JP4314386B2 - Ｂｃｌ−２調節因子（ＢＭＦ）配列及びアポトーシスの調節におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

本発明は、一般的に、哺乳動物細胞におけるアポトーシスをとりわけ調節できる新規な分子、及びこれらの分子をコードする遺伝子配列に関する。より具体的には、本発明は本明細書では「Ｂｍｆ」と称する、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質の新規なメンバー、及びそれらをコードする遺伝子配列、及びＢｍｆの発現を指示するプロモーター配列などの調節配列に関する。Ｂｍｆは生存を促進するＢｃｌ−２ファミリー構成員との相互作用を促進しそれによりアポトーシスの引金を引くＢＨ３ドメインを含む。従って、ＢｍｆはＢＨ３のみの分子であるとみなされる。本発明の分子は、例えば、治療、診断、抗体形成において、そして生理学的な細胞死又は細胞生存を調節でき、及び／又は細胞周期開始を調節できる治療用物質のスクリーニング手段として有用である。本発明は更に、単独で又はＢｉｍのような、ただしこれに限定しない別のＢｃｌ−２型分子の対立遺伝子の一方または両方における突然変異と組み合わさって、Ｂｍｆ対立遺伝子の一方又は両方が突然変異し、又は部分的に若しくは全体的に欠失した遺伝的に改変された動物を意図する。この遺伝子改変動物は特に、アポトーシスでの欠陥により惹起される疾病の症状を緩和する物質や、標的細胞のアポトーシスを特異的に促進する物質のスクリーニングに有用である。

本明細書で参照する如何なる先行技術も、この先行技術がどの国でも共通な一般知識の一部を形成するものであるとの認識又は如何なる形の示唆でもなく、またそのように解されるべきではない。

アポトーシス、即ち生理学的及び遺伝子的に改変された細胞死の過程は、多細胞生物で組織をモデルし、ホメオスタシスを維持する上で中心的な重要性を有する（非特許文献１、非特許文献２を参照）。この内在する自殺プログラムの根底にある生化学の理解への大きな進歩が行われているところである。細胞アポトーシス作用分子には、カスパーゼと呼ばれるシステインプロテイナーゼの集合が含まれ、この集合は重要な細胞基質を分解する（非特許文献３を参照）。カスパーゼの活性化を支配する調節機構はあまり解明されていない。しかしながら、Ｂｃｌ−２が原型分子である（そしてＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質と呼ばれる）タンパク質ファミリーは、中心的な役割を果たす（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７を参照）。

Ｂｃｌ−２は最初に同定された細胞内アポトーシス調節遺伝子であり（非特許文献８を参照）、高レベルは多様な細胞障害条件の下で細胞生存性を高める。Ｂｃｌ−ｘ_L（非特許文献９を参照）及びＢｃｌ−ｗ（非特許文献１０を参照）などの他の細胞同族体もまた、アデノウイルスＥ１Ｂ １９Ｋタンパク質（非特許文献１１を参照）及びエプスタイン・バーウイルスＢＨＲＦ−１（非特許文献１２を参照）などのより遠い関係にあるウイルス性同族体がすると同様に、細胞生存性を高める。

Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシスを促進するＢＨ３−のみの構成員は、マウスとＣ．エレガンス程度に遠い関係の種でのアポトーシスの開始に不可欠である（非特許文献１３を参照）。これまで唯一認識されたＣ．エレガンスのＢＨ３−のみのタンパク質であるＥＧＬ−１は、この生物において進行するようにプログラムされている全ての細胞死にとって必要である。対照的に、幾つかのＢＨ３−のみのタンパク質である、Ｂｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ及びＰｕｍａが哺乳動物で既に同定されている。ノックアウトマウスでの実験では、異なるアポトーシス刺激はそれらの開始に異なるＢＨ３−のみのタンパク質を必要とすることが分かった（非特許文献１３を参照）。例えば、Ｂｉｍはサイトカインの除去や抗原受容体刺激によって誘発されるアポトーシスには不可欠であるが、糖質コルチコイドにより誘発される細胞死では不必要である（非特許文献１４、非特許文献１５を参照）。対照的に、ＢｉｄはＦａｓ誘発性の肝細胞の死滅に関与する。（非特許文献１６を参照）。更に、異なる細胞型は、その進行するようプログラムされた死に、異なるＢＨ３−のみのタンパク質を必要とする場合がある。この考えと一致して、Ｂｉｍを欠いたマウスはリンパ系細胞及び骨髄系細胞を異常に蓄積するが、赤血球形成は正常のようである（非特許文献１４を参照）。これらの結果は個々の哺乳動物のＢＨ３−のみのタンパク質が固有の機能を持つことを示している。

ＢＨ３−のみのタンパク質のアポトーシスを促進する活性は厳密な制御の下にある。Ｃ．エレガンスでは、ＥＧＬ−１は産卵に必要な一群の神経細胞の転写抑制因子ＴＲＡ−１Ａにより調節される（非特許文献１７を参照）。いくつかの哺乳動物のＢＨ３−のみのタンパク質もまた転写調節を受ける。例えば、Ｎｏｘａはｐ５３誘発性遺伝子として発見され、従ってＤＮＡ損傷により誘発されるアポトーシスを媒介するものとして第一候補である（非特許文献１８を参照）。哺乳動物のＢＨ３−のみのタンパク質の幾つかはまた、翻訳後にも調節され得る（非特許文献１３を参照）。成長因子により刺激された細胞では、Ｂａｄはリン酸化され、１４−３−３骨格タンパク質に結合することにより、生存を促進するＢｃｌ−２ファミリー構成員から隔離される（非特許文献１９を参照）。健康な細胞では、Ｂｉｍはダイニン軽鎖、ＤＬＣ１／ＬＣ８（非特許文献２０）に結合することにより微小管ダイニンモーター複合体（microtubular dynein motor complex）に隔離される。ＵＶ−照射やタキソールでの処置などの一定のアポトーシス性刺激は、Ｂｉｍ（まだＤＬＣ１に結合しているもの）を遊離させ、生存を促進するＢｃｌ−２ファミリー構成員にそれを転移させ、結合させそしてＢｃｌ−２ファミリー構成員を不活性化させる。このプロセスは細胞死執行者であるシステインプロテアーゼ（カスパーゼ）とは無関係に起こり、それ故アポトーシスでは上流の情報伝達事象を構成する（非特許文献２０を参照）。対照的にＢｉｄのアポトーシス促進活性は、様々なカスパーゼ（例えば、カスパーゼ−８）又はセリンプロテアーゼ・グランザイムＢによる切断で解放される（非特許文献２１、非特許文献２２を参照）。このことはそれがアポトーシスの開始因子ではなく増幅機構の一部として機能することを示す。これらの観察は、細胞の特定部位への隔離を通じて、異なるＢＨ３−のみのタンパク質が細胞内ストレスの異なる形に対するセンサーとして機能することを示す。
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本発明に先立つ研究において、本発明者らは胚形成で一定の役割を果たす新規なＢＨ３−のみのタンパク質を探求した。本発明に従って、本発明者らはＭｃｌ−１を餌にして、１７日齢のマウスの胚ライブラリーの酵母菌−２ハイブリッドスクリーニングにより同定された「Ｂｍｆ」（Ｂｃｌ−２改変因子）をクローニングした。Ｂｍｆは細胞死を誘発し、生存促進Ｂｃｌ−２ファミリーのあるメンバー又は全メンバーに対して「死亡リガンド」として作用すると提唱される。この新しい遺伝子の同定は、治療、診断、抗体形成に使用するための、そして生理学的な細胞死の改変に関わる一定の範囲の生産物の同定及び合理的設計を可能とする。これらの治療用分子は、Ｂｍｆ機能の拮抗薬又は作用薬のいずれかとして作用する場合があり、癌、自己免疫性疾患又は変性疾患の治療に有用である。

発明の概要
本明細書を通して、文脈が他の解釈を求めない限り、「含む（comprise）」及びその変化形である「comprises」又は「comprising」などは、記載された要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を含むことを意味すると解釈されるが、他の如何なる要素若しくは整数、又は要素若しくは整数の群を排除するものではないと理解すべきである。

ヌクレオチド配列とアミノ酸配列は配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）により参照される。配列番号：は数字によりで配列識別子＜４００＞１（配列番号：１）、＜４００＞２（配列番号：２）などに対応する。配列表は請求項の後に掲載する。

アミノ酸配列における特定の突然変異は本明細書では「Ｘ₁ｎＸ₂」で表す。このＸ₁は突然変異前の元のアミノ酸残基であり、ｎは残基の数であり、そしてＸ₂は突然変異したアミノ酸である。Ｘｎヘの参照は、Ｘがアミノ酸でｎが残基の数である特定のアミノ酸への参照である。略字Ｘは、３文字又は１文字のアミノ酸コードの省略形である場合がある。

本発明は、生存を促進するＢｃｌ−２ファミリーの新規なメンバーの同定に部分的に基づいている。このタンパク質は、本明細書では「Ｂｃｌ−２改変因子」又は「Ｂｍｆ」と称する。このタンパク質は、Ｍｃｌ−１を餌として用いたマウス胚ライブラリーの酵母２ハイブリッドスクリーニングで同定した。Ｂｍｆはアポトーシスを誘発するＢＨ３−のみのタンパク質であり、アノイキス（anoikis）により活性化される。

従って、本発明の一つの側面は、Ｂｍｆ又はその誘導体若しくは同族体を特定する特徴を一つ以上持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

本発明の別の一側面は、実質的に配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに実質的に記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％又はそれ以上の類似性を有するアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体をコードするヌクレオチド配列又はコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

本発明の更に別の側面は、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つで実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つと低ストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに記載されるアミノ酸配列、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有する配列に相当するアミノ酸配列をコードする、その誘導体若しくは同族体を含む核酸分子を意図する。

本発明のさらに別の一側面は、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７で実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を意図する。

本発明のまた別の一側面は、ｂｍｆコードする単離された核酸分子又はその誘導体であって、外核酸分子が、
（ｉ）配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つに記載さ れるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体をコードし、又は配列番号：２又 は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５ ％の類似性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｉｉ）配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７の一つで実質 的に記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは類似体を含む核酸分子、（ｉｉｉ）低ストリンジェンシー条件下で配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号： ５又は配列番号：７の一つで実質的に記載されるヌクレオチド配列、誘導体若しく は同族体とハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番 号：６又は配列番号：８に記載されるアミノ酸配列、誘導体又は同族体、又は配列 番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なく とも約４５％の類似性を有する配列に相当するアミノ酸配列をコードできる核酸分 子、
（ｉｖ）低ストリンジェンシー条件下で、項（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の核酸分 子とハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６ 又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を持つアミノ酸配列を コードできる核酸分子、及び、
（ｖ）項（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の核酸分子の誘導体又は哺乳動 物同族体、
から成るリストから選択される核酸分子に向けられている。

本発明の更なる側面は、
（ｉ）配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つで実質的 に記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体、又は配列番号：２又は 配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％ 以上の類似性を有する配列を有するポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７の一つで実質 的に記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは同族体、又は配列番号： ２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約 ４５％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする配列、によってコードされるポ リペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７の一つに記 載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは同族体と低ストリンジェンシー 条件下でハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号 ：６又は配列番号：８に実質的に記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは 同族体、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の 一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分 子によってコードされるポリペプチド、
（ｉｖ）項（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義されたホモ二量体型をしたポリペプチド、及び、
（ｖ）項（ｉ）又は（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で定義されたヘテロ二量体型をしたポリペプチド、
から成るリストから選択される単離されたポリペプチドに向けられている。

本発明のまた別の一側面は、遺伝子改変された非ヒト動物を生産する方法であって、該方法が一つ又は複数のヌクレオチド置換、付加及び／又は欠失又は逆位又は挿入を保持するｂｍｆヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を動物の胚性幹細胞に導入する工程であり、相同組換えのために選択する該胚幹細胞のゲノム内のｂｍｆ遺伝子との相同組換えを促進するのに十分なｂｍｆヌクレオチド配列が存在する工程、及び突然変異したｂｍｆ遺伝子を保持する胚性幹細胞を選択する工程、及び該胚性幹細胞から遺伝的に改変された動物を形成させる工程を含む方法を提供する。

本明細書を通して使用する１文字及び３文字の省略形は下に定義するとおりである。
（外１）

配列番号の表を下に挙げる。
（外２）

好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、部分的にはタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーの新規なメンバーの同定に基づく。このタンパク質は「Ｂｃｌ−２変更因子（Bcl-2 modifying factor）」に因んで「Ｂｍｆ」と呼ばれる。健康的な細胞では、ダイニンの軽鎖、特にダイニン軽鎖２（ＤＬＣ２）に結合することにより、Ｂｍｆはアクチンに基づくミオシンＶモーター複合体に封鎖されると提唱されている。更に、アノイキスなどのある種のアポトーシス刺激はＢｍｆをミオシンＶモーター複合体から放出し、Ｂｃｌ−２へ移動させて結合させるということが提唱されている。従って、Ｂｍｆは別の細胞骨格構造上のモーター複合体への封鎖により、細胞内損傷のセンサーとして機能する。

従って、本発明の一つの側面は、配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つで実質的に記載されるアミノ酸配列、又はその誘導体若しくは同族体、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％以上の類似性を有するアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体をコードするヌクレオチド配列又はコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

本明細書で使用する用語「類似性」は、比較される配列間のヌクレオチド又はアミノ酸レベルでの正確な同一性を含む。ヌクレオチドレベルで非同一性がある場合は、「類似性」は結果的には異なるが、それにもかかわらず構造的、機能的、生化学的及び／又はコンホーメーションのレベルで互いに関連するアミノ酸を生ずる配列の間の相違を含む。アミノ酸レベルで相違が存在する場合は、「類似性」は、それにもかかわらず構造的、機能的、生化学的及び／又はコンホーメーションのレベルで互いに関連するアミノ酸を含む。特に好ましい実施態様では、ヌクレオチド及び配列の比較は類似性ではなく同一性のレベルで行なう。

二つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列関係を記述するのに用いられる用語には、「参照配列」、「比較窓」、「配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性のパーセンテージ」、「配列同一性のパーセンテージ」、「実質的に類似する」及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、少なくとも１２モノマーであるがしばしば１５モノマーから１８モノマー、及びしばしば３０モノマーなどの少なくとも２５モノマー以上の長さである。二つのポリヌクレオチドはそれぞれ（１）二つのポリヌクレオチド間で類似する配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）の場合、及び（２）二つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含む場合があるため、二つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、配列類似性の局所的領域を同定し比較するために通常「比較窓」上で二つのポリヌクレオチドを配列比較することにより行われる。「比較窓」は、参照配列と比較される通常は１２個の連続した残基の概念的セグメントを指す。この比較窓は、二つの配列を最適に整列させるために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比べて、約２０％以下の付加又は欠失（即ちギャップ）を含んでも良い。比較窓に整列させるための最適な配列整列は、アルゴリズムをコンピュータ実行（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース７.０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクスコンピュータグループ、米国，ウィスコンシン，マディソン，サイエンスドライブ５７５）によって、又は目視及び選択される様々な方法のいずれかにより得られる最良の整列（即ち、比較窓上で最も高い相同性パーセンテージが得られた整列）によって行わってもよい。例えば、アルチュルら（Nucl. Acids Res. 25: 3389, 1997)により開示されたようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列分析の詳細な議論はアウスベルらのユニット１９.３（「分子生物学の最新プロトコル」、ジョンワイリーアンドサンズ インク、1994-1998、15章）で見られる。

本明細書で使用する用語「配列類似性」及び「配列同一性」は、比較窓の上でヌクレオチド対ヌクレオチドごと又はアミノ酸対アミノ酸ごとに比較した場合に配列が同一である又は機能的又は構造的に類似していることの程度を指す。従って、例えば「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓の上で最適に並べられた二つの配列を比較し、両方の配列で同一の核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓ，及びＭｅｔ）が発生する位置の数を決定して適合する位置の数を求め、この適合位置の数を比較窓にある位置の総数（即ち、窓サイズ）で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算する。本発明の目的では、「配列同一性」はＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用バージョン２.５、ヒタチソフトウェアエンジニアリングＣｏ.，Ｌｔｄ.，サウスサンフランシスコ、カリフォルニア、米国）でこのソフトウェアに添付のリファレンス・マニュアルで使用していた標準のデフォルト値を用いて計算される「適合パーセンテージ」を意味するものと解される。配列類似性についても同様である。

本発明の別の側面は、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうち一つに実質的に記載されるヌクレオチド配列、又は低ストリンジェンシー条件下で配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうち一つとハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうち一つに記載されるアミノ酸配列又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有する配列をコードする、その誘導体若しくは同族体を含む核酸分子を意図する。

より具体的には、本発明は配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７で実質的に記載されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を意図する。

対象となる核酸分子は、Ｂｍｆ又はその同族体若しく機能的誘導体を含む誘導体を特定する特性を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。

本明細書で低ストリンジェンシーと言うときは、ハイブリッド形成における、少なくとも約０から少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミド及び、少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩、及び洗浄条件条件における少なくとも約１Ｍから少なくとも約２Ｍの塩を含み包含する。一般的に、低ストリンジェンシーは約２５〜３０℃から約４２℃までである。この温度は変更されることがあり、ホルムアミドを置換するため及び／又は別のストリンジェンシー条件を与えるためにより高い温度を用いても良い。必要であれば、ハイブリッド形成における、少なくとも約１６％ｖ／ｖから少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約０.５Ｍから少なくとも約０.９Ｍの塩、及び洗浄条件における、少なくとも約０.５Ｍから少なくとも約０.９Ｍの塩を含み包含する中ストリンジェンシー、又はハイブリッド形成における、少なくとも約３１％ｖ／ｖから少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミド及び少なくとも約０.０１Ｍから少なくとも約０.１５Ｍの塩、及び洗浄条件における、少なくとも約０.０１Ｍから少なくとも約０.１５Ｍの塩を含み包含する高ストリンジェンシーなどの別のストリンジェンシー条件を適用しても良い。一般的に、洗浄はＴ_m＝６９.３＋０.４１（Ｇ＋Ｃ）％で実施される。（マーマー及びドーティー、J. Mol. Biol. 5: 109, 1962）。しかしながら、二本鎖ＤＮＡのＴ_mは適合しない塩基のペアの数が１％増えるごとに１℃減少する（ボナー及びラスキー、Eur. J. Biochem.46: 83, 1974）。ホルムアミドはこれらのハイブリッド形成条件では任意選択的である。従って、特に好ましいレベルのストリンジェンシーは次のように定義される：低ストリンジェンシーは、２５〜４２℃で６倍ＳＳＣ緩衝液０.１％ｗ／ｖＳＤＳ、中ストリンジェンシーは、２０℃から６５℃の範囲の温度で２倍ＳＳＣ緩衝液、０.１％ｗ／ｖＳＤＳ、、高ストリンジェンシーは、少なくとも６５℃の温度で０.１倍ＳＳＣ緩衝液、０.１％ｗ／ｖＳＤＳである。

本発明のこの側面の核酸分子は本明細書の「ｂｍｆ」に相当する。この遺伝子は、本発明に基づき、アポトーシスを誘発すると決定された。ｂｍｆ遺伝子の産物は「Ｂｍｆ」と表され、本発明を如何なる方法でも制限しない。ヒトのｂｍｆはヒトの染色体位置１５ｑ１４に位置付けされた。Ｂｍｆは、それを含む唯一のＢｃｌ−２ホモロジー領域がＢＨ３であるため、「ＢＨ３のみ」タンパク質として知られる。従ってＢｍｆは、例えばＢｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ及びＨｒｋも含むＢｃｌ−２関連ＢＨ３のみアポトーシス促進グループの新規なメンバーを形成する。

ｂｍｆをコードする核酸分子は、ｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ配列又はゲノム配列などのデオキシリボ核酸の配列であることが好ましい。ゲノム配列はまた、エキソン及びイントロンをも含んでも良い。ゲノム配列はまた、プロモーター領域又は他の調節領域を含んでも良い。ｂｍｆ遺伝子配列はスプライス変異体を含む。

以後「Ｂｍｆ」及び「ｂｍｆ」への言及は、例えば、ｂｍｆｍＲＮＡの別のスプライシングから生じるものとして特定されうるｂｍｆのポリペプチド及びｃＤＮＡイソ型を含む、Ｂｍｆ及びｂｍｆそれぞれの全ての形への言及であると解されるべきである。

タンパク質及び／または遺伝子は、好ましくはヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、愛玩動物（例えば、イヌ、ネコ）、捕獲された野生動物（例えば、キツネ、カンガルー、コアラ、シカ）、鳥類（例えば、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、エミュー、ダチョウ）、爬虫類又は魚類に由来する。

誘導体には、融合タンパク質を含む天然、合成又は組換えによる資源由来の断片（ペプチドなど）、パーツ、部分、化学的等価物、突然変異体、同族体、又は模倣体が含まれる。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失又は置換から誘導される場合がある。アミノ酸挿入誘導体は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合並びに１個又は複数のアミノ酸の配列内挿入を含む。アミノ酸配列挿入変異体は一つ以上のアミノ酸残基がそのタンパク質の予め定められた位置に導入されたものであるが、得られる産物の適当なスクリーニングをするのであれば無差別挿入も可能である。欠失変異体は、該配列から一つ以上のアミノ酸の除去により特徴付けられる。アミノ酸の置換変異体は、配列の少なくとも一つの残基が除去され、且つその場所に異なる残基が挿入されたものである。アミノ酸配列への付加は他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質との融合を含む。突然変異体は本明細書に記載の特定のＢｍｆ又はｂｍｆ突然変異分子を含むがこれらに限定されないと解すべきである。誘導体は、例えばＢＨ３領域から、ダイニン結合領域から又はリン酸化の部位から誘導されるペプチドを含む。ペプチドは、例えば本明細書に記載のＢｍｆの少なくとも４個の連続したアミノ酸に相当する少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む分子を含む。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」はペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含すると解されるべきである。

Ｂｍｆの誘導体はペプチド、ポリペプチド又は他のタンパク質性分子又は非タンパク質性分子に融合したＢｍｆ全タンパク質の特定のエピトープ又は部分を有する断片を含む。例えば、Ｂｍｆ又はその誘導体は細胞へのその移行を促進するため、分子と融合する場合がある。本明細書で意図されるＢｍｆの類似体は、側鎖の改変、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質の合成の間における非天然型アミノ酸及び／又はその誘導体の組み込み、架橋の使用、及びタンパク質性分子又はその類似体に立体構造上の制約を課す他の方法を含むが、これらに限定されない。核酸配列の誘導体は同様に、１個又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は他の核酸分子との融合を含む付加から誘導される場合がある。本発明の核酸分子の誘導体は、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制及び融合での使用に適した分子を含む。

本発明により意図される側鎖改変の例には、アルデヒドとの反応に続くＮａＢＨ₄での還元による還元的アルキル化、メチルアセチミデートによるアミジン化、無水酢酸によるアシル化、シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸及び10テトラヒドロ無水フタル酸によるアミノ基のアシル化、及びピリドキサル−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ₄による還元などによるアミノ基の変更が含まれる。

アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサル及びグリオキサルなどの試薬で複素環式縮合物を形成することにより改変される場合がある。

カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成を経るカルボジイミド活性とその後に続く例えば対応するアミドへの誘導化により改変される場合がある。

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、システイン酸への過ギ酸酸化、他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成、マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換されたマレイミドとの反応、４−塩化水銀安息香酸、４−塩化水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−塩化水銀−４−ニトロフェノール及び他の水銀化合物を用いた水銀誘導体の形成、アルカリ性ｐＨでのシアン酸塩によるカルバモイル化などの方法により、改変される場合がある。

トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化又は２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド又はスルフェニルハライドによるインドール環のアルキル化により、改変される場合がある。他方、チロシン残基はテトラニトロメタンにより硝酸化することにより３−ニトロチロシン誘導体を生じうる。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化又はピロ炭酸ジエチルによるＮ−カルベトキシル化により行われる場合がある。

ペプチド合成の間における非天然型アミノ酸及び誘導体の組み込みの例は、ノルロイシン、４−アミノブチル酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ−異性体の使用を含むが、これらに限定されない。本明細書で意図する非天然型アミノ酸のリストを表１に示す。

例えば３Ｄ立体構造を安定させるために架橋剤を用いることも可能で、ｎ＝１からｎ＝６の（ＣＨ₂）_nスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ基反応性部分と、マレイミド又はジチオ部分（ＳＨ）若しくはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）などの別の基に特異的に反応する部分を通常含むヘテロ−二官能性試薬が用いられる。加えてペプチドは、例えばＣα及びＮα―メチルアミノ酸の組込み、アミノ酸のＣα原子とＣβ原子の間に二重結合の導入、及びＮ末端とＣ末端間、二つの側鎖間、又は一つの側鎖とＮ末端若しくはＣ末端の間でアミド結合を形成するなどの共有結合の導入による、環状ペプチド又は類似体の形成によって、立体構造的に制約することができる。

本発明の核酸分子は、単離された形であるか又は発現ベクターなどのようなベクターに連結されていることが好ましい。「単離された」とは、少なくとも一つの精製工程を経た核酸分子を意味しており、これは便宜的に、分子量、コード活性、ヌクレオチド配列、塩基組成又は他の便利な手段で測定されたとき、例えば他の組成物との関連で少なくとも約１０％の核酸分子、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約３０％、さらに好ましくは少なくとも約４０〜５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０〜７０％、さらに好ましくは８０〜９０％又はそれ以上の、対象となる核酸分子を含む組成物により定義される。本発明の核酸分子はまた、好ましい実施態様では、生物学的に純粋であるとみなされる場合がある。

特に好ましい実施態様では、ｂｍｆに対応するヌクレオチド配列は、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つで記載されるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ配列であるか、又は配列番号：１又は配列番号：３又は配列５又は配列番号：７のうちの一つと類似性を有し且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに記載されるアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有する配列をコードするヌクレオチド配列を含む、その誘導体又は同族体である。

本発明の核酸分子の誘導体はまた、低ストリンジェンシー条件下で、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つに記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成できる核酸分子をも含む。該低ストリンジェンシーは４２℃であるのが好ましい。

別の実施態様では、本発明は、ｂｍｆ又はその誘導体をコードする単離された核酸分子であって、該核酸分子が
（i) 配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに 記載されるアミノ酸配列、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又 は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有するその誘導体若し くは同族体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ii) 配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つで 実質的に記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは同族体を含む核酸分 子、
（iii) 配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つ で実質的に記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは同族体と低ストリ ンジェンシー条件下でハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４ 又は配列番号：６又は配列番号：８のうち一つに記載されるアミノ酸又はその誘導 体若しくは同族体又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番 号：８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有する配列に対応するアミノ酸 配列をコードできる核酸分子、
（iv) 項（i)又は（ii) の核酸分子と低ストリンジェンシー条件でハイブリッド形成で き、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ 以上と少なくとも約４５％の類似性を有するアミノ酸配列をコードできる核酸分子 、及び、
（v) 項（i)又は（ii) 又は（iii)又は（iv）の核酸分子の誘導体又は哺乳動物同族体、から成るリストから選択される核酸分子を対象とする。

本明細書で特定の配列（例えば、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７）とハイブリッド形成する能力と言う場合は、別の表現では、その相補形とハイブリッド形成する能力をも含む。言い換えれば、核酸分子は配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７又はその相補形とハイブリッド形成するものを包含する。

核酸分子は原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞又は植物細胞）で発現できる発現ベクターに連結されうる。この核酸分子は、例えば、シグナルペプチド、サイトカイン又はＢｃｌ−２ファミリーの他のメンバーなどの別の実態をコードする核酸分子に連結、融合、または他の方法で結合することがある。

本発明は、ネズミ種又は他の哺乳動物種由来のｂｍｆ用のプロモーターに及ぶ。ネズミ及びヒトのｂｍｆプロモーターを含むヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号：９及び配列番号：１０で示される。本発明はこれらのプロモーターの突然変異体及び誘導体、及び遺伝子構築物、遺伝子療法及び遺伝子改変動物の作成におけるこれらの使用に及ぶ。プロモーターの突然変異体又は誘導体は、配列番号：９又は１０と少なくとも７０％の類似性を有するか又は低ストリンジェンシー条件下で配列番号：９又は配列番号：１０又はその相補形とハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を含むものを含む。

本発明は、以下に定義する核酸分子の発現産物に及ぶ。

この発現産物は、配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに記載されるアミノ酸配列を有するＢｍｆ、又は上で定義したその誘導体若しくは同族体、又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つに記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体と少なくとも約４５％の類似性を有するアミノ酸配列を有する哺乳動物同族体である。

本発明の別の一側面は、
（i) 配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８のうちの一つで 実質的に記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体又は配列番号：２ 又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくとも約４ ５％の類似性を有する配列を有するポリペプチド、
（ii) 配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７のうちの一つ で実質的に記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若しくは同族体又は配列番 号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８の一つ以上と少なくと も約４５％の類似性を有するアミノ酸をコードする配列によってコードされるポリ ペプチド、
（iii) 低ストリンジェンシー条件下で、配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号： ５又は配列番号：７のうちの一つに記載されるヌクレオチド配列又はその誘導体若 しくは同族体とハイブリッド形成でき、且つ配列番号：２又は配列番号：４又は配 列番号：６又は配列番号：８に実質的に記載されるアミノ酸配列又はその誘導体若 しくは同族体又は配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号： ８の一つ以上と少なくとも約４５％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする核 酸分子によりコードされるポリペプチド、
（iv) 項（i)又は（ii) 又は（iii)で定義されたホモ二量体の形のポリペプチド、及び、
（v) 項（i)又は(ii)又は（iii)で定義されたヘテロ二量体の形のポリペプチド
から成るリストから選択される単離されたポリペプチドを対象とする。

すでに定義したとおり、本発明はＢｍｆのペプチド又はその誘導体に及ぶ。該ペプチドは配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８で定義されたポリペプチドの少なくとも５連続のアミノ酸を含むことが好ましい。本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸分子にも及ぶ。

本発明の別の一側面は、Ｂｍｆ又はその誘導体若しくは同族体を特定する特性を一つ以上有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。

本明細書でいうところのＢｍｆの「特定する特性」は、次の特徴を一つ以上含む：即ち、
（i) アポトーシスを誘発するポリペプチド、
（ii) 配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８で実質的に記 載されるアミノ酸配列又はその誘導体若しくは同族体を有するポリペプチド、
（iii) 配列番号：２又は配列番号：４又は配列番号：６又は配列番号：８と少なくとも ４５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、
（iv) アポトーシスを誘発する、項（ii) 又は（iii)で定義されたポリペプチド、
（v) 配列番号：１又は配列番号：３又は配列番号：５又は配列番号：７で実質的に記載 される核酸配列又はその誘導体若しくは同族体によりコードされるポリペプチド、
（vi) 低ストリンジェンシー条件下で、配列番号：１又は配亜３又は配列番号：５又は 配列番号：７のうちの一つに記載されるヌクレオチド配列とハイブリッド形成でき る核酸分子によりコードされるポリペプチド、
（vii) アポトーシスを誘発する、項（v)又は(vi)で定義されたポリペプチド、及び、
（viii) 項（i)から（vii)までに定義されたポリペプチドのアポトーシス誘発性でない誘導体、である。

本発明は本発明のこの側面の核酸分子の発現産物に及ぶことを理解されたい。

本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に限定することを意図するものではないが、ＢＨ３領域はＢｍｆの細胞障害作用の一部の原因となる。このＢＨ３領域は、例えばＢｃｌ−ｘ_Lなどの生存促進分子のＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３領域により形成される伸長した疎水性の窪みと相互作用する両親媒性α−へリックスを形成する。Ｂｍｆのアポトーシス促進作用はＢｃｌ−２ファミリーの反アポトーシスメンバーに結合するその能力を反映する。

やはり本発明をいずれか一つの理論又は作用様式に限定することなく、Ｂｍｆのアポトーシス促進活性は転写レベルと翻訳後のレベルの両方で調節されると考えられる。Ｂｍｆの非コード５’領域の配列分析は、ＡＰＩなどの転写因子のための幾つかの推定上の結合部位を明らかにした。Ｂｍｆは、ＤＬＣ２などのダイニン軽鎖を介して相互作用すると提唱されている。ダイニン軽鎖は、ミオシンＶモーター複合体の構成成分である高度に保存されたタンパク質である。

ＢｍｆのミオシンＶモーター複合体との相互作用は、Ｂｍｆのアボトーシス促進活性を調節する。ダイニン軽鎖への結合を破壊するＢｍｆにおける１個又は複数のアミノ酸の突然変異は本発明で包含される。

従って、本発明の関連する一側面は、変異体によりコードされるポリペプチドへの少なくとも一つのアミノ酸の付加、置換及び／または欠失をもたらす該核酸分子における一つ以上のヌクレオチドの突然変異体を含む単離されたｂｍｆ核酸分子の変異体であって、該ポリペプチドがＤＬＣ２などのダイニン軽鎖と結合、共役、又は他の方法で結合することができないものである変異体を対象とする。

突然変異は、ダイニン軽鎖に結合する領域における改変したアミノ酸配列を結果として生ずることが好ましい。本発明は、これまでに定義した領域と機能的に等価な領域でアミノ酸の付加、置換及び／または欠失を生ずる突然変異を含むＢｍｆの変異体に及ぶことを理解されたい。

従って、本発明は殊に、ダイニン軽鎖に結合する変異体によりコードされるポリペプチドの領域で少なくとも一つのアミノ酸の付加、置換及び／または欠失をもたらす核酸分子における一つ以上のヌクレオチド突然変異を含む単離されたｂｍｆ核酸分子であって、該ポリペプチドがダイニン軽鎖と結合、共役、又他の方法で結合できないものである核酸分子を対象とする。

別の場所における一つ以上の突然変異と組み合わされて発生する本発明で意図される突然変異体も、本発明で意図される。

本発明は、本発明のこの側面に基づいて定義された核酸分子変異体の発現産物に及ぶ。

従って、本発明は少なくとも１個のアミノ酸の付加、置換及び又は欠失を含む単離されたＢｍｆポリペプチドの変異体であって、該ポリペプチドがダイニン軽鎖と結合、共役、又他の方法で結合できないものである変異体を対象とする。

本発明は本発明のこの側面の核酸分子及びポリペプチドの誘導体に及ぶ。用語「誘導体」は上で定義したように解されるべきである。

既に定義したように、「Ｂｍｆ」及び「ｂｍｆ」と言う場合は、本発明のこの側面に従って定義された変異体分子への言及を含むものと解されるべきである。

本発明のＢｍｆは、二つ以上の分子が共に結合していることを意味する多量体形であっても良い。同じＢｍｆ分子が共に結合している場合、この複合体はホモ多量体である。ホモ多量体の一例はホモ二量体である。少なくとも一つのＢｍｆが少なくとも一つの非Ｂｍｆ分子と結合している場合、この複合体はヘテロ二量体のようなヘテロ多量体である。ヘテロ多量体は、Ｂｃｌ−２ファミリーの別のメンバーの分子又はアポトーシスを調節できる他の分子を含んでも良い。更に本発明は、ＢｍｆとＢｉｍのような他の分子との間の融合、又はハイブリッド、又はヘテロ二量体を意図する。

従って本発明は、哺乳動物におけるｂｍｆの発現を調節する方法であって、ｂｍｆの発現を高レベル調節又は低レベル調節又は別の方法で調節するのに十分な時間及び条件の下で調節に効果的な量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含む方法を意図する。例えば、オリゴヌクレオチドなどのｂｍｆアンチセンス配列は、その細胞（ccll) が生存する能力を向上させるために細胞に導入される場合がある。逆に、Ｂｍｆ又はその誘導体をコードする核酸分子は、内因性ｂｍｆ遺伝子を発現するいずれかの細胞の生存能力を減少するために導入される場合がある。ｂｍｆ発現の調節は、ＢｍｆＲＮＡのスプライシングパターンなどの転写現象及び翻訳現象の調節に及ぶと解されるべきである。

本発明の別の一側面は、哺乳動物におけるＢｍｆの活性を調節する方法であって、Ｂｍｆ活性を増加又は減少させるのに十分な時間及び条件の下で調節に効果的な量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含む方法を意図する。

哺乳動物への薬物投与による該活性の調節は、
（i) ｂｍｆの発現を調節し、
（ii) Ｂｍｆの拮抗薬として機能し、及び
（iii) Ｂｉｍの作用薬として機能する
タンパク質性又は非タンパク質性の分子を該哺乳動物に導入する工程を含むがこれに限定されない幾つかの技術の一つにより達成できる。

該タンパク質性分子は融合タンパク質又は次の例えば天然物スクリーニングを含む天然供給源又は組換え供給源から誘導しても良い。該非タンパク質性分子は、例えば核酸分子であっても良く、又は例えば天然物スクリーニングなどの天然供給源から誘導してもよく、又は化学的に合成しても良い。本発明は、Ｂｍｆの拮抗薬または作用薬として作用できるＢｍｆの化学的類似体を意図する。化学的作用薬は必ずしもＢｍｆから誘導されなくても良いが、特定の立体構造的類似性を共有することがある。また化学的作用薬は、Ｂｍｆの物理化学的な特性を模倣するように特別に設計される場合がある。拮抗薬は、Ｂｍｆがその正常な又は病理学的な生物機能を実行するのを遮断、阻害、又はその他の方法で阻止することができる何らかの化合物でありうる。拮抗薬は、Ｂｍｆの部分又はそのペプチド、Ｂｍｆ又はＢｍｆの部分に特異的なモノクローナル抗体、及び哺乳動物細胞のｂｍｆ遺伝子又はｍＲＮＡの転写又は翻訳を阻止するアンチセンス核酸又はオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。Ｂｍｆ及びｂｍｆの作用薬は、例えば、Ｂｃｌ−２などの反アポトーシス分子と相互作用してそれらの機能的活性を阻止し、それによりアポトーシスを促進する既に定義した誘導体又は変異体分子又はペプチドを含む。作用薬はまた、Ｂｍｆのダイニン軽鎖への結合又はダイニン軽鎖とダイニン中間鎖との相互作用を破壊又は阻止することができる分子を含んでも良い。

該タンパク質性又は非タンパク質性分子は、ｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性を調節するため直接的又は間接的のいずれかで作用して良い。該分子は、ｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性を調節するためＢｍｆ又はＢｍｆと結合する場合には、直接的に作用する。該分子は、他の分子がｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性を直接的又は間接的のいずれかで調節するｂｍｆ及びＢｍｆ以外の分子と結合する場合には、間接的に作用する。

従って、本発明の方法は、ｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性を調節する調節工程のカスケードの誘発を介する、ｂｍｆ又はＢｍｆの発現又は活性の調節を包含する。

ｂｍｆ発現又はＢｍｆ活性の増加は、例えば、癌及び自己免疫疾患における自己反応性リンパ球の減少などの状態における治療又は予防に役立つ。ｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性の減少は、例えばγ線照射や化学療法の間の、又はＨＩＶ／ＡＩＤＳ又は他のウイルス性感染症、虚血、又は心筋梗塞の間の細胞障害状態下などでの細胞死又は細胞の変性の阻害又は阻止を調節するのに役立つ。Ｂｍｆは生殖細胞内で発現するため、ｂｍｆ発現又はＢｍｆ活性の調節は、例えば生殖能力のある精子の生成を阻止することにより、避妊薬又は避妊法として有用である。

本発明の別の一側面は、哺乳動物でアポトーシスを調節する方法であって、ｂｍｆをコードするヌクレオチド配列の発現を調節するのに十分な時間及び条件の下で、効果的量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含む方法を意図する。

本発明のまた別の一側面は、哺乳動物におけるアポトーシスを調節する方法であって、Ｂｍｆの活性を調節するのに十分な時間及び条件の下で、効果的量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含む方法を意図する。

本発明のまた別の一側面は、哺乳動物におけるアポトーシスを調節する方法であって、効果的量のＢｍｆ又はｂｍｆ又はその誘導体を該哺乳動物に投与する工程を含む方法を意図する。

用いられるＢｍｆ、ｂｍｆ又はその誘導体または薬物はまた、Ｂｍｆ、ｂｍｆ又は薬物を標的細胞に特異的に送達するモノクローナル抗体などの標的化手段に連結されてもよい。

本発明の好ましい実施態様では、この方法で使用されるＢｍｆ、ｂｍｆ又は薬物は、これらの細胞に特異的に送達することを可能にするために、該標的細胞に特異的な抗体に連結される。

Ｂｍｆ又はｂｍｆの調節は、他の分子又はｂｉｍ又はＢｉｍなどの遺伝子、これらに限定されないが、の調節と同時に又は逐次的に行なっても良い。

医薬組成物の形でのＢｍｆ、ｂｍｆ又は薬物の投与は、任意の便利な手段により行っても良い。医薬組成物のＢｍｆ、ｂｍｆ又は薬物は、個々の場合によって決まる量で投与される場合に治療活性を示すことを意図する。このバリエーションは、例えばヒト又は動物、及びＢｍｆ、ｂｍｆ又は選択される薬物によって決まる。広範囲の投与量が適用できるであろう。例えば患者を考慮して、体重１キログラム当たり１日に約０.０１ｍｇから約１０ｍｇのＢｍｆ又は薬物が投与されることがある。投薬計画は、最適な治療反応が得られるように調節して良い。例えば、数回の分割投与は、毎日、毎週、毎月又は他の適切な時間間隔で投与される場合もあれば、状況の緊急性に応じて比例して減少される場合もある。Ｂｍｆ又は薬物は、経口、静脈内（水溶性の場合）、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内又は座薬又は移植（例えば、徐放性分子を用いて）によるなどの便宜的な方法で投与して良い。特にＢｍｆ又は薬物に関して、これらのペプチドは酸付加塩又は例えば亜鉛、鉄などとの金属錯塩など（これらは本出願の目的では、塩とみなされる）の、薬学的に許容されうる無害の塩の形で投与して良い。このような酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などがある。もし活性成分が錠剤の形で投与されるのであれば、この錠剤はトラガカントゴム、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、アルギン酸などの崩壊剤、及びマグネシウムステアリン酸塩などの潤滑剤を含んでも良い。

本発明の更なる側面は、哺乳動物の疾病状態における本発明の使用に関する。例えば、本発明は特に、癌、変性疾患、自己免疫疾患、ウイルス感染に対する治療又は予防における使用、又は生殖細胞調節への使用に適用できるが、これらに限定されない。

従って、本発明の別の側面は、哺乳動物を治療する方法であって、該方法がｂｍｆの発現を調節するのに十分な時間及び条件の下で効果的量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含み、該調節が結果としてアポトーシスの調節をもたらすものである方法に関する。

また別の一側面では、本発明は哺乳動物を治療する方法であって、該方法がＢｍｆの活性を調節するのに十分な時間及び条件の下で効果的量の薬物を該哺乳動物に投与する工程を含み、該調節が結果としてアポトーシスの調節をもたらすものである方法に関する。

別の一側面では、本発明は哺乳動物を治療する方法であって、アポトーシスを調節するのに十分な時間及び条件の下で効果的量のＢｍｆ又はその誘導体を哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。

本発明のまた別の側面は哺乳動物を治療する方法であって、アポトーシスを調節するのに十分な時間及び条件の下で効果的量のｂｍｆ又はその誘導体を該哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。

また別の側面では、本発明はアポトーシス調節のための医薬の製造における、ｂｍｆ又はその誘導体の発現を調節できる薬物の使用に関する。

本発明の別の側面は、アポトーシス調節のための医薬の製造における、Ｂｍｆ又はその誘導体の発現を調節できる薬物の使用に関する。

本発明の更なる側面は、アポトーシス調節のための医薬の製造における、Ｂｍｆ又はｂｍｆ又はその誘導体の使用に関する。

本発明のまた別の側面は、ｂｍｆ発現の調節に用いられる薬物であって、該ｂｍｆ発現の調節がアポトーシスを調節するものである薬物に関する。

本発明の更に別の側面は、Ｂｍｆ発現の調節に用いられる薬物であって、該Ｂｍｆ発現の調節がアポトーシスを調節するものである薬物に関する。

本発明の別の一側面はアポトーシス調節に用いられるＢｍｆ又はｂｍｆ又はその誘導体に関する。

本発明の関連する側面では、治療を受ける哺乳動物は治療上又は予防上の処置が必要なヒト又は動物であって良い。

更にまた別の側面では、本発明は一つ以上の薬学的に許容されうる担体及び／又は希釈剤と組み合わせてｂｍｆ発現又はＢｍｆ活性の調節が可能なｂｍｆ、Ｂｍｆ又はその誘導体又は薬物を含む医薬組成物を意図する。

注射可能な用途に適した医薬剤形は、無菌水溶液（水溶性の場合）及び無菌の注射可能溶液を即時調製するための無菌の粉末を含む。この医薬剤形は製造及び保存の条件において安定していなければならず、バクテリア及び菌類などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物及び植物油を含む溶剤又は希釈剤であり得る。適切な流動性が、例えば界面活性剤の使用により維持できる。微生物作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール（thirmerosal）などの様々な抗細菌性及び抗真菌性薬物により、もたらすことができる。多くの場合には、例えば糖又は塩化ナトリウムなどの等張性薬物を含むのが好ましい。注射可能組成物の持続的吸収は、組成物に例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる薬物を用いることで得ることができる。

無菌の注射可能溶液は、必要量の活性な化合物を、活性成分及び必要であれば任意選択的に他の活性成分と共に適当な溶剤中で混合し、その後濾過滅菌又は他の適当な手段で滅菌して調製する。無菌の注射可能溶液の調製用の無菌粉末の場合は、適切な調製法には、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術が含まれ、これにより活性成分プラス付加的に所望される任意の成分の粉末が得られる。

ｂｍｆ、Ｂｍｆ及び／又はＢｍｆの調節因子が適切に保護されている場合には、これらは例えば不活性な希釈剤で又は同化される食用担体と共に経口投与しても良く、又は硬殻ゼラチンカプセル若しくは軟殻ゼラチンカプセルに封入しても良く、又は圧縮して錠剤にしても良く、又は直接食事の食物に混合するか母乳を介して投与しても良い。経口治療投与のために、活性成分は賦形剤と混合し、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、オブラートなどの形で用いて良い。このような組成物及び製剤は少なくとも１重量％の活性化合物を含むべきである。組成物及び製剤のパーセンテージは当然変化し、単位重量の約５から約８０％の間にあるのが便利である。このような治療に有用な組成物の活性化合物の量は、適切な用量が得られる量である。本発明の組成物及び製剤は、経口投薬単位剤形が活性化合物をを約０．１μｇから２００ｍｇまでの間で含むように調製されることが好ましい。別の投薬量としては、約１μｇから約１０００ｍｇまで及び約１０μｇから約５００ｍｇまでが含まれる。これらの投薬量は個人ごと又は体重Ｋｇごとであって良い。投与は時間ごと、日ごと、週ごと、月ごと、又は年ごとであって良い。

錠剤、トローチ、丸薬、カプセル、クリームなどはまた、以下に掲げるような成分を含んでも良い。ゴム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチンなどの結合剤、リン酸二カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及びサッカロース、ラクトース、サッカリンなどの甘味料、又はペパーミント、冬緑油若しくはチェリー香料などの香味料を添加しても良い。投薬単位剤形がカプセルの場合、上の種類の材料に加え、液体担体を含めても良い。他の様々な材料が被覆剤として、またその他の方法で投薬単位の物理的形状を修飾するために存在する。例えば、錠剤、丸薬又はカプセルはシェラック、糖又は両方で被覆しても良い。シロップ又はエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてサッカロース、保存剤としてメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチェリー香料やオレンジ香料などの香味料を含んでも良い。もちろん、如何なる投薬単位剤形を調製する際に使用する如何なる材料も使用量で薬学的に純粋で実質的に無毒性でなければならない。加えて、活性化合物（単数又は複数）は徐放性の製剤及び処方に組み込んでも良い。

薬学的に許容されうる担体及び／または希釈剤は、溶剤、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などのいずれか及び全てを含む。薬学的に活性な物質にこのような媒体及び薬物を使用することは、当分野では良く知られており、従来の媒体又は薬物のいずれかが活性成分と使用禁忌である場合を除き、治療用組成物におけるこれらの使用が意図される。補充的な活性成分も、該組成物に混合できる。

投薬の容易性及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位剤形に処方することは特に有利である。本明細書で使用する投薬単位剤形とは、処置の対象となる哺乳動物に対する均質な投与に適した物理的に分離した単位を指し、それぞれの単位が必要な薬学的担体と一緒に、所望の治療効果を生むよう計算された予じめ定めた量の活性成分を含む。本発明の新規な投薬単位剤形の仕様は、（ａ）活性物質の特有の特性及び達成すべき特定の治療効果、及び（ｂ）本明細書で詳細に開示するように身体的な健康が損なわれた疾病状態を有する生体被験体における疾病の治療用の活性成分を混合する技術に固有の限界、に基づいており、直接依存する。

主要な活性成分は、便利で且つ効果的な投与のために、適切な薬学的に許容されうる担体と共に、効果的な量で、上で開示したような投与単位剤形に配合される。投与単位剤形は、例えば、主要な活性成分を０.５μｇから約２０００ｍｇまでの範囲の量で含むことができる。割合で表すと、活性成分は一般的にｍｌの担体中に約０.５μｇから約２０００ｍｇまで存在する。補充的な活性成分を含む組成物の場合、投薬量は該成分の通常の投薬量と投与方式を参照して決められる。

薬学的組成物はまた、標的細胞をトランスフェクトできるベクターなどの遺伝子分子であって、該ベクターがｂｍｆの発現又はＢｍｆの活性を調節できる核酸分子を保持するものである遺伝子分子を含んでも良い。該ベクターは、例えば、ウイルス性ベクターであることがある。

生理学的な細胞死の調節を必要とする条件には、例えば神経変性疾患、心筋梗塞、筋肉退化症、低酸素症、虚血、ＨＩＶ感染を伴う患者においてアンチセンス配列を利用する細胞の生存を向上させること、又は疾病の治療のために移植される細胞の生存を延長するための条件が含まれる。また、本発明の分子は、例えば腫瘍細胞又は自己反応性リンパ球の生存能力を減少させるのに役立つ。このアンチセンス配列はまた、細胞のインビトロの挙動を調節するために、例えば未確認の成長因子が必要な細胞型から新規な系統を開発するプロトコルの一部として、以下に述べるようなモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の単離を容易にするため、及び遺伝的に改変されている一次移植片由来の細胞の生存を強化するために、用いられることがある。

本発明の又別の一側面は、Ｂｍｆ又はｂｍｆ又はそれらの誘導体に対して特異性を有する抗原結合性の部分を含む免疫相互作用分子を対象とする。

「免疫相互作用分子」とは、抗原結合性部分を含む任意の分子又は該分子の誘導体を指すものと理解すべきである。本発明のこの側面が意図する分子の例には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体（合成抗体、ハイブリッド抗体、ヒト化交代、触媒性抗体を含む）及びＴ細胞抗原受容体結合分子が含まれるが、これらに限定されない。該免疫相互作用分子はモノクローナル抗体であることが好ましい。

この好ましい実施態様に基づき、Ｂｍｆ又はｂｍｆ又はこれらの誘導体に対して特異性を有するモノクローナル抗体を提供する。

「Ｂｍｆ又はｂｍｆに対して特異性を有する」分子とは、Ｂｍｆ又はｂｍｆの一つ以上のエピトープのいずれかに対して特異性を有するモノクローナル抗体などの分子を指すと解すべきである。これらのエピトープは、天然のＢｍｆかｂｍｆ分子か又はその変性された分子のいずれかのの立体構造的エピトープ、線状エピトープ、又は立体構造エピトープ及び線状エピトープの組み合わせであって良い。

より好ましくは、Ｂｍｆに特異性を有するモノクローナル抗体が提供される。

本発明の免疫相互作用分子は自然に発生しても良く、合成又は組換えで生産しても良い。例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、Ｂｍｆ又はｂｍｆに対する自然発生する抗体から選択しても良く、又はＢｍｆ又はｂｍｆに対して特異的に生産させても良い。後者の場合、Ｂｍｆ又はｂｍｆはまず担体分子と混合する必要がある場合がある。本発明の抗体及び／または組換えＢｍｆは、治療薬又は診断薬として特に有用である。代わりにＦａｂ断片のような抗体の断片を用いても良い。更に、本発明は組換え抗体及び合成抗体、抗体ハイブリッド、及び非Ｂｍｆ抗原に対して生産されるがいずれか一つ以上のＢｍｆエピトープと交差反応する抗体に及ぶ。「合成抗体」は、本明細書では抗体の断片及び抗体ハイブリッドを含むものとみなす。本発明のこの側面の抗体は免疫療法に特に有用であり、アポトーシスを評価したり又は治療計画のプログラムを監視したりするための診断手段として用いても良い。

例えば、Ｂｍｆ及びｂｍｆは、それぞれＢｍｆ及びｂｍｆに対する自然発生抗体をスクリーニングするために用いることができる。これらは、例えば、ある種の変性疾患で発生することがある。

例えば、特異的抗体はＢｍｆタンパク質をスクリーニングするのに使用できる。後者は、細胞抽出物又は他の生体液におけるＢｍｆのレベルをスクリーニングする手段として、又は培養上清から組換え手段で作られたＢｍｆを精製する手段として、重要であろう。本明細書で意図する検定技術は当分野で知られており、例えば、サンドイッチ検定法、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーを含む。

上で議論した最初に述べた抗体に向けた任意の第二抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は抗体の断片）を含めることは、本発明の範囲内である。第一抗体及び第二抗体の両方を検出検定で用いても良く、又は第一抗体を市販の抗免疫グロブリン抗体と共に用いても良い。本明細書で意図する抗体には、Ｂｍｆのいずれかの領域に特異的ないずれの抗体も含まれる。

ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は共に、タンパク質誘導体又はペプチド誘導体で免疫化することによって得られ、どちらのタイプも免疫検定に利用できる。両方のタイプの血清を得る方法は当分野で良く知られている。ポリクローナル血清はあまり好ましくないが、適当な実験動物に効果的量のＢｍｆ、又はその抗原性部分を注射し、動物から血清を回収し、既知の免疫吸着技術のいずれかで特定の血清を単離することにより比較的簡単に調製される。この方法で生産された抗体は事実上どのタイプの免疫検定にも利用できるが、これはその生産物の不均一性の可能性があるため、一般的にはあまり好まれない。

免疫検定におけるモノクローナル抗体の使用は、大量に生産できることと生産物の均一性のため特に好ましい。不死の細胞株と免疫原性調製物に感作されたリンパ球を融合することにより誘導したモノクローナル抗体産物用のハイブリドーマ細胞株の調製は、当業者らに良く知られている技術により行うことができる。（例えば、ドイラード及びホフマン，ハイブリドーマに関する基本事実，免疫学概要Vol.，シュヴァルツ編，1981、コーラー及びミルスタイン，Nature 256: 495-499, 1975 、コーラー及びミルスタイン, European Journal of Immunology 6: 511-519, 1976 参照）。

免疫相互作用分子のスクリーニングは、時間がかかり労働集約的作業である。しかしながら、本発明者らは、限定はしないがＢｍｆのような低レベルの細胞質タンパク質に対する免疫相互作用分子、特に抗体を同定するための迅速且つ効率的なフローサイトメトリースクリーニング方法を開発した。

本発明のこの側面に基づく方法は、これらの細胞をレポーター分子と一緒に又は別々に対象の抗体と共に培養した後の細胞集団の分析に基づくものである。この細胞集団は、目的のタンパク質を発現する細胞と目的のタンパク質を発現しない細胞の両方を含むものである。この分析はフローサイトメトリー分析であることが好ましく、目的のタンパク質を発現する細胞は目的のタンパク質をコードする核酸分子でトランスフェクトされそれにより該タンパク質を高レベルで発現するものであることが好ましい。タンパク質が細胞質タンパク質である場合、このタンパク質は目的の抗体と培養する前に透過してしまう。目的のタンパク質を発現しない細胞と発現する細胞の両方を含む細胞集団をスクリーニングすることにより、対象の抗体が目的のタンパク質に対するものである場合には二重の蛍光ピークが観察されるので、どの抗体が目的のタンパク質と結合するかの決定は単純になる。低い方の強度のピークはバックグラウンド染色を表し、一方高い方の蛍光強度のピークは特定染色の結果である。この方法でスクリーニングされた抗体が目的のタンパク質に対するものでない場合、低い蛍光強度のピークが１本観察される。目的のタンパク質に特異的でないが両方の細胞集団に存在する未知のエピトープの幾つかと結合する抗体は、高い蛍光強度のピークを１本生じる。この技術は低レベルの細胞質内分子に対する免疫相互作用分子をスクリーニングする迅速且つ正確な方法を提供する（オーライリー、1998、上記）。

従って、本発明の別の一側面は、細胞によって生産される目的タンパク質に特異的な、試料内の、免疫相互作用分子を検出する方法であって、該方法が、免疫相互作用分子が該試料内に存在する場合には、それが該目的のタンパク質と相互作用するのに十分な時間及び条件の下で、目的のタンパク質を生産する細胞と目的のタンパク質を生産しない細胞を定義された比率で含む細胞細胞集団とテスト対象の試料とを接触させる工程、及び該免疫相互作用分子−タンパク質複合体を検出手段にかける工程を含む方法を提供する。

該免疫相互作用分子は抗体であることが好ましい。

該検出手段は、検出可能なシグナルを与えることができるレポーター分子で標識化された抗免疫グロブリン抗体を含むことが更に好ましい。該レポーター分子が蛍光色素であればさらに好ましい。

「試料」とは、抗体などの免疫相互作用分子を潜在的に含む任意の試料を指すものと解すべきである。該免疫相互作用分子は天然、組換え又は合成手段によって生産されうる。

本発明の方法は、本発明の試料と共にインキュベートされた細胞をフローサイトメトリー分析にかけて蛍光性シグナルを発生させる工程であって、蛍光性シグナルの差異が該細胞により発現される標的タンパク質と抗体との結合の指標となる工程に基づいている。

本明細書で例示する方法は、Ｂｍｆのエピトープに対する抗原結合部位を含む免疫相互作用分子をスクリーニングする方法に関するが、これに限定しない。前骨髄単球細胞株であるＦＤＣ−Ｐ１を、Ｂｃｌ−２発現構築物及びＥＥ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）エピトープで標識されたＢｍｆ構築物でトランスフェクトする。Ｂｃｌ−２でトランスフェクトした細胞対Ｂｍｆでトランスフェクトした細胞の比率を１：１に固定し、これを透過処理し、ハイブリドーマ上清などの目的の免疫相互作用分子と接触させる。抗体と結合した細胞内分子を可視化することは、例えば蛍光標識したレポーター分子の使用を含む当業者らに知られた幾つかの技術により達成できる。目的の抗体がＢｍｆに対して産生された場合、二本の蛍光のピークが観察され、強度の低い方のピークはＢｃｌ−２でトランスフェクトされた負の対照細胞のバックグラウンド染色を表す。

本発明の別の側面では、本発明の分子はまた、Ｂｍｆによって調節される障害の診断などの適用に使用するためのスクリーニングの標的として役に立つ。例えば、癌、変性疾患又は不妊症の素因又は進行の指標としての組織内のＢｍｆ又はｂｍｆのレベルのスクリーニングなど。本発明のこの側面のスクリーニングはまた、Ｂｍｆ又はｂｍｆにおける突然変異の検出に向けられる場合がある。

従って、本発明の別の側面は、被験体から得た生体試料中のＢｍｆを検出する方法であって、免疫相互作用分子−Ｂｍｆ複合体が形成するのに十分な時間及び条件の下で、該生体試料を既に定義したＢｍｆ又はその誘導体に特異的な免疫相互作用分子と接触させる工程、次いで該複合体を検出する工程を含む方法を意図する。

該免疫相互作用分子は抗体であることが好ましい。該抗体はモノクローナル抗体であればさらに好ましい。

本発明のこの側面の生体試料とは、被験体から得た組織を含む任意の試料を指すと解されるべきであって、該「組織」は生体液、生検試料、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ特性などの、それらに由来する組織または流体または抽出物の何らかの形のものを含む最も広い意味に解釈されるべきである。

本発明のさらに別の側面は、被験体から得た生体試料中のｂｍｆを検出する方法であって、免疫相互作用分子−ｂｍｆ複合体が形成するのに十分な時間及び条件の下で、該生体試料を既に定義したｂｍｆ又はその誘導体に特異的な免疫相互作用分子と接触させる工程、ついで該複合体を検出する工程を含む方法を意図する。

「免疫相互作用」分子とは、ｂｍｆ又はＢｍｆまたはその誘導体と共役し、結合し又は他の方法で結合する任意の分子を指すものと理解されるべきである。例えば、該相互作用分子は、核酸分子又は抗核抗体であっても良い。

Ｂｍｆの存在は、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー法などの幾つかの方法で測定して良い。ＢｍｆｍＲＮＡ若しくはＢｍｆＤＮＡは、例えば正常所在位置でのハイブリッド形成又はノーザンブロット法、又はサザンブロット法により検出されうる。これらは当然、伝統的な競争タイプの結合検定法だけでなく、１部位及び２部位の両方、又は非競争タイプの「サンドイッチ」検定法を含む。これらの検定法には、標的に対する標識化抗体の直接結合法も含まれる。

サンドイッチ検定法は、数ある中でも最も有用で、一般的に用いられる検定法であり、本発明での使用にも好適である。サンドイッチ検定技術の幾つかの変法が存在し、それらのいずれも本発明に包含されるつもりである。簡単に言えば、典型的なフォワード検定では、無標識抗体を固体基体上に固定化し、テストの対象となる試料を結合した分子と接触させる。次いで、適当なインキュベーション期間、即ち抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間の後、検出可能なシグナルを発することができるレポーター分子で標識化され且つ抗原に特異的な第二抗体を付加して、第二の抗体−抗原−標識化抗体の複合体を形成するのに十分な時間インキュベートする。無反応な物質はすべて洗い流し、抗原の存在をレポーター分子が発するシグナルを観察することにより測定する。その結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものでも、既知量のハプテンを含む対照試料との比較による定量的なものでも良い。フォワード検定の変法は、試料と標識抗体の両方が同時に結合抗体に付加される同時検定を含む。これらの技術は、容易に明らかになると思われる僅かな変法をも含め、当業者らに良く知られている。本発明によれば、試料は細胞抽出物、組織生検、又はおそらく血清、唾液、粘膜分泌物、リンパ液、組織液、及び呼吸液を含む、Ｂｍｆを含むと思われる試料である。従って、この試料は一般的には生体液を含む生体試料であるが、発酵液や細胞培養液などから得られる上清にも及ぶ。

典型的なフォワードサンドイッチ検定法では、Ｂｍｆまたはその抗原部分に対して特異性を有する第一抗体を、共有結合的又は受動的のいずれかで固体表面に結合する。この固体表面は典型的にはガラス又は重合体で、最も一般的に使用される重合体は、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンである。この固体支持体は管、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又は免疫検定を行うのに適した他の任意の表面の形態であって良い。結合工程は当分野で良く知られており、一般的に架橋的共有結合又は物理的吸着から成り、重合体−抗体複合体はテスト試料のために調製時に洗浄する。次にこの固相の複合体にテスト対象の試料の一部を添加し、この抗体に存在するサブユニットのいずれかと結合させるのに十分な時間（例えば２〜４０分、又はより都合がよければ一晩）及び適切な条件の下（例えば２５℃など、室温から約４０℃まで）でインキュベートする。このインキュベーション期間の後、抗体サブユニット固相を洗浄して乾燥し、このハプテンの一部に特異的な第二抗体と共にインキュベートする。この第二抗体は、第二抗体のハプテンへの結合を示すために用いられるレポーター分子と連結されている。

代わりの方法は、生体試料内の標的分子を固定する工程、次いでこの固定された標的を、レポーター分子で標識化された又はされていない特異的な抗体と接触させる工程を含む。標的の量及びレポーター分子のシグナルの強度に応じて、結合した標的は抗体での直接標識化により検出可能となりうる。また、第一抗体に特異的な標識化された第二抗体は、標的−第一抗体複合体に曝され、標的−第一抗体−第二抗体の三重複合体を形成する。この複合体は、レポーター分子が発するシグナルにより検出される。

本発明で用いる「レポーター分子」は、その分子の化学的性質により抗原結合抗体の検出を可能とする分析的に同定可能なシグナルを発する分子を意味する。検出は定性的又は定量的のいずれであっても良い。この種の検定で普通に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光団又は放射性核種含有分子（即ち、放射性同位体）及び化学発光性分子のいずれかである。

酵素免疫測定法の場合、酵素は一般的にはグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸を用いて第二抗体に結合される。しかしながら、容易に分かるように、多種多様の異なる結合技術が存在し、これらは容易に熟練技術者らに利用可能である。通常使用される酵素には、中でもホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的には対応する酵素による加水分解により検出可能な色の変化を引き起こすことで選ばれる。適当な酵素の例には、アルカリフォスファターゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。上で述べた色素生産性基質ではなく蛍光性産物を生ずる、蛍光発生的基質を採用することも可能である。どの場合においても、酵素標識化された抗体を第一抗体ハプテン複合体に添加し、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。適切な基質を含む溶液を次に抗体−抗原−抗体の複合体に添加する。この基質は第二抗体に連結された酵素と反応して定性的な可視性シグナルを生じ、これは更に通常分光光学的に定量化されて試料中に存在するハプテンの量を示すことになる。「レポーター分子」はまた、ラテックスビーズ上の赤血球などの細胞凝集又は凝集阻止の使用にも及ぶ。

また、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光化合物は、その結合能力を変えることなく抗体に化学的に結合しうる。特殊な波長の光を照射することで活性化された場合、この蛍光色素で標識化された抗体はその光エネルギーを吸収し、分子内で励起状態を誘発し、その後光学顕微鏡で可視的に検知できる特有の色の光を放射する。ＥＩＡの場合のように、蛍光で標識化された抗体を第一抗体−ハプテン複合体に結合させる。結合しなかった試薬を洗い落とした後、残った三重複合体を次に適切な波長の光に曝す、観察された蛍光は目的のハプテンの存在を示す。免疫蛍光技術及びＥＩＡ技術は共に当分野で極めて良く確立されており、特に本方法には好ましい。

しかしながら、放射性同位元素、化学発光分子又は生物発光分子などの他のレポーター分子もまた、採用される場合がある。

本発明はまた、ｂｍｆ又はその誘導体を検出するためのＰＣＲ分析などを含む遺伝子検定法をも意図する。

本発明は更に、ｂｍｆの一方又は両方の対立遺伝子が、単独で、又はＢｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、ｂｌｘ３及び／又はＰｕｍａをコードする遺伝子など（これらに限定されない）の別のＢｃｌ−２分子の一方又は両方の対立遺伝子における別の突然変異と組み合わさって、突然変異している遺伝子改変動物を提供する。これらの動物はまた、他の遺伝子又は遺伝子の対立遺伝子でも突然変異を有しうる。この遺伝子改変動物は、ネズミ種（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、モルモット又はハムスターなどの実験動物、ヒツジ、ブタ、ウマ又はウシなどの家畜動物、又は霊長類などの非ヒト哺乳動物であることが好ましい。遺伝子改変動物はマウス又はラットなどのネズミ種であるのが便利であり好ましい。

遺伝子改変は、一般的には１個又は複数のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は付加又は逆位又は挿入などの突然変異の形である。一般的に、このような遺伝子改変動物は「ノックアウト」動物と呼ばれる。

一般的に改変動物及び特にノックアウトネズミ科動物は、かなりの数の手段で調製しうる。一つの方法では、相同的組換えさせるのに十分な程、ｂｍｆ又はｂｉｍなどの標的配列と相同的なヌクレオチド配列を含む標的に向かう（targeting)ＤＮＡ構築物を調製する。ｂｍｆ又はｂｉｍを標的とする配列は標的Ｂｍｆ又はＢｉｍ配列に対して相同遺伝子（isogenic) 又は非相同遺伝子でありうる。標的に向かうＤＮＡ構築物は、一般的に相同的組み換えにより、該標的ｂｍｆ又はｂｉｍ遺伝子が挿入突然変異によって破壊されるように、標的に向かう配列内に選択可能マーカーを含む。この標的に向かうＤＮＡ構築物は一般的に胚性幹細胞又は胚性幹細胞株に導入される。適当な標的に向かうベクターの一つを図５Ａに示す。

選択可能マーカーを用いる別のものとして、後に選択又は検知され得る表現形の変化を誘発する突然変異が導入される場合がある。

従って、本発明の別の一側面は、遺伝子的に改変された非ヒト動物を生産する方法であって、該方法が１個又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／または欠失又は逆位又は挿入を保持するｂｍｆヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を動物の胚性幹細胞中に導入する工程であり、相同組換えを選択する該胚性幹細胞のゲノム内に、ｂｍｆ遺伝子との相同組換えを促進するのに十分なｂｍｆヌクレオチド配列が存在するものである工程、及び突然変異したｂｍｆ遺伝子を保持する胚性幹細胞を選択する工程、及び次いで該胚幹細胞から遺伝子改変動物を作成する工程、を含む方法を提供する。

この遺伝子改変動物は、マウスやラットなどのネズミ種であることが好ましい。

Ｂｍｆヌクレオチド配列は、該胚幹細胞内のｂｍｆ遺伝子に対して相同遺伝子的であっても非相同遺伝子的であっても良い。

用語「相同遺伝子的」とは、構築物中のｂｍｆヌクレオチド配列が胚性幹細胞が誘導されたのと同じ動物系統から誘導されることを意味する。

本発明は、非相同的に媒介された標的ＤＮＡ配列の組み込みを更に意図する。

様々な選択可能マーカーが採用され、一般的方法論については、米国特許第５，７８９，２１５を参照しうる。

上の方法は、ｂｍｆに加え、他のＢｃｌ−２遺伝子（例えば、Ｂｉｍ、Ｂｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ、Ｈｒｋ、Ｎｏｘａ又はＰｕｍａ）及び／又は他の構造遺伝子又は調節遺伝子などの異なる遺伝子中に複数の突然変異を導入するためにも、同様に適用して良い。

育種プロトコルもまた、Ｂｍｆ中に突然変異又は他の遺伝子改変を導入するために適用して良い。ひとつのアプローチでは、ＥＭＳ又は他の突然変異を誘発したマウスを、Ｇ１世代を作成するため非突然誘発性マウスと交雑する。このＧ１世代は次に指標系統と交雑してＧＩＦＩ家系を作成する、これは次にｂｍｆにおける突然変異を表現形的にスクリーニングしうる。ｂｍｆでの突然変異は優性でも劣性であって良く、突然変異はｂｍｆについて直接、又はその別の遺伝子に対するその効果により、又はその別の遺伝子に対する最初の突然変異の効果を緩和する際におけるその効果で検出してもよい。

ｂｍｆ対立遺伝子の一方又は両方において単独で又は他のＢｃｌ−２ファミリー遺伝子などの他の遺伝子における突然変異と組み合わされて突然変異を保持するノックアウトマウスを含む遺伝子改変動物は全て、本発明に包含される。

本発明は、以下の限定的でない実施例を用いて更に説明する。

Ｂｍｆの同定及びクローニング
本発明者らは、胚形成である役割を果たした新規なＢＨ３のみタンパク質を探索した。Ｍｃｌ−１欠乏マウスは、生存促進Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを欠いたノックアウトマウス全てのうちで最も深刻な発生的欠陥を有するので、Ｍｃｌ−１を餌として用いた。Ｂｍｆ（Bcl-2 modifying factor（bcl-2 変更因子））は、Ｍｃｌ−１を餌として用いた１７日のマウス胚ライブラリーの酵母２ハイブリッドスクリーニングにより同定した。

１７日のマウス胚からの又は胚期９日から分娩後１日までのマウスの胚からのｃＤＮＡライブラリーをｐＡＤ−ＧＡＬ４−２.１（ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２.１キット、ストラタジーン）で調製した。ベイトベクターは、その疎水性Ｃ末端をコードする配列を欠いたマウスｍｃｌ−１をｐＧＢＴ−９（クローンテック）中にクローニングして作成した。酵母形質転換及びプラスミドレスキューは既に記載したとおり実行した（プサラカスら、1999、上掲）。７×１０⁵クローンをスクリーニングし、一つの陽性クローンを得た。Ｍｃｌ−１と新規なタンパク質の間の相互作用はβガラクトシダーゼ染色法（プサラカスら、1999、上掲）で確認した。配列分析から、このクローンが５’末端を欠いた部分的なものであることが明らかになった。この部分的なクローンをプローブとして用いて、ｐ５３^-/-ＫＯ５２ＤＡ２０胸腺種細胞株から誘導されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより（ストラッサーら、Cell 79: 329, 1994）、全長クローンを単離した。ヒトｂｍｆはマウスｂｍｆをプローブとして用いてヒト活性化Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして単離した。Ｂｍｆ相互作用タンパク質をスクリーニングするために、選択マーカーとしてクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの遺伝子を保持するｐＧＢＴ−９誘導体中にマウスｂｍｆをサブクローニングした。５×１０⁶個のスクリーニングしたクローンのうち、６０個の陽性クローンが最初に選択され、そのうち６個が後に誤った陽性であると分かった。

詳細な配列分析（クローら、1994、上掲）から、ＢｍｆがＢｉｍ、Ｂｉｋ及びＥＧＬ−１で見出されたものに最も類似するＢＨ３ドメインを保持することが明らかになった（図１Ａ及びＢ）。酵母２ハイブリッドシステムでは、ＢｍｆはＭｃｌ−１及び他の生存促進Ｂｃｌ−２タンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_L及びＢｃｌ−ｗ）とは相互作用したが、テストしたアポトーシス促進ファミリーメンバー（Ｂａｘ、Ｂｉｄ及びＢａｄ）とは相互作用しなかった。２９３Ｔ細胞で一時的に過剰発現した場合、Ｂｍｆは生存促進Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーであるＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｗ、並びにＢｃｌ−ｘ_L及びＭｃｌ−１と免疫共沈降できた（図１Ｃ）が、アポトーシス促進Ｂａｘ又はＢＨ３のみタンパク質Ｂｉｍに結合しなかった。ＢｍｆとＢｃｌ−２又はＢｃｌ−ｗとの相互作用は、そのＢＨ３ドメイン内の不変性ロイシン（Ｌ１３８Ａ）を突然変異させることにより、大きく減少した（図１Ｃ）。更に、Ｂｃｌ−２のＢＨ１（Ｇ１４５Ｅ）ドメイン又はＢＨ２（Ｗ１８８Ａ）ドメイン内で保存された残基の突然変異は、そのＢｉｍ（オコーナーら、EMBO J. 17: 384, 1998）又はＢａｘ（インら、Nature369: 321, 1994）への結合を破壊するものであるが、これはまたそのＢｍｆへの結合をも破壊する。内因性Ｂｍｆが、界面活性剤で溶解されたＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（図１Ｄ）由来の内因性Ｂｃｌ−２と免疫共沈降できたことは重要である。これは、これらのタンパク質が過剰発現した場合にのみ結合するという可能性を排除する。

Ｂｍｆの生物学的活性は、それをジャーカットヒトＴリンパ腫細胞中で、並びに安定にトランスフェクトされたＬ９２９マウス線維芽細胞中で（図１Ｅ）、又はＩＬ−３依存性ＦＤＣ−Ｐ１マウス前骨髄球細胞中で（図２Ｃ）、一時的に過剰発現させて調べた。Ｂｍｆの発現は２４時間以内に約８０％のジャーカット細胞でアポトーシスを誘発し、Ｌ９２９線維芽細胞コロニーの形成を約６５％減少させた（図１Ｅ）。Ｂｍｆに誘発されたジャーカット細胞のアポトーシスは、カスパーゼ阻害因子バキュロウイルスｐ３５によって、又はＢｃｌ−２又はその同族体（Ｂｃｌ−ｘ_L、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１）の共発現によって遮断されたが、Ｂｃｌ−２のＢＨ１（Ｇ１４５Ｅ）ドメイン又はＢＨ２（Ｗ１８８Ａ）ドメインによっては遮断されなかった。そのアポトーシス促進活性と一致して、Ｂｃｌ−２（またはその同族体の一つ）も発現した場合にのみ、ＦＤＣ−Ｐ１細胞内で高レベルのＢｍｆが安定して発現できた。このようなＢｍｆ／Ｂｃｌ−２を共発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞は、サイトカイン除去、γ−照射、又はエトポシドによる治療に応答してＢｃｌ−２発現細胞よりも急速に死滅した（図２Ｃ）。実施された全ての細胞死検定において、ＢＨ３ドメインを欠いたＢｍｆ突然変異体又はその中にＬ１３８Ａ突然変異を有するＢｍｆ突然変異体は不活性であった（図１Ｅ及び２Ｃ）。これらの結果は、Ｂｍｆが生存促進Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに結合してアポトーシスを開始するＢＨ３のみタンパク質であることを立証する。

Ｂｍｆの発現パターン
Ｂｍｆの発現パターンを、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、及びウェスタンブロット法で研究した。Ｂリンパ系及びＴリンパ系、骨髄質系又は繊維芽細胞質系起源の細胞株の多くで、及びＥ９から誕生までの全ての発生過程におけるマウス胚で、ｂｍｆｍＲＮＡが見つかった（図１Ｆ）。アフィニティ精製されたウサギのポリクローナル抗体又はラットのモノクローナル抗体（後述）を用いた細胞溶解物のウェスタンブロット法は、多くの器官でＢｍｆに相当する単一バンドを検出し、膵臓、肝臓、腎臓及び造血組織で突出したレベルを示した（図１Ｇ）。従って、Ｂｍｆは胚形成の間、多くの成熟組織で発現される。

ダイニン軽鎖及びＢｍｆに対するモノクローナルラット抗体は、既発表のプロトコル（オーライリーら、1998、上掲）を用いて作成した。簡単に言えば、ウィスターラットを精製した組換えマウスＤＬＣ１／ＬＣ８又はマウスのＢｍｆで免疫化した。免疫化したラットの脾臓細胞をＳｐ２／０骨髄腫細胞と融合した。その結果得られたハイブリドーマクローンを、特定の抗体の生産について、免疫蛍光染色分析及びフローサイトメトリー分析でスクリーニングした。ハイブリドーマは２回クローニングし、抗体はタンパク質−Ｇカラム（アマシャムファーマシア）上で又はＭＡＲ１８.５（モノクローナルマウス抗ラットＩｇｋ）抗体と結合したセファロースカラム上のいずれかで精製した。モノクローナル抗体１１Ｆ７（ラットＩｇＧ２ａ／κ）はマウス及びヒトＤＬＣ１／ＬＣ８及びＤＬＣ２を認識したが、一方１０Ｄ６（ラットμ／κ）はマウス及びヒトＤＬＣ１／ＬＣ８を検出するがＤＬＣ２は検出しない。モノクローナル抗体９Ｇ１０及び１２Ｅ１０（共にラットγ２ａ／κ）はウェスタンブロット法及び免疫沈降法で内因性のマウス及びヒトのＢｍｆを検出する。ポリクローナル抗Ｂｍｆ抗体を作成するため、ニュージーランドホワイト種ウサギを５００μｇの組換えマウスＢｍｆで免疫化した。３週間の間隔で増幅免疫を与えた。１２日後に血清を採取し、組換えマウスＢｍｆタンパク質と結合したセファロースカラム上で精製した。

アポトーシスの構造
ｂｍｆ発現がアポトーシス刺激により誘発されるのかどうかを検討するため、サイトカイン欠乏、γ照射又はデキサメタゾンによる処置又はイオノマイシンを含む様々な形のストレスに曝した胸腺細胞由来のｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した（後述）。これらの刺激はどれもｂｍｆ発現に何の影響も与えず（図２Ａ）、Ｂｍｆが翻訳後に恐らくは他のタンパク質との相互作用により調節される可能性について研究させるように本発明者らを駆り立てた。Ｂｍｆを餌として用いたマウス胚ｃＤＮＡライブラリの酵母２ハイブリッドスクリーニングは１４の独立のＭｃｌ−１クローンと、驚くべきことに、ダイニン軽鎖（ＤＬＣ）をコードする４０を超えるクローンを単離した。先に行ったスクリーニングでは、Ｂｉｍは専らＤＬＣ１／ＬＣ８を単離した（プサラカスら、1999、上掲）。対照的に、Ｂｍｆと相互作用するダイニン軽鎖のほとんどは密接な関係にあるタンパク質ＤＬＣ２をコードしていた（ネスビッツら、J. Neurosci.20: 4524, 2000）。一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞での共免疫沈降実験は、ＢｍｆとＤＬＣ２との相互作用を確認した（図２Ｂ）。配列比較では、ＢｍｆがＢＨ３ドメインに加え、ＤＬＣ１／ＬＣ８とのその結合を媒介するＢｉｍ（ａａ５１−ＤＫＳＴＱＴＰＳＰ）内の領域と良く類似する短い領域（ａａ６７−ＤＫＡＴＱＴＬＳＰ）を有することが明らかになった（図１Ａ）。これはＢｍｆのＤＬＣ結合モチーフであり、その内部での突然変異（Ａ６９Ｐ又はＤ６７Ｋ６８Ａ６９＞ＡＡＡ、以後ＡＡＡ突然変異と呼ぶ）が酵母細胞及び哺乳動物細胞においてＢｍｆとＤＬＣ２との相互作用を排除するためである（図２Ｂ）。さらに、ＩＬ−３欠乏又はγ照射において、Ｂｃｌ−２及びＢｍｆの非ＤＬＣ２結合突然変異体を共発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞は、Ｂｃｌ−２及び野生型Ｂｍｆを共発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞よりも急速に死滅した（図２Ｃ）。これらのＢｍｆ突然変異体、野生型Ｂｍｆよりも強力にＬ９２９繊維芽細胞コロニーの形成をも抑制した。従って、ＤＬＣ２との相互作用はＢｍｆのアポトーシス促進活性を負の方向で調節する。

ｂｍｆｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析は次のプライマーを用いて実施した：５’（センス）プライマー ５’ＣＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧ３’［配列番号：１１］、３’（アンチセンス）プライマー ５’ＣＡＧＡＧＣＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧ３’［配列番号：１２］。サザンブロット上でのＰＣＲ産物の検出は、内部ｂｍｆプライマー５’ＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡ３’［配列番号：１３］を用いて実施した。ＧＡＰＤＨ発現の分析用に、次のプライマーを使用した：５’（センス）プライマー ５’ＴＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧ３’［配列番号：１４］、３’（アンチセンス）プライマー ５’ＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴＡＧＧＣＣＡＴ３’［配列番号：１５］及び内部プライマー ５’ＣＣＣＧＧＣＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧ３’［配列番号：１６］。

機能モデル
本発明者らが考察した問題は、何故Ｂｍｆは高度に関係のあるパートナー、ＤＬＣ−１又はＤＬＣ−２と結合することにより調節されるのかということである。Ｂｍｆは別々のストレス刺激を感知するために細胞内の部位（複数）に隔離されると提唱する。繊維状アクチンとパクリタキセル（タキソール）重合可能微小管分画への細胞タンパク質の分離は、以前の結果（プサラカスら、1999、上記）と一致して、Ｂｉｍとダイニン中間鎖（ＩＣ７４）は大部分が微小管成分（Ｐ２）と共移動し、一方Ｂｍｆとミオシンは繊維状アクチンを含むＰ１分画に限定されたことを明らかにした（図３Ａ）。更に、サイトカラシンＤ又はＣ．ジフィキリ (dificcili)毒素Ｂなどのアクチン脱重合物質で細胞を処理すると、繊維状アクチンを含むＰ１画分からＢｍｆが解放され、一方Ｂｉｍの分画化は影響されなかった（図３Ｂ）。

細胞下分画のため、５×１０⁶のＭＣＦ−７細胞を１％のトリトン−Ｘ−１００を含む抽出緩衝液５０μＬに溶解した。細胞破砕物及び細胞核を２０００ｇで遠心分離機にかけ除去した。次いで上清を３７℃で１３分間１００μＭのパクリタキセル（タキソール）及び５単位のアピラーゼ（シグマ）と共にインキュベートした。この混合物を次いで７.５％のショ糖（抽出緩衝液内で生成）のクッション０.５ｍＬの上に載せ、３０℃で１４０，０００ｇで３０分間、遠心分離した。このペレットを微小細管Ｐ２画分として、及びその上清をＳ画分として保存した。アクチンが豊富なＰ１画分を微小細管構成成分の混入なしに得るために、ＭＣＦ−７細胞を２時間、２μｇ／ｍＬのコルヒチン及び１μｇ／ｍＬのノコダゾール（nocodazole）の存在下で、溶解に先立って培養した。これらの溶解物は次いで細胞破砕物及び核（上述）を除去し、その後、４℃で６０分間、１４０，０００ｇで遠心分離してペレット（Ｐ１）画分を得た。ショ糖勾配上での抽出物の分画のため、１０⁷の細胞を５００μＬ抽出緩衝液中に溶解した。細胞破砕物及び核を除去した後、その上清を１００μＭのパクリタキセル（タキソール）プラス５単位のアピラーゼで処理し、３７℃で１３分インキュベートした後、５〜２０％のショ糖勾配（１％のトリトンＸ−１００で調整）上に載せ、１５℃で１８時間、１４０，０００ｇで遠心分離した。

ＢｍｆとＢｉｍが別々に局在することは、それらの好ましいダイニン軽鎖パートナーによりほとんど決定される。先の報告（ベナシュスキーら、J. Biol. Chem.272: 20929, 1997）とは反対に、ＤＬＣ１／ＬＣ８のみ又はＤＬＣ１／ＬＣ８とＤＬＣ２の両方のいずれかを識別するモノクローナル抗体を用いて（図３Ｃ）、本発明者らはＤＬＣ２を含むがＤＬＣ１／ＬＣ８を含まない精製したミオシンＶモーター複合体を示した（図３Ｄ）。この観察は、Ｂｍｆが、優先的にＤＬＣ２と結合することにより、ダイニンモーター複合体の一部を形成するのではなく、繊維状アクチン上のミオシンＶと複合体を形成するかもしれないことを示唆する。この考えに一致し、マウスの脾臓細胞からの抽出物を組換えＢｍｆ及びＢｉｍとインキュベートすると、ＢｍｆのみがミオシンＶと結合することが確認された（図３Ｅ）。更に、Ｂｍｆ及びＢｉｍは、ショ糖勾配上でＭＣＦ−７細胞の溶解物の細胞下分画の後に、別々の移動パターンを示した（図３Ｆ）。ＤＬＣ１／ＬＣ８はホモ二量体を形成する傾向が強いので、そしてそれはＢｉｍとＩＣ７４と同じ領域を介して結合する（ローら、J. Biol. Chem.276: 14059, 2001）ので、ＤＬＣ１／ＬＣ８ホモ二量体の一方のパートナーは恐らくＩＣ７４と相互作用し、他方のパートナーはＢｉｍと結合し、それにより微小細管ダイニンモーター複合体にそれを隔離する。ＤＬＣ２ホモ二量体は一方の腕でＢｍｆと結合し他方の腕でミオシンＶと結合することにより、Ｂｍｆを繊維状アクチンに隔離する可能性がある。

本発明者らは次に、Ｂｍｆ及びＢｉｍが、両方のタンパク質を内因的に発現する細胞を用いて、別個のアポトーシス刺激により活性化されるかどうかを調べた。われわれの先の結果（プサラカスら、1999、上記）と一致して、ＭＣＦ−７細胞のＵＶ照射はダイニンモーター複合体が存在するペレット画分からＢｉｍを放出した。健康な又は損傷を受けたＭＣＦ−７細胞の溶解液をショ糖勾配遠心分離で比較すると、ＢｍｆはＵＶ照射に応答して密度の高い画分から低い画分へ転座することも明らかになった（図４Ａ）。微小細管を重合させることで知られる化学療法薬物、パクリタキセル（タキソール）による処置はＢｉｍを放出したがＢｍｆは放出しなかった（図４Ａ）。アポトーシスへのこの経路におけるＢｉｍの重要な役割と一致して、Ｂｉｍを欠いた胸腺細胞はパクリタキセルの細胞障害効果に異常に抵抗する（フリッシュ及びルオスサーティ、Science 286(5445): 1735-1738、 1999）。一方、アノイキス（細胞接着及びインテグリン発信の非存在）、即ちアクチン細胞骨格に影響を与えるアポトーシス刺激（フリッシュ及びルオスラーティ、1997、上記）はＢｉｍではなくＢｍｆの選択的放出をもたらす（図４Ａ）。これらの実験は、カスパーゼの活性化を阻害するのに十分な濃度（５０μＭ）の広域スペクトル性のカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在下で行ったため、Ｂｍｆ及び／又はＢｉｍの放出はアポトーシス変化の結果ではなく、アポトーシスシグナル発信における開始事象を表すようである。重要なことに、本発明者らはアノイキスの間に放出された内因性Ｂｍｆ（ＤＬＣ２と共に）はミトコンドリアから単離された内因性Ｂｃｌ−２と共免疫沈降できることを示した（図４Ｂ）。対照的に、健康な細胞のミトコンドリアから単離されたＢｃｌ−２と複合体を形成することが見出されたＢｍｆは殆どなかった。

集約すると、本発明者らのデータは、Ｂｍｆ及びＢｉｍが細胞ストレスの別の形により惹起される別の死亡シグナルを形質導入する二つのアポトーシス促進性ＢＨ３のみタンパク質を表すことを証明する。これらは細胞の健康を監視するために主要な細胞骨格に搭載された見張り役を表すようである。例えば、パクリタキセルによる微小細管の障害はＢｉｍを活性化するがＢｍｆは活性化せず、一方アクチン細胞骨格に影響を与えるアノイキスは、Ｂｍｆを活性化するがＢｉｍは活性化しない。抗アポトーシスＢｃｌ−２の脱調節による発現は腫瘍形成を促進できるため（ストラッサーら、Nature 348: 331、1990）、アポトーシス促進性のＢＨ３のみタンパク質における異常はガンをも引き起こすことができる可能性がある。ヒトｂｍｆの遺伝子は染色体１５ｑ１４に位置し、多くの転移性ではあるが主要ではない癌腫で失われた候補となる腫瘍抑制遺伝子の部位として同定された（ウィックら、Oncogene 12: 973 、1996）。アノイキスは転移性腫瘍増殖に対する障壁として意味づけられてきた（ルオスラーティ及びリード、Cell77: 477、1994）。１５ｑ１４突然変異を保持する転移性腫瘍は、従って、Ｂｍｆの発現又は機能に異常を有する場合がある。

Ｂｍｆノックアウトマウスの形成
マウスはＣ５７ＢＬ／６へ戻し交配されるＣ５７ＢＬ／６背景で選択する。子孫は野生型又は突然変異型のｂｍｆ遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを使用して遺伝子形を決定する。

ｂｍｆを標的にするベクターは図５Ａに示すように作成する。ネオマイシン又はハイグロマイシンの配列を選択可能マーカーとして用いる。その構築物を胚性幹細胞中に導入し、ネオマイシン又はハイグロマイシンを用いて形質転換された細胞を選択する。次いでこの形質転換された胚性幹細胞を遺伝子改変マウスを形成させるために用いる。

Ｂｍｆのゲノム機構とプロモーター領域の同定
ネズミｂｍｆ遺伝子のゲノム機構を図５Ａに示す。この領域の上流は配列番号：９で略記したようにプロモーター領域を含む。ヒトｂｍｆ遺伝子からの対応するプロモーターは配列番号：１０に略記する。

当業者らは本明細書に記載された発明は具体的に記載されたもの以外に変化及び修正しやすいことを認めるであろう。本発明がこのような変化及び修正を全て含むものと理解すべきである。本発明はまた、本明細書で個別に又は集合的に言及したまたは示した全ての工程、特性、組成物及び化合物、及び、該工程又は特性のいずれか二つ以上の組み合わせのいずれか及び全てを含む。

図１は、Ｂｍｆ、即ち新規な哺乳動物のＢＨ３のみタンパク質を表したものである。（Ａ）マウス及びヒトのＢｍｆのアミノ酸配列の予測。Ｂｉｍのダイニン軽鎖結合モチーフと共に保存されている９個のアミノ酸を、アスタリスク１つ（*）を付けた四角で表す。隠れたマルコフモデル（クローら、 J. Mol. Biol. 235: 1501, 1994）で同定された短いＢＨ３領域は、アスタリスク２つ（**）を付けた四角で表す。（Ｂ）ＢｍｆのＢＨ３領域を他のアポトーシス促進性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーと整列したもの。黒い四角は同一のアミノ酸を示し、灰色の四角は類似する残基を示す。（Ｃ）野生型Ｂｍｆは生存促進Ｂｃｌ−２及びＢＣｌ−ｗと結合するが、ＢＨ３突然変異体は結合しない。共免疫沈降実験は前に記載したとおり（プサラカスら、1999、上掲）に実施した。簡単に言えば、２９３Ｔ細胞を一時的にＦＬＡＧで標識したＢｃｌ−２（又はＢｃｌ−ｗ）及びＥＥ（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）で標識したＢｍｆ又はＬ１３８Ａ突然変異Ｂｍｆの発現構築物と共トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を代謝的に³⁵Ｓ−メチオニンで標識し、一晩培養した後に収穫した。等価のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−沈殿性³⁵Ｓカウントを含む大量の細胞溶解液をＦＬＡＧ又はＥＥエピトープ標識に対するｍＡｂｓとの免疫沈降に用いた。（Ｄ）ＭＣＦ−７細胞におけるＢｃｌ−２と内因性Ｂｍｆとの相互作用。１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００を含む溶解緩衝液内で調製した１０⁷のＭＣＦ−７細胞からの溶解物を、セファロースに結合したＢｃｌ−２−１００（抗−ヒトＢｃｌ−２）ｍＡｂ又は同位体に適合した対照ｍＡｂのいずれかと免疫共沈降した。結合したタンパク質をレムリ緩衝液中（非還元性）中で煮沸してビーズから溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画し、ニトロセルロースフィルターへ転移した。ラットの抗―Ｂｍｆ・ｍＡＢ（９Ｇ１０）を用いてウェスタンブロット法を実施した。アスタリスク（*）は免疫共沈降に使用したｍＡＢの軽鎖を示す。（Ｅ）野生型Ｂｍｆは、Ｌ９２９繊維芽細胞を死滅させたがＢＨ３突然変異体は死滅させなかった。Ｌ９２９繊維芽細胞を、空のベクター即ちハイグロマイシン耐性のみの発現構築物、又は野生型Ｂｍｆ、ＢｍｆのＢＨ３突然変異体（Ｌ１３８Ａ）又はそのＢＨ３領域を欠いたＢｍｆでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をハイグロマイシンを含む培地内で培養し、その結果得られた薬物耐性コロニーを１０〜１４日後に数えた。値は３回の独立した実験の平均値（＋／−ＳＤ）である。（Ｆ及びＧ）細胞株及び組織におけるＢｍｆの発現。ノーザンブロット分析（Ｆ）のため、様々な細胞株又はマウス胚（胚期９日から生後1日）由来の４μｇのポリＡ⁺ＲＮＡを電気泳動し、ブロットし、マウスｂｍｆｃＤＮＡプローブで精査した。ｇａｐｄｈｃＤＮＡクローンによる精査を負荷対照として用いた。ウェスタンブロット分析（Ｇ）のため、種々のマウスの組織からの５０μｇの総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画し、ニトロセルロースフィルター上へ電気ブロットし、Ｂｍｆに対するアフィニティ精製したウサギのポリクローナル抗体で精査した。負荷対象としてＨＳＰ７０に対するモノクローナル抗体による精査を用いた。 図２はＢｍｆがＤＬＣ２との相互作用により調節されることを示す図である。（Ａ）様々はアポトーシス刺激で処理した胸腺細胞におけるｂｍｆｍＲＮＡの発現。総ＲＮＡは、胸腺細胞（新鮮な状態で単離された）から、又はサイトカインの非存在又はデキサメサゾン（１μｇ）、γ照射（１０Ｇｙ）若しくはイオノマイシン（１μｇ／ｍＬ）での処理の状態での培養後の表示時点で単離した。これらの条件はすべて、実質的なアポトーシスを誘発し、従ってどのＲＮＡも処置後７時間後には収穫できなかった。次に２μｇのＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素を用いて逆転写した。ｃＤＮＡの５倍の希釈液をｂｍｆに特異的なプライマーを用いてＰＣＲ分析にかけた。ＰＣＲ産物の移転後、ニトロセルロース濾紙を³²Ｐで標識した内部ｂｍｆオリゴヌクレオチドプローブを用いて精査した。（Ｂ）Ｂｍｆはそのダイニン軽鎖結合領域を介してＤＬＣ２に結合する。共免疫沈降実験は図１Ｃの説明で記載したとおり、ＦＬＡＧで標識されたＤＬＣ２及びＥＥで標識されたｗｔＢｍｆ、ＢｍｆのＢＨ３突然変異体（Ｌ１３８Ａ）又はＢｍｆ（Ａ６９Ｐ又はＡＡＡ）、Ｂｉｄ又はＢａｘのＤＬＣ結合領域突然変異体を一時的に発現する２９３Ｔ細胞の溶解物から実施した。アスタリスク（*）は免疫沈降化に用いたｍＡｂの軽鎖を示す。（Ｃ）ＤＬＣ２との相互作用はＢｍｆのアポトーシス促進効力を調節する。Ｂｃｌ−２プラスＥＥで標識されたｗｔＢｍｆ、ＢｍｆのＢＨ３突然変異体（Ｌ１３８Ａ）又はＢｍｆのＤＬＣ結合領域突然変異体（Ａ６９Ｐ又はＡＡＡ）を安定に発現するＦＤＣ−Ｐ１細胞を、１〜６日間ＩＬ−３欠乏状態とする。細胞可視性はヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリー分析により評価する。値はそれぞれの遺伝子系の４個の独立したクローンで実施した３回の独立した実験の平均値（＋／−ＳＤ）である。 図３はＢｍｆがＤＬＣ２を介してアクチンに基づくミオシンＶモーター複合体と結合することを示す写真である。（Ａ）１０⁷のＭＣＦ−７細胞からの溶解物をＰ１、Ｐ２及びＳ画分中に分けた。次に、それぞれの画分からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画し、ニトロセルロース上へ移転させ、Ｂｍｆ、Ｂｉｍ_L（オーライリーら、Biotechniques 25: 824, 1998）、ミオシンＶ（エスプレフィコら、J. Cell Biol. 119: 1541, 1992）又はダイニン中間鎖ＩＣ７４（シグマ）に特異的なｍＡｂｓを用いて精査した。（Ｂ）ＭＣＦ−７細胞を、サイトカラシンＤ（１０μｇ）又はトキシンＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで３時間処理し、次いで（Ａ）で記載したように分画し処理した。（Ｃ）ＤＬＣ１／ＬＣ８及びＤＬＣ２の両方、又はＤＬＣ１／ＬＣ８のみを認識する新規なｍＡｂｓの特性決定。ＦＬＡＧで標識されたＤＬＣ１又はＤＬＣ２を一時的に発現する２９３Ｔ細胞からの抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流し、ニトロセルロースの膜上へ電気ブロットし、ラットモノクローナル抗体１１Ｆ７（ＤＬＣ１及びＤＬＣ２の両方を認識する）又は１０Ｄ６（ＤＬＣ１のみを認識する）で精査した。矢印で記す分子量が低い方のかすかなバンドは内因性ＤＬＣ１を示す。（Ｄ）ミオシンＶはたいていＤＬＣ２と結合し、一方ダイニンはＤＬＣ１／ＬＣ８と優勢に結合する。細胞質のダイニンはＭＣＦ−７細胞（パスカルら、Methods Enzymol. 196: 181, 1991）から濃縮され、ミオシンＶはマウスの脾臓（ｍ）又はニワトリの脳（ｃ）から精製した（ケニー、 Methods Enzymol. 298: 3, 1998）。これらの濃縮された画分を、ラットｍＡｂｓ１１Ｆ７（ＤＬＣ１／ＬＣ８及びＤＬＣ２を認識する）又は１０Ｄ６（ＤＬＣ１／ＬＣ８のみを認識する）を用いてウェスタンブロット法で分析した。ニトロセルロース膜を、ミオシン及びダイニンモーター分画の純度を立証するため、ミオシンＶ又はＩＣ７４（シグマ）に対する抗体で精査した。（Ｅ）マウスの脾臓細胞からの抽出物（２００μグラムのタンパク質）を組換えＧＳＴ又はＧＳＴで標識したＦＡＤＤと４℃で３時間インキュベートし、Ｂｍｆタンパク質又はＢｉｍ_Lタンパク質、及び結合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ上で回収した。結合タンパク質をレムリ緩衝液（非還元性）中で煮沸してビーズから溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画し、ニトロセルロース膜上へ電気ブロットし、ミオシンＶに対する抗体で精査した（エスプレフィコら、1992、上掲）。このニトロセルロース膜をアミドブラック（ボトムパネル）で染色し、匹敵する量のタンパク質がプルダウン実験で用いられたことを記録した。（Ｆ）１０⁷のＭＣＦ−７細胞からの溶解物を５〜２０％ｗ／ｖのショ糖勾配を通して分画した。そのペレットと可溶性画分を、Ｂｍｆ、Ｂｉｍ、ＤＬＣ１／ＬＣ８又はＤＬＣ２の存在についてウェスタンブロット法で分析した。 図４は、Ｂｍｆ及びＢｉｍがその隔離部位から別々のアポトーシス刺激に反応して放出されることを示す写真である。（Ａ）ＭＣＦ−７細胞を広域スペクトルのカスパーゼ抑制剤ｚＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）の存在下で培養した。対照（未処理）細胞からの溶解物を、アノイキス（ポリ−ヘムでコーティングしたペトリ皿上で懸濁して２４時間細胞を培養）、ＵＶ照射（１００Ｊ／ｍ²）、パクリタキセル（タキソール １μＭ）を含む様々なアポトーシス刺激に曝した細胞からの溶解物と比較した。１０⁷細胞の溶解物をショ糖勾配により分画した。そのペレットと可溶性画分を回収し、Ｂｍｆ及びＢｉｍについて特異的なモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法により分析した。（Ｂ）アノイキスの間、Ｂｍｆはミトコンドリアに転座し、Ｂｃｌ−２と結合する。ミトコンドリアは前に記載したように２×１０⁸の健康なＭＣＦ−７細胞か又はアノイキスに付された細胞から精製した。ミトコンドリアのタンパク質を１％ｖ／ｖのトリトンＸ−１００（プサラカスら、1999、上掲）を含む溶解緩衝液中で抽出した。免疫沈降はセファロースビーズと結合した抗ヒトＢｃｌ−２ｍＡＢ（Ｂｃｌ２−１００）を用いて実施した。結合タンパク質をレムリ緩衝液（非還元性）中でビーズを煮沸して溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでサイズ分画し、ニトロセルロース膜に電気ブロットし、Ｂｃｌ−２、Ｂｍｆ又はダイニン軽鎖に対するｍＡｂｓで精査した。 図５Ａはマウスのｂｍｆ遺伝子座のゲノム機構を示す図式である。 図５Ｂはノックアウトマウスを作成するのに用いられるＮＥＢ１９３ｎｅｏ又はＮＥＢ１９３ｈｙｇｒｏにおけるｂｍｆを標的とする構築物のグラフ図式である。

Claims (12)

1. 配列番号：１または配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
2. 配列番号：１または配列番号：３に記載されるヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
3. 配列番号：２に記載されるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質。
4. 配列番号：２に記載されるアミノ酸配列からなる、単離されたタンパク質。
5. 配列番号：４に記載されるアミノ酸配列からなる、単離されたタンパク質。
6. 請求項３、４または５に記載のタンパク質に対し特異性を有するモノクローナル抗体。
7. 遺伝子改変された非ヒト動物であって、請求項１に記載の核酸分子の一つ又は両方の対立遺伝子が単独で又はＢｌｋ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ及び／又はＰｕｍａをコードする遺伝子など（これらに限定されない）の別のＢｃｌ−２分子の対立遺伝子の一つ又は両方における別の突然変異と組み合わされて突然変異した、遺伝子改変された非ヒト動物。
8. 該動物がマウスである、請求項７記載の遺伝子改変動物。
9. 該動物がラットである、請求項７記載の遺伝子改変動物。
10. 該動物がブタである、請求項７記載の遺伝子改変動物。
11. 遺伝子改変された非ヒト動物を生産する方法であって、該方法が動物の胚性幹細胞中に１個又は複数のヌクレオチドの置換、付加及び／又は欠失又は逆位又は挿入を保持する突然変異した請求項１に記載の核酸分子を含む遺伝子構築物を導入する工程であり、該相同的組換えを選択する該胚性幹細胞のゲノム内部に相同的組換えを促進するのに十分な請求項１に記載の核酸分子が存在するものである工程、及び突然変異した請求項１に記載の核酸分子を保持する胚性幹細胞を選択する工程、及び次いで該胚性幹細胞から遺伝子改変された動物を形成させる工程を含む方法。
12. 遺伝子改変動物がマウス又はラットである請求項１１記載の方法。

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