JP4295841B2 - 抗アレルギー外用剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、アトピー性皮膚炎のようなアレルギー性皮膚炎に対して抗アレルギー効果を発揮する抗アレルギー外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息、枯草熱、遅延型接触皮膚炎等のアレルギー性疾患の罹患者が著しく増加する傾向にあり、深刻な社会問題となっている。これらの原因としては、栄養状態、環境汚染やストレス等といった複合的な要因が挙げられる。現在、これらのアレルギー性疾患に対する治療薬としては、種々の抗アレルギー剤が使用されており、特にアトピー性皮膚炎のようなアレルギー性疾患では、皮膚の炎症に伴って水疱やかゆみの症状が続くことから、外用剤として抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、ステロイド剤等が用いられている。
【０００３】
また、天然物中にも種々の抗アレルギー性物質の存在が知られており、蜜蜂の巣の構成成分であるプロポリス、或いはスギ（葉）、ヒキオコシ、ボタン、エゴマ、アルニカ、ハイビスカス（花）、ススキ（花穂）、ウコン、ハハキギ（果実）、シソ、シジュウム、延命草、シラカバ、落花生、クレソン又はホウセンカの植物エキス、種々のハーブや漢方薬等が挙げられ、外用剤としての利用も行われている。
【０００４】
天然のプロポリスは、様々な生理活性物質等を含有しているため、目的に応じて抽出、分画して利用されている。プロポリスからの抽出物としては、アルコール等の親水性有機溶媒に可溶な成分及び水に可溶な成分が主として利用されており、いずれも抗アレルギー作用の存在が知られている。
【０００５】
一方、ホウセンカの抗アレルギー作用については、アレルギー動物モデルを用いた抗アナフィラキシー作用（K.Ishiguro,et.al., Phytother.Res.,6,112-113,1992）や、肥満細胞からの脱顆粒抑制や抗ヒスタミン作用（H.Fukumoto,et.al., Phytother.Res.,10,202-206,1996 ）等の存在が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の抗ヒスタミン剤又は抗炎症剤を有効成分とする外用剤では、アレルギー症状を一時的に抑制はするが、外用剤の投与を止めると再び症状が悪化し、恒久的な体質改善にはつながらない可能性が高い。また、ステロイド剤を有効成分とする外用剤では、副作用によって別の深刻な問題が引き起こされる可能性があり、特に長期間の連続投与が困難となりやすい。
【０００７】
一方、前記従来のプロポリス又はホウセンカエキスを単独で含有する外用剤では、高い抗アレルギー効果が得られ難かったり、或いは充分な効果が得られない場合があった。
【０００８】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、取り扱い性がよく、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与が可能であるとともに、高い抗アレルギー効果を発揮することができる抗アレルギー外用剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の抗アレルギー外用剤は、プロポリス及びホウセンカのエキスを含有するものである。
【００１０】
請求項２に記載の抗アレルギー外用剤は、請求項１に記載の発明において、前記ホウセンカのエキスは、ホウセンカの花弁から抽出されるエキスであるものである。
請求項３に記載の抗アレルギー外用剤は、基剤、プロポリス及びホウセンカのエキスよりなり、前記プロポリス及びホウセンカのエキスの含有量が各々０．０１〜４０重量％であり、かつホウセンカのエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量であるものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
外用剤は、プロポリス及びホウセンカのエキスを有効成分として含有し、抗アレルギー作用を有するものである。
【００１２】
プロポリスは、蜜蜂が種々の植物から集めてきた樹脂状物質及び蜜蜂自身の腺分泌物から構成される天然物質であり、樹脂、ミツロウ、精油、花粉、フラボノイド等が含有されている。このプロポリスは、蜜蜂の巣の骨格及び間仕切り部分を形成し、微生物、ウィルス、昆虫等の外敵が巣へ侵入するのを防ぐ役割を持つと考えられている。古来より、プロポリスは、民間療法薬として使用されているが、近年になってその薬理作用には抗菌作用、抗ウィルス作用、抗酸化作用、抗炎症作用、抗潰瘍作用、局所麻酔作用、免疫調節作用、制癌作用、抗アレルギー作用等の存在が明らかにされている。
【００１３】
原料となるプロポリス原塊は、ブラジル、中国、日本、米国、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国等の様々な産地で採取されるものが使用される。天然のプロポリス原塊は、様々な生理活性物質及び夾雑物が含有されているが、そのまま利用しても、公知の方法によって目的とする成分を選択的に抽出した抽出物を利用してもよい。なお、以下の記載において、プロポリスとは、プロポリス原塊及びその抽出物を表すものとする。
【００１４】
プロポリス原塊からの抽出物としては、エタノール等の親水性有機溶媒に可溶な成分（以下、プロポリスのアルコール抽出物と記載する）及び水に可溶な成分（以下、プロポリスの水抽出物と記載する）が主として利用されており、いずれも抗アレルギー作用の存在が知られている。プロポリスのアルコール抽出物は、抗アレルギー作用と同時に、イソプレニルカフェ酸やフェニルエチルカフェ酸等のアレルギー作用を有する物質が含有されているが、プロポリスの水抽出物にはこれらの成分の存在は知られておらず、アレルギー発症の報告もほとんどない。従って、外用剤の有効成分としてプロポリスの水抽出物を使用するのが好ましい。このようにして得られるプロポリスの形態は、目的に応じて適宜選択され、液状、ペースト状又は粉末状とすることができる。
【００１５】
ツリフネソウ科の植物としては、ホウセンカ（ Impatiens balsamina LINN.）、ツリフネソウ（ Impatiens textori MIQ. ）、キツリフネ（Impatiens noli-tangere LINN.）、ハガクレツリフネ（Impatiens hypophylla Makino ）を始めとして世界中に２属約４５０種が知られている。これらの植物のうち、我が国において栽培及び入手が容易であるうえ、抗アレルギー性物質の存在が確認されていることから、ホウセンカのエキスを外用剤の有効成分とするのが好ましい。また、原料となるホウセンカは、主として日本列島、朝鮮半島及び満州地方に分布しているが、いずれの産地で採取されたものでも使用することができる。
【００１６】
ホウセンカのエキスは、ホウセンカの紅色花弁、白色花弁又はそれらが混合されたものから好適に抽出される。これらのホウセンカの花弁からエキスを抽出する方法としては、例えば水、アルカリ水又はエタノール等の親水性有機溶媒を使用する抽出方法が用いられる。このようにして得られるホウセンカエキスの形態は、プロポリスの場合と同様に、液状、ペースト状又は粉末状とすることができる。
【００１７】
外用剤は、有効成分として前記のプロポリス及び好ましくはホウセンカのエキスを同時に含有し、抗アレルギー作用を有するものである。この外用剤の形態は、目的に応じて適宜選択され、液状、ゼリー状、乳状、エアゾール状、軟膏状又は粉末状とすることができ、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等として利用される。
【００１８】
粉末状以外の形態の外用剤に含有されるプロポリス及びホウセンカエキスを合計した総含有量は、０．０２〜５０重量％の範囲が好ましく、０．０４〜４０重量％の範囲がさらに好ましい。この総含有量が０．０２重量％未満の場合、抗アレルギー効果を充分に発揮させることができない。逆に５０重量％を越える場合、充分な効果は得られるが、プロポリス及びホウセンカエキスを必要以上に加えることとなり、経済的でない。
【００１９】
さらに、外用剤に含有されるプロポリス又はホウセンカエキス各々の含有量は、０．０１〜４０重量％の範囲が好ましく、０．０２〜２０重量％の範囲がさらに好ましい。各々の有効成分の含有量が０．０１重量％未満の場合、抗アレルギー効果を充分に発揮させることができない。逆に４０重量％を越える場合、充分な効果は得られるが、プロポリス又はホウセンカエキスを必要以上に加えることとなり、経済的でない。一方、浴用剤のような粉末状の外用剤の場合は、これらの総含有量及び含有量を上記の範囲より増加させることが可能である。
【００２０】
この外用剤におけるプロポリス及びホウセンカエキスの配合割合としては、ホウセンカエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量であるのが好ましく、０．１〜１０倍量であるのがさらに好ましい。この配合割合において、両成分の配合量の比が０．０１倍未満又は１００倍を越える場合には、外用剤に両成分を含有させることによる相乗的な効果の増大が引き起こされないことから、高い抗アレルギー効果を発揮させることができない。
【００２１】
また、この外用剤は、前記の有効成分に加えて、油性又は水性の基剤、乳化剤、ゲル化剤、エモリエント剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤等の公知の添加剤を適宜添加することも可能である。さらに、必要に応じて、ビタミン類やアミノ酸類、或いは抗炎症剤、皮膚機能亢進剤、角質溶解剤等の薬剤を添加することもできる。
【００２２】
以上のように構成される外用剤は、例えばクリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等の形状で、皮膚を介して人体に投与される。この外用剤の経皮投与は、通常１日１〜３回程度、皮膚の患部に塗布したり、入浴時に浴槽の湯に溶解して使用する。そして、この外用剤は、アトピー性皮膚炎のようなアレルギー性皮膚炎に対して抗アレルギー効果を発揮するとともに、虫刺されによるかゆみの沈静化にも効果を発揮する。
【００２３】
次に、上記実施形態の外用剤によって発揮される効果について説明する。
・ 実施形態の外用剤によれば、有効成分としてプロポリス及びホウセンカエキスを同時に含有することによって、それぞれの成分が有している抗アレルギー作用を相乗的に増大させて、高い抗アレルギー効果を発揮させることができる。さらに、取り扱い性がよいうえ、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与を可能にすることができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、世界中の様々な産地で採取されるプロポリス原塊及びホウセンカを使用できることから、原料の入手が容易であるうえ、安価に製造することができる。また、我が国で容易に栽培又は入手することができる。・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス原塊をそのまま利用することもできるうえ、様々な公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、様々な種類の外用剤を容易に製造することができる。さらに、プロポリスの水抽出物を使用することによって、アレルギー作用のほとんどない高性能な外用剤を製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、ホウセンカのエキスを様々な公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、様々な種類の外用剤を容易に製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、外用剤を液状、ゼリー状、乳状、エアゾール状、軟膏状又は粉末状とすることができることから、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等の多様な形態での投与を行うことができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス及びホウセンカエキスの総含有量を０．０２〜５０重量％とすることによって、必要かつ充分な抗アレルギー効果を発揮させることができるうえ、経済的である。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス又はホウセンカエキス各々の含有量を０．０１〜４０重量％とすることによって、必要かつ充分な抗アレルギー効果を発揮させることができるうえ、経済的である。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス及びホウセンカエキスの配合割合として、ホウセンカエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量とすることによって、両成分による抗アレルギー効果の相乗的増大効果を確実に引き起こすことができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、有効成分に加えて、油性又は水性の基剤、乳化剤、ゲル化剤、エモリエント剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤等の添加剤を添加することによって、様々な形態の外用剤を製造できるとともに、より高性能な外用剤とすることができる。さらに、必要に応じて、ビタミン類やアミノ酸類、或いは抗炎症剤、皮膚機能亢進剤、角質溶解剤等の薬剤を添加することによって、さらに高性能な外用剤を製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、１日１〜３回程度、皮膚の患部に塗布したり、入浴時に湯舟に溶解して使用することによって、患者に対する肉体的、精神的負担が軽微であるとともに、長期間にわたる連続投与を容易に行うことができる。
【００２４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例について説明する。
（比較例１）
ブラジル産プロポリス原塊１０ｋｇを粉砕機で粉砕し、蒸留水５０リットルを加えて４５℃で５時間撹拌機で撹拌して、プロポリスの水抽出物が充分に溶解された懸濁液を得た。この懸濁液を遠心分離機を用いて遠心分離し、不溶解物を沈澱させて上清を分離した。この分離された上清に珪藻土を１ｋｇ添加して珪藻土濾過を行った。この濾液を凍結乾燥したところ、４０４ｇのプロポリス水抽出物乾燥粉末が得られた。
（比較例２）
プロポリス原塊の代わりにホウセンカの乾燥花弁（白色）１ｋｇを使用して、比較例１と同様に乾燥粉末を作製したところ、２８０ｇのホウセンカ水抽出物乾燥粉末が得られた。
（実施例１）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末と比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末とを１対１の重量比で混合したものを実施例１の乾燥粉末とした。
（ヒアルロニダーゼ活性阻害試験）
比較例１、比較例２及び実施例１で得られた乾燥粉末が有する抗アレルギー効果を示す指標として、ヒアルロニダーゼ活性阻害効果を以下に記載する試験方法に従って測定した。
【００２５】
試料として比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を水に溶解した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）中に添加し、濃度の異なる４種類の水溶液を作製した。これら４種類の水溶液に、ヒアルロニダーゼ（シグマ社製の牛睾丸由来、タイプＩＶ−Ｓ）を３９０単位添加して反応液とした。なお、比較例１及び比較例２の反応液中の乾燥粉末の終濃度は、表１に示すように０．０３、０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｍｌであり、実施例１の場合は、表１の括弧内に示すように０．０６、０．２、０．６、２．０ｍｇ／ｍｌである。また、これらの乾燥粉末を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照とした。
【００２６】
これらの抽出物によるヒアルロニダーゼ活性阻害を充分に行うために、上記５種類の反応液を３７℃で２０分間プレインキュベートした。その後、ヒアルロニダーゼの活性化物質である化合物４８／８０（シグマ社製のＮ−メチル−ｐ−メトキシフェネチルアミンのホルムアルデヒド縮合物）の濃縮液を、終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、さらに３７℃で２０分間プレインキュベートして、ヒアルロニダーゼを活性化した。このプレインキュベートされた溶液に、基質であるヒト臍帯由来ヒアルロン酸カリウム（和光純薬製）の濃縮液を、終濃度が０．６ｍｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で４０分間インキュベートして酵素反応を行った。
【００２７】
その後、基質が分解されることによって遊離したＮ−アセチルグルコサミンをモルガン・エルソンの改良法（Davidson,E.A., J.Biol.Chem.,242,437,1967）により発色させ、分光光度計ＵＶー１２００（島津製作所製）を用いて５８５ｎｍの吸光度を測定した。この測定結果から、比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を含有する反応液におけるヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００２８】
【数１】
さらに、これらの乾燥粉末の濃度とヒアルロニダーゼ活性阻害率との関係から、最小二乗法によってヒアルロニダーゼ活性を５０％阻害する場合の濃度（ＩＣ50）（ｍｇ／ｍｌ）を求めた。これらの結果を表１に示す。なお、阻害率の測定において、正確な数値が得られなかった試験の結果については記入しなかった。
【００２９】
【表１】
表１の結果より、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物は、それぞれ単独でヒアルロニダーゼ活性阻害効果を発揮したが、両者を同時に含有する場合のヒアルロニダーゼ活性阻害効果は、単独の場合より十数倍高かったことが示された。従って、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物を同時に含有させることによって、目的とするヒアルロニダーゼ活性阻害効果が相乗的に発揮されることが示された。
（ヒスタミン遊離抑制試験）
比較例１、比較例２及び実施例１で得られた乾燥粉末が有する抗アレルギー効果を示す指標として、ヒスタミン遊離抑制効果を以下に記載する試験方法に従って測定した。
【００３０】
ウイスター系雄性ラットを断頭致死させて、その腹腔内に５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．０ｍＭＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、５．０ｍＭ グルコース、１単位／ｍｌのヘパリンを含有する）を２０ｍｌ注入した。腹部を２分間マッサージした後、腹腔内液を採取して、３００×ｇの遠心力で５分間遠心分離（４℃）した。前記５ｍＭリン酸緩衝液で細胞を数回洗浄した後、約５×１０4 個／ｍｌの細胞濃度の肥満細胞浮遊液を調製した。
【００３１】
試料として比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を前記５ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度の異なる４種類の水溶液を作製した。２．５ｍｌの肥満細胞浮遊液（約１．３×１０5 個の肥満細胞が存在している）に前記の水溶液を０．５ｍｌ混合し、３７℃で５分間プレインキュベートした。これらの混合液に、ヒスタミン遊離促進物質である化合物４８／８０の水溶液（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ加えたものを反応液とした。
【００３２】
なお、比較例１及び比較例２の反応液中の乾燥粉末の終濃度は、表２に示すように０．０３、０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｍｌであり、実施例１の場合は、表２の括弧内に示すように０．０６、０．２、０．６、２．０ｍｇ／ｍｌである。また、乾燥粉末及び遊離促進物質を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照１とするとともに、乾燥粉末のみを添加しない反応液を作製して対照２とした。
【００３３】
これらの反応液を３７℃で１０分間インキュベートして肥満細胞のヒスタミン遊離反応を行った後、４℃に冷却して反応を停止させた。これらの反応液を２５００×ｇの遠心力で軽く遠心分離（４℃）して、肥満細胞を遠心管の底に沈渣させた。そして、遠心管内で分離された沈渣及び上清を別の容器に採取し、それらに含まれるヒスタミン量をショアらの方法（Shore,P.A.,et.al.,J.Exp.Ther.,127,182,1959）に従って測定した。これらの測定結果から、比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を含有する反応液におけるヒスタミン遊離率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００３４】
【数２】
さらに、ヒスタミン遊離率の計算結果を利用して、それぞれの反応液におけるヒスタミン遊離抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００３５】
【数３】
これらの乾燥粉末の濃度とヒスタミン遊離抑制率との関係から、最小二乗法によってヒスタミンの遊離を５０％阻害する場合の濃度（ＩＣ50）（ｍｇ／ｍｌ）を求めた。これらの結果を表２に示す。なお、ヒスタミン量の測定において、正確な数値が得られなかった試験の結果については記入しなかった。
【００３６】
【表２】
表２の結果より、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物は、それぞれ単独で肥満細胞のヒスタミン遊離を抑制したが、両者を同時に含有する場合のヒスタミン遊離抑制効果は、単独の場合より十数倍高いことが示された。従って、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物を同時に含有させることによって、目的とするヒスタミン遊離抑制効果が相乗的に発揮されることが示された。
（比較例３）
１０．０ｇの固体パラフィン、１０．０ｇのビースワックス、１０．０ｇのスクワラン及び適当量の香料を混合し、さらにワセリンを加えて全量を１００．０ｇとした。この混合物を７０℃前後の温度で加熱溶解させた後に撹拌冷却させることによって、基剤である軟膏剤を作製した。
（比較例４）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様にプロポリス水抽出物軟膏剤を作製した。
（比較例５）
比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様にホウセンカ水抽出物軟膏剤を作製した。
（実施例２）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ及び比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様に軟膏剤を作製した。
（ラット受身皮膚アナフィラキシー反応試験）
比較例３〜比較例５及び実施例２で作製された軟膏剤が有する抗アレルギー効果を示す指標として、以下に記載する受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応試験を行った。
【００３７】
図１に示すように、２４匹の７〜９週齢のウイスター系雄性ラット１の背部に正方形状（５ｃｍ×５ｃｍ）の剪毛部２を形成し、生理食塩水０．０５ｍｌを剪毛部２左寄りの注射部位３に、一定間隔をあけて２カ所皮内注射した。さらに、２５ｎｇ／ｍｌの抗２，４−ジニトロフェノールモノクローナル免疫グロブリンＥ抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体）の生理食塩水溶液０．０５ｍｌを、ラット１背部の剪毛部２右寄りの注射部位４に一定間隔をあけて２カ所皮内注射した。
【００３８】
比較例３〜５及び実施例２で作製した軟膏剤を１００ｍｇ塗布した直径１．５ｃｍの円形動物用パッチテスト絆創膏を、それぞれ１２枚ずつ作製した。そして、皮内注射されたラット１を無作為に６匹ずつ４つのグループに分類し、グループ毎に同じ種類の絆創膏を抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体の生理食塩水溶液を皮内注射された皮膚上に閉鎖貼布した。
【００３９】
２４時間経過後、２，４−ジニトロフェノールを共有結合させたオボアルブミン（ＤＮＰ−ＯＶＡ）の２０μｇ／ｍｌの生理食塩水溶液、及び５ｍｇ／ｍｌのエバンスブルー生理食塩水溶液を等量混合させた抗原溶液を、ラット１の尾５に存在する静脈に１．０ｍｌ注射してＰＣＡ反応を起こさせた。３０分経過後にラット１を放血致死させ、剪毛部２の皮膚に形成された青染部位を切除して組織片を得た。
【００４０】
この組織片を２規定（Ｎ）のＮａＯＨ水溶液１．０ｍｌに２４時間浸漬させて組織片を溶解した後、５ＭのＨ3 ＰＯ4 水溶液０．５ｍｌで中和し、アセトン３．０ｍｌを添加してエバンスブルー色素をアセトン層中に抽出させた。このアセトン溶液の６２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計ＵＶー１２００（島津製作所製）を用いて測定し、アセトン溶液中のエバンスブルー色素濃度を調べた。
【００４１】
あらかじめエバンスブルー・アセトン溶液の希釈系列の吸光度を測定することにより作製しておいた検量線と照らし合わせることによって、４グループそれぞれの色素漏出量の平均値及び標準偏差（μｇ）を求めた。さらに、比較例４、比較例５及び実施例２で作製された軟膏剤が有するＰＣＡ反応抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００４２】
【数４】
これらの結果を表３に示す。
【００４３】
【表３】
表３の結果より、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物から作製された軟膏剤は、それぞれ単独でＰＣＡ反応を抑制したが、両者を同時に含有する場合のＰＣＡ反応抑制効果は、相加的効果として予想される２倍より高かったことが示された。従って、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物を同時に含有させる軟膏剤によって、目的とするＰＣＡ反応抑制効果が相乗的に発揮されることが示された。なお、色素漏出量の測定結果をスチューデント法によるＴ検定を用いて統計処理を行ったところ、比較例４及び５ではｐ＜０．０５、実施例２ではｐ＜０．０１であったことより、いずれも有意にＰＣＡ反応を抑制したことが示された。
（比較例６）
１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの０．１重量％オリーブオイル溶液を作製して、比較例６のオイル溶液とした。
（モルモット皮膚感作性試験）
実施例１で得られた抽出物の経皮投与による皮膚刺激性（抗原性の有無）を検証するために、以下に記載するマクシミゼーション法に基づくモルモットの皮膚感作性試験を行った。
【００４４】
図２に示すように、体重３００〜３５０ｇの雄性モルモット６の肩甲骨上を長方形状（４ｃｍ×６ｃｍ）に剪毛した剪毛部７に、以下に記載する３種類の液体を２カ所ずつ皮内注射することによって、１８匹のモルモット６を免疫した。
【００４５】
第１の液体は、蒸留水のみからなる油中水（ｗ／ｏ）型完全フロイントアジュバントの懸濁液であり、図２の剪毛部７における注射部位８の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。第２の液体は、実施例１の乾燥粉末の２０重量％水溶液であり、剪毛部７における注射部位９の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。第３の液体は、前記第２の液体を懸濁させた油中水（ｗ／ｏ）型完全フロイントアジュバントの懸濁液であり、剪毛部７における注射部位１０の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。
【００４６】
１週間経過後、剪毛部７の皮膚の浸透性を向上させるために、１０重量％のラウリル硫酸ナトリウムを混合させたワセリンを剪毛部７に塗布した。１日経過後、第２の液体０．２ｍｌを２ｃｍ×４ｃｍの動物用パッチテスト絆創膏に塗布し、４８時間閉鎖貼布した。
【００４７】
約２週間経過したところで、モルモット６の右脇腹を剪毛して、正方形状（５ｃｍ×５ｃｍ）の右脇腹剪毛部１１を形成した。実施例１の乾燥粉末の２重量％、１０重量％及び２０重量％水溶液０．１ｍｌを、２ｃｍ×２ｃｍの動物用パッチテスト絆創膏に塗布して、それぞれ６匹ずつのモルモット６の右脇腹剪毛部１１に２４時間閉鎖貼布した。
【００４８】
絆創膏を取り除いてから２４時間後の右脇腹剪毛部１１における皮膚反応を、抗原性なし、軽度の抗原性有り、中程度の抗原性有り及び強度の抗原性有りの４段階に分類して判定した。なお、軽度の抗原性有りとは皮膚に現れた紅斑が軽度又は散在性である症状を表し、強度の抗原性有りとは強い紅斑に浮腫が見られる症状を表し、中程度の抗原性有りとは軽度及び強度の中間の症状を表す。
【００４９】
また、対照試験として、前記モルモット６の免疫に用いた第２の液体の代わりに、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの１．０重量％オリーブオイル溶液を使用して、上記の方法と同様に６匹のモルモット６を免疫した。さらに、前記モルモット６の右脇腹剪毛部１１に閉鎖貼布される実施例１の乾燥粉末水溶液の代わりに、比較例６のオイル溶液を使用して、上記の方法と同様にモルモット６の右脇腹剪毛部１１における皮膚反応を判定した。これらの結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
表４の結果より、対照試験である１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンは、モルモットに対して有意に抗原性を有していたが、プロポリス水抽出物及びホウセンカ水抽出物を含有する水溶液は、抗原性を有しないことが示された。
（アトピー性皮膚炎患者に対する臨床試験）
実施例２で作製された軟膏剤を使用して、アトピー性皮膚炎患者に対する臨床試験を行った。すなわち、アトピー性皮膚炎と診断された患者１０例を対象に、原則として他の外用剤を使用させず、患部に１日１〜３回、１ヶ月間塗布するように指示したうえで、実施例２の軟膏剤を経皮投与した。そして、１０例中で最終判定日まで観察できた９例を対象に、他覚所見として紅斑、乾燥、掻き傷及び湿潤の状態を診察するとともに、自覚症状として掻痒の改善効果について聞き取り調査を行った。これらの診察及び聞き取り調査の結果を総合的に評価することによって、臨床試験の結果を著効、有効、不変及び悪化の４段階で判定した。
【００５１】
その結果、９例中８例にアトピー性皮膚炎の改善効果が認められたことが示された。これらの症例の多くは、軟膏剤の投与開始１週間後位から徐々に症状が改善されてきていたことも聞き取り調査の結果から判明した。さらに、全ての症例で副作用が認められなかったうえ、使用感においても特に苦情は聞かれなかった。
（実施例３）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、ミツロウを１１．０ｇ、パラフィンワックスを６．０ｇ、流動パラフィンを２７．５ｇ、ラノリンを３．０ｇ、イソプロピルミリステートを６．０ｇ、スクワランを８．０ｇ、アラントインを０．５ｇ、ＰＯＥソルビタンモノステアレートを１．５ｇ、ソルビタンモノステアレートを４．０ｇ、プロピレングリコールを２．０ｇ及び防腐剤を適当量混合した混合物を、約７５℃の温度で加熱溶解した。ホウ砂１．０ｇ及び蒸留水２７．５ｇを混合して約７５℃に加熱し、前記混合物に撹拌しながら加えた後、約５５℃の温度まで冷却したところで適当量の香料を加えて撹拌した。さらに、そのまま約４５℃の温度まで撹拌を続けた後に放置してクリーム剤を得た。
（実施例４）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、ポリエチレングリコール４００を２．０ｇ、プロピレングリコールを３．０ｇ、トリエタノールアミンを１．０ｇ及び蒸留水を８３．０ｇ混合した水溶液を作製した。また、セタノールを１．５ｇ、ステアリン酸を１．０ｇ、パルミチン酸を０．５ｇ、ラノリン酸を１．０ｇ、スクワランを２．０ｇ、ミリスチン酸イソプロピルを１．０ｇ、モノステアリン酸グリセリルを１．５ｇ及びツゥイーン２０を０．５ｇ混合した溶液を作製した。上記２種類の溶液をそれぞれ約７０℃に加熱して充分に溶解した後、乳化機を使用して混合乳化した後に冷却して乳液を得た。
（実施例５）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、グリセリンを１０．０ｇ、ジプロピレングリコールを１０．０ｇ、１，３−ブチレングリコールを５．０ｇ、ポリエチレングリコール１５００を５．０ｇ及びＰＯＥ硬化ヒマシ油を２．０ｇ混合し、約６０℃の温度で充分に加熱溶解して溶液を得た。この溶液にセチルイソオクタネート１０．０ｇ、スクワラン５．０ｇ及びメチルパラベン１．０ｇを混合し、約６０℃の温度で充分に加熱溶解した後、ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズ処理した処理液を作製した。さらに、カルボキシビニルポリマー０．３ｇ及びヘキサメタリン酸ソーダ０．０８ｇを蒸留水１１．０ｇに溶解させた水溶液を前記処理液に添加してホモゲナイズ処理を行った。最後に、水酸化カリウム０．１２ｇを蒸留水３８．５ｇに溶解した水溶液を添加した後、ホモゲナイザーで乳化してローションを得た。
（実施例６）
実施例１で得られた乾燥粉末を７０．０ｇ、乳酸ナトリウムを２１．０ｇ、ピルビン酸ナトリウムを８．０ｇ、香料を１．０ｇ及び着色料を適当量混合して粉末状の浴用剤を得た。なお、この浴用剤は、入湯用の湯に１００〜１００００倍に希釈して使用するとよい。
（アレルギー体質の人に対する投与試験）
実施例３で得られたクリーム剤、実施例４で得られた乳液、実施例５で得られたローション及び実施例６で得られた浴用剤を使用して、皮膚のかゆみを訴えるアレルギー体質の人を対象に、経皮投与試験を行った。すなわち、それぞれ１例ずつを対象に、原則として他の外用剤を使用させず、患部に１日１〜３回、１週間塗布するように指示したうえで、実施例３〜実施例６の外用剤を経皮投与した。但し、実施例６の浴用剤は、入浴の際に１日１回投与した。
【００５２】
１週間後、自覚症状として掻痒の改善効果について聞き取り調査を行ったところ、全ての例で症状の改善が認められたうえ、使用感においても特に苦情は聞かれなかった。
【００５３】
なお、前記実施形態を以下のように構成することもできる。
・ 例えば浴用剤入りの湯舟で入浴した後、皮膚患部にクリーム剤を塗布する等、２種類以上の外用剤を併用して投与すること。
【００５４】
このように構成した場合、より効果的なアレルギー性疾患の治療を可能とすることができる。
次に、前記実施形態から把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記プロポリスは、プロポリス原塊に含有される水に可溶な物質を水で抽出した抽出物である請求項１から請求項３のいずれかに記載の抗アレルギー外用剤。
【００５５】
このように構成した場合、アレルギー作用をほとんど有しない高性能な外用剤を製造することができる。
【００５６】
・ プロポリス及びツリフネソウ科の植物のエキスを含有し、抗アレルギー作用を有する抗アレルギー外用剤を、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤又は浴用剤として、１日に少なくとも１〜３回、皮膚の患部に塗布するか、又は浴槽の湯に溶解して使用する抗アレルギー外用剤の使用方法。
【００５７】
このように構成した場合、様々な形態の外用剤を手軽に使用でき、患者に対する肉体的、精神的負担が軽微であるとともに、長期間にわたる連続投与を容易に行うことができる。
【００５８】
【発明の効果】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の抗アレルギー外用剤によれば、取り扱い性がよく、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与が可能であるとともに、高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
【００５９】
請求項２に記載の抗アレルギー外用剤によれば、請求項１に記載の発明の効果に加え、より確実に高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
請求項３に記載の抗アレルギー外用剤によれば、さらに高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ラットＰＣＡ反応試験におけるラットを示す平面図。
【図２】 モルモット皮膚感作性試験におけるモルモットを示す平面図。
【発明の属する技術分野】
この発明は、アトピー性皮膚炎のようなアレルギー性皮膚炎に対して抗アレルギー効果を発揮する抗アレルギー外用剤に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、アトピー性皮膚炎、花粉症、気管支喘息、枯草熱、遅延型接触皮膚炎等のアレルギー性疾患の罹患者が著しく増加する傾向にあり、深刻な社会問題となっている。これらの原因としては、栄養状態、環境汚染やストレス等といった複合的な要因が挙げられる。現在、これらのアレルギー性疾患に対する治療薬としては、種々の抗アレルギー剤が使用されており、特にアトピー性皮膚炎のようなアレルギー性疾患では、皮膚の炎症に伴って水疱やかゆみの症状が続くことから、外用剤として抗ヒスタミン剤、抗炎症剤、ステロイド剤等が用いられている。
【０００３】
また、天然物中にも種々の抗アレルギー性物質の存在が知られており、蜜蜂の巣の構成成分であるプロポリス、或いはスギ（葉）、ヒキオコシ、ボタン、エゴマ、アルニカ、ハイビスカス（花）、ススキ（花穂）、ウコン、ハハキギ（果実）、シソ、シジュウム、延命草、シラカバ、落花生、クレソン又はホウセンカの植物エキス、種々のハーブや漢方薬等が挙げられ、外用剤としての利用も行われている。
【０００４】
天然のプロポリスは、様々な生理活性物質等を含有しているため、目的に応じて抽出、分画して利用されている。プロポリスからの抽出物としては、アルコール等の親水性有機溶媒に可溶な成分及び水に可溶な成分が主として利用されており、いずれも抗アレルギー作用の存在が知られている。
【０００５】
一方、ホウセンカの抗アレルギー作用については、アレルギー動物モデルを用いた抗アナフィラキシー作用（K.Ishiguro,et.al., Phytother.Res.,6,112-113,1992）や、肥満細胞からの脱顆粒抑制や抗ヒスタミン作用（H.Fukumoto,et.al., Phytother.Res.,10,202-206,1996 ）等の存在が報告されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の抗ヒスタミン剤又は抗炎症剤を有効成分とする外用剤では、アレルギー症状を一時的に抑制はするが、外用剤の投与を止めると再び症状が悪化し、恒久的な体質改善にはつながらない可能性が高い。また、ステロイド剤を有効成分とする外用剤では、副作用によって別の深刻な問題が引き起こされる可能性があり、特に長期間の連続投与が困難となりやすい。
【０００７】
一方、前記従来のプロポリス又はホウセンカエキスを単独で含有する外用剤では、高い抗アレルギー効果が得られ難かったり、或いは充分な効果が得られない場合があった。
【０００８】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、取り扱い性がよく、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与が可能であるとともに、高い抗アレルギー効果を発揮することができる抗アレルギー外用剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の抗アレルギー外用剤は、プロポリス及びホウセンカのエキスを含有するものである。
【００１０】
請求項２に記載の抗アレルギー外用剤は、請求項１に記載の発明において、前記ホウセンカのエキスは、ホウセンカの花弁から抽出されるエキスであるものである。
請求項３に記載の抗アレルギー外用剤は、基剤、プロポリス及びホウセンカのエキスよりなり、前記プロポリス及びホウセンカのエキスの含有量が各々０．０１〜４０重量％であり、かつホウセンカのエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量であるものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
外用剤は、プロポリス及びホウセンカのエキスを有効成分として含有し、抗アレルギー作用を有するものである。
【００１２】
プロポリスは、蜜蜂が種々の植物から集めてきた樹脂状物質及び蜜蜂自身の腺分泌物から構成される天然物質であり、樹脂、ミツロウ、精油、花粉、フラボノイド等が含有されている。このプロポリスは、蜜蜂の巣の骨格及び間仕切り部分を形成し、微生物、ウィルス、昆虫等の外敵が巣へ侵入するのを防ぐ役割を持つと考えられている。古来より、プロポリスは、民間療法薬として使用されているが、近年になってその薬理作用には抗菌作用、抗ウィルス作用、抗酸化作用、抗炎症作用、抗潰瘍作用、局所麻酔作用、免疫調節作用、制癌作用、抗アレルギー作用等の存在が明らかにされている。
【００１３】
原料となるプロポリス原塊は、ブラジル、中国、日本、米国、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国等の様々な産地で採取されるものが使用される。天然のプロポリス原塊は、様々な生理活性物質及び夾雑物が含有されているが、そのまま利用しても、公知の方法によって目的とする成分を選択的に抽出した抽出物を利用してもよい。なお、以下の記載において、プロポリスとは、プロポリス原塊及びその抽出物を表すものとする。
【００１４】
プロポリス原塊からの抽出物としては、エタノール等の親水性有機溶媒に可溶な成分（以下、プロポリスのアルコール抽出物と記載する）及び水に可溶な成分（以下、プロポリスの水抽出物と記載する）が主として利用されており、いずれも抗アレルギー作用の存在が知られている。プロポリスのアルコール抽出物は、抗アレルギー作用と同時に、イソプレニルカフェ酸やフェニルエチルカフェ酸等のアレルギー作用を有する物質が含有されているが、プロポリスの水抽出物にはこれらの成分の存在は知られておらず、アレルギー発症の報告もほとんどない。従って、外用剤の有効成分としてプロポリスの水抽出物を使用するのが好ましい。このようにして得られるプロポリスの形態は、目的に応じて適宜選択され、液状、ペースト状又は粉末状とすることができる。
【００１５】
ツリフネソウ科の植物としては、ホウセンカ（ Impatiens balsamina LINN.）、ツリフネソウ（ Impatiens textori MIQ. ）、キツリフネ（Impatiens noli-tangere LINN.）、ハガクレツリフネ（Impatiens hypophylla Makino ）を始めとして世界中に２属約４５０種が知られている。これらの植物のうち、我が国において栽培及び入手が容易であるうえ、抗アレルギー性物質の存在が確認されていることから、ホウセンカのエキスを外用剤の有効成分とするのが好ましい。また、原料となるホウセンカは、主として日本列島、朝鮮半島及び満州地方に分布しているが、いずれの産地で採取されたものでも使用することができる。
【００１６】
ホウセンカのエキスは、ホウセンカの紅色花弁、白色花弁又はそれらが混合されたものから好適に抽出される。これらのホウセンカの花弁からエキスを抽出する方法としては、例えば水、アルカリ水又はエタノール等の親水性有機溶媒を使用する抽出方法が用いられる。このようにして得られるホウセンカエキスの形態は、プロポリスの場合と同様に、液状、ペースト状又は粉末状とすることができる。
【００１７】
外用剤は、有効成分として前記のプロポリス及び好ましくはホウセンカのエキスを同時に含有し、抗アレルギー作用を有するものである。この外用剤の形態は、目的に応じて適宜選択され、液状、ゼリー状、乳状、エアゾール状、軟膏状又は粉末状とすることができ、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等として利用される。
【００１８】
粉末状以外の形態の外用剤に含有されるプロポリス及びホウセンカエキスを合計した総含有量は、０．０２〜５０重量％の範囲が好ましく、０．０４〜４０重量％の範囲がさらに好ましい。この総含有量が０．０２重量％未満の場合、抗アレルギー効果を充分に発揮させることができない。逆に５０重量％を越える場合、充分な効果は得られるが、プロポリス及びホウセンカエキスを必要以上に加えることとなり、経済的でない。
【００１９】
さらに、外用剤に含有されるプロポリス又はホウセンカエキス各々の含有量は、０．０１〜４０重量％の範囲が好ましく、０．０２〜２０重量％の範囲がさらに好ましい。各々の有効成分の含有量が０．０１重量％未満の場合、抗アレルギー効果を充分に発揮させることができない。逆に４０重量％を越える場合、充分な効果は得られるが、プロポリス又はホウセンカエキスを必要以上に加えることとなり、経済的でない。一方、浴用剤のような粉末状の外用剤の場合は、これらの総含有量及び含有量を上記の範囲より増加させることが可能である。
【００２０】
この外用剤におけるプロポリス及びホウセンカエキスの配合割合としては、ホウセンカエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量であるのが好ましく、０．１〜１０倍量であるのがさらに好ましい。この配合割合において、両成分の配合量の比が０．０１倍未満又は１００倍を越える場合には、外用剤に両成分を含有させることによる相乗的な効果の増大が引き起こされないことから、高い抗アレルギー効果を発揮させることができない。
【００２１】
また、この外用剤は、前記の有効成分に加えて、油性又は水性の基剤、乳化剤、ゲル化剤、エモリエント剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤等の公知の添加剤を適宜添加することも可能である。さらに、必要に応じて、ビタミン類やアミノ酸類、或いは抗炎症剤、皮膚機能亢進剤、角質溶解剤等の薬剤を添加することもできる。
【００２２】
以上のように構成される外用剤は、例えばクリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等の形状で、皮膚を介して人体に投与される。この外用剤の経皮投与は、通常１日１〜３回程度、皮膚の患部に塗布したり、入浴時に浴槽の湯に溶解して使用する。そして、この外用剤は、アトピー性皮膚炎のようなアレルギー性皮膚炎に対して抗アレルギー効果を発揮するとともに、虫刺されによるかゆみの沈静化にも効果を発揮する。
【００２３】
次に、上記実施形態の外用剤によって発揮される効果について説明する。
・ 実施形態の外用剤によれば、有効成分としてプロポリス及びホウセンカエキスを同時に含有することによって、それぞれの成分が有している抗アレルギー作用を相乗的に増大させて、高い抗アレルギー効果を発揮させることができる。さらに、取り扱い性がよいうえ、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与を可能にすることができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、世界中の様々な産地で採取されるプロポリス原塊及びホウセンカを使用できることから、原料の入手が容易であるうえ、安価に製造することができる。また、我が国で容易に栽培又は入手することができる。・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス原塊をそのまま利用することもできるうえ、様々な公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、様々な種類の外用剤を容易に製造することができる。さらに、プロポリスの水抽出物を使用することによって、アレルギー作用のほとんどない高性能な外用剤を製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、ホウセンカのエキスを様々な公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、様々な種類の外用剤を容易に製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、外用剤を液状、ゼリー状、乳状、エアゾール状、軟膏状又は粉末状とすることができることから、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤、浴用剤等の多様な形態での投与を行うことができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス及びホウセンカエキスの総含有量を０．０２〜５０重量％とすることによって、必要かつ充分な抗アレルギー効果を発揮させることができるうえ、経済的である。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス又はホウセンカエキス各々の含有量を０．０１〜４０重量％とすることによって、必要かつ充分な抗アレルギー効果を発揮させることができるうえ、経済的である。
・ 実施形態の外用剤によれば、プロポリス及びホウセンカエキスの配合割合として、ホウセンカエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量とすることによって、両成分による抗アレルギー効果の相乗的増大効果を確実に引き起こすことができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、有効成分に加えて、油性又は水性の基剤、乳化剤、ゲル化剤、エモリエント剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤等の添加剤を添加することによって、様々な形態の外用剤を製造できるとともに、より高性能な外用剤とすることができる。さらに、必要に応じて、ビタミン類やアミノ酸類、或いは抗炎症剤、皮膚機能亢進剤、角質溶解剤等の薬剤を添加することによって、さらに高性能な外用剤を製造することができる。
・ 実施形態の外用剤によれば、１日１〜３回程度、皮膚の患部に塗布したり、入浴時に湯舟に溶解して使用することによって、患者に対する肉体的、精神的負担が軽微であるとともに、長期間にわたる連続投与を容易に行うことができる。
【００２４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例について説明する。
（比較例１）
ブラジル産プロポリス原塊１０ｋｇを粉砕機で粉砕し、蒸留水５０リットルを加えて４５℃で５時間撹拌機で撹拌して、プロポリスの水抽出物が充分に溶解された懸濁液を得た。この懸濁液を遠心分離機を用いて遠心分離し、不溶解物を沈澱させて上清を分離した。この分離された上清に珪藻土を１ｋｇ添加して珪藻土濾過を行った。この濾液を凍結乾燥したところ、４０４ｇのプロポリス水抽出物乾燥粉末が得られた。
（比較例２）
プロポリス原塊の代わりにホウセンカの乾燥花弁（白色）１ｋｇを使用して、比較例１と同様に乾燥粉末を作製したところ、２８０ｇのホウセンカ水抽出物乾燥粉末が得られた。
（実施例１）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末と比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末とを１対１の重量比で混合したものを実施例１の乾燥粉末とした。
（ヒアルロニダーゼ活性阻害試験）
比較例１、比較例２及び実施例１で得られた乾燥粉末が有する抗アレルギー効果を示す指標として、ヒアルロニダーゼ活性阻害効果を以下に記載する試験方法に従って測定した。
【００２５】
試料として比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を水に溶解した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）中に添加し、濃度の異なる４種類の水溶液を作製した。これら４種類の水溶液に、ヒアルロニダーゼ（シグマ社製の牛睾丸由来、タイプＩＶ−Ｓ）を３９０単位添加して反応液とした。なお、比較例１及び比較例２の反応液中の乾燥粉末の終濃度は、表１に示すように０．０３、０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｍｌであり、実施例１の場合は、表１の括弧内に示すように０．０６、０．２、０．６、２．０ｍｇ／ｍｌである。また、これらの乾燥粉末を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照とした。
【００２６】
これらの抽出物によるヒアルロニダーゼ活性阻害を充分に行うために、上記５種類の反応液を３７℃で２０分間プレインキュベートした。その後、ヒアルロニダーゼの活性化物質である化合物４８／８０（シグマ社製のＮ−メチル−ｐ−メトキシフェネチルアミンのホルムアルデヒド縮合物）の濃縮液を、終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、さらに３７℃で２０分間プレインキュベートして、ヒアルロニダーゼを活性化した。このプレインキュベートされた溶液に、基質であるヒト臍帯由来ヒアルロン酸カリウム（和光純薬製）の濃縮液を、終濃度が０．６ｍｇ／ｍｌとなるように加えて、３７℃で４０分間インキュベートして酵素反応を行った。
【００２７】
その後、基質が分解されることによって遊離したＮ−アセチルグルコサミンをモルガン・エルソンの改良法（Davidson,E.A., J.Biol.Chem.,242,437,1967）により発色させ、分光光度計ＵＶー１２００（島津製作所製）を用いて５８５ｎｍの吸光度を測定した。この測定結果から、比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を含有する反応液におけるヒアルロニダーゼ活性阻害率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００２８】
【数１】
【００２９】
【表１】
（ヒスタミン遊離抑制試験）
比較例１、比較例２及び実施例１で得られた乾燥粉末が有する抗アレルギー効果を示す指標として、ヒスタミン遊離抑制効果を以下に記載する試験方法に従って測定した。
【００３０】
ウイスター系雄性ラットを断頭致死させて、その腹腔内に５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＣａＣｌ2 、１．０ｍＭＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、５．０ｍＭ グルコース、１単位／ｍｌのヘパリンを含有する）を２０ｍｌ注入した。腹部を２分間マッサージした後、腹腔内液を採取して、３００×ｇの遠心力で５分間遠心分離（４℃）した。前記５ｍＭリン酸緩衝液で細胞を数回洗浄した後、約５×１０4 個／ｍｌの細胞濃度の肥満細胞浮遊液を調製した。
【００３１】
試料として比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を前記５ｍＭリン酸緩衝液に溶解し、濃度の異なる４種類の水溶液を作製した。２．５ｍｌの肥満細胞浮遊液（約１．３×１０5 個の肥満細胞が存在している）に前記の水溶液を０．５ｍｌ混合し、３７℃で５分間プレインキュベートした。これらの混合液に、ヒスタミン遊離促進物質である化合物４８／８０の水溶液（０．０１ｍｇ／ｍｌ）を０．５ｍｌ加えたものを反応液とした。
【００３２】
なお、比較例１及び比較例２の反応液中の乾燥粉末の終濃度は、表２に示すように０．０３、０．１、０．３、１．０ｍｇ／ｍｌであり、実施例１の場合は、表２の括弧内に示すように０．０６、０．２、０．６、２．０ｍｇ／ｍｌである。また、乾燥粉末及び遊離促進物質を添加しない反応液を、上記と同様に作製して対照１とするとともに、乾燥粉末のみを添加しない反応液を作製して対照２とした。
【００３３】
これらの反応液を３７℃で１０分間インキュベートして肥満細胞のヒスタミン遊離反応を行った後、４℃に冷却して反応を停止させた。これらの反応液を２５００×ｇの遠心力で軽く遠心分離（４℃）して、肥満細胞を遠心管の底に沈渣させた。そして、遠心管内で分離された沈渣及び上清を別の容器に採取し、それらに含まれるヒスタミン量をショアらの方法（Shore,P.A.,et.al.,J.Exp.Ther.,127,182,1959）に従って測定した。これらの測定結果から、比較例１、比較例２及び実施例１の乾燥粉末を含有する反応液におけるヒスタミン遊離率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００３４】
【数２】
【００３５】
【数３】
【００３６】
【表２】
（比較例３）
１０．０ｇの固体パラフィン、１０．０ｇのビースワックス、１０．０ｇのスクワラン及び適当量の香料を混合し、さらにワセリンを加えて全量を１００．０ｇとした。この混合物を７０℃前後の温度で加熱溶解させた後に撹拌冷却させることによって、基剤である軟膏剤を作製した。
（比較例４）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様にプロポリス水抽出物軟膏剤を作製した。
（比較例５）
比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様にホウセンカ水抽出物軟膏剤を作製した。
（実施例２）
比較例１で得られたプロポリス水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ及び比較例２で得られたホウセンカ水抽出物乾燥粉末を２．０ｇ加えて、比較例３と同様に軟膏剤を作製した。
（ラット受身皮膚アナフィラキシー反応試験）
比較例３〜比較例５及び実施例２で作製された軟膏剤が有する抗アレルギー効果を示す指標として、以下に記載する受身皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応試験を行った。
【００３７】
図１に示すように、２４匹の７〜９週齢のウイスター系雄性ラット１の背部に正方形状（５ｃｍ×５ｃｍ）の剪毛部２を形成し、生理食塩水０．０５ｍｌを剪毛部２左寄りの注射部位３に、一定間隔をあけて２カ所皮内注射した。さらに、２５ｎｇ／ｍｌの抗２，４−ジニトロフェノールモノクローナル免疫グロブリンＥ抗体（抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体）の生理食塩水溶液０．０５ｍｌを、ラット１背部の剪毛部２右寄りの注射部位４に一定間隔をあけて２カ所皮内注射した。
【００３８】
比較例３〜５及び実施例２で作製した軟膏剤を１００ｍｇ塗布した直径１．５ｃｍの円形動物用パッチテスト絆創膏を、それぞれ１２枚ずつ作製した。そして、皮内注射されたラット１を無作為に６匹ずつ４つのグループに分類し、グループ毎に同じ種類の絆創膏を抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体の生理食塩水溶液を皮内注射された皮膚上に閉鎖貼布した。
【００３９】
２４時間経過後、２，４−ジニトロフェノールを共有結合させたオボアルブミン（ＤＮＰ−ＯＶＡ）の２０μｇ／ｍｌの生理食塩水溶液、及び５ｍｇ／ｍｌのエバンスブルー生理食塩水溶液を等量混合させた抗原溶液を、ラット１の尾５に存在する静脈に１．０ｍｌ注射してＰＣＡ反応を起こさせた。３０分経過後にラット１を放血致死させ、剪毛部２の皮膚に形成された青染部位を切除して組織片を得た。
【００４０】
この組織片を２規定（Ｎ）のＮａＯＨ水溶液１．０ｍｌに２４時間浸漬させて組織片を溶解した後、５ＭのＨ3 ＰＯ4 水溶液０．５ｍｌで中和し、アセトン３．０ｍｌを添加してエバンスブルー色素をアセトン層中に抽出させた。このアセトン溶液の６２０ｎｍにおける吸光度を分光光度計ＵＶー１２００（島津製作所製）を用いて測定し、アセトン溶液中のエバンスブルー色素濃度を調べた。
【００４１】
あらかじめエバンスブルー・アセトン溶液の希釈系列の吸光度を測定することにより作製しておいた検量線と照らし合わせることによって、４グループそれぞれの色素漏出量の平均値及び標準偏差（μｇ）を求めた。さらに、比較例４、比較例５及び実施例２で作製された軟膏剤が有するＰＣＡ反応抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００４２】
【数４】
【００４３】
【表３】
（比較例６）
１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの０．１重量％オリーブオイル溶液を作製して、比較例６のオイル溶液とした。
（モルモット皮膚感作性試験）
実施例１で得られた抽出物の経皮投与による皮膚刺激性（抗原性の有無）を検証するために、以下に記載するマクシミゼーション法に基づくモルモットの皮膚感作性試験を行った。
【００４４】
図２に示すように、体重３００〜３５０ｇの雄性モルモット６の肩甲骨上を長方形状（４ｃｍ×６ｃｍ）に剪毛した剪毛部７に、以下に記載する３種類の液体を２カ所ずつ皮内注射することによって、１８匹のモルモット６を免疫した。
【００４５】
第１の液体は、蒸留水のみからなる油中水（ｗ／ｏ）型完全フロイントアジュバントの懸濁液であり、図２の剪毛部７における注射部位８の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。第２の液体は、実施例１の乾燥粉末の２０重量％水溶液であり、剪毛部７における注射部位９の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。第３の液体は、前記第２の液体を懸濁させた油中水（ｗ／ｏ）型完全フロイントアジュバントの懸濁液であり、剪毛部７における注射部位１０の皮内にそれぞれ０．１ｍｌ注射した。
【００４６】
１週間経過後、剪毛部７の皮膚の浸透性を向上させるために、１０重量％のラウリル硫酸ナトリウムを混合させたワセリンを剪毛部７に塗布した。１日経過後、第２の液体０．２ｍｌを２ｃｍ×４ｃｍの動物用パッチテスト絆創膏に塗布し、４８時間閉鎖貼布した。
【００４７】
約２週間経過したところで、モルモット６の右脇腹を剪毛して、正方形状（５ｃｍ×５ｃｍ）の右脇腹剪毛部１１を形成した。実施例１の乾燥粉末の２重量％、１０重量％及び２０重量％水溶液０．１ｍｌを、２ｃｍ×２ｃｍの動物用パッチテスト絆創膏に塗布して、それぞれ６匹ずつのモルモット６の右脇腹剪毛部１１に２４時間閉鎖貼布した。
【００４８】
絆創膏を取り除いてから２４時間後の右脇腹剪毛部１１における皮膚反応を、抗原性なし、軽度の抗原性有り、中程度の抗原性有り及び強度の抗原性有りの４段階に分類して判定した。なお、軽度の抗原性有りとは皮膚に現れた紅斑が軽度又は散在性である症状を表し、強度の抗原性有りとは強い紅斑に浮腫が見られる症状を表し、中程度の抗原性有りとは軽度及び強度の中間の症状を表す。
【００４９】
また、対照試験として、前記モルモット６の免疫に用いた第２の液体の代わりに、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンの１．０重量％オリーブオイル溶液を使用して、上記の方法と同様に６匹のモルモット６を免疫した。さらに、前記モルモット６の右脇腹剪毛部１１に閉鎖貼布される実施例１の乾燥粉末水溶液の代わりに、比較例６のオイル溶液を使用して、上記の方法と同様にモルモット６の右脇腹剪毛部１１における皮膚反応を判定した。これらの結果を表４に示す。
【００５０】
【表４】
（アトピー性皮膚炎患者に対する臨床試験）
実施例２で作製された軟膏剤を使用して、アトピー性皮膚炎患者に対する臨床試験を行った。すなわち、アトピー性皮膚炎と診断された患者１０例を対象に、原則として他の外用剤を使用させず、患部に１日１〜３回、１ヶ月間塗布するように指示したうえで、実施例２の軟膏剤を経皮投与した。そして、１０例中で最終判定日まで観察できた９例を対象に、他覚所見として紅斑、乾燥、掻き傷及び湿潤の状態を診察するとともに、自覚症状として掻痒の改善効果について聞き取り調査を行った。これらの診察及び聞き取り調査の結果を総合的に評価することによって、臨床試験の結果を著効、有効、不変及び悪化の４段階で判定した。
【００５１】
その結果、９例中８例にアトピー性皮膚炎の改善効果が認められたことが示された。これらの症例の多くは、軟膏剤の投与開始１週間後位から徐々に症状が改善されてきていたことも聞き取り調査の結果から判明した。さらに、全ての症例で副作用が認められなかったうえ、使用感においても特に苦情は聞かれなかった。
（実施例３）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、ミツロウを１１．０ｇ、パラフィンワックスを６．０ｇ、流動パラフィンを２７．５ｇ、ラノリンを３．０ｇ、イソプロピルミリステートを６．０ｇ、スクワランを８．０ｇ、アラントインを０．５ｇ、ＰＯＥソルビタンモノステアレートを１．５ｇ、ソルビタンモノステアレートを４．０ｇ、プロピレングリコールを２．０ｇ及び防腐剤を適当量混合した混合物を、約７５℃の温度で加熱溶解した。ホウ砂１．０ｇ及び蒸留水２７．５ｇを混合して約７５℃に加熱し、前記混合物に撹拌しながら加えた後、約５５℃の温度まで冷却したところで適当量の香料を加えて撹拌した。さらに、そのまま約４５℃の温度まで撹拌を続けた後に放置してクリーム剤を得た。
（実施例４）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、ポリエチレングリコール４００を２．０ｇ、プロピレングリコールを３．０ｇ、トリエタノールアミンを１．０ｇ及び蒸留水を８３．０ｇ混合した水溶液を作製した。また、セタノールを１．５ｇ、ステアリン酸を１．０ｇ、パルミチン酸を０．５ｇ、ラノリン酸を１．０ｇ、スクワランを２．０ｇ、ミリスチン酸イソプロピルを１．０ｇ、モノステアリン酸グリセリルを１．５ｇ及びツゥイーン２０を０．５ｇ混合した溶液を作製した。上記２種類の溶液をそれぞれ約７０℃に加熱して充分に溶解した後、乳化機を使用して混合乳化した後に冷却して乳液を得た。
（実施例５）
実施例１で得られた乾燥粉末を２．０ｇ、グリセリンを１０．０ｇ、ジプロピレングリコールを１０．０ｇ、１，３−ブチレングリコールを５．０ｇ、ポリエチレングリコール１５００を５．０ｇ及びＰＯＥ硬化ヒマシ油を２．０ｇ混合し、約６０℃の温度で充分に加熱溶解して溶液を得た。この溶液にセチルイソオクタネート１０．０ｇ、スクワラン５．０ｇ及びメチルパラベン１．０ｇを混合し、約６０℃の温度で充分に加熱溶解した後、ホモゲナイザーを用いてホモゲナイズ処理した処理液を作製した。さらに、カルボキシビニルポリマー０．３ｇ及びヘキサメタリン酸ソーダ０．０８ｇを蒸留水１１．０ｇに溶解させた水溶液を前記処理液に添加してホモゲナイズ処理を行った。最後に、水酸化カリウム０．１２ｇを蒸留水３８．５ｇに溶解した水溶液を添加した後、ホモゲナイザーで乳化してローションを得た。
（実施例６）
実施例１で得られた乾燥粉末を７０．０ｇ、乳酸ナトリウムを２１．０ｇ、ピルビン酸ナトリウムを８．０ｇ、香料を１．０ｇ及び着色料を適当量混合して粉末状の浴用剤を得た。なお、この浴用剤は、入湯用の湯に１００〜１００００倍に希釈して使用するとよい。
（アレルギー体質の人に対する投与試験）
実施例３で得られたクリーム剤、実施例４で得られた乳液、実施例５で得られたローション及び実施例６で得られた浴用剤を使用して、皮膚のかゆみを訴えるアレルギー体質の人を対象に、経皮投与試験を行った。すなわち、それぞれ１例ずつを対象に、原則として他の外用剤を使用させず、患部に１日１〜３回、１週間塗布するように指示したうえで、実施例３〜実施例６の外用剤を経皮投与した。但し、実施例６の浴用剤は、入浴の際に１日１回投与した。
【００５２】
１週間後、自覚症状として掻痒の改善効果について聞き取り調査を行ったところ、全ての例で症状の改善が認められたうえ、使用感においても特に苦情は聞かれなかった。
【００５３】
なお、前記実施形態を以下のように構成することもできる。
・ 例えば浴用剤入りの湯舟で入浴した後、皮膚患部にクリーム剤を塗布する等、２種類以上の外用剤を併用して投与すること。
【００５４】
このように構成した場合、より効果的なアレルギー性疾患の治療を可能とすることができる。
次に、前記実施形態から把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 前記プロポリスは、プロポリス原塊に含有される水に可溶な物質を水で抽出した抽出物である請求項１から請求項３のいずれかに記載の抗アレルギー外用剤。
【００５５】
このように構成した場合、アレルギー作用をほとんど有しない高性能な外用剤を製造することができる。
【００５６】
・ プロポリス及びツリフネソウ科の植物のエキスを含有し、抗アレルギー作用を有する抗アレルギー外用剤を、クリーム剤、軟膏剤、ローション、乳液、エアゾール剤、パップ剤又は浴用剤として、１日に少なくとも１〜３回、皮膚の患部に塗布するか、又は浴槽の湯に溶解して使用する抗アレルギー外用剤の使用方法。
【００５７】
このように構成した場合、様々な形態の外用剤を手軽に使用でき、患者に対する肉体的、精神的負担が軽微であるとともに、長期間にわたる連続投与を容易に行うことができる。
【００５８】
【発明の効果】
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の抗アレルギー外用剤によれば、取り扱い性がよく、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与が可能であるとともに、高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
【００５９】
請求項２に記載の抗アレルギー外用剤によれば、請求項１に記載の発明の効果に加え、より確実に高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
請求項３に記載の抗アレルギー外用剤によれば、さらに高い抗アレルギー効果を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ラットＰＣＡ反応試験におけるラットを示す平面図。
【図２】 モルモット皮膚感作性試験におけるモルモットを示す平面図。
Claims (3)
- プロポリス及びホウセンカのエキスを含有する抗アレルギー外用剤。
- 前記ホウセンカのエキスは、ホウセンカの花弁から抽出されるエキスである請求項１に記載の抗アレルギー外用剤。
- 基剤、プロポリス及びホウセンカのエキスよりなり、前記プロポリス及びホウセンカのエキスの含有量が各々０．０１〜４０重量％であり、かつホウセンカのエキスの配合量がプロポリスに対して０．０１〜１００倍量である抗アレルギー外用剤。
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