JP4213586B2 - ラクダ抗体ライブラリーの作製方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、ラクダ抗体ライブラリーの作製方法に関する。
背景技術
ラクダ科の動物の免疫グロブリン（抗体分子）を構成するＩｇＧには、重鎖と軽鎖を有するヘテロ４量体の構造と、重鎖の２量体からなる構造とが存在することが知られている（Ｉｓｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．４３ Ｎｏ３ １９８（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ，３６３，４４６（１９９３））。４量体構造はヒトをはじめとする多くの動物に共通の特徴である。一方、後者の重鎖２量体構造からなるＩｇＧは、ラクダ科動物に特徴的なＩｇＧとされている。ラクダ科動物における、重鎖の２量体からなるＩｇＧは、病的な状態に起因する偶発的なものではない。
アジアやアフリカのラクダ科動物であるＣａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓやＣａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ、並びに南アメリカのラクダ科動物の全ての種において、軽鎖を欠く免疫グロブリンが見出されている。南アメリカのラクダ科動物としては、たとえばＬａｍａ Ｐａｃｏｓ、Ｌａｍａ Ｇｌａｍａ、あるいはＬａｍａ Ｖｉｃｕｇｎａ等を示すことができる。動物種によって２量体ＩｇＧの分子量は異なっている。これらの免疫グロブリンを構成する重鎖の分子量は、約４３ｋＤａから約４７ｋＤａ、通常４５ｋＤａである。
重鎖２量体ＩｇＧのもうひとつの特徴は、この抗体がＲｏｉｔｔらの定義によるＣＨ１と呼ばれる定常領域の最初のドメインを欠く点である。また、ヒンジ部分も通常のヘテロ４量体抗体（重鎖＋軽鎖）とは異なるアミノ酸配列を有している。アミノ酸配列の違いに基づいて、ヒトコブラクダのＩｇＧは次のように分類されている（Ｎａｔｕｒｅ ３６３ ４４６（１９９３））。
ＩｇＧ２：長いヒンジ配列（配列番号：８）を持つ
ＩｇＧ３：短いヒンジ配列（配列番号：９）を持つ
ＩｇＧ１：ヘテロ４量体抗体
重鎖２量体ＩｇＧのＶＨ領域は、軽鎖との疎水的相互作用が必要ないため、重鎖における軽鎖と接触する部分が親水性のアミノ酸残基に変異している。通常のヘテロ４量体ＩｇＧのＶＨとの構造的な違いによって、重鎖２量体ＩｇＧのＶＨ領域はＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれている。
ＶＨＨは、その親水性アミノ酸残基のため溶解性が優れる。ＶＨＨにおけるアミノ酸置換は、一次構造（アミノ酸配列）のいたるところに分散している。そしてこれら親水性アミノ酸残基は、ＶＨにおけるＶＬドメインと相互作用する位置に相当する三次構造空間内にクラスターを形成する。ここで、前記の三次構造空間を、特に前部ＶＬサイドと呼ぶ。これらのアミノ酸置換は、例えばＶ３７ＦまたはＶ３７Ｙ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５ＲまたはＬ４５Ｃであり、Ｗ４７の多くもＧｌｙに置換されている。このような置換は、ＶＨＨの前部ＶＬサイドの親水性を高める。
したがって、ＶＨＨの溶解度は、ヒトまたはマウスから単離精製されたＶＨ（シングルドメイン抗体；Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４（１９８９））の溶解度よりもはるかに大きい。ＶＨＨは、通常の緩衝液に対してどのような凝集の徴候も見せることなく、１０ｍｇ／ｍｌにまで容易に濃縮することができる。この濃度は、たとえばマウスのＶＨの溶解度の約１００倍に匹敵する。
また、ラクダやラマに由来するＶＨＨの熱安定性は、マウスのヘテロ４量体抗体と比較して非常に高い。これらの種に由来するＶＨＨを利用すれば、たとえば９０℃でも抗原結合能を維持している分子の提供が可能である（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４３１（１）３７，１９９９）。
さてラクダ科動物の抗体レパートリーの多様性は、ＶＨまたはＶＨＨ領域中のＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１、２、３によって決定される。３つのＣＤＲを有する点は、他の動物種のＩｇＧと共通する。しかし、ラクダＶＨＨ領域中のＣＤＲ３は、平均１６アミノ酸と相対的に長いという特徴を有する（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（９）１１２９，１９９４）。たとえばマウスのＶＨのＣＤＲ３が平均９アミノ酸であることと比較すると、ラクダのＩｇＧにおけるＣＤＲ３が相対的に非常に長いことがよくわかる。
ところで、これまでに構造がわかっている重鎖＋軽鎖ヘテロ４量体抗体の抗原結合部位の多くは、ｇｒｏｏｖｅ（溝）またはｃａｖｉｔｙ（くぼみ）またはｆｌａｔ（平坦）といった抗原結合面を形成することが知られている〔Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，２３，１９９４〕。したがって、もし結合対象物質のエピトープもまたｇｒｏｏｖｅまたはｃａｖｉｔｙであった場合、抗体の抗原結合部位は、うまく結合できない可能性がある。たとえば、酵素等のタンパク質の触媒性または機能的残基あるいは毒性部分は、多くの場合、ｃｌｅｆｔ（裂け目）の内側に位置している。この構造が、酵素の基質や受容体が、タンパク質と非常に特異的に相互作用することを容易にしている。しかし、ｃａｖｉｔｙやｃｌｅｆｔといった構造はヘテロ４量体抗体にとっては認識が難しいため、大きな免疫原性はない。
これに対してラクダ科動物のＶＨＨは、上述したその特徴的な構造によりｃｌｅｆｔおよびｃａｖｉｔｙを特異的に認識できることが報告されている。例えば、酵素を抗原として免疫したラクダの末梢血から抗体を分離した実験では、ラクダＩｇＧ２、ＩｇＧ３のみに酵素活性中心を塞ぐ抗体が存在し、ＩｇＧ１には活性中心を塞ぐ抗体が得られなかったと報告された（ＥＭＢＯ Ｊ １７（１３）：３５１２，１９９８）。更に、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ活性阻害作用を有するＶＨＨが、Ｌｙｓｏｚｙｍｅで免疫したラクダに由来するライブラリーからファージディスプレイ法によって分離された（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（４１４）５２１，１９９７）。そして分離されたＶＨＨの構造が、ＬｙｓｏｚｙｍｅとのＸ線結晶解析（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｕｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，８０３，１９９６）によって示された。その結果は、ラクダ抗体のＩｇＧ２あるいはＩｇＧ３においては、ＣＤＲ３領域が長く突き出して酵素の基質結合部位に入り込んで活性中心を塞ぐように結合することにより、拮抗阻害を起こしていることを示していた。
ラクダ科動物に由来するＶＨＨには、このように溶解性が高い、４量体構造のＩｇＧでは期待できない新たな活性を有する可能性がある、といった産業上有用な特徴を見出すことができる。抗体可変領域の取得には、目的とする抗原による動物の免疫と、抗体の分離が必要である。しかし、このような古典的な手法は、大量の抗原を精製しなければならないことや、非特異的な抗体の生成といった問題を伴う。そこで抗体可変領域をより容易に取得する手法として、ｒｇｄｐライブラリーを用いたスクリーニング方法が提案されている。ｒｇｄｐライブラリーとは、抗体可変領域のような結合親和性物質をコードする遺伝子が、その発現産物を提示した遺伝的表示パッケージで構成されたライブラリーを言う。抗体可変領域を提示したファージライブラリーは、ｒｇｄｐライブラリーの代表的な例である。
抗体可変領域を提示したファージライブラリーを用いた、抗体の取得方法は、労働集約的な古典的な抗体の作製手法に代わる新たな抗体の取得方法として注目されている。本発明者らも、抗体可変領域を効率的に取得することができる新規な抗体ライブラリーを作製し、既に特許出願している（ＷＯ ０１／６２９０７）。ＶＨＨについてもそのライブラリーを作製し、ライブラリーから任意の抗原に対する結合親和性を有するＶＨＨを自由に選択することができれば有用である。しかし、ラクダ科動物のＶＨＨのライブラリーの作製には、いくつかの問題点が指摘されている。
ラクダ科動物のＶＨＨ構造のもうひとつの特徴として、通常可変領域に存在する２２番目と９２番目のシステインの他に、ＣＤＲ３にシステイン残基が存在することが多いことが挙げられる。ＣＤＲ３のシステイン残基はＣＤＲ１あるいはＣＤＲ２近傍にあるもうひとつのシステインと、ジスルフィド結合すると考えられている（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（９）１１２９，１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：１３１，１９９９）。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ｇｅｒｍｌｉｎｅ（生殖系列）のＶ遺伝子によって決定される。そしてそれらは、ＣＤＲ３とともに抗原結合に関して重要な役割を果たしている。（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｕｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，８０３，１９９６、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７（４）１９９９、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１１（１）：１２３，２００１）。一般にｇｅｒｍｌｉｎｅ（生殖系列）とは、生殖細胞などで維持される染色体遺伝子、すなわちリアレンジメントを生じていない染色体遺伝子を意味している。本出願では、染色体遺伝子の中でも特に抗体遺伝子を構成する部分をｇｅｒｍｌｉｎｅと言う。
最近、ラクダ科動物であるヒトコブラクダおよびラマのｇｅｒｍｌｉｎｅが調査された。その結果ヒトコブラクダおよびラマのＩｇＧは、ＣＤＲ２の長さとＶ領域のシステインの位置によって分類されている（ＥＭＢＯ Ｊ．１９（５）９２１，２０００、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７ ５７９，２０００）。
しかし、従来取得されている抗体遺伝子は、ヒトコブラクダのｇｅｒｍｌｉｎｅ全体に由来する抗体遺伝子を充分にカバーしているとは考えにくいことが指摘されている。たとえば、これまでに得られた抗体のｃＤＮＡの塩基配列の分類が一部のクラスに集中していることから、これらの抗体が由来するｇｅｒｍｌｉｎｅは偏っていることが明らかである（ＥＭＢＯ Ｊ．１９（５）９２１，２０００）。また方法論的にも、次のような問題点が考えられた。すなわち公知のライブラリー構築には、Ｎ末端側のプライマーは１種しか用いられていなかった。そのため、特異性の問題からＶＨＨ遺伝子が由来するｇｅｒｍｌｉｎｅの漏れの可能性、あるいは増幅産物が偏る可能性があった（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１４ ５２１，１９９７）。
構成遺伝子に偏りがあるライブラリーは、レパートリーに乏しい。したがって、このようなライブラリーをスクリーニングしても、目的の抗原に対する抗体を得られない可能性がある。このことが、非免疫ラクダ由来ファージライブラリーから酵素活性を阻害する、あるいは促進する抗体が取得できない原因となっている可能性がある。
従来技術では、ラクダやラマの免疫グロブリン重鎖の可変領域を取得するために、十分量の抗原を用いて予めラクダやラマを免疫する方法が提唱されている（特表平１１−５０３９１８、ＥＭＢＯ Ｊ １７（１３）：３５１２，１９９８、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（４１４）５２１，１９９７）。この方法は、ラクダやラマの免疫系が、それ自身の重鎖抗体をｉｎ ｖｉｖｏで成熟させることを利用している（特表２０００−５１５００２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２４０）１８５，２０００）。この方法に基づいて、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ、破傷風トキソイド、カルボニックアンヒドラーゼ、アミラーゼ、ＲＮａｓｅＡ、あるいはアゾ色素などを認識する抗体が得られている。
しかしながら、この方法は、免疫感作を要するために次のような様々な制約を受ける。
免疫感作期間が必要であること、
ラクダ科動物への免疫原の毒性の影響、
免疫原性が低い物質の抗体の取得が難しいこと、そして
免疫感作のために相対的に多量の抗原が必要であること
更に、免疫感作の問題を回避する方法として、以下のステップを特徴とする方法が提唱された（特表２０００−５１５００２）。
１）ラクダ科重鎖抗体をランダムに選択し；
２）コーディング配列を単離し、ファージディスプレイベクターにおいてクローニングし；
３）そのコーディング配列を少なくともひとつのコドンにおいてランダムに置換することにより修飾し；
４）ファージディスプレイベクターにおいてランダムに突然変異したコーディング配列のライブラリを作製し；
５）そのベクターを導入したファージにおいて該コーディング配列を発現し；
６）次いで、ファージを固定抗原で選り分けることによって抗原に特異的な認識分子を選択する、
またこれに類する解決法として、ラクダ抗体のフレームワークを利用する方法も提案されている。この方法は、ＶＨＨおよびＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を、ラクダ抗体のフレームワークに組み込んでラクダ抗体を再構築する方法である。この手法は、マウスのＶＨをヒト化するために考え出された手法を応用している。各ＣＤＲのループをランダムに突然変異させて、レパートリーサイズを大きくすることができる。その結果、親和性と特異性を調整することができる（特表２０００−５１５００２）。
これらの解決法は、いずれもコーディング配列に人為的な変異を導入することによって多様性を獲得しようという原理に基づいている。しかしながら、こういった試みの多くは変異の導入の際に多大な労力、煩雑な手順を経ており、多大な時間を費やしていた。また、こういった試みの多くは、活性な抗体の生成に伴って、遥かに多くの不活性な抗体を多く生み出す非効率性を伴っていた。
一方、免疫していないラクダの組織や血液から得たＶＨＨの遺伝子をファージディスプレイベクターに組み込んでファージライブラリーを作製し、このライブラリーから結合能のあるファージを固定抗原で選り分けることによって抗原に特異的な認識分子を選択する方法も考えられる。しかしこの方法では、けっきょく免疫原性が充分なものに対するＶＨＨしか得られないと考えられていた。そのため、ＶＨＨの遺伝子を組み込んだファージライブラリーを用いる方法については、充分な検討は行われてこなかった（特表２０００−５１５００２）。したがって、酵素の活性を阻害あるいは促進する抗体が得られるほど多様なレパートリーを含む非免疫ラクダ由来ＶＨＨ抗体ファージライブラリーはこれまで存在しなかった。
発明の開示
本発明の課題は、十分なレパートリーサイズを有するＶＨＨライブラリーの提供である。また本発明は、不活性なＶＨＨの生成を伴わないＶＨＨライブラリーの提供を課題とする。
本発明は、従来のＶＨＨ可変領域単離プロセスを改善することによって非常に大きいレパートリーの広がりをもつＶＨＨライブラリーを提供する。すなわち、遺伝子を増幅するプライマーの工夫によって、より生体における多様性を忠実に再現したｇｅｒｍｌｉｎｅ ＶＨＨ遺伝子を増幅することができた。
また、ＶＨＨはラクダ科の動物に発達した、補完的な意味合いの大きい抗体分子であり、ＶＨ遺伝子とは抗体の成熟プロセス等が全く異なる集団であることを我々は明らかにした。そこで、ＶＨＨ遺伝子の多様性を最大限とするため、これまでのライブラリーでは重視されていなかった個体数を増加させることによる多様性の確保を試みた。その結果、１個体を越える数のラクダの遺伝子を用いて多様性の大きいライブラリーを作製することに成功した。
また、我々はＰＣＲ法を用いて遺伝子を増幅する際に失われる多様性を最小限とするため、ＰＣＲで増幅させる遺伝子は対数増殖期で回収し、一部の遺伝子が飽和することを防いだ。更に、我々はＩｇＭクラスの可変領域遺伝子も取得した。一般にＩｇＭクラスの免疫グロブリンはナイーブなレパートリーを有するとされている。そのためＩｇＧは、ラクダ生体に生じた自然な免疫感作によるクローンの偏りを伴っている可能性がある。一方ＩｇＭではこのような偏りが起こっていないと考えられる。
以上のプロセスを経て、非免疫抗体可変領域ライブラリーとしては非常に大きな多様性を確保したライブラリーを作製することが可能となった。すなわち本発明は、以下の抗体可変領域のライブラリー、その作製方法、およびその用途に関する。
〔１〕ラクダ科動物生体における可変領域の多様性を維持した、ラクダ科動物由来ＶＨＨのライブラリー。
〔２〕ライブラリーを構成するクローンの任意の３３クローンを取り出して調べたときに、少なくとも８個以上のクラスが含まれる、〔１〕に記載のライブラリー。
〔３〕ライブラリーを構成するクローンから無作為に十分量のクローンを取り出して調べたときに、少なくとも６つのＶＨＨサブファミリーが含まれ、かつ１５個以上のクラスが含まれる、〔２〕に記載のライブラリー。
〔４〕少なくとも、１０５以上のＶＨＨ遺伝子クローンを含む、〔１〕に記載のライブラリー
〔５〕ＩｇＧ２、および／またはＩｇＧ３のイムノグロブリン遺伝子に由来するＶＨＨ遺伝子クローンで構成された、〔１〕に記載のライブラリー。
〔６〕ＶＨＨ遺伝子の構成比率が６０％以上である〔５〕に記載のライブラリー。
〔７〕ｒｇｄｐライブラリーである〔１〕に記載のライブラリー
〔８〕以下の工程を含む、目的とする物質に対する親和性を有するＶＨＨをコードする遺伝子の取得方法。
（１）〔７〕に記載のライブラリーを、目的とする物質に接触させる工程、および
（２）目的とする物質に結合するＶＨＨを有するクローンを選択する工程
〔９〕目的とする物質が酵素分子またはその断片である〔８〕に記載の方法。
〔１０〕次の工程を含む、酵素活性を調節する作用を有するＶＨＨを取得する方法。
（１）〔９〕に記載の方法によって、酵素に結合するＶＨＨを取得する工程、
（２）工程（１）で取得されたＶＨＨを当該酵素と接触させる工程、および
（３）ＶＨＨを接触させない場合と比較して、当該酵素の酵素活性を変化させる作用を有するＶＨＨを選択する工程
〔１１〕〔８〕または〔１０〕に記載の方法によって選択されたＶＨＨをコードする遺伝子。
〔１２〕次の工程を含む、ラクダ科動物由来ＶＨＨを可変領域として有するイムノグロブリンまたはその断片の製造方法。
（１）〔８〕に記載の方法によって目的とする物質に対する結合活性を有するＶＨＨをコードする遺伝子を取得する工程、
（２）得られたＶＨＨをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現可能なベクターに組み込んでＶＨＨ発現ベクターとする工程、および
（３）ＶＨＨ発現ベクターを宿主細胞に導入し、その培養物からＶＨＨを含む蛋白質を回収する工程
〔１３〕次の工程を含む、ＶＨＨライブラリーの作製方法。
（１）ラクダ科動物に属する動物種の複数の個体からＶＨＨ遺伝子を取得する工程、および
（２）工程（１）で取得したＶＨＨ遺伝子を混合してライブラリーとする工程
〔１４〕工程（１）で取得したＶＨＨ遺伝子を増幅する工程を含む〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕ＰＣＲ法によって増幅する〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕増幅産物が指数増殖を示しているときにＰＣＲ法の増幅産物を回収する工程を含む〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕ラクダ科動物がヒトコブラクダであり、配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの５’側プライマー、および配列番号：１０に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる３’側プライマーからなるプライマーセットを用い、各プライマーセットによる増幅産物を混合する工程を含む〔１５〕に記載の方法。
〔１８〕ラクダ科動物がヒトコブラクダであり、配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの５’側プライマー、および配列番号：１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる３’側プライマーからなるプライマーセットを用い、各プライマーセットによる増幅産物を混合する工程を含む〔１５〕に記載の方法。
〔１９〕制限酵素ＳｆｉＩおよびＡｓｃＩで消化した増幅産物を次の性状（ｉ）および（ｉｉ）を有するベクターにライゲーションする工程を含む〔１７〕または〔１８〕に記載の方法。
（ｉ）ＳｆｉＩサイトおよびＡｓｃＩサイトを有する、および
（ｉｉ）適当な宿主に形質転換することによって上記サイトに挿入された外来性遺伝子がコードする蛋白質をファージを構成する蛋白質との融合蛋白質として発現する
〔２０〕〔１７〕または〔１８〕に記載の方法によって作製することができるＶＨＨライブラリー。
〔２１〕配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された５’側プライマーと、配列番号：１０または配列番号：１１、に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された３’側プライマーからなるラクダのＶＨＨ遺伝子増幅用のプライマーセット。
〔２２〕次の工程を含む、ＶＨライブラリーの製造方法。
（１）ラクダ科動物に属する動物種の複数の個体からＶＨ遺伝子を取得する工程、および
（２）工程（１）で取得したＶＨ遺伝子を混合してライブラリーとする工程
〔２３〕工程（１）で取得したＶＨ遺伝子を増幅する工程を含む〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕ＰＣＲ法によって増幅する〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕増幅産物が指数増殖を示しているときにＰＣＲ法の増幅産物を回収する工程を含む〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕ラクダ科動物がヒトコブラクダであり、配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの５’側プライマー、および配列番号：４１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる３’側プライマーからなるプライマーセットを用い、各プライマーセットによる増幅産物を混合する工程を含む〔２４〕に記載の方法。
〔２７〕制限酵素ＳｆｉＩおよびＡｓｃＩで消化した増幅産物を次の性状（ｉ）および（ｉｉ）を有するベクターにライゲーションする工程を含む〔２６〕に記載の方法。
（ｉ）ＳｆｉＩサイトおよびＡｓｃＩサイトを有する、および
（ｉｉ）適当な宿主に形質転換することによって上記サイトに挿入された外来性遺伝子がコードする蛋白質をファージを構成する蛋白質との融合蛋白質として発現する
〔２８〕ラクダ科動物のＩｇＭ由来のＶＨのライブラリー。
〔２９〕〔２２〕に記載の方法によって得ることができるＶＨのライブラリー。
〔３０〕ｒｇｄｐライブラリーである〔２８〕または〔２９〕に記載のライブラリー。
〔３１〕以下の工程を含む、目的とする物質に対する親和性を有するＶＨをコードする遺伝子の取得方法。
（１）〔３０〕に記載のライブラリーを、目的とする物質に接触させる工程、および
（２）目的とする物質に結合するＶＨを有するクローンを選択する工程
〔３２〕目的とする物質が酵素分子またはその断片である〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕次の工程を含む、酵素活性を調節する作用を有するＶＨを取得する方法。
（１）〔３１〕に記載の方法によって、酵素に結合するＶＨを取得する工程、
（２）工程（１）で取得されたＶＨを当該酵素と接触させる工程、および
（３）ＶＨを接触させない場合と比較して、当該酵素の酵素活性を変化させる作用を有するＶＨを選択する工程
〔３４〕〔３１〕に記載の方法によって選択されたＶＨをコードする遺伝子。
〔３５〕次の工程を含む、ヒトコブラクダ由来ＶＨを可変領域として有するイムノグロブリンまたはその断片の製造方法。
（１）〔３１〕に記載の方法によって目的とする物質に対する結合活性を有するＶＨをコードする遺伝子を取得する工程、
（２）得られたＶＨをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現可能なベクターに組み込んでＶＨ発現ベクターとする工程、および
（３）ＶＨ発現ベクターを宿主細胞に導入し、その培養物からＶＨを含む蛋白質を回収する工程
〔３６〕配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの５’側プライマー、および配列番号：４１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる３’側プライマーからなるヒトコブラクダＶＨ遺伝子増幅用プライマーセット。
本発明は、ラクダ科動物生体における可変領域の多様性を維持した、ラクダ科動物由来抗体可変領域のライブラリーに関する。可変領域遺伝子としてＶＨＨ遺伝子からなるＶＨＨライブラリーが生体における多様性を維持していることは、例えば次のようにして確認することができる。すなわち、ライブラリーを構成するクローンの任意の３３クローンを取り出して調べたときに、少なくとも８個以上のクラスが含まれるライブラリーは、生体における多様性を維持していると言う事ができる。より具体的には、ライブラリーを構成するクローンから無作為に十分量のクローンを取り出して調べたときに、望ましくは６つのＶＨＨサブファミリーが含まれ、かつ１５個以上のクラスが含まれる場合に、当該ライブラリーは生体におけるＶＨＨの多様性を維持していると言うことができる。
本発明において、ＶＨＨのサブファミリーはシステイン残基の位置に基づく分類である。またクラスは、システイン残基の位置、ＣＤＲ２の長さ、およびＣＤＲ１の長さに基づく分類である。実施例２に示した表１の中で、１つの枠が１つのクラスに相当する。
ＶＨＨの公知のサブファミリー分類（ＥＭＢＯ Ｊ．１９（５）９２１，２０００、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏ １２７（１０）２０００）は、システイン残基の位置とＣＤＲ２の長さに基づく分類となっている。これに対して本発明者らの解析によれば、公知の分類ではカバーすることができないシステイン残基やＣＤＲ２の長さが確認された。またＣＤＲ１を構成するアミノ酸残基の数も、本発明者らの解析結果では複数種の長さが見出されているのに対して、これまでは１種類とされていた。したがって、公知の分類に基づいてＶＨＨを分類することは、事実上不可能である。
さて、公知のライブラリーの解析結果（ＥＭＢＯ Ｊ．１９（５）９２１，２０００）に上記本発明におけるサブファミリー、およびクラスの分類方法を適用すると、サブファミリー数：５、クラス数：７（７２クローン中）となる。一方、本発明によるＶＨＨライブラリーでは、たとえば後に述べる実施例において作製したＶＨＨライブラリーを構成するクローンの解析結果に先の分類方法を適用すると、次のような結果になる。
ＩｇＧ２由来のＶＨＨライブラリー中、任意の８９クローンの解析結果：
サブファミリー数：７ クラス数：３１
ＩｇＧ３由来のＶＨＨライブラリー中、任意の５９クローンの解析結果：
サブファミリー数：７ クラス数：２０
本発明者らは、これらの知見に基づいて、ライブラリーを構成する任意の５０クローン以上を調べ、先の分類に基づくサブファミリー数が６以上、そしてクラス数が１５以上である場合に、当該ライブラリーが十分な多様性を維持していると判断することができると考えた。
本発明のＶＨＨライブラリーは、具体的にはたとえば１０^５以上のクローン数を有していることが望ましい。したがって、非免疫ラクダ抗体ライブラリーでは、少なくともそれ以上のクローン数を有することが望まれる。本発明の抗体ライブラリーは、より望ましくは１０^６以上、通常１０^７以上、あるいは１０^８以上、更に望ましくは１０^９以上、また理想的には１０^１０以上のクローン数とすることにより、実用的なライブラリーとすることができる。
たとえば後に述べるような方法によって得ることができる本発明のラクダ抗体ライブラリーは、１０^１０以上のクローン数を有する。これほど多様性に富むＶＨＨ遺伝子ライブラリーは、これまでに報告は無い。更に重要なことは、本発明のライブラリーを構成するＶＨＨ遺伝子に占める、正常な遺伝子の割合が極めて高いことである。ＶＨＨ遺伝子が正常であることは、ＶＨＨ遺伝子の塩基配列を決定し、以下のような条件について解析することにより確認することができる。
フレームワーク（ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ）において公知のラクダ抗体のフレームワークと相同性の高い塩基配列を有していること、
翻訳アミノ酸配列にフレームシフトが無いこと、そして
ストップコドンを生じていないこと
更に好ましくは、ヒンジ領域においてＶＨＨの特徴である親水性のアミノ酸が位置する部位において、親水性のアミノ酸残基を有していることも、正常なＶＨＨ遺伝子の条件として重要である。
本発明のライブラリーを構成するＶＨＨ遺伝子の好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上が正常である。更に具体的には、本発明は９０％以上の正常なＩｇＧ２由来ＶＨＨ遺伝子を含むＶＨＨライブラリーに関する。あるいは本発明は、９５％以上の正常なＩｇＧ３由来ＶＨＨ遺伝子を含むＶＨＨライブラリーに関する。先に述べたような高度な多様性を有し、しかもこのような高い割合で正常なＶＨＨ遺伝子を含むライブラリーは、公知の方法で得ることはできない。
本発明において、ＶＨＨとはラクダ科動物の血中に見られる２量体構造の免疫グロブリンを構成する可変領域を言う。本発明のライブラリーを構成するＶＨＨ遺伝子は、可変領域のみならず定常領域を含むことができる。したがって、ＶＨＨ遺伝子がヒンジ領域の塩基配列を伴っていてもよい。ＶＨＨとＶＨは、ヒンジ領域に構造的な違いが見られることが多いので、ヒンジ領域にプライマーを設定してヒンジ領域を伴ったＶＨＨ遺伝子を取得することにより、ＶＨＨ遺伝子を特異的に集めることができる。
後に述べる実施例においては、この考えかたにしたがってヒンジ領域において３’側（Ｃ末端側）のプライマーを設定している。その結果、実施例において使用したプライマーによって増幅されたＶＨＨ遺伝子は、それぞれ次のような高い割合で目的とするクラスのＶＨＨで占められていた。
ＩｇＧ２（配列番号：１０）ＶＨ：ＶＨＨ＝７：９１（９３％ ＶＨＨ）
ＩｇＧ３（配列番号：１１）ＶＨ：ＶＨＨ＝１：１６７（９９％ ＶＨＨ）
ＩｇＭ（配列番号：４１）ＶＨ：ＶＨＨ＝１８９：３（１．６％ ＶＨＨ）
本発明のＶＨＨライブラリーは、たとえば次のような手法を利用することによって作製することができる。以下に述べる手法は、いずれもＶＨＨのレパートリーサイズの不足を補うために有用である。
（１）複数の個体に由来するＶＨＨ遺伝子を利用する
（２）より幅広い遺伝子を増幅できるプライマーを使って、ＶＨＨ遺伝子を増幅する
（３）ＶＨＨ遺伝子の増幅にあたっては、指数的な増幅が進行しつつあるときに増幅産物を回収する
続けて、これらの手法をより具体的に説明する。
（１）複数の個体に由来するＶＨＨ遺伝子を利用する
本発明者らの知見によれば、ラクダ科動物のＶＨＨ遺伝子のレパートリーサイズは限られ、偏っている場合が多い。そのため、１個体のＶＨＨ遺伝子のみでは、任意の抗原に対する抗体を自由に取得できるほどのレパートリーサイズを有するライブラリーを作製することは難しい。そこで、１個体を越える数のＶＨＨ遺伝子を利用して、ライブラリーを作製することによって、レパートリーサイズを有効に拡大することができる。
１個体を越える数のＶＨＨ遺伝子とは、遺伝的に異なる複数の個体から取得されたＶＨＨ遺伝子を含むことを意味する。本発明において遺伝的に異なる複数の個体とは、ゲノムレベルで遺伝的な相違を有する個体を言う。したがって、たとえ同腹仔であっても、それが１卵性でなければ遺伝的には異なる個体である。しかし、レパートリーサイズを広げるという目的のためには、より遺伝的に遠い関係にある個体を組み合わせるほうが有利である。
本発明において、１個体を越える数のＶＨＨ遺伝子は、１個体分のＶＨＨ遺伝子に、その個体とは異なる個体に由来するＶＨＨ遺伝子を加えることによって得ることができる。加えるＶＨＨ遺伝子は限定されない。したがって、たとえば他の個体に由来するＶＨＨ遺伝子の、部分的な集団を加えた場合も、本発明に含まれる。
加えるべきＶＨＨ遺伝子は、１個体あたり１０^５個以上の細胞から回収するのが好ましく、各個体から取得したＶＨＨ遺伝子集団の全体とするのが望ましい。全体を利用することによって遺伝子の偏りを防ぐことができる。遺伝子の偏りは、レパートリーサイズを小さくする原因となることから、できるだけＶＨＨ遺伝子集団の全体を加えるようにすることは有効である。なおＶＨＨ遺伝子集団の全体とは、取得することができたＶＨＨ遺伝子の全体を言う。つまり本発明は、ある個体のＶＨＨ遺伝子集団を漏れなく加える場合のみならず、取得可能なＶＨＨ遺伝子の全てを加える場合を含む。
また本発明において、ある個体に由来するＶＨＨ遺伝子に対して添加する他の個体に由来するＶＨＨ遺伝子は、個体間の偏りを避けるために、均等に添加するのが望ましい。ＶＨＨ遺伝子を混合する目的は、レパートリーサイズを大きくすることである。個体間のＶＨＨ遺伝子に偏りがある場合には、そのライブラリーを使ったスクリーニングにおいて、特定の個体に由来するＶＨＨ遺伝子が優先的に選択される可能性が高まる。このような状況では、レパートリーサイズを大きくした効果は小さくなる。したがって、個体間の偏りを小さくすることは重要である。つまり、ある個体に由来するＶＨＨ遺伝子に他の個体のＶＨＨ遺伝子を加える場合には、等量のＶＨＨ遺伝子の添加が望ましい。更に複数の個体に由来するＶＨＨ遺伝子を混合する場合にも、等量のＶＨＨ遺伝子を利用するようにすることが望まれる。
（２）より幅広い遺伝子を増幅できるプライマーを使って、ＶＨＨ遺伝子を増幅する
個体からライブラリーの構築に必要な量のｍＲＮＡを得ることができれば、そのままライブラリーを作製することができる。しかし通常は個体から取得したｍＲＮＡは微量であることから、ＶＨＨ遺伝子ライブラリーの構築にあたっては、このｍＲＮＡを増幅する。このとき、ＶＨＨ遺伝子を漏れなく増幅しなければ、ライブラリーのレパートリーサイズを大きくすることはできない。
本発明において、遺伝子の増幅方法は限定されない。ＶＨＨ遺伝子集団を、できるだけ漏れなく増幅することができる方法であれば、任意の方法を利用することができる。遺伝子の増幅方法として、ＰＣＲ法を利用するときには、幅広いＶＨＨ遺伝子の増幅を期待できるプライマーを利用する。ラクダやラマのＶＨＨ遺伝子の取得のためのプライマーは公知である。しかし、本発明者らの知見によれば、公知のプライマーを単独で用いたのでは、ＶＨＨ遺伝子を偏り無く増幅することは難しい。
そこで本発明者らは、ＶＨＨ遺伝子をより偏り無く増幅することができるプライマーを新たにデザインした。本発明者らがデザインした、ヒトコブラクダＶＨＨ遺伝子を増幅するためのＮ末端側（５’側）のプライマーの塩基配列を配列番号：１〜配列番号：６に記載した。またＣ末端側（３’側）は、ヒンジ領域からＣＨ３の間でアニールすることができるプライマーを用いれば良い。このようなプライマーは公知である。例えば本発明者らは、ヒンジ領域のアミノ酸配列を解析し、ＩｇＧ２とＩｇＧ３のヒンジ領域に対して、それぞれ配列番号：１０および配列番号：１１に記載の塩基配列からなるプライマーをデザインした。これらのプライマーは、６種類の５’側プライマーのそれぞれについて、２種類の３’側プライマーを組み合せた、１２とおりの組み合せのプライマーセットとして用いられる。
ヒトコブラクダ以外のラクダ科動物のＶＨＨ遺伝子を増幅するには、実施例に記載したような解析方法によって目的とするＶＨＨ遺伝子の塩基配列を解析し、プライマーをデザインすることができる。
更に本発明者らは、ＶＨ構造を持つ抗体でも、酵素活性を調節する抗体が得られる場合があることから、ＩｇＭの抗原認識レパートリーに注目した。ＩｇＭは、ＩｇＧのＶＨＨの抗原認識レパートリーを補完する上で抗原刺激がない段階での可変領域の原型と考えることができる。免疫による重鎖のｉｎ ｖｉｖｏにおける成熟において、ＩｇＭはあらゆる抗原に対しての可変領域の原型を保持しており、クラスチェンジによって抗原に最適なＩｇＧ可変領域を作り出す設計図を保持していると考えた。そこで、本発明者らはラクダのμ鎖認識配列（配列番号：４１）を新たに利用してＩｇＭの可変領域を単離することに成功した。このＩｇＭ由来重鎖可変領域ライブラリーはレパートリーの多様性をさらに広げ、認識分子、酵素活性調節分子単離に役立つ。本発明において、ＩｇＭ由来のＶＨからなるライブラリーの構築においても、そのレパートリーの多様性を高く維持するために、複数の個体に由来するｍＲＮＡを用いることは有効である。
ＩｇＭ由来のＶＨライブラリーは、ＩｇＧ２やＩｇＧ３に由来するＶＨＨレパートリーに対して、補完的な意味合いを持つ。補完的とは、ＶＨＨからでは選択することができない、あるいはポピュレーションが少ないために選択が困難な機能を有する抗体可変領域を補うことを言う。これらのライブラリーを組み合せることによって、より広範囲な分子を認識しうる抗体可変領域を取得することができる。より具体的には、より多様な酵素に対して酵素活性を調節する機能を有する抗体可変領域の単離が可能である。
これらのプライマーを組み合せて、ラクダの抗体産生細胞から取得したｍＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＶＨＨ遺伝子（ＩｇＭの場合は主にＶＨ遺伝子を含む）を増幅する。抗体産生細胞としては、脾細胞や末梢血Ｂ細胞等を用いることができる。増幅したＶＨＨ遺伝子を回収してライブラリーとして構築することにより、本発明のＶＨＨライブラリーとすることができる。
本発明においては、ある個体に由来するＶＨＨ遺伝子に、他の個体のＶＨＨ遺伝子を加えることによって、レパートリーサイズの大きさを獲得している。そのためには、増幅産物を混合するか、あるいは予め複数の個体に由来するｍＲＮＡを混合したものを鋳型として遺伝子を増幅すれば良い。複数の個体から一定量のｍＲＮＡを集め、ｍＲＮＡの混合物を鋳型として遺伝子を増幅することによって、個体間の遺伝子の偏りを小さくすることができる。また遺伝子の増幅や回収の操作も１度で済むので合理的である。
より具体的には、複数のラクダ個体からｍＲＮＡを集め、その等量を混合してｍＲＮＡプールとする。このｍＲＮＡプールからランダムプライマー、オリゴｄＴプライマー、あるいは定常領域と相同なプライマー等を用いてｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲの鋳型とする。ＰＣＲにおいては、（３）として述べるように指数増幅期において増幅産物を回収するようにする。
本発明のＶＨＨライブラリーは、ＩｇＧ２とＩｇＧ３を別々にライブラリーとすることもできるし、あるいは各ライブラリーを混合して単一のライブラリーとすることもできる。更にＩｇＭのＶＨライブラリーを組み合せる場合においても、各ライブラリーを別のライブラリーとすることもできるし、あるいは各ライブラリーを混合して単一のライブラリーとすることもできる。個別にライブラリー化する場合には、前記プライマーのうち、３’側プライマーを共有している増幅産物どうしを混合することによって、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＭのライブラリーとすることができる。
ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３に由来するＶＨＨ、若しくはＩｇＭに由来するＶＨを、それぞれのクラス毎にライブラリー化することにより、他のクラスのＶＨＨ（またはＶＨ）の影響を受けないスクリーニングが可能となる。たとえば、本発明者らの知見によれば、ＩｇＧ２とＩｇＧ３とを混合してスクリーニングすると、ＩｇＧ２が優先的に選択される傾向が観察される場合があった。その原因としては、各クラスの発現レベルの違い、構成クローン数の違い等が考えられた。クラス別のライブラリーとすれば、このようなクラス間のＶＨＨの干渉を受けることなく、各クラスから目的とする機能を有する抗体を偏り無く取得できる可能性が高まる。
あるいは個体ごとにＶＨＨ遺伝子を増幅し、その増幅産物を混合するときには、個体間の遺伝子の割合を一定に保つことにより遺伝子の偏りを防ぐ。具体的には、鋳型の量やプライマーの組み合せ、ＰＣＲの反応回数などの、遺伝子増幅の条件を個体間で厳密に一致させる。更に、増幅産物を均等に混合することによって、偏りを防止することができる。ライブラリーに偏りが無いことは、ＶＨＨ遺伝子発現産物の生体におけるｇｅｒｍｌｉｎｅ（生殖系列）比率が、ライブラリーにおいて維持されていることを意味する。
ｇｅｒｍｌｉｎｅ中のＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子のリアレンジメントにより、ＶＨＨ遺伝子が形成される。ＶＨＨ遺伝子発現産物を構成するクローンを調べることにより、そのＶＨＨ遺伝子中のＶＨ、Ｄ、およびＪＨがｇｅｒｍｌｉｎｅ中のどの遺伝子セグメントに由来するかを調べることが理論上可能である。さらに複数のクローンを調べることにより、各遺伝子セグメントの生体中の発現産物全体における使用頻度を推定することができる。このようにして推定された発現産物全体における各遺伝子セグメントの使用頻度をここではｇｅｒｍｌｉｎｅ比率と呼ぶ。
実際には各遺伝子セグメントの遺伝子配列は完全に明らかになっているわけではないので、後述する「サブファミリー」あるいは「クラス」分類に基づいてｇｅｒｍｌｉｎｅ比率を分析した。各遺伝子セグメントは、ＣＤＲ配列の長さ、Ｃｙｓの位置等の特徴によって「サブファミリー」あるいは「クラス」に分類することができる。偏りの生じているライブラリーでは特定の遺伝子セグメントに由来するクローンの発現頻度は生体中の発現頻度と異なると言える。そこでｇｅｒｍｌｉｎｅ比率をライブラリーの評価に用いることができる。
本発明者らが利用した１２通りのプライマーセットは、ＶＨＨ遺伝子を構成する可能性があるあらゆるｇｅｒｍｌｉｎｅの遺伝子を増幅することができる。つまり、上記プライマーを用いれば、ＶＨＨが由来するｇｅｒｍｌｉｎｅのｉｎ ｖｉｖｏにおける存在比を維持したライブラリーを作製することができる。
ＶＨＨの多様性は、抗体遺伝子を構成するＶＨ−Ｄ−ＪＨ３つの遺伝子セグメントの組み合せ、これらの遺伝子セグメントの再編成過程における塩基の付加や欠損、あるいは抗体産生細胞の変異によってもたらされていると考えられている。これらの機構は、通常の哺乳動物における抗体の多様性獲得のための機構と同様と考えられている。
ＶＨＨの多様性を支える機構の内、ＶＨ−Ｄ−ＪＨの各セグメントが選択され再編成される工程は、Ｂ細胞の成熟にともなって染色体において生じる遺伝的な変化である。Ｂ細胞分化途上に抗体遺伝子座で起こる重鎖のＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子の再編成は、抗原の有無に関係なく起こる。１個のＢ細胞は、１組のＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子を発現する。同じｇｅｒｍｌｉｎｅに由来することは、同じＶＨＨを産生することを意味しない。
さて、抗体産生細胞は、互いに異なるＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子の組み合せを有する細胞集団である。ＶＨＨ遺伝子をライブラリー化する過程で一部のｇｅｒｍｌｉｎｅ由来の抗体遺伝子（すなわちＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子の組み合せ）が失われることは、ライブラリーに偏りを生じさせる原因となる。ＶＨＨ遺伝子の多様性を支える機構は、ＶＨ−Ｄ−ＪＨ遺伝子の再編成のみではない。しかし失われた一部のｇｅｒｍｌｉｎｅ由来の抗体遺伝子を変異によって再生することが極めて困難であることから考えると、ｇｅｒｍｌｉｎｅ由来の抗体遺伝子の比を維持したライブラリーを構成することの重要性は容易に理解できる。したがって、ＶＨＨ遺伝子に人為的に変異を導入してレパートリーサイズを拡張する試みによって、失われた一部のｇｅｒｍｌｉｎｅ由来の遺伝子を補うことができるかどうかは疑問である。
本発明において、ライブラリーが生体における多様性を維持していることは、たとえば次のようにして確認することができる。すなわち、ライブラリーを構成するクローンから無作為に十分量のクローンを取り出して調べたときに、望ましくは６つのＶＨＨサブファミリーが含まれ、かつ１５個以上のクラスが含まれるとき、当該ライブラリーは生体内における多様性を維持していると見なすことができる。なお解析に用いる十分量のクローンとは、たとえば５０クローン以上を言う。
ところで本発明のＶＨＨライブラリーは、ＶＨＨ遺伝子以外の遺伝子の混入が許容される。特に、ＶＨでは認識が難しい抗原決定基に対して結合するＶＨＨの取得においては、ＶＨＨ取得の障害とはなりにくい。たとえライブラリー中にＶＨが共存していても、ＶＨが抗原を占有する可能性が低いためである。しかし、ＶＨＨライブラリーがＶＨＨに固有の利点を期待してスクリーニングされるものであることを考慮すると、ＶＨＨ遺伝子以外の遺伝子の混入は避けるのが望ましい。本発明のＶＨＨライブラリーは、通常６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上がＶＨＨ遺伝子で構成されるものとする。ＶＨなどのＶＨＨ遺伝子以外の遺伝子の構成が高まると、場合によりＶＨＨ遺伝子のスクリーニング効率を低下させる原因となる恐れがある。
たとえば本発明者らが見出した前記ＶＨＨ遺伝子増幅用のプライマーを用いたＰＣＲ法によってＶＨＨ遺伝子を増幅することにより、ＶＨＨ遺伝子を選択的に取得することができる。このようにして構築された本発明のＶＨＨライブラリーは、ＶＨＨ遺伝子の構成比率が著しく高い。本発明の望ましいＶＨＨライブラリーは、たとえば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上のＶＨＨを含む。より具体的には、本発明は、９０％以上、たとえば９３％以上のＩｇＧ２由来のＶＨＨを含むＶＨＨライブラリーに関する。あるいは本発明は、９５％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上のＩｇＧ３由来のＶＨＨを含むＶＨＨライブラリーに関する。
（３）ＶＨＨ遺伝子の増幅にあたっては、指数的な増幅が進行しつつあるときに増幅産物を回収する
ＰＣＲに代表される遺伝子の増幅反応によって得ることができる産物の量には、通常、上限がある。つまり、反応がある水準に達すると、増幅反応が進まなくなる。このことは、鋳型の量にかかわらず、増幅反応の結果として得ることができる増幅産物の量が一定であることを意味している。生体内における抗体遺伝子は、多様な遺伝子の複雑な集合体として存在している。このような集合体を鋳型として人為的に増幅すると、その産物は、しばしば数的に優位な遺伝子によって占められてしまう。優位な遺伝子が増幅反応の上限に達した時点で、増幅反応が停止してしまうためである。このような現象が起きると、遺伝子増幅によって多くのレパートリーが失われてしまうことになる。
本発明者らは、遺伝子増幅反応の指数的な増幅が起きている間に増幅産物を回収することにより、遺伝子増幅を通じてレパートリーを失う危険性を小さくすることができることを見出した。指数的な増幅が起きている間は、全ての鋳型がほぼ同じ確率で増幅されていると見なすことができる。したがって、その間に増幅産物を回収すれば、増幅反応の間に失われるレパートリーを最小限度にとどめることができる。
指数的な増幅が起きていることは、遺伝子増幅産物の量をモニターすることによって確認することができる。特に、ＰＣＲのように反応サイクルの数によって反応の進行が制御されている場合には、各反応サイクルごとに増幅産物の量をモニターし、反応が上限に達するのに必要なサイクル数を明らかにすることができる。サイバーグリーン等のインターカレーター存在下で増幅反応を行えば、増幅産物の量を蛍光強度の変化によってモニターすることができる。あるいは反応液を分取して電気泳動を行えば、増幅産物を視覚的に確認することもできる。
たとえば実施例に示した条件では、ＰＣＲ法を１７サイクル以下とすることにより、指数的な増幅が起きている間に増幅産物を回収することができる。ＰＣＲ法において、指数的な増幅が起きている状態は、種々の条件によって決定される。たとえば、鋳型となる遺伝子の量、プライマーの量、ＤＮＡポリメラーゼの種類や使用量は、指数的な増幅が起きている状態に対して影響を与える要因となる。したがって実施例とは異なる条件においては、１７サイクル以上であっても、指数的な増幅が継続する場合もある。ある条件のもとで指数的な増幅が起きている状態にあることは、上記のようにして確認することができる。
このような条件でＶＨＨ遺伝子を増幅すれば、増幅産物における遺伝子間のバランスは、鋳型における各遺伝子の数的なバランスを反映している。その結果、数的に優位な遺伝子とともに、少数の遺伝子も取得できる可能性が高まる。
上記のような条件で取得されたＶＨＨ遺伝子は、任意の方法によってライブラリーとすることができる。本発明のライブラリーは、ｒｇｄｐライブラリーとすると、結合親和性に基づくスクリーニングに有利である。ｒｇｄｐライブラリーとは、複製可能な遺伝的表示パッケージのライブラリー（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｐｌａｙ ｐａｃｋａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ）を言う。すなわち、遺伝子を保持するとともに、その遺伝子の発現生成物を表面に提示したもの（遺伝的表示パッケージ）で構成されるライブラリーを呼ぶ。代表的なｒｇｄｐライブラリーとしては、ファージディスプレー法を利用したファージライブラリーが挙げられる。ｒｇｄｐライブラリーには、ファージライブラリーのほか、外来タンパク質をその表面に発現している形質転換細胞やリボゾームからなるライブラリーを示すことができる。
ファージディスプレー法はＳｍｉｔｈにより１９８５年（Ｓｍｉｔｈ ＧＰ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５ ２２８：４０７５ １３１５−７）に考案されたもので、Ｍ１３ファージのような一本鎖環状ＤＮＡを持つ線状のバクテリオファージが用いられる。ファージ粒子はＤＮＡの周囲を取り囲んでファージ粒子の大部分を構成するｃｐ８というタンパクと、ファージが大腸菌に感染する時に機能する５個のｃｐ３と呼ばれるタンパクからなっている。このｃｐ３もしくはｃｐ８と融合した形でポリペプチドをコードするように遺伝子を構築し、ファージ粒子表面にそのタンパクを発現させるシステムがファージディスプレーシステムである。結合性のタンパク質を表面に保持したファージ粒子は、そのリガンドとの結合活性を利用して濃縮することができる。こうして目的とするＤＮＡを濃縮する方法は、パニング法と呼ばれている。濃縮されたファージ粒子には、必要な結合活性を持つタンパク質をコードするＤＮＡがパッケージングされている。このように繊維状ファージの利用によって、結合活性に基づくスクリーニングと、ＤＮＡのクローニングとをきわめて効率的に行うことができるシステムが実現した（特表平５−５０８０７６）。繊維状ファージを使ったライブラリーには、Ｆａｂ分子として発現が可能な方法も報告された（特表平６−５０６８３６）。この報告において、ｃｐ３等のＮ末端を欠損させて可変領域を融合させる方法が試みられた。
上記のようにして得られたＶＨＨ遺伝子は、たとえば以下のようにしてファージライブラリーとすることができる。まず、ＶＨＨ遺伝子の増幅産物を制限酵素で処理する。実施例に示した５’側プライマーである配列番号：１〜配列番号：６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドには、ＳｆｉＩサイトが含まれている。得られた断片を、ファージ蛋白質との融合蛋白質を発現することができるＶＨＨ遺伝子導入用の発現ベクターに挿入する。ＶＨＨ遺伝子との融合パートナーとするファージ蛋白質には、ｃｐ３やｃｐ８が利用される。発現ベクターには、ＶＨＨ遺伝子断片を導入するための制限酵素サイトを用意しておく。たとえば実施例に用いたベクターのＳｆｉＩ−ＡｓｃＩサイトには、ＶＨＨ遺伝子の増幅産物のＳｆｉＩ−ＡｓｃＩ処理断片を導入することができる。
ＶＨＨ遺伝子の組み込みには、Ｃｒｅリコンビナーゼを利用することもできる。すなわち、ＬｏｘＰ配列を付加したプライマーを利用して両端にＬｏｘＰ配列を有するＶＨＨ遺伝子の増幅産物を得る。一方、発現ベクターの組み込み部位にもＬｏｘＰ配列を配置しておけば、両者をＣｒｅリコンビナーゼの作用で組み換えることができる。
ＶＨＨ遺伝子導入用の発現ベクターとしては、ｃｐ３やｃｐ８等のファージ表面蛋白質をコードする遺伝子を有し、当該蛋白質との融合蛋白質としてＶＨＨ遺伝子を発現するように、ＶＨＨ遺伝子組み込み用の部位を配置したベクターを用いる。ＶＨＨ遺伝子組み込み用の部位には、例えば実施例に示したようなＳｆｉＩ／ＡｓｃＩサイトを用いることができる。この制限酵素の認識配列は、本発明者らが解析した範囲では、ラクダＶＨＨ遺伝子に見出すことができなかった。したがってＳｆｉＩ／ＡｓｃＩという制限酵素の組み合せは、ラクダＶＨＨ遺伝子ライブラリーの構築に有用である。
更に、ファージミドを感染させた宿主微生物の培養上清をスクリーニングのための試料とするためには、宿主微生物において動作可能なプロモーターと、シグナル配列とを備えた発現ベクターを用いる。たとえば大腸菌を宿主とする場合には、シグナル配列としてｐｅｌＢ配列などを挿入した繊維状ファージ用のファージミドベクターを利用することができる。本発明のライブラリーの構築に有用な発現ベクターとして、たとえば実施例に示した発現ベクターｐＦＣＡ−１０を示すことができる。
ＶＨＨ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、ヘルパーファージとともに宿主に導入し、両者を発現させることによってＶＨＨを表面に発現したファージ粒子とすることができる。このファージ粒子を回収すれば、本発明によるファージライブラリーを得ることができる。
ヘルパーファージとは、前記発現ベクターが導入された菌に感染して、ファージ成分を供給することにより、前記発現ベクターがコードするファージ表面蛋白質を有するファージを生じさせるものをいう。このとき、発現ベクターに由来する融合蛋白質が利用されるため、ファージ粒子の表面にはＶＨＨが存在することになる。
本発明のＶＨＨファージライブラリーは、パニング法によるＶＨＨのスクリーニングに有用である。パニング法とは、目的とする物質に対するＶＨＨの結合親和性を利用して、ＶＨＨを発現するファージを選択するための方法である。具体的には、まず目的とする物質にＶＨＨを発現したファージライブラリーを接触させ、この物質に結合したファージを集める。回収したファージを必要に応じて増幅し、再び目的物質への接触と回収を繰り返す。パニング法を利用して、当該物質に対する結合親和性を有するＶＨＨを発現したファージ取得することができる。ファージには、ＶＨＨをコードする遺伝子がパッケージングされている。したがって、ファージを取得することは、同時にＶＨＨをコードする遺伝子を取得することに他ならない。
本発明のＶＨＨライブラリーは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶＨＨの多様性を越える、極めてレパートリーサイズの大きなライブラリーである。したがって、本発明のＶＨＨライブラリーを利用することによって、通常の免疫操作では取得することが困難な機能を有するＶＨＨでさえ、容易に選択することができる。たとえば酵素の活性を調節する４量体ＩｇＧタイプの抗体を取得することは、困難な場合が多いことは既に述べた。これに対して、２量体免疫グロブリンを構成するＶＨＨでは、酵素活性を調節する抗体も容易に取得できる可能性がある。たとえば、実施例においては、本発明のＶＨＨライブラリーを用いることによって、任意の酵素に対して、その酵素活性を調節する機能を有する複数のＶＨＨを取得することができることを示した。このように非免疫ラクダに由来するＶＨＨまたはＶＨのライブラリーから任意の酵素に対する酵素活性を調節する機能を有する複数のＶＨＨ遺伝子を取得できることは、当該ライブラリーの多様性を評価するための指標の一つである。
上記のように、本発明のＶＨＨライブラリーまたはＶＨライブラリーは、酵素活性を調節する機能を有するＶＨＨの取得に有用である。すなわち前記目的とする物質として酵素分子またはその断片を用いることにより、酵素活性を調節する機能を有するＶＨＨまたはＶＨを取得することができる。酵素分子の断片は、当該酵素を断片化することによって得ることができる。この目的に用いる酵素分子またはその断片は、他の蛋白質との融合蛋白質とすることもできる。あるいは酵素をコードする遺伝子の部分配列を発現させ、その発現産物を断片として利用しても良い。酵素活性を調節する機能を有するＶＨＨまたはＶＨの取得を目的とするとき、酵素の活性部位を含む断片を用いるのが有利である。酵素の活性部位を明らかにする方法は公知である。パニング法によって選択されたＶＨＨまたはＶＨは、更に酵素分子に対する作用を確認することによって、最終的に酵素活性を調節する機能を評価することができる。より具体的には、酵素分子に評価すべきＶＨＨまたはＶＨを接触させ、接触させない場合と比較して酵素活性が変化した場合には、そのＶＨＨまたはＶＨが酵素活性を調節する機能を有すると確認することができる。本発明において、酵素活性を調節する機能には、酵素活性の阻害または促進が含まれる。
本発明に基づいて取得されたＶＨＨまたはＶＨをコードする遺伝子は、適当な発現系を利用することによって、イムノグロブリンまたはイムノグロブリン断片に翻訳することができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、ラクダ科動物由来ＶＨＨを可変領域として有するイムノグロブリンまたはその断片の製造方法に関する。あるいはＶＨＨの代わりにＶＨを利用して、同様の手法によってＶＨを有するイムノグロブリンを製造することができる。
（１）上記方法によって目的とする物資に対する結合活性を有するＶＨＨをコードする遺伝子を取得する工程、
（２）得られたＶＨＨをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現可能なベクターに組み込んでＶＨＨ発現ベクターとする工程、および
（３）ＶＨＨ発現ベクターを宿主細胞に導入し、その培養物からＶＨＨを含む蛋白質を回収する工程
本発明に基づいてｒｇｄｐライブラリーから取得されたＶＨＨをコードする遺伝子は、ＶＨＨ発現ベクターから回収することができる。たとえば、ライブラリーの構築に用いたプライマーを用いて、発現ベクターを鋳型としてＰＣＲを行えば、目的とするＶＨＨ遺伝子を増幅することができる。あるいは取得すべきＶＨＨクローンが大量に得ることができる場合には、制限酵素処理によってＶＨＨ遺伝子断片を切り出すこともできる。
選択されたＶＨＨ遺伝子は、定常領域をコードする遺伝子と連結すれば、完全な２量体免疫グロブリンとすることもできる。たとえば、ＩｇＧの細胞やウイルスに対する障害作用を利用する場合には、定常領域を有するＩｇＧの方が有利である。このとき、ヒトの定常領域を組み合せてキメラ抗体とすることにより、安全な製剤とすることができる。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける診断薬や工業的な用途においては、ＶＨＨのまま用いることもできる。あるいはＶＨＨに適当なタグを付加した融合蛋白質とすることもできる。タグには、Ｈｉｓタグなどを用いることができる。Ｈｉｓタグを付加したＶＨＨは、ニッケルカラムなどを利用して容易に精製することができる。あるいはＶＨＨは、ＧＦＰまたはＲＦＰなどの異種蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５７，１７５−１８４，２００１）。
ＶＨＨ遺伝子を、ＶＨＨ、あるいはＶＨＨを含む融合蛋白質として発現させるための発現ベクターには、任意のベクターを利用することができる。たとえば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍａｓｈａｍ）、ｐＴＺ１９Ｒ、ｐＴＺ１８Ｒ等のベクターはイムノグロブリンの発現に有用である。これらのベクターの構築方法は公知である。ＶＨＨ遺伝子を導入した発現ベクターは、各ベクターに応じた宿主に形質転換することができる。たとえば先に例示した発現ベクターであれば、ＤＨ１２Ｓ、ＴＧ１、ＨＢ２１５１等に形質転換することにより、ＶＨＨを発現させることができる。本発明に基づいて得られたＶＨＨ、あるいはＶＨＨを含む免疫グロブリンにはさまざまな用途が考えられる
例えば、ウイルス、細菌、寄生虫またはその他の病原因子に由来する疾患は、多くの場合、免疫グロブリンの結合による、病原因子の酵素活性の妨害、または病原因子による標的分子の認識の妨害によって疾患の発生を回避することができる。さらに、免疫グロブリンを毒性物質の活性（毒性）部位に結合させることによってその有害な影響を無効にすることができる。
本発明によって取得されたラクダ抗体ＶＨ、ＶＨＨには、酵素活性の阻害作用のみならず、酵素活性を増強する作用も期待できる。このような作用を有するラクダ抗体ＶＨ、ＶＨＨによって、酵素機能の不調またはタンパク質認識の不調を由来とする、複合した酵素的または生理的プロセスの機能不全に対して、症状の悪化を抑えたり、病的苦痛の緩和、あるいは治癒も期待できる。
また本発明によって得られた酵素阻害抗体は、その酵素活性の評価に利用することができる。すなわち、ある酵素活性が酵素阻害抗体によって阻害されれば、その試料中には酵素阻害抗体によって阻害される酵素が存在することを明らかにすることができる。酵素阻害抗体の添加量と阻害のレベルを関連付けることによって、試料中に含まれる酵素活性レベルを定量的に評価することもできる。
その他に、本発明によって得られた酵素作用を増強する作用を有する抗体は、当該酵素活性の検出に有用である。具体的には、酵素作用を増強する作用を有する抗体によって、微量な酵素活性を増幅して検出する系を構築することができる。本発明によって得られた抗体を利用した、酵素活性の試験測定キット、診断技術を提供することができる。
更に本発明によって得られた酵素活性を調節する作用を有する抗体を、工業的な酵素反応に利用することができる。たとえば酵素活性を促進する抗体を酵素反応系に共存させることによって、目的とする生産物の収量を向上させることができる。あるいは逆に、目的とする生産物を消費する酵素活性を抑制する抗体を酵素反応系に共存させて、生産物の生産量を向上させることもできる。更に、望ましくない副生物を生じる酵素活性を抑制することにより、生産物の純度の向上を期待することもできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕 ラクダ抗体ライブラリーの作製
１−１．ラクダｇｅｒｍｌｉｎｅ中の制限酵素部位の確認、プライマー設計
以下の実施例において、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏｌａｂｓあるいは同社製のバッファーをＮＥＢと記載する。ラクダＶＨあるいはＶＨＨのｇｅｒｍｌｉｎｅに関して、参考文献（ＥＭＢＯ．Ｊ．１９（５）９２１，２０００）より、ベクターへのサブクローニングに使用する制限酵素ＳｆｉＩ、ＡｓｃＩによる切断部位が無いことを確認し、ＶＨおよびＶＨＨのｇｅｒｍｌｉｎｅを網羅するＶ領域のＮ末端６種のプライマーを設計した。プライマーの塩基配列を配列番号：１〜配列番号：６に示す。

次にＶ領域のＣ末端のプライマーを設計した。
今回作製したラクダライブラリーはスクリーニングの利便を考えて、凝集を起こす可能性のあるＶＨ（ＩｇＧ１）をできるだけ除くこととした。このためＩｇＧ１を除きＩｇＧ２およびＩｇＧ３を選択的にライブラリーに含めることした。そのためには、ＩｇＧ１には存在せず、ＩｇＧ２あるいはＩｇＧ３にのみ存在する配列をプライマーとして使用すればよい。
そこで、本発明者らはＶ領域のさらにＣ末端側に存在するヒンジ領域の配列の差異に着目した。以前取得したラクダＩｇＧ１遺伝子のヒンジ領域（ＰＣＲ産物８００ｂｐ）を解析しＩｇＧ２、ＩｇＧ３と比較した。その結果、この領域におけるアミノ酸配列には以下に示すような差異が見られた。

この結果を元に、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３を選択的に増幅するプライマーを、Ｖ領域のさらにＣ末端側に存在するヒンジ領域Ｎ末端塩基配列を決定して設計した。こうして決定したＣ末端側（３’側）のプライマーの塩基配列を配列番号：１０（ＩｇＧ２ＬＢ１）および配列番号：１１（ＩｇＧ３ＬＢ２）に示した。

１−２．ライブラリー用クローニングベクター
まずＶＨＨ遺伝子を組み込むＳｆｉＩ−ＡｓｃＩサイトにｓｔｕｆｆｅｒ配列が入った発現用ベクターを構築した。ベクターの構築に用いたｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクター、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄベクター、およびラクダＶＨＨ組み込み用発現ベクターｐＦＣＡ−１０の構造を図１に、またｐＦＣＡ−１０の塩基配列と蛋白質コード領域によってコードされるアミノ酸配列を図２に示した。ベクターが制限酵素によって切断されなかった場合、あるいは抗体遺伝子が組み込まれなかった場合にｃｐ３が発現しないように工夫した。ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄおよびｐＦＣＡ−１０は、以下のようにして構築した。
１−２−１．ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの作製
ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ３μｇ（３μＬ）（ＷＯ ０１／６２９０７を参照）をＢｓｔＰＩ（３Ｕ／μＬ）３μＬ、１０×Ｈ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３９μＬと混合し、３７℃で２時間、制限酵素処理を行った。処理後、エタノール沈殿して得られた沈殿を１０μＬのＴＥバッファーに溶解した。これに、ＳａｃＩ（１０Ｕ／μＬ）１μＬ、１０×Ｌ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＤＷ３４μＬを混合して３７℃で２時間、制限酵素処理した後、アガロースゲル電気泳動して、４．７ｋｂ断片を回収した。回収物をエタノール沈殿して１０μＬとした（ｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片）。
一方、プライマーｌｉｎＦ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬとプライマーｌｉｎＲ（１００ｐｍｏｌ／μＬ）５μＬを混合し、９４℃で５分加熱した後、８０℃５分、７０℃５分、室温放置３０分によりアニールさせた。このうち、２μＬと上記で得られたｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ｄ ＢｓｔＰＩ−ＳａｃＩ断片１μＬ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ １．５μＬ、ＤＷ ９．５μＬ、Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ １μＬを混合し、１６℃で１６時間反応させた。反応後、エタノール沈殿して３μＬに濃縮し、そのうち１．５μＬを用いて、大腸菌ＤＨ１２Ｓコンピテントセル２０μＬをエレクトロポレーションにより形質転換した。得られたクローンのプラスミドを抽出し、塩基配列を確認して、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄと名づけた。図１（上）にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄの構造を模式的に示した。また、図１６および図１７にｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示した。そして図１９および図２０に、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示した。

１−２−２．ラクダ抗体ライブラリー用ベクター（ｐＦＣＡ−１０）の作製
ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄベクター２μｇ（１０μＬ）と、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、ＤＷ ７８μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ（１２ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ（ＡｓｃＩに添付）１０μＬ、ＤＷ ７８μＬ、ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動して目的の断片（３．７ｋｂ）を回収し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製した。エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。
次に、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクター０．１μｇ（５μＬ）、Ｍ１３ＲＶプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ、５’−ＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ−３’；配列番号：１２／サワデーテクノロジー社製）１μＬ、ＸｈｏＡｓｃプライマー（１００ｐｍｏｌ／μＬ，５’−ＣＧＡＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’；配列番号：１３／サワデーテクノロジー社製）１μＬ、１０×ｂｕｆｆｅｒ ＃１（ＫＯＤに添付）１０μＬ、ｄＮＴＰｍｉｘ（ＫＯＤに添付）１０μＬ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２ ４μＬ、ＤＷ ６８μＬ，ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５ｕ／μＬ；東洋紡社製）１μＬを氷上で混合し、ミネラルオイルを２滴添加して、９４℃で２分保温した。次いで、９４℃で１分、５５℃で２分、７２℃で１分を２５サイクル繰り返した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で確認後、４００ｂｐ付近のバンドを切り出し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製して、エタノール沈殿後、ＴＥ １０μｌに懸濁した。
これに、１０×Ｍ ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ，ＤＷ ７８μＬ，ＨｉｎｄＩＩＩ（１２ｕ／μＬ；宝酒造社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬのＴＥに溶解した。続いて、これに１０×ＮＥＢ４ ｂｕｆｆｅｒ（ＡｓｃＩに添付）１０μＬ，ＤＷ ７８μＬ、ＡｓｃＩ（１０ｕ／μＬ；ＮＥＢ社製）２μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートしたのち、エタノール沈殿して濃縮しアガロースゲル電気泳動した。３４０ｂｐ付近のバンドを回収し、ジーンクリーンＩＩキット（フナコシ株式会社）で精製したのち、エタノール沈殿して濃縮し、１０μＬの１／１０ＴＥに溶解した。このうち半分の５μｌに、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｓｃＩ断片２μＬ、１０×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ２μＬ、１０ｍＭ ＡＴＰ ２μＬ，ＤＷ ８μＬ、およびＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ １μＬを加えて混合し、１６℃で１６時間インキュベートした。エタノール沈殿して３μＬの１／５ＴＥに溶解し、その半分を用いてコンピテントセルＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）２０μＬに懸濁し、以下の条件でエレクトロポレーションを行うことにより、形質転換した。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
得られた形質転換体１２個について、ＬＢＧＡ中で３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてプラスミドを抽出し、その塩基配列を確認した。配列は、蛍光プライマーＭ１３ Ｒｅｖｅｒｓｅ（ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＩＣ−４０００−２１Ｂアロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって決定した。その結果、いずれも設計したとおりの配列であった。このうちのひとつ（Ｎｏ．１）を４００ｍＬの培養液からアルカリ法にて調製し、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心法で精製して、２１０μｇ得た。これを、ｐＦＣＡ−１０と名づけ、ラクダ抗体ライブラリー用ベクターとした。
１−３．凍結脾臓からのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製（グアニジン−超遠心法）
ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）の凍結脾臓約９ｇを凍結したままハンマーで細かく砕いた。重量を測定した後、すぐにＧＴＣ溶液（４．０Ｍグアニジンチオシアネート、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ４．５）、使用直前に２−メルカプトエタノール４５０μＬ加える）４５ｍｌを加え、氷冷したｎｉｓｓｅｉ Ｅｘｃｅｌ Ａｕｔｏ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒで１７０００ｒｐｍ、２ｍｉｎでさらに断片化した。次にテフロンホモジェナイザーで、結合組織かすのみが残るよう完全にホモジェネートした。ホモジェネート液をガーゼでろ過した。
ろ過した液にＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔを０．２３ｇ粉末で加えよく溶かした。注射筒に注射針１８Ｇをつけ３回、２１Ｇで５回、２２Ｇで５回溶液を出し入れしＤＮＡをせん弾力で断片化した。
室温で５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離して沈殿を除いた。溶液は約３６ｍｌであった。ＨＩＴＡＣＨＩ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｗａｒｅ １３ＰＡチューブをＤＥＰＣ水で洗い、ＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣｌ，０．０１Ｍ ＥＤＴＡ）４ｍｌ入れ、界面を乱さぬよう上清６ｍｌを重層した。超遠心は日立ＨＩＭＡＣ５５Ｐ−７２、ローターＲＰ４０Ｔ−７４０を用いて３０，０００ｒｐｍ、２０時間行った。
（以下の工程に用いる試薬はＴＥＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ）を除きすべてＤＥＰＣ処理したものを用い、ＲＮＡ分解酵素の混入を極力防ぐように注意して作業した。）
遠心後、上層を注意深く除き（パスツールピペットは頻繁に交換する）、約０．５ｍｌになったらチューブをひっくり返して液を捨てた。熱したカッターで底から１ｃｍ程度のＲＮＡ沈殿部を切り取り、７５％エタノールで沈殿をすすぎ風乾した。ＴＥＳ溶液で沈殿を溶かし、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２、２．５体積のエタノールを添加して沈殿させ、使用時まで−８０℃に保存した。
上記と同様の工程により２２頭のラクダ脾臓からグアニジン−超遠心法によってｔｏｔａｌ ＲＮＡを取得した。このｔｏｔａｌ ＲＮＡから市販のオリゴｄＴカラムキット（ファルマシア ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴカラム法）を用いてｍＲＮＡを調製した。収量はＴｏｔａｌ ＲＮＡの１％程度であった。
１−４．ＶＨＨ型選択重鎖可変部抗体ライブラリー作製
１−４−１．ｃＤＮＡ調製
各ラクダに由来するｍＲＮＡ １μｇずつを混合し、ライブラリーテンプレートとした。このｍＲＮＡをランダムプライマー（Ｎ６，ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）のマニュアルに従って逆転写酵素反応させｃＤＮＡを作製した。
この際に［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰの取り込みを測定したところ２．４％の［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰが取り込まれ、転写率は１５．８％であることが分かった。取り込み率から計算して２２μｇのｍＲＮＡから３．３μｇのｃＤＮＡを得た。
１−４−２．ライブラリー用ＰＣＲ、ＶＨＨ遺伝子断片回収
ＶＨＨ型選択重鎖可変部抗体ライブラリーとしてＩｇＧ２とＩｇＧ３のそれぞれについて、別々にライブラリーを作製した。ラクダ２２頭で発現されているｇｅｒｍｌｉｎｅ比率を反映したライブラリーを作製するため、ＰＣＲの増幅プロセスをモニターして指数増幅期における増幅産物を回収した。ＰＣＲの増幅プロセスは、反応を数サイクル毎に止め、ＤＮＡ量を定量することによってモニターした。指数的に遺伝子が増幅されている間であれば、多様な断片であっても増殖前のレパートリーを正確に反映した遺伝子断片集団を得られるはずである。
ラクダ抗体遺伝子をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにライゲーションして作製したコントロールＤＮＡの原液、１０倍希釈、および１００倍希釈をテンプレートとして遺伝子の増幅を確認した（図３）。このときＮ末端プライマーとしてＶＨ３ａプライマー（配列番号：１）を用い、Ｃ末端プライマーとしてＪ遺伝子を元に作製した、”Ｊプライマー”（５’−ＡＡ ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣ ＴＧＡ ＶＧＡ ＧＲＹ ＧＧＴ ＧＡＣ ＹＨＧ−３’；ただし、Ｖ：ＡＣＧ、Ｒ：ＡＧ、Ｙ：ＣＴ、Ｈ：ＡＣＴの混合塩基を示す。配列番号：４２）を用いた。Ｎ末端プライマーをＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ１（配列番号：２）あるいはＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ２（配列番号：３）に変えて、コントロールＤＮＡ原液をテンプレートとして同様の実験を行ったものも図３のｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２としてそれぞれ示した。
いくつかのサイクル数で反応を止め、反応液の一部を取り出し、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（ＧＩＢｃｏＢＲＬ）で染色したのち蛍光光度計を用いてＤＮＡを定量した。１０倍希釈あるいは１００倍希釈の２０サイクル目までのようにＤＮＡ濃度が低い段階では、測定ノイズのために見かけ上増幅率が低くみえる場合もあるが、おおむね２７サイクル程度までは、指数的な増幅を確認できた。
次に実際に１−４−１で得られたｃＤＮＡを用いて、配列番号：１−配列番号：６のプライマーを用いて遺伝子を増幅した。１５、１７、１９、２１サイクルで反応を止め、反応液２μＬを電気泳動した。その結果少なくとも１９サイクルまでに反応が飽和状態に達することはなかった（図４）。
以上の結果より等量のｃＤＮＡに対して、６種類の５’プライマーに対して、２種類の３’プライマー（ＩｇＧ２ ＬＢ１あるいはＩｇＧ３ ＬＢ２）の全ての組み合せについて、１７サイクルのＰＣＲ反応を実施した。
ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＬＡ Ｔａｑ（宝酒造） ０．５μｌ
１０ｘ ＬＡ バッファー（宝ＬＡ Ｔａｑ添付） １０μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（宝ＬＡ Ｔａｑ添付） １０μｌ
ｄＮＴＰ（宝ＬＡ Ｔａｑ添付） １６μｌ
滅菌ＭｉｌｌｉＱ ６１．５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ ｃＤＮＡ １μｌ
５’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ） ０．５μｌ
３’側プライマー（１００ｐｍｏｌ／μｌ） ０．５μｌ
５’側プライマーには、ＶＨ３ａ（配列番号：１）、ＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ１（配列番号：２）、ＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ２（配列番号：３）、ＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ４（配列番号：４）、ＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ５（配列番号：５）、およびＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ６（配列番号：６）のいずれかを用いた。また３’側プライマーには、ＩｇＧ２ＬＢ１（配列番号：１０）、またはＩｇＧ３ＬＢ２（配列番号：１１）のいずれかを用いた。これらのプライマーの全ての組み合せで（５’側６種×３’側２種＝１２とおり）、ＰＣＲを行った。
５’側プライマーにＶＨＨ−ｇｅｒｍＦ１を用いたときは１１０本、他は５５本の上記反応液が入った０．５ｍｌチューブにミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ）を５０μＬ重層し９４℃で３ｍｉｎの後、９４℃で１ｍｉｎ、６１℃で２ｍｉｎ（ＩｇＧ３ＬＢ２を用いたときは５９℃）、７２℃で１ｍｉｎを１７サイクル増幅させた。ＩｇＧ２の６種、あるいはＩｇＧ３の６種のＰＣＲ増幅断片をそれぞれ混ぜて、電気泳動した。目的の断片を含むバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）で回収した。ＩｇＧ３に対し４８μｇ、ＩｇＧ２に対し２５μｇのＰＣＲ断片を回収した。
１−４−３．ＰＣＲ増幅遺伝子断片のライブラリーベクターへの挿入
酵素切断とライゲーションの条件を以下に示す。
（１）ライブラリー用ベクターｐＦＣＡ−１０ ＳｆｉＩ（ＮＥＢ）切断、ＴｓＡＰ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）処理
ベクター １００μｇ
ＮＥＢ Ｎｏ．２ ２００μＬ
１０ｘＢＳＡ（宝酒造） ２００μＬ
ＳｆｉＩ １０Ｕ／μＬ １００μＬ
ＴｓＡＰ １Ｕ／μＬ ２０μＬ
滅菌ＭｉｌｌｉＱで ２０００μＬに調整した。
上記組成の反応液をミネラルオイルで重層し５０℃、５時間切断した。引き続き、更に以下のものを加えＴｓＡＰ処理した。
ＮＥＢ Ｎｏ．２ １０μＬ
１０ｘＢＳＡ（宝酒造） １０μＬ
Ｄｗ ４０μＬ
ＴｓＡＰ １Ｕ／μＬ ４０μＬ
６５℃で３０ｍｉｎ反応後、ｓｔｏｐ液を加えて６５℃、２０ｍｉｎで失活させた。フェノール−クロロホルム処理を２回行いクロロホルム処理し、ブタノール濃縮で１ｍｌまで濃縮後、２１０μｇのグリコーゲンを加えてエタノール沈殿した。１０５μｇのベクターを回収した。
次に、以下の操作によりＩｇＧ２、またはＩｇＧ３のＰＣＲ増幅産物をＳｆｉＩで切断した。
ＰＣＲフラグメント ２５．０μｇ
ＮＥＢ Ｎｏ．２ ５０μＬ
１０ｘＢＳＡ（宝酒造） ５０μＬ
ＳｆｉＩ １０Ｕ／μＬ ２５μＬ
滅菌ＭｉｌｌｉＱで ２００μＬに調整した。
反応液をミネラルオイルで上層し５０℃、３時間切断した。フェノール−クロロホルム処理しクロロホルム処理、エタノール沈殿した。２２μｇのＩｇＧ２、および２３．８μｇのＩｇＧ３を回収した。
（２）ＳｆｉＩ部分ライゲーション
ＩｇＧ２またはＩｇＧ３ ＰＣＲ増幅産物のＳｆｉＩ切断断片 ８μｇ
ライブラリー用ベクターｐＦＣＡ−１０ ｓｆｉＩ切断ＤＮＡ ４０μｇ
１０ ｍＭ ＤＴＴ ４０μＬ
１０ ｍＭ ＡＴＰ ４０μＬ
１０ｘＬｉｇａｓｅバッファー（宝酒造Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ添付）
４０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）３５０Ｕ／μＬ ４０μＬ
滅菌ＭｉｌｌｉＱで ４００μＬに調整した。
反応液を１６℃、１３時間処理した時点で以下のものを追加添加した。
Ｄｗ １２０μＬ
１０ ｍＭ ＤＴＴ ２０μＬ
１０ ｍＭ ＡＴＰ ２０μＬ
１０ｘＬｉｇａｓｅバッファー ２０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）３５０Ｕ／μＬ ２０μＬ
さらに１６℃、６．５時間反応後、フェノール−クロロホルム処理し２３０μＬまでブタノール濃縮して７０μｇのグリコーゲンを加えてエタノール沈殿した。３４．１μｇのＩｇＧ２ライゲーションＤＮＡ、および２９．７μｇのＩｇＧ３ライゲーションＤＮＡを得た。
（３）ＡｓｃＩ切断
回収したＩｇＧ２ライゲーションＤＮＡ（３４．１μｇ）、またはＩｇＧ３ライゲーションＤＮＡ（２９．７μｇ）を、以下の組成の反応液で３７℃、３時間処理した。
ＮＥＢ Ｎｏ．４ ６１μＬ
ＡｓｃＩ（ＮＥＢ）１０Ｕ／μＬ ５０μＬ
滅菌ＭｉｌｌｉＱで ６１０μＬに調整した。
反応後、フェノール−クロロホルム処理し２００μＬまでブタノール濃縮した。７０μｇのグリコーゲンを加えてエタノール沈殿し、２５μｇのＩｇＧ２ライゲーション、および２９μｇのＩｇＧ３ライゲーションを得た。
（４）ＡｓｃＩ部分ライゲーション
回収した２５μｇＤＮＡのＩｇＧ２ライゲーション、または２９μｇＤＮＡのＩｇＧ３ライゲーションを、以下の組成の反応液で処理した。
１０ ｍＭ ＤＴＴ ７５０μＬ
１０ ｍＭ ＡＴＰ ７５０μＬ
１０ｘＬｉｇａｓｅ バッファー ７５０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）３５０Ｕ／μＬ ３７５μＬ
滅菌ＭｉｌｌｉＱで ７５００μＬに調整した。
１６℃、１６時間処理した時点で、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ ＹＭ−１０（分画分子量１００００，ａｍｉｃｏｎ）で各６００μＬまで濃縮し、フェノール−クロロホルム処理し７０μｇのグリコーゲンを加えてエタノール沈殿させた。２３．７μｇのＩｇＧ２ライゲーション、および２７．８μｇのＩｇＧ３ライゲーションを得た。
１−４−４．ライブラリー発現確認
上述の通り作製した、ラクダＶＨＨ遺伝子を組み込んだ発現ベクター０．２μｇを２０μＬのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に形質転換し、培養上清をとってＶＨＨ−ｃｐ３の発現を確認した。ｐＦＣＡ−１０は分泌シグナルＰｅｌＢ配列を含んでいるので、このベクターで形質転換した大腸菌の培養上清には、微量ながらファージのＶＨＨ−ｃｐ３蛋白質が産生される。したがって、培養上清をＥＬＩＳＡによってモニターすることにより、ＶＨＨ−ｃｐ３の発現を確認することができる。ＥＬＩＳＡによって培養上清中のＶＨＨ−ｃｐ３の発現をモニターした結果、９割が発現していた。ＥＬＩＳＡによるモニターの結果を図５（ＩｇＧ２）、および図６（ＩｇＧ３）に示した。ＥＬＩＳＡの具体的な操作は以下に述べるとおりである。
対数増殖期初期に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導し、２１時間後に遠心、回収した培養上清をＭＡＸＩＳＯＲＰに感作した。１次抗体はウサギ抗ｃｐ３抗体の５００倍希釈を、２次抗体はＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ鎖）ヤギＦａｂ’１万倍希釈を用いた。ＨＲＰ活性の測定のために、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液１００μＬを加えて１０分間反応させた後、２Ｎ硫酸１００μＬを加えて反応を停止し、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。図５および図６の右端の３ａ−ｌｉｂ１−４、Ｓｆｉ３６は、ｆｒａｍｅ ｓｈｉｆｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ（ネガティブコントロール）の結果である。
１−４−５．ＶＨＨ型選択重鎖可変部抗体ライブラリー（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３ラ イブラリー）の形質転換
以下の条件でエレクトロポレーションを行うことにより、大腸菌を形質転換し、ファージ遺伝子を導入した。
エレクトロポレーター
ＢＲＬ社Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｃａｔ．ｓｅｒｉｅｓ １６００）
設定条件；ｖｏｌｔａｇｅ ｂｏｏｓｔｅｒ ４ｋΩ
ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ ３３０μＦ
ＤＣ ｖｏｌｔｓ ＬｏｗΩ
ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｅ Ｆａｓｔ
ＩｇＧ２についてはライゲーションによって得られた２３．７μｇＤＮＡをＤＨ１２Ｓ ２ｍｌに対し形質転換（各０．２μｇを２０μＬのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）にエレクトロポレーション）し、その一部をサンプリングし全体の形質転換菌の数を見積もったところ、１．７ｘ１０^１０であった。これをグリセロールストックし、２０Ｌスケールでファージを調製した。
滅菌した４．８Ｌの２ｘＴＹ（ＤＩＦＣＯ）培地に１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加え、グリセロールストックを加えて波長６００ｎｍにおける吸光度０．３付近になるようにした。これを１６等分し３００ｍＬを滅菌済み５Ｌのフラスコで３７℃で振とう培養し、６００ｎｍ吸光度１．０に達するまで増殖させた。培養液にヘルパーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）をフラスコあたり３ｍｌ加えて３７℃、１時間培養した。これに滅菌２ｘＴＹ培地９００ｍＬと１００μｇ／ｍｌのアンピシリン０．９ｍＬ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン１．２ｍＬを各フラスコに加えて１７時間、３７℃で振とう培養した。
培養時のヘルパーファージ感染時の菌数は５．６６ｘ１０^１１でありヘルパーファージ感染率は７５％（ヘルパーファージ感染時アンピシリン耐性菌４，０６ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍｌ、アンピシリンおよびカナマイシン耐性菌３．０５ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）であった。目標とする１０^１０以上の独立クローンが得られた。
ファージを回収するため、菌液を４℃で１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心し上清を集めた。上清に２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌを４Ｌ加えて約２０ｍｉｎ静かに攪拌した。
４℃で１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心して沈殿を１ＬのＰＢＳに溶解し、２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ ＮａＣｌ ２００ｍＬを加えて約２０ｍｉｎ静かに攪拌した。４℃で１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨ててさらに４℃で１００００ｒｐｍ、１ｍｉｎ遠心、沈殿を回収した。沈殿は０．０５％ＮａＮ_３含有ＰＢＳ２０ｍＬに溶解し、ライブラリーファージ溶液とした。
次に回収したファージの力価を以下のようにチェックした。具体的には、ファージ溶液をＰＢＳで１０^６、１０^７、１０^８希釈し、その１０μＬをＤＨ１２Ｓ ９９０μＬに感染させ、３７℃で１時間培養した。これをＬＢＧＡプレートに１００μＬまいて３０℃で１８時間培養し、コロニーカウントで原液力価を見積もった。その結果、力価３．７３ｘ１０^１３ＣＦＵ／ｍｌのライブラリーファージが２０ｍｌ得られた。
ＩｇＧ３についてはライゲーションによって得られた２７．８μｇ ＤＮＡを、２ｍｌのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に対してエレクトロポレーションによって形質転換した（各０．２μｇを２０μＬのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）に導入）。その一部をサンプリングし全体の形質転換菌の数を見積もったところ、１．１ｘ１０^１０であった。調製についてはＩｇＧ２の場合と同様である。
培養時のヘルパーファージ感染時の菌数は８．６４ｘ１０^１１でありヘルパーファージ感染率は７８％（ヘルパーファージ感染時アンピシリン耐性４，６４ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍｌ、アンピシリンおよびカナマイシン耐性３．６３ｘ１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）であった。目標とする１０^１０以上の独立クローンが得られた。
これをグリセロールストックし、グリセロールストックから２０Ｌスケールでファージを調製し、力価４．２６ｘ１０^１３ｃｆｕ／ｍｌのライブラリーファージが２０ｍｌ得られた。
１−４−６．ライブラリーの遺伝子配列確認
ライブラリーを構成するＶＨＨクローンをランダムに選択し、その塩基配列を決定した。塩基配列は２−６−２に述べる方法にしたがって決定した。決定された塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を解析し、ｉｎ ｆｒａｍｅでかつフレームワークのアミノ酸配列に公知のＶＨＨ遺伝子と有為な相同性が認められば正常と判定した。実際にはフレームワークの相同性が著しく低いものは確認できず、フレームシフトやストップコドンの挿入が起きたものを異常と判定した。その結果ＩｇＧ２については８７％のクローンの遺伝子配列が正常であった。シーケンスが正常であったもののうち、Ｌ鎖と相互作用する４４、４５番目アミノ酸が親水性、すなわちＶＨＨであるのは９２．３％であった。
ＩｇＧ３については９５．８％のクローンのシーケンスが正常であった。Ｌ鎖と相互作用する４４、４５番目アミノ酸は９６％が親水性、すなわちＶＨＨであった。ＶＨとＶＨＨのｇｅｒｍｌｉｎｅ遺伝子における比率が約１：１であることを考えると、非常に高い選択性でＶＨＨがライブラリー化されていることが分かった。
このようにして、良好な発現率かつ高ＶＨＨ比率のライブラリーが作製できた。
〔実施例２〕
ＶＨＨ遺伝子の解析
実施例１では、以下の配列番号に記載された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。各組み合わせによって増幅されるＶＨＨの由来を改めてまとめると、以下のとおりとなる。

各ライブラリーからそれぞれ無作為に５０クローン以上を取り出し、遺伝子の塩基配列を解析した結果の一例を表１に示す。表中の一つのセルが一つのクラスに対応する。表１において、システイン残基の位置に基づいてサブファミリーが、そして更にサブファミリー内でＣＤＲ２とＣＤＲ１の長さに基づいてクラスが分類されている。ＣＤＲの決定方法は公知の方法（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９９１）Ｎｏ．９１−３２４２）にしたがった。分類の指標とする構造的な特徴は次の基準にしたがって特定された。
ＣＤＲ１の長さ：
Ｎ末端から３１番目のアミノ酸からＫａｂａｔにしたがって定義される３６番目のＷ（トリプトファン）の１つ手前のアミノ酸までのアミノ酸の個数
ＣＤＲ２の長さ：
Ｋａｂａｔにしたがって定義される５０番目のアミノ酸から６６番目のＲ（アルギニン）の１つ手前のアミノ酸までのアミノ酸の個数
Ｃｙｓ位置番号：
３６番目のＷ（トリプトファン）よりＮ末端側にあるときはＮ末端から数えた位置を示す番号をＣｙｓ位置番号とした。また３６番目のＷ（トリプトファン）よりＣ末端側にあるときは、３６番目のＷを３６としてＣｙｓ位置まで数えた番号をＣｙｓ位置番号とした。

文献（ＥＭＢＯ Ｊ．１９（５）９２１，２０００）によれば、
１）システイン残基の位置、および
２）ＣＤＲ２配列の長さ、
によりＶＨＨ遺伝子を７つのサブファミリーに分類する試みがなされている。すなわち、システイン残基の位置（３０，３２，３３，４５）とＣＤＲ２配列の長さ１６または１７アミノ酸から表２のように分類する方法を提唱している。

表中の空欄は、それに該当するクローンを上記文献の報告者が見出しえなかったものである。これに対して、本発明者らによる解析の結果、表１に示すとおり、表２に示されたサブファミリー分類以上の多様性があることが判明した。例えばＣＤＲ２の長さにしても１６、１７以外の長さを持つものが多数存在しており、またシステイン残基の位置にも５０の位置のものあるいは上記のシステイン残基の位置の組み合わせのものなどが存在していた。
さらに、上記文献ではＣＤＲ１の長さは５アミノ酸のもののみが報告されているが、当発明者らの解析結果である表１に明らかなように、これにも多くの多様性があることが明らかとなった。ＣＤＲ１の長さやＣＤＲ２の長さはＣＤＲ３と異なり抗体遺伝子の再編成（リアレンジメント）においても変化しない位置であるからｇｅｒｍｌｉｎｅにおいてもｍＲＮＡにおいても基本的に長さに変化はないと考えられる。
以上をふまえて、当発明者は表１に示すとおり、１）システインの位置において８つのサブファミリーに分類した。さらに、２）ＣＤＲ２配列の長さ、および３）ＣＤＲ１配列の長さの指標を加えた新たなクラス分類を試みた。表１においては、各クラスごとに分類されているが、文献において報告されているｇｅｒｍｌｉｎｅの多様性よりもはるかに大きい多様性を持つことが明らかである。このことから、新たに本発明者らがデザインしたプライマーにより増幅されたＶＨＨ遺伝子は、ラクダ生体における多様性をより忠実に再現したものであると言える。
また本発明者らが新たに見出したＶＨＨのサブファミリーは、ライブラリーのＶＨＨ遺伝子の多様性の指標として有用である。すなわち、ライブラリーを構成するクローンの任意の３３クローンを取り出してＶＨＨの構造を解析し、本発明者らによる分類方法に基づいて分類したとき、少なくとも８個以上のクラスを含んでいれば、そのライブラリーは、生体における多様性を維持していると言うことができる。本発明における生体における多様性を維持している望ましいライブラリーは、ライブラリーを構成するクローンから無作為に十分量のクローンを取り出して調べたときに、６以上のＶＨＨサブファミリーを含み、かつ１５個以上のクラスを含む。
〔実施例３〕
ＶＨＨ型抗体ライブラリーを用いたＧＳＴに対するＶＨＨの作製
３−１．スクリーニング条件の決定
ＷＯ ０１／６２９０７に記載のスクリーニング方法に基づいて、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に対する結合親和性を有するＶＨＨを選択した。
ＧＳＴを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにＰＢＳで調製し、試験管（Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）１本（１回目）または２本（２，３回目）に３．８ｍｌずつ入れ、４℃で１８時間インキュベートしてＧＳＴを試験管内壁に吸着させた。吸着後、液を捨て２％スキムミルク含有ＰＢＳ３．８ｍｌずつを加えて２５℃で１時間反応させ、ブロッキングした。
ＩｇＧ２とＩｇＧ３ライブラリーは混合せずに独立にスクリーニングすることとした。使用ファージ量は表３のＩｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ（ｃｆｕ）量に示した。２％スキムミルク含有ＰＢＳに浮遊したファージ液を３．８ｍｌずつ試験管に添加し、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で８回洗浄した。
つぎに、０．１Ｍトリエチルアミン（ｐＨ１２．３）を試験管１本につき３．５ｍＬずつ添加し、ローテーターを用いて室温で２０分間反応させ乖離させた後、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）０．８７５ｍＬ／試験管を加えて中和することによって、抗原結合マキシソープチューブに結合したファージを回収した。
３−２．回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地５０ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になったとき、３−１で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
２）ヘルパーファージの感染
上記１）の培養液５４ｍＬに、２×ＹＴ培地４３３ｍＬ、４０％グルコース１２．５ｍＬ、および１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．５ｍＬを加えて３７℃で波長６００ｎｍにおける吸光度が０．５になるまで培養した後、４℃、５０００ｒｐｍで１０分間遠心して菌体を沈殿させ、回収して１００ｍｇ／ｍＬアンピシリン０．１５ｍＬを加えた２×ＹＴ培地１５０ｍＬに懸濁した。これにヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を１／１００量（１．５ｍＬ）加え、３７℃で１時間振とう培養した。
培養液を予め３７℃に暖めた培地（２×ＹＴ培地に１００μｇ／ｍＬアンピシリンと７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えた液）４５０ｍＬに加えて３７℃で一晩培養した。
３）ファージの回収
上記２）の培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、その上清に２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて室温で２０分間静置した後、４℃で８０００ｒｐｍ、１５分間遠心して沈殿を回収した。沈殿に培養液の１／１０量の滅菌ＰＢＳを加えて溶解し、再度２．５Ｍの塩化ナトリウムを加えた２０％のポリエチレングリコールを１／５量加えて４℃で１００００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を捨て、さらにスピンダウンして４℃で１００００ｒｐｍ、２分間遠心した。これに０．０５％のＮａＮ_３を加えたＰＢＳを培養液の１／１００量加えて沈殿を溶解し、ＶＨＨファージを回収した。
３−３．増幅したファージによる再スクリーニング
増幅したファージを用いて、抗原結合試験管を用いて同様のスクリーニングを繰り返した。スクリーニングでの洗浄は、非特異に吸着したファージを乖離し、結合力の高いファージを選択する上で重要なステップであることから、洗浄条件は２回目のスクリーニング３０回、３回目のスクリーニング３５回にした。
３−４．ファージのスクリーニングの評価法
以上の方法でスクリーニングを繰り返すとき、（抗原吸着済試験管に投入したファージの総数）÷（抗原吸着済試験管から回収したファージの総数）が前回のスクリーニングに比べて明らかに小さくなれば、目的のＶＨＨを提示しているファージが濃縮されつつあると推測できる。溶液に含まれるファージ数の計算は以下のように行った。
１）ファージの希釈系列を以下のように作製した。
［１］１×１０^−２希釈：ファージ液１０μＬ＋ＰＢＳ ９９０μＬ
［２］１×１０^−４希釈：［１］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ ９９０μＬ
［３］１×１０^−６希釈：［２］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ ９９０μＬ
［４］１×１０^−８希釈：［３］の希釈液１０μＬ＋ＰＢＳ ９９０μＬ
［５］１×１０^−９希釈：［４］の希釈液１００μＬ＋ＰＢＳ ９００μＬ
［６］１×１０^−１０希釈：［５］の希釈液１００μＬ＋ＰＢＳ ９００μＬ
［４］、［５］、および［６］の希釈系列１０μＬにＤＨ１２Ｓ ９９０μＬ
を加えたものを作り、３７℃で１時間感染させ、これをＬＢＧＡプレートに１００μＬまいて３０℃で１８〜２４時間培養し、コロニーを計数した。上記希釈系列のうち、通常［４］のプレートが５０個以上のプラークを作る。ｍＬ当たりのファージ数は［４］のプレートのプラーク数に基づいて、以下のように算出される。
原液のファージ数＝（コロニー数／プレート）×（１×１０^８）×１０^３ｃｆｕ／ｍＬ
３−５．ＧＳＴスクリーニング結果
回収されたファージ数も同様に計算し、本抗原に対するＶＨＨを提示するファージの数をスクリーニングごとに求めたところ、表３のようになった。３^ｒｄスクリーニングで回収ファージ比率（Ｉｎｐｕｔ／ｏｕｔｐｕｔ）の上昇が見られたため、この段階で特異的なＶＨＨが濃縮されていることが予測された。

３−６スクリーニングによって得られたＶＨＨの抗原結合活性の測定
３−６−１．得られたファージＶＨＨのＥＬＩＳＡ法による活性の確認
上記のスクリーニングによって選択されたＶＨＨについて、抗原結合活性（アフィニティー）を９６ウェルマイクロタイタープレートを用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。サンプルはファージ型のＶＨＨではなく、ＶＨＨ−ｃｐ３型のＶＨＨを用いた。
まず、ＶＨＨ−ｃｐ３を発現させるために、ファージの感染した大腸菌を１％Ｇｌｕｃｏｓｅと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴで３０℃１８時間培養した後、０．１％グルコースと１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えた２×ＹＴ １．５ｍＬに上記培養液を５μＬ加えて３０℃で４時間培養した。このときの大腸菌の濃度は波長６００ｎｍの吸光度を測定するとき、約０．５であった。
これに１ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を加えてさらに３０℃で１８時間培養した後、培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブにとり、１００００ｒｐｍ，４℃で５分間遠心してその培養上清をとり、０．１％となるようアジ化ナトリウムを添加して試料とした。
次にＧＳＴを結合したＥＬＩＳＡプレートを準備した。ＧＳＴを終濃度１００μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウエルに１００μＬ添加して４℃で１８時間結合させたのち、５％ＢＳＡ（ブロッキング液）を各ウエルに２００μＬ添加して３７℃で１時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、ＰＢＳで１回洗浄して、アフィニティーの測定に用いた。
試料を各ウエルに１００μＬ加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ＰＢＳで４回洗浄し、２５０倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗ｃｐ３抗体（（株）医学生物学研究所製）を１００μＬ加えて２５℃で１時間反応させた。再度ＰＢＳで４回洗浄し、オルトフェニレンジアミンと過酸化水素の溶液１００μＬを加えて暫時反応させた後、２Ｎ硫酸１００μＬを加えて反応を停止し、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果１９２クローン中７１クローンに結合活性が確認された。ＩｇＧ２で４６クローン（図７）、ＩｇＧ３で２５クローン（図８）の結合活性を有するクローンを選択することができた。
３−６−２．得られた抗ＧＳＴ ＶＨＨの配列解析
抗原結合活性を示した７１個のクローンを選択し、ＬＢＧＡ中で３０℃１８時間培養した後、倉敷紡績社製ＤＮＡ分離装置ＰＩ−５０を用いてファージミドを精製した。これを用いて、その遺伝子の塩基配列を確認した。塩基配列は、蛍光プライマーＴ７（アロカ社製）を用いて、サーモシークエンスキット（アマシャム・ファルマシア製）とアロカ社製Ｌ１−ＣＯＲ４２００Ｌ（Ｓ）−２を使用したジデオキシ法によって決定した。
ＣＤＲ３の配列からＩｇＧ３は１種類、ＩｇＧ２は６種類であることがわかった。スクリーニングによって得られたクローンのＣＤＲ３のアミノ酸配列を表４にまとめた。ＩｇＧ３の１種のＣＤＲ３はＩｇＧ２にも見られサブクラスの切り替わるメカニズムがある可能性があると考えられた。

３−７．抗ＧＳＴ ＶＨＨ精製（ＰｒｏｔｅｉｎＡ融合型への変換、発現確認ＥＬＩＳＡ、大量精製）
３種類の抗ＧＳＴ ＶＨＨをｃｐ３融合蛋白質からｐｒｏｔｅｉｎＡ融合蛋白質に変換した。抗ＧＳＴ ＶＨＨとして、次の３クローンを用いた。
Ｎｏ２１：２クローン単離されたクローン
Ｎｏ２９：最もＥＬＩＳＡ値が高かったクローン
Ｎｏ７５：最もメジャーなＣＤＲ３（３８クローン）を持つクローン
各クローンの塩基配列とアミノ酸配列は、次の配列番号に示す。

操作は次のとおりである。まずｃｐ３領域をＳａｌＩのセルフライゲーションによって除き、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔを得た。Ｎｏ２１，Ｎｏ．２９，Ｎｏ７５の各クローンＤＮＡについて以下の方法でＳａｌＩ切断した。
１μｇ ＤＮＡ（各ｃｐ３発現型ＶＨＨ発現ベクター）／３３μＬ 滅菌ＭＩＬＬＩＱ水
４μＬ １０×Ｈｉｇｈ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造、ＳａｌＩに添付）
３μＬ ＳａｌＩ（宝酒造）
上記組成の反応液を３７℃で２時間インキュベートした。これを０．８％ａｇａｒｏｓｅｇｅｌで１００ｍＡ、約１時間電気泳動し、４ｋＢ付近に見えるバンドをカッターナイフで切りだした。ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）でＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿させた。こうして得たＤＮＡを以下の条件でセルフライゲーションした。
回収ＤＮＡを６２μＬの滅菌ＭＩＬＬＩＱ水に溶解
１０ｍＭ ＤＴＴ １０μＬ
１０ｍＭ ＡＴＰ １０μＬ
１０ｘＬｉｇａｓｅバッファー １０μＬ
Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（宝酒造）３５０Ｕ／μＬ ８μＬ
反応液を１６℃、１５時間インキュベートした後、エタノール沈殿してＤＮＡを回収した。これを滅菌ＭＩＬＬＩＱ水で１０倍希釈した３μｌのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に溶解した。このうち、１．５μＬを２０μＬ ＤＨ１２Ｓにエレクトロポレーションで形質転換した。形質転換の条件は、前記１−４−５．「ＶＨＨ型選択重鎖可変部抗体ライブラリー（ＩｇＧ２、ＩｇＧ３ライブラリー）形質転換」に記載したとおりである。得られた菌株をグルコース０．１％存在２ｘＴＹ５００ｍｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンで培養し、対数増殖前期（ＯＤ６６０ｎｍ＝０．５）に１ｍＭのＩＰＴＧで発現を誘導した。発現誘導後、２０時間で集菌し上清を回収しｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨ含有培養上清を得た。
次に、ｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨを以下のようにして精製した。まず得られた培養上清１００ｍｌに対し、３６ｇの割合で硫安を加え（６０％硫安）、４℃で１時間攪拌して蛋白質を沈殿させた。次いで、８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して上清を捨てた。
５００ｍｌの培養上清あたり、１粒のプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ^ＴＭ、ロシュ社製）を３０ｍＬのＰＢＳで溶解して添加し、１００００ｒｐｍで１５ｍｉｎ遠心して沈殿物を除いた。上清３０ｍＬに０．０５％ＮａＮ_３、およびＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｐｈａｒｍａｃｉａ）１．５ｍｌ樹脂を加えて１時間攪拌した。カラム（１０ｍｌｐｏｌｙ−ｐｒｅｐ、Ｂｉｏ ＲＡＤ）に樹脂液を入れ自由落下により詰め、０．１％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを１０ｍＬずつ２回流した。次に１０ｍＬのＰＢＳを２回流した。更に５０ｍｌのＰＢＳで同様に流した。最後に１０倍希釈した５ｍｌのＰＢＳを流した後、以下の条件でｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨを溶出した。
５０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．４）３ｍｌを流し、溶出液を回収した。
次に０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）４ｍｌを流し、溶出液を回収した。
最後に５０ｍＭクエン酸（ｐＨ２．４）５ｍｌを流し、溶出液を回収した。
回収した溶出液を３ＭのＴｒｉｓ ３５０μＬで中和し、ｐＨ試験紙で中性を確認した。各溶出液を、３５００ＭＷ ＣＯ透析膜（ＰＩＥＲＣＥ）で３ＬのＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。透析後、０．０５％となるようＮａＮ_３を添加した。２８０ｎｍの吸光度を測定することによって、得られた精製蛋白質の濃度を決定した。蛋白質濃度は、ＯＤ２８０ｎｍの値を１．４で割った値をμｇ／ｍＬで示した。更に回収された蛋白質の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。結果は以下に示すとおりである。

ｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨの分子量は、理論値では２８ＫＤである。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、これらの蛋白質が目的とする構造を有していることを裏付けているといえる。
次に、形質転換体の上清を用いて、ｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨのＧＳＴに対する結合活性を確認した。まず形質転換体１６クローンずつを少量で発現させ、そのｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨ含有培養上清を１次抗体として、ＧＳＴをコートしたマイクロカップ（ＭＡＸＩＳＯＲＰ）に分注した。更に２次抗体はＰｒｏｔｅｉｎＡと親和性のあるｒａｂｂｉｔ抗ｍｏｕｓｅ Ｆａｂ抗体（４０００倍希釈）を、そして３次抗体は４０００倍希釈ｇｏａｔ抗ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ−ＨＲＰ（医学生物学研究所）を用い、ＰｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨの発現、並びにその結合能を確認した。
その結果、いずれの形質転換体の培養上清においても、ＧＳＴに対して結合活性を有するｐｒｏｔｅｉｎＡ型ＶＨＨが検出された。
３−４．精製抗ＧＳＴ ＶＨＨの結合定数測定
本発明のライブラリーから選択されたＶＨＨの、ＧＳＴとの相互作用について解析した。具体的には、親和性測定および動力学的分析によって、クローンＮｏ．７５、Ｎｏ．２９とＧＳＴとの相互作用のｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離定数；ｋｄ／ｋａ）を決定した。解析には、ＢＩＡＣＯＲＥ１０００バイオセンサー装置を利用した。
カルボキシメチルデキストラン（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒａｄｅ、ＢＩＡＣＯＲＥ）センサーチップを用いた。ＣＭ５マトリックスへの静電吸着および、ＣＭ５上のリシル基と活性化したカルボキシル基とを共有結合させ、抗原（ＧＳＴ）をチップに固定した。ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学反応（Ｊｏｈｎｓｏｎら）によって、カルボキシル基を活性化した。
流速５μＬ／ｍｉｎ ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ）の条件下、ＥＤＣ／ＮＨＳ（アミンカップリングキット、ＢＩＡＣＯＲＥをＥＤＣ、ＮＨＳを当量混合）でＣＭ５上のリシル基の活性化後（コンタクトタイム２．４ｍｉｎ）に、ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ）でチップを洗浄した。続いてＧＳＴ２０μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ製、０．６ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌを１０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）で希釈）をチップに加えた。チップをＨＢＳ−ＥＰ洗浄した後、続いて、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５を加えて、残っている活性化カルボキシル基を不活性化した。不活性化した後、５０ｍＭのＮａＯＨで洗浄して、共有結合していないすべてのＧＳＴを除去した。固定化された抗原の量は、２２５２ＲＵであると算出された。飽和量のクローンＮＯ．７５をセンサーに加えることによって結合を評価したところ、３００ＲＵ付近であった。
すべての解析実験は、ＨＢＳ−ＥＰ流速３５μｌ／ｍｉｎ ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ）中２５℃にて行い、再生は５０ｍＭのＮａＯＨで１分間行った。
クローンＮｏ．７５の濃度を変化させて（５×１０^−８Ｍ−４．０×１０^−７Ｍ）結合を追跡した。曲線は（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ｂｉｎｄｉｎｇ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎＶｅｒ．３）を用いると、良好にフィットした。ベースライン補正も考慮に入れた。Ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎＶｅｒ．３）により、ｋａ（１／Ｍｓ）を決定したところ、３．８１×１０^４Ｍ^−１Ｓ^−１の値が得られた。ｋｄ（１／Ｓ）を決定したところ、９．１５×１０^−４Ｓ^−１であり、マストランスポート制限が生じるので、この値を下限として用いる。動力学的分析に基づいてＫＤを算出した値は、２４ｎＭであった。
クローンＮｏ．２９の評価の際、固定化された抗原の量は１７５０ＲＵ、飽和量のクローンＮｏ．２９をセンサーに加えることによって結合を評価したところ、４６０ＲＵ付近であった。他は同様な条件で評価したところ、ｋａ（１／Ｍｓ）２．５４×１０^４Ｍ^−４Ｓ^−１、ｋｄ（１／Ｓ）２．５５×１０^−３Ｓ^−１であり、動力学的分析に基づいてＫＤを算出した値は、１００ｎＭであった。クローンＮｏ．７５はｋｄが低く、そのため結合定数が高くなっていた。従ってクローンＮｏ．７５は解離しにくいＶＨＨであると考えられた。
実施例４
４．精製抗ＧＳＴ ＶＨＨを用いた酵素活性阻害実験
４−１．酵素活性測定条件設定
ＧＳＴはグルタチオン、ＣＤＮＢの両方を基質とすることができる、２基質系酵素である。文献（Ｈａｂｉｇ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｎｏｖ．２５，２４９（２２）：７１３０，１９７４）で報告されている条件：ＣＤＮＢ １ｍＭ、グルタチオン１ｍＭ、ＧＳＴ濃度１．５μＭに基づいて、本発明のＶＨＨライブラリーから選択されたＶＨＨの酵素活性に与える影響を評価した。また、酵素反応３分までは直線的だがそれ以降はやや傾きが低くなっているので、３分までの各１分ごとの値から傾きを算出し、酵素反応速度を求めた。
この測定法で、ＣＤＮＢを１ｍＭの条件で固定しグルタチオン濃度を２−０．０６２５ｍＭの間で変化させて、Ｅｄｉｅのプロットで結合定数を求めたところ、報告されているものと同等であった。（測定値ｋｍ＝０．４８ｍＭ）さらに、同じ酵素濃度でＣＤＮＢを変化させたときに吸光度計で測定可能な範囲（水ブランクに対し１．５付近まで）に入るようにグルタチオン濃度を決定すると０．２５ｍＭが適当であった。
４−２．ＶＨＨによる酵素阻害性確認
ＣＤＮＢ １ｍＭ、グルタチオン１ｍＭ、酵素濃度１．４２μＭ、の酵素反応測定条件で測定するため、ＶＨＨをセントリコンＹＭ−１０（ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。その結果、３．８−５μＭでＶＨＨ（クローン：Ｎｏ２１，Ｎｏ２９，Ｎｏ７５）を共存させられるようになった。そこで４−１と同様に酵素反応速度を測定した。
ＭＩＬＬＩＱ水 ２２０μＬ
１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．５） ２５μＬ
１００ｍＭ ＣＤＮＢ ２．５μＬ
１００ｍＭ グルタチオン ２．５μＬ
１．０μｇ ＧＳＴ／２５μＬ ＰＢＳ、および各ＶＨＨ（０−５μＭ）の混合液を室温で１時間インキュベートした後に、上記組成に加えた。添加後、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、Ｎｏ．２１およびＮｏ．２９は、最も高いＶＨＨ濃度でも酵素阻害性は見られないと思われた。Ｎｏ．７５については、ＶＨＨ濃度依存的な酵素阻害活性があると考えられた。その阻害は１．５μＭ以上で顕著であった。Ｎｏ．７５の測定結果を図９に示した。
さらに、見かけ上のｋｍが変化しているかどうかを確認するため、ＣＤＮＢ １ｍＭで固定しグルタチオン濃度を２−０．０６２５ｍＭの間で変化させた。以下の条件で反応を実施した。
ＭＩＬＬＩＱ水 ２２０μＬ
１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．５） ２５μＬ
１００ｍＭ ＣＤＮＢ ２．５μＬ
２００ｍＭ−６．２５ｍＭ グルタチオン ２．５μＬ
１．０μｇＧＳＴ／２５μＬ ＰＢＳ及び各ＶＨＨ（２μＭ）の混合液を室温で１時間インキュベートした後に、上記組成に加えた。添加後、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一部をまとめたのが図１０である。Ｎｏ．２９については、最も高いＶＨＨ濃度でも、ＶＨＨを添加しない場合とほぼ同じ結果となった。一方Ｎｏ．７５は、ＶＨＨ濃度２μＭで大きく傾きが異なり、見かけ上のＶｍａｘが小さく、見かけ上のｋｍは変化していなかった。この結果は、Ｎｏ．７５のＶＨＨがグルタチオンに対して非拮抗的にＧＳＴを阻害したことを示している。
次に、グルタチオン０．２５ｍＭでＣＤＮＢを４−０．２５ｍＭ間で変化させた場合、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ｂｕｒｇのプロットで直線になることをまず確認した。以下の条件で測定を実施した。
１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ６．５） ２５μＬ
１００ｍＭ ＣＤＮＢ １０−１．２５μＬ
２５ｍＭ グルタチオン ２．５μＬ
ＭＩＬＬＩＱ水で ２５０μＬに反応液を調整した。
１．０μｇＧＳＴ／２５μＬ ＰＢＳ及び各ＶＨＨ（２μＭ）の混合液を室温で１時間インキュベートした後に、上記組成に加えた。添加後、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を測定した。
結果の一部を図１１にまとめた。この系にＮｏ．７５ ＶＨＨを用いた場合は、大きく傾きが異なり、みかけ上のＶｍａｘが小さく、みかけ上のｋｍは変化していなかった。これはＶＨＨがＣＤＮＢに対して非拮抗的にＧＳＴを阻害したことを示している。
以上のことからＮｏ．７５ ＶＨＨは２つの基質いずれに対しても非拮抗に作用する。したがって、ＧＳＴにおけるこれらの基質の結合領域とは違う部位をエピトープとして持ち、ＶＨＨの結合によって中間体である酵素基質複合体（ＥＳＣ）の立体構造が変化する結果、反応産物を作れなくなると考えられた。
〔実施例５〕
ＶＨＨ型抗体ライブラリーによる乳酸デヒドロゲナーゼＶＨＨスクリーニング
５−１．ＬＤＨスクリーニング
乳酸脱水素酵素に対して結合親和性を有するＶＨＨをスクリーニングした。スクリーニングには、大腸菌で発現させたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ由来の乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＡＣＴＩＣ ＤＥＨＹＤＲＯＧＥＮＡＳＥ；ＬＤＨ、ＳＩＧＭＡ製、２５０ｕｎｉｔｓ）を抗原として用いた。
市販のＬＤＨには、活性単位が１２３ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｓｏｌｉｄ、５８６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎと記載されていた。この市販品の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。その結果、純度８０％程度と考えられた。（３５ＫＤのモノマーが２つ会合したダイマーと、４つ会合したテトラマーを形成している）
スクリーニングの操作は以下のとおりである。ＬＤＨ濃度は０．２ｍｇ／ｍｌにＰＢＳで調製し、ＭＩＣＲＯＳＯＲＰ ＬＯＯＳＥ（ＮＵＮＣ社ＩＭＭＵＮＯ ＭＯＤＵＬＥ）に２５μｌ／ｗｅｌｌ分注した。１回目のスクリーニング用に４Ｗｅｌｌ、２〜４回目のスクリーニングには１ｗｅｌｌを使った。４℃で１８時間インキュベートしてＬＤＨをウエル内壁に吸着させた。吸着後、液を捨て１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ １５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて３７℃で１時間反応させ、ブロッキングした。
ライブラリーを表５のＩｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ（ｃｆｕ）量（緩衝液は１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）を５０μｌずつ添加し、３７℃で２時間反応させた後、ＰＢＳで表５のｗａｓｈの回数洗浄した。続いて抗原に結合したファージを以下のように回収した。すなわち、０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）を５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１０分間反応させ乖離させた後、２Ｍ Ｔｒｉｓ ３μｌ／ｗｅｌｌを加えて中和し、この液を回収した。
５−２．回収したファージの増幅
回収した液は（ファージの大腸菌への感染）（ヘルパーファージの感染）（ファージの回収）の処理を行い、含まれているファージを精製・増幅した。
１）ファージの大腸菌への感染
大腸菌（ＤＨ１２Ｓ）を２×ＹＴ培地２ｍＬで培養し、波長６００ｎｍの吸光度が０．５になるよう増殖させ、５−２で乖離させたファージ液を加えて３７℃で１時間振とう培養した。
２）ヘルパーファージの感染
１）の培養液に、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地（３０ｇＴｒｉｐｔｏｎｅ（ＤＩＦＣＯ）、２０ｇのｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇＭＯＰＳ（ナカライテスク）を蒸留水で１Ｌにし、ｐＨ７．０に調整して１２１℃で２０分間蒸気滅菌したもの）６ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンをＦｉｎａｌ １／１０００倍量加えて３７℃で２時間１６０ｒｐｍ振とう培養した。その後、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を１０^１２ＣＦＵ（１．０ｍＬ）加え、ＳｕｐｅｒＢｒｏｔｈ培地を９２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬアンピシリンをＦｉｎａｌ １／１０００倍量加え、３７℃で２時間１６０ｒｐｍ振とう培養した。その後７０μｇ／ｍＬになるよう、カナマイシンを加え３７℃で一晩培養した。
ファージの回収、増幅したファージによる再スクリーニング、ファージのスクリーニングの評価法は抗ＧＳＴ ＶＨＨで述べた方法に従った。ただし、洗浄にはＰＢＳを用い、２、３回目のスクリーニングでは１５回、４回目のスクリーニングでは２０回洗浄した。
５−３．ＬＤＨスクリーニング結果
スクリーニング経過を表５に示した。表５から明らかなように、４^ｔｈで回収率（ｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ）が上昇し、ＬＤＨに対するＶＨＨが単離されたと考えられた。

抗ＧＳＴ ＶＨＨの場合と同様な方法でスクリーニング３回目から６０クローン、４回目から３６クローンモノクローン化した。次に、抗ＧＳＴ ＶＨＨの場合と同様な方法でＥＬＩＳＡを行った。
２００μｇ／ｍｌでＰＢＳに溶かしたＬＤＨをＭＡＸＩＳＯＲＰに感作した。この抗原感作プレートに、１次抗体として培養上清、２次抗体としてマウス抗ｃｐ３モノクローナル３Ｇ３Ａ８Ｈ１ １０倍希釈、そして３次抗体としてヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＯＤ １０００倍希釈を加えた。ネガティブコントロールは、抗原感作に代えてＰＢＳを添加した。
ＥＬＩＳＡの結果を図１２（スクリーニング３回目）、および図１３（スクリーニング４回目）に示す。４回目のスクリーニングでは２９クローンがＥＬＩＳＡ陽性であった。
次に抗ＧＳＴ ＶＨＨの場合と同様な方法で遺伝子の塩基配列を解析した結果、ＣＤＲ３の配列から判断して１１種類のＶＨＨが単離できた（ＶＨ型が２種類存在）。
５−４．抗ＬＤＨ ＶＨＨのＰｒｏｔｅｉｎＡ融合型への変換
実施例３（ＧＳＴ）で記述した方法に準じて、ＳａｌＩ切断ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎにより８クローンをｐｒｏｔｅｉｎＡ型に変換した。
ＶＨＨクローンを導入した形質転換体を８００ｍｌスケールで培養し、ＩｇＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製したところ、各クローンについて２００−８００μｇの精製ＶＨＨを得た。実験に用いた８つのクローンの塩基配列と、その塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を以下の配列番号に示した。

５−５．乳酸デヒドロゲナーゼＶＨＨの阻害活性
ピルビン酸から乳酸を生成する反応の阻害活性をクローンＮｏ．４０７、４１５、４２１、４２６、４２８、４３０、４３４、およびコントロールについて実施した。コントロールには先の実施例で得られた抗ＧＳＴ ＶＨＨ（クローンＮｏ．２９）を用いた。
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＶＨＨ濃度を見積もり、ＬＤＨ（１．４μＭ）に対してＶＨＨ８μＭで１時間インキュベートし残存酵素活性を測定した。活性検出条件は以下のとおりである。
６６ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．０
１ｍＭ ピルビン酸
１２０μＭ ＮＡＤＨ
２８０ｎＭ ＬＤＨ、１．６μＭ ＶＨＨ（ｆｉｎａｌ）、２６℃（室温）
ＬＤＨが触媒する反応：

酵素活性は、３４０ｎｍの吸光度を測定することによって検出した。測定結果を図１４に示す。その結果、クローンＮｏ．４１８、Ｎｏ．４２１、およびＮｏ．４２８についてはむしろ酵素反応を促進していた。Ｎｏ．４３０は阻害した。Ｎｏ．４０７、Ｎｏ．４１５、Ｎｏ．４２６、およびＮｏ．４３４は、コントロールとして用いた抗ＧＳＴ ＶＨＨ（クローンＮｏ．２９）添加と同じ反応速度であり、ＬＤＨの酵素活性に影響を及ぼさないと考えられた。
次に、基質混入の可能性や低分子の反応促進物質の存在も考え、ＶＨＨ溶液をＭｗ３０００の限外ろ過（ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ−３）でろ液のみでの結果も確認してみた。その結果、ろ液には促進効果、阻害効果認められなかった。したがって、図１４で確認された酵素活性の調節作用は、高分子であるタンパクすなわちＶＨＨによる活性調節によるものと考えられた。ここで用いた反応条件下では乳酸生成方向の反応速度を１０倍高めるＶＨＨ（Ｎｏ．４１８、およびＮｏ．４２１）、５倍高めるＶＨＨ（Ｎｏ．４２８）と、乳酸生成方向の反応速度を阻害するＶＨＨ（Ｎｏ．４３０）が得られた。
ピルビン酸濃度を変更して感度を上げ、使用酵素とＶＨＨの使用量を抑制した条件で酵素活性を検出するため、予備実験を行った。予備実験の結果、使用酵素濃度２２．４ｎＭで酵素活性を測定できることがわかった。そこでクローンＮｏ．４３０について、ＶＨＨ濃度依存性を確認してみた。（酵素５６ｎＭとＶＨＨをインキュベート）
酵素活性の測定条件を以下に示す。
６６ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー ｐＨ７．０
１０ｍＭ ピルビン酸
１２０μＭ ＮＡＤＨ
２２．４ｎＭ ＬＤＨ（ｆｉｎａｌ）、２６℃
測定結果を図１５に示した。５倍量（２７８ｎＭ）のＶＨＨから阻害効果が出始め、２０倍では残存活性２０％までに阻害した。
５−６．乳酸デヒドロゲナーゼＶＨＨのＢＩＡＣＯＲＥによる結合定数測定
ＧＳＴの場合同様の操作で、ＬＤＨをＣＭ−センサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｒａｄｅ、ＢＩＡＣＯＲＥ）にアミノカップリング法により固定化した。
ＥＤＣ／ＮＨＳ（アミンカップリングキット（ＢＩＡＣＯＲＥ）のＥＤＣ、ＮＨＳを当量混合）でＣＭ５上のリシル基の活性化後（コンタクトタイム８ｍｉｎ）に、ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡＣＯＲＥ）でチップを洗浄した。続いてＬＤＨ２０μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ，０．２μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌを１０ｍＭの酢酸（ｐＨ５．０）で希釈）をチップに加えた。チップをＨＢＳ−ＥＰ洗浄した後、続いて、１Ｍのエタノールアミン、ｐＨ８．５を加えて、残っている活性化カルボキシル基を不活性化した。不活性化した後、ＨＢＳ−ＥＰで洗浄して、共有的に結合していないすべてのＬＤＨを除去した。固定化された抗原の量は、５６５３ＲＵと算出された。飽和量のクローンＮｏ．４３０をセンサーに加えることによって結合を評価したところ、８００ＲＵ付近、クローンＮｏ．４２８では５００ＲＵ付近、クローンＮｏ．４２１では１４００ＲＵ付近であった。
すべての実験は、ＨＢＳ−ＥＰ中２５℃にて行い、再生条件は最適条件で実施した。洗浄は５０ｍＭのクエン酸（ｐＨ２．５）で１分間行った。
ＬＤＨの濃度を変化させて（５×１０^−８Ｍ−４．０×１０^−７Ｍ）結合を追跡した。曲線は（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）ｂｉｎｄｉｎｇあるいは１：１ｂｉｎｄｎｉｇ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎＶｅｒ．３）を用いると、良好にフィットした。ベースライン補正も考慮に入れた。Ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎＶｅｒ．３）により、ｋａ（１／Ｍｓ）、ｋｄ（１／Ｓ）、動力学的分析に基づいてＫＤを算出した値は、表６に示すとおりであった。
酵素阻害実験ではＮｏ．４３０は、ＩＣ５０がおよそ４００ｎＭ程度であり、これはＫＤが２５０ｎＭ程度の測定値と近い値である。結合により阻害が起こっている証拠であると考えられた。

〔実施例６〕
６．ＩｇＭの重鎖可変領域ライブラリーの作製
６−１．ＩｇＭの定常領域Ｃμ（ｃｏｎｓｔａｎｔ μ）のクローニング
ラクダ２２頭分のｍＲＮＡからランダムプライマーを用いて実施例１と同様にしてｃＤＮＡを作製した。
ヒト、マウス間で保存されていたＩｇＭの定常領域Ｃμ（ｃｏｎｓｔａｎｔ μ）Ｃ末端部分の配列を元に以下のプライマーを作製し、重鎖可変領域のＮ末端側のプライマーとラクダｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行い、ラクダＣμをクローニングした。

ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｆｉＩ、ＡｓｃＩによって切断し、ＳｆｉＩ、ＡｓｃＩ切断したベクターｐＦＣＡ−１０にクローニングし、前述の方法によって形質転換した。形質転換体から前述のようにＤＮＡを調製し、ＣμのＮ末端部分の塩基配列を決定した。ラクダＣμ Ｎ末端の塩基配列とアミノ酸配列は以下の通りであった。

６−２．ＩｇＭの重鎖可変領域作製
新規にクローニングしたラクダＣμ配列から、ＩｇＭ重鎖可変領域を選択的に取り出すことができるプライマーとして、次の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをデザインした。

前述したＩｇＧ ＶＨＨライブラリー作製の項と同様な手法で、取得したラクダ２２頭分のｍＲＮＡ ２０μｇを鋳型としてランダムプライマーによりｃＤＮＡを取得した。
得られたｃＤＮＡの１／４０量を鋳型として、Ｖ領域のＮ末端部分プライマー６種（配列番号：１〜６）それぞれと上記プライマーを対にして組み合わせ、６種類のプライマーセットでＰＣＲを行った。
ＰＣＲ条件は９５℃、３ｍｉｎの後、９４℃、１ｍｉｎ，７２℃ ２ｍｉｎ，７２℃ １ｍｉｎを１９サイクル行った。各プライマーの組み合わせから得られたＰＣＲ産物をすべて混合し、０．８％アガロースゲルで泳動し約０．５ｋｂｐのバンドをカッターナイフで切り出した。ＤＮＡの抽出はＱＩＡＥＸ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。ＤＡＰＩを用い、回収ＤＮＡ量を見積もったところ１７８μｇであった。
６−３．ベクターへのＩｇＭの重鎖可変領域のクローニング
実施例１で記述した方法に準じて、混合した回収ＰＣＲ断片を制限酵素Ｓｆｉ Ｉ切断し、Ｓｆｉ Ｉ切断したベクターｐＦＣＡ−１０にライゲーションし、フェノール処理とエタノール沈殿を行いＤＮＡ断片を回収した。さらに制限酵素Ａｓｃ Ｉによって切断を行い、フェノール処理とエタノール沈殿を行いＤＮＡ断片を回収してライゲーションを行った。ＤＡＰＩ染色により、回収ＤＮＡ量を測定すると６６μｇであった。
６−４．形質転換
実施例１で記述した方法に準じて上記で得られたＤＮＡをｔｏｔａｌ ７．５ｍｌのＤＨ１２Ｓに対して形質転換した。（０．１７μｇＤＮＡを２０μｌのＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓにエレクトロポレーション法によって形質転換する作業を繰り返した）その一部をサンプリングし全体の形質転換菌の数を見積もったところ、６．６ｘ１０^１０であった。
６−５．ＩｇＭの重鎖可変領域ライブラリーファージ作製
形質転換した大腸菌の一部を終夜培養したところ、２．５ｘ１０^１１ ＤＨ１２Ｓ／８７．５ｍｌになっていた。これに滅菌２ｘＴＹ培地２Ｌ、グルコース最終濃度１％、アンピシリン最終濃度１００μｇ／ｍｌ加え、３７℃でＯ．Ｄ．６００ｎｍ ０．８となるまで培養した。これを８０００ｒｐｍｘ１０ｍｉｎ，４℃遠心し、沈殿の菌体を滅菌２ｘＴＹ培地２Ｌ、アンピシリン最終濃度１００μｇ／ｍｌで溶解、ヘルパーファージＫＯ７ ２０ｍＬを加えて３７℃１時間培養した。
これに滅菌２ｘＴＹ培地４Ｌ、アンピシリン最終濃度１００μｇ／ｍｌ、カナマイシン最終濃度５０μｇ／ｍｌ加えて終夜培養した。実施例１で記述した方法に準じて終夜培養液からファージを回収し２．４ｘ１０^１４ｃｆｕ／ｍｌのファージライブラリー溶液５０ｍＬが得られた。
実施例７
７．ＩｇＭの重鎖可変領域ライブラリーによるβ−ｇａｌに対する抗体のスクリーニング
７−１．β−ｇａｌに対する抗体のスクリーニング条件
スクリーニング方法は、ＷＯ ０１／６２９０７及び実施例３のＧＳＴのスクリーニングに準じた。ただし、β−ｇａｌ濃度は０．１ｍｇ／ｍｌにＰＢＳで調製し、試験管（Ｎｕｎｃ社Ｍａｘｉｓｏｒｐ）２本（１回目）または１本（２，３回目）に３．８ｍｌずつ４℃で１８時間インキュベートしてβ−ｇａｌを試験管内壁に吸着させた。吸着後、液を捨て２％スキムミルク含有ＰＢＳ ３．８ｍｌずつを加えて２５℃で１時間反応させ、ブロッキングした。
ＩｇＭの重鎖可変領域ライブラリーライブラリーを下表のＩｎｐｕｔ ｐｈａｇｅ（ｃｆｕ）量、２％スキムミルク含有ＰＢＳを３．８ｍｌずつ試験管に添加しスクリーニングした。（表７）
７−２．β−ｇａｌに対する抗体のスクリーニング結果
３ｒｄで回収率（ｏｕｔｐｕｔ／ｉｎｐｕｔ）が上昇し、β−ｇａｌに対する抗体が濃縮されていると考えられた。

７−３．抗β−ｇａｌ抗体モノクローンＥＬＩＳＡ
実施例３のＧＳＴ抗体の場合と同様な方法で３回目のスクリーニングの結果得られたファージクローンからモノクローン化を実施した。実施例３のＧＳＴ抗体の場合と同様な方法でＥＬＩＳＡを行ったところ、４８クローン中、４３クローンがＥＬＩＳＡ陽性であった。（図１８）
産業上の利用の可能性
本発明によって、生体におけるＶＨＨ領域の多様性を維持した、ＶＨＨライブラリーが提供された。しかも本発明のライブラリーを構成するＶＨＨは、正常な塩基配列を多く含み、発現率が高い。つまり本発明のＶＨＨライブラリーは、活性なＶＨＨによって構成されていると言うことができる。したがって、本発明のＶＨＨライブラリーを用いることによって、任意の抗原に対する結合親和性を有するＶＨＨを自由に得ることができる。
一般に免疫感作しないラクダ科動物からは、強い免疫原性を有する抗原に対する結合親和性を有するＶＨＨしか得られないと考えられていた。しかし本発明者らは、ライブラリーのレパートリーサイズを大きくすることによって、幅広い機能を有するＶＨＨを自由に得ることができるＶＨＨライブラリーを実現した。免疫感作を必要とせず、しかも公知のライブラリーよりもはるかに多様性に富むライブラリーを実現した点で、本発明はＶＨＨの産業的な利用に大きく貢献する。
一方、公知のライブラリーの作製方法は、１個体におけるｉｎ ｖｉｖｏのＶＨＨレパートリーサイズが制限、あるいは偏ることがまったく考慮されていなかった。その結果、公知の方法によって構築されたＶＨＨライブラリーの多様性は、生体におけるＶＨＨ領域の多様性を反映していなかった。このことは、表１に分類した多くのＶＨＨのクラスが、本発明のライブラリーから見出された新規な構造的特徴を有していることからも明らかである。人為的に変異を導入してライブラリーの多様性を増す方法は公知である。しかし人為的に変異を導入する方法は、活性な抗体の生成に伴って、遥かに多くの不活性な抗体を多く生み出す非効率性を伴っていた。結局公知の方法に基づくＶＨＨライブラリーは、活性なＶＨＨからなり、かつ多様性に富んでいなければならないという、ＶＨＨライブラリーに求められる特性を満たしていなかった。
ＶＨＨは、一般に用いられているＩｇＧを構成するＶＨに比べて、溶解性や安定性などの点において、優れた特性を有している。更にＶＨＨには、ＶＨで構成されたＩｇＧでは得ることが難しい結合活性を期待することができる。しかし本発明者らの知見によれば、ＶＨＨの１個体におけるｉｎ ｖｉｖｏのレパートリーサイズは制限されている。したがって、公知のライブラリーの作製手法に基づいてライブラリーを作製している限り、ＶＨＨのライブラリーのレパートリーサイズは、１個体におけるｉｎ ｖｉｖｏのレパートリーサイズを越えられない。つまり、ＶＨＨには様々な有用性が期待されつつも、公知のＶＨＨライブラリーを利用した場合には、希望する機能を有するＶＨＨを得られる可能性は極めて低いといわざるを得なかった。
本発明は、１個体におけるｉｎ ｖｉｖｏのレパートリーサイズを超える多様性を持つＶＨＨライブラリーの提供を通じて、産業上有用なＶＨＨを自由に取得することを可能とした。言いかえれば、本発明のライブラリーによって、はじめて希望する機能を有するＶＨＨの取得が可能となった。
このことは、実施例において、酵素活性を調節する機能を有するＶＨＨが容易に選択されていることからも明らかである。しかも実施例においては、複数の酵素に対して多様な影響を与える複数のＶＨＨが選択されている。このような多様な機能を有するＶＨＨを容易に選択できるのは、ＶＨＨがＶＨとは異なる活性を有していることに加えて、本発明のライブラリーが高度な多様性を有しているからに他ならない。
更に本発明によって提供された、ＩｇＭ由来のＶＨからなるライブラリーは、上記のような多様性を有するＶＨＨライブラリーを更に補完するライブラリーとして有用である。したがって、本発明のＩｇＭ由来のＶＨライブラリーを利用することによって、ＶＨＨからでは選択することができない、あるいはポピュレーションが少ないために選択が困難な機能を有する抗体可変領域を選択することができる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、ラクダ抗体ライブラリー用ベクター（ｐＦＣＡ−１０）、およびその構築に利用した公知のベクター（ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄベクターとｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄベクター）の構造を示す図である。
図２は、ラクダＶＨＨ組み込み用発現ベクターｐＦＣＡ−１０の塩基配列、および蛋白質コード領域によってコードされるアミノ酸配列を示す図である。
図３は、ＰＣＲの各反応サイクルにおける増幅産物の量をモニターした結果を示す図である。鋳型としてはコントロールＤＮＡ原液、その１０倍希釈、あるいは１００倍希釈を用いた。縦軸は、ＤＮＡの量（μｇ／ｍＬ）を対数で表し、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。
図４は、ラクダ抗体ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲの、各反応サイクルにおける増幅産物を電気泳動した結果を示す写真である。写真の下に５’側プライマーの名称を記載した。各プライマーについて左から順に、１５、１７、１９、および２１サイクル目の増幅産物を泳動した。上の写真は３’側プライマーとしてＩｇＧ２用の、そして下の写真はＩｇＧ３用のプライマーを用いたときの結果である。
図５は、ラクダＶＨＨ遺伝子（ＩｇＧ２）を組み込んだ発現ベクターを導入したＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）における、ＶＨＨ−ｃｐ３の発現を確認した結果を示す図である。図中、縦軸は吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）を、横軸はサンプル番号を示す。
図６は、ラクダＶＨＨ遺伝子（ＩｇＧ３）を組み込んだ発現ベクターを導入したＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ^ＴＭ ＤＨ１２Ｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）における、ＶＨＨ−ｃｐ３の発現を確認した結果を示す図である。図中、縦軸は吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）を、横軸はサンプル番号を示す。
図７は、ＶＨＨ（ＩｇＧ２）クローンのＧＳＴに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法によって確認した結果を示す図である。図中、縦軸は吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）を、横軸はサンプル番号を示す。
図８は、ＶＨＨ（ＩｇＧ３）クローンのＧＳＴに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法によって確認した結果を示す図である。図中、縦軸は吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）を、横軸はサンプル番号を示す。
図９は、抗ＧＳＴ ＶＨＨによるＧＳＴ活性阻害作用を測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＶＨＨを作用させないときの酵素活性を１００とするＧＳＴの残存活性（％）を、横軸はＶＨＨの添加濃度（μＭ）を示す。
図１０は、抗ＧＳＴ ＶＨＨの、グルタチオンに対する拮抗性の検討結果を示す図である。図中、縦軸は時間当たりの吸光度変化量の逆数、横軸はＣＤＮＢ濃度の逆数を示す。
図１１は、抗ＧＳＴ ＶＨＨの、ＣＤＮＢに対する拮抗性の検討結果を示す図である。図中、縦軸は時間当たりの吸光度変化量の逆数、横軸はグルタチオン濃度の逆数を示す。
図１２は、スクリーニング３サイクル目における、ＬＤＨに対するＶＨＨクローンの反応性をＥＬＩＳＡ法によって確認した結果を示す図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡの測定値ＯＤ４９２ｎｍを、横軸はサンプル番号を示す。
図１３は、スクリーニング４サイクル目における、ＬＤＨに対するＶＨＨクローンの反応性をＥＬＩＳＡ法によって確認した結果を示す図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡの測定値ＯＤ４９２ｎｍを、横軸はサンプル番号を示す。
図１４は、抗ＬＤＨ ＶＨＨがＬＤＨ活性に与える影響を測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＥＬＩＳＡの測定値ＯＤ４９２ｎｍを、横軸は酵素反応開始後の経過時間（分）を示す。
図１５は、抗ＬＤＨ ＶＨＨによるＬＤＨ活性阻害作用の、ＶＨＨ濃度依存性を測定した結果を示す図である。図中、縦軸はＶＨＨを作用させないときの酵素活性を１００とするＬＤＨの残存活性（％）を、横軸はＶＨＨの添加濃度（μＭ）を示す。
図１６は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ１９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図である（図１７に続く）。
図１７は、ｓｃＮｃｏｐＦＣＡＨ９−Ｅ８ＶＨｄＶＬｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図である（図１６の続き）。
図１８は、ＶＨＨ（ＩｇＭ）クローンのβ−Ｇａｌに対する反応性を、ＥＬＩＳＡ法によって確認した結果を示す図である。図中、縦軸は吸光度（ＯＤ４９２ｎｍ）を、横軸はサンプル番号を示す。
図１９は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図である（図２０に続く）。
図２０は、ｐｓｃＦｖＣＡ−Ｅ８ＶＨｄのインサート部の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を示す図である（図１９の続き）。

Claims (18)

1. ヒトコブラクダの生体における可変領域の多様性を維持した、ヒトコブラクダ由来VHH遺伝子のライブラリーであって、該ライブラリーが、以下の工程（１）および（２）によって製造されたライブラリー；
   （１）ヒトコブラクダの複数の個体から VHH 遺伝子を取得する工程であって、配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの 5' 側プライマーと、配列番号：１０または配列番号：１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された 3' 側プライマーからなるプライマーセットを用い、各プライマーセットによる PCR 増幅産物を混合する工程、および
   （２）工程（１）で取得した VHH 遺伝子を混合してライブラリーとする工程。
2. 複数の個体から採取された抗体産生細胞由来の mRNA を鋳型とし、かつ PCR において指数増幅期において回収された VHH 遺伝子を混合した、請求項１に記載のライブラリー。
3. ライブラリーを構成するクローンの任意の３３クローンを取り出して調べたときに、少なくとも８個以上のクラスが含まれ、かつライブラリーが１０ ^５ 以上の VHH 遺伝子を含む、請求項１〜請求項２のいずれかに記載のライブラリー。
4. ライブラリーを構成するクローンから無作為に十分量のクローンを取り出して調べたときに、少なくとも６つのVHHサブファミリーが含まれ、かつ１５個以上のクラスが含まれる、請求項３に記載のライブラリー。
5. ライブラリーを構成する１０ ^９ 以上のVHH遺伝子が生体に由来するVHH遺伝子である請求項１〜請求項４のいずれかに記載のライブラリー。
6. VHH 遺伝子が由来する germline の in vivo における存在比が維持されている請求項１〜請求項５のいずれかに記載のライブラリー。
7. IgG2、および／またはIgG3のイムノグロブリン遺伝子に由来するVHH遺伝子クローンで構成された、請求項１〜請求項６のいずれかに記載のライブラリー。
8. VHH遺伝子の構成比率が８０ %以上である請求項７に記載のライブラリー。
9. rgdpライブラリーである請求項１〜請求項８のいずれかに記載のライブラリー。
10. 以下の工程を含む、目的とする物質に対する親和性を有するVHHをコードする遺伝子の取得方法；
    （１）請求項９に記載のライブラリーを、目的とする物質に接触させる工程、および
    （２）目的とする物質に結合するVHHを有するクローンを選択する工程。
11. 目的とする物質が酵素分子である請求項１０に記載の方法。
12. 次の工程を含む、酵素活性を調節する作用を有するVHHを取得する方法；
    （１）請求項１１に記載の方法によって、酵素に結合するVHHを取得する工程、
    （２）工程（１）で取得されたVHHを当該酵素と接触させる工程、および
    （３）VHHを接触させない場合と比較して、当該酵素の酵素活性を変化させる作用を有するVHHを選択する工程。
13. 次の工程を含む、ヒトコブラクダ由来 VHH を可変領域として有するイムノグロブリンの製造方法；
    （１）請求項１０に記載の方法によって目的とする物質に対する結合活性を有するVHHをコードする遺伝子を取得する工程、
    （２）得られたVHHをコードする遺伝子を、宿主細胞において発現可能なベクターに組み込んでVHH発現ベクターとする工程、および
    （３）VHH発現ベクターを宿主細胞に導入し、その培養物からVHHを含む蛋白質を回収する工程。
14. 次の工程を含む、VHHライブラリーの作製方法；
    （１）ヒトコブラクダの複数の個体から VHH 遺伝子を取得する工程であって、配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択されたいずれかの 5' 側プライマーと、配列番号：１０または配列番号：１１に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された 3' 側プライマーからなるプライマーセットを用い、各プライマーセットによる PCR 増幅産物を混合する工程、および
    （２）工程（１）で取得したVHH遺伝子を混合してライブラリーとする工程。
15. 増幅産物が指数増殖を示しているときにPCR法の増幅産物を回収する工程を含む請求項１４に記載の方法。
16. 制限酵素SfiIおよびAscIで消化した増幅産物を次の性状(i)および(ii)を有するベクターにライゲーションする工程を付加的に含む請求項１４または１５に記載の方法；
    (i)SfiIサイトおよびAscIサイトを有する、および
    (ii)適当な宿主に形質転換することによって上記サイトに挿入された外来性遺伝子がコードする蛋白質をファージを構成する蛋白質との融合蛋白質として発現する。
17. 請求項１４〜請求項１６のいずれかに記載の方法によって作製することができるVHH遺伝子ライブラリー。
18. 配列番号：１〜配列番号：６に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された5'側プライマーと、配列番号：１０または配列番号：１１、に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択された3'側プライマーからなるラクダのVHH遺伝子増幅用のプライマーセット。

Images