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JP4280444B2 - Compositions and methods for inhibiting neoplastic cell growth - Google Patents

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Description

【0001】
(発明の分野)
本発明は、腫瘍性細胞成長を阻害する為の方法及び組成物に関する。特に、本発明は、腫瘍を治療するための抗腫瘍組成物及び方法に関する。さらに本発明は、成長阻害性、例えば抗腫瘍性化合物を同定するためのスクリーニング方法にも関する。
【0002】
(発明の背景)
悪性腫瘍(癌)は、米国において心臓疾患に続き第2の主要な死亡原因である(Boring等, CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993])。
癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍実体を形成する異常な、又は腫瘍性の細胞数の増加、これらの腫瘍性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節及び離間部位に拡散(転移)する悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
近年の癌治療の発達にも関わらず、腫瘍性細胞成長を阻害することのできる新たな治療薬が大いに必要とされている。従って、本発明の目的は、癌細胞などの腫瘍細胞の成長を阻害できる化合物を同定することである。
【0003】
(発明の概要)
A.実施態様
本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するための方法及び組成物に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物患者、好ましくはヒトにおける癌、例えば乳癌、前立腺癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌及びCNS癌、白血病、骨髄腫などを含む腫瘍を治療するための方法及び組成物に関する。
一態様では、本発明は、ここに定義するPROポリペプチド、又はそのアゴニストを、製薬的に許容される担体と混合して含んでなる腫瘍性細胞成長阻害のために有用な物質の組成物に関する。好ましい実施態様では、この物質の組成物は、PROポリペプチド、又はそのアゴニストの成長阻害量を含んでいる。他の好ましい実施態様では、この組成物は、PROポリペプチド、又はそのアゴニストの細胞毒性量を含む。場合によっては、この物質の組成物は、一又は複数の成長阻害及び/又は細胞毒性及び/又は化学治療薬を含有してよい。
さらなる態様では、本発明は、ここに定義されるPROポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量を含んでなる、哺乳動物における腫瘍を治療するために有用な物質の組成物に関する。この腫瘍は、好ましくは癌である。
【0004】
他の態様では、本発明は、前記腫瘍細胞を、ここに定義される、PROポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量に暴露することを含んでなる、腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。特別な実施態様では、アゴニストは、抗-PROアゴニスト抗体である。他の実施態様では、アゴニストは、PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である。この方法は、インビトロ又はインビボで実施される。
またさらなる実施態様では、本発明は、
(a)容器;及び
(b)当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備する製造品に関し、当該組成物は新生細胞成長、例えば腫瘍細胞成長を阻害するのに有用であり、当該組成物中の活性剤は、ここに定義されるPROポリペプチド、又はそのアゴニスト;及び
(c)前容器に取り付けられた容器、又は前容器に含まれる包装挿入物であって、前記PROポリペプチド、又はそのアゴニストの腫瘍性細胞の成長阻害における使用について言及するもので、アゴニストはPROポリペプチドへ結合する抗体であろう製造品からなる。特別な実施態様では、アゴニストは、抗-PROアゴニスト抗体である。他の実施態様では、アゴニストは、PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である。ここに定義されるPROポリペプチドを腫瘍の治療に有効な量で含有する類似の製造品も本発明の範囲内に包含される。また、ここに定義されるPROポリペプチド又はそのアゴニストを含み、さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を付加的に含む製造品も本発明の範囲内である。
【0005】
B.更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
一側面では、単離された核酸分子は、(a)PROポリペプチドのDNA分子で、ここに開示された完全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示された膜貫通タンパク質でシグナルペプチドを含む又は含まないものの細胞外ドメイン、又はここに開示されたいずれかの具体的に定義された完全長アミノ酸配列の断片或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約81%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約82%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約83%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約84%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約85%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約86%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約87%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約88%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約89%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約90%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約91%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約92%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約93%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約94%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約95%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約96%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約97%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約98%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0006】
他の側面では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されたPROポリペプチドの完全長配列をコードするcDNAを含んでなるDNA分子、ここに開示されたPROポリペプチドのシグナル配列を欠く配列、ここに開示されたPROポリペプチドの膜貫通タンパク質の細胞外ドメインでシグナル配列を含む又は含まない配列、或いはここに開示されたいずれかの具体的に定義された完全長アミノ酸配列の断片、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約81%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約82%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約83%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約84%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約85%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約86%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約87%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約88%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約89%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約90%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約91%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約92%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約93%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約94%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約95%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約96%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約97%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約98%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0007】
さらなる側面では、本発明は、(a)ここに開示されATCCへ寄託された任意のヒトcDNAによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約81%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約82%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約83%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約84%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約85%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約86%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約87%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約88%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約89%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約90%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約91%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約92%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約93%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約94%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約95%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約96%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約97%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約98%の配列同一性を有する、あるいは少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【0008】
さらに他の側面では、本発明は、膜貫通ドメインが欠損又は不活性化のいずれかであるPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなヌクレオチド配列と相補的なPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、これらポリペプチドの膜貫通ドメインは、ここに開示されている。従って、ここに開示されるPROポリペプチドの可溶性ドメインが考察されている。
【0009】
他の実施態様は、例えば、場合によっては抗-PRO抗体の結合部位を含んでなるポリペプチドをコードするPROポリペプチドのコード化断片のためのハイブリダイゼーションプローブ、又ははアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての利用を見出しうるPROポリペプチドコード化配列断片或いはその補体に関する。そのような核酸断片は通常少なくとも約20のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約30のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約40のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約50のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約60のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約70のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約80のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約90のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約100のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約110のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約120のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約130のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約140のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約150のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約160のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約170のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約180のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約190のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約200のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約250のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約300のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約350のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約400のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約450のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約500のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約600のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約700のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約800のヌクレオチド長さ、あるいは少なくとも約900のヌクレオチド長さ及びあるいは少なくとも約1000のヌクレオチド長さであり、ここで、「約」という用語は、その参照長さのプラス又はマイナス10%の参照ヌクレオチド配列長さを意味する。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してPROポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより常套的に決定することができることに留意される。そのようなPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるPROポリペプチド断片、好ましくは抗-PRO抗体に対する結合部位を含んでなるPROポリペプチド断片である。
【0010】
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたPROポリペプチドを提供する。
ある側面では、本発明は、ここに開示された完全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く完全長アミノ酸配列、或いはシグナルペプチドを有する又は有しないここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含んでなるPROポリペプチドに対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の酸アミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPROポリペプチドに関する。
【0011】
更なる側面では、本発明は、ここに開示されたATCCに寄託された任意のヒトタンパク質cDNAによってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の酸アミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性及びあるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたPROポリペプチドに関する。
【0012】
特定の態様では、本発明は、N末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを持たない単離されたPROポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたPROポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はPROポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養物からPROポリペプチドを回収することを含んでなる。
【0013】
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで特定した天然PROポリペプチドのアゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニストは抗PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物活性をモニターすることを含んでなる、PROポリペプチドに対するアゴニストの同定方法に関する。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
よりさらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチド、又はここに記載されたPROポリペプチドのアゴニスト、或いは抗-PRO抗体を担体との組み合わせで含んでなる物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
【0014】
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、そのアゴニスト又は抗PRO抗体に反応性のある症状の治療に有用な医薬の調製のための、PROポリペプチド、又は上述のそのアゴニスト、又は抗PRO抗体の使用に関する。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、任意のここに記載するポリペプチドをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。任意のそのようなベクターを含んでなる宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドに関する製造方法がさらに提供され、それは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
【0015】
他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのFc領域に融合した任意のここに記載のポリペプチドを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブを任意の上記又は下記のヌクレオチド配列から誘導してもよい。
【0016】
(好適な実施態様の詳細な説明)
ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/番号)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。「数字」がここで使用される実際の数値符号である、ここで使用される「PRO/番号ポリペプチド」及び「PRO/番号」という用語は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここで記載されているPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
【0017】
「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列PROポリペプチドは、関連する図に示されている完全長アミノ酸配列を含有する成熟又は完全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているPROポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置1において示されている一方で、図のアミノ酸位置1より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、PROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【0018】
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又は明細書において同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約5を越えないアミノ酸を含みうるし、結合したシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
【0019】
ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC-末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsenら, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinjeら, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、1つ以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのC-末端境界の何れかの側の約5アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【0020】
「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される完全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く完全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された完全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、完全長天然アミノ酸配列のN-又はC-末端において1つ又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される完全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く完全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された完全長PROポリペプチドの特に同定された他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、あるいは少なくとも約20アミノ酸長、あるいは少なくとも約30アミノ酸長、あるいは少なくとも約40アミノ酸長、あるいは少なくとも約50アミノ酸長、あるいは少なくとも約60アミノ酸長、あるいは少なくとも約70アミノ酸長、あるいは少なくとも約80アミノ酸長、あるいは少なくとも約90アミノ酸長、あるいは少なくとも約100アミノ酸長、あるいは少なくとも約150アミノ酸長、あるいは少なくとも約200アミノ酸長、あるいは少なくとも約300アミノ酸長、又はそれ以上である。
【0021】
ここに定義されるPROポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【0022】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例としては、表2-3が、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【0023】
特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
【0024】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0025】
さらに、%アミノ酸配列同一性値も、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480(1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、(a)WU-BLAST-2によって決定した、天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象であるPROポリペプチドのアミノ酸配列と対象である比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチド変異体であってもよい、対象であるPROポリペプチドが比較される配列)の間で一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象であるPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する又は有しているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という記載では、アミノ酸配列Aが対象である比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象であるPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
【0026】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるような活性PROポリペプチドをコードする核酸分子、並びにここで開示する完全長天然配列PROポリペプチド配列、ここで開示するシグナルペプチドを欠く完全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチドを有する又は有しないここで開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここで開示する完全長PROポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約80%の核酸配列同一性を有することを意味する。通常、PRO変異体ポリヌクレオチドは、ここで開示する完全長天然配列PROポリペプチド、ここで開示するシグナルペプチドを欠く完全長天然配列PROポリペプチド、シグナルペプチドを有する又は有しないここで開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここで開示する完全長PROポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも約80%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約81%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約82%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約83%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約84%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約85%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約86%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約87%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約88%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約89%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約90%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約91%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約92%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約93%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約94%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約95%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約96%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約97%の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有する。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
【0027】
通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約60ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約90ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約120ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約150ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約180ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約210ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約240ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約270ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約300ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約450ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約600ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【0028】
ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、PRO配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用することによって得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所,ワシントン D.C.,20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【0029】
ここでの目的のために、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さがアミノ酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。%核酸配列同一性の計算の例としては、表4及び5が「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
【0030】
特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschulら, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードでき、又は別な方法で米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランドから得ることができる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
【0031】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0032】
さらに、%核酸配列同一性値も、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480(1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のためには、%核酸配列同一性値は、(a)WU-BLAST-2によって決定した、天然PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象であるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と対象である比較核酸配列(即ち、PROポリペプチド変異体であってもよい、対象であるPROポリペプチドコード化核酸分子が比較される配列)の間で一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象であるPROポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有する又は有している核酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という記載では、核酸配列Aが対象である比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象であるPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【0033】
他の実施態様では、PRO変異体ポリヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で、ここに開示する完全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションする核酸分子である。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【0034】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
【0035】
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸、又は抗-PRO抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、PROポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、この単離された核酸は、天然においてそれに付随しているすべての構成成分を有しないものである。単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子、又は単離された抗-PROコード化核酸分子は、天然で見出される形態あるいは設定とは以外のものである。単離された核酸分子は、それ故に、PROポリペプチドコード化核酸分子、又は天然の細胞中に存在するPROポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかしながら、PROポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする単離された核酸分子は、通常はPROポリペプチド又は抗-PRO抗体を発現する細胞に含まれていて、例えば、その核酸分子は天然細胞とは異なる染色体位置にある。
【0036】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において、作用可能に結合したコード配列の発現にとって必要なDNA配列を意味する。原核生物に適したなコントロール配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞が、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することは知られている。
【0037】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0038】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-PROポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-PRO抗体組成物、一本鎖抗-PRO抗体、及び抗-PRO抗体の断片を包含している(下記参照)。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、少量存在し得る自然に生じる可能性のある突然変異を除いて、構成する個々の抗体が同一である集団から得られる抗体を称する。
【0039】
ハイブリダイゼーション反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にすることになり、低い温度は緊縮性を低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応の緊縮性の更なる詳細及び説明については、Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers, 1995)を参照のこと。
【0040】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
【0041】
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
【0042】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは、約10〜約20の残基)を有する。
【0043】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを組み合わせた抗体様分子を表す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である所望の結合特異性のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列の融合体を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【0044】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PROによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
【0045】
抗体又はここに開示するスクリーニングアッセイで同定できる他の分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチドなど)における「生物学的活性」は、「治療的有効量」の定義に関連してここに列挙する効果の一つ以上を発揮するこのような分子の能力を意味するために使用される。特別な実施態様では、「生物学的活性」は、腫瘍性細胞成長又は増殖を阻害する能力である。好ましい生物学的活性とは、標的腫瘍(例えば癌)細胞の成長の遅延、又は完全な停止を含む阻害である。他の好ましい生物学的活性とは、標的腫瘍(例えば癌)細胞の死をもたらす細胞毒性活性である。さらに他の好ましい生物学的活性とは、標的腫瘍(例えば癌)細胞のアポトーシスの誘発である。
【0046】
「免疫学的活性」という語は、PROポリペプチドの少なくとも一つのエピトープとの免疫学的交差反応性を意味する。
ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活性を持つPROポリペプチドの定性的生物学的活性を、公知の活性PROポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを意味する。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジュバント中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜内又は皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反応性は好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子(例えば抗体)の対応するPROポリペプチドに対する結合親和性が、その分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対する結合親和性より有意に高い(好ましくは少なくとも約2倍、より好ましくは少なくとも約4倍、さらにより好ましくは少なくとも約6倍、最も好ましくは少なくとも約8倍高い)ことを意味する。
【0047】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、並びに全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
【0048】
「治療」とは、疾患の病理の進展を予防すること、或いはそれを改善することを意図することを行う介入である。従って、「治療」とは、治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療を必要するものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍(例えば、癌)治療では、治療薬は直接に腫瘍細胞の病理を低下させ得るし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び/又は化学治療に対してより敏感にし得る。
癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
【0049】
ここに開示されるポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」とは、腫瘍性細胞成長、腫瘍成長に関しては、標的細胞の成長を或る程度阻害できる量である。この用語は、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び/又は細胞毒性効果及び/又はアポトーシスを誘起することのできる量を含む。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのPROポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」は、経験的及び日常的手法によって決定できる。
【0050】
「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、一つ又は複数の次の効果を誘起することのできる量を意味する:(1)遅延化及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害;(2)腫瘍細胞数の減少;(3)腫瘍サイズの縮小;(4)腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害(即ち、減少、遅延化又は完全な停止);(5)転移の阻害(即ち、減少、遅延化又は完全な停止);(6)抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらしてもよいが、必ずしも必要ではない;及び/又は(7)疾患に関連する一つ又は複数の徴候の程度の軽減。腫瘍の治療の目的のためのPROポリペプチド又はそのアゴニストの「治療的有効量」は、経験的及び日常的手法で決定できる。
【0051】
PROポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのPROポリペプチド又はそのアゴニストの「成長阻害量」は、経験的及び日常的手法によって決定できる。
PROポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのPROポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量」は、経験的及び日常的手法によって決定できる。
ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び/又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90とRe186)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。
【0052】
「化学治療薬」は、腫瘍、例えば癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)及びドキセタキセル(Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rance)、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号)、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナプリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホルモン様薬剤である。
【0053】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、S期でそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期を(S期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばG1停止又はM期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S期停止にも溢流し、例えば、DNAアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5-フルオロウラシル、及びara-Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができる。
【0054】
「サイトカイン」という用語は、1つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;副甲状腺ホルモン;チロキシン;インシュリン;プロインシュリン;レラキシン;プロレラキシン;糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、及び黄体化ホルモン(LH);肝臓成長因子;線維芽成長因子;プロラクチン;胎盤ラクトゲン;腫瘍壊死因子-α及び-β;ミューラー阻害因子;マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド;インヒビン;アクチビン;血管内皮成長因子;インテグリン;トロンボポエチン(TPO);NGF-β等の神経成長因子;血小板成長因子;TGF-α及びTGF-β等のトランスフォーミング成長因子;インシュリン様成長因子-I及びII;エリスロポエチン(EPO);骨誘発因子;インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン;コロニー刺激因子(CSFs)、例えばマクロファージ-CSF(M-CSF);顆粒球-マクロファージ-CSF(GM-CSF);及び顆粒球-CSF(G-CSF);インターロイキン(ILs)、例えばIL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12;腫瘍壊死因子、例えばTNF-α及びTNF-β;及びLIF及びキットリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【0055】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), pp.247-267, Human Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な5-フルオロシトシン及び他の5-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞毒性薬の例には、前記の化学療法剤が含まれるが、これらに限られない。
【0056】
「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然のPROポリペプチドの生物学的活性に類似する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は特に、アゴニスト抗体又は抗体断片、天然のPROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、腫瘍細胞を候補アゴニストに暴露し、腫瘍細胞成長の阻害を測定することを含みうる。
「慢性」投与とは、初期の治療効果(活性)を長期間にわたって維持するようにするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
【0057】
治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時(一時)及び任意の順序での連続投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【0058】
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(V)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(V)を、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【0059】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、共に軽鎖及び重鎖の可変ドメインにある相補性決定領域(CDRs)又は高頻度可変領域と呼ばれる3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大きくベータ-シート構造とり、β-シート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、CDRsにより連結された4つのFR領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のCDRは、FRにより近接して結合せしめられ、他の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-3242, Vol.I, 647-669頁(1991)参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与といった種々のエフェクター機能を示す。
【0060】
ここで使用される場合の「高頻度可変領域」は、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」(例えば、軽鎖可変領域の残基24−34(L1)、50−56(L2)及び89-97(L3)及び重鎖可変領域の31−35(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3);Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))からのアミノ酸残基、及び/又は「高頻度可変ループ」(例えば、軽鎖可変領域の残基26−32(L1)、50−52(L2)及び91−96(L3)及び重鎖可変領域の残基26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3);Clothia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987))からの残基を含む。「フレームワーク」又は「FR」残基は、ここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【0061】
「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab')、及びFv断片;ダイアボディ(diabody);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]);一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成される多重特異的抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を持つ2つの同一な抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映した名称の残りの「Fc」断片を生成する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有するF(ab’)断片を生じ、その断片は、なお抗原を交差結合が可能である。
【0062】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの3つのCDRが相互作用してV−Vに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRが抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識しそれと結合する能力を有する。
【0063】
またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一つ又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab’断片と相違する。ここで、Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab’を表す。F(ab’)抗体断片は、最初はFab’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一つに分類することができる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンを異なるクラスへ分類することができる。免疫グロブリンの五つの主要なクラスには:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかを、更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2へ分類し得る。
【0064】
ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在する自然に起こりうる突然変異以外は同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的に異なる決定基(エピトープ)に対して向けられた異なる抗体を含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられている。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されないという点において好都合である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、並びに任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に基づいて使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【0065】
ここでのモノクローナル抗体は、特に、その重鎖又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導されたか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同的であるが、鎖の残りの部分が、他の種から誘導されたか、或いは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同的である「キメラ」抗体、並びに所望の生物学的活性を示すのであれば、このような抗体の断片を含む(米国特許第4,816,567号;Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984])。
【0066】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片(例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab')あるいは抗体の他の抗原結合性配列)である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であって、そのレシピエントの相補性決定領域(CDR)が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のCDR(ドナー抗体)に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。幾つかの場合では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)の残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるCDR又はフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最大化するために施される。一般にヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、FR領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -525 (1986);Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. struct. Biol. 2: 593 -596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が対象とする抗原でマカゲザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するPRIMATIZED(商品名)抗体を含む。
【0067】
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のV及びVドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはV及びVドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。sFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(V−V)内で軽鎖可変ドメイン(V)に重鎖可変ドメイン(V)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、EP404097;WO93/11161;及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【0068】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリー(Lowry)法によって決定した場合95重量%以上の、最も好ましくは99重量%の抗体まで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え体細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【0069】
「特異的に結合する」抗体、又は特定のポリペプチド、或いは特定のポリペプチド上のエピトープへ特異的な抗体とは、他のポリペプチド、又はポリペプチドエピトープとは実質的には結合せずに、特定のポリペプチド、或いは特定のポリペプチド上のエピトープへ結合するものである。
「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自身によって検出可能でもよく(例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識)、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の化合物が接着できる非水性マトリクスを意味する。ここに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス(例えば、孔の制御されたガラス)、ポリサッカリド(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル;その他では精製用カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)を含むことができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々の粒子の不連続な固体相も含む。
【0070】
「リポソーム」は、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はそれに対する抗体)の送達に有用な、脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した2層構造に配列される。
「小分子」は、ここで約500ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【0071】
下記に示すように、表1はALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの安全なソースコードを提供する。このソースコードは、UNIXオペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを与える。
さらに、表2−5は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた%アミノ酸配列同一性(表2−3)、並びに%核酸配列同一性(表4−5)を決定するために下記の方法を使用した仮説的例示であり、「PRO」は対象とする仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」とは、対象とする「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO-DNA」は対象とする仮説的PROコード化核酸配列を示し、「比較DNA」は対象とする「PRO-DNA」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
【0072】

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【0073】
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【0074】
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【0075】
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【0080】
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【0087】
Figure 0004280444
【0088】
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【0089】
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【0090】
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【0091】
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【0092】
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【0093】
II.本発明の組成物及び方法
A.完全長PROポリペプチド
本発明は、本出願でPROポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することによって容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も同一であると証明できるリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0094】
B.PRO変異体
ここに記載した完全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化、あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変える可能性があることを理解するであろう。
【0095】
ここに記載した、天然完全長配列PROポリペプチド、或いはPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異に関する任意の技術及び指針を用いて作成することができる。変異は、天然配列PROと比べるとPROポリペプチドのアミノ酸配列に変化を結果として引き起こす、PROポリペプチドをコードする一つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、この変異は、PROポリペプチドの一つ又は複数のドメインにおいて、少なくとも1つのアミノ酸を任意の他のアミノ酸によって置換することである。どのアミノ酸残基が所望の活性へ逆の作用を与えることなく挿入、置換又は欠失されるのかを決定する指針は、PROポリペプチドの配列を相同性のある既知タンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内で生じるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一つのアミノ酸を類似の構造及び/又は化学特性を有する他のアミノ酸で置換すること、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列のアミノ酸に挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、完全長又は成熟天然配列によって阻害される活性に関して、この結果として生じた変異体を試験することによって決定できる可能性がある。
【0096】
PROポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、N-末端又はC-末端で切断されてもよく、或いは内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性にとって必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO断片は、多くの従来技術のいずれかによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法には、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基で規定されているタンパク質の部位を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理することによって、あるいは適合する制限酵素でDNAを消化し、所望の断片を単離することによってPRO断片を生成することが含まれる。さらに他の好適な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することが含まれる。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’及び3’プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、添付した図面に示す天然PROポリペプチドと少なくとも一つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を表6において、好ましい置換の見出しの下に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表6で例示的置換と名前を付けた、或いは更に下記にアミノ酸分類に関連して記載しているような、より置換的な変化が導入されて生成物がスクリーニングされる。
【0097】
Figure 0004280444
【0098】
ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
【0099】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とする。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入され得る。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発[Carterら, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zollerら, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wellsら, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wellsら, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]等のこの分野で周知の方法を用いて作成することができ、或いはクローニングしたDNAに対して他の知られた技術を実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
【0100】
また、隣接配列に沿って1つ又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中では、概して好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるので、概して好ましい。さらに、それは埋もれ、そして露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)]。アラニン置換によって十分な量の変異体が生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0101】
C.PROの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一形式は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖、或いはN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化は、例えば抗-PRO抗体の精製方法に用いる水不溶性支持体マトリクス又は表層へPROを架橋させること、並びに逆の場合にとっても有用である。一般に用いられる架橋剤には、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬が含まれる。
【0102】
他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、並びに任意のC末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の形式には、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更が含まれる。ここで意図される「天然グリコシル化パターンの変更」とは、天然配列PROに見られる1又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない1又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節には、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化が含まれる。
【0103】
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、1又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
【0104】
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddinら, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、並びにEdgeら, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakuraら, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の形式には、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、PROポリぺプチドを種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへ結合させることが含まれる。
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド、又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【0105】
一実施態様では、このようなキメラ分子には、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合体が含まれる。エピトープタグは、概して、PROポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって、PROポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド、並びにそれらの各々の抗体は、この分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(ポリ-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-His-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Fieldら, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evanら, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985)];並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborskyら, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]が含まれる。他のタグポリペプチドには、フラッグペプチド[Hoppら, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)];KT3エピトープペプチド[Martinら, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[Skinnerら, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuthら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397(1990)]が含まれる。
【0106】
それに換わる実施態様では、キメラ分子は、PROと免疫グロブリン、或いは免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合はIgG分子のFc領域とであり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えて、PROポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、或いはヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0107】
D.PROの調製
以下の説明は、主として、PROポリペプチド核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、PROポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewartら, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア(1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて完全長PROポリペプチドを生産してもよい。
【0108】
1.PROポリペプチドをコードするDNAの単離
PROポリペプチドをコードするDNAは、PROmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPRO-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、PCR法を使用するものである[Sambrookら,上掲;Dieffenbachら, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
【0109】
下記の実施例には、cDNAライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrookら,に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankら,の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は完全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されていないmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrookら,に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【0110】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrookら, 上掲に見出すことができる。
【0111】
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl、CaPO、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookら,に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開のWO89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiaoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansourら, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【0112】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium、ネズミチフス菌)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルスリチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompT kanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行 米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【0113】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP139,383);クルベロミセス宿主(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleerら, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourtら, J. Bacteriol.154(2): 737-742 [1983])、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、クルベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Bergら, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピチア・パストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sreekrishnaら, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]);カンジダ;トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Caseら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]);シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日発行のEP394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行のWO91/00357);及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburnら, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(C1化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【0114】
グリコシル化PROポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7,ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Grahamら, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))ヒト肺細胞 (W138,ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2,HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562,ATCC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【0115】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、1つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、1つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の1つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
【0116】
PROポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO-コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列を、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【0117】
発現及びクローニングベクターの双方は、1つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、多くの細菌、酵母及びウイルスに関してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は、殆どののグラム陰性細菌にとって適したものであり、2μプラスミド開始点は、酵母にとって適したものであり、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は、哺乳動物細胞のクローニングベクターとして有用である。
発現及びクローニングベクターは、概して選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンのような抗生物質、或いは他の毒素に対する耐性を付与し、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素、例えばバチルス属のD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【0118】
哺乳動物細胞にとって適した選べるマーカーの例としては、DHFRあるいはチミジンキナーゼのような、PRO-コード化核酸を取り込むことのできる細胞を同定することを可能にするものである。野生型DHFRを用いた場合に適した宿主細胞は、Urlaubらにより Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され、増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌での使用に適した選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcombら, Nature, 282:39(1979);Kingsmanら, Gene, 7:141(1979);Tschemperら, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076、又はPEP4-1のような、トリプトファンによって成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常は、PRO-コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主で使用するのに適したプロモーターには、β-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Changら, Nature, 275:615 (1978); Goeddelら, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーター[deBoer ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]が含まれる。また、細菌系で使用するプロモータは、PROポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【0119】
酵母宿主で用いるのに適したプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman ら, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess ら, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターある他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に使用するのに適したベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【0120】
哺乳動物宿主細胞のベクターからのPROポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター、又は免疫グロブリンプロモーター、並びに熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターが宿主細胞系に適合するならば、これらプロモーターによって制御される。
より高等な真核生物による、所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクターへエンハンサー配列を挿入することによって増強される可能性がある。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、概して、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期のポリオーマエンハンサー、及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROポリペプチドコード化配列の5’又は3’位でベクター中へスプライシングされる可能性があるが、好ましくはプロモーターの5’位に位置している。
【0121】
また、真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)で用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスDNA又はcDNAの5’、時には3’の非翻訳領域から通常は取得できる。これらの領域は、PROポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な更に他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Nature, 293:620-625 (1981); Manteiら, Nature, 281:40-46 (1979);EP117,060;及びEP117,058に記載されている。
【0122】
4.遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRO DNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【0123】
5.ポリペプチドの精製
PROポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
【0124】
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182(1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選択される精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
【0125】
E.抗体
本発明の組成物及び方法で使用するための候補薬剤の幾つかは、PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する抗体及び抗体断片である。
1.ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0126】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【0127】
免疫化剤は、典型的にはPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般に、ヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]。不死化細胞系は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【0128】
好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやマナサス,バージニア州のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【0129】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈方法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【0130】
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrisonら, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【0131】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0132】
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab')あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]。
【0133】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【0134】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985;Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95(1991))。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【0135】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又ははヒト化抗体である。本発明では、結合特異性の一方はPROポリペプチドに対して、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質、又はレセプター又はレセプターサブユニットに対するものである。
二重特異性抗体を作成する方法は、当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常は達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【0136】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合することができる。この融合は、好ましくは、少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするDNA、そして望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主微生物へ同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖が、より大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はトレオニン)と置き換えることによって、第2の抗体分子の界面に作り出す。これによって、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対して、ヘテロダイマーの収量を増大させるためのメカニズムが提供される。
【0137】
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab')二重特異性抗体)として調製することができる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解的に切断してF(ab')断片を生成する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。生成されたFab’断片を、次いでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体へ転換する。Fab’-TNB誘導体の一つを、次いでメルカプトエチルアミンでの還元によってFab’-チオールへ再転換し、他のFab’-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。この生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
Fab’ 断片を大腸菌から直接に回収し、化学的に結合させて二重特異性抗体を形成してもよい。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab')分子の製造が記載されている。各Fab’断片を大腸菌から別個に分泌し、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗体を形成した。このように形成された二重特異性抗体は、ErbB2レセプターを過剰発現している細胞及び正常なヒトT細胞と結合することができ、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発する。
【0138】
また、組換え細胞培養から直接に二重特異性抗体断片を作成し分離することに関する様々な技術も記述されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって、二つの異なった抗体のFab’ 部分に結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成させ、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法は、抗体ホモダイマーの生産にも使用することができる。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)によって記述された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提示している。この断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするためには短か過ぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン(V)と結合した重鎖可変ドメイン(V)を含んでいる。従って、一つの断片のV及びVドメインは、他の断片の相補的V及びVドメインと強制的に対形成し、それによって2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(sFv)ダイマーを使用して、二重特異性抗体断片を製造するその他の方法についても報告されている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【0139】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここで与えられるPROポリペプチド上の2つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、細胞防御メカニズムを特定のPROポリペプチドを発現する細胞へ集中させるために、抗-PROポリペプチドアームを、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28又はB7)等の白血球上のトリガー分子、或いはFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgGのFcレセプター(FcγR)に結合するアームに結合させてもよい。二重特異性抗体を、細胞毒性薬を特定のPROポリペプチドを発現する細胞に局在化させるために使用してもよい。これらの抗体は、PRO-結合アーム、並びに細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAと結合するアームを有する。対象とする他の二重特異性抗体は、PROポリペプチドに結合し、さらに組織因子(TF)と結合する。
【0140】
5.ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体も本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は2つの共有結合した抗体で構成されている。このような抗体は、例えば、不要な細胞を免疫系細胞の標的とするため[米国特許第4,676,980号]、そしてHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関するものを含む、合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することが可能であると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか、或いはチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構成できる可能性がある。この目的のために適した試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、並びに、例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【0141】
6.エフェクター機能の設計
例えば癌治療における抗体の効能を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合を形成させてもよい。このようにして産生されたホモダイマー抗体は、改善されたインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞死滅、及び抗体依存性細胞障害活性(ADCC)を有し得る。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる可能性がある。あるいは、二重Fc領域を有し、それによって増強された補体溶解及びADCC能を有し得る抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【0142】
7.免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)と抱合している抗体を含む免疫コンジュゲートに関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reが含まれる。
【0143】
抗体及び細胞毒性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体-レセプターコンジュゲートは患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合コンジュゲートを循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
【0144】
8.免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985);Hwangら, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で周知の方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0145】
F.腫瘍性細胞成長又は増殖を阻害できるタンパク質の同定
本出願で開示したタンパク質を、現在、国立癌学会(NCI)の実験的、疾患指向性、インビトロ薬剤スクリーニングで使用されている60腫瘍系のパネルで検定した。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する細胞毒性及び/又は細胞増殖抑制活性を有する分子を同定することである。NCIは毎年10,000を越える新たな分子をスクリーニングしている(Monks等, J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10): 1-12 [1989])。この実験で使用された腫瘍細胞系は、上掲のMonks等に記載されている。本出願のタンパク質によって、成長が有意に阻害された細胞系を実施例で特定した。
【0146】
結果は、試験したタンパク質が種々の癌細胞系において細胞増殖抑制性、そして或る例と濃度では細胞毒性活性を示すことを明らかにした。
腫瘍(例えば癌)に関する他の細胞ベースのアッセイ及び動物モデルも、NCI癌スクリーニングの発見を裏付け、ここで同定したタンパク質と腫瘍性細胞成長の進行及び病因との関係をさらに理解するために使用できる。例えば、トランスジェニック動物の腫瘍から誘導された一次培地は(以下に記載するような)、ここでの細胞ベースのアッセイで使用できる。トランスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術は、この分野で周知である(例えば、Small等, Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 [1985]参照)。
【0147】
G.動物モデル
ここで同定された遺伝子の腫瘍の進行及び原因における役割を更に理解するために、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の周知の動物モデルを使用することができる。これらモデルのインビボの性質によって、特にヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌(例えば、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など)の動物モデルには、非組換え及び組換え(トランスジェニック)動物の両方が含まれる。非組換え動物モデルには、例えば、マウスモデルのような齧歯類が含まれる。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、或いはオルトピン(orthopin)移植、例えば大腸組織に移植された大腸癌細胞を使用することで、腫瘍細胞を同系マウスに導入することによって作成することができる。(1997年9月18日に発行されたPCT公報WO 97/33551参照。)
【0148】
癌遺伝子の研究において、おそらくは最も頻繁に用いられる動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。ハイポ/形成不全を持つヌードマウスが、ヒト腫瘍異種移植の宿主としての機能を果たすという所見は、この目的に関するそれの広範な用途につながっている。常染色体劣性nu遺伝子が、例えば、ASW、A/He、AKR、BALB/c、B10.LP、C17、C3H、C57BL、C57、CBA、DBA、DDD、I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、RIII及びSJLを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子系統に導入された。さらに、遺伝的な免疫欠損症を持つヌードマウス以外の広範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられている。さらなる詳細については、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 及び B. Winograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照。
【0149】
これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍/癌細胞系、例えば任意の上記に列挙した腫瘍細胞系、及び、例えばB104-1-1細胞系(neuプロトオンコジーンで形質移入された安定NIH-3T3細胞系);ras-形質移入NIH-3T3細胞:Caco-2(ATCC HTB-37)、中程度に良く分化したグレードIIヒト大腸腺癌細胞系、HT-29(ATCC HTB-38)、あるいは腫瘍及び癌から誘導することができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、液体窒素中で凍結及び保存することを含む標準的な条件を用いて、手術を受けている患者から得ることができる(Karmali等, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983])。
【0150】
腫瘍細胞は、種々の手法によって、ヌードマウスなどの動物へ導入できる。マウスの皮下(s.c.)空間は、腫瘍移植にとっては非常に適している。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー(trochar)を用いてニードル生検として、又は細胞懸濁物としてs.c.移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植では、適切な大きさの腫瘍組織断片がs.c.空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍、或いは安定な腫瘍細胞系から新たに調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞を、皮下植え込みとして注射することもできる。この位置において、種菌が皮膚結合組織の下層とs.c.組織との間に析出される。Boven及びWinograd (1991), 上掲。乳癌の動物モデルは、例えば、ラット神経芽腫細胞(それからneu癌遺伝子が最初に単離される)の移植、或いは、基本的にはDrebin等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9129-9133 (1986)に記載されているように、neu形質移入NIH-3T3細胞をヌードマウスに移植することによって生成できる。
【0151】
同様に、結腸癌の動物モデルは、結腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wang等, Cancer Research 54, 4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に記載されている。このモデルは、AntiCancer, Inc. (San Diego, California)から市販されている「METAMOUSE」に基づく。
動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビトロ培養の細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的となることができる。あるいは、この継代で得られる腫瘍は単離することができ、継代前細胞と1又はそれ以上の継代の後に単離した細胞のRNAを、対象である遺伝子の差次的発現に関して分析する。このような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。
【0152】
例えば、Meth A、CMS4、CMS5、CMS21、及びWEHI-164は、BALB/c雌マウスの化学的に誘導された線維肉腫(DeLeo等, J. Exp. Med. 146, 720 [1977])であり、種々の抗原の抗-腫瘍活性の研究のための高度に制御可能なモデル系を提供する(Palladino等, J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987])。要約すると、腫瘍細胞をインビトロで細胞培地中で成長させる。動物に注射する前に、細胞系を洗浄して約10x10から10x10細胞/mlの細胞密度でバッファー中に懸濁させる。次いで動物を10から100μlの細胞懸濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで1から3週間放置する。
さらに、最も徹底的に研究されている実験腫瘍の一つであるマウスのルイス肺(3LL)癌腫を、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小細胞癌腫(SCCL)と診断されたヒト患者の治療における有益な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスの腫瘍断片、或いは培地で維持された細胞の注射によって正常マウスへ導入することができ(Zupi等, Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980])、証拠は、腫瘍がたった一つの細胞の注射から始まり、極めて高い割合の感染腫瘍細胞の生存することを示している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986]を参照のこと。
【0153】
動物モデルにおける、移植腫瘍に対する試験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療の前後で腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定されている。二次元に限定した測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、数式を用いて、通常は相当する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確である。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延によってより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利用可能である。しかし、腫瘍に続く壊死及び炎症反応が、少なくとも初期に、腫瘍の大きさを実際には増大させ結果となり得ることを注記しておく。従って、形態学的方法とフローサイトメトリー分析を組み合わせて、これらの変化を注意深くモニターする必要がある。
【0154】
トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、ここで同定された遺伝子のコード部分を対象とする動物のゲノムに導入することによって、組換え(トランスジェニック)動物モデルを加工することができる。トランスジェニック操作の標的となれる動物には、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルが含まれる。導入遺伝子をこれらの動物へ導入するためのこの分野で周知の技術には、前核マイクロインジェクション(Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号);胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移(例えば、Van der Putten等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]);胚性肝細胞での遺伝子標的化(Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]);胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]);精子媒介遺伝子転移(Lavitrano等, Cell 57, 717-73 [1989])が含まれる。概説としては、例えば、米国特許第4,736,866号を参照のこと。
【0155】
本発明の目的としては、トランスジェニック動物には、その細胞一部にのみ導入遺伝子を有するもの(「モザイク動物」)が含まれる。この導入遺伝子を、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組み込むことができる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術によって可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によってモニターできる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認のためには、サザンブロット分析又はPCR増幅を用いることができる。次いで、インサイツバイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、PCR、又は免疫組織化学などの技術を用いて、mRNA発現のレベルを分析することができる。この動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに調べられる。
【0156】
自発的な動物腫瘍の治療における、ここで同定されるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに他の候補薬の有効性も試験できる。このような研究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌(SCC)である。ネコ口腔SCCは極めて侵襲的な悪性腫瘍で、ネコに最も多く発生する口腔悪性腫瘍であり、この種において報告されている口腔腫瘍の60%以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、この低い転移の発生率は、単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているにすぎないと思われる。これらの腫瘍は、主にネコの口腔の解剖学的形状のため、通常は手術できない。現在、この腫瘍に関する有効な治療法はない。研究に入る前に、各々のネコは、完全な臨床検査、生体組織検査を受け、コンピュータ断層撮影(CT)によってスキャンする。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研究から排除した。この舌はその腫瘍のために麻痺し、治療でこの腫瘍を殺したとしても、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを、長期に渡って繰り返し治療する。治療期間中は、腫瘍の写真を毎日撮影し、それを各撮影後に再チェックする。治療の後、各ネコに再度CTスキャンを施した。CTスキャン及びラジオグラフは、その後8週間ごとに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上及び/又は生存期間の延長を必要とする。
さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらのイヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は、動物におけるこの型の腫瘍の希な発症によって制限される。
【0157】
H.候補薬についてのスクリーニングアッセイ
候補薬に関するスクリーニングアッセイは、ここで同定されたポリペプチドのレセプターと競合的に結合、或いは複合体形成する化合物、或いはそのようなレセプターを通じてのその他のシグナルを同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイには、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイが含まれ、それらを、特に小分子候補薬の同定を適したものにする。考えられる小分子には、抗体合成有機又は無機化合物が含まれ、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、(ポリ)ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。アッセイには、種々の形式で実施でき、その形式には、この分野で良く特徴付けられた、タンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイが含まれる。
【0158】
結合アッセイでは、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離、或いは反応混合物中で検出できる。特別な実施態様では、ここで同定された遺伝子にコードされているポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有結合によって固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、概して、固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることによって完成する。あるいは、固定化されるべきポリペプチドに対して特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。このアッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面へ検出可能なラベルで標識されてよい非固定化成分を添加することによって実施される。反応が完了すると、未反応成分を、例えば洗浄によって除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能なラベルを有している場合には、表面に固定化されたラベルの検出は、複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分がラベルを持たない場合には、複合体形成は、例えば、固定化された複合体と特異的に結合する標識抗体によって検出することができる。
【0159】
候補化合物が相互作用するものの、特定のレセプターと結合しない場合には、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイには、架橋、同時免疫沈降、並びにグラジエント又はクロマトグラフィーカラムを通す同時精製などの伝統的な手法が含まれる。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)]に開示されているような、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)]が示している酵母菌ベースの遺伝子系を用いることによってモニターすることができる。酵母菌GAL4などの多くの転写アクチベータは、2つの物理的に別々のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2-ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインと融合し、他方では候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインと融合する、2つのハイブリッドタンパク質を用いる。GAL4活性化プロモーターの制御下でのGAL1-lacZリポーター遺伝子の発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。2-ハイブリッド技術を用いた、2つの特定のタンパク質間におけるタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【0160】
I.製薬組成物
本発明のポリペプチド、ここで同定したタンパク質と特異的に結合するアゴニスト抗体、並びにここで開示したスクリーニングアッセイによって同定された他の分子は、癌を含む腫瘍の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
抗体断片が用いられる場合には、標的タンパク質の結合ドメインと特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列と結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき及び/又は組換えDNA技術によって生成できる(例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993])。
また、ここでの製剤は、治療される特定の徴候に必要な1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば細胞毒性薬、サイトカイン、化学治療薬、又は成長阻害剤等のその機能を向上させる薬剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的にとって有効な量での組み合わせで存在する。
【0161】
ここで同定されるポリペプチド、又はそれらのアゴニストの治療用製剤は、親油性製剤或いは水性溶液の形態で、所望される程度の純度を持つ活性成分を任意の製薬的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって調製されて保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる服用量及び濃度では受容者にとって非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンズアルコニウムクロライド;ベンズエトニウムクロライド;フェノール;ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)及び/又はトゥイーン(TWEEN)(商品名)、プルロニクス(PLURONICS)(商品名)、及びポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0162】
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量での組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術、或いは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
治療的抗体組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバッグ又はバイアルに入れられる。
【0163】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例には、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(D)-3-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下、並びに起こり得る免疫原性の変化をもたらす。関与している機構に依存する安定化に関して、合理的な方法を工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S-S結合形成であると見出された場合には、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、並びに特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成され得る。
【0164】
J.治療方法
抗体、ペプチド及び小分子アゴニストを含む、本発明のポリペプチド並びにそれらのアゴニストを、種々の腫瘍、例えば癌の治療に用いてもよい。治療される状態又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍(例えば、腎臓(renal)、肝臓、腎臓(kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、胸腺、肝癌(hepatic carcinoma);肉腫;膠芽細胞腫;及び種々の頭部及び頸部の腫瘍);白血病及びリンパ悪性疾患;ニューロン、グリア、星状、視床下部及び腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔疾患などの疾患;及び炎症、脈管形成及び免疫学的疾患が含まれる。本発明の抗腫瘍剤(ここに開示したポリペプチド及びそれらの活性に類似したアゴニスト、例えば抗体、ペプチド及び有機小分子を含む)は、周知の方法、例えば、ボーラスとして、又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、或いは筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、眼内、動脈内、病巣内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などによって、哺乳動物、好ましくはヒトへ投与される。
【0165】
他の治療的養生法を、本発明の抗癌剤の投与に組み合わせてもよい。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は、放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法、並びに服用スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者によって経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法、並びに服用スケジュールは、Chemotherapy Service, M.C. Perry編, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤の投与に先立って、又はそれに続いて投与してもよく、或いはそれと同時に投与してもよい。本発明の抗癌剤は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物、或いはオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)の既知の服用量との組み合わせてもよい。
【0166】
また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又は血管内皮因子(VEGF)に結合する抗体を投与することも好ましい。あるいは、或いは更には、同じ、又は二つ以上の異なる癌関連抗原と結合する二つ以上の抗体を、患者へ同時投与してもよい。時には、患者にサイトカインを投与することも有益である。好ましい実施態様では、ここでの抗癌剤は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まずは成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗癌剤を投与する。しかしながら、同時投与、或いは本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な服用量は、現在用いられている量であり、この成長阻害剤とここでの抗体との組み合わせ(相乗)効果により減少させることが可能である。
【0167】
疾患の予防又は治療のための、ここでの抗腫瘍剤の適切な服用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止或いは治療目的で薬剤が投与されるのか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、並びに主治医の裁量によって決まる。薬剤は、一回、又は一連の治療を通して、患者へ適切に投与される。動物実験は、ヒトの治療に有効な服用量を決定するための信頼性のある指針を提供する。有効な服用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti J.及びChappell. W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら編, Pergamon Press, New York 1989, 42-49に主張されているような原理に従って実施することができる。
【0168】
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、例えば、1又はそれ以上の分離投与によるか、又は連続注入によるかに関わらず、約1μg/kgから15mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)の抗腫瘍剤が、患者への投与の最初の候補容量である。典型的な1日の服用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kg以上であろう。数日又はそれより長きに渡る繰り返し投与では、状態に応じて、望ましい病徴の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の服用量計画が有益である可能性もある。この治療の進展は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。特に服用量及び送達方法に対する指針は、文献に提供されている;例えば米国特許第4,657,760号、同5,206,344号又は同5,255,212号を参照のこと。異なる製剤形態が、異なる治療用化合物及び異なる疾患にとって有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
【0169】
K.製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤は本発明の抗腫瘍剤である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第2の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【0170】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【0171】
(実施例)
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、VAである。
【0172】
実施例1:新規なポリペプチド及びそれをコードするcDNAを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(必要ならば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。このESTデータベースには、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び独自に開発したデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)が含まれた。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の6フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードしない、70のBlastスコア(90の場合もある)又はそれ以上のこれら比較を、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、他の同定されたEST配列に関連するコンセンサスDNA配列を、phrapを用いて構築した。さらに、この得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(全てではない)BLAST又はBLAST-2及びpharpの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
【0173】
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRによって対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びにPROポリペプチドの完全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向PCRプライマーは、一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、たいていは約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は、通常は40−55bp長である。あるケースでは、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きい場合に、付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。完全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によってスクリーニングした。次いで、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一つを用いて対象である遺伝子をコードするクローンを単離するために、ポジティブライブラリを使用した。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、例えばInvitrogen, San Diego, CA等の市販試薬を用いて、標準的な方法によって作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【0174】
実施例2:シグナルアルゴリズム分析を用いたcDNAクローンの単離
ジェネンテク,インク(サウス サンフランシスコ,カリフォルニア)が独自に開発した配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び/又は個人の(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc.,Palo Alto, CA)データベースから集団化し組み立てられたEST断片だけでなくESTsへ適用することで、種々のポリペプチド-コード化核酸配列を同定した。このシグナル配列アルゴリズムは、検討中の配列又は配列断片の5’末端にある一番目、あるいは二番目のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの特徴に基づく分泌シグナルスコアを計算する。一番目のATGに続くヌクレオチドには、停止コドンを持たない少なくとも35の明白なアミノ酸がコードされていなければならない。一番目のATGが必須のアミノ酸を有する場合、二番目のものは検討しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけない。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、分泌シグナルに関連することが知られている7つのセンサー(評価パラメータ)の一組を用いて、ATGコドンを取り囲むDNA及び対応するアミノ酸配列にスコアをつけた。このアルゴリズムを利用することで、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【0175】
実施例3:ヒトPRO943をコードするcDNAクローンの単離
コンセンサスDNA配列を、上記の実施例1に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に関連して組み立て、ここでDNA36360と命名した。幾つかの場合には、DNA36360は、上記で議論したEST配列のソースを用いて可能な限りそのコンセンサス配列の中間体を伸張させるためのBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸張させたコンセンサス配列の中間体に由来する。
DNA36360コンセンサス配列に基づいて、1)PCRによって対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO943のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは、一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、たいていは約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は、通常は40−55bp長である。あるケースでは、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きい場合に、付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。完全長クローンに関して幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によってスクリーニングした。次いで、プローブオリゴヌクレオチドとプライマー対の一つを用いて対象である遺伝子をコードするクローンを単離するために、ポジティブライブラリを使用した。
【0176】
PCRプライマーの対(正及び逆)を合成した:
正方向PCRプライマー:5'-CGAGATGACGCCGAGCCCCC-3'(配列番号:7)
逆方向PCRプライマー:5'-CGGTTCGACACGCGGCAGGT G-3'(配列番号:8)
さらに、合成オリゴヌクレオチドバイブリダイゼーションプローブは、以下の核酸配列を持つDNA36360配列から作成した:
バイブリダイゼーションプローブ:
5'-TGCTGCTCCTGCTGCCGCCGCTGCTGCTGGGGGCCTTCCCGCCGG-3'
(配列番号:9)
【0177】
cDNAライブラリの構築のためのRNAを、ヒト胎児脳組織から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、例えばInvitrogen, San Diego, CA等の市販試薬を用いて、標準的な方法によって作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO943の完全長DNA配列(ここでDNA52192−1369と命名される[Fig1、配列番号:1])並びにPRO943の誘導タンパク質配列を与えた。
【0178】
上記において同定された完全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置150−152に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置1662−1664の停止コドンで終端する(Fig1、配列番号:1)。予測されるポリペプチドは504アミノ酸長であり(Fig2)、約54,537ダルトンの見積もられた分子量及び約10.04のpIを有する。Fig2(配列番号:2)に示す完全長PRO943配列の分析は、Fig2に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在を明らかにし、これら重要なポリペプチドドメインの位置として定められたものは、おおよそ上記に示す通りである。Fig2に示す完全長PRO943配列の分析によって、以下の存在が明らかとなった:約アミノ酸1〜約アミノ酸17のシグナルペプチド;約アミノ酸376〜約アミノ酸396の膜貫通ドメイン、約アミノ酸212〜約アミノ酸220及び約アミノ酸329〜約アミノ酸337のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸111〜約アミノ酸115、約アミノ酸231〜約アミノ酸235、約アミノ酸255〜約アミノ酸259及び約アミノ酸293〜約アミノ酸297の潜在的N-グリコシル化部位:並びに約アミノ酸219〜約アミノ酸237の免疫グロブリン及びMHCタンパク質配列相同ブロック。クローンDNA52192−1369は1998年7月1日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203042が付与されている。
【0179】
Fig2(配列番号:2)に示す完全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析によって、PRO943アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:B49151, A39752, FGR1_XENLA, S38579, RATHBFGFRB_1, TVHU2F, FRG2_MOUSE, CEK3_CHICK, P_R21080及びA27171_1との間の配列同一性が明らかになった。
【0180】
実施例4: ヒトPRO1250をコードするcDNAクローンの単離
上記の実施例2に記載のシグナル配列アルゴリズムを使用することで、IncyteESTクラスター配列番号56523と命名したIncyteデータベースからのESTクラスター配列の同定がなされた。次いで、この配列を、上記のシグナルアルゴリズムの下で記載されている種々のEST DNAデータベースと比較し、更にIncyte EST 3371784の同定がなされた。このEST配列に相当する完全長クローンの更なる試験とシークエンシングによって、完全長DNA配列DNA60775−1532(Fig3、配列番号:3)、及び誘導PRO1250天然配列タンパク質(Fig4、配列番号:4)の単離がなされた。
【0181】
クローンDNA60775−1532(配列番号:3)は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置74−76に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2291−2293の停止コドンで終端する(Fig3)。予測されるPRO1250ポリペプチド前駆体(配列番号:4)は、739アミノ酸長である(Fig3)。Fig4に示した完全長PRO1250タンパク質は、約82,263ダルトンの推定分子量及び約7.55のpIを有する。PRO1250ポリペプチド(配列番号:4)の分析によって、以下の存在が明らかとなった:約アミノ酸61から約アミノ酸80のII型膜貫通ドメイン、約アミノ酸314から約アミノ酸326の推定AMP-結合ドメインシグネイチャー配列、並びに約アミノ酸102から約アミノ酸106、約アミノ酸588から約アミノ酸594、及び約アミノ酸619から約アミノ酸623の潜在的なN-グリコシル化部位。DNA60775−1532(配列番号:3)を含むcDNAクローンは、1998年9月1日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203173が付与された。
【0182】
実施例5: ヒトPRO1337をコードするcDNAの単離
上記の実施例1に記載の方法を使用することで、単一のIncyteESTが同定され(配列番号:1747546)、更にここで「DNA4417」と称された。コンセンサス配列を構築するために、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、DNA4417配列を、上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。コンセンサス配列はここで「DNA45669」と命名した。DNA45669コンセンサス配列に基づいて、1)PCRによって対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、並びに2)PRO1337の完全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正及び逆)を合成した:
正方向PCRプライマー45669.f1:
5'-CAACCATGCAAGGACAGGGCAGG-3' (配列番号:10)
正方向PCRプライマー45669.f2:
5'-CTTTGCTGTTGGCCTCTGTGCTCCCAACCATGCAAGGACAGGGCAGG-3'
(配列番号:11)
逆方向PCRプライマー45669.r1:
5'-TGACTCGGGGTCTCCAAAACCAGC-3'(配列番号:12)
逆方向PCRプライマー45669.r2:
5'-GGTATAGGCGGAAGGCAAAGTCGG-3' (配列番号:13)
加えて、合成オリゴヌクレオチドバイブリダイゼーションプローブは、以下のヌクレオチド配列を持つコンセンサスDNA45669配列から作成した。
バイブリダイゼーションプローブ45669.P1:
5'-GGCATCTTACCTTTATGGAGTACTCTTTGCTGTTGGCCTCTGTGCTCC-3'
(配列番号:14)
【0184】
完全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリのDNAを、上記で同定したPCRプライマー対によるPCR増幅でスクリーニングした。次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いて、PRO1337遺伝子をコードするクローンを単離するために、ポジティブライブラリを使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNAシークエンシングによって、PRO1337の完全長DNA配列(ここでDNA66672−1586と命名[Fig5、配列番号:5]);並びにPRO1337の誘導タンパク質配列が得られた。
【0185】
PRO1337の全コード化配列をFig5(配列番号:5)に示す。クローンDNA66672−1586は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置60−62に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1311−1313に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は417アミノ酸長である。Fig6に示した完全長PRO1337タンパク質は約46,493ダルトンの推定分子量及び約9.79のpIを有する。
PRO1337ポリペプチド(配列番号:6)の分析によって以下の存在が明らかとなった:約アミノ酸1から約アミノ酸20のシグナルペプチド;約アミノ酸101から約アミノ酸105、及び約アミノ酸390から約アミノ酸394のN-グリコシル化部位;約アミノ酸377から約アミノ酸385のチロシンキナーゼリン酸化部位;並びに約アミノ酸7から約アミノ酸13、約アミノ酸97から約アミノ酸103、約アミノ酸326から約アミノ酸332、並びに約アミノ酸363から約アミノ酸369のN-ミリストイル化部位。
【0186】
Fig6(配列番号:6)に示す完全長配列のWU−BLAST2配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析によって、
PRO1337のアミノ酸配列と以下のDayhoff配列THBG_HUMANとの間の有意な相同性が明らかにされた。また、相同性はPRO1337アミノ酸配列と次のDayhoff配列:KAIN_HUMAN, HSACT1_1, IPSP_HUMAN, G02081, HAMHPP_1, CPI6_RAT, S31507, AB000547_1, 及びKBP_MOUSEの間に見いだされた。
クローンDNA60775−1532は、1998年9月22日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203265が付与された。
【0187】
実施例6:インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定mRNA合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、PCR生成33P-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。[33P]UTP-標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
【0188】
33P-リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P-UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P-UTPを含む管に以下の成分を添加した:
2.0μlの5x転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 10μ; 10mMのGTP, CTP & ATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRNAsin
1.0μlのDNAテンプレート(1μg)
1.0μlのH
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS, T7=S,通常)
【0189】
管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMICROCON-50(商品名)限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR II(商品名)で数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1−3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。ゲルをプラスチックラップ(SARAN(商品名)ブランド)でラップし、−17℃のフリーザー内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0190】
33P-ハイブリダイゼーション
A.凍結切片の前処理
スライドをフリーザーから取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
B.パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、SQ HO中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
【0191】
C.プレハイブリッド化
スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリダイゼーションバッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ HO)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ HOを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
D.ハイブリダイゼーション
スライド当たり1.0x10cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
【0192】
E.洗浄:
洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2x10分間、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、V=4L)。
F.オリゴヌクレオチド
ここに開示したDNA配列の二つについてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである:
(1)DNA52192−1369
D-269E FGFrp1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTGACCATGTGGACCAAGG-3'
(配列番号:15)
C-257I FGFrp2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCTGGCAGCACGGTGAGGAAG-3'
(配列番号:16)
【0193】
G.結果
ここに開示した上記のDNA配列に関して、インサイツ分析を実施した。これらの分析の結果は次の通りである:
DNA52192−1369(FGFレセプター様分子)
発現は、胎児骨格筋と長骨軟骨組織に観察された。他の箇所と同じく、相対的に高いバッググラウンドシグナルは問題である。一つの胎児肝臓では、発現は、増結部位において生じるように思われる。検査した胎児組織(E12−E16週)には、胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊椎、体壁、骨盤、及び下肢が含まれた。検査した成人ヒト組織には、肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、腎細胞癌、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢が含まれた。アセトアミノフェンは、肝臓障害及び肝硬変を誘導した。検査したアカゲザル組織二は、大脳皮質(rm)及び海馬(rm)が含まれた。検査したチンパンジー組織には、甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃粘膜及び唾液腺が含まれた。
【0194】
実施例7:ハイブリダイゼーションプローブとしてのPROの利用
以下の方法は、PROをコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての利用を示している。
ここに開示されている完全長又は成熟PROをコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの相同的なDNA(PROの天然発生変異体をコードするもの等)のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
どちらかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリダイゼーション及び洗浄を、次の高緊縮性条件下において実施する。PROポリペプチドをコードする遺伝子から誘導された放射標識プローブフィルターへのハイブリダイゼーションを、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中において42℃で20時間実施する。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDS水溶液中において42℃で実施する。
次いで、この分野で知られている標準的技術を用いて、完全長天然配列をコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAを同定することができる。
【0195】
実地例8:大腸菌におけるPROの発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるPROの非グリコシル化型の調製を例証する。
選択したPCRプライマーを利用して、DNA配列コード化を最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。種々の発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含むpBR322(大腸菌由来;Bolivarら, Gene, 2:95 (1997)を参照のこと)がある。このベクターを制限酵素によって消化し、脱リン酸化する。次いで、PCR増幅配列をベクターへライゲーションする。このベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリHisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリHisリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PROコード領域、ラムダ転写集結因子及びargU遺伝子をコードする配列を含む。
【0196】
次いで、Sambrookら, 上記に記載されている方法を用いて、このライゲーション混合物を選択した大腸菌株を形質転換するために利用した。形質転換体をLBプレート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。制限分析及びDNA配列決定によって、プラスミドDNAを単離し、確認することができる。
選択したクローンを、抗生物質で補填されたLBブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。次いで、この一晩の培養を、より大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間、細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したPROタンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において、金属キレート化カラムを用いて精製することが可能である。
【0197】
以下の手法を用いて、ポリ−Hisタグ形態でPROを大腸菌で発現させてもよい。選択したPCRプライマーを用いて、PROをコードするDNAを最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、そしてエンテロキナーゼによるタンパク質分解的除去を提供する他の有用な配列を含む。次いで、PCR増幅を施したポリ-Hisタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体を、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中で、30℃で振盪しながら3−5のOD600に達するまで成長させる。次いで、培養液を50−100倍希釈してCRAP培地(3.57gの(NHSO、0.71gのクエン酸ナトリウム・2HO、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSOの混合で調製)とし、そして30℃で振盪によって約20−30時間成長させる。SDS-PAGEによって発現を確認するために試料を取り出し、この大量培養液を遠心分離して細胞がペレットとなるようにする。精製及びリフォールディング(再折りたたみ)まで、細胞ペレットを凍結する。
【0198】
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)の大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁する。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを、各々の最終濃度が0.1M及び0.02Mとなるように添加し、この溶液を4℃で終夜に渡って撹拌する。この工程によって、すべてのシステイン残基が亜硫酸によりブロックされた変性タンパク質が生じる。この溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮する。その上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターで濾過して透明にする。この透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化した5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷する。このカラムを、50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄する。タンパク質を、250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する分画をプールし、4℃で保存する。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて、280nmにおけるその吸収によって見積もった。
【0199】
試料を20mMトリス、pH8.6、0.3M NaCl、2.5M尿素、5mMシステイン、20mMグリシン及び1mMEDTAからなる新たに調製した再生バッファーで徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択する。このリフォールディング溶液を4℃で12−36時間ゆっくりと撹拌する。リフォールディング反応は、TFAを最終濃度が0.4%(約3のpH)となるように添加することにより停止させる。タンパク質の更なる精製の前に、この溶液を0.22ミクロンフィルターで濾過し、アセトニトリルを最終濃度が2−10%となるように添加する。再生したタンパク質を、10〜80%のアセトニトリルのグラジエントによる溶離をともなう0.1%TFAの移動バッファーを使用して、Poros R1/H逆相カラムによるクロマトグラフにかける。A280吸収を持つ分画のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同的な再生タンパク質を含有する分画をプールする。一般的に、殆どのタンパク質の正確に再生した種は、逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているその疎水性内面によってこれらの種が最もコンパクトであるので、最低濃度のアセトニトリルで溶離される。凝集した種は、通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。誤って再生したタンパク質の形態を所望の形態から分離するのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
【0200】
所望の再生したPROポリペプチドを含有する分画をプールし、溶液へ穏やかな窒素の弱い気流を当てることでアセトニトリルを除去した。透析、或いは調製バッファーで平衡化し、無菌濾過されたG25Superfine(Pharmacia)樹脂によるゲル濾過によって、タンパク質を0.14M 塩化ナトリウム及び4%マンニトールを含む20mMのHepes、pH6.8に調製した。
ここで開示された多くのPROポリペプチドは、上記の方法によって成功裏に発現した。
【0201】
実施例9:哺乳動物細胞におけるPROの発現
この実施例は、哺乳動物細胞での組み換え発現によるPROの潜在的なグリコシル化形態の調製を例証する。
発現ベクターとしては、ベクターpRK5(1989年3月15日公開のEP307,247参照)を用いる。場合によっては、上記のSambrook等に記載のようなライゲーション方法を用いて、選択した制限酵素でPRO DNAをpRK5とライゲーションし、PRODNAの挿入を可能にする。
【0202】
一実施態様では、選択宿主細胞を293細胞にしてもよい。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)を、ウシ胎児血清、そして場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質で補ったDMEMなどの培地中の組織培養プレートで、集密化するまで成長させる。約10μgのpRK5-PRODNAを、約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA[Thimmappayaら, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μlの1mM トリス-HCl、0.1mM EDTA、0.227M CaClに溶解する。この混合物に、滴状の500μlの50mM HEPES(pH7.35)、280mM NaCl、1.5mM NaPOを添加し、25℃で10分間に渡って、析出物を形成させる。この析出物を懸濁して293細胞に加え、37℃で約4時間に渡って定着させた。培地を吸引し、2mlの20%グリセロールのPBSを30秒間で添加した。次いで、この293細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加して細胞を約5日間に渡ってインキュベートした。
【0203】
形質移入後のの約24時間には、培養培地を除去し、培養培地(のみ)或いは200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培地で置換した。12時間のインキュベーションの後には、培養上清を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに負荷する。この処理したゲルを乾燥し、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間に渡ってフィルムにさらす。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施してもよく(無血清培地で)、この培地を選択されたバイオアッセイで試験する。
【0204】
これに換わる技術としては、Somparyacら, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて、PROを293細胞へ過度的に導入してもよい。293細胞を、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5-PRODNAを添加する。この細胞を、まずは遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮し、PBSで洗浄する。DNA-デキストラン沈殿物を、細胞ペレット上で4時間に渡ってインキュベートする。この細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン、及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、培養上清を遠心分離し、濾過して細胞及び細胞片を除去した。次いで、任意の透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって、発現したPROを含む試料を濃縮し、精製することができる。
【0205】
他の実施態様では、PROをCHO細胞で発現させることができる。CaPO又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いて、pRK5-PROをCHO細胞へ形質移入することができる。上記に記載のように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地と置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地と置換してもよい。好ましくは、この培養を約6日間インキュベートし、次いで培養上清を収集する。次いで、発現したPROを含む培地を、濃縮して任意の選択した方法によって精製することができる。
【0206】
また、エピトープタグPROを、宿主CHO細胞で発現させてもよい。PROをpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物を、PCRを施してポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグとのフレームとしてバキュロウイルス発現ベクターへ融合できる。ポリ-hisタグPRO挿入物を、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現したポリ-hisタグPROを含む培地は、次いで濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製できる。
またPROは、一過性発現法によってCHO及び/又はCOS細胞で、他の安定な発現方法によってCHO細胞で発現させてもよい。
CHO細胞における安定な発現は、以下の方法を用いて実施された。タンパク質を、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列(例えば、細胞外ドメイン)がヒンジ、CH2及びCH2ドメイン及び/又はポリ-Hisタグ形態を含むIgG1定常領域配列へ融合しているIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現させる。
【0207】
PCR増幅に続いて、Ausubelら, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載のような標準的技術を用いて、それぞれのDNAをCHO発現ベクターにサブクローニングする。CHO発現ベクターを、対象とするDNAの5’及び3’に適合する制限部位を有し、cDNAの簡便にシャトル化ができるように作成する。CHO細胞での発現に利用されるベクターは、Lucasら, Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようなものであり、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持に関する選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)を使用して、約1千万のCHO細胞に導入する。この細胞を、上記のLucas等に記載されているように成長させる。下記に記載のような更なる成長及び生産のために、約3x10の細胞をアンプルで凍結する。
【0208】
このプラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配することで解凍し、ボルテックスによって混合する。内容物を10mLの媒質を含む遠心管へピペットし、1000rpmで5分間遠心分離する。その上清を吸引し、細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加)に懸濁する。次いで、この細胞を90mLの選択培地を含む100mLスピナーに分ける。1−2日後、細胞を150mLの選択培地で満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートする。2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x10細胞/mLで播種する。遠心分離及び生産培地での再懸濁によって、細胞培地を新鮮な培地で交換する。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載されている生産培地を使用してもよい。3Lの生産スピナーを1.2x10細胞/mLで播種する。0日目に、細胞数とpHを測定する。1日目に、スピナーから試料採取し、濾過空気での散布を実施する。2日目に、スピナーから試料採取し、温度を33℃に変え、30mLの500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)を使用する。生産を通して、7.2近傍に維持するために、必要ならばpHを調節する。10日後、或いは生存率が70%を下回るまで、細胞培養を遠心分離で回収して0.22μmフィルターで濾過する。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムへ負荷する。
【0209】
ポリ-Hisタグ作成物に関しては、タンパク質をNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを培養上清へ5mMの濃度まで添加した。この培養上清を、0.3M NaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes,pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムへ4−5ml/分の流速で4℃でポンプ供給した。負荷後、このカラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーでタンパク質を溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて25mlのG25 Superfine(Pharmacia)で、10mM Hepes、0.14M NaCl及び4%マンニトール,pH6.8を含む貯蔵バッファーへ脱塩し、−80℃で貯蔵した。
【0210】
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を、以下のようにして培養上清から精製する。この培養上清を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー,pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)へポンプ注入する。負荷後、100mMのクエン酸,pH3.5で溶離する前に、このカラムを平衡バッファーで強く洗浄する。275μLの1Mトリスバッファー,pH9を含む管に1mlの分画を回収することによって、溶離したタンパク質を即座に中和する。高度に精製されたタンパク質は、続いて、ポリ−Hisタグタンパク質に関して上記に記載した貯蔵バッファーで脱塩する。その均一性は、SDSポリアクリルアミドゲル、及びエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定によって評価する。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが,上記に記載のようにして成功裏に発現した。
【0211】
実施例10:酵母菌でのPROの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROポリペプチドの組換え発現を示す。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROの細胞内生産又は分泌のために、酵母菌発現ベクターを作成する。PROポリペプチドをコードするDNA及びプロモーターを、選択したプラスミドの適切な制限酵素部位に挿入してPROポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROをコードするDNAを、選択したプラスミドへ、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、天然PROシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌α因子又はインベルターゼ分泌シグナル/リーダー配列、並びに(必要ならば)PROの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
【0212】
酵母菌株AB110等の酵母菌を、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降、並びにSDS−PAGEによる分離に続くクマシーブルー染色によるゲルの染色によって分析することができる。
続いて、遠心分離と続く選択したカートリッジフィルターを用いての培地の濃縮によって、発酵培地から酵母菌細胞を取り除くことで、組換えPROポリペプチドを単離そして精製できる。選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いて、PROポリペプチドを含む濃縮物をさらに精製してもよい。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが、上記のようにして成功裏に発現された。
【0213】
実施例11: バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるPROの組換え発現を記載する。
PROコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグには、ポリ-hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)が含まれる。pVL1393(Navagen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む、種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PRO又はPROコード配列の所定部分(例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列、或いはタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列など)が、5’及び3’領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
【0214】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時トランスフェクションすることによって作成される。28℃で4−5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilleyら, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施される。
【0215】
次に、発現されたポリ-hisタグPROは、例えばNi2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーによって、次のようにして精製できる。抽出は、Rupertら, Nature, 362:175-179 (1993)に記載のように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製する。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes,pH7.9;12.5mMのMgCl;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)で再懸濁し、氷上で2回ずつ20秒間超音波処理する。この超音波処理物は、遠心分離によって透明にし、その上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈して0.45μmフィルターで濾過する。Ni2+-NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄して25mLの負荷バッファーで平衡化する。濾過した細胞抽出物を、毎分0.5mLでこのカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる地点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、このカラムを、非特異的に結合しているタンパク質を溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄した。A280のベースラインに再度到達した後、このカラムを二次洗浄バッファーでの0から500mMイミダゾールのグラジエントで展開した。1mLの分画を回収し、SDS-PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に共役させたNi2+-NTAによるウェスタンブロットで分析する。溶離したHis10-タグPROを含む分画をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したPROポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【0216】
実施例12: PROに結合する抗体の調製
この実施例は、実質的には他のどんなポリペプチド又はポリペプチドエピトープにも結合せず、PROポリペプチド又はPROペプチド上のエピトープと特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原には、精製PROポリペプチド、PROポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROポリペプチドを発現する細胞が含まれる。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をせずにおこなうことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化して1−100マイクログラムの量で皮下又は腹腔内へ注入したPRO免疫原によって免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ)で乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。この免疫化したマウスを、次いで10から12日後に、選択したアジュバントで乳化した付加的免疫源によって追加免疫する。その後、数週間に渡って、このマウスをさらなる免疫注射で追加免疫する。抗PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するレトロオービタル出血によって、血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【0217】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に対して「ポジティブ(陽性)」な動物へPROの最後の静脈内注射をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで、脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させる。そして、融合によって、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔くことができるハイブリドーマ細胞の生成が可能となり、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖が阻害される。
ハイブリドーマ細胞は、PROに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。PROに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ(陽性)」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることができる。
【0218】
実施例13: 特異的抗体を用いたPROポリペプチドの精製
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製され得る。例えば、プロ-PROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-PROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr-活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
【0219】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞の画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加、或いはこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞、又は細胞成分画分の可溶化によって誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地に有用な量で分泌され得る。
可溶化PROポリペプチド含有調製物を、免疫親和性カラムへ貫流させ、PROポリペプチドの好ましい吸着を可能にする条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)でカラムを洗浄する。次いで、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)でカラムを溶離し、PROポリペプチドを回収する。
【0220】
実施例14: 薬物スクリーニング
本発明は、任意の種々の薬物スクリーニング技術において、PROポリペプチド、或いはその結合断片を利用することによって、化合物のスクリーニングのために特に有用である。そのような試験に用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、或いは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法では、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸によって安定に形質転換される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質転換細胞に対して、競合的結合アッセイによってスクリーニングされる。生存可能又は固定化形態のいずれかによって、このような細胞は標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間の複合体の形成を測定してよい。あるいは、試験される試薬によって生じるPROポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成の減少を調べることができる。
【0221】
従って、本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えることのできる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、そのような試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、或いは(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について、検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、概して、PROポリペプチド又は断片が標識される。適切なインキュベーションの後、遊離型のPROポリペプチド又は断片が結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する、或いはPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【0222】
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適した結合親和性を有する化合物に関する高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に公開されたWO84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体、或いは幾つかの他の表面上で合成される。PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPROポリペプチドは、この分野で良く知られた方法によって検出される。精製したPROポリペプチドを、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PROポリペプチドとの結合が可能な中和抗体が、PROポリペプチド又はその断片との結合に関して、試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイを考慮する。この方法では、PROポリペプチドと一つ又は複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出することに使用することができる。
【0223】
実施例15: 合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)或いはそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、PROポリペプチドのより活性があって安定な形態の、或いはインビボでPROポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991))。
【0224】
1つの方法では、PROポリペプチド、又はPROポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、X線結晶学によって、コンピュータモデル化によって、最も典型的には2つの方法の組み合わせによって決定される。分子の構造を解明し、活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合では、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例としては、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、或いはAthaudaら,J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【0225】
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。この方法によって、原理的には、それに続く薬剤設計が準拠することのできるファーマコア(pharmacore)が生成される。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体(抗-ids)を生成することによって、タンパク質結晶学を完全にバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。次いで、抗-idは、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、X線結晶学のような分析実験を実施するために十分な量のPROポリペプチドが入手可能である。その上、ここで提供したPROポリペプチドのアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【0226】
実施例16: インビトロ抗腫瘍アッセイ
PRO943、PRO1250、及びPRO1337ポリペプチドの抗増殖活性を、基本的にはSkehan等, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112(1990)によって記載されているスルホローダミンB(SRB)染色結合アッセイを使用して、国立ガン研究所(NCI)の治験疾患指向インビトロ抗ガン薬発見アッセイで決定した。この研究で使用した60の腫瘍細胞株(「NCIパネル」)と同様にインビトロでのそれらの維持と培養に関する条件は、Monks等, J. Natl. Cancer Inst., 83:757-766 (1991)によって記載されている。このスクリーニングの目的は、異なったタイプの腫瘍に対して試験化合物の細胞障害及び/又は細胞分裂停止活性を初期に評価することである(上掲のMonks等;Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10):1-12[1989])。
【0227】
およそ60のヒト腫瘍細胞株由来の細胞をトリプシン/EDTA(Gibco)で収集し、一度洗浄し、IMEMに再懸濁させ、その生存度を決定した。細胞懸濁物をピペット(100μl容量)で別個の96ウェルのマイクロタイタープレートに加えた。過成長を防ぐため、6日のインキュべーションの細胞密度は、2日のインキュべーションのインキュベーションより少なかった。安定化のために、37℃での24時間のプレインキュベーション時間で播種が可能になった。意図した試験濃度の2倍希釈物が、時間ゼロの時点で、100μlの分割量でマイクロタイタープレートウェルに加えられた(1:2の希釈)。試験化合物を5倍半の対数希釈で評価した(1000から100,000倍)。インキュベーションは、5%のCO雰囲気及び100%湿度で、2日間及び6日間行われた。
【0228】
インキュべーション後、培地を取り除き、細胞を40℃で0.1mlの10%トリクロロ酢酸中に固定した。プレートを脱イオン水で5回洗浄し、乾燥させ、1%酢酸に溶解した0.1mlの0.4%スルホローダミンB染料(Sigma)で30分間染色し、1%酢酸で4回洗い流して未結合染料を取り除き、乾燥させ、0.1mlの10mMトリス塩基[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]、pH10.5で5分間で染色物を抽出した。492nmでのスルホローダミンBの吸光度(OD)を、コンピュータに接続した96ウェルのマクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は一回又は複数の濃度で、少なくとも40%の成長阻害効果を示すとポジティブと考えられる。結果を次の表7に示すが、そこでは腫瘍細胞型の省略記号は次の通りである:
NSCL=非小細胞肺ガン;CNS=中枢神経系
【0229】
Figure 0004280444
【0230】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア20110−2209米国(ATCC)に寄託した:
Figure 0004280444
【0231】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、何れが最初に来ようとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【0232】
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【0233】
Figure 0004280444
【0234】
Figure 0004280444

【図面の簡単な説明】
【Fig1】 配列番号:1が、ここにおいて「DNA52192−1369」と命名された天然配列PRO943cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:1)。
【Fig2】 Fig1に示す配列番号:1のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:2)。
【Fig3】 配列番号:3が、ここにおいて「DNA60775−1532」と命名された天然配列PRO1250cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:3)。
【Fig4】 Fig3に示す配列番号:3のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:4)。
【Fig5】 配列番号:5が、ここにおいて「DNA66672−1586」と命名された天然配列PRO1337cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:5)。
【Fig6】 Fig5に示す配列番号:5のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列(配列番号:6)。[0001]
(Field of Invention)
The present invention relates to methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth. In particular, the present invention relates to anti-tumor compositions and methods for treating tumors. The invention further relates to screening methods for identifying growth inhibitory, eg, anti-tumor compounds.
[0002]
(Background of the Invention)
Malignant tumors (cancers) are the second leading cause of death after heart disease in the United States (Boring et al., CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993]).
Cancer is derived from normal tissue and forms an abnormal or neoplastic cell that forms a tumor entity, invasion of adjacent tissue by these neoplastic tumor cells, and ultimately through the blood and lymphatic system Characterized by the generation of malignant cells that diffuse (metastasize) to local lymph nodes and distant sites. In a cancerous state, cells proliferate under conditions in which normal cells do not grow. Cancer itself manifests in a wide variety of forms characterized by different degrees of invasiveness and aggressiveness.
Despite recent advances in cancer therapy, there is a great need for new therapeutic agents that can inhibit neoplastic cell growth. Accordingly, an object of the present invention is to identify compounds that can inhibit the growth of tumor cells such as cancer cells.
[0003]
(Summary of Invention)
A. Embodiment
The present invention relates to methods and compositions for inhibiting tumor cell growth. More particularly, the present invention treats tumors, including breast cancer, prostate cancer, rectal cancer, lung cancer, ovarian cancer, kidney cancer and CNS cancer, leukemia, myeloma, etc. in mammalian patients, preferably humans. Relates to a method and a composition.
In one aspect, the invention relates to a composition of matter useful for inhibiting neoplastic cell growth comprising a PRO polypeptide as defined herein, or an agonist thereof, in admixture with a pharmaceutically acceptable carrier. . In a preferred embodiment, the composition of matter comprises a growth inhibitory amount of the PRO polypeptide, or agonist thereof. In another preferred embodiment, the composition comprises a cytotoxic amount of a PRO polypeptide, or agonist thereof. In some cases, the composition of matter may contain one or more growth inhibitory and / or cytotoxic and / or chemotherapeutic agents.
In a further aspect, the present invention relates to a composition of matter useful for treating a tumor in a mammal comprising an effective amount of a PRO polypeptide as defined herein, or an agonist thereof. This tumor is preferably cancer.
[0004]
In another aspect, the invention relates to a method of inhibiting tumor cell growth comprising exposing said tumor cells to an effective amount of a PRO polypeptide, or an agonist thereof, as defined herein. In a particular embodiment, the agonist is an anti-PRO agonist antibody. In other embodiments, the agonist is a small molecule that mimics the biological activity of a PRO polypeptide. This method is performed in vitro or in vivo.
In yet a further embodiment, the present invention provides:
(A) a container; and
(B) an article of manufacture comprising a composition containing an active agent contained in the container, the composition being useful for inhibiting neoplastic cell growth, eg tumor cell growth, in the composition And the active agent is a PRO polypeptide as defined herein, or an agonist thereof; and
(C) a container attached to the front container, or a package insert contained in the front container, which refers to the use of said PRO polypeptide, or an agonist thereof, in the growth inhibition of neoplastic cells, wherein the agonist is PRO It consists of an article of manufacture that will be an antibody that binds to the polypeptide. In a particular embodiment, the agonist is an anti-PRO agonist antibody. In other embodiments, the agonist is a small molecule that mimics the biological activity of a PRO polypeptide. Similar articles of manufacture that contain a PRO polypeptide as defined herein in an amount effective for the treatment of tumors are also encompassed within the scope of the invention. Also within the scope of the invention are articles of manufacture that contain a PRO polypeptide or an agonist thereof as defined herein and additionally contain additional growth inhibitors, cytotoxic agents or chemotherapeutic agents.
[0005]
B. Further embodiments
In another embodiment of the invention, the invention provides an isolated nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a PRO polypeptide.
In one aspect, the isolated nucleic acid molecule is (a) a PRO polypeptide DNA molecule, the full-length amino acid sequence disclosed herein, the amino acid sequence lacking the signal peptide disclosed herein, disclosed herein The extracellular domain of a transmembrane protein with or without a signal peptide, or a fragment of any of the specifically defined full-length amino acid sequences disclosed herein, or (b) the complement of the DNA molecule of (a) With at least about 80% sequence identity, alternatively at least about 81% sequence identity, alternatively at least about 82% sequence identity, or at least about 83% sequence identity. Or at least about 84% sequence identity, or at least about 85% sequence identity, or at least Have about 86% sequence identity, alternatively at least about 87% sequence identity, alternatively at least about 88% sequence identity, alternatively at least about 89% sequence identity, or at least about 90 % Sequence identity, or at least about 91% sequence identity, alternatively at least about 92% sequence identity, alternatively at least about 93% sequence identity, or at least about 94%. Have sequence identity, alternatively at least about 95% sequence identity, alternatively at least about 96% sequence identity, alternatively at least about 97% sequence identity, or at least about 98% sequence identity Nucleotides having at least about 99% sequence identity It contains the column.
[0006]
In another aspect, the isolated nucleic acid molecule comprises: (a) a DNA molecule comprising a cDNA encoding the full-length sequence of a PRO polypeptide disclosed herein, a signal sequence of a PRO polypeptide disclosed herein Of the extracellular domain of the transmembrane protein of the PRO polypeptide disclosed herein, with or without a signal sequence, or any of the specifically defined full-length amino acid sequences disclosed herein. A fragment, or (b) at least about 80% sequence identity, or at least about 81% sequence identity, or at least about 82% sequence identity to the complement of the DNA molecule of (a) Or at least about 83% sequence identity, or at least about 84% sequence identity, or less Also have about 85% sequence identity, alternatively at least about 86% sequence identity, alternatively at least about 87% sequence identity, alternatively at least about 88% sequence identity, or at least about 89% sequence identity, alternatively at least about 90% sequence identity, alternatively at least about 91% sequence identity, alternatively at least about 92% sequence identity, alternatively at least about 93% Having at least about 94% sequence identity, at least about 95% sequence identity, at least about 96% sequence identity, or at least about 97% sequence identity Have identity, or have at least about 98% sequence identity, or Even without comprising a nucleotide sequence having about 99% sequence identity.
[0007]
In a further aspect, the invention provides (a) a DNA molecule that encodes the same mature polypeptide encoded by any human cDNA disclosed herein and deposited with the ATCC, or (b) a DNA of (a) Have at least about 80% sequence identity to the complement of the molecule, alternatively at least about 81% sequence identity, alternatively at least about 82% sequence identity, or at least about 83% sequence Have at least about 84% sequence identity, at least about 85% sequence identity, at least about 86% sequence identity, or at least about 87% sequence identity Or at least about 88% sequence identity, or at least about 89% sequence identity Having at least about 90% sequence identity, alternatively having at least about 91% sequence identity, alternatively having at least about 92% sequence identity, or having at least about 93% sequence identity, Or at least about 94% sequence identity, alternatively at least about 95% sequence identity, alternatively at least about 96% sequence identity, alternatively at least about 97% sequence identity, or at least It relates to an isolated nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence having about 98% sequence identity or at least about 99% sequence identity.
[0008]
In yet another aspect, the invention provides a nucleotide sequence that encodes a PRO polypeptide that is either defective or inactivated in the transmembrane domain, or a nucleotide that encodes a PRO polypeptide complementary to such a nucleotide sequence. Provided are isolated nucleic acid molecules comprising sequences, the transmembrane domains of these polypeptides are disclosed herein. Accordingly, the soluble domains of the PRO polypeptides disclosed herein are contemplated.
[0009]
Other embodiments are, for example, as hybridization probes for an encoded fragment of a PRO polypeptide, or antisense oligonucleotide probe, optionally encoding a polypeptide comprising a binding site of an anti-PRO antibody. It relates to a PRO polypeptide coding sequence fragment or its complement that may find use. Such nucleic acid fragments are usually at least about 20 nucleotides in length, alternatively at least about 30 nucleotides in length, alternatively at least about 40 nucleotides in length, alternatively at least about 50 nucleotides in length, alternatively at least about 60 nucleotides in length. Or at least about 70 nucleotides, alternatively at least about 80 nucleotides, alternatively at least about 90 nucleotides, alternatively at least about 100 nucleotides, alternatively at least about 110 nucleotides, alternatively at least about 120 Nucleotide length, or at least about 130 nucleotide length, alternatively at least about 140 nucleotide length, alternatively at least about 150 nucleotide length, alternatively at least about 1 0 nucleotide length, alternatively at least about 170 nucleotide length, alternatively at least about 180 nucleotide length, alternatively at least about 190 nucleotide length, alternatively at least about 200 nucleotide length, alternatively at least about 250 nucleotide length Or at least about 300 nucleotides, alternatively at least about 350 nucleotides, alternatively at least about 400 nucleotides, alternatively at least about 450 nucleotides, alternatively at least about 500 nucleotides, alternatively at least about 600 Nucleotide length, or at least about 700 nucleotides length, alternatively at least about 800 nucleotides length, alternatively at least about 900 nucleotides length Beauty alternatively at least about 1000 nucleotides in length, wherein the term "about" means plus or minus 10% of the reference nucleotide sequence length of the reference length. A novel fragment of a PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence can be used to align a PRO polypeptide-encoding nucleotide sequence to other known nucleotide sequences using any of a number of well-known sequence alignment programs, Note that this can be routinely determined by determining whether the peptide-encoding nucleotide sequence fragment is novel. All such PRO polypeptide-encoding nucleotide sequences are contemplated herein. Also contemplated are PRO polypeptide fragments encoded by these nucleotide molecule fragments, preferably PRO polypeptide fragments comprising a binding site for an anti-PRO antibody.
[0010]
In another embodiment, the invention provides an isolated PRO polypeptide encoded by any of the isolated nucleic acid sequences identified above.
In one aspect, the invention provides an extracellular form of a transmembrane protein disclosed herein with or without a full-length amino acid sequence disclosed herein, a full-length amino acid sequence lacking a signal peptide disclosed herein, or a signal peptide. At least about 80% amino acid sequence identity, alternatively at least about 81% amino acid sequence identity, alternatively at least about 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% to a PRO polypeptide comprising a domain Amino acid sequence identity, or at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, alternatively at least about 86% amino acid sequence identity, alternatively at least about 87% amino acid sequence identity, or At least about 88% amino acid sequence identity Or at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% acid amino acid sequence identity, alternatively at least about 91% amino acid sequence identity, alternatively at least about 92% amino acid sequence identity, or at least about 93 % Amino acid sequence identity, or at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, alternatively at least about 96% amino acid sequence identity, or at least about 97% amino acid sequence identity Or an isolated PRO polypeptide comprising an amino acid sequence having at least about 98% amino acid sequence identity, or alternatively at least about 99% amino acid sequence identity.
[0011]
In a further aspect, the present invention provides at least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence encoded by any human protein cDNA deposited with the ATCC disclosed herein. Amino acid sequence identity, or at least about 82% amino acid sequence identity, alternatively at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, or at least about 85% amino acid sequence identity, or At least about 86% amino acid sequence identity, alternatively at least about 87% amino acid sequence identity, alternatively at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, or at least about 90% acid Amino acid sequence identity or low At least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92% amino acid sequence identity, alternatively at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, or at least about 95% amino acid. Amino acids having sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity, alternatively at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity and alternatively at least about 99% amino acid sequence identity It relates to an isolated PRO polypeptide comprising a sequence.
[0012]
In a particular aspect, the invention provides an isolated PRO polypeptide that does not have an N-terminal signal sequence and / or an initiation methionine, which is encoded by a nucleotide sequence that encodes such an amino acid sequence described above. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods are used to cultivate a host cell comprising a vector containing a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide. Recovering the PRO polypeptide from the culture.
Another aspect of the invention provides an isolated PRO polypeptide in which the transmembrane domain is deleted or the transmembrane domain is inactivated. Methods for producing it are also described herein, wherein these methods are used to cultivate a host cell comprising a vector containing a suitable encoding nucleic acid molecule under conditions suitable for expression of the PRO polypeptide. Recovering the PRO polypeptide from the culture.
[0013]
In yet another embodiment, the present invention relates to agonists of the natural PRO polypeptides identified herein. In certain embodiments, the agonist is an anti-PRO antibody or a small molecule.
In a further embodiment, the invention relates to a method for identifying an agonist for a PRO polypeptide comprising contacting the PRO polypeptide with a candidate molecule and monitoring biological activity mediated by said PRO polypeptide. Preferably, the PRO polypeptide is a native PRO polypeptide.
In yet a further embodiment, the invention relates to a composition of matter comprising a PRO polypeptide, or an agonist of a PRO polypeptide described herein, or an anti-PRO antibody in combination with a carrier. In some cases, the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier.
[0014]
Another embodiment of the invention is a PRO polypeptide, or an agonist thereof, or an anti-PRO as described above for the preparation of a medicament useful for the treatment of a condition responsive to a PRO polypeptide, an agonist thereof or an anti-PRO antibody. It relates to the use of antibodies.
In a further embodiment of the invention, the invention provides a vector comprising DNA encoding any of the herein described polypeptides. Host cells comprising any such vectors are also provided. By way of example, the host cell may be a CHO cell, E. coli, or baculovirus infected insect cell. Further provided is a production method for any of the polypeptides described herein, comprising culturing host cells under conditions suitable for expression of the desired polypeptide and recovering the desired polypeptide from the cell culture medium.
[0015]
In other embodiments, the invention provides chimeric molecules comprising any of the polypeptides described herein fused to a heterologous polypeptide or amino acid sequence. Examples of such chimeric molecules include any of the herein described polypeptides fused to an epitope tag sequence or an Fc region of an immunoglobulin.
In another embodiment, the invention provides an antibody that specifically binds to any of the above or below described polypeptides. In some cases, the antibody is a monoclonal antibody, a humanized antibody, an antibody fragment or a single chain antibody.
In yet another embodiment, the present invention provides oligonucleotide probes useful for the isolation of genomic and cDNA nucleotide sequences or antisense probes, which may be derived from any of the above or below nucleotide sequences. Good.
[0016]
Detailed Description of Preferred Embodiments
As used herein, the terms “PRO polypeptide” and “PRO” refer to various polypeptides immediately followed by a numerical sign, with the full sign (eg, PRO / number) described herein. Means a specific polypeptide sequence. The terms “PRO / number polypeptide” and “PRO / number” as used herein, where “number” is the actual numerical sign used herein, are native sequence polypeptides and variants (herein more detailed). Defined). The PRO polypeptides described herein may be isolated from a variety of sources, such as human tissue types or other sources, and may be prepared by recombinant or synthetic methods.
[0017]
A “native sequence PRO polypeptide” includes a polypeptide having the same amino acid sequence as the corresponding PRO polypeptide from nature. Such native sequence PRO polypeptides can be isolated from nature or can be produced by recombinant or synthetic means. The term “native sequence PRO polypeptide” specifically includes naturally occurring truncated or secreted forms (eg, extracellular domain sequences), naturally occurring mutated forms (eg, alternatively spliced) of a particular PRO polypeptide. Form) and naturally occurring allelic variants of the polypeptide. In various embodiments of the invention, the native sequence PRO polypeptide disclosed herein is a mature or full length native sequence polypeptide containing the full length amino acid sequence shown in the associated figures. Start and stop codons are shown in the figure in bold typeface and underline. However, while the PRO polypeptide disclosed in the relevant figure is shown at amino acid position 1 in the figure to begin with a methionine residue, other polypeptides located either upstream or downstream of amino acid position 1 in the figure are shown. It is possible and possible that a methionine residue is used as the starting amino acid residue of a PRO polypeptide.
[0018]
The PRO polypeptide “extracellular domain” or “ECD” means a form of a PRO polypeptide that is substantially free of transmembrane and cytoplasmic domains. Usually, PRO polypeptide ECD has less than 1% of their transmembrane and / or cytoplasmic domains, preferably less than 0.5% of such domains. It will be understood that any transmembrane domain identified for a PRO polypeptide of the invention is identified according to criteria routinely used in the art to identify that type of hydrophobic domain. . Although the exact boundaries of the transmembrane domain can vary, it is likely not to exceed about 5 amino acids from either end of the originally identified domain. Accordingly, the PRO polypeptide extracellular domain may optionally comprise no more than about 5 amino acids from either end of the transmembrane domain identified in the Examples or specification, and have or be associated with a signal peptide. Not such polypeptides and the nucleic acids encoding them are contemplated in the present invention.
[0019]
Appropriate positions for the “signal peptides” of the various PRO polypeptides disclosed herein are set forth herein and in the accompanying drawings. However, as noted, the C-terminal boundary of the signal peptide can vary, but is most likely less than about 5 amino acids on either side of the signal peptide C-terminal boundary as defined herein. High, the C-terminal boundary of a signal peptide can be identified according to criteria routinely used to identify such types of amino acid sequence components (eg, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6). (1997) and von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). Furthermore, in some cases, it is also observed that cleavage of the signal peptide from the secreted polypeptide is not completely uniform, resulting in one or more secreted species. These mature polypeptides, and polynucleotides encoding them, which are cleaved within less than about 5 amino acids on either side of the C-terminal boundary of the signal peptide as defined herein, are contemplated in the present invention. The
[0020]
A “PRO polypeptide variant”, as defined above or below, is a full-length native sequence PRO polypeptide disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein. Means an active PRO polypeptide having at least about 80% amino acid sequence identity with the extracellular domain of a PRO disclosed herein with or without a signal peptide or other fragments of the full-length PRO polypeptide disclosed herein . Such PRO polypeptide variants include, for example, PRO polypeptides in which one or more amino acid residues have been added or deleted at the N- or C-terminus of the full-length natural amino acid sequence. Typically, a PRO polypeptide variant is disclosed herein with or without a full-length native amino acid sequence disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide sequence that lacks a signal peptide disclosed herein. At least about 80% amino acid sequence identity, or at least about 81% amino acid sequence identity, or at least about at least about the extracellular domain of PRO or other specifically identified fragments of the full-length PRO polypeptide disclosed herein. 82% amino acid sequence identity, or at least about 83% amino acid sequence identity, alternatively at least about 84% amino acid sequence identity, alternatively at least about 85% amino acid sequence identity, or at least about 86% amino acid sequence identity Or at least about 87% amino acid sequence Or at least about 88% amino acid sequence identity, alternatively at least about 89% amino acid sequence identity, alternatively at least about 90% amino acid sequence identity, alternatively at least about 91% amino acid sequence identity, or at least about 92 % Amino acid sequence identity, or at least about 93% amino acid sequence identity, alternatively at least about 94% amino acid sequence identity, alternatively at least about 95% amino acid sequence identity, or at least about 96% amino acid sequence identity Or at least about 97% amino acid sequence identity, alternatively at least about 98% amino acid sequence identity, and alternatively at least about 99% amino acid sequence identity. Typically, the PRO variant polypeptide is at least about 10 amino acids long, alternatively at least about 20 amino acids long, alternatively at least about 30 amino acids long, alternatively at least about 40 amino acids long, alternatively at least about 50 amino acids long, alternatively at least about 60 amino acids long. Or at least about 70 amino acids long, alternatively at least about 80 amino acids long, alternatively at least about 90 amino acids long, alternatively at least about 100 amino acids long, alternatively at least about 150 amino acids long, alternatively at least about 200 amino acids long, alternatively at least about 300 amino acids long, Or more.
[0021]
The “percent (%) amino acid sequence identity” identified herein for a PRO polypeptide as defined herein introduces gaps if necessary to align the sequences and obtain maximum percent sequence identity. And is defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence that are identical to the amino acid residues of the PRO polypeptide, assuming that any conservative substitutions are not considered part of the sequence identity. Alignments for the purpose of determining percent amino acid sequence identity can be obtained by various methods within the skill of the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 or Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using available computer software. One skilled in the art can determine appropriate parameters for measuring alignment, including any algorithms necessary to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared. However, for purposes herein,% amino acid sequence identity values can be obtained by using the sequence comparison program ALIGN-2, for which the complete source code for the ALIGN-2 program is provided in Table 1 below. can get. The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, Inc., and the source code shown in Table 1 below was submitted to the US Copyright Office, Washington, DC, 20559 along with the user documentation, with US copyright registration number TXU510087 Registered below. ALIGN-2 is preferably available from Genentech, South San Francisco, California, and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use on a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0022]
For purposes herein, the% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with or against a given amino acid sequence B (or with or against a given amino acid sequence B or A given amino acid sequence A having or containing a certain% amino acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues with a score that is identical by alignment of A and B of the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be understood that if the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B is different from the% amino acid sequence identity of B to A. As an example of calculating% amino acid sequence identity using this method, Table 2-3 shows the% amino acid sequence identity of the amino acid sequence called “PRO” for the amino acid sequence called “Comparative Protein”. The calculation method is shown.
[0023]
Unless otherwise noted, all% amino acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% amino acid sequence identity values may be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://www.ncbi.nlm.nih.gov, or otherwise obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = possible, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low composite length = 15/5 Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
[0024]
In situations where NCBI-BLAST2 is used for amino acid sequence comparison, the% amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A with or against a given amino acid sequence B (or with a given amino acid sequence B, or In contrast, a given amino acid sequence A, which has or contains some% amino acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction X / Y
Here, X is the number of amino acid residues having a score that is identical by the alignment of A and B of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Y is the total number of amino acid residues of B. It will be understood that if the length of amino acid sequence A is different from the length of amino acid sequence B, then the% amino acid sequence identity of A to B is different from the% amino acid sequence identity of B to A.
[0025]
Furthermore,% amino acid sequence identity values may also be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). In addition, most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. Parameters that are not set to initial values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. For purposes herein, the% amino acid sequence identity value is: (a) the amino acid sequence of the subject PRO polypeptide having a sequence derived from a native PRO polypeptide as determined by WU-BLAST-2; The number of identical amino acid residues that match between the subject comparative amino acid sequences (ie, the sequences to which the subject PRO polypeptide is compared, which may be a PRO polypeptide variant), (b) Determined by the quotient divided by the total number of residues in a PRO polypeptide. For example, in the description “a polypeptide comprising amino acid sequence A having or having at least 80% amino acid sequence identity to amino acid sequence B”, amino acid sequence A is a comparative amino acid sequence of interest. The amino acid sequence B is the amino acid sequence of the PRO polypeptide of interest.
[0026]
“PRO variant polynucleotide” or “PRO variant nucleic acid sequence” refers to a nucleic acid molecule encoding an active PRO polypeptide as defined below, as well as the full-length native sequence PRO polypeptide sequence disclosed herein, wherein A full-length native sequence PRO polypeptide sequence lacking the signal peptide disclosed in <RTIgt;, </ RTI> the extracellular domain of a PRO polypeptide disclosed herein with or without a signal peptide, or any other of the full-length PRO polypeptide sequences disclosed herein Means having at least about 80% nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence encoding the fragment. Typically, a PRO variant polynucleotide is a full-length native sequence PRO polypeptide disclosed herein, a full-length native sequence PRO polypeptide that lacks a signal peptide disclosed herein, a PRO polypeptide disclosed herein with or without a signal peptide. At least about 80% nucleic acid sequence identity, or at least about 81% nucleic acid sequence identity with the nucleic acid sequence encoding the extracellular domain of the peptide, or any other fragment of the full-length PRO polypeptide sequence disclosed herein, Or at least about 82% nucleic acid sequence identity, or at least about 83% nucleic acid sequence identity, or at least about 84% nucleic acid sequence identity, or at least about 85% nucleic acid sequence identity, or at least about 86%. Nucleic acid sequence identity, or at least about 87% nucleic acid sequence identity Or at least about 88% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 89% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 90% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 91% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 92% Or at least about 93% nucleic acid sequence identity, or at least about 94% nucleic acid sequence identity, or at least about 95% nucleic acid sequence identity, or at least about 96% nucleic acid sequence identity, Alternatively, it has at least about 97% nucleic acid sequence identity, alternatively at least about 98% nucleic acid sequence identity, and alternatively at least about 99% nucleic acid sequence identity. Variants do not contain the native nucleotide sequence.
[0027]
Typically, a PRO variant polynucleotide is at least about 30 nucleotides long, alternatively at least about 60 nucleotides long, alternatively at least about 90 nucleotides long, alternatively at least about 120 nucleotides long, alternatively at least about 150 nucleotides long, alternatively at least about 180 nucleotides long Or at least about 210 nucleotides long, alternatively at least about 240 nucleotides long, alternatively at least about 270 nucleotides long, alternatively at least about 300 nucleotides long, alternatively at least about 450 nucleotides long, alternatively at least about 600 nucleotides long, alternatively at least about 900 nucleotides long, Or more.
[0028]
“Percent (%) nucleic acid sequence identity” relative to the PRO-encoding nucleic acid sequence identified herein introduces a gap if necessary to align the sequences and obtain maximum percent sequence identity, and Defined as the percent of nucleotides in the candidate sequence that are identical. Alignments for the purpose of determining percent nucleic acid sequence identity are publicly known in various ways within the knowledge of those skilled in the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 or Megalign (DNASTAR) software. This can be achieved by using available computer software. For purposes herein,% amino acid sequence identity values are obtained by using the sequence comparison program ALIGN-2, for which the complete source code for the ALIGN-2 program is provided in Table 1 below. . The ALIGN-2 sequence comparison computer program was created by Genentech, and the source code shown in Table 1 below was submitted to the US Copyright Office, Washington DC, 20559 along with the user documentation, with US copyright registration number TXU510087 Registered below. ALIGN-2 is preferably available from Genentech, South San Francisco, California, and may be compiled from the source code provided in Table 1 below. The ALIGN-2 program is compiled for use on a UNIX operating system, preferably digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters are set by the ALIGN-2 program and do not vary.
[0029]
For purposes herein,% nucleic acid sequence identity with or relative to a given nucleic acid sequence C, or to a given nucleic acid sequence D (or to or against a given amino acid sequence D) A given nucleic acid sequence C having or containing a degree of% nucleic acid sequence identity) is calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleic acid residues with a score that is identical by C and D alignment of the sequence alignment program ALIGN-2, and Z is the total number of nucleic acid residues of D. It will be appreciated that if the length of nucleic acid sequence C is different from the length of amino acid sequence D, then the percent nucleic acid sequence identity of C to D is different from the percent nucleic acid sequence identity of D to C. As an example of calculating% nucleic acid sequence identity, Tables 4 and 5 show how to calculate% nucleic acid sequence identity for a nucleic acid sequence called “PRO-DNA” of a nucleic acid sequence called “Comparative DNA”. .
[0030]
Unless otherwise noted, all% amino acid sequence identity values herein are obtained using the ALIGN-2 sequence comparison computer program as described above. However,% amino acid sequence identity values may be determined using the sequence comparison program NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). The NCBI-BLAST2 sequence comparison program can be downloaded from http://www.ncbi.nlm.nih.gov, or otherwise obtained from the National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. NCBI-BLAST2 uses several search parameters, all of which are set to initial values, for example, unmask = possible, chain = all, predicted occurrence = 10, minimum low composite length = 15/5 Multipath e-value = 0.01, multipath constant = 25, final gap alignment dropoff = 25, and scoring matrix = BLOSUM62.
[0031]
In situations where NCBI-BLAST2 is used for nucleic acid sequence comparisons, the given nucleic acid sequence C is in percent or identical to a given nucleic acid sequence D (or with a given nucleic acid sequence D, or In contrast, a given nucleic acid sequence C having or containing a certain percentage of nucleic acid sequence identity) may be calculated as follows:
100 times the fraction W / Z
Here, W is the number of nucleic acid residues with a score that is identical by the alignment of C and D of the sequence alignment program NCBI-BLAST2, and Z is the total number of nucleic acid residues of D. It will be appreciated that if the length of the nucleic acid sequence C is different from the length of the nucleic acid sequence D, then the% nucleic acid sequence identity of C to D is different from the% nucleic acid sequence identity of D to C.
[0032]
Furthermore,% nucleic acid sequence identity values may also be determined using the WU-BLAST-2 computer program (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)). In addition, most WU-BLAST-2 search parameters are set to initial values. Parameters that are not set to initial values, ie adjustable parameters, are set to the following values: overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word threshold (T) = 11, and scoring matrix = BLOSUM62. For purposes herein, the% nucleic acid sequence identity value is (a) a PRO polypeptide code that is a subject having a sequence derived from a native PRO polypeptide-encoding nucleic acid as determined by WU-BLAST-2. Identical amino acids between the nucleic acid sequence of the activated nucleic acid molecule and the subject comparative nucleic acid sequence (ie, the sequence to which the subject PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule is compared, which may be a PRO polypeptide variant) The number of residues is determined by the quotient divided by (b) the total number of nucleotides of the subject PRO polypeptide-encoding nucleic acid. For example, in the description “a polypeptide comprising nucleic acid sequence A having or having at least 80% nucleic acid sequence identity to nucleic acid sequence B”, nucleic acid sequence A is a comparative nucleic acid sequence of interest. The nucleic acid sequence of the PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule of interest is nucleic acid sequence B.
[0033]
In other embodiments, the PRO variant polynucleotide encodes an active PRO polypeptide and preferably hybridizes to the nucleotide sequence encoding the full-length PRO polypeptide disclosed herein under stringent hybridization and wash conditions. Nucleic acid molecule. The PRO variant polypeptide may be one encoded by a PRO variant polynucleotide.
[0034]
"Isolated" when used to describe the various polypeptides disclosed herein means a polypeptide that has been identified and separated and / or recovered from a component of its natural environment. Contaminant components of the natural environment are substances that typically interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide, including enzymes, hormones, and other proteinaceous or non-proteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the polypeptide is (1) sufficient to obtain an N-terminal or internal amino acid sequence of at least 15 residues by using a spinning cup sequenator, or (2) Coomassie blue or It is preferably purified to homogeneity by SDS-PAGE under non-reducing or reducing conditions using silver staining. Isolated polypeptide includes protein in situ within recombinant cells, since at least one component of the PRO polypeptide natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated polypeptide will be prepared by at least one purification step.
[0035]
An “isolated” PRO polypeptide-encoding nucleic acid, or an “isolated” nucleic acid molecule that encodes an anti-PRO antibody, is typically associated with a natural source of nucleic acid encoding the PRO polypeptide. A nucleic acid molecule separated from at least one contaminating nucleic acid molecule. Preferably, the isolated nucleic acid is one that does not have all the components that naturally accompany it. An isolated PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule, or an isolated anti-PRO-encoding nucleic acid molecule, is other than in the form or setting found in nature. An isolated nucleic acid molecule is therefore distinguished from a PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule or a PRO polypeptide-encoding nucleic acid molecule present in natural cells. However, an isolated nucleic acid molecule that encodes a PRO polypeptide, or an isolated nucleic acid molecule that encodes an anti-PRO antibody, is usually contained in a cell that expresses the PRO polypeptide or anti-PRO antibody. For example, the nucleic acid molecule is at a chromosomal location different from that of natural cells.
[0036]
The expression “control sequence” means a DNA sequence necessary for the expression of an operably linked coding sequence in a particular host organism. Suitable control sequences for prokaryotes, for example, include a promoter, optionally an operator sequence, and a ribosome binding site. It is known that eukaryotic cells utilize promoters, polyadenylation signals and enhancers.
[0037]
A nucleic acid is “operably linked” when it is in a functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, a presequence or secretory leader DNA is operably linked to the DNA of the polypeptide if expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; Is operably linked to the coding sequence; or the ribosome binding site is operably linked to the coding sequence if it is positioned so as to facilitate translation. In general, “operably linked” means that the bound DNA sequences are in close proximity and, in the case of a secretory leader, in close proximity and in the reading phase. However, enhancers do not necessarily have to be close together. Binding is achieved by ligation at convenient restriction sites. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used according to conventional techniques.
[0038]
The term “antibody” is used in the broadest sense and includes, for example, a single anti-PRO polypeptide monoclonal antibody (including agonist antibodies), anti-PRO antibody compositions with multi-epitope specificity, single chain anti- PRO antibodies and anti-PRO antibody fragments are included (see below). The term “monoclonal antibody” as used herein refers to a substantially homogeneous population of antibodies, ie, the individual antibodies that make up the same, except for naturally occurring mutations that may be present in small quantities. Refers to an antibody obtained from a population.
[0039]
The “stringency” of a hybridization reaction is readily determined by those skilled in the art and is generally an empirical calculation that depends on probe length, wash temperature, and salt concentration. In general, the longer the probe, the higher the temperature required for proper annealing, and the shorter the probe, the lower the required temperature. Hybridization generally depends on the ability of denatured DNA to reanneal when the complementary strand is present in an environment below its melting point. The higher the degree of homology desired between the probe and the hybridization sequence, the higher the relative temperature that can be used. As a result, higher relative temperatures will make the reaction conditions more stringent and lower temperatures will reduce the stringency. For further details and explanation of the stringency of hybridization reactions, see Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995).
[0040]
As defined herein, “stringent conditions” or “highly stringent conditions” are: (1) 0.015 M sodium chloride / 0.0015 M at low ionic strength and high temperature, eg, 50 ° C., for washing. Using sodium citrate / 0.1% sodium dodecyl sulfate; (2) denaturing agents such as formamide during hybridization, eg 50% (v / v) formamide and 0.1% bovine serum albumin at 42 ° C. /0.1% Ficoll / 0.1% polyvinylpyrrolidone / 50 mM sodium phosphate buffer pH 6.5 and 750 mM sodium chloride, 75 mM sodium citrate; (3) 50% formamide at 42 ° C. 5 × SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M sodium citrate), 50 mM LiS Sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 μg / ml), 0.1% SDS, and 10% dextran sulfate at 42 ° C. Identified by washing with 0.2x SSC (sodium chloride / sodium citrate) and 50% formamide at 55 ° C followed by a high stringency wash consisting of 0.1x SSC with EDTA at 55 ° C.
[0041]
“Moderate stringency conditions” were identified as described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989) Includes the use of hybridization conditions (eg, temperature, ionic strength and% SDS). Moderate stringency conditions include 20% formamide, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7.6), 5 × Denhardt's solution, 10% dextran sulfate, and 20 mg / mL. Conditions include overnight incubation at 37 ° C. in a solution containing denatured sheared salmon sperm DNA, followed by washing the filter at 37-50 ° C. in 1 × SSC. Those skilled in the art will recognize how to adjust temperature, ionic strength, etc. as needed to accommodate factors such as probe length.
[0042]
The term “epitope tag” as used herein refers to a PRO polypeptide fused to a “tag polypeptide”, or a chimeric polypeptide comprising their domain sequence. A tag polypeptide has a sufficient number of residues to provide an epitope from which the antibody can be produced, or an epitope that can be identified by several other reagents, but its length is the length of the target PRO polypeptide. Short enough not to inhibit the activity of the peptide. Also, the tag polypeptide is preferably fairly unique so that the antibody does not substantially cross-react with other epitopes. Suitable tag polypeptides generally have at least 6 amino acid residues, usually about 8 to about 50 amino acid residues (preferably about 10 to about 20 residues).
[0043]
The term “immunoadhesin” as used herein refers to an antibody-like molecule that combines the binding specificity of a heterologous protein (“adhesin”) with an immunoglobulin constant domain. Structurally, an immunoadhesin comprises a fusion of an amino acid sequence having an amino acid sequence of a desired binding specificity other than the antigen recognition and binding site of an antibody with an immunoglobulin constant domain sequence. The adhesin portion of an immunoadhesin molecule is typically a contiguous amino acid sequence that includes at least a receptor or ligand binding site. The immunoglobulin constant domain sequence of the immunoadhesin can be any of IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtype, IgA (including IgA-1 and IgA-2), IgE, IgD or IgM. It can be obtained from the immunoglobulins.
[0044]
As used herein, “active” and “activity” means a form of PRO that retains the biological and / or immunological activity of a natural or naturally occurring PRO polypeptide, and “biological” By activity is meant a biological function (inhibitory or stimulatory) caused by a natural or naturally occurring PRO, excluding the ability to generate antibodies against antigenic epitopes possessed by the natural or naturally occurring PRO. Thus, “immunological” activity means the ability to generate antibodies against an antigenic epitope of a natural or naturally occurring PRO.
[0045]
“Biological activity” in an antibody or other molecule (eg, organic or inorganic small molecule, peptide, etc.) that can be identified in the screening assays disclosed herein is listed herein in connection with the definition of “therapeutically effective amount”. Used to mean the ability of such a molecule to exert one or more of its effects. In a particular embodiment, “biological activity” is the ability to inhibit neoplastic cell growth or proliferation. Preferred biological activities are inhibition, including slow growth or complete arrest of target tumor (eg, cancer) cells. Other preferred biological activities are cytotoxic activities that result in the death of target tumor (eg, cancer) cells. Yet another preferred biological activity is the induction of apoptosis of target tumor (eg cancer) cells.
[0046]
The term “immunological activity” refers to immunological cross-reactivity with at least one epitope of a PRO polypeptide.
As used herein, “immunological cross-reactivity” refers to a polyclonal antiserum in which a candidate polypeptide produces a qualitative biological activity of a PRO polypeptide with this activity against a known active PRO polypeptide. It can be competitively inhibited. Such antisera are prepared in a conventional manner, for example, by subcutaneously injecting a known active analog in complete Freund's adjuvant into a goat or rabbit and then boosting intraperitoneally or subcutaneously in incomplete Freund. The The immunological cross-reactivity is preferably “specific” because the binding affinity of the identified immunological cross-reactive molecule (eg, antibody) to the corresponding PRO polypeptide is any other Significantly higher than the binding affinity for known natural polypeptides (preferably at least about 2-fold, more preferably at least about 4-fold, even more preferably at least about 6-fold, most preferably at least about 8-fold higher). Means.
[0047]
“Tumor” as used herein refers to all tumorigenic cell growth and proliferation, whether malignant or benign, and all precancerous and cancerous cells and tissues.
The terms “cancer” and “cancerous” refer to or describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth. Examples of cancer include, but are not limited to, adenocarcinoma, lymphoma, blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include breast cancer, prostate cancer, colon cancer, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, glioblastoma, cervical cancer, Ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatocellular carcinoma, colorectal cancer, endometrial cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, liver cancer, spawning cancer, thyroid cancer, liver cancer and various types of head and neck cancer Is included.
[0048]
“Treatment” is an intervention that is intended to prevent or improve the development of a pathology of a disease. “Treatment” thus refers to both therapeutic treatment and prophylactic or protective measures. Those in need of treatment include those already with the disease as well as those in which the disease is to be prevented. In tumor (eg, cancer) treatment, the therapeutic agent can directly reduce the pathology of the tumor cells or can make the tumor cells more sensitive to other therapeutic mediators such as radiation and / or chemotherapy.
The “pathology” of cancer includes all phenomena that compromise the good survival of the patient. This includes, but is not limited to, abnormal or uncontrolled cell growth, metastasis, inhibition of normal function of neighboring cells, release of cytokines or other secreted products at abnormal levels, suppression of inflammation or immune response Or worsening.
[0049]
An “effective amount” of a polypeptide or an agonist thereof disclosed herein is an amount capable of inhibiting the growth of target cells to some extent with respect to neoplastic cell growth and tumor growth. The term includes amounts capable of inducing growth inhibition, cell division arrest and / or cytotoxic effects and / or apoptosis of the target cell. An “effective amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof for the purpose of inhibiting neoplastic cell growth can be determined by empirical and routine techniques.
[0050]
“Therapeutically effective amount” means an amount capable of inducing one or more of the following effects with respect to the treatment of tumors: (1) some or all of tumor growth, including retardation and complete growth arrest; (2) Reduction of tumor cell number; (3) Reduction of tumor size; (4) Inhibition of tumor cell infiltration into peripheral organs (ie, reduction, delay or complete arrest); (5 ) Inhibition of metastasis (ie, reduction, delay or complete cessation); (6) promotion of anti-tumor immune response, which may lead to tumor regression or rejection, but is not necessary; and / or (7) Reduction of the degree of one or more symptoms associated with the disease. A “therapeutically effective amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof for tumor treatment purposes can be determined by empirical and routine techniques.
[0051]
A “growth inhibitory amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof is an amount that can inhibit the growth of cells, particularly tumors, eg, cancer cells, in vitro or in vivo. A “growth inhibitory amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof for the purpose of inhibiting neoplastic cell growth can be determined by empirical and routine techniques.
A “cytotoxic amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof is an amount that can destroy cells, particularly tumors, eg, cancer cells, in vitro or in vivo. A “cytotoxic amount” of a PRO polypeptide or agonist thereof for the purpose of inhibiting neoplastic cell growth can be determined by empirical and routine techniques.
The term “cytotoxic agent” as used herein refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and / or causes destruction of cells. This term refers to radioisotopes (eg, I 131 , I 125 , Y 90 And Re 186 ), Chemotherapeutic agents and toxins such as enzymatically active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof.
[0052]
A “chemotherapeutic agent” is a chemical compound useful in the treatment of tumors, such as cancer. Examples of chemotherapeutic agents include adriamycin, doxorubicin, epirubicin, 5-fluorouracil, cytosine arabinoside (“Ara-C”), cyclophosphamide, thiotepa, busulfan, cytoxin, taxoids such as paclitaxel (Taxol, Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) and doxetaxel (Taxotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rance), Toxoter, methotrexate, cisplatin, melphalan, vinblastine, bleomycin, etoposide, ifosfamide, mitomycin C, mitoxantrone, vinxanthrone Carboplatin, teniposide, daunomycin, carminomycin, aminopterin, dactinomycin, mitomycin, esperamicin (US Pat. No. 4,675,187), melphalan, and Includes other related nitrogen mustards. Also included in this definition are hormone-like drugs that act to regulate or inhibit hormonal effects on tumors such as tamoxifen and onapristone.
[0053]
As used herein, “growth inhibitory agent” refers to a compound or composition that inhibits the growth of cells, particularly cancer cells that overexpress any gene identified herein, in vitro or in vivo. That is, growth inhibitors significantly reduce the proportion of cells that overexpress such genes in the S phase. Examples of growth inhibitory agents include agents that inhibit the cell cycle (at a location other than S phase), such as agents that induce G1 arrest or M-phase arrest. Classical M-phase blockers include vincas (vincristine and vinblastine), taxol, and topo II inhibitors such as doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide and bleomycin. These agents that cause G1 arrest also overflow S phase arrest, for example DNA alkylating agents such as tamoxifen, prednisone, dacarbazine, mechloretamine, cisplatin, methotrexate, 5-fluorouracil, and ara-C. More information can be found in The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, ed., Chapter 1, title `` Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs '', Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especially p13. it can.
[0054]
The term “cytokine” is a general term for proteins that are released from one cell population and act as intercellular mediators to other cells. Examples of such cytokines are lymphokines, monokines, and traditional polypeptide hormones. Cytokines include growth hormones such as human growth hormone, N-methionyl human growth hormone, and bovine growth hormone; parathyroid hormone; thyroxine; insulin; proinsulin; relaxin; prorelaxin; glycoproteins such as follicle stimulating hormone (FSH) ), Thyrotropin (TSH), and luteinizing hormone (LH); liver growth factor; fibroblast growth factor; prolactin; placental lactogen; tumor necrosis factor-α and -β; Mueller inhibitor; mouse gonadotropin-related peptide Inhibin; Activin; Vascular endothelial growth factor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nerve growth factor such as NGF-β; Platelet growth factor; Transforming growth factor such as TGF-α and TGF-β; Insulin-like growth factor-I And I Erythropoietin (EPO); osteoinductive factors; interferons such as interferon-α, -β, and -γ; colony stimulating factors (CSFs) such as macrophage-CSF (M-CSF); granulocyte-macrophage-CSF (GM-) CSF); and granulocyte-CSF (G-CSF); interleukins (ILs) such as IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL -7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; tumor necrosis factors such as TNF-α and TNF-β; and other polypeptide factors including LIF and kit ligand (KL). As used herein, the term cytokine includes proteins from natural sources or from recombinant cell culture and is the biologically active equivalent of native sequence cytokines.
[0055]
The term “prodrug” as used in this application is a precursor or derivative of a pharmaceutically active substance that is less cytotoxic to tumor cells compared to the parent drug and is enzymatically activated or converted to a more active parent form Means form. For example, Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy”, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986), and Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery. , Borchardt et al. (Ed.), Pp. 247-267, Human Press (1985). The prodrugs of the present invention include, but are not limited to, phosphate-containing prodrugs, thiophosphate-containing prodrugs, sulfate-containing prodrugs, peptide-containing prodrugs, D-amino acid modified prodrugs, glycosylated prodrugs, optionally substituted Phenoxyacetamide-containing prodrugs or optionally substituted phenylacetamide-containing prodrugs, 5-fluorocytosine and other 5-fluorouridine prodrugs that can be converted to more active, non-cytotoxic drugs. Non-limiting examples of cytotoxic drugs that can be derivatized to the prodrug form used in the present invention include, but are not limited to, the chemotherapeutic agents described above.
[0056]
The term “agonist” is used in the broadest sense and includes any molecule that resembles the biological activity of a native PRO polypeptide disclosed herein. Suitable agonist molecules include in particular agonist antibodies or antibody fragments, naturally occurring PRO polypeptide fragments or amino acid sequence variants, peptides, small organic molecules, and the like. A method of identifying an agonist of a PRO polypeptide can include exposing tumor cells to a candidate agonist and measuring inhibition of tumor cell growth.
“Chronic” administration means administration of the drug in a continuous manner as opposed to an acute manner in order to maintain the initial therapeutic effect (activity) over a long period of time. An “intermittent” administration is a treatment that is not made continuously without interruption, but rather is essentially periodic.
[0057]
“Mammal” for purposes of treatment means any animal classified as a mammal, humans, livestock and farm animals, zoos, sports or pet animals such as dogs, horses, cats, cows, etc. including. Preferably the mammal is a human.
Administration of “in combination with” one or more additional therapeutic agents includes simultaneous (temporary) and sequential administration in any order.
As used herein, a “carrier” includes a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or stabilizer and is non-toxic to cells or mammals exposed to them at the dosage and concentration used. is there. Often the physiologically acceptable carrier is an aqueous pH buffered solution. Examples of physiologically acceptable carriers include phosphate, citrate, and other organic acid salt buffers; antioxidants including ascorbic acid; low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptides; Eg serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophobic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine; monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates including glucose, mannose or dextran; EDTA Chelating agents such as; sugar alcohols such as mannitol or ancestor rubitol; salt-forming counterions such as sodium; and / or nonionic surfactants such as TWEEN (trade name), polyethylene glycol (PEG), and PLURONICS (product) Name).
[0058]
“Natural antibodies” and “natural immunoglobulins” are heterotetrameric glycoproteins of approximately 150,000 daltons, usually composed of two identical light (L) chains and two identical heavy (H) chains. . Each light chain is linked to the heavy chain by one covalent disulfide bond, and the number of disulfide bonds varies among the heavy chains of different immunoglobulin isotypes. Each heavy and light chain also has regularly spaced interchain disulfide bridges. Each heavy chain is a variable domain (V H ) At one end. Each light chain has a variable domain (V L ) With a constant domain at the other end; the light chain constant domain is aligned with the first constant domain of the heavy chain and the light chain variable domain is aligned with the variable domain of the heavy chain. Certain amino acid residues are thought to form an interface between the light and heavy chain variable domains.
[0059]
The term “variable” refers to the fact that certain sites in the variable domain vary widely in sequence within an antibody and are used for the binding and specificity of each particular antibody to that particular antigen. To do. However, variability is not uniformly distributed across the variable domains of antibodies. It is concentrated in three segments called complementarity determining regions (CDRs) or hypervariable regions both in the light and heavy chain variable domains. The more highly conserved portions of variable domains are called the framework region (FR). The natural heavy and light chain variable domains are composed of four beta-sheet structures, four linked by CDRs that form a loop bond that binds and in some cases forms part of the β-sheet structure. Each FR region is included. The CDRs of each chain are bound closer to the FR and contribute to the formation of the antigen binding site of the antibody together with the CDRs of the other chains (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I). Pp. 647-669 (1991)). The constant domains are not directly related to antibody binding to antigen, but exhibit various effector functions such as antibody involvement in antibody-dependent cytotoxicity.
[0060]
“Hypervariable region” when used herein refers to the amino acid residues of an antibody which are responsible for antigen binding. The hypervariable region is a “complementarity determining region” or “CDR” (eg, residues 24-34 (L1), 50-56 (L2) and 89-97 (L3) of the light chain variable region and the heavy chain variable. Regions 31-35 (H1), 50-65 (H2) and 95-102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991)) and / or “hypervariable loops” (eg, residues 26-32 (L1), 50-52 (L2) and 91-96 (L3) and heavy chain variable region) and heavy Residues from chain variable region residues 26-32 (H1), 53-55 (H2) and 96-101 (H3); Clothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)) Including. “Framework” or “FR” residues are those variable domain residues other than the hypervariable region residues as herein defined.
[0061]
“Antibody fragments” comprise a portion of a native antibody, preferably the antigen binding or variable region of the native antibody. Examples of antibody fragments are Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 And Fv fragments; diabody; linear antibodies (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); single chain antibody molecules; and multispecificity formed from antibody fragments Specific antibodies.
Papain digestion of antibodies, called “Fab” fragments, combines two identical antigen-binding fragments, each with a single antigen-binding site, and the remaining “Fc” fragment, whose name reflects its ability to crystallize easily. Generate. Pepsin treatment is F (ab ′) with two antigen binding sites. 2 Give rise to fragments, which are still capable of cross-linking antigen.
[0062]
“Fv” is the minimum antibody fragment which contains a complete antigen recognition and binding site. This region consists of a dimer of one heavy chain and one light chain variable region in tight, non-covalent association. In this arrangement, the three CDRs of each domain interact to form V H -V L The antigen binding site is determined on the surface of the monomer. Correctly, the six CDRs provide antigen binding specificity for the antibody. However, even a single variable domain (or half of an Fv comprising only three CDRs specific for an antigen) has a lower affinity than the entire binding site, but has the ability to recognize and bind to an antigen. Have.
[0063]
The Fab fragment also contains the constant domain of the light chain and the first constant domain (CH1) of the heavy chain. Fab fragments differ from Fab ′ fragments by the addition of several residues at the carboxy terminus of the heavy chain CH1 domain including one or more cysteines from the antibody hinge region. Here, Fab′-SH represents Fab ′ in which the cysteine residue of the constant domain has a free thiol group. F (ab ') 2 Antibody fragments are initially produced as pairs of Fab ′ fragments that have hinge cysteines between them. Other chemical couplings of antibody fragments are also known.
“Light chains” of antibodies (immunoglobulins) from any vertebrate species can be classified into one of two distinct types called kappa and lambda, based on the amino acid sequences of their constant domains. .
Depending on the amino acid sequence of the constant domain of the heavy chain, immunoglobulins can be classified into different classes. There are five main classes of immunoglobulins: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, some of which are further classified into subclasses (isotypes) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA and IgA2. obtain.
[0064]
The term “monoclonal antibody” as used herein is derived from a substantially homogeneous population of antibodies, ie, a population that is identical except for naturally occurring mutations in which the individual antibodies comprising the population are present in small amounts. Refers to antibody. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed to a single antigenic site. Furthermore, unlike conventional (polyclonal) antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant on the antigen. ing. In addition to specificity, monoclonal antibodies are advantageous in that they are synthesized by hybridoma culture and are not contaminated by other immunoglobulins. The modifier “monoclonal” indicates the character of the antibody as obtained from a substantially homogeneous antibody population, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, the monoclonal antibodies used in accordance with the present invention may be made by the hybridoma method first described by Kohler et al., Nature, 256: 495 [1975], or by recombinant DNA methods (eg, US patents). No. 4,816,567). In addition, the “monoclonal antibody” is a technique described in, for example, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 [1991] and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). It may be isolated from a phage antibody library.
[0065]
A monoclonal antibody here is in particular part of its heavy or light chain derived from a particular species or identical or homologous to the corresponding sequence in an antibody belonging to a particular antibody class or subclass. A “chimeric” antibody in which the remainder of the chain is derived from another species or is identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody belonging to a particular antibody class or subclass, as well as the desired biological activity Is included (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]).
[0066]
“Humanized” forms of non-human (eg, murine) antibodies are specific chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg, Fv, Fab, Fab ′) that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. , F (ab ') 2 Or other antigen-binding sequence of the antibody). For the most part, humanized antibodies are human immunoglobulins (recipient antibodies) whose complementarity determining regions (CDRs) are CDRs (donor antibodies) of species other than humans such as mice, rats, goats, etc. Substituted with residues having the desired specificity, affinity and capacity derived from In some cases, Fv framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are replaced with corresponding non-human residues. Furthermore, humanized antibodies may comprise residues that are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. These modifications are made to further refine and maximize antibody performance. In general, a humanized antibody has at least one, typically all or substantially all of the CDR regions corresponding to those of a non-human immunoglobulin and all or substantially all of the FR regions are of human immunoglobulin consensus sequence, typically Will contain substantially all of the two variable domains. An optimal humanized antibody will also contain at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin. For further details, see Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). checking ... Humanized antibodies include PRIMATIZED (trade name) antibodies derived from antibodies produced by immunizing macaques with the antigen of interest of the antigen binding region of the antibody.
[0067]
“Single-chain Fv” or “sFv” antibody fragments H And V L Antibody fragments that contain domains are present in a single polypeptide chain. Preferably, the Fv polypeptide is V H And V L Further comprising a polypeptide linker between the domains, which allows sFV to form the desired structure for antigen binding. For a review of sFv, see Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
The term “diabody” refers to a small antibody fragment having two antigen-binding sites, which fragments are identical polypeptide chains (V H -V L ) Within the light chain variable domain (V L ) In the heavy chain variable domain (V H ) Are combined. Using a linker that is so short that it allows pairing of two domains on the same chain, the domain is forced to pair with the complementary domain of the other chain, creating two antigen binding sites. Diabodies are described in further detail, for example, in EP404097; WO93 / 11161; and Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).
[0068]
An “isolated” antibody is one that has been identified and separated or recovered from a component of its natural environment. Contaminants of the natural environment are substances that interfere with the use of antibodies for diagnosis or therapy, and include enzymes, hormones, and other non-proteinaceous solutes. In a preferred embodiment, the antibody is (1) at least 95% by weight or more preferably 99% by weight antibody as determined by the Lowry method, and (2) by using a spinning cup sequenator. To the extent sufficient to obtain 15 N-terminal or internal amino acid sequence residues, or (3) to homogeneity by SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions using Coomassie blue or preferably silver staining Purified. Isolated antibody includes the antibody in situ within recombinant cells since at least one component of the antibody's natural environment will not be present. Ordinarily, however, isolated antibody will be prepared by at least one purification step.
[0069]
An antibody that "specifically binds", or a specific polypeptide, or an antibody specific for an epitope on a specific polypeptide, does not substantially bind to another polypeptide or polypeptide epitope. , Which bind to a specific polypeptide or epitope on a specific polypeptide.
The term “label” when used herein refers to a detectable compound or composition that binds directly or indirectly to the antibody to produce a “labeled” antibody. The label may be detectable by itself (eg, a radioisotope label or a fluorescent label), or in the case of an enzyme label, it may catalyze chemical conversion of the detectable substrate compound or composition.
“Solid phase” means a non-aqueous matrix to which a compound of the invention can adhere. Examples of solid phases encompassed herein are those partially or wholly formed of glass (eg, controlled pore glass), polysaccharides (eg, agarose), polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicone. including. In certain embodiments, depending on the context, the solid phase can include the wells of an assay plate; otherwise, a purification column (eg, an affinity chromatography column). The term also includes a discontinuous solid phase of discrete particles, such as those described in US Pat. No. 4,275,149.
[0070]
“Liposomes” are various types of small vesicles containing lipids, phospholipids and / or surfactants that are useful for delivering drugs (PRO polypeptides or antibodies thereto) to mammals. The components of the liposome are usually arranged in a bilayer structure similar to the lipid sequence of biological members.
“Small molecule” is defined herein as having a molecular weight of less than about 500 Daltons.
[0071]
As shown below, Table 1 provides secure source code for the ALIGN-2 sequence comparison computer program. This source code is routinely compiled for use on the UNIX operating system and provides the ALIGN-2 sequence comparison computer program.
In addition, Table 2-5 shows the following methods for determining% amino acid sequence identity (Table 2-3) and% nucleic acid sequence identity (Table 4-5) using the ALIGN-2 sequence comparison computer program: , “PRO” indicates the amino acid sequence of the target hypothetical PRO polypeptide, and “comparison protein” indicates the amino acid of the polypeptide to which the target “PRO” polypeptide is compared. Indicates the sequence, "PRO-DNA" indicates the hypothetical PRO-encoding nucleic acid sequence of interest, "comparison DNA" indicates the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule to which the "PRO-DNA" nucleic acid molecule of interest is compared, “X”, “Y” and “Z” each represent a different hypothetical amino acid residue, and “N”, “L” and “V” each represent a different hypothetical nucleotide.
[0072]
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II. Compositions and methods of the invention
A. Full-length PRO polypeptide
The present invention provides newly identified and isolated nucleic acid sequences encoding polypeptides referred to in this application as PRO polypeptides. In particular, cDNAs encoding various PRO polypeptides have been identified and isolated, as described in further detail in the Examples below.
As disclosed in the examples below, various cDNA clones have been deposited with the ATCC. The exact nucleotide sequence of these clones can be readily determined by sequencing the deposited clones using routine methods in the art. The predicted amino acid sequence can be determined from the nucleotide sequence using routine skill. For the PRO polypeptides and encoding nucleic acids described herein, Applicants have identified what is believed to be the reading frame that can prove to be the most identical to the currently available sequence information.
[0094]
B. PRO mutant
In addition to the full-length native sequence PRO polypeptides described herein, it is contemplated that PRO variants can also be prepared. PRO variants can be prepared by introducing appropriate nucleotide changes into the PRO polypeptide DNA or by synthesizing the desired PRO polypeptide. One skilled in the art will appreciate that amino acid changes, such as changes in the number or position of glycosylation sites, or changes in membrane anchoring properties, can alter the post-translational process of the PRO polypeptide.
[0095]
As described herein, mutations in the native full-length sequence PRO polypeptide, or various domains of the PRO polypeptide, include any of the conservative and non-conservative mutations described in, for example, US Pat. No. 5,364,934. Can be created using the following techniques and guidelines. A mutation may be a substitution, deletion or insertion of one or more codons encoding a PRO polypeptide that results in a change in the amino acid sequence of the PRO polypeptide as compared to the native sequence PRO. In some cases, the mutation is a substitution of at least one amino acid by any other amino acid in one or more domains of the PRO polypeptide. Guidance in determining which amino acid residues are inserted, substituted or deleted without adversely affecting the desired activity is to compare the sequence of the PRO polypeptide to the sequence of homologous known protein molecules; It is found by minimizing amino acid sequence changes that occur within regions of high homology. Amino acid substitutions can be the result of substituting one amino acid with another amino acid having similar structural and / or chemical properties, eg, substitution of leucine with serine, ie, a conservative amino acid substitution. Insertions and deletions can optionally be in the range of 1 to 5 amino acids. Acceptable mutations can be determined by systematically creating insertions, deletions or substitutions in the amino acids of the sequence and testing the resulting mutants for activity that is inhibited by the full-length or mature native sequence. there is a possibility.
[0096]
PRO polypeptide fragments are provided herein. Such fragments may be cleaved at the N-terminus or C-terminus, for example, or lack internal residues when compared to a full-length native protein. Certain fragments lack amino acid residues that are not essential for a desired biological activity of the PRO polypeptide.
PRO fragments may be prepared by any of a number of conventional techniques. Desired peptide fragments may be chemically synthesized. Alternative methods include enzymatic digestion, for example by treating the protein with an enzyme known to cleave a defined protein site at a particular amino acid residue, or with a compatible restriction enzyme. It involves generating a PRO fragment by digesting and isolating the desired fragment. Yet another suitable technique involves isolating and amplifying a DNA fragment encoding the desired polypeptide fragment by polymerase chain reaction (PCR). Oligonucleotides that determine the desired ends of the DNA fragments are used in PCR 5 ′ and 3 ′ primers. Preferably, the PRO polypeptide fragment shares at least one biological and / or immunological activity with the native PRO polypeptide shown in the accompanying drawings.
In a particular embodiment, the conservative substitutions of interest are shown in Table 6 under the preferred substitution heading. If such a substitution results in a change in biological activity, a more substituting change, named as an exemplary substitution in Table 6, or further described below in connection with the amino acid classification, Introduced product is screened.
[0097]
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[0098]
Substitutional modifications of the function and immunological identity of the polypeptide include (a) the structure of the polypeptide backbone of the substitution region, eg a sheet or helical arrangement, (b) the target site charge or hydrophobicity, or (c) the side This is achieved by selecting substituents that differ substantially in their effect while maintaining chain bulk. Naturally occurring residues can be grouped based on common side chain properties:
(1) Hydrophobicity: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) Neutral hydrophilicity: cys, ser, thr;
(3) Acidity: asp, glu;
(4) Basicity: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Residues affecting chain orientation: gly, pro; and
(6) Aromatic: trp, tyr, phe.
[0099]
Non-conservative substitutions require exchanging one member of these classes for another. Residues so substituted can also be introduced at conservative substitution sites, preferably left (non-conserved) sites.
Mutations can be performed using oligonucleotide-mediated (site-specific) mutagenesis, alanine scanning, and PCR mutagenesis [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], cassette mutagenesis [Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)], limited selective mutagenesis [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] or other methods well known in the art, or other known techniques can be performed on the cloned DNA to produce PRO mutant DNA.
[0100]
Scanning amino acid analysis can also be used to identify one or more amino acids along adjacent sequences. Preferred scanning amino acids are relatively small and neutral amino acids. Such amino acids include alanine, glycine, serine, and cysteine. Alanine is a generally preferred scanning amino acid within this group because it eliminates side chains beyond the beta carbon and is unlikely to change the backbone structure of the mutant [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. Alanine is also generally preferred because it is the most common amino acid. Furthermore, it is often buried and found in both exposed positions [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., NY); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. If an alanine substitution does not produce a sufficient amount of the mutant, an isoteric amino acid can be used.
[0101]
C. Modification of PRO
Covalent modifications of the PRO polypeptide are included within the scope of the present invention. One form of covalent modification is by reacting a PRO polypeptide target amino acid residue with an organic derivatization reagent capable of reacting with a selected side chain of the PRO polypeptide, or an N- or C-terminal residue. is there. Derivatization with bifunctional reagents is useful, for example, for crosslinking PRO to a water-insoluble support matrix or surface used in anti-PRO antibody purification methods and vice versa. Commonly used crosslinking agents include, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane, glutaraldehyde, N-hydroxysuccinimide esters such as esters with 4-azidosalicylic acid, 3,3′-dithiobis ( Homobifunctional imide esters including disuccinimidyl esters such as succinimidyl propionate), bifunctional maleimides such as bis-N-maleimide-1,8-octane, and methyl-3-[(p- Reagents such as azidophenyl) -dithio] propioimidate.
[0102]
Other modifications include deamination of glutaminyl and asparaginyl residues to the corresponding glutamyl and aspartyl residues, hydroxylation of proline and lysine, phosphorylation of the hydroxyl group of seryl or threonyl residues, lysine, arginine, and Methylation of α-amino group of histidine side chain [TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-terminal amine acetylation, and optional Amidation of the C-terminal carboxyl group of
Other forms of covalent modification of the PRO polypeptide included within the scope of the invention include altering the native glycosylation pattern of the polypeptide. As intended herein, “altered native glycosylation pattern” refers to the deletion of one or more carbohydrate moieties found in the native sequence PRO (removal of existing glycosylation sites or glycosylation by chemical and / or enzymatic means). And / or the addition of one or more glycosylation sites that are not present in the native sequence PRO. In addition, this clause includes qualitative changes in glycosylation of natural proteins, including changes in the nature and properties of the various carbohydrate moieties present.
[0103]
Addition of glycosylation sites to the PRO polypeptide may involve amino acid sequence alterations. This alteration may be made, for example, by addition or substitution of one or more serine or threonine residues to the native sequence PRO (O-linked glycosylation site). The PRO amino acid sequence is optionally altered through changes at the DNA level, particularly by mutating the DNA encoding the PRO polypeptide at a preselected base to generate a codon that is translated into the desired amino acid. Also good.
Another means of increasing the number of carbohydrate moieties on the PRO polypeptide is by chemical or enzymatic coupling of glycosides to the polypeptide. Such methods are described in the art, for example, in WO 87/05330 issued September 11, 1987, and in Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306 (1981). Has been.
[0104]
Removal of carbohydrate moieties present on the PRO polypeptide can be accomplished chemically or enzymatically, or by mutational substitution of codons encoding amino acid residues presented as targets for glucosylation. Chemical deglycosylation techniques are known in the art, for example by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), and Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981). ). Enzymatic cleavage of the carbohydrate moiety on a polypeptide is accomplished by using various endo and exoglycosidases as described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
Other forms of covalent modification of the PRO of the present invention include US Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; Bind PRO polypeptide to one of various non-proteinaceous polymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylene in the manner described in 4,791,192 or 4,179,337 Included.
The PRO polypeptides of the present invention may also be modified by methods that form chimeric molecules comprising other heterologous polypeptides or PRO polypeptides fused to an amino acid sequence.
[0105]
In one embodiment, such chimeric molecules include a fusion of a tag polypeptide and a PRO polypeptide that provides an epitope to which an anti-tag antibody can selectively bind. The epitope tag is generally located at the amino or carboxyl terminus of the PRO polypeptide. The presence of such an epitope tag form of a PRO polypeptide can be detected using an antibody against the tag polypeptide. Providing the epitope tag also allows the PRO polypeptide to be readily purified by affinity purification using an anti-tag antibody or other type of affinity matrix that binds to the epitope tag. Various tag polypeptides, as well as their respective antibodies, are well known in the art. Examples include poly-histidine (poly-his) or poly-histidine-glycine (poly-His-gly) tag; flu HA tag polypeptide and its antibody 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8: 2159. -2165 (1988)]; c-myc tag and 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 and 9E10 antibodies thereto [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: 3610-3616 (1985)]; and herpes simplex virus sugars A protein D (gD) tag and its antibody [Paborsky et al., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)] are included. Other tag polypeptides include flag peptides [Hopp et al., BioTechnology, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitope peptides [Martin et al., Science, 255: 192-194 (1992)]; α-tubulin epitopes Peptide [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; and T7 gene 10 protein peptide tag [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].
[0106]
In an alternative embodiment, the chimeric molecule may comprise a fusion of PRO with an immunoglobulin or a specific region of an immunoglobulin. For a bivalent form of a chimeric molecule (also referred to as “immunoadhesin”), such fusion can be with the Fc region of an IgG molecule. The Ig fusion preferably comprises a solubilized (transmembrane domain deleted or inactivated) form of the PRO polypeptide in place of at least one variable region within the Ig molecule. In a particularly preferred embodiment, the immunoglobulin fusion comprises the hinge, CH2 and CH3 or hinge, CH1, CH2 and CH3 regions of the IgG1 molecule. For the production of immunoglobulin fusions, see US Pat. No. 5,428,130 issued June 27, 1995.
[0107]
D. Preparation of PRO
The following description relates primarily to a method of producing a PRO polypeptide by culturing cells transformed or transfected with a vector containing the PRO polypeptide nucleic acid. Of course, it is contemplated that the PRO polypeptide can be prepared using other methods well known in the art. For example, PRO polypeptide sequences, or portions thereof, may be produced by direct peptide synthesis using solid phase techniques [eg, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco, California ( 1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154 (1963)]. In vitro protein synthesis may be performed by manual techniques or by automation. Automated synthesis may be performed, for example, using an Applied Biosystems Peptide Synthesizer (Foster City, Calif.) According to the manufacturer's instructions. The various portions of the PRO polypeptide may be chemically synthesized separately and combined using chemical or enzymatic methods to produce the full-length PRO polypeptide.
[0108]
1. Isolation of DNA encoding PRO polypeptide
DNA encoding a PRO polypeptide can be obtained from a cDNA library prepared from tissues that carry PRO mRNA and are believed to express it at detectable levels. Accordingly, human PRODNA can be conveniently obtained from a cDNA library prepared from human tissue, as described in the Examples. The PRO-encoded gene can also be obtained from a genomic library or by a known synthesis method (for example, automated nucleic acid synthesis).
Libraries can be screened with probes (such as antibodies to PRO polypeptides or oligonucleotides of at least about 20-80 bases) designed to identify the gene of interest or the protein encoded by that gene. Screening of cDNA or genomic libraries with selected probes is performed using standard procedures described in, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). be able to. Another method of isolating the gene encoding the desired PRO polypeptide is to use PCR [Sambrook et al., Supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995). )].
[0109]
The following examples describe cDNA library screening techniques. The oligonucleotide sequence selected as the probe must be long enough and clear enough to minimize false positives. The oligonucleotide is preferably labeled such that it can be detected upon hybridization to DNA in the library being screened. Labeling methods are well known in the art, 32 This includes the use of radiolabels such as P-labeled ATP, biotinylation or enzyme labeling. Hybridization conditions including moderate stringency and high stringency are shown in Sambrook et al., Supra.
Sequences identified in such library screening methods can be compared and aligned with well-known sequences deposited in the public databases of GenBank et al., Or personal sequence databases and made available to the public. Sequence identity within the determined region of the molecule or over the full length (either at the amino acid or nucleic acid level) can be determined using methods known in the art and described herein. it can.
Nucleic acids with protein coding sequences use the deduced amino acid sequences disclosed herein for the first time and, if necessary, Sambrook et al., Supra, detecting production intermediates and precursors of mRNA that are not reverse transcribed into cDNA. Obtained by screening selected cDNA or genomic libraries using conventional primer extension methods.
[0110]
2. Host cell selection and transformation
To transfect or transform host cells with the expression or cloning vectors for PRO production described herein, to induce promoters, to select for transformants, or to amplify genes encoding the desired sequences Incubate in a suitably modified conventional nutrient medium. Culture conditions, such as medium, temperature, pH, etc. can be selected by one skilled in the art without undue experimentation. In general, principles, protocols, and practical techniques for maximizing cell culture productivity can be found in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, edited by M. Butler (IRL Press, 1991) and Sambrook et al., Supra. it can.
[0111]
Methods of prokaryotic cell transfection and eukaryotic cell transfection, eg CaCl 2 , CaPO 4 Liposome-mediated and electroporation are known to those skilled in the art. Depending on the host cell used, transformation is done using standard methods appropriate to that cell. Calcium treatment or electroporation with calcium chloride as described in Sambrook et al., Supra, is generally used for prokaryotes. Infection with Agrobacterium tumefaciens is characterized by the characteristics of certain plant cells, as described in Shaw et al., Gene, 23: 315 (1983) and WO 89/05859 published June 29, 1989. Used for conversion. For mammalian cells without such cell walls, the calcium phosphate precipitation method of Graham and van der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978) is preferred. General aspects of mammalian cell host system transformations are described in US Pat. No. 4,399,216. Transformation into yeast is typically performed by Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) and Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3829 (1979). Implemented according to the method. However, other methods of introducing DNA into cells, such as nuclear microinjection, electroporation, intact cells, or bacterial protoplast fusion using polycations such as polybrene, polyornithine, etc. can also be used. See Keown et al., Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990) and Mansour et al., Nature, 336: 348-352 (1988) for various techniques for transforming mammalian cells.
[0112]
Suitable host cells for cloning or expressing the DNA in the vectors described herein are prokaryotic, yeast, or higher eukaryotic cells. Suitable prokaryotes include, but are not limited to, eubacteria such as Gram negative or Gram positive microorganisms such as Enterobacteriaceae such as E. coli. Various E. coli strains are publicly available, for example E. coli K12 strain MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli strains W3110 (ATCC 27,325) and K5772 (ATCC 53,635). Other preferred prokaryotic host cells are E. coli, such as E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, such as Salmonella Typhimurium, Salmonella typhimurium), Serratia, eg Serratia marcescans, and Shigella, and Neisseria gonorrhoeae, eg B. subtilis and B. licheniformis (eg April 1989) Bacillus licheniformis 41P) described in DD266, 710 issued on the 12th), Pseudomonas, for example, Enterobacteriaceae such as Pseudomonas aeruginosa and Streptomyces. These examples are illustrative rather than limiting. Strain W3110 is one particularly preferred host or parent host because it is a common host strain for recombinant DNA product fermentation. Preferably, the host cell secretes a minimal amount of proteolytic enzyme. For example, strain W3110 may be modified to have a genetic mutation in a gene encoding a foreign protein in the cell, examples of such hosts include E. coli W3110 strain 1A2 with the complete genotype tonA; Escherichia coli W3110 strain 9E4 with the different genotype tonA ptr3; complete genotype tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kan r E. coli strain W3110 27C7 (ATCC 55,244); complete genotype tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan r Escherichia coli W3110 strain 37D6; E. coli W3110 strain 40B4 which is a 37D6 strain having a non-kanamycin resistant degP deletion mutation; and a mutant periplasmic protease disclosed in US Pat. No. 4,946,783 issued August 7, 1990 E. coli strains having Alternatively, in vitro methods of cloning such as PCR or other nucleic acid polymerase reactions are preferred.
[0113]
In addition to prokaryotes, eukaryotic microbes such as filamentous fungi or yeast are suitable cloning or expression hosts for PRO polypeptide-encoding vectors. Saccharomyces cerevisia is a commonly used lower eukaryotic host microorganism. In addition, Schizosaccharomyces prombe (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 issued May 2, 1985); Kluveromyces hosts (US Pat. No. 4 , 943,529; Fleer et al., Bio / Technology, 9: 968-975 (1991)), for example K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154). (2): 737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (K. wickeramii). ) (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio / Technology, 8: 135 ( 1990) ), K. thermotolerans and K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Biol. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244, 234); Red and red mold (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [ 1979]); Schwanniomyces, for example Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538, published Oct. 31, 1990); and filamentous fungi, such as Neurospora, Penicillium, Tripok Tolypocladium (WO91 / 00357 published January 10, 1991); and Aspergillus hosts, such as Aspergi Nidalance (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) and Aspergillus niger (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Preferred methylotrophic (C1 compound-utilizing, Methylotropic) yeasts here are, but not limited to, Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, and Contains yeast that can grow in methanol selected from the genus consisting of Rhodotorula. A list of specific species that are illustrative of this yeast classification is described in C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
[0114]
Suitable host cells for the expression of glycosylated PRO polypeptide are derived from multicellular organisms. Examples of invertebrate cells include insect cells such as Drosophila S2 and Spodospera Sf9, and plant cells. Examples of useful mammalian host cell lines include Chinese hamster ovary (CHO) and COS cells. More detailed examples include monkey kidney CV1 strain transformed with SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); human embryonic kidney strain (293 or 293 cells subcloned for growth in suspension culture, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); Chinese hamster ovary cells / -DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); mouse Sertoli cells (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)) human lung cells (W138, ATCC CCL 75); human hepatocytes (Hep G2, HB 8065); and mouse breast tumor cells ( MMT 060562, ATCC CCL51). The selection of an appropriate host cell is within the common general knowledge of this field.
[0115]
3. Selection and use of replicable vectors
Nucleic acid (eg, cDNA or genomic DNA) encoding a PRO polypeptide is inserted into a replicable vector for cloning (amplification of DNA) or expression. Various vectors are publicly available. The vector can be, for example, in the form of a plasmid, cosmid, virus particle, or phage. The appropriate nucleic acid sequence is inserted into the vector by a variety of techniques. In general, DNA is inserted into an appropriate restriction endonuclease site using techniques well known in the art. Vector components generally include, but are not limited to, one or more signal sequences, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. Standard ligation techniques known to those skilled in the art are used to make a suitable vector containing one or more of these components.
[0116]
PRO polypeptides are not only produced directly by recombinant techniques, but also fused to heterologous polypeptides, which are signal sequences or mature proteins or other polypeptides having a specific cleavage site at the N-terminus of the polypeptide. It is also produced as a peptide. In general, the signal sequence is a component of the vector, or a part of the PRO-encoding DNA that is inserted into the vector. The signal sequence may be, for example, a prokaryotic signal sequence selected from the group of alkaline phosphatase, penicillinase, lpp or thermostable enterotoxin II leader. For yeast secretion, signal sequences include yeast invertase leader, alpha factor leader (Saccharomyces and Kluyveromyces alpha factor leader, the latter described in US Pat. No. 5,010,182. Or an acid phosphatase leader, C. albicans glucoamylase leader (EP362179, issued April 4, 1990), or WO 90/13646 published on November 15, 1990. It can be a signal. In mammalian cell expression, mammalian signal sequences may be used for direct secretion of signal sequences from the same or related species of secreted polypeptides, as well as proteins such as viral secretion leaders.
[0117]
Both expression and cloning vectors contain a nucleic acid sequence that enables the vector to replicate in one or more selected host cells. Such sequences are well known for many bacteria, yeasts and viruses. The origin of replication from plasmid pBR322 is suitable for most gram-negative bacteria, the 2μ plasmid origin is suitable for yeast, and various viral origins (SV40, polyoma, adenovirus, VSV or BPV) is useful as a cloning vector for mammalian cells.
Expression and cloning vectors generally contain a selection gene, also termed a selectable marker. Typical selection genes are (a) confer resistance to antibiotics such as ampicillin, neomycin, methotrexate, or tetracycline, or other toxins, (b) compensate for auxotrophic defects, or (c) complex media. It encodes a protein that supplies a gene that encodes an important nutrient that cannot be obtained from, for example, D. alanine racemase of Bacillus.
[0118]
Examples of selectable markers suitable for mammalian cells are those that make it possible to identify cells that can take up a PRO-encoding nucleic acid, such as DHFR or thymidine kinase. Suitable host cells when using wild-type DHFR were prepared and expanded as described by Urlaub et al. In Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980). It is a defective CHO cell line. A suitable selection gene for use in yeast is the trp1 gene present in the yeast plasmid YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. The trp1 gene provides a selectable marker for a mutant strain of yeast lacking the ability to grow by tryptophan, for example, ATCC No. 44076, or PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
Expression and cloning vectors usually contain a promoter operably linked to the PRO-encoding nucleic acid sequence to control mRNA synthesis. Promoters that are recognized by a variety of potential host cells are known. Suitable promoters for use in prokaryotic hosts include β-lactamase and lactose promoter systems [Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], alkaline phosphatase, Tryptophan (trp) promoter system [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EP 36,776], and hybrid promoters such as the tac promoter [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21 -25 (1983)]. Promoters used in bacterial systems also have a Shine-Dalgarno (SD) sequence operably linked to the DNA encoding the PRO polypeptide.
[0119]
Examples of suitable promoter sequences for use in yeast hosts include 3-phosphoglycerate kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)] or other glycolytic enzymes [Hess et al., J Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4900 (1987)], eg enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, pyruvate decarboxylase, phosphofructokinase Glucose-6-phosphate isomerase, 3-phosphoglycerate mutase, pyruvate kinase, trioselate isomerase, phosphoglucose isomerase, and glucokinase.
Other yeast promoters that are inducible promoters with the additional effect that transcription is controlled by growth conditions include alcohol dehydrogenase 2, isocytochrome C, acid phosphatase, degrading enzymes related to nitrogen metabolism, metallothionein, glyceraldehyde- There is a promoter region of 3-phosphate dehydrogenase and the enzymes that govern the utilization of maltose and galactose. Suitable vectors and promoters for use in expression in yeast are further described in EP 73,657.
[0120]
PRO polypeptide transcription from mammalian host cell vectors includes, for example, polyoma virus, infectious epithelioma virus (UK 2,211,504 published July 5, 1989), adenovirus (eg, adenovirus 2), bovine papilla Promoters derived from the genomes of viruses such as tumor virus, avian sarcoma virus, cytomegalovirus, retrovirus, hepatitis B virus and simian virus 40 (SV40), heterologous mammalian promoters such as actin promoter, or immunoglobulin promoter As well as promoters derived from heat shock promoters are controlled by these promoters if they are compatible with the host cell system.
Transcription of the DNA encoding the desired PRO polypeptide by higher eukaryotes may be enhanced by inserting an enhancer sequence into the vector. Enhancers are cis-acting elements of DNA, usually about 10 to 300 base pairs, that act on a promoter to enhance its transcription. Many enhancer sequences are now known from mammalian genes (globin, elastase, albumin, α-fetoprotein and insulin). In general, however, enhancers from eukaryotic cell viruses will be used. Examples include the late SV40 enhancer (100-270 base pairs) of the origin of replication, the early promoter of cytomegalovirus, the polyoma enhancer late of the origin of replication, and the adenovirus enhancer. Enhancers may be spliced into the vector at the 5 ′ or 3 ′ position of the PRO polypeptide coding sequence, but are preferably located 5 ′ of the promoter.
[0121]
Expression vectors used in eukaryotic host cells (nucleated cells from yeast, fungi, insects, plants, animals, humans, or other multicellular organisms) are also required for transcription termination and mRNA stabilization. Also includes sequences. Such sequences can usually be obtained from the 5 ′ and sometimes 3 ′ untranslated regions of eukaryotic or viral DNA or cDNA. These regions contain nucleotide segments transcribed as polyadenylated fragments in the untranslated portion of the mRNA encoding the PRO polypeptide.
Still other methods, vectors and host cells suitable for adapting to the synthesis of PRO polypeptides in recombinant vertebrate cell culture are described in Gething et al., Nature, 293: 620-625 (1981); Mantei et al., Nature 281: 40-46 (1979); EP 117,060; and EP 117,058.
[0122]
4). Gene amplification / expression detection
Amplification and / or expression of the gene is based on the sequences provided herein, using appropriately labeled probes, eg, conventional Southern blotting, Northern blotting to quantify mRNA transcription [Thomas, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], dot blot method (DNA analysis), or in situ hybridization method. Alternatively, antibodies capable of recognizing specific double strands, including DNA double strands, RNA duplexes and DNA-RNA hybrid duplexes or DNA-protein duplexes, can also be used. The antibody can then be labeled and an assay can be performed, where the duplex is bound to the surface, so that the antibody bound to the duplex at the time of formation on the surface of the duplex is bound. The presence can be detected.
Alternatively, gene expression can be measured by immunological methods that directly quantify gene product expression, such as immunohistochemical staining of cells or tissue sections and cell culture or body fluid assays. Antibodies useful for immunohistochemical staining and / or assay of sample fluids can be monoclonal or polyclonal and can be prepared in any mammal. Conveniently, the antibody is directed against a native sequence PRO polypeptide or against a synthetic peptide based on the DNA sequence provided herein, or an exogenous sequence fused to PRO DNA and encoding a specific antibody epitope. Can be prepared.
[0123]
5. Purification of polypeptides
The PRO polypeptide form can be recovered from the culture medium or from the lysate of the host cell. If membrane-bound, it can be detached from the membrane using an appropriate wash solution (eg Triton-X100) or enzymatic cleavage. Cells used for the expression of PRO polypeptides can be disrupted by various chemical or physical means such as freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cytolytic agents.
[0124]
It may be desirable to purify the PRO polypeptide from recombinant cell proteins or polypeptides. An example of a suitable purification procedure is purified by the following procedure: fractionation on an ion exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin such as DEAE; chromatofocusing; PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; protein A sepharose column to remove contaminants such as IgG; and metal chelation column to bind the epitope tag form of the PRO polypeptide. It is possible to use many protein purification methods known in the art and described, for example, in Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). it can. The purification process chosen depends, for example, on the production method used and in particular on the nature of the particular PRO produced.
[0125]
E. antibody
Some of the candidate agents for use in the compositions and methods of the invention are antibodies and antibody fragments that mimic the biological activity of PRO polypeptides.
1. Polyclonal antibody
Methods for preparing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. Polyclonal antibodies in mammals can be generated by one or more injections of, for example, an immunizing agent and, if desired, an adjuvant. Typically, the mammal is injected with the immunizing agent or adjuvant by multiple subcutaneous or intraperitoneal injections. The immunizing agent can comprise a PRO polypeptide or a fusion protein thereof. It is useful to conjugate the immunizing agent to a protein that is known to be immunogenic in the immunized mammal. Examples of such immunogenic proteins include, but are not limited to, keyhole limpet hemocyanin, serum albumin, bovine thyroglobulin, and soybean trypsin inhibitor. Examples of adjuvants that can be used include Freund's complete adjuvant and MPL-TDM adjuvant (monophosphoryl lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate). The immunization protocol will be selected by one skilled in the art without undue experimentation.
[0126]
2. Monoclonal antibody
Alternatively, the antibody may be a monoclonal antibody. Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method as described in Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975). In hybridoma methods, mice, hamsters or other suitable host animals are typically immunized with an immunizing agent to generate antibodies that specifically bind to the immunizing agent or to generate lymphocytes that can be generated. Trigger. Lymphocytes can also be immunized in vitro.
[0127]
The immunizing agent typically comprises a PRO polypeptide or a fusion protein thereof. Generally, peripheral blood lymphocytes ("PBL") are used when human-derived cells are desired, or spleen cells or lymph node cells are used when non-human mammalian sources are desired. The The lymphocytes are then fused with an immortal cell line using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103. ]. Immortal cell lines are usually transformed mammalian cells, particularly myeloma cells from rodents, cows and humans. Usually, rat or mouse myeloma cell lines are used. The hybridoma cells are preferably cultured in a suitable medium containing one or more substances that inhibit the survival or growth of unfused, immortalized cells. For example, if the parent cell lacks the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT), the hybridoma medium typically contains hypoxatin, aminopetitin and thymidine ("HAT medium"). This substance prevents the growth of HGPRT-deficient cells.
[0128]
Preferred immortal cell lines are those that fuse efficiently, support stable high levels of antibody expression by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium. A more preferred immortal cell line is the mouse myeloma line, which is available, for example, from the Salk Institute Cell Distribution Center in San Diego, California and the American Type Culture Collection in Manassas, VA. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines for producing human monoclonal antibodies have also been disclosed [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984), Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63].
The culture medium in which the hybridoma cells are cultured is then assayed for the presence of monoclonal antibodies against the PRO polypeptide. Preferably, the binding specificity of the monoclonal antibody produced by the hybridoma cells is measured by an immunoprecipitation or in vitro binding assay such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunoassay (ELISA). Such techniques and assays are known in the art. The binding affinity of the monoclonal antibody can be measured, for example, by the Scatchard assay by Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
[0129]
After the desired hybridoma cells are identified, clones can be subcloned by the limiting dilution method and grown by standard methods [Goding, supra]. Suitable media for this purpose include, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium and RPMI-1640 medium. Alternatively, the hybridoma cells can be grown as ascites in vivo in a mammal.
Monoclonal antibodies secreted by the subclone can be isolated from the culture medium or ascites fluid by conventional immunoglobulin purification methods such as protein A-Sepharose method, hydroxylapatite chromatography method, gel electrophoresis method, dialysis method or affinity chromatography. Separated or purified.
[0130]
Monoclonal antibodies can also be made by recombinant DNA methods, such as those described in US Pat. No. 4,816,567. The DNA encoding the monoclonal antibody of the present invention can be easily obtained using a conventional method (for example, using an oligonucleotide probe capable of specifically binding to the gene encoding the heavy and light chains of the mouse antibody). Can be isolated and sequenced. The hybridoma cells of the present invention are a preferred source of such DNA. Once isolated, the DNA can be placed in an expression vector that transfects a host cell, such as a monkey COS cell, a Chinese hamster ovary (CHO) cell, or a myeloma cell that does not produce immunoglobulin protein. The monoclonal antibody can be synthesized in a recombinant host cell. Alternatively, the DNA may be non-immune to immunoglobulin coding sequences, for example by replacing coding sequences of human heavy and light chain constant domains in place of homologous mouse sequences [US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Supra]. Modification can be made by covalently binding part or all of the coding sequence of a globulin polypeptide. Such a non-immunoglobulin polypeptide substitutes for the constant domain of the antibody of the invention or substitutes for the variable domain of one antigen binding site of the antibody of the invention to produce a chimeric bivalent antibody. can do. Such non-immunoglobulin polypeptides can be substituted for the constant domains of the antibodies of the invention, or can be substituted for the variable domains of one antigen binding site of the antibodies of the invention, producing chimeric bivalent antibodies.
[0131]
The antibody may be a monovalent antibody. Methods for preparing monovalent antibodies are well known in the art. For example, one method involves recombinant expression of immunoglobulin light chains and modified heavy chains. The heavy chain is generally cleaved at any point in the Fc region so as to prevent heavy chain crosslinking. Alternatively, the relevant cysteine residues are substituted or deleted with other amino acid residues to prevent crosslinking.
In vitro methods are also suitable for preparing monovalent antibodies. Generation of fragments thereof, particularly Fab fragments, by antibody digestion can be accomplished using conventional techniques known in the art.
[0132]
3. Human and humanized antibodies
The antibodies of the present invention further include humanized antibodies or human antibodies. Humanized forms of non-human (eg mouse) antibodies are chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof (eg Fv, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 Or other antigen-binding subsequence of the antibody), which contains a minimal sequence derived from non-human immunoglobulin. A humanized antibody is a CDR residue of a non-human species (donor antibody) in which the complementarity determining region (CDR) of the recipient has the desired specificity, affinity and ability, such as mouse, rat or rabbit. Human immunoglobulin (recipient antibody) substituted by In some examples, human immunoglobulin Fv framework residues are replaced by corresponding non-human residues. Humanized antibodies may also contain residues which are found neither in the recipient antibody nor in the imported CDR or framework sequences. Generally, a humanized antibody has at least one, typically all or almost all CDR regions corresponding to those of a non-human immunoglobulin and all or almost all FR regions of a human immunoglobulin consensus sequence, typically Contains substantially all of the two variable domains. Humanized antibodies optimally comprise at least part of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); and Presta, Curr. Op Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
[0133]
Methods for humanizing non-human antibodies are well known in the art. Generally, one or more amino acid residues derived from non-human are introduced into a humanized antibody. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization essentially involves winter and co-workers [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann by replacing the corresponding sequence of a human antibody with a rodent CDR or CDR sequence. Et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)] by replacing the rodent CDR or CDR sequence with the corresponding sequence of a human antibody. To be implemented. Thus, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No. 4,816,567) wherein substantially less than an intact human variable domain has been substituted with the corresponding sequence from a non-human species. In practice, humanized antibodies are typically human antibodies in which some CDR residues and possibly some FR residues are substituted by residues from analogous sites in rodent antibodies.
[0134]
Human antibodies also include phage display libraries [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. It can also be created using various known methods. Also, techniques such as Cole et al. And Boerner et al. Can be used to prepare human monoclonal antibodies (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. P. 77 (1985; Boerner et al., J. Immunol. 147 (1): 86-95 (1991)) Similarly, human antibodies introduce human immunoglobulin loci into transgenic animals, eg, mice in which endogenous immunoglobulin genes are partially or completely inactivated. Upon loading, human antibody production is observed that is very similar to that found in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly, and antibody repertoire. For example, US Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, and the following scientific literature: Marks et al., Bio / Technology 10, 779- 783 (1992); Lonberg et al., Nature 36 8 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern Rev. Immunol. 13 65-93 (1995).
[0135]
4). Bispecific antibody
Bispecific antibodies are monoclonal, preferably human or humanized, antibodies that have binding specificities for at least two different antigens. In the present invention, one of the binding specificities is for a PRO polypeptide and the other is for any other antigen, preferably a cell surface protein, or receptor or receptor subunit.
Methods for making bispecific antibodies are well known in the art. Traditionally, recombinant production of bispecific antibodies is based on the co-expression of two immunoglobulin heavy / light chain pairs where the two heavy chains have different specificities (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Because of the random assortment of immunoglobulin heavy and light chains, these hybridomas (quadromas) produce a potential mixture of 10 different antibody molecules, only one of which has the correct bispecific structure. Purification of the correct molecule is usually accomplished by an affinity chromatography step. Similar procedures are disclosed in WO 93/08829 published May 13, 1993, and Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).
[0136]
Antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) can be fused to immunoglobulin constant domain sequences. This fusion is preferably with an immunoglobulin heavy chain constant domain, comprising at least part of the hinge, CH2 and CH3 regions. Desirably, at least one fusion has a first heavy chain constant region (CH1) containing the site necessary for light chain binding. The DNA encoding the immunoglobulin heavy chain fusion and, if desired, the immunoglobulin light chain are inserted into separate expression vectors and cotransfected into a suitable host microorganism. For further details of generating bispecific antibodies see, for example, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
According to other methods described in WO 96/27011, the interface between a pair of antibody molecules can be manipulated to maximize the percentage of heterodimers recovered from recombinant cell culture. A preferred interface comprises at least part of the CH3 domain of an antibody constant domain. In this method, one or more small amino acid side chains from the interface of the first antibody molecule are replaced with larger side chains (eg tyrosine or tryptophan). A complementary “cavity” of the same or smaller size as the large side chain is created at the interface of the second antibody molecule by replacing the large amino acid side chain with a small one (alanine or threonine). This provides a mechanism for increasing the yield of heterodimers over other unwanted end products such as homodimers.
[0137]
Bispecific antibodies can be full length antibodies or antibody fragments (eg, F (ab ′) 2 Bispecific antibodies). Techniques for producing bispecific antibodies from antibody fragments have also been described in the literature. For example, bispecific antibodies can be prepared using chemical linkage. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) proteolytically cleaves intact antibody to F (ab ') 2 Describes the procedure for generating fragments. These fragments are reduced in the presence of the dithiol complexing agent sodium arsenite to stabilize vicinal dithiols and prevent intermolecular disulfide formation. The resulting Fab ′ fragment is then converted to a thionitrobenzoate (TNB) derivative. One of the Fab′-TNB derivatives is then reconverted to Fab′-thiol by reduction with mercaptoethylamine and mixed with an equimolar amount of other Fab′-TNB derivatives to form bispecific antibodies. This generated bispecific antibody can be used as a drug for selective immobilization of an enzyme.
Fab ′ fragments may be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form bispecific antibodies. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describes a fully humanized bispecific antibody F (ab ′). 2 The production of molecules is described. Each Fab ′ fragment was secreted separately from E. coli and directional chemical conjugated in vitro to form bispecific antibodies. The bispecific antibody thus formed is capable of binding to cells overexpressing ErbB2 receptor and normal human T cells, and exhibits lytic activity of human cytotoxic lymphocytes against human breast tumor targets. Trigger.
[0138]
Also described are various techniques related to making and isolating bispecific antibody fragments directly from recombinant cell culture. For example, bispecific antibodies have been produced using leucine zippers. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Fos and Jun protein leucine zipper peptides were conjugated to the Fab ′ portions of two different antibodies by gene fusion. Antibody homodimers are reduced at the hinge region to form monomers and then reoxidized to form antibody heterodimers. This method can also be used for the production of antibody homodimers. The “diabody” technology described by Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) presents another mechanism for generating bispecific antibody fragments. This fragment is linked to a light chain variable domain (V by a linker that is too short to allow pairing between two domains on the same chain. L ) And a heavy chain variable domain (V H ) Is included. Thus, one fragment's V H And V L A domain is a complementary V of another fragment. L And V H Forces pairing with the domain, thereby forming two antigen-binding sites. Other methods for producing bispecific antibody fragments using single chain Fv (sFv) dimers have also been reported. See Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994).
[0139]
More than bivalent antibodies are also contemplated. For example, trispecific antibodies can be prepared. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Exemplary bispecific antibodies can bind to two different epitopes on the PRO polypeptide provided herein. Alternatively, to focus the cellular defense mechanism on cells that express a particular PRO polypeptide, the anti-PRO polypeptide arm can be a trigger molecule on leukocytes such as a T cell receptor molecule (eg, CD2, CD3, CD28 or B7). Alternatively, it may be bound to an arm that binds to an Fc receptor (FcγR) of IgG such as FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) and FcγRIII (CD16). Bispecific antibodies may be used to localize cytotoxic agents to cells that express a particular PRO polypeptide. These antibodies have a PRO-binding arm and an arm that binds to a cytotoxic agent or chelating agent such as EOTUBE, DPTA, DOTA, or TETA. Other bispecific antibodies of interest bind to the PRO polypeptide and further bind to tissue factor (TF).
[0140]
5. Heteroconjugate antibody
Heteroconjugate antibodies are also within the scope of the present invention. Heteroconjugate antibodies are composed of two covalently bound antibodies. Such antibodies are used, for example, to target unwanted cells of immune system cells [US Pat. No. 4,676,980] and for the treatment of HIV infection [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Proposed. This antibody could be prepared in vitro using known methods in synthetic protein chemistry, including those related to cross-linking agents. For example, immunotoxins may be constructed using a disulfide exchange reaction or by forming a thioether bond. Examples of suitable reagents for this purpose include iminothiolate and methyl-4-mercaptobutyrimidate, and those disclosed, for example, in US Pat. No. 4,676,980.
[0141]
6). Effector function design
For example, to enhance the efficacy of an antibody in cancer therapy, it is desirable to modify the antibody of the present invention with respect to effector function. For example, cysteine residues may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region. The homodimeric antibody produced in this way may have improved internalization capability and / or increased complement-mediated cell killing, and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Homodimeric antibodies with enhanced anti-tumor activity may also be prepared using heterobifunctional crosslinkers as described in Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993) . Alternatively, an antibody can be designed that has a dual Fc region, thereby having enhanced complement lysis and ADCC ability. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
[0142]
7). Immunoconjugate
The present invention also contemplates chemotherapeutic agents, cytotoxic agents such as toxins (eg, enzyme-active toxins from bacteria, fungi, plants or animals, or fragments thereof), or radioisotopes (ie, radioconjugates). And an immunoconjugate comprising the antibody.
Chemotherapeutic agents useful for the production of such immunoconjugates have been described above. Enzyme-active toxins and fragments thereof that can be used include diphtheria A chain, non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A Chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii protein, dianthin protein, Phytolaca americana protein (PAPI, PAPII, and PAP-S), momordica charantia inhibitor, Curcin, crotin, sapaonaria oficinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, phenomycin, enomycin and trichothecene ( tricothecene). A variety of radioactive nucleotides are available for the production of radioconjugated antibodies. For example, 212 Bi, 131 I, 131 In, 90 Y and 186 Re is included.
[0143]
Conjugates of antibodies and cytotoxic agents can be selected from various bifunctional protein coupling agents such as N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithiol) propionate (SPDP), iminothiolane (IT), imidoester bifunctionality. Derivatives (such as dimethyl adipimidate HCL), active esters (such as disuccinimidyl suberate), aldehydes (such as glutaraldehyde), bis-azide compounds (such as bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine), bis-diazonium Using derivatives (such as bis- (p-diazoniumbenzoyl) -ethylenediamine), diisocyanates (such as triene 2,6-diisocyanate), and bis-active fluorine compounds (such as 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene) Can be created. For example, a ricin immunotoxin can be prepared as described in Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylenetriaminepentaacetic acid (MX-DTPA) is an example of a chelating agent for conjugation of radionucleotide to an antibody. See WO94 / 11026.
In other embodiments, the antibody may be conjugated to a “receptor” (such as streptavidin) for use in pre-targeting the tumor, the antibody-receptor conjugate is administered to the patient, and then a clarifier is applied. Used to remove unbound conjugates from the circulation, followed by administration of a “ligand” (eg, avidin) conjugated to a cytotoxic agent (eg, a radionucleotide, etc.).
[0144]
8). Immunoliposome
The antibodies disclosed herein may also be prepared as immunoliposomes. Liposomes containing antibodies are described in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); Prepared by methods well known in the art such as described in US Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Liposomes with improved circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
Particularly useful liposomes are generated by the reverse phase evaporation method with a lipid composition comprising phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through a filter of a predetermined size to produce liposomes having a desired diameter. Fab ′ fragments of antibodies of the invention can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction as described in Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982). A chemotherapeutic agent (such as doxorubicin) is optionally contained within the liposome. See Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
[0145]
F. Identification of proteins that can inhibit neoplastic cell growth or proliferation
The proteins disclosed in this application were assayed in a panel of 60 tumor lines currently used in the National Cancer Society (NCI) experimental, disease-oriented, in vitro drug screening. The purpose of this screening is to identify molecules with cytotoxic and / or cytostatic activity against different types of tumors. NCI screens more than 10,000 new molecules every year (Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3 (10): 1-12 [1989]). The tumor cell lines used in this experiment are described in Monks et al. Cell lines whose growth was significantly inhibited by the proteins of this application were identified in the examples.
[0146]
The results revealed that the tested proteins were cytostatic in various cancer cell lines and cytotoxic activity in some cases and concentrations.
Other cell-based assays and animal models for tumors (eg cancer) can also be used to support the discovery of NCI cancer screening and to further understand the relationship between the proteins identified here and the progression and pathogenesis of neoplastic cells. . For example, primary media derived from tumors of transgenic animals (as described below) can be used in the cell-based assays herein. Techniques for deriving continuous cell lines from transgenic animals are well known in the art (see, eg, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 [1985]).
[0147]
G. Animal model
To further understand the role of the genes identified here in tumor progression and pathogenesis and to test the efficacy of candidate therapeutics including antibodies and other agonists of natural polypeptides, including small molecule agonists Various well-known animal models can be used. The in vivo nature of these models can predict response, particularly in human patients. Animal models of tumors and cancers (eg, breast cancer, colon cancer, prostate cancer, lung cancer, etc.) include both non-recombinant and recombinant (transgenic) animals. Non-recombinant animal models include, for example, rodents such as mouse models. Such models include standard techniques such as subcutaneous injection, tail vein injection, spleen transplantation, intraperitoneal transplantation, subrenal transplantation, or orthopin transplantation, such as colon cancer cells transplanted into colon tissue. In use, it can be generated by introducing tumor cells into syngeneic mice. (See PCT publication WO 97/33551 issued on September 18, 1997.)
[0148]
Probably the most frequently used animal species in oncogene research is immunodeficient mice, especially nude mice. The finding that hypo / hypoplastic nude mice serve as a host for human tumor xenografts has led to their widespread use for this purpose. An autosomal recessive nu gene is, for example, ASW, A / He, AKR, BALB / c, B10. A large number of different nude mice including LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I / st, NC, NFR, NFS, NFS / N, NZB, NZC, NZW, P, RIII and SJL It was introduced into a common gene line. In addition, a wide range of other animals other than nude mice with genetic immune deficiency have been grown and used as recipients for tumor xenografts. For further details, see The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, CRC Press, Inc., 1991.
[0149]
Cells introduced into these animals include well-known tumor / cancer cell lines, such as any of the tumor cell lines listed above, and the stable NIH transfected with, for example, the B104-1-1 cell line (neu proto-oncogene). -3T3 cell line); ras-transfected NIH-3T3 cells: Caco-2 (ATCC HTB-37), moderately well differentiated grade II human colon adenocarcinoma cell line, HT-29 (ATCC HTB-38), Alternatively, it can be derived from tumors and cancer. Tumor or cancer cell samples can be obtained from patients undergoing surgery using standard conditions including freezing and storage in liquid nitrogen (Karmali et al., Br. J. Cancer 48, 689). -696 [1983]).
[0150]
Tumor cells can be introduced into animals such as nude mice by various techniques. The subcutaneous (sc) space of mice is very suitable for tumor transplantation. Tumors can be obtained as a solid block, as a needle biopsy using a trochar, or as a cell suspension. c. Can be transplanted. For solid block or trochar transplants, appropriately sized tumor tissue fragments are s. c. Introduced into space. Cell suspensions are freshly prepared from primary tumors or stable tumor cell lines and injected subcutaneously. Tumor cells can also be injected as subcutaneous implants. In this position, the inoculum is s. c. It is deposited between the tissues. Boven and Winograd (1991), supra. Animal models of breast cancer include, for example, transplantation of rat neuroblastoma cells (from which the neu oncogene is first isolated), or basically Drebin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9129. -9133 (1986) can be generated by transplanting neu transfected NIH-3T3 cells into nude mice.
[0151]
Similarly, animal models of colon cancer are generated by passaging colon cancer cells to animals, such as nude mice, and leading to the development of tumors in these animals. Orthotopic transplantation models of human colon cancer in nude mice are described, for example, in Wang et al., Cancer Research 54, 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research 55, 681-684 (1995). This model is based on “METAMOUSE” commercially available from AntiCancer, Inc. (San Diego, California).
Tumors that arise in animals can be removed and cultured in vitro. Cells in vitro cultured can then be passaged to animals. These tumors can be targets for further testing and drug screening. Alternatively, tumors obtained at this passage can be isolated and RNA of the cells prior to passage and cells isolated after one or more passages are analyzed for differential expression of the gene of interest. To do. Such passaging techniques can be performed on well-known tumor or cancer cell lines.
[0152]
For example, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21, and WEHI-164 are chemically induced fibrosarcoma (DeLeo et al., J. Exp. Med. 146, 720 [1977]) in BALB / c female mice. Provides a highly controllable model system for the study of anti-tumor activity of various antigens (Palladino et al., J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987]). In summary, tumor cells are grown in vitro in cell culture media. Before injecting the animal, the cell line is washed to approximately 10 × 10 6 To 10x10 7 Suspend in buffer at a cell density of cells / ml. Animals are then infected subcutaneously with 10-100 μl of cell suspension and left for 1-3 weeks until tumors appear.
Furthermore, the mouse Lewis lung (3LL) carcinoma, one of the most thoroughly studied experimental tumors, can be used as a tumor model for research. Efficacy in this tumor model correlated with beneficial effects in the treatment of human patients diagnosed with small cell carcinoma of the lung (SCCL). This tumor can be introduced into normal mice by injection of affected mouse tumor fragments, or cells maintained in media (Zupi et al., Br. J. Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980] ), Evidence indicates that the tumor starts with an injection of only one cell and a very high proportion of infected tumor cells survive. For more information on this tumor model, see Zacharski, Haemostasis 16, 300-320 [1986].
[0153]
One way to evaluate the effectiveness of a test compound against a transplanted tumor in an animal model is to measure the size of the tumor before and after treatment. Traditionally, the size of the implanted tumor has been measured with a two or three dimensional slide caliper. Measurements limited to two dimensions do not accurately reflect the size of the tumor and are therefore usually converted to corresponding volumes using mathematical formulas. However, measurement of tumor size is very inaccurate. The therapeutic effect of a candidate drug can be better described by treatment-induced growth delay and specific growth delay. Another important variable in the description of tumor growth is tumor volume doubling time. Computer programs for calculating and describing tumor growth are also available, such as the program reported by Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng, Basel, 1989, 301 It is. However, it is noted that the necrosis and inflammatory response following the tumor can actually result in an increase in tumor size, at least early. Therefore, these changes need to be carefully monitored using a combination of morphological methods and flow cytometric analysis.
[0154]
Recombinant (transgenic) animal models can be processed using standard techniques for transgenic animal production by introducing the coding portion of the gene identified here into the genome of the animal of interest. . Animals that can be targeted for transgenic manipulation include, but are not limited to, mice, rats, rabbits, guinea pigs, sheep, goats, pigs, and non-human primates such as baboons, chimpanzees and monkeys. Techniques well known in the art for introducing transgenes into these animals include pronuclear microinjection (Hoppe and Wanger, US Pat. No. 4,873,191); retrovirus-mediated gene transfer to the embryonic lineage (eg, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]); Gene targeting in embryonic hepatocytes (Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]); (Lo, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]); sperm-mediated gene transfer (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]). For review, see, for example, US Pat. No. 4,736,866.
[0155]
For the purposes of the present invention, transgenic animals include those having a transgene only in a portion of their cells ("mosaic animals"). This transgene can be incorporated as a single transgene or as a concatamer, eg, head-to-head or head-to-tail tandem. Selective introduction of transgenes into specific cell types is also possible, for example, by the technique of Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992).
Transgene expression in transgenic animals can be monitored by standard techniques. For example, Southern blot analysis or PCR amplification can be used to confirm transgene integration. The level of mRNA expression can then be analyzed using techniques such as in situ hybridization, Northern blot analysis, PCR, or immunohistochemistry. The animal is further examined for signs of tumor or cancer development.
[0156]
The effectiveness of antibodies that specifically bind to the polypeptides identified herein, as well as other candidate drugs, in the treatment of spontaneous animal tumors can also be tested. A suitable target for such studies is feline oral squamous cell carcinoma (SCC). The cat oral SCC is a highly invasive malignant tumor, the most frequently occurring oral malignant tumor in cats, accounting for more than 60% of the oral tumors reported in this species. It rarely metastasizes to distant sites, but this low incidence of metastasis may only reflect the short survival of cats with this tumor. These tumors are usually inoperable because of the cat's oral anatomy. There is currently no effective treatment for this tumor. Prior to entering the study, each cat undergoes a complete clinical examination, biopsy, and is scanned by computed tomography (CT). Cats diagnosed with sublingual oral squamous cell tumors were excluded from the study. The tongue is paralyzed due to the tumor, and even if the treatment kills the tumor, the animal will not be able to feed itself. Each cat is treated repeatedly over time. During the treatment period, a picture of the tumor is taken daily and rechecked after each acquisition. After treatment, each cat was again CT scanned. CT scans and radiographs were evaluated every 8 weeks thereafter. Data were evaluated for differences in survival, reactivity and toxicity compared to the control group. A positive response requires tumor shrinkage, preferably improved quality of survival and / or prolonged survival.
In addition, other spontaneous animal tumors such as canine, feline and baboon fibrosarcoma, adenocarcinoma, lymphoma, chrondroma, leiomyosarcoma can also be tested. Breast cancer in these dogs and cats is a preferred model because its expression and behavior is very similar to that of humans. However, the use of this model is limited by the rare development of this type of tumor in animals.
[0157]
H. Screening assays for candidate drugs
Screening assays for candidate drugs are designed to identify compounds that competitively bind to or complex with the receptors of the polypeptides identified herein, or other signals through such receptors. Such screening assays include assays that follow high-throughput screening of chemical libraries, making them particularly suitable for the identification of small molecule drug candidates. Possible small molecules include antibody synthetic organic or inorganic compounds, which are peptides, preferably soluble peptides, (poly) peptide-immunoglobulin fusions, particularly but not limited to poly- and monoclonal antibodies and antibodies. It includes fragments, single chain antibodies, anti-idiotype antibodies, and chimeric or humanized forms of those antibodies or fragments, as well as antibodies, including human antibodies and antibody fragments. Assays can be performed in a variety of formats, including protein-protein binding assays, biochemical screening assays, immunoassays, and cell-based assays that are well characterized in the art.
[0158]
In binding assays, the interaction is binding and the complex formed can be isolated or detected in the reaction mixture. In a particular embodiment, the polypeptide receptor or candidate drug encoded by the gene identified herein is immobilized to a solid phase, such as a microtiter plate, by covalent or non-covalent bonding. Non-covalent bonding is generally accomplished by coating a solid surface with a solution of the polypeptide and drying. Alternatively, an immobilized antibody specific for the polypeptide to be immobilized, such as a monoclonal antibody, can be used to anchor it to a solid surface. This assay is performed by adding an immobilization component, such as a non-immobilization component, that may be labeled with a detectable label to the coated surface containing the anchoring component. When the reaction is completed, unreacted components are removed, for example, by washing, and the complex adhered to the solid surface is detected. If the first non-immobilized component has a detectable label, detection of the label immobilized on the surface indicates that complex formation has occurred. If the initial non-immobilized component does not have a label, complex formation can be detected, for example, by a labeled antibody that specifically binds to the immobilized complex.
[0159]
If the candidate compound interacts but does not bind to a particular receptor, its interaction with the polypeptide can be assayed by well-known methods for detecting protein-protein interactions. Such assays include traditional techniques such as cross-linking, co-immunoprecipitation, and co-purification through gradient or chromatographic columns. Furthermore, protein-protein interactions have been described by Fields and co-workers, as disclosed in Chevray and Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)] [Fiels and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)] to monitor by using a yeast-based gene system be able to. Many transcriptional activators, such as yeast GAL4, consist of two physically separate modular domains, one that acts as a DNA binding domain and the other that functions as a transcriptional activation domain. The yeast expression system described in the previous literature (commonly referred to as the “2-hybrid system”) takes advantage of this property, on the one hand the target protein is fused with the DNA binding domain of GAL4 and on the other hand a candidate. Two hybrid proteins are used in which the activation protein to be fused to the activation domain. Expression of the GAL1-lacZ reporter gene under the control of a GAL4-activated promoter depends on reconstitution of GAL4 activity through protein-protein interactions. Colonies containing interacting polypeptides are detected with a chromogenic substance for β-galactosidase. A complete kit (MATCHMAKER ™) for identifying protein-protein interactions between two specific proteins using the two-hybrid technology is commercially available from Clontech. This system can also be extended to the mapping of protein domains involved in a particular protein interaction as well as the identification of amino acid residues important for this interaction.
[0160]
I. Pharmaceutical composition
Polypeptides of the invention, agonist antibodies that specifically bind to the proteins identified herein, as well as other molecules identified by the screening assays disclosed herein, are useful for the treatment of tumors, including cancer. It can be administered in the form.
Where antibody fragments are used, the smallest inhibitory fragment that specifically binds to the binding domain of the target protein is preferred. For example, peptide molecules that retain the ability to bind to a target protein sequence can be designed based on the variable region sequence of the antibody. Such peptides can be synthesized chemically and / or produced by recombinant DNA techniques (eg, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]).
The formulation herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or in addition, the composition may include an agent that improves its function, such as a cytotoxic agent, cytokine, chemotherapeutic agent, or growth inhibitory agent. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
[0161]
The therapeutic formulations of the polypeptides identified herein, or their agonists, are in the form of lipophilic formulations or aqueous solutions with the active ingredient having the desired degree of purity in any pharmaceutically acceptable carrier, supplement. Prepared and stored by mixing with a form or stabilizer (Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]). Acceptable carriers, excipients, or stabilizers are nontoxic to recipients at the dosages and concentrations used, and buffers such as phosphoric acid, citric acid, and other organic acids; ascorbic acid and methionine Antioxidants containing; preservatives (octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol; butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclo Hexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than about 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin, or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; glycine Amino acids such as glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides including glucose, mannose, or dextrin, and other carbohydrates, chelating agents such as EDTA, sugars such as sucrose, mannitol, trehalose or sorbitol; Salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg, Zn-protein complexes) and / or nonionic such as TWEEN (trade name), PLURONICS (trade name), and polyethylene glycol (PEG) Contains a surfactant.
[0162]
The formulations herein may also contain more than one active compound as necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. Alternatively or in addition, the composition may comprise a cytotoxic agent, cytokine or growth inhibitor. These molecules are suitably present in combination in amounts that are effective for the purpose intended.
The active ingredients can also be used in colloidal drug delivery systems (for example, in microcapsules prepared by coacervation techniques or by interfacial polymerization, such as hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly (methyl methacrylate) microcapsules, respectively. , Liposomes, albumin globules, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or microemulsions. These techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Formulations used for in vivo administration must be sterile. This is easily accomplished by filtration through sterile filtration membranes.
The therapeutic antibody composition is generally placed in a container with a sterile access port, such as an intravenous solution bag or a bag or vial with a stopper pierceable with a hypodermic needle.
[0163]
Sustained release formulations may be prepared. Suitable examples of sustained release formulations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing antibodies, which are in the form of shaped articles, such as films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyester hydrogels (eg, poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polyactides (US Pat. No. 3,773,919), L-glutamic acid and γ-ethyl-L- Degradable lactic acid-glycolic acid copolymers such as glutamate, non-degradable ethylene-vinyl acetate, LUPRON DEPOT (trade name) (injectable globules of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetate), poly- (D) -3- Hydroxybutyric acid is included. While polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid can release molecules for over 100 days, certain hydrogels release proteins in a shorter time. When encapsulated antibodies remain in the body for a long time, they denature or aggregate upon exposure to moisture at 37 ° C, resulting in reduced biological activity as well as possible immunogenic changes. Bring. Rational methods can be devised for stabilization depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be intermolecular S—S bond formation through thio-disulfide exchange, stabilization may include modification of sulfhydryl residues, lyophilization from acidic solutions, moisture content. Control, addition of appropriate additives, and development of specific polymer matrix compositions can be achieved.
[0164]
J. et al. Method of treatment
The polypeptides of the invention, including antibodies, peptides and small molecule agonists, and their agonists may be used for the treatment of various tumors such as cancer. Examples of conditions or diseases to be treated include benign or malignant tumors (eg, renal, liver, kidney, bladder, breast, stomach, ovary, colorectal, prostate, pancreas, lung, vulva, Thymus, hepatic carcinoma; sarcoma; glioblastoma; and various head and neck tumors); leukemia and lymphoid malignancies; neurons, glia, astrocytes, hypothalamus and glands, macrophages, epithelium, between Diseases such as quality and blastocoel disease; and inflammation, angiogenesis and immunological diseases. The antitumor agents of the present invention (including the polypeptides disclosed herein and agonists similar to their activity, including antibodies, peptides and small organic molecules) are well known in the art, for example, as a bolus or continuously over a period of time. Mammals by intravenous administration by injection or by intramuscular, intraperitoneal, intracerebral spinal cord, intraocular, intraarterial, intralesional, subcutaneous, interarticular, intrasynovial, intrathecal, oral, topical, or inhalation route, etc. Preferably administered to humans.
[0165]
Other therapeutic regimens may be combined with the administration of the anticancer agents of the invention. For example, patients treated with such anti-cancer agents may receive radiation therapy. Alternatively, or in addition, a chemotherapeutic agent may be administered to the patient. The preparation of such chemotherapeutic agents, as well as the dosing schedule, is used according to the manufacturer's instructions or determined empirically by skilled practitioners. Preparation methods for such chemotherapy and dosing schedules are also described in Chemotherapy Service, edited by MC Perry, Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1992). The chemotherapeutic agent may be administered prior to or subsequent to administration of the anti-tumor agent of the invention, or may be administered simultaneously. The anticancer agent of the present invention may be combined with a known dose of an antiestrogenic compound such as tamoxifen or an antiprogesterone such as onapristone (see EP 616812).
[0166]
It is also preferred to administer antibodies against tumor-associated antigens, such as antibodies that bind to ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, or vascular endothelial factor (VEGF). Alternatively or additionally, two or more antibodies that bind to the same or two or more different cancer-associated antigens may be co-administered to the patient. Sometimes it is also beneficial to administer cytokines to the patient. In a preferred embodiment, the anticancer agent herein is co-administered with a growth inhibitor. For example, a growth inhibitor is first administered, followed by administration of the anticancer agent of the present invention. However, simultaneous administration, or administration of the anticancer agent of the present invention first is also conceivable. A suitable dose for a growth inhibitor is the amount currently used and can be reduced by the combined (synergistic) effect of this growth inhibitor and the antibody herein.
[0167]
The appropriate dose of anti-tumor agent here for the prevention or treatment of disease is the type of disease being treated, the severity and course of the disease, as defined above, Whether or not it is administered, depends on the previous treatment, the patient's clinical history and response to the drug, and the discretion of the attending physician. The drug is suitably administered to the patient at one time or through a series of treatments. Animal experiments provide reliable guidance for determining effective doses for human therapy. Interspecific scaling of effective doses is described, for example, by Mordenti J. and Chappell. W. `` The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics '', Toxicokinetics and New Drug Development, edited by Yacobi et al., Pergamon Press, New York 1989, 42-49. Can be implemented according to the principle as claimed in
[0168]
For example, depending on the type and severity of the disease, for example, from about 1 μg / kg to 15 mg / kg (eg, 0.1-20 mg, whether by one or more separate doses or by continuous infusion) / Kg) of the anti-tumor agent is the first candidate volume for administration to the patient. A typical daily dose will be about 1 μg / kg to 100 mg / kg or more, depending on the above factors. For repeated administrations over several days or longer, depending on the condition, treatment continues until the desired suppression of symptoms is observed. However, other dosage regimens may be beneficial. The progress of this therapy is easily monitored by conventional techniques and assays. In particular, guidance on dosage and delivery methods is provided in the literature; see, for example, US Pat. Nos. 4,657,760, 5,206,344, or 5,255,212. Different dosage forms are effective for different therapeutic compounds and different diseases, eg administration targeted to one organ or tissue needs to be transported differently from other organs or tissues Is expected.
[0169]
K. Products
In another embodiment of the present invention, an article of manufacture containing materials useful for the diagnosis or treatment of the above diseases is provided. This product comprises a container and a label. Suitable containers include, for example, bottles, vials, syringes, and test tubes. The container may be formed from a material such as glass or plastic. The container contains a composition effective to diagnose and treat the condition and may have a sterile access port (e.g., the container may be an intravenous solution bag or vial with a stopper pierceable by a hypodermic needle). May be). The active agent in the composition is the antitumor agent of the present invention. The label on or on the container indicates that the composition is used for diagnosis or treatment of the selected condition. The article of manufacture may further comprise a second container containing a pharmaceutically acceptable buffer such as phosphate buffered saline, Ringer's solution and dextrose solution. It may further include other materials desirable from a commercial and user standpoint, including other buffers, diluents, filters, needles, syringes, and package inserts with instructions for use.
[0170]
The following examples are provided for purposes of illustration only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.
All patents and references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0171]
(Example)
Commercially available reagents referred to in the examples were used according to manufacturer's instructions unless otherwise indicated. The source of cells identified by the ATCC registration number throughout the following examples and specification is American Type Culture Collection, Manassas, VA.
[0172]
Example 1: Extracellular domain homology screening to identify novel polypeptides and cDNAs encoding them
Extracellular domain (ECD) sequences from approximately 950 known secreted proteins from the Swiss-Prot public database (including secreted signal sequences, if necessary) were used to search the EST database. This EST database included public databases (eg, Dayhoff, GenBank) and proprietary databases (eg, LIFESEQ (trade name), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA). The search was performed using the computer program BLAST or BLAST2 (Altschul and Gish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)) as a comparison of the ECD protein sequence with a 6-frame translation of the EST sequence. These comparisons of 70 Blast scores (possibly 90) or higher, which do not encode known proteins, are clustered with the program “phrap” (Phil Green, University of Washington, Seattle, WA) and consensus DNA sequences Built in.
Using this extracellular domain homology screen, consensus DNA sequences related to other identified EST sequences were constructed using phrap. In addition, this resulting consensus DNA sequence is often extended using repeated cycles of BLAST or BLAST-2 and pharp (if not all) and the consensus sequence is possible using the sources of EST sequences discussed above. As long as possible.
[0173]
Based on the consensus sequence obtained as described above, oligonucleotides are then synthesized, and a cDNA library containing the sequence of interest is identified by PCR, as well as a clone of the full-length coding sequence of the PRO polypeptide. It was used to use as a probe. Forward and reverse PCR primers are generally in the range of 20 to 30 nucleotides and are usually designed to give PCR products that are about 100-1000 bp long. The probe sequence is usually 40-55 bp long. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen several libraries for full-length clones, library DNA was screened by PCR amplification with PCR primer pairs as described by Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. A positive library was then used to isolate a clone encoding the gene of interest using one of the probe oligonucleotide and primer pair.
The cDNA library used for the isolation of cDNA clones was prepared by standard methods using commercially available reagents such as Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, roughly sized by gel electrophoresis, and an appropriate cloning vector (such as pRKB or pRKD; pRK5B Is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), cloned in the specified orientation at unique XhoI and NotI sites.
[0174]
Example 2: Isolation of cDNA clones using signal algorithm analysis
Sequence discovery algorithms originally developed by Genentech, Inc. (South San Francisco, California) are public (eg, GenBank) and / or personal (LIFESEQ®, Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) databases Various polypeptide-encoding nucleic acid sequences were identified by application to ESTs as well as EST fragments assembled and assembled from. This signal sequence algorithm calculates a secretory signal score based on the characteristics of the DNA nucleotide surrounding the first or second methionine codon (ATG) at the 5 ′ end of the sequence or sequence fragment under consideration. The nucleotide following the first ATG must encode at least 35 distinct amino acids without a stop codon. If the first ATG has an essential amino acid, the second is not considered. If none of the requirements is met, the candidate sequence is not scored. To determine whether an EST sequence contains a genuine signal sequence, a set of seven sensors (evaluation parameters) known to be associated with a secretory signal, and the DNA surrounding the ATG codon and corresponding The amino acid sequence to be scored. Utilizing this algorithm, a number of polypeptide-encoding nucleic acid sequences have been identified.
[0175]
Example 3: Isolation of a cDNA clone encoding human PRO943
A consensus DNA sequence was assembled in conjunction with other EST sequences using phrap as described in Example 1 above, and was herein designated as DNA36360. In some cases, DNA36360 may be a consensus sequence stretched using repeated cycles of BLAST and phrap to extend the consensus sequence intermediate as much as possible using the EST sequence source discussed above. Derived from an intermediate.
Based on the DNA36360 consensus sequence, oligonucleotides were synthesized to 1) identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) use as a probe to isolate a clone of the PRO943 coding sequence. . Forward and reverse PCR primers are generally in the range of 20 to 30 nucleotides and are usually designed to give PCR products that are about 100-1000 bp long. The probe sequence is usually 40-55 bp long. In some cases, additional oligonucleotides are synthesized when the consensus sequence is greater than about 1-1.5 kbp. To screen several libraries for full-length clones, library DNA was screened by PCR amplification with PCR primer pairs as described by Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra. A positive library was then used to isolate a clone encoding the gene of interest using one of the probe oligonucleotide and primer pair.
[0176]
PCR primer pairs (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer: 5'-CGAGATGACGCCGAGCCCCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Reverse PCR primer: 5'-CGGTTCGACACGCGGCAGGT G-3 '(SEQ ID NO: 8)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was generated from the DNA36360 sequence having the following nucleic acid sequence:
Hybridization probe:
5'-TGCTGCTCCTGCTGCCGCCGCTGCTGCTGGGGGCCTTCCCGCCGG-3 '
(SEQ ID NO: 9)
[0177]
RNA for construction of the cDNA library was isolated from human fetal brain tissue. The cDNA library used for the isolation of cDNA clones was prepared by standard methods using commercially available reagents such as Invitrogen, San Diego, CA. The cDNA is primed with oligo dT containing a NotI site, ligated to a SalI hemikinase adapter with blunt ends, cut with NotI, roughly sized by gel electrophoresis, and an appropriate cloning vector (such as pRKB or pRKD; pRK5B Is a precursor of pRK5D that does not contain an SfiI site; see Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991)), cloned in the specified orientation at unique XhoI and NotI sites.
The DNA sequence of the clone isolated as described above gave the full-length DNA sequence of PRO943 (herein referred to as DNA52192-1369 [FIG1, SEQ ID NO: 1]) as well as the derived protein sequence of PRO943.
[0178]
The full-length clone identified above contains a single open reading frame reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 150-152, and ends with a stop codon at nucleotide positions 1662-1664 (FIG. 1, sequence). Number: 1). The predicted polypeptide is 504 amino acids long (Figure 2), has an estimated molecular weight of about 54,537 daltons and a pI of about 10.04. Analysis of the full-length PRO943 sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) reveals the presence of various important polypeptide domains as shown in FIG. 2, and the positions of these important polypeptide domains are defined as It is roughly as shown above. Analysis of the full-length PRO943 sequence shown in FIG. 2 revealed the presence of: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 17; a transmembrane domain from about amino acid 376 to about amino acid 396, about amino acid 212 to about amino acid 220. And a tyrosine kinase phosphorylation site from about amino acid 329 to about amino acid 337; a potential N of about amino acid 111 to about amino acid 115, about amino acid 231 to about amino acid 235, about amino acid 255 to about amino acid 259, and about amino acid 293 to about amino acid 297 -Glycosylation sites: and immunoglobulin and MHC protein sequence homology blocks of about amino acid 219 to about amino acid 237. Clone DNA52192-1369 has been deposited with ATCC on July 1, 1998 and is assigned ATCC deposit no.
[0179]
By analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the ALIGN-2 sequence alignment analysis of the full-length sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), the PRO943 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: B49151, A39752, FGR1_XENLA, S38579 , RATHBFGFRB_1, TVHU2F, FRG2_MOUSE, CEK3_CHICK, P_R21080 and A27171_1 were revealed.
[0180]
Example 4: Isolation of a cDNA clone encoding human PRO1250
By using the signal sequence algorithm described in Example 2 above, the EST cluster sequence was identified from the Incyte database named Incyte EST cluster SEQ ID NO: 56523. This sequence was then compared to the various EST DNA databases described under the signal algorithm described above to further identify Incyte EST 3371784. By further testing and sequencing of the full-length clone corresponding to this EST sequence, the full-length DNA sequence DNA60775-1532 (FIG. 3, SEQ ID NO: 3) and the derived PRO1250 native sequence protein (FIG. 4, SEQ ID NO: 4) I was separated.
[0181]
Clone DNA60775-1532 (SEQ ID NO: 3) contains a single open reading frame, has an apparent translation start site at nucleotide positions 74-76, and ends with a stop codon at nucleotide positions 2291-2293 (FIG. 3). The predicted PRO1250 polypeptide precursor (SEQ ID NO: 4) is 739 amino acids long (FIG. 3). The full-length PRO1250 protein shown in FIG. 4 has an estimated molecular weight of about 82,263 daltons and a pI of about 7.55. Analysis of the PRO1250 polypeptide (SEQ ID NO: 4) revealed the presence of: a Type II transmembrane domain from about amino acid 61 to about amino acid 80, a putative AMP-binding domain signature from about amino acid 314 to about amino acid 326 The sequence and potential N-glycosylation sites from about amino acid 102 to about amino acid 106, from about amino acid 588 to about amino acid 594, and from about amino acid 619 to about amino acid 623. A cDNA clone containing DNA60775-1532 (SEQ ID NO: 3) was deposited with the ATCC on September 1, 1998 and was assigned ATCC deposit number 203173.
[0182]
Example 5: Isolation of cDNA encoding human PRO1337
Using the method described in Example 1 above, a single Incyte EST was identified (SEQ ID NO: 1747546), further referred to herein as “DNA4417”. To construct a consensus sequence, the BLAST and phrap cycles were extended and the DNA4417 sequence was extended as much as possible using the sources of EST sequences discussed above. The consensus sequence was herein designated “DNA45669”. Based on the DNA45669 consensus sequence, 1) to identify a cDNA library containing the sequence of interest by PCR, and 2) to use the oligonucleotide as a probe to isolate a clone of the full-length coding sequence of PRO1337. Synthesized.
PCR primers (forward and reverse) were synthesized:
Forward PCR primer 45669. f1:
5'-CAACCATGCAAGGACAGGGCAGG-3 '(SEQ ID NO: 10)
Forward PCR primer 45669. f2:
5'-CTTTGCTGTTGGCCTCTGTGCTCCCAACCATGCAAGGACAGGGCAGG-3 '
(SEQ ID NO: 11)
Reverse PCR primer 45669. r1:
5'-TGACTCGGGGTCTCCAAAACCAGC-3 '(SEQ ID NO: 12)
Reverse PCR primer 45669. r2:
5'-GGTATAGGCGGAAGGCAAAGTCGG-3 '(SEQ ID NO: 13)
In addition, a synthetic oligonucleotide hybridization probe was generated from the consensus DNA45669 sequence having the following nucleotide sequence:
Hybridization probe 45669. P1:
5'-GGCATCTTACCTTTATGGAGTACTCTTTGCTGTTGGCCTCTGTGCTCC-3 '
(SEQ ID NO: 14)
[0184]
To screen several libraries for sources of full-length clones, library DNA was screened by PCR amplification with the PCR primer pairs identified above. A positive library was then used to isolate a clone encoding the PRO1337 gene using one of the probe oligonucleotide and PCR primer pair. RNA for construction of the cDNA library was isolated from human tissue.
DNA sequencing of the clones isolated as described above resulted in the full-length DNA sequence of PRO1337 (herein designated as DNA66672-1586 [Fig5, SEQ ID NO: 5]); and the derived protein sequence of PRO1337.
[0185]
The entire coding sequence of PRO1337 is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 5). Clone DNA66672-1586 contains a single open reading frame with an apparent translation start site at nucleotide positions 60-62 and an apparent stop codon at nucleotide positions 1311-1313. The predicted polypeptide precursor is 417 amino acids long. The full-length PRO1337 protein shown in FIG. 6 has an estimated molecular weight of about 46,493 daltons and a pI of about 9.79.
Analysis of the PRO1337 polypeptide (SEQ ID NO: 6) revealed the presence of: a signal peptide from about amino acid 1 to about amino acid 20; N from about amino acid 101 to about amino acid 105, and from about amino acid 390 to about amino acid 394 A glycosylation site; a tyrosine kinase phosphorylation site from about amino acid 377 to about amino acid 385; and from about amino acid 7 to about amino acid 13, from about amino acid 97 to about amino acid 103, from about amino acid 326 to about amino acid 332, and from about amino acid 363 to about N-myristoylation site at amino acid 369.
[0186]
By analysis of the Dayhoff database (version 35.45 SwissProt 35) using the full-length WU-BLAST2 sequence alignment analysis method shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 6),
Significant homology was revealed between the amino acid sequence of PRO1337 and the following Dayhoff sequence THBG_HUMAN. Homology was also found between the PRO1337 amino acid sequence and the following Dayhoff sequences: KAIN_HUMAN, HSACT1_1, IPSP_HUMAN, G02081, HAMHPP_1, CPI6_RAT, S31507, AB000547_1, and KBP_MOUSE.
Clone DNA60775-1532 was deposited with ATCC on September 22, 1998 and is assigned ATCC deposit number 203265.
[0187]
Example 6: In situ hybridization
In situ hybridization is a powerful and versatile technique for the detection and localization of nucleic acid sequences within cell or tissue preparations. It is useful, for example, for identification of gene expression sites, analysis of tissue distribution of transcripts, identification and localization of viral infection, specific mRNA synthesis and chromosomal mapping.
In situ hybridization is performed by PCR according to an optimal variant of the protocol of Lu and Gillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994). 33 Performed with P-labeled riboprobe. Briefly, formalin-fixed, paraffin-embedded human tissue was sectioned, deparaffinized, deproteinized with proteinase K (20 g / ml) for 15 minutes at 37 ° C., and as described in Lu and Gillett, supra. In situ hybridization. [ 33 A P] UTP-labeled antisense riboprobe is generated from the PCR product and hybridized overnight at 55 ° C. The slides are immersed in Kodak NTB2 nuclear track emulsion and exposed for 4 weeks.
[0188]
33 P-riboprobe synthesis
6.0 μl (125 mCi) 33 P-UTP (Amersham BF 1002, SA <2000 Ci / mmol) was speed-vacuum dried. Dry 33 The following ingredients were added to the tube containing P-UTP:
2.0 μl of 5x transcription buffer
1.0 μl of DTT (100 mM)
2.0 μl NTP mixture (2.5 mM: 10 μ; 10 mM GTP, CTP & ATP + 10 μl H 2 O)
1.0 μl of UTP (50 μM)
1.0 μl of RNAsin
1.0 μl of DNA template (1 μg)
1.0 μl of H 2 O
1.0 μl RNA pomerase (T3 = AS, T7 = S, normal for PCR products)
[0189]
Tubes were incubated at 37 ° C. for 1 hour, 1.0 μl RQ1 DNase was added, and then incubated at 37 ° C. for 15 minutes. 90 μl of TE (10 mM Tris pH 7.6 / 1 mM EDTA pH 8.0) was added and the mixture was pipetted onto DE81 paper. The remaining solution was loaded onto a MICROCON-50 (trade name) ultrafiltration unit and spun using program 10 (6 minutes). The filtration unit was converted to a second tube and spun using program 2 (3 minutes). After the final recovery spin, 100 μl TE was added. 1 μl of the final product was pipetted onto DE81 paper and counted with 6 ml of BIOFLUOR II (trade name).
The probe was run on a TBE / urea gel. 1-3 μl probe or 5 μl RNA MrkIII was added to 3 μl loading buffer. After heating on a heating block to 95 ° C. for 3 minutes, the gel was immediately placed on ice. Gel wells were flushed, sample loaded, and run at 180-250 volts for 45 minutes. The gel was wrapped with plastic wrap (SARAN brand) and exposed to XAR film with a reinforcing screen in a freezer at -17 ° C for 1 hour to overnight.
[0190]
33 P-hybridization
A. Cryosection pretreatment
Slides were removed from the freezer, placed in an aluminum tray and thawed at room temperature for 5 minutes. The tray was placed in a 55 ° C. incubator for 5 minutes to reduce condensation. Slides were fixed in 4% paraformaldehyde for 5 minutes in a steam hood and washed with 0.5 × SSC for 5 minutes at room temperature (25 ml 20 × SSC + 975 ml SQ H 2 O). After deproteinization for 10 minutes at 37 ° C. in 0.5 μg / ml proteinase (12.5 μl of 10 mg / ml stock in 250 ml preheated RNase-free RNase buffer), sections were washed with 0.5 × SSC for 10 minutes at room temperature. . Sections were dehydrated in 70%, 95%, 100% ethanol for 2 minutes each.
B. Pretreatment of paraffin-embedded sections
Slide deparaffinized and SQ H 2 Place in O and rinse twice with 2 × SSC for 5 minutes each at room temperature. Sections were 20 μg / ml proteinase K (500 μl 10 mg / ml in 250 ml RNase-free RNase buffer; 37 ° C., 15 minutes) -human embryo or 8x proteinase K (100 μl in 250 ml RNase buffer, 37 ° C., 30 minutes) — Deproteinized with formalin tissue. Subsequent rinsing and dehydration with 0.5 × SSC was performed as described above.
[0191]
C. Pre-hybridization
Slides were arranged in plastic boxes lined with Box buffer (4 × SSC, 50% formamide) -saturated filter paper. Tissue was mixed with 50 μl of hybridization buffer (3.75 g dextran sulfate + 6 ml SQ H 2 O), vortexed, removed cap and heated in microwave for 2 minutes. After cooling on ice, 18.75 ml formamide, 3.75 ml 20 × SSC and 9 ml SQ H 2 O was added and the tissue was vortexed well and incubated at 42 ° C. for 1-4 hours.
D. Hybridization
1.0x10 per slide 6 The cpm probe and 1.0 μl tRNA (50 mg / ml stock) were heated at 95 ° C. for 3 minutes. Slides were chilled on ice and 48 μl of hybridization buffer was added per slide. After vortexing, 50 μl 33 P mixture was added to 50 μl of prehybrid on slide. Slides were incubated overnight at 55 ° C.
[0192]
E. Washing:
Washing was performed with 2 × SSC, EDTA for 2 × 10 minutes at room temperature (400 ml 20 × SSC + 16 ml 0.25 M EDTA, Vf = 4 L) followed by RNase A treatment for 30 minutes at 37 ° C. (10 μg / ml in 250 ml RNase buffer 500 μl = 20 μg) / ml). Slides were washed 2 × 10 minutes with EDTA at room temperature. The stringent wash conditions are as follows: 2 hours at 55 ° C., 0.1 × SSC, EDTA (20 ml 20 × SSC + 16 ml EDTA, V f = 4L).
F. Oligonucleotide
In situ analysis was performed on two of the DNA sequences disclosed herein. The oligonucleotides used for these analyzes are as follows:
(1) DNA52192-1369
D-269E FGFrp1:
5'-GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCGCTGACCATGTGGACCAAGG-3 '
(SEQ ID NO: 15)
C-257I FGFrp2:
5'-CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGATCTGGCAGCACGGTGAGGAAG-3 '
(SEQ ID NO: 16)
[0193]
G. result
In situ analysis was performed on the above DNA sequences disclosed herein. The results of these analyzes are as follows:
DNA52192-1369 (FGF receptor-like molecule)
Expression was observed in fetal skeletal muscle and long bone cartilage tissue. As elsewhere, a relatively high background signal is a problem. In one fetal liver, expression appears to occur at the site of consolidation. Fetal tissues examined (E12-E16 weeks) include placenta, umbilical cord, liver, kidney, adrenal gland, thyroid, lung, heart, large blood vessel, esophagus, stomach, small intestine, spleen, thymus, pancreas, brain, eye, spine, Body wall, pelvis, and lower limbs were included. Adult human tissues examined include liver, kidney, adrenal gland, myocardium, aorta, spleen, lung, skin, chondrosarcoma, eye, stomach, stomach cancer, colon, colon cancer, renal cell carcinoma, prostate, bladder mucosa and gallbladder It was. Acetaminophen induced liver damage and cirrhosis. The two rhesus monkey tissues examined included cerebral cortex (rm) and hippocampus (rm). Chimpanzee tissues examined included thyroid, parathyroid, ovary, nerve, tongue, thymus, adrenal gland, gastric mucosa and salivary gland.
[0194]
Example 7: Use of PRO as a hybridization probe
The following method demonstrates the use of a nucleic acid sequence encoding PRO as a hybridization probe.
The DNA containing the full-length or mature PRO coding sequence disclosed herein can be used to screen for homologous DNA from human tissue cDNA libraries or human tissue genomic libraries (such as those encoding naturally occurring variants of PRO). Used as a probe.
Hybridization and washing of the filter containing either library DNA is performed under the following high stringency conditions. Hybridization to a radiolabeled probe filter derived from the gene encoding the PRO polypeptide was performed using 50% formamide, 5 × SSC, 0.1% SDS, 0.1% sodium pyrophosphate, 50 mM sodium phosphate, pH 6.8, Perform in a solution of 2x Denhardt's solution and 10% dextran sulfate for 20 hours at 42 ° C. Filter washing is performed at 42 ° C. in 0.1 × SSC and 0.1% aqueous SDS.
Standard techniques known in the art can then be used to identify DNA having the desired sequence identity with the DNA encoding the full-length native sequence.
[0195]
Example 8: Expression of PRO in E. coli
This example illustrates the preparation of a non-glycosylated form of PRO by recombinant expression in E. coli.
The DNA sequence encoding is first amplified using the selected PCR primers. This primer must contain a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site on the selected expression vector. Various expression vectors can be used. An example of a suitable vector is pBR322 (derived from E. coli; see Bolivar et al., Gene, 2:95 (1997)) which contains genes for ampicillin and tetracycline resistance. This vector is digested with restriction enzymes and dephosphorylated. The PCR amplified sequence is then ligated to the vector. This vector preferably contains an antibiotic resistance gene, a trp promoter, a poly-His leader (including the first six STII codons, a poly-His leader, and an enterokinase cleavage site), a PRO coding region, a lambda transcription factor and the argU gene Contains the encoding sequence.
[0196]
This ligation mixture was then utilized to transform selected E. coli strains using the method described in Sambrook et al., Supra. Transformants are identified by their ability to grow on LB plates and then antibiotic resistant colonies are selected. Plasmid DNA can be isolated and confirmed by restriction analysis and DNA sequencing.
Selected clones can be grown overnight in a liquid medium such as LB broth supplemented with antibiotics. This overnight culture may then be used to inoculate a larger scale culture. The cells are then grown to the desired optical density, during which the expression promoter begins to act.
After further culturing the cells for several hours, the cells can be collected by centrifugation. The cell pellet obtained by centrifugation can be solubilized using various agents known in the art, and the dissolved PRO protein is then subjected to metal chelation under conditions that allow tight binding of the protein. It is possible to purify using a column.
[0197]
PRO may be expressed in E. coli in poly-His tag form using the following procedure. Using the selected PCR primers, DNA encoding PRO is first amplified. This primer provides a restriction enzyme site corresponding to the restriction enzyme site of the chosen expression vector, as well as efficient and reliable translation initiation, rapid purification on metal chelate columns, and proteolytic removal by enterokinase Includes other useful sequences. The poly-His tag sequence subjected to PCR amplification is then ligated to an expression vector, which is used for transformation of an E. coli host based on strain 52 (W3110 fuhA (tonA) lon galE rpoHts (htpRts) clpP (lacIq)). . Transformants were initially OD of 3-5 in LB containing 50 mg / ml carbenicillin with shaking at 30 ° C. 600 Grow until reaching. The culture was then diluted 50-100 times with CRAP medium (3.57 g (NH 4 ) 2 SO 4 0.71 g sodium citrate 2H 2 O, 1.07 g KCl, 5.36 g Difco yeast extract, 5.36 g Sheffield hycase SF in 500 mL water, and 110 mM MPOS, pH 7.3, 0.55% (w / v) glucose and 7 mM. MgSO 4 And is grown for about 20-30 hours by shaking at 30 ° C. A sample is taken to confirm expression by SDS-PAGE, and the large-scale culture is centrifuged so that the cells become pellets. The cell pellet is frozen until purification and refolding (refolding).
[0198]
Resuspend 0.5 to 1 L fermentation (6-10 g pellet) E. coli paste in 10 volumes (w / v) in 7 M guanidine, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Solid sodium sulfate and sodium tetrathionate are added to a final concentration of 0.1M and 0.02M, respectively, and the solution is stirred at 4 ° C. overnight. This step results in a denatured protein in which all cysteine residues are blocked with sulfite. This solution is concentrated in a Beckman Ultracentrifuge at 40,000 rpm for 30 minutes. The supernatant is diluted with 3-5 volumes of metal chelate column buffer (6M guanidine, 20 mM Tris, pH 7.4) and filtered through a 0.22 micron filter to clarify. This clear extract is loaded onto a 5 ml Qiagen Ni-NTA metal chelate column equilibrated with metal chelate column buffer. The column is washed with an addition buffer containing 50 mM imidazole (Calbiochem, Utrol grade), pH 7.4. The protein is eluted with a buffer containing 250 mM imidazole. Fractions containing the desired protein are pooled and stored at 4 ° C. Protein concentration was estimated by its absorption at 280 nm using the extinction coefficient calculated based on its amino acid sequence.
[0199]
The protein is regenerated by gradually diluting the sample with freshly prepared regeneration buffer consisting of 20 mM Tris, pH 8.6, 0.3 M NaCl, 2.5 M urea, 5 mM cysteine, 20 mM glycine and 1 mM EDTA. The refolding volume is selected so that the final protein concentration is 50-100 microgram / ml. The refolding solution is stirred gently at 4 ° C. for 12-36 hours. The refolding reaction is stopped by adding TFA to a final concentration of 0.4% (about pH 3). Prior to further purification of the protein, the solution is filtered through a 0.22 micron filter and acetonitrile is added to a final concentration of 2-10%. Regenerated protein is chromatographed on a Poros R1 / H reverse phase column using 0.1% TFA transfer buffer with elution with a gradient of 10-80% acetonitrile. A 280 Aliquots of fractions with absorption are analyzed on SDS polyacrylamide gels and fractions containing homologous regenerative proteins are pooled. In general, correctly regenerated species of most proteins are eluted with the lowest concentration of acetonitrile because these species are most compact by their hydrophobic inner surface shielded from interaction with the reverse phase resin. . Aggregated species are usually eluted at higher acetonitrile concentrations. In addition to separating the misregenerated protein form from the desired form, the reverse phase process also removes endotoxin from the sample.
[0200]
Fractions containing the desired regenerated PRO polypeptide were pooled and the acetonitrile removed by applying a gentle stream of gentle nitrogen to the solution. The protein was prepared in 20 mM Hepes, pH 6.8 containing 0.14 M sodium chloride and 4% mannitol by dialysis or gel filtration with G25 Superfine (Pharmacia) resin equilibrated with preparation buffer and sterile filtered.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed by the methods described above.
[0201]
Example 9: Expression of PRO in mammalian cells
This example illustrates the preparation of a potential glycosylated form of PRO by recombinant expression in mammalian cells.
As the expression vector, vector pRK5 (see EP307,247 published on March 15, 1989) is used. In some cases, the ligation method as described in Sambrook et al. Above is used to ligate PRO DNA with pRK5 with the selected restriction enzyme to allow the insertion of PRODNA.
[0202]
In one embodiment, the selected host cell may be 293 cells. Human 293 cells (ATCC CCL 1573) are grown to confluence in tissue culture plates in media such as DMEM supplemented with fetal calf serum and, optionally, nutrient components and / or antibiotics. About 10 μg of pRK5-PRODNA is mixed with about 1 μg of VA RNA gene-encoding DNA [Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982))] and 500 μl of 1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl 2 Dissolve in To this mixture was added a drop of 500 μl of 50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO. 4 And a precipitate is formed at 25 ° C. for 10 minutes. This precipitate was suspended and added to 293 cells and allowed to settle at 37 ° C. for about 4 hours. The medium was aspirated and 2 ml of 20% glycerol in PBS was added over 30 seconds. The 293 cells were then washed with serum free medium, fresh medium was added and the cells were incubated for about 5 days.
[0203]
Approximately 24 hours after transfection, the culture medium is removed and the culture medium (only) or 200 μCi / ml 35 S-cysteine and 200 μCi / ml 35 The medium was replaced with a medium containing S-methionine. After 12 hours of incubation, the culture supernatant is collected, concentrated with a spin filter and loaded onto a 15% SDS gel. The treated gel is dried and exposed to the film for a selected time that reveals the presence of the PRO polypeptide. The medium containing the transformed cells may be further incubated (in serum-free medium) and this medium is tested in the selected bioassay.
[0204]
As an alternative technique, PRO may be excessively introduced into 293 cells using the dextran sulfate method described in Somparyac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981). 293 cells are grown to maximal density in a spinner flask and 700 μg pRK5-PRODNA is added. The cells are first concentrated from the spinner flask by centrifugation and washed with PBS. The DNA-dextran precipitate is incubated on the cell pellet for 4 hours. The cells were treated with 20% glycerol for 90 seconds, washed with tissue culture medium, and re-introduced into the spinner flask containing tissue culture medium, 5 μg / ml bovine insulin, and 0.1 μg / ml bovine transferrin. After about 4 days, the culture supernatant was centrifuged and filtered to remove cells and cell debris. The sample containing the expressed PRO can then be concentrated and purified by selected methods such as any dialysis and / or column chromatography.
[0205]
In other embodiments, PRO can be expressed in CHO cells. CaPO 4 Alternatively, pRK5-PRO can be transfected into CHO cells using known reagents such as DEAE-dextran. As described above, the cell culture medium is incubated and the culture medium is culture medium (only) or 35 It can be replaced with a medium containing a radiolabel such as S-methionine. After identifying the presence of the PRO polypeptide, the medium may be replaced with serum-free medium. Preferably, the culture is incubated for about 6 days and then the culture supernatant is collected. The medium containing the expressed PRO can then be concentrated and purified by any selected method.
[0206]
In addition, the epitope tag PRO may be expressed in host CHO cells. PRO may be subcloned from the pRK5 vector. The subclone insert can be subjected to PCR and fused to a baculovirus expression vector as a frame with a selected epitope tag, such as a poly-his tag. The poly-his tagged PRO insert can then be subcloned into an SV40 derived vector containing a selectable marker such as DHFR for selection of stable clones. Finally, CHO cells were transfected with the SV40 derived vector (as described above). In order to confirm expression, labeling may be performed as described above. The medium containing the expressed poly-his tag PRO is then concentrated and Ni 2+ -Purified by selected methods such as chelate affinity chromatography.
Moreover, PRO may be expressed in CHO and / or COS cells by a transient expression method, and in CHO cells by another stable expression method.
Stable expression in CHO cells was performed using the following method. IgG constructs in which proteins are fused to IgG1 constant region sequences in which the coding sequence (eg, extracellular domain) of the solubilized form of each protein comprises a hinge, CH2 and CH2 domain and / or a poly-His tag form ( Immunoadhesin).
[0207]
Following PCR amplification, each DNA is subcloned into a CHO expression vector using standard techniques such as those described in Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997). A CHO expression vector is prepared so that it has restriction sites compatible with 5 ′ and 3 ′ of the DNA of interest and can be easily shuttled to cDNA. A vector used for expression in CHO cells is as described in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24: 9, 1774-1779 (1996), and the target cDNA and dihydrofolate reductase ( The SV40 early promoter / enhancer is used to control the expression of (DHFR). DHFR expression allows selection for stable maintenance of the plasmid following transfection.
Twelve micrograms of the desired plasmid DNA is obtained using about 10 million CHO using the commercially available transfection reagents Superfect® (Quiagen), Dosper® and Fugene® (Boehringer Mannheim). Introduce into cells. The cells are grown as described in Lucas et al. Above. About 3 × 10 for further growth and production as described below 7 Freeze cells with ampoules.
[0208]
The ampoule containing the plasmid DNA is thawed by placing it in a water bath and mixed by vortexing. Pipette the contents into a centrifuge tube containing 10 mL of medium and centrifuge at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant is aspirated and the cells are suspended in 10 mL selective medium (0.2 μm filtered PS20, 5% 0.2 μm diafiltered fetal bovine serum added). The cells are then divided into 100 mL spinners containing 90 mL selective medium. After 1-2 days, the cells are transferred to a 250 mL spinner filled with 150 mL selective medium and incubated at 37 ° C. After 2-3 days, add 250 mL, 500 mL and 2000 mL spinners to 3 × 10 5 Seed at cells / mL. The cell culture medium is replaced with fresh medium by centrifugation and resuspension in production medium. Any suitable CHO medium may be used, but in practice the production medium described in US Pat. No. 5,122,469 issued June 16, 1992 may be used. 1.2x10 3L production spinner 6 Seed at cells / mL. On day 0, cell number and pH are measured. On the first day, a sample is taken from the spinner and sprayed with filtered air. On the second day, a sample is taken from the spinner, the temperature is changed to 33 ° C., 30 mL of 500 g / L glucose and 0.6 mL of 10% antifoam (eg 35% polydimethylsiloxane emulsion, Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion ). Adjust pH if necessary to maintain near 7.2 throughout production. After 10 days, or until the viability falls below 70%, the cell culture is collected by centrifugation and filtered through a 0.22 μm filter. The filtrate is stored at 4 ° C. or immediately loaded onto a purification column.
[0209]
For the poly-His tag construct, the protein was purified using a Ni-NTA column (Qiagen). Prior to purification, imidazole was added to the culture supernatant to a concentration of 5 mM. The culture supernatant was pumped at 4 ° C. at a flow rate of 4-5 ml / min onto a 6 ml Ni-NTA column equilibrated with 20 mM Hepes, pH 7.4 buffer containing 0.3 M NaCl and 5 mM imidazole. After loading, the column was further washed with equilibration buffer and protein was eluted with equilibration buffer containing 0.25 M imidazole. The highly purified protein was subsequently desalted with 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) into a storage buffer containing 10 mM Hepes, 0.14 M NaCl and 4% mannitol, pH 6.8 and stored at −80 ° C.
[0210]
The immunoadhesin (Fc-containing) construct is purified from the culture supernatant as follows. The culture supernatant is pumped onto a 5 ml protein A column (Pharmacia) equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8. After loading, the column is washed strongly with equilibration buffer before eluting with 100 mM citric acid, pH 3.5. Immediately neutralize the eluted protein by collecting 1 ml fractions in tubes containing 275 μL of 1 M Tris buffer, pH 9. The highly purified protein is subsequently desalted with the storage buffer described above for the poly-His tag protein. Its homogeneity is assessed by SDS polyacrylamide gel and N-terminal amino acid sequencing by Edman degradation.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.
[0211]
Example 10: Expression of PRO in yeast
The following method demonstrates recombinant expression of a PRO polypeptide in yeast.
First, a yeast expression vector is created for intracellular production or secretion of PRO from the ADH2 / GAPDH promoter. DNA encoding a PRO polypeptide and promoter is inserted into the appropriate restriction enzyme sites of the selected plasmid to direct intracellular expression of the PRO polypeptide. For secretion, the DNA encoding PRO is transferred to a selected plasmid, DNA encoding the ADH2 / GAPDH promoter, native PRO signal peptide or other mammalian signal peptide, or, for example, yeast alpha factor or invertase secretion signal / It can be cloned with a leader sequence as well as a linker sequence for expression of PRO (if necessary).
[0212]
Yeast strains such as yeast strain AB110 can then be transformed with the expression plasmid and cultured in the selected fermentation medium. Transformed yeast supernatants can be analyzed by precipitation with 10% trichloroacetic acid and staining of the gel with Coomassie blue staining following separation by SDS-PAGE.
The recombinant PRO polypeptide can then be isolated and purified by removing yeast cells from the fermentation medium by centrifugation followed by concentration of the medium using a selected cartridge filter. The concentrate containing the PRO polypeptide may be further purified using a selected column chromatography resin.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.
[0213]
Example 11: Expression of PRO in baculovirus infected insect cells
The following method describes recombinant expression of PRO in baculovirus infected insect cells.
The sequence encoding PRO is fused upstream of an epitope tag contained in a baculovirus expression vector. Such epitope tags include poly-his tags and immunoglobulin tags (such as the Fc region of IgG). A variety of plasmids can be used, including plasmids derived from commercially available plasmids such as pVL1393 (Navagen). Briefly, PRO or a predetermined portion of a PRO coding sequence (eg, a sequence encoding the extracellular domain of a transmembrane protein, or a sequence encoding a mature protein when the protein is extracellular) is 5 ′ and 3 ′. Amplified by PCR with primers complementary to the region. The 5 ′ primer may include flanking (selected) restriction enzyme sites. The product is then digested with selected restriction enzymes and subcloned into an expression vector.
[0214]
Recombinant baculoviruses were transferred simultaneously using the above plasmid and BaculoGold (trade name) viral DNA (Pharmingen) using lipofectin (commercially available from GIBCO-BRL) in Spodoptera frugiperda (“Sf9”) cells (ATCC CRL 1711). Created by After incubation at 28 ° C. for 4-5 days, the released virus is collected and used for further amplification. Viral infection and protein expression are performed as described in O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
[0215]
Next, the expressed poly-his tag PRO is, for example, Ni 2+ -It can be purified by chelate affinity chromatography as follows. Extracts are prepared from virus-infected recombinant Sf9 cells as described in Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993). Briefly, Sf9 cells were washed and sonicated buffer (25 mL Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl 2 0.1 mM EDTA; 10% glycerol; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl) and sonicated twice on ice for 20 seconds. The sonicated product is clarified by centrifugation, and the supernatant is diluted 50-fold with loading buffer (50 mM phosphate, 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 7.8) and filtered through a 0.45 μm filter. . Ni 2+ -Prepare an NTA agarose column (commercially available from Qiagen) with a total volume of 5 mL, wash with 25 mL of water and equilibrate with 25 mL of loading buffer. The filtered cell extract is loaded onto the column at 0.5 mL per minute. Column A is the point where fraction collection begins 280 Wash with loading buffer to baseline. The column was then washed with a secondary wash buffer (50 mM phosphate; 300 mM NaCl, 10% glycerol, pH 6.0) that elutes nonspecifically bound protein. A 280 After reaching the baseline again, the column was developed with a gradient of 0 to 500 mM imidazole in the secondary wash buffer. 1 mL fractions were collected and Ni-conjugated to SDS-PAGE and silver staining or alkaline phosphatase (Qiagen) 2+ -Analyze by Western blot with NTA. Eluted His 10 -Fractions containing the tag PRO are pooled and dialyzed against loading buffer.
Alternatively, purification of IgG tag (or Fc tag) PRO can be performed using known chromatographic techniques including, for example, protein A or protein G column chromatography.
Many of the PRO polypeptides disclosed herein were successfully expressed as described above.
[0216]
Example 12: Preparation of antibody binding to PRO
This example illustrates the preparation of a monoclonal antibody that can specifically bind to a PRO polypeptide or an epitope on a PRO peptide without binding to virtually any other polypeptide or polypeptide epitope.
Techniques for the production of monoclonal antibodies are known in the art and are described, for example, in Goding above. Immunogens that can be used include purified PRO polypeptides, fusion proteins comprising PRO polypeptides, and cells that express recombinant PRO polypeptides on the cell surface. The selection of the immunogen can be performed by one skilled in the art without undue experimentation.
Mice such as Balb / c are immunized with PRO immunogen emulsified with complete Freund's adjuvant and injected subcutaneously or intraperitoneally in an amount of 1-100 micrograms. Alternatively, the immunogen may be emulsified with MPL-TDM adjuvant (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, Montana) and injected into the animal's hind footpad. The immunized mice are then boosted 10 to 12 days later with an additional immunogen emulsified with the selected adjuvant. The mice are then boosted with additional immunizations over several weeks. Serum samples may be taken periodically from mice by retro-orbital bleeding tested in an ELISA assay for detection of anti-PRO antibodies.
[0217]
After a suitable antibody titer has been detected, animals that are “positive” for antibodies can be given a final intravenous injection of PRO. Three to four days later, the mice are sacrificed and spleen cells are removed. The spleen cells were then (using 35% polyethylene glycol), P3X63AgU. Fusion to 1st selected mouse myeloma cell line. The fusion then enables the generation of hybridoma cells that can be seeded in 96-well tissue culture plates containing HAT (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) media, and includes non-fusion cells, myeloma hybrids, and spleen cell hybrids. Growth is inhibited.
Hybridoma cells are screened by ELISA for reactivity to PRO. The determination of “positive” hybridoma cells that secrete the desired monoclonal antibody to PRO is within the common general knowledge.
Positive hybridoma cells are injected intraperitoneally into syngeneic Balb / c mice to produce ascites containing anti-PRO monoclonal antibodies. Alternatively, hybridoma cells can be grown in tissue culture flasks or roller bottles. Purification of monoclonal antibodies produced in ascites can be performed using ammonium sulfate precipitation followed by gel exclusion chromatography. Alternatively, affinity chromatography based on the affinity of antibody for protein A or protein G can be used.
[0218]
Example 13: Purification of PRO polypeptides using specific antibodies
Natural or recombinant PRO polypeptides can be purified by various standard protein purification methods in the art. For example, a pro-PRO polypeptide, mature polypeptide, or pre-PRO polypeptide is purified by immunoaffinity chromatography using an antibody specific for the PRO polypeptide of interest. In general, an immunoaffinity column is made by covalently binding an anti-PRO polypeptide antibody to an activated chromatography resin.
Polyclonal immunoglobulins are prepared from immune sera either by precipitation with ammonium sulfate or purification with immobilized protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, NJ). Similarly, monoclonal antibodies are prepared from mouse ascites fluid by ammonium sulfate precipitation or chromatography with immobilized protein A. The partially purified immunoglobulin is covalently bound to a chromatographic resin such as CnBr-activated Sepharose (trade name) (Pharmacia LKB Biotechnology). The antibody is bound to the resin, the resin is blocked, and the derivative resin is washed according to the manufacturer's instructions.
[0219]
Such immunoaffinity columns are utilized in the purification of PRO polypeptides by preparing a fraction of cells containing a solubilized form of PRO polypeptide. This preparation is induced by the addition of detergent or solubilization of whole cells or cell component fractions obtained via differential centrifugation by methods known in the art. Alternatively, solubilized PRO polypeptide comprising a signal sequence can be secreted in an amount useful for the medium in which the cells are grown.
The solubilized PRO polypeptide-containing preparation is allowed to flow through the immunoaffinity column and the column is washed under conditions that allow preferred adsorption of the PRO polypeptide (eg, a high ionic strength buffer in the presence of a detergent). The column is then eluted under conditions that degrade antibody / PRO polypeptide binding (eg, a low pH of about 2-3, a high concentration of urea or a chaotrope such as thiocyanate ion), and the PRO polypeptide is recovered.
[0220]
Example 14: Drug screening
The present invention is particularly useful for screening compounds by utilizing PRO polypeptides, or binding fragments thereof, in any of a variety of drug screening techniques. The PRO polypeptide or fragment used in such a test may be free in solution, immobilized on a solid support, supported on the cell surface, or located within the cell. One method of drug screening utilizes eukaryotic or prokaryotic host cells that are stably transformed with recombinant nucleic acids expressing the PRO polypeptide or fragment. Agents are screened against such transformed cells by competitive binding assays. Depending on either the viable or immobilized form, such cells can be used in standard binding assays. For example, the formation of a complex between the PRO polypeptide or fragment and the reagent being tested may be measured. Alternatively, the decrease in complex formation between the PRO polypeptide and its target cell caused by the reagent being tested can be examined.
[0221]
Accordingly, the present invention provides methods for screening for drugs or any other reagent that can affect a PRO polypeptide related disease or disorder. These methods involve contacting such a reagent with a PRO polypeptide or fragment, and (i) for the presence of a complex between the reagent and the PRO polypeptide or fragment, or (ii) for the PRO polypeptide or fragment and the cell. Testing for the presence of a complex between In these competitive binding assays, the PRO polypeptide or fragment is generally labeled. After appropriate incubation, the free PRO polypeptide or fragment separates from the bound form, and the amount of free or uncomplexed label determines that the specific reagent binds to the PRO polypeptide or the PRO polypeptide / cell It is a measure of the ability to inhibit the complex.
[0222]
Other techniques for drug screening provide high-throughput screening for compounds with suitable binding affinity for polypeptides and are described in detail in WO 84/03564 published September 13, 1984. Yes. Briefly, a number of different small peptide test compounds are synthesized on a solid support, such as a plastic pin, or some other surface. When applied to a PRO polypeptide, the peptide test compound reacts with the PRO polypeptide and is washed. Bound PRO polypeptide is detected by methods well known in the art. Purified PRO polypeptide can also be coated directly onto plates for use in the drug screening techniques described above. Furthermore, non-neutralizing antibodies can be used to capture the peptide and immobilize it on a solid support.
The present invention also contemplates competitive drug screening assays in which neutralizing antibodies capable of binding to the PRO polypeptide specifically compete with the test compound for binding to the PRO polypeptide or fragment thereof. This method can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with a PRO polypeptide.
[0223]
Example 15: Rational drug design
The purpose of rational drug design is to produce biologically active polypeptides of interest (eg, PRO polypeptides) or structural analogs of small molecules with which they interact, eg, agonists, antagonists, or inhibitors. is there. Any of these examples can be used to create drugs that are more active and stable forms of the PRO polypeptide or that promote or inhibit the function of the PRO polypeptide in vivo (see Hodgson, Bio / Technology). 9: 19-21 (1991)).
[0224]
In one method, the three-dimensional structure of a PRO polypeptide, or PRO polypeptide-inhibitor complex, is determined by X-ray crystallography, by computer modeling, and most typically by a combination of the two methods. In order to elucidate the structure of the molecule and determine the active site, both the shape and charge of the PRO polypeptide must be confirmed. Less often, useful information regarding the structure of the PRO polypeptide may be obtained by modeling based on the structure of homologous proteins. In both cases, relevant structural information is used to design similar PRO polypeptide-like molecules or to identify effective inhibitors. Useful examples of rational drug design include molecules with improved activity or stability as shown in Braxton and Wells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992), or Athauda et al., J. Biochem ., 113: 742-746 (1993), including molecules that act as inhibitors, agonists or antagonists of the natural peptide.
[0225]
It is also possible to isolate a target-specific antibody selected by the functional assay as described above and to elucidate its crystal structure. This method, in principle, produces a pharmacore that the subsequent drug design can comply with. By generating anti-idiotype antibodies (anti-ids) against functional pharmacologically active antibodies, protein crystallography can be completely bypassed. As a mirror image of the mirror image, the anti-ids binding site can be predicted to be an analog of the original receptor. The anti-id can then be used to identify and isolate the peptide from a bank of chemically or biologically produced peptides. The isolated peptide will function as a pharmacore.
In accordance with the present invention, sufficient quantities of PRO polypeptides are available to perform analytical experiments such as X-ray crystallography. Moreover, the knowledge of the amino acid sequence of the PRO polypeptide provided herein provides guidance for use in computer modeling techniques to replace or add to X-ray crystallography.
[0226]
Example 16: In vitro anti-tumor assay
The anti-proliferative activity of PRO943, PRO1250, and PRO1337 polypeptides was basically determined by sulforhodamine B (SRB) staining binding described by Skehan et al., J. Natl. Cancer Inst., 82: 1107-1112 (1990). The assay was used to determine the National Cancer Institute (NCI) clinical disease-oriented in vitro anti-cancer drug discovery assay. The conditions for their maintenance and culture in vitro as well as the 60 tumor cell lines used in this study ("NCI panel") are described in Monks et al., J. Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991). It is described by. The purpose of this screening is to initially assess the cytotoxic and / or mitotic activity of the test compound against different types of tumors (Monks et al. Supra; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol, supra). Update, 3 (10): 1-12 [1989]).
[0227]
Cells from approximately 60 human tumor cell lines were collected with trypsin / EDTA (Gibco), washed once, resuspended in IMEM and their viability determined. The cell suspension was pipetted (100 μl volume) into a separate 96 well microtiter plate. To prevent overgrowth, the cell density of the 6-day incubation was less than the incubation of the 2-day incubation. For stabilization, seeding was possible with a 24 hour preincubation time at 37 ° C. Two-fold dilutions of the intended test concentration were added to microtiter plate wells in 1: 100 aliquots (1: 2 dilution) at time zero. Test compounds were evaluated at 5 and a half log dilutions (1000 to 100,000 times). Incubation is 5% CO 2 Performed for 2 days and 6 days in atmosphere and 100% humidity.
[0228]
After incubation, the medium was removed and the cells were fixed in 0.1 ml 10% trichloroacetic acid at 40 ° C. The plate is washed 5 times with deionized water, dried, stained with 0.1 ml 0.4% sulforhodamine B dye (Sigma) dissolved in 1% acetic acid for 30 minutes, washed off 4 times with 1% acetic acid and not washed. The bound dye was removed and dried, and the stain was extracted with 0.1 ml of 10 mM Tris base [Tris (hydroxymethyl) aminomethane], pH 10.5 for 5 minutes. The absorbance (OD) of sulforhodamine B at 492 nm was measured using a 96 well macrotiter plate reader connected to a computer.
A test sample is considered positive if it exhibits a growth inhibitory effect of at least 40% at one or more concentrations. The results are shown in the following Table 7, where the abbreviations for tumor cell types are as follows:
NSCL = non-small cell lung cancer; CNS = central nervous system
[0229]
Figure 0004280444
[0230]
Deposit of materials
The following materials were deposited with the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 USA (ATCC):
Figure 0004280444
[0231]
These deposits were made in accordance with the provisions of the Budapest Treaty and its regulations (Budapest Convention) on the international recognition of the deposit of microorganisms in the patent procedure. This guarantees that the live culture of the deposit will be maintained for 30 years from the date of deposit. Deposits may be obtained from the ATCC in accordance with the terms of the Budapest Treaty and in accordance with an agreement between Genentech and ATCC, whichever comes first, at the time of issuance of the relevant US patent or any Ensures that the progeny of the deposited culture are made available permanently and unrestricted at the time of publication of a US or foreign patent application, and is subject to 35 USC 122 and the Patent Office Commissioner Regulation (specifically 37 CFR of reference number 886OG638). Guarantees that the offspring will be made available to those who have been determined to have the rights in accordance with (including Section 1.14).
[0232]
The assignee of this application will promptly replace the material with the same other at the time of notification if the culture of the deposited material dies or is lost or destroyed when cultured under appropriate conditions. Agree to The availability of deposited materials is not considered a license to practice the present invention in violation of rights granted under any governmental authority in accordance with patent law.
The above written description is considered to be sufficient to enable one skilled in the art to practice the invention. The deposited embodiments are intended as an illustration of certain aspects of the invention, and since any functionally equivalent product is within the scope of the invention, the deposited product will limit the scope of the invention. It is not limited. The deposition of materials herein does not acknowledge that the written description contained herein is insufficient to allow implementation of any aspect of the present invention, including its best mode, and that It is not to be construed as limiting the scope of the claims for the particular illustrations represented. Indeed, various modifications of the invention in addition to those shown and described herein will be apparent to those skilled in the art from the foregoing description and are intended to be within the scope of the following claims.
[0233]
Figure 0004280444
[0234]
Figure 0004280444

[Brief description of the drawings]
[Figure 1] SEQ ID NO: 1 is the nucleotide sequence of the native sequence PRO943 cDNA, herein designated "DNA52192-1369" (SEQ ID NO: 1).
[FIG. 2] An amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 1 shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 2).
[Figure 3] SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of the native sequence PRO1250 cDNA, designated herein as "DNA60775-1532" (SEQ ID NO: 3).
[FIG. 4] An amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 3 shown in FIG. 3 (SEQ ID NO: 4).
[Figure 5] SEQ ID NO: 5 is the nucleotide sequence of the native sequence PRO1337 cDNA, herein designated "DNA66672-1586" (SEQ ID NO: 5).
[FIG. 6] An amino acid sequence derived from the coding sequence of SEQ ID NO: 5 shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 6).

Claims (29)

Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドを製薬的に許容される担体と混合して有効量含んでなる、腫瘍性細胞成長阻害に関して有用な物質の組成物。  A composition of a substance useful for inhibiting tumor cell growth, comprising an effective amount of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) mixed with a pharmaceutically acceptable carrier. Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの成長阻害量を含んでなる、請求項1に記載の物質の組成物。  The composition of the substance of Claim 1 which comprises the growth inhibitory amount of polypeptide shown in FIG2 (sequence number: 2). Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの細胞毒性量を含んでなる、請求項1に記載の物質の組成物。  The composition of matter of claim 1 comprising a cytotoxic amount of the polypeptide shown in Fig 2 (SEQ ID NO: 2). さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を付加的に含んでなる、請求項1に記載の物質の組成物。  The composition of matter of claim 1 additionally comprising a further growth inhibitory agent, cytotoxic agent or chemotherapeutic agent. Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの治療的有効量を含んでなる、哺乳動物の腫瘍の治療に関して有用な物質の組成物。  A composition of matter useful for the treatment of mammalian tumors, comprising a therapeutically effective amount of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). 前記腫瘍が癌である、請求項5の物質の組成物。  6. The composition of matter of claim 5, wherein the tumor is cancer. 癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、メラノーマ及び白血病からなる群より選択される請求項6に記載の物質の組成物。  The composition of matter according to claim 6, wherein the cancer is selected from the group consisting of breast cancer, ovarian cancer, kidney cancer, colorectal cancer, lung cancer, bladder cancer, central nervous system cancer, melanoma and leukemia. 前記腫瘍細胞を、Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの有効量に暴露することを含んでなる、インビトロで腫瘍細胞の成長を阻害する方法。  A method of inhibiting tumor cell growth in vitro comprising exposing said tumor cells to an effective amount of a polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). 容器;及び
当該容器内に収容された組成物とを具備し、前記組成物が請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物である製造品。
A manufactured product comprising: a container; and a composition contained in the container, wherein the composition is the composition according to any one of claims 1 to 7.
腫瘍細胞成長を阻害するための前記組成物の用途を記した、前記容器に貼付られたラベル又は前記容器に挿入された包装挿入物をさらに具備する請求項9に記載の製造品。  10. The article of manufacture of claim 9, further comprising a label affixed to the container or a packaging insert inserted into the container that describes the use of the composition to inhibit tumor cell growth. 前記活性剤が、哺乳動物における腫瘍の治療に有効な量で存在する、請求項9に記載の物質の製造品。  10. The article of manufacture of claim 9, wherein the active agent is present in an amount effective to treat a tumor in a mammal. さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を付加的に含む請求項13に記載の物質の製造品。  14. The article of manufacture of claim 13, additionally comprising a further growth inhibitory agent, cytotoxic agent or chemotherapeutic agent. Fig2(配列番号:2)に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising an isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). Fig1(配列番号:1)に示すヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising an isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). Fig1(配列番号:1)に示すヌクレオチド配列の完全長コード化配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising an isolated nucleic acid having at least 80% nucleic acid sequence identity to the full-length coding sequence of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) . 請求項13から15のいずれか一項に記載の核酸を含むベクターを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising a vector comprising the nucleic acid according to any one of claims 13 to 15. 前記ベクターが、該ベクターで形質転換した宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に結合したものである、請求項16に記載の組成物。  17. The composition of claim 16, wherein the vector is operably linked to a control sequence recognized by a host cell transformed with the vector. 請求項16に記載のベクターを含む宿主細胞を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising a host cell comprising the vector of claim 16. 前記細胞がCHO細胞である、請求項18に記載の組成物。  The composition of claim 18, wherein the cell is a CHO cell. 前記細胞が大腸菌である、請求項18に記載の組成物。  19. The composition of claim 18, wherein the cell is E. coli. 前記細胞が酵母菌細胞である、請求項18に記載の組成物。  19. The composition of claim 18, wherein the cell is a yeast cell. 前記細胞がバキュウロウイルス感染昆虫細胞である、請求項18に記載の組成物。  19. The composition of claim 18, wherein the cell is a baculovirus infected insect cell. Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの発現に適した条件下で請求項18に記載の宿主細胞を培養し、そしてその細胞培養から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる前記ポリペプチドを製造する方法によって製造されたFig2(配列番号:2)に示すポリペプチドを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  19. The polypeptide comprising culturing the host cell of claim 18 under conditions suitable for expression of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) and recovering the polypeptide from the cell culture. A composition for inhibiting the growth of tumor cells, comprising the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) produced by the method for producing a tumor cell. Fig2(配列番号:2)に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチドを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  A composition for inhibiting tumor cell growth, comprising an isolated polypeptide having at least 80% amino acid sequence identity to the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2). 異種アミノ酸配列に融合した請求項24に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。  25. A composition for inhibiting tumor cell growth comprising a chimeric molecule comprising the polypeptide of claim 24 fused to a heterologous amino acid sequence. 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項25に記載の組成物。  26. The composition of claim 25, wherein the heterologous amino acid sequence is an epitope tag sequence. 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのFc領域である請求項25に記載の組成物。  26. The composition of claim 25, wherein the heterologous amino acid sequence is an Fc region of an immunoglobulin. (a)Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、結合するシグナルペプチドを欠くものに対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有するもの
(b)Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、結合するシグナルペプチドを有するもの;又は
(c) Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列であって、結合するシグナルペプチドを欠くもの
有する単離された核酸を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。
(A) a nucleotide sequence encoding a polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) having at least 80% nucleic acid sequence identity to that lacking a binding signal peptide;
(B) a nucleotide sequence encoding the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), which has a signal peptide to bind; or (c) the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) A nucleotide sequence that encodes the extracellular domain of and lacking a binding signal peptide ;
Including isolated nucleic acids having the composition for inhibiting the growth of tumor cells.
(a)Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドであって、結合するシグナルペプチドを欠くものに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するもの
(b)Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、結合するシグナルペプチドを有するもの;又は
(c)Fig2(配列番号:2)に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、結合するシグナルペプチドを欠くもの
有する単離されたポリペプチドを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物。
(A) the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2), which has at least 80% amino acid sequence identity to that lacking the signal peptide to bind;
(B) the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) having a signal peptide to bind; or (c) the extracellular domain of the polypeptide shown in FIG. 2 (SEQ ID NO: 2) Those lacking a signal peptide to bind ,
It includes an isolated polypeptide having the composition for inhibiting the growth of tumor cells.
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