JP4306491B2 - 液体クロマトグラフ - Google Patents

Description

本発明は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）に関し、例えば高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）の分離カラムにより各成分に分離された試料のうちの微少量をスプリッタにより取り出して質量分析計（ＭＳ）に導くＬＣＭＳシステムに関する。

ＬＣＭＳシステムでは、分離流路上において分析試料を一定流量で送液し、分離カラムで分離した試料成分を含む溶出液の一部を質量分析計に送って検出する。また、その検出結果に基づいて残りの溶出液をフラクションコレクタにより分画して捕集する分取ＬＣＭＳシステムも用いられている。

検出器として質量分析計を用いる場合、質量分析計に導く試料は非常に微量である必要がある。そのため、分離カラムからの溶出液をそのまま質量分析計に導くことができず、溶出液のうちのごく一部だけが質量分析計に導かれるようにスプリッタで分ける必要がある。

分離カラムからの溶出液のごく一部だけを取り出す高比率スプリッタとして、配管抵抗型スプリッタや流路切換えバルブ型スプリッタなどがある。
配管抵抗型スプリッタは、分離カラムからの流路を２つの配管により２流路に分岐させ、その流路抵抗を利用して目的のスプリット比に調節する。しかし、配管抵抗型スプリッタではその原理から使用移動相の組成の変化によってスプリット比も変化してしまうという欠点がある。スプリット比が変化すると検出器で検出する信号強度が変動し、定量性が悪くなる。また、スプリット比が小さくなると、検出器に過大な試料が送られ、特に質量分析検出器汚染の原因となる。

一方、流路切換えバルブ型スプリッタは２つの流路の間を小さな溝が往復することによって流路を切り換え、往復する溝の容積や周期を調節することによって目的のスプリット比に対応させて液体を分ける（非特許文献１参照。）。この方式では、スプリット比が移動相の組成の変化に影響されないシステムの構築が可能になる。
MRA100-000 Mass Rate Attenuator［on line］、２００１年１１月１６日、Rheodyne LLC、［平成２０年１０月１７日検索］、インターネット（ＵＲＬ：http://www.sonic.net/~rheodyne/lit/docs/2320943B.pdf）

流路切換えバルブ型のスプリッタは、その構造からバルブ切換えに伴なう圧力変動を生じる。また、この方式では一方の流路を流れる試料を他方の流路に断続的に導入するので、導入試料の濃度は変動を生じることになる。この圧力変動はクロマトグラムのノイズの原因となり、濃度変動は試料ピーク形状を変形させることになる。

そこで本発明は、流路切換えバルブ型スプリッタを用いたＬＣＭＳシステムにおいて、流路の切換えによって生じる圧力変動や試料の濃度変動を緩和することを目的とする。

本発明は、試料を注入するインジェクションポートと試料を成分に分離する分離カラムを流路上に備えてインジェクションポートに注入された試料を移動相とともに分離カラムに移送して成分に分離する分離流路と、分離流路の下流側先端に接続され、分離カラムからの溶出液を分画捕集するフラクションコレクタと、検出器を流路上に備えて試料成分を検出器に導き試料成分の検出を行なう検出流路と、分離流路の分離カラムとフラクションコレクタの間の流路と検出流路の検出器の上流側の流路との間に接続され、分離流路から溶出液の一部を検出流路に導入する切換えバルブ型スプリッタと、を備え、検出流路は、検出器よりも上流において切換えバルブ型スプリッタの上流側と下流側との間を直接接続するバイパス流路と、切換えバルブ型スプリッタの下流側のバイパス流路との合流点より下流側に設けられたミキサとを備えており、ミキサは検出器で検出される成分のピーク幅とフラクションコレクタに到達した同成分のピーク幅を一致させる容量をもち、フラクションコレクタは検出器からの検出ピークに基づいた信号で分画動作を行なうものであることを特徴とするものである。

流路が切り換えられ検出流路のスプリッタ部分で流路が閉じられても、流れる液体はバイパス流路を通って下流側に流れるので、バルブ切換えに伴なう圧力変動を抑制することができる。また、さらにその下流側にミキサを設けたので、断続的に試料を検出流路に導入してもミキサで混合されてから検出器に送られるので、濃度変動を緩和することができる。
本発明を分取ＬＣＭＳシステムに適用した場合、質量分析計で得たピーク形状が圧力変動や濃度変動の影響をほとんど受けずに滑らかになるので、正確に試料成分を分画捕集することができる。

以下に本発明を適用した分取ＬＣＭＳシステムの一実施例を説明する。図１はその分取ＬＣＭＳシステムの構成を示す流路図である。
４は試料を各成分に分離する分離流路である。分離流路４は移動相として、例えばアセトニトリルと水との溶液が用いられ、その組成がグラジエント機構により時間的に変化させられながら一定流量で送液される。その流路上に、試料を注入するインジェクションポート１２と試料を各成分に分離する分離カラム１４を備えている。また、分離流路４の下流側先端はフラクションコレクタ１６に接続されており、送液されてきた溶出液を分画捕集するようになっている。

８は分離カラムからの溶出液を検出器に導き、試料成分を検出する検出流路である。検出流路８は、メイクアップポンプ２０によって移動相が送液されており、下流側に検出器としてのフォトダイオードアレイ（以下、ＰＤＡという。）２２を備え、さらに下流側に質量分析装置（ＭＳ）２４を備えている。
ＰＤＡ２２は流れてくる液体に特定の波長を持つ光を照射し、その吸光度を測定することにより液体中の成分量を検出する。ＭＳ２４は導かれた試料をイオン化して分析を行なう。

分離流路４と検出流路８との間には、分離流路４においては分離カラム１４の下流で、検出流路８においてはＰＤＡ２２の上流に流路切換えバルブ型スプリッタ２が設けられている。流路切換えバルブ型スプリッタ２は分離流路４と検出流路８との間を一本の小さな溝２ａが往復することにより接続する流路を切り換え、その溝２ａの容積や周期によりスプリット比を調節できるようになっている。

溝２ａが分離流路４側にある場合には、分離カラム１４からの溶出液は溝２ａを流れてフラクションコレクタ１６に導かれる。分離流路４で流路切換えバルブ型スプリッタ２より下流の部分を分画流路と呼ぶ。流路切換えバルブ型スプリッタ２が切り換えられると溝２ａが検出流路８側に移動し、溝２ａを流れていた溶出液は溝２ａとともに検出流路８に移動し、メイクアップポンプ２０からの移動相とともに検出器側に導入される。

２６は検出流路８において流路切換えバルブ型スプリッタ２の上流側と下流側とを直接接続するバイパス流路である。バイパス流路２６は、流路切換えバルブ型スプリッタ２の上流側と下流側を直接接続するように、３方ジョイント３０、３２によって取り付けられている。流路切換えバルブ型スプリッタ２の溝２ａが分離流路４側にある場合には、検出流路８のメイクアップポンプ２０からの移動相はバイパス流路２６を通って流れるので、圧力変動を抑制することができる。バイパス流路２６は溝２ａを通る検出流路８の約１／３程度の流量で移動相が流れるように設定されている。

２８は検出流路８とバイパス流路２６との合流点とＰＤＡ２２の間に設けられたミクロボリュームミキサである。検出流路８には、流路切換えバルブ型スプリッタ２により分離カラム１４からの溶出液が原理的に断続的に導入されるので、検出流路８を流れる液体の試料成分濃度にはムラがある。そこで、検出流路８を流れる液体を検出器の上流側で一定量ずつ混合してからＰＤＡ２２及びＭＳ２４に送ることで、流路切換えバルブ型スプリッタ２の断続的な溶出液の導入によって生じる試料成分の濃度変動を抑制することができる。

ミキサ２８は容量を変えることができるようになっている。検出器で検出されるピーク幅はミキサ２８の容量を変化させることにより調整することができ、ピーク幅を広げる場合にはミキサ２８の容量を大きくし、ピーク幅の広がりを小さくする場合にはミキサ２８の容量を小さくする。これは、ＭＳ２４で検出される成分のピーク幅とフラクションコレクタ１６に到達した同成分のピーク幅を合わせるのに有効的である。

この実施例の分取ＬＣＭＳシステムでは、フラクションコレクタ１６の分画動作をＭＳ２４の検出ピークに基づいた信号で行なっている。このＬＣＭＳシステムでは、ＭＳ２４で検出する試料成分の特定イオン強度に基づいたクロマトグラムを測定し、その信号強度が所定のレベル以上になるとフラクションコレクタ１６の分注ノズルが所定の試料容器に溶出液を分注し、その信号強度が所定のレベルより小さくなると分注ノズルが移動して流れてくる溶出液をその他の場所に排出する。

以下にこの実施例の動作を説明する。
分離流路４を移動相が一定の流量で流れている。インジェクションポート１２に試料が注入されると、分離カラム６で試料は各成分に分離されて溶出し、流路切換えバルブ型スプリッタ２に導入される。流路切換えバルブ型スプリッタ２は、例えば０．２５〜２Ｈｚの間に設定された一定周期で微少体積の切換えを行なっている。流路切換えバルブ型スプリッタ２に導入された溶出液のうちの微少量が流路切換えバルブ型スプリッタ２が切り換えられることによって検出流路８に導入され、ミキサ２８内において混合された後、ＰＤＡ２２およびＭＳ２４に導入される。
一方、分離流路４で流路切換えバルブ型スプリッタ２の下流側に導入された溶出液は、フラクションコレクタ１６によりＭＳ２４からの検出信号に基づいて所定の試料容器に分画捕集される。

図２はＭＳ２４における検出信号の一例を示したものであり、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はバイパス流路２６とミキサ２８を設けなかった場合における検出信号であり、（Ｄ）はこの実施例の検出信号である。測定条件は移動相の流量が２．０ｍＬ／ｍｉｎで、カラムとして内径が４．６ｍｍ、長さが５０ｍｍのＳｈｉｍ−ｐａｃｋ ＶＰ−ＯＤＳカラム（株式会社島津製作所の製品）を使用した。流路切換えバルブ型スプリッタ２のスプリット比を５００：１（分画流路側：検出流路側）、バルブ切換えの周波数を０．６７Ｈｚに設定した。検出する成分はベルベリンであり、ＭＳではｍ／ｚ＝３３６．１のピーク強度の時間変化をクロマトグラムとして表示した。

（Ａ）はＭＳ２４の信号取込み時間が０．０３秒であるときの検出信号である。検出器までの流路上にバイパス流路とミキサを設けでいないので、検出信号の取込み時間が短いと流路切換えバルブ型スプリッタ２の流路切換え動作による圧力変動や断続的な試料成分の導入による濃度変動の影響を受けて信号強度が変動している。
この実施例のような分取ＬＣＭＳシステムでは、検出器での信号強度に基づいて試料成分の分画捕集を行なっているので、信号強度が変動し、予め設定された分画捕集用の信号強度の閾値を挟んで変動すると正確に分画捕集を行なうことができなくなる。
（Ｂ）は信号取込み時間を０．１秒にした場合の検出信号である。（Ａ）の状態よりも信号取込み時間を長くしたことで、信号強度の変動は（Ａ）よりも抑制されているが若干の変動は検出されている。
（Ｃ）はさらに信号取込み時間を長く２秒とした場合の検出信号である。信号取込み時間を長くすることで信号強度の変動を抑制することができる。しかし、信号取込み時間を長くすると本来の検出ピークの形状とかけ離れてしまうので信号取込み時間を長くすることは好ましくない。
（Ｄ）は信号取込み時間が０．０３秒である場合であるが、本発明により検出器２２、２４までの流路上にバイパス流路２６とミキサ２８を設けることで、検出信号の取込み時間が短くてもバルブ切換えによるノイズを緩和することができるので、検出器での検出信号が滑らかなピーク形状となり、試料を各成分に正確に分画捕集することができる。

本発明は薬品、化学品、生体物質などの分離分析に利用することができる。

本発明を適用した分取ＬＣＭＳシステムの一実施例の構成を概略的に示す流路図である。 質量分析計における検出信号の一例を示したものであり、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）はバイパス流路２６とミキサ２８を設けなかった場合における検出信号であり、（Ｄ）はこの実施例の検出信号である。

符号の説明

２ 流路切換えバルブ型スプリッタ
２ａ 溝
４ 分離流路
８ 検出流路
１２ インジェクションポート
１４ 分離カラム
１６ フラクションコレクタ
２０ メイクアップポンプ
２２ フォトダイオードアレイ
２４ 質量分析計
２６ バイパス流路
２８ ミクロボリュームミキサ
３０、３２ 三方ジョイント

Claims (1)

1. 試料を注入するインジェクションポートと試料を成分に分離する分離カラムを流路上に備えて、前記インジェクションポートに注入された試料を移動相とともに前記分離カラムに移送して成分に分離する分離流路と、
   前記分離流路の下流側先端に接続され、前記分離カラムからの溶出液を分画捕集するフラクションコレクタと、
   検出器を流路上に備えて試料成分を前記検出器に導き試料成分の検出を行なう検出流路と、
   前記分離流路の分離カラムと前記フラクションコレクタの間の流路と、前記検出流路の検出器の上流側の流路との間に接続され、前記分離流路から溶出液の一部を前記検出流路に導入する切換えバルブ型スプリッタと、を備え、
   前記検出流路は、検出器よりも上流において、前記切換えバルブ型スプリッタの上流側と下流側との間を直接接続するバイパス流路と、前記切換えバルブ型スプリッタの下流側の前記バイパス流路との合流点より下流側に設けられたミキサとを備えており、
   前記ミキサは、前記検出器で検出される成分のピーク幅を前記フラクションコレクタに到達した同成分のピーク幅に一致させる容量をもち、
   前記フラクションコレクタは前記検出器からの検出ピークに基づいた信号で分画動作を行なうものであることを特徴とする液体クロマトグラフ。

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