーラップが行なわれる、請求項１９に記載の方法。
21. 位置信号及び総合信号がルックアップ・データと組み合される、請求項２０に記載の方法。
22. ルックアップ・データによってさまざまな色素の表示、及び形成画像の展開表示のいずれかがなされる、請求項２１に記載の方法。
23. 検出チャネル内の比較器を通じて測定信号と基準信号との比較を行ない、基準信号以下、及び基準信号超過の場合のいずれかの場合には作動指示器の変更を行なう、請求項２２に記載の方法。
24. 必要に応じ、それぞれの検出チャネルの遮断、及び無応答化のいずれかを行なう、請求項２３に記載の方法。
25. それによってスペクトル領域の分析対象幅を狭隘化させる、請求項２４に記載の方法。
26. 検出チャネルの信号をそれぞれ少なくとも一つの積分器の接続によって発生させる、請求項２５に記載の方法。
27. 検出チャネルの信号を光子計数及び続いてのデジタル／アナログ変換によって発生させる、請求項２６に記載の方法。
28. 光子計数を時間の関数で行なう、請求項２７に記載の方法。
29. 単一の蛍光、複数の光子蛍光、及び錯綜光子によって励起された蛍光のいずれかを把握するための、請求項２８に記載の方法。
30. 試料が、好ましくは微量滴定プレートであって、特に作用物質の検査において照射と検出が平行になされる、請求項２９に記載の方法。
31. 走査型近接場顕微鏡での検出のための、請求項３０に記載の方法。
32. 蛍光と相関させた分光器における単一光子、及び多光子の色素蛍光検出のいずれかのための、請求項３１に記載の方法。
33. 共焦点型検出による、請求項３２に記載の方法。
34. 走査装置を有する、請求項３３に記載の方法。
35. 照射においてＸ／Ｙスキャナを用いる、請求項３４に記載の方法。
36. Ｘ／Ｙ走査テーブルを有する、請求項３５に記載の方法。
37. 非共焦点型検出による、請求項３２に記載の方法。
38. 走査装置を有する、請求項３７に記載の方法。
39. デスキャン検出による、請求項３２に記載の方法。
40. ブライトフィールド結像による、請求項３９に記載の方法。
41. 点結像による、請求項３２に記載の方法。
42. ノンデスキャン検出による、請求項３２に記載の方法。
43. ブライトフィールド結像による、請求項４２に記載の方法。
44. 非走査、共焦点又は非共焦点での検出及び点結像又はブライトフィールド結像による、請求項３２に記載の方法。
45. Ｘ／Ｙ走査テーブルによる、請求項４４に記載の方法。
46. 照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性値、主として蛍光、ルミネセンス、りん光、酵素で活性化した光の放射、及び酵素で活性化した蛍光のうち少なくともいずれか１つについての特に放射及び吸収のいずれかに関する特性値の光学的把握のための装置構成において、
    放射光線又は吸収光線のいずれかについてスペクトル重心及び最大値のうちの少なくとも一つの位置を測定し、前記スペクトル重心及び最大値のうちの少なくとも一つの位置と、前記スペクトル重心及び前記最大値のうちの少なくとも一つの位置に対応する色分類を含むデータとを合成し、複数の検出チャネルの加算信号を生成し、合成結果と前記加算信号とを乗算して強度画像を生成するための手段が備えられている、照射試料が持つ波長依存性の特徴的な特性値の光学的把握のための装置構成。
47. 試料の放射光線を分散素子によって分割し、少なくとも一つの方向において場所的分解を伴った検出を行なう、請求項４６に記載の装置構成。
48. 蛍光光線の分割を行なう、請求項４７に記載の装置構成。
49. 吸収度測定のため、試料から反射した、又は試料を透過した光線を分散素子によって分割し、少なくとも一つの方向において場所的分解を伴った検出を行なう、請求項４８に記載の装置構成。
50. 前記複数の検出チャネル間のスペクトル加重計算、複数検出チャネルにおける検出チャネル信号の総和計算及び検出チャネルの総和計算を行なう、請求項４９に記載の装置構成。
51. 検出チャネルと前記加重計算で用いられる加重曲線とを掛け合わせることによって検出チャネルの信号を加重計算し、対象チャネルの総和計算によって総合信号を算出し、加重信号の総和を総合信号で割ることによって位置信号を算出する、請求項５０項に記載の装置構成。
52. 加重曲線が直線である、請求項５１に記載の装置構成。
53. 検出チャネルの信号を変換してデジタルで読み出しさせ、加重及び総和計算をコンピュータによりデジタルで行なう、請求項５２に記載の装置構成。
54. アナログデータの加工による加重計算及び総和計算を抵抗カスケードにより行なう、請求項５３に記載の装置構成。
55. 抵抗の調整が可能である、請求項５４に記載の装置構成。
56. 加重曲線が調整可能である、請求項５５に記載の装置構成。
57. 位置信号及び総合信号をアナログで求め、変換してデジタルで読み出しする、請求項５６に記載の装置構成。
58. 加重方向が逆向きの加重曲線で加重計算した個別チャネルの信号総和に相当する上方信号と下方信号を読み出し、デジタル変換してコンピュータに送り込む、請求項５７に記載の装置構成。
59. 画像の形成に位置信号と総合信号が使用される、請求項５８に記載の装置構成。
60. カラーコード化された蛍光画像が形成される、請求項５９に記載の装置構成。
61. 別な画像によりオーバーラップが行なわれる、請求項６０に記載の装置構成。
62. 位置信号及び総合信号がルックアップ・データと組み合される、請求項６１に記載の装置構成。
63. ルックアップ・データによってさまざまな色素の表示、及び形成画像の展開表示のうち少なくともいずれかがなされる、請求項６２に記載の装置構成。
64. 検出チャネル内の比較器を通じて測定信号と基準信号との比較を行ない、基準信号以下、又は基準信号超過の場合に作動指示器の変更を行なう、請求項６３に記載の装置構成。
65. 必要に応じ、それぞれの検出チャネルの遮断、及び無応答化のいずれかを行なう、請求項６４に記載の装置構成。
66. スペクトル領域の分析対象幅を狭隘化させることによる、請求項６５に記載の装置構成。
67. 検出チャネルの信号をそれぞれ少なくとも一つの積分器の接続によって発生させる、請求項６６に記載の装置構成。
68. 検出チャネルの信号を光子計数及び続いてのデジタル／アナログ変換によって発生させる、請求項６７に記載の装置構成
69. 光子計数を時間の関数で行なう、請求項６８に記載の装置構成。
70. 単一の光子蛍光、複数の光子蛍光、及び錯綜光子によって励起された蛍光のうち少なくともいずれかを把握するための、請求項６９に記載の装置構成。
71. 試料が、好ましくは微量滴定プレートであって、特に作用物質の検査において照射と検出が平行になされる、請求項７０に記載の装置構成。
72. 顕微鏡内で用いられる、請求項７１に記載の装置構成。
73. 走査型近接場顕微鏡での検出のための、請求項７２に記載の装置構成。
74. 蛍光と相関させた分光器における単一光子、及び多光子の少なくともいずれかの色素蛍光検出のための、請求項７３に記載の装置構成。
75. 共焦点型検出による、請求項７４に記載の装置構成。
76. 走査装置による、請求項７５に記載の装置構成。
77. 照射においてＸ／Ｙスキャナを用いる、請求項７６に記載の装置構成。
78. Ｘ／Ｙ走査テーブルによる、請求項７７に記載の装置構成。
79. 非共焦点型検出による、請求項７４に記載の装置構成。
80. 走査装置による、請求項７９に記載の装置構成。
81. デスキャン検出による、請求項７４に記載の装置構成。
82. ブライトフィールド結像による、請求項８１に記載の装置構成。
83. 点結像による、請求項７４に記載の装置構成。
84. ノンデスキャン検出による、請求項７４に記載の装置構成。
85. ブライトフィールド結像による、請求項８４に記載の装置構成。
86. 非走査、共焦点又は非共焦点での検出及び点結像又はブライトフィールド結像による、請求項７４に記載の装置構成。
87. Ｘ／Ｙ走査テーブルによる、請求項８６に記載の装置構成。

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