JP4273311B2

JP4273311B2 - Method and reagent for measuring substance to be measured in sample

Info

Publication number: JP4273311B2
Application number: JP2003158696A
Authority: JP
Inventors: 幸仁水谷; 雄樹中村; 幸造川崎; 龍彦田中
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 2002-04-26
Filing date: 2003-04-28
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2023-04-28
Also published as: JP2004004097A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の測定対象物質を測定する際に、試料中に含まれる干渉物質による影響を回避し、正確な測定値を得ることができる、測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法に関する。
本発明によれば、例えば、試料中に金属キレート剤が含まれる場合でも、Ｃ反応性蛋白を誤差無く正確に測定することができる。
【０００２】
本発明は、臨床検査、免疫学、及び医学などの生命科学分野、分析化学などの化学分野、食品衛生分野、並びに環境衛生分野等において有用なものである。
【０００３】
【従来の技術】
血液、尿等の試料中に含まれる測定対象物質の測定は、疾病の診断において大変有用なものであり、臨床検査においては、例えば、酵素反応を利用した酵素学的測定方法、抗原と抗体の間の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法、又は測定対象物質に特定の物質が結合した際のシグナルの生成を測定する方法等が普及し、様々な測定方法が開発されている。
【０００４】
例えば、免疫学的測定方法は、試料中に含まれる測定対象物質と、この測定対象物質に対して特異的に結合する特異的結合物質との結合の有無、又は結合の量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものである。
この免疫学的測定方法においては、特に、測定対象物質に対する抗体を含む比濁法測定試薬と測定対象物質を含む試料を接触させ、測定対象物質に対する抗体と測定対象物質との抗原抗体反応により生成した測定対象物質と抗体との凝集塊により生じた濁度を測定することにより、試料中の測定対象物質の定量を行う免疫比濁法（ＴＩＡ）が繁用されている。
【０００５】
また、担体（ラテックス粒子等）に固定化された測定対象物質に対する抗体若しくは抗原を含む比濁法測定試薬と、測定対象物質を含む試料とを接触させ、前記担体に固定化された測定対象物質に対する抗体若しくは抗原と測定対象物質との抗原抗体反応により生成した「〔担体＝測定対象物質に対する抗体若しくは抗原〕−〔測定対象物質〕」の凝集塊により生じた濁度を測定することにより、試料中の測定対象物質の定量を行う比濁法（担体がラテックス粒子の場合は、「ラテックス免疫比濁法」）も繁用されている。
そして、これらの定量測定は、Ｃ反応性蛋白（以下ＣＲＰと略すこともある）、免疫グロブリン、補体成分等の定量に使用されている。
【０００６】
また、例えば、酵素学的測定方法は、試料中に含まれる測定対象物質を基質とする酵素による触媒反応により、場合により更なる反応により、シグナルを生成させ、この生成したシグナルの有無又はシグナルの量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものである。
【０００７】
また、試料中に含まれる測定対象物質が酵素である場合に、この酵素の基質となる物質を接触させ、酵素による触媒反応により、場合により更なる反応により、シグナルを生成させ、この生成したシグナルの有無又はシグナルの量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものも酵素学的測定方法である。
【０００８】
例としては、ヘキソキナーゼ及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素などを用いたグルコースの測定方法や、４−ニトロフェニルリン酸を基質として用いるアルカリ性ホスファターゼ活性測定方法等を挙げることができる。
【０００９】
更には、例えば、測定対象物質に特定の物質が結合した際のシグナルの生成を測定する方法は、試料中に含まれる測定対象物質に、この測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質を接触させ、この測定対象物質と前記シグナル生成物質との接触及び結合により生成したシグナルの有無又はシグナルの量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものである。
【００１０】
例としては、測定対象物質である蛋白質にアルカリ性下で２価の銅イオンを接触させ、蛋白質中のペプチド結合と銅イオンとの錯体の形成により、紫紅色の発色を生成させ、これを測定することによるビュレット法を挙げることができる。また、測定対象物質であるアルブミンに色素〔ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）又はブロモクレゾールグリーン（ＢＣＧ）など〕を接触させ、色素がアルブミンと結合することによる色調の変化を測定する方法等を例として挙げることができる。
【００１１】
これらの測定方法においては、測定反応液中に干渉物質が存在すると、この干渉物質が測定対象物質の測定値に影響を及ぼし、正確な測定が行えないことがあることが知られている。
【００１２】
例えば、試料中のＣＲＰの測定においては、試料中にＥＤＴＡ等の干渉物質が存在することによりＣＲＰ測定値に影響を及ぼし、正確な測定を行えないことが問題となっている。
【００１３】
このＣＲＰは、肺炎球菌菌体のＣ多糖体と沈降反応を示す蛋白であり、血清等の試料中にＣＲＰが存在することは、感染症に罹患していること、又は体内に炎症が生じていること等の証拠となる。
このためＣＲＰは各種炎症のマーカーとして、感染症又は炎症等の疾患の診断のためにその測定が行われている。
このＣＲＰの測定法としては、Ｃ多糖体との特異的反応をみる方法、及び試薬に抗ヒトＣＲＰ抗体を用い、試料中のＣＲＰと試薬中の抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体反応により、抗原抗体複合体を生成させる方法等を挙げることができる。
現在では、抗ＣＲＰ抗体との抗原抗体複合体を生成させる方法である、毛細管法、免疫比濁法、ラテックス免疫比濁法等が日常検査に広く利用されている。
しかしながら、この抗ＣＲＰ抗体を用いてＣＲＰを測定する場合、試料中にＥＤＴＡ等の金属キレート剤が存在すると、存在しない場合に比べて測定値が低下してしまい、ＣＲＰを正確に測定できない場合があった。
【００１４】
ＣＲＰはカルシウムイオン（Ｃａ^２＋）との結合部位を有しており、Ｃａ^２＋と結合したＣＲＰはその立体構造（抗原性）の一部を変化させることが分かっている（例えば、非特許文献１参照。）。
【００１５】
【非特許文献１】
「臨床病理」，第３２巻，第２号，第２２３頁〜第２２４頁，１９８４年発行
【００１６】
例えば、抗血清を得るために、動物にＣＲＰを接種すると、ＣＲＰは動物の血液中のＣａ^２＋と結合しＣａ結合型ＣＲＰとなり、このＣａ結合型ＣＲＰに対する抗体ができる。
この抗体の多くはＣａ結合型ＣＲＰ及びＣａ非結合型ＣＲＰのどちらとも反応できるが、残りの一部はＣａ非結合型ＣＲＰとは反応できないことが知られている。
ここで、得られた抗体を用いて試料中のＣＲＰを測定した場合、試料中にＥＤＴＡが存在していると、ＥＤＴＡが存在しない場合に比べて測定値が低下してしまう（負の影響）という問題点があった。
これは、試料中のＣａ結合型ＣＲＰに結合していたＣａ^２＋がＥＤＴＡと結合し、Ｃａ非結合型ＣＲＰとなることにより、ＣＲＰの抗原性が変化してしまい、抗体の一部が反応できなくなるためであると考えられている。
【００１７】
また、血清等の試料中のアルブミンの測定は、体内蛋白代謝異常の指標としてその測定が重要視されている。
このアルブミンの測定において、従来は、アルブミンと結合することにより色調を変化させる色素としてブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）を使用するＢＣＧ法が用いられることが多かった。
しかし、このＢＣＧ法はアルブミンのみならず、グロブリンも測り込んでしまうという問題点があった。
【００１８】
本発明者らは、グロブリンを測り込むことのない、アルブミンと結合することにより色調を変化させる色素としてブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を使用するＢＣＰ法について検討を進めるうち、今まで全く知られていなかったことに気が付いた。
すなわち、試料中の脂肪酸の濃度が高くなるにつれ、試料中のアルブミン測定値に正の誤差が生じることに気が付いた。
つまり、ＢＣＰ法による試料中のアルブミン測定時に、試料中に含まれる脂肪酸が干渉物質となり、ＢＣＰ法における測定反応に干渉し、アルブミン測定値に正の誤差（正の影響）を生じさせるというものである。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、従来の試料中の測定対象物質の測定にみられる、試料中に含まれる干渉物質による測定値への影響を回避し、正確な測定を行うことができる手段を提供することである。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、あらかじめ測定反応液中に干渉物質と同じ機能を有する物質を存在させることにより、この干渉物質の影響を回避できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は、試料中の測定対象物質の測定時に、試料中に含まれる干渉物質による影響を回避し、正確な測定を行うため、測定反応時に前記の干渉物質と同じ機能を有する物質を存在させて測定を行い、試料中の測定対象物質の測定値と既知濃度の標準物質の測定値との比例計算によって測定対象物質の含有量（濃度）を求める、試料中の測定対象物質の測定方法である。
【００２２】
また、本発明は、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を含有する、試料中の測定対象物質の測定試薬であって、この測定試薬が試料中の測定対象物質の測定値と既知濃度の標準物質の測定値との比例計算によって測定対象物質の含有量（濃度）を求めるものである、試料中の測定対象物質の測定試薬である。
更に、本発明は、試料中の測定対象物質の測定反応時に、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を存在させて測定を行い、試料中の測定対象物質の測定値と既知濃度の標準物質の測定値との比例計算によって測定対象物質の含有量（濃度）を求める、試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法である。
【００２３】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法においては、試料中の測定対象物質の測定値と既知濃度の標準物質の測定値との比例計算によって測定対象物質の含有量（濃度）を求める際の試料中の測定対象物質の測定値として試料測定時の吸光度値を、既知濃度の標準物質の測定値として標準物質測定時の吸光度値を、それぞれ挙げることができる。
そして、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法においては、干渉物質と同じ機能を有する物質として、この干渉物質を挙げることができる。
【００２４】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法においては、試料中の測定対象物質の測定として、抗原抗体反応を利用して行われるものを挙げることができる。
【００２５】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法においては、試料中の測定対象物質の測定として、酵素反応を利用して行われるものを挙げることができる。
【００２６】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法においては、試料中の測定対象物質の測定として、測定対象物質に特定の物質が結合した際のシグナルの生成を測定するものを挙げることができる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
１．干渉物質
本発明において、干渉物質とは、試料中の測定対象物質の測定において、試料中にその干渉物質が存在することによって、測定対象物質の測定値に正又は負の誤差を与える物質のことをいう。
【００２８】
このような物質としては、例えば、金属キレート剤又は脂肪酸等を挙げることができる。
【００２９】
なお、本発明においては、干渉物質が金属キレート剤である場合に、特に好適である。
【００３０】
ここで、金属キレート剤とは、金属イオンに配位する多座配位子であって、金属イオンへの配位により金属を含んだ環状構造（キレート環）を形成する有機化合物をいう。
例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、ジアミノプロパノール四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ジエチレン（トリアミン）五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二プロピオン酸（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンビスメチレンホスホン酸（ＥＤＤＰＯ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）（ＥＤＴＰＯ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ビス（ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）、ヘキサメチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、イミノ二酢酸（ＩＤＡ）、ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ三プロピオン酸（ＮＴＰ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＰＯ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）等又はその塩が挙げられる。
なお、上記の塩としては、ナトリウム、カリウム若しくはリチウムなどのアルカリ金属との塩、アンモニウム塩、又は塩酸塩等を挙げることができる。
【００３１】
また、本発明においては、干渉物質が脂肪酸である場合に、特に好適である。
【００３２】
ここで、脂肪酸とは、脂肪族モノカルボン酸、脂肪族ジカルボン酸、又はこれらの塩をいう。
【００３３】
例えば、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸若しくはリグノセリン酸などの飽和脂肪酸又はこれらの塩、あるいは、デセン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、エルシン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸若しくはエイコサペンタエン酸などの不飽和脂肪酸又はこれらの塩等を挙げることができる。
なお、上記の塩としては、ナトリウム、カリウム若しくはリチウムなどのアルカリ金属との塩、又は、カルシウム若しくはマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩等を挙げることができる。
【００３４】
２．干渉物質と同じ機能を有する物質
本発明においては、試料中の測定対象物質の測定において、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を含有又は存在させる。
ここで、干渉物質と同じ機能を有する物質とは、干渉物質と全く同じ物質、又は構造の一部若しくは全部が異なるが、同じ作用を起こすものをいう。
【００３５】
例えば、干渉物質が、金属キレート剤の一種であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である場合には、ＥＤＴＡ自体又はＥＤＴＡと同じ機能を有する他の金属キレート剤を測定試薬に含有させる、又は測定時に存在させればよい。
【００３６】
なお、本発明において、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質として、金属キレート剤を含有又は存在させる場合には、ＥＤＴＡ又はその塩を含有又は存在させることが好ましい。これは、ＥＤＴＡが六座配位子であり、各種金属イオンと安定に結合することができること、また極めて一般的な金属キレート剤であるため容易に入手でき、経済的であることによる。
【００３７】
また、例えば、干渉物質が、脂肪酸である場合には、前記の脂肪酸（遊離の脂肪酸又は脂肪酸塩）の１種又は２種以上を測定試薬に含有させる、又は測定時に存在させればよい。
【００３８】
なお、本発明において、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質として、前記の通り脂肪酸を含有又は存在させる場合には、脂肪族鎖の炭素数が１０以上の脂肪酸（遊離の脂肪酸又は脂肪酸塩）を含有又は存在させることが好ましい。このうち、その溶解性より、カプリン酸、ラウリン酸、オレイン酸若しくはリノール酸、又はこれらの塩を含有あるいは存在させることがより好ましい。同じ理由により、特に、カプリン酸又はこの塩を含有又は存在させることが好ましい。
【００３９】
また、本発明における干渉物質と同じ機能を有する物質の使用方法としては、例えば、緩衝液等に含有させた干渉物質と同じ機能を有する物質を、測定対象物質の測定を行わせる前にあらかじめ試料と接触させる方法を挙げることができる。
又は、測定試薬中に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質を含有させ、この測定試薬と試料を接触させて測定反応を行わせ、試料中の測定対象物質の測定反応時に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質を共存させる方法を挙げることができる。
あるいは、これらの２つの方法を組み合わせた方法等を挙げることができる。
【００４０】
更に、本発明において、干渉物質と同じ機能を有する物質の濃度は、測定試薬と試料の混合比率、干渉物質の作用機序等により上限及び下限濃度が異なり、一概に決めることができないので、試料中に含まれる干渉物質による影響を回避するのに充分な濃度を適宜設定すればよい。
【００４１】
例えば、干渉物質と同じ機能を有する物質として、金属キレート剤を使用する場合には、最終反応液中の下限濃度が０．００１ｍＭ以上が好ましく、０．０１ｍＭ以上がより好ましく、０．１ｍＭ以上が特に好ましい。なお、上限濃度は測定反応に影響を及ぼさない限り制限はない。ただし、コスト上の観点からいえば、５００ｍＭ以下が好ましく、１００ｍＭ以下がより好ましく、５０ｍＭ以下が特に好ましい。
【００４２】
また、例えば、干渉物質と同じ機能を有する物質として、脂肪酸を使用する場合には、最終反応液中の下限濃度が０．０１ｍＭ以上が好ましく、０．１ｍＭ以上がより好ましく、０．２ｍＭ以上が特に好ましい。なお、上限濃度は測定反応に影響を及ぼさない限り制限はない。ただし、コスト上の観点からいえば、５０ｍＭ以下が好ましく、１０ｍＭ以下がより好ましく、５ｍＭ以下が特に好ましい。
【００４３】
３．測定対象物質
本発明において、測定対象物質としては、試料中におけるその存在の有無、又は含有量（濃度）を測定しようとする物質であり、かつ干渉物質によりその測定値が影響を受けるものであれば、特に限定しない。
この測定対象物質としては、例えば、蛋白質、糖質、脂質、核酸等のような有機物質、又は金属等の無機物質等を挙げることができる。
【００４４】
なお、本発明においては、測定対象物質として、特に、金属イオンと結合することにより抗原性が変化する物質を挙げることができる。
ここで、抗原性が変化するとは、具体的には、金属イオンが測定対象物質の金属結合部位と結合又は金属結合部位と脱離することにより、抗体結合部位の立体構造又は電荷等の環境を変化させてしまい、抗体との結合性に変化が生じることを意味する。
【００４５】
そして、金属イオンとしては、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）、ナトリウムイオン（Ｎａ^＋）、カリウムイオン（Ｋ^＋）、鉄イオン（Ｆｅ^２＋）、銅イオン（Ｃｕ^２＋）、亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）又はニッケルイオン（Ｎｉ^２＋）等を挙げることができる。
【００４６】
この金属イオンと結合することにより抗原性が変化する物質としては、例えば、Ｃ反応性蛋白、トロポニン、カルモジュリン、ラクトフェリン、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）又はメタロチオネイン等を挙げることができる。
【００４７】
なお、本発明においては、測定対象物質として、特に、Ｃ反応性蛋白を挙げることができる。
【００４８】
また、本発明においては、測定対象物質として、アルブミン若しくは総蛋白質などの蛋白質又はペプチド等を挙げることができる。特に、測定対象物質として、アルブミンを挙げることができる。
【００４９】
４．試料
本発明において、試料とは、前記の測定対象物質が存在する可能性があり、かつ該測定対象物質の存在の有無、又は含有量（濃度）の測定を行おうとするものをいう。
例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；ヒト若しくは動物の脳等の臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞或いは菌体の抽出液；植物の抽出液；穀物、野菜、果物、魚介類、肉類又は加工食品等の食品、水、茶、コーヒー、牛乳、又は果汁等の飲料；試薬又は医薬品；そして、飲料水、河川水、湖沼水、海水、又は土壌の懸濁液等の環境分析用試料等を挙げることができる。
【００５０】
５．測定方法
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、試料中の測定対象物質の測定時に、試料中に含まれる干渉物質による影響を回避するため、測定反応時に前記の干渉物質と同じ機能を有する物質を存在させて測定を行うものである。
【００５１】
本発明における試料中の測定対象物質の測定方法としては、例えば、酵素反応を利用した酵素学的測定方法、抗原と抗体の間の抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法、測定対象物質に特定の物質が結合した際のシグナルの生成を測定する測定方法等を挙げることができる。
【００５２】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において好適である。
この免疫学的測定方法としては、例えば、ラテックス免疫比濁法；ラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法；酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫測定法、すなわち標識免疫測定法；ウエスタンブロット法；Ｄａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）〔Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年、及びＷＯ９８／２３９６３号公報〕；イムノクロマトグラフィー法；又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体の被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面に集まるか否かにより測定を行う方法等を挙げることができる。
【００５３】
また、前記の標識免疫測定法においては、サンドイッチ法、競合法、又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても本発明を適用することができる。
なお、この測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。また、この測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【００５４】
また、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法において、干渉物質と同じ機能を有する物質を測定反応時に存在させる方法としては、前記「２．干渉物質と同じ機能を有する物質」に記載してある方法から適宜選択して使用することができる。
【００５５】
例えば、ラテックス免疫比濁法を測定原理としてＣＲＰの測定を行う場合を例に挙げると、２ステップ法により測定を行う場合には、緩衝液からなる第１試薬に干渉物質と同じ機能を有する物質を含有させ、ＣＲＰの測定を行わせる前にあらかじめ試料と接触させてもよいし、又は、抗ＣＲＰ抗体等が固定化されたラテックス粒子が存在する第２試薬中に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質を含有させ、この第２試薬と試料及び第１試薬の混合物を接触させて測定反応を行わせ、試料中のＣＲＰの測定反応時に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質を共存させてもよい。あるいは、これらの２つの方法を組み合わせて使用してもよい。
【００５６】
なお、測定方法として担体を用いる測定方法を使用する場合、担体の種類や形状は特に限定されず、例えば、以下に記載したような、免疫学的測定方法、免疫学的測定試薬等において通常用いられている担体等を挙げることができる。
【００５７】
担体としては、例えば、ラテックス免疫比濁法に使用されているラテックス粒子、又はラテックス免疫比濁法に使用が可能な粒子等を挙げることができる。
このようなラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアクリル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができる。
【００５８】
また、担体としては、例えば、セラチン粒子などを用いる粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法に使用されている粒子、又はこの間接凝集反応測定法に使用が可能な粒子等を挙げることができる。
このような粒子としては、例えば、ポリスチレン、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子又はその他の人工担体等を挙げることができる。
更に、粒子として、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着色したものを使用してもよい。
【００５９】
これらの間接凝集反応測定法に使用されている又は使用が可能な粒子の粒径については、特に制限はない。
しかし、これらの粒子の粒径としては、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．１〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。
また、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００６０】
また、担体としては、例えば、間接凝集反応測定法に使用されている容器、又はこの間接凝集反応測定法に使用することが可能な容器等を挙げることができる。
このような容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
なお、前記容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが好ましい。
【００６１】
また、担体としては、例えば、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫測定法、すなわち標識免疫測定法に使用されている担体、又はこの標識免疫測定法に使用することが可能な担体等を挙げることができる。
このような担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネイト、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等を挙げることができる。
【００６２】
また、担体としては、例えば、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された被検物質（測定対象物質）に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質（測定対象物質）に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用いる測定法に使用される担体、又はこの測定法に使用することが可能な担体等を挙げることができる。
このような担体としては、例えば、ポリスチレン、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非吸水性の材質が挙げられる。
【００６３】
また、以上記載した担体を強磁性体で被覆又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を用いることもできる。
【００６４】
更に、本発明の試料中の測定対象物質の測定方法は、測定対象物質に特定の物質が結合した際のシグナルの生成を測定する測定方法において好適である。
【００６５】
この測定方法は、試料中に含まれる測定対象物質に、この測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質を接触させ、この測定対象物質と前記シグナル生成物質との接触及び結合により生成したシグナルの有無又はシグナルの量を測ることにより、試料中に含まれる測定対象物質の有無の測定〔定性測定〕、又はその含有量（濃度）の測定〔定量測定〕を行うものである。
【００６６】
なお、シグナルが、測定対象物質と、この測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質（シグナル生成物質）との接触及び結合の他に、更に他の反応を続けることにより生成するものであってもよい。
【００６７】
また、このシグナルの生成であるが、これは測定対象物質と、この測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質（シグナル生成物質）との接触及び結合により、光学的、電気的、磁気的若しくは他のエネルギー等におけるシグナル（信号）が生じること又は変化することを検出することができるということを意味する。
【００６８】
例えば、測定対象物質と前記シグナル生成物質との接触及び結合により、吸光度、透過率若しくは蛍光強度が変化するもの、又は光の吸収曲線が変化するもの等を挙げることができ、この場合、吸光度、透過率若しくは蛍光強度又は光の吸収曲線の変化の量を測定することにより、前記のシグナルの生成を測定することができる。
【００６９】
この測定対象物質と前記シグナル生成物質との組み合わせを以下例示する。
測定対象物質がアルブミンの場合、前記シグナル生成物質として、ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）又はブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）等を挙げることができる。
【００７０】
ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を用いる場合には、アルブミンとの接触、結合により、色調が黄緑色から青紫色に変化するので、５７０〜６３０ｎｍ近辺における吸光度の増加を測定することによりシグナル生成の測定を行う。
【００７１】
また、ブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）を用いる場合には、アルブミンとの接触、結合により、色調が黄褐色から青緑色に変化するので、６００〜６６０ｎｍ近辺における吸光度の増加を測定することによりシグナル生成の測定を行う。
【００７２】
そして、測定対象物質が総蛋白質の場合、前記シグナル生成物質として、２価の銅イオン等を挙げることができる。
２価の銅イオンを用いる場合には、蛋白質のペプチド結合と２価の銅イオンとの接触、結合により、色調が青色から紅色に変化するので、５００〜６００ｎｍ近辺における吸光度の増加を測定することによりシグナル生成の測定を行う。
【００７３】
なお、本発明においては、測定対象物質がアルブミンであり、前記シグナル生成物質がブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）である場合に、特に好適である。
【００７４】
なお、この測定方法は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
また、この測定方法は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
【００７５】
また、この測定方法において、干渉物質と同じ機能を有する物質を測定反応時に存在させる方法としては、前記「２．干渉物質と同じ機能を有する物質」に記載してある方法から適宜選択して使用すればよいが、例えば、ＢＣＰ法により試料中のアルブミンの測定を行う場合を例に挙げると、緩衝液等からなる第１試薬に干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させ、試料中に含まれるアルブミンと第２試薬に含有させたＢＣＰとの測定反応を行わせる前にあらかじめ試料と接触させてもよい。
又は、ＢＣＰを含有させた第２試薬中に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させ、この第２試薬と試料及び第１試薬の混合物を接触させて測定反応を行わせ、試料中のアルブミンの測定反応時に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質を共存させてもよい。
あるいは、これらの２つの方法を組み合わせ、第１試薬と第２試薬の両方に本発明の干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させてもよい。
【００７６】
６．測定試薬
本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を含有するものである。
【００７７】
本発明における試料中の測定対象物質の測定試薬においては、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を含有させる以外は、前記「５．測定方法」に記載したような測定方法を測定原理とした、酵素学的測定試薬、免疫学的測定試薬、又は測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質を試料中の測定対象物質に接触、結合させ、生成するシグナルを測定する方法において使用される測定試薬等において用いられる組成であればよい。
【００７８】
なお、本発明の試料中の測定対象物質の測定試薬は、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定試薬、又は測定対象物質に結合した際にシグナルが生成する物質を試料中の測定対象物質に接触、結合させ、生成するシグナルを測定する方法における測定試薬において好適である。
【００７９】
また、本発明の測定試薬には、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を含ませてもよい。
【００８０】
なお、本発明における測定試薬が液状状態の場合、その溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
【００８１】
また、本発明を免疫学的測定試薬において実施する場合には、抗原又は抗体を固定化した担体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などの蛋白質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００８２】
また、本発明を免疫学的測定試薬以外の測定試薬において実施する場合には、測定対象物質の測定に影響を与えない種類及び濃度の蛋白質；各種塩類；各種糖類；抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；安定化剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００８３】
【作用】
本発明においては、試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬において、試料中の干渉物質と同じ機能を有する物質を存在又は含有させることにより、干渉物質による影響を回避し、正確な測定を行うことができる。
【００８４】
この作用機序について、試料中に含まれる干渉物質がＥＤＴＡであり、ＥＤＴＡを含有させた測定試薬を使用して試料中のＣＲＰの測定を行う場合を例に挙げて説明する。
【００８５】
生体試料中のＣＲＰは、カルシウムイオン（Ｃａ^２＋）と結合したＣａ結合型ＣＲＰとして存在している。
この試料にＥＤＴＡ（干渉物質）が混入すると、Ｃａ結合型ＣＲＰに結合していたＣａ^２＋が混入してきたＥＤＴＡと結合し、失われてしまうため、Ｃａ結合型ＣＲＰはＣａ非結合型ＣＲＰとなる（ＣＲＰの抗原性が変化する）。
【００８６】
従来のＥＤＴＡを含有していないＣＲＰ測定試薬（従来の測定試薬）を使用して試料中のＣＲＰの測定を行う場合、試料にＥＤＴＡが含まれているときは、測定試薬中の抗ＣＲＰ抗体の一部は、Ｃａ非結合型ＣＲＰと反応できないため、得られる吸光度は、試料にＥＤＴＡが含まれていない場合よりも低下したものとなる。
【００８７】
ここで、ＣＲＰの測定値は、既知濃度のＣＲＰ標準物質を測定した時の吸光度との比例計算によって求める。〔試料中の測定対象物質濃度＝（試料測定時の吸光度値÷標準物質測定時の吸光度値）×標準物質中の測定対象物質濃度〕
この標準物質中のＣＲＰはＣａ結合型ＣＲＰとして存在しているため、従来の測定試薬を使用して標準物質中のＣＲＰを測定した場合、測定試薬中の抗ＣＲＰ抗体は標準物質中の全てのＣＲＰと反応できるため、吸光度の低下がない。
つまり、標準物質を測定して得られた吸光度との比例計算によって求めた、ＥＤＴＡを含む試料中のＣＲＰ測定値は、実際の測定値より低下したものとなってしまう。
【００８８】
これに対して、ＥＤＴＡを含有させた測定試薬（本発明の測定試薬）を使用して、この試料中のＣＲＰを測定した場合は、試料と測定試薬を混合した段階で、試料中のＣａ結合型ＣＲＰに結合していたＣａ^２＋が測定試薬中のＥＤＴＡと結合してしまうため、試料中にＥＤＴＡが含まれている場合も、含まれていない場合も、（試料中に含まれていた）Ｃａ結合型ＣＲＰはＣａ非結合型ＣＲＰとなる（ＣＲＰの抗原性が変化する）。
【００８９】
ここで、本発明の測定試薬を使用して試料中のＣＲＰの測定を行う場合、（試料中に含まれていた）Ｃａ結合型ＣＲＰはＣａ非結合型ＣＲＰとなっており、すなわち、ＣＲＰは全てＣａ非結合型ＣＲＰとなっているので、試料にＥＤＴＡが含まれている場合も、含まれていない場合も、得られる吸光度は同じ値となる。（同じく低下した値となる。）
【００９０】
更に、既知濃度のＣＲＰ標準物質の測定においても、この標準物質を測定試薬と混合した場合に、標準物質中のＣａ結合型ＣＲＰに結合していたＣａ^２＋が測定試薬中のＥＤＴＡと結合してしまうため、（標準液に含まれていた）Ｃａ結合型ＣＲＰは全てＣａ非結合型ＣＲＰとなり、本発明の測定試薬を使用して標準物質中のＣＲＰを測定した場合も、測定試薬中の抗ＣＲＰ抗体の一部が、Ｃａ非結合型ＣＲＰと反応できないため、得られる吸光度は、低下したものとなる。
【００９１】
前述のように試料中のＣＲＰ測定値は、標準物質を測定して得られた吸光度との比例計算によって求める。〔試料中の測定対象物質濃度＝（試料測定時の吸光度値÷標準物質測定時の吸光度値）×標準物質中の測定対象物質濃度〕
よって、本発明の測定試薬を使用した場合、標準物質の吸光度も、試料中のＣＲＰの吸光度も、同程度に低下したものとなるため、比例計算によって求めた試料中のＣＲＰ濃度は、前記の差が相殺されて、本来の濃度（真値）となる。
【００９２】
以上のことより、試料中にＥＤＴＡが含まれている場合と含まれていない場合での測定値（ＣＲＰ濃度）に差は生じないことになる。
つまり、本発明の測定方法及び測定試薬では、ＥＤＴＡ等の干渉物質の影響を受けないということが言える。（標準物質に含まれていたＣＲＰも、試料に含まれていたＣＲＰも、全てＣａ非結合型として測定されるため、試料中に含まれていたＥＤＴＡの影響は生じない。）
【００９３】
また、試料中に含まれる干渉物質が脂肪酸であり、脂肪酸を含有させた測定試薬を使用して試料中のアルブミンの測定を行う場合を例に挙げて説明する。
【００９４】
先にも述べたように、本発明者らは、試料中の脂肪酸の濃度が高くなるにつれ、試料中のアルブミン測定値に正の誤差が生じることに気が付いた。
【００９５】
すなわち、ＢＣＰ法により試料中のアルブミンを測定する際に、試料中の脂肪酸の濃度が通常の濃度であればアルブミン測定値に誤差は生じないのであるが、試料中の脂肪酸が高濃度の場合はその濃度に応じてアルブミン測定値に正の誤差が生じてくることが判明した。
【００９６】
つまり、試料中のアルブミンの測定反応時に高濃度の脂肪酸が存在すると、高濃度の脂肪酸が存在しない時よりも、アルブミンとＢＣＰの結合による色調の変化に由来する吸光度の増加度が高くなってしまい、本来のアルブミン測定値（アルブミン濃度）よりも高い値が得られてしまう。すなわち、測定値に正の誤差が生じてしまう。
【００９７】
従来の、脂肪酸を含有していないアルブミン測定試薬（従来の測定試薬）を使用して、試料中のアルブミンの測定を行う場合、試料に高濃度の脂肪酸が含まれている場合は、測定により得られる吸光度は、試料に脂肪酸が含まれていない場合よりも高いものとなる。
【００９８】
ここで、アルブミンの測定値は、既知濃度のアルブミン標準物質を測定した時の吸光度との比例計算によって求めるが、この標準物質中の脂肪酸濃度は通常高濃度ではないので、従来の測定試薬を使用して標準物質中のアルブミンを測定した場合、標準物質中の脂肪酸に由来する吸光度の増加は生じないか又はごく僅かなものにすぎない。
【００９９】
従って、標準物質を測定して得られた吸光度との比例計算によって求めた、脂肪酸を含む試料中のアルブミン測定値は、本来の測定値より高いものとなってしまう。
【０１００】
これに対して、脂肪酸を含有させた測定試薬（本発明の測定試薬）を使用して、この試料中のアルブミンを測定した場合は、試料中に高濃度の脂肪酸が含まれている場合も、試料中に高濃度の脂肪酸が含まれていない場合も、いずれにおいても、測定試薬中に脂肪酸が含まれているため、高い濃度の脂肪酸の存在下でアルブミンと色素（ＢＣＰ等）との測定反応が行われ、吸光度の測定が行われる。
【０１０１】
すなわち、試料中に高濃度の脂肪酸が含まれていない場合であっても、測定試薬に含まれていた脂肪酸の存在により、試料中に高濃度の脂肪酸が含まれている場合と同様に吸光度が増加し、これにより試料中の脂肪酸濃度の高低による差はなくなる。
【０１０２】
前述のように試料中のアルブミン測定値（アルブミン濃度）は、標準物質を測定して得られた吸光度との比例計算によって求める。〔試料中の測定対象物質濃度＝（試料測定時の吸光度値÷標準物質測定時の吸光度値）×標準物質中の測定対象物質濃度〕
よって、本発明の測定試薬を使用した場合、標準物質を測定して得た吸光度も、試料を測定して得た吸光度も、いずれも脂肪酸の存在により増加したものとなるため、比例計算によって求めた試料中のアルブミン濃度は、前記の吸光度の増加分が相殺されて、本来のアルブミン濃度（真値）が得られる。
【０１０３】
以上のことより、試料中に脂肪酸が含まれている場合と含まれていない場合とでの測定値（アルブミン濃度）に差は生じないことになる。
つまり、本発明の測定方法及び測定試薬では、試料中に含まれる脂肪酸等の干渉物質の影響を受けないということが言える。
【０１０４】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【０１０５】
〔実施例１〕
本発明のＣＲＰ測定用試薬を用いて干渉物質による影響の回避効果を確認した。
【０１０６】
（１）ＣＲＰ測定用試薬の調製
平均粒径０．１μｍのラテックス１０％懸濁液１０．４ｍＬに、抗ＣＲＰヤギポリクローナル抗体を１．４ｇ／ｄＬの濃度で４．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）に混和した液７．３６ｍＬを加え、５℃にて一晩攪拌した。
遠心分離により上清を除去した後、沈殿部に０．８５％牛血清アルブミンを含む１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２）を加え懸濁し、室温下で３０分間攪拌した。
遠心分離により沈殿部を回収した後、これを０．０５％アジ化ナトリウム水溶液で波長５８５ｎｍにおける吸光度が１４．８ＯＤとなるように懸濁し、抗ＣＲＰ抗体固定化粒子懸濁液を調製した。
【０１０７】
また、１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、波長５８５ｎｍにおける吸光度が１．４８ＯＤとなるように、抗ＣＲＰ抗体固定化粒子懸濁液と混和した後、ＥＤＴＡ二ナトリウムを０．５ｍＭ、又は５ｍＭとなるように添加し、ＣＲＰ測定用試薬とした。また、ＥＤＴＡ二ナトリウムを添加しないものを比較例とした。
【０１０８】
（２）検量線入力済み磁気カードの作成
前記（１）で調製したＣＲＰ測定用試薬の２．１ｍＬをセルに分注し、これを分光光度計内にセットして３７℃にて１５分間加温した。
このセルにＣＲＰ濃度０．３〜１５ｍｇ／ｄＬのリコンビナントＣＲＰ溶液７種類を、各３０μＬ加えて測定を開始した。
波長５８５ｎｍにおける試料添加７秒後の吸光度（ＯＤ７）と試料添加３０秒後の吸光度（ＯＤ３０）を求めた。
そして吸光度の差（ＯＤ３０−ＯＤ７）を求めた。
【０１０９】
以上の操作を５回繰り返して行い、吸光度の差の平均値を求めた。
吸光度の差をＸとし、試料中のＣＲＰ濃度をＹとして検量線を作成し、この検量線を磁気カードに磁気カード書き込み装置を用いて書き込んだ。
【０１１０】
（３）試料の調製
ＣＲＰ濃度未知の血清３種類にＥＤＴＡ二ナトリウムを各々１又は２ｍｇ／ｍＬとなるように添加したもの、及び、ＥＤＴＡ二ナトリウムを添加しないものをＣＲＰ測定用の試料として調製した。
【０１１１】
（４）試料中のＣＲＰの測定
前記（１）で調製したＣＲＰ測定用試薬を用いて試料中のＣＲＰを測定した。
ＣＲＰの測定は、クイックターボＩＩ（シノテスト社）にて行った。
【０１１２】
まず、前記（２）で作成した磁気カードを用いて検量線を入力した。
【０１１３】
次に、前記（１）で調製したＣＲＰ測定用試薬７００μＬずつを円筒状の攪拌子を含む光路長７ｍｍのキュベットに分注し、これをクイックターボＩＩの恒温漕（３７℃）にて１５分間加温した。
【０１１４】
このキュベットを測定部にセットし前記（３）で調製した試料１０μＬを加えて測定を開始した。
【０１１５】
波長５８５ｎｍにおける試料添加７秒後の吸光度（ＯＤ７）と試料添加３０秒後の吸光度（ＯＤ３０）を求めた。そして吸光度の差（ＯＤ３０−ＯＤ７）を求め、あらかじめ磁気カードにより入力されている検量線によりＣＲＰ濃度を算出した。
【０１１６】
（５）測定結果
前記（４）において、試料中のＣＲＰの測定を行って得られた濃度を、表１に示した。
【０１１７】
【表１】

【０１１８】
（６）考察
表１より、比較例のＣＲＰ測定用試薬を使用した場合には、試料中のＥＤＴＡ濃度が１ｍｇ／ｍＬの場合は１．６〜１１．８％、２ｍｇ／ｍＬの場合は７．９〜１７．６％もＣＲＰ測定値が低下しており、試料中のＥＤＴＡの増加によってＣＲＰ測定値が低下してしまっていることが分かる。
【０１１９】
これに対して、本発明のＣＲＰ測定用試薬を使用した場合には、試料中のＥＤＴＡ濃度がいずれの濃度の場合も、ＣＲＰ測定値は殆ど低下しておらず、試料中のＥＤＴＡが増加してもＣＲＰを問題なく測定できていることが分かる。
【０１２０】
従って、本発明の測定方法及び測定試薬を使用すれば、試料中にＥＤＴＡ等の干渉物質が含まれていても、測定対象物質を正確に測定できることが確かめられた。
【０１２１】
また、ＣＲＰは、ＥＤＴＡ採血をすることが多い血算と同時に測定する機会が多いため、ＥＤＴＡによる測定値への影響が回避できれば、ＥＤＴＡ血漿でのＣＲＰ測定が可能になり、一度の採血で血算とＣＲＰの測定を行うことが期待される。
【０１２２】
〔参考例〕
従来のアルブミン測定試薬では、試料中の脂肪酸濃度が高濃度となるにつれ、アルブミン測定値に正の誤差が生じることを確かめた。
【０１２３】
（１）従来のアルブミン測定試薬の調製
従来のアルブミン測定試薬（ＢＣＰ法）を調製した。
【０１２４】
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ５．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１２５】
トライトンＸ−１０００．１５％
コハク酸（緩衝剤）１２５ｍＭ
【０１２６】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ５．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１２７】
ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）０．３ｍＭ
トライトンＸ−１０００．１５％
コハク酸（緩衝剤）１２５ｍＭ
【０１２８】
（２）試料の調製
ヒト血清にオレイン酸ナトリウムを添加し、脂肪酸を高濃度含むヒト血清試料を調製した。
【０１２９】
まず、１種類のヒト血清を用意した。
【０１３０】
また、２ｍＭのオレイン酸ナトリウム水溶液を調製し、これを純水で５段階に希釈した。（１／５、２／５、３／５、４／５及び５／５）
【０１３１】
次に、これらを各々、前記のヒト血清と１：９の比率で混合した。
また別に、純水と前記のヒト血清とを１：９の比率で混合した。
これにより、ヒト血清に脂肪酸であるオレイン酸ナトリウムを添加した（又は添加しない）６種類の試料を調製した。（これらの６種類の試料のアルブミン濃度はいずれも同濃度である。）
【０１３２】
これらの各試料の脂肪酸濃度を遊離脂肪酸測定試薬「ラボサットＮＥＦＡ」（シノテスト社）で測定したところ、次の通りであった。
〔因みに、ヒト血清中での脂肪酸（遊離脂肪酸）の濃度の基準範囲は、１４０〜８５０μＥｑ／Ｌ（酵素法）である。（金井編著「臨床検査法提要改訂第３１版」，第５６３頁，金原出版社，平成１０年９月２０日発行）〕
【０１３３】
試料Ａ：オレイン酸ナトリウム・無添加（５８２μＥｑ／Ｌ）
試料Ｂ：オレイン酸ナトリウム・１／５（１，００９μＥｑ／Ｌ）
試料Ｃ：オレイン酸ナトリウム・２／５（１，３８５μＥｑ／Ｌ）
試料Ｄ：オレイン酸ナトリウム・３／５（１，７６９μＥｑ／Ｌ）
試料Ｅ：オレイン酸ナトリウム・４／５（２，１８９μＥｑ／Ｌ）
試料Ｆ：オレイン酸ナトリウム・５／５（２，５７８μＥｑ／Ｌ）
【０１３４】
（３）試料中のアルブミンの測定
前記（２）で調製した６種類の試料のそれぞれについて、前記（１）で調製した従来のアルブミン測定の第１試薬及び第２試薬を用い、アルブミンの測定を行った。
【０１３５】
この測定は７１７０Ｓ形自動分析装置（日立製作所社）を使用して行い、前記（２）で調製した試料の３μＬに、前記（１）の▲１▼で調製した第１試薬１８０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記（１）の▲２▼で調製した第２試薬６０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
第２試薬添加直前と添加５分後の主波長６００ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
【０１３６】
この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。
なお、純水を試料として、上記の通りに測定を行い、得られた吸光度を試薬盲検値として、前記の測定で得られた吸光度より差し引いた。
以上の測定を、前記（２）で調製した各試料について行った。
【０１３７】
（４）測定結果
前記（３）において、従来のアルブミン測定試薬により試料中のアルブミンの測定を行って得られた吸光度値を表２に示した。
【０１３８】
【表２】

【０１３９】
なお、この表における括弧内の数値は、オレイン酸ナトリウムを添加しない試料（脂肪酸濃度５８２μＥｑ／Ｌ）の測定値（吸光度値）を１００％としたときの、各試料の測定値の相対比率を表す。
【０１４０】
（５）考察
この表より、ヒト血清試料中の脂肪酸濃度が高くなるにつれ、アルブミン測定により得られる測定値（吸光度値）が上昇していることが分かる。
これにより、従来のアルブミン測定試薬による測定では、試料中に含まれる脂肪酸は干渉物質として働き、試料中の脂肪酸濃度が高い場合には測定に正の誤差が生じてしまい、正確なアルブミン測定値が得られないことが確かめられた。
【０１４１】
〔実施例２〕
干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させたアルブミン測定試薬を用いて、試料中のアルブミンの測定を行い、干渉作用抑制の効果を確かめた。
【０１４２】
（１）アルブミン測定試薬の調製
〔１〕本発明のアルブミン測定試薬の調製
本発明のアルブミン測定試薬（ＢＣＰ法）を調製した。
【０１４３】
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ５．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４４】
脂肪酸０．５ｍＭ
（ａ）カプリン酸ナトリウム
（ｂ）ラウリン酸ナトリウム
（ｃ）オレイン酸ナトリウム又は
（ｄ）リノール酸ナトリウム
【０１４５】
トライトンＸ−１０００．１５％
コハク酸（緩衝剤）１２５ｍＭ
【０１４６】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨ５．５（２０℃）の試薬を調製した。
【０１４７】
ブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）０．３ｍＭ
トライトンＸ−１０００．１５％
コハク酸（緩衝剤）１２５ｍＭ
【０１４８】
〔２〕従来のアルブミン測定試薬の調製
従来のアルブミン測定試薬（ＢＣＰ法）を調製した。
【０１４９】
▲１▼ 第１試薬の調製
前記参考例の（１）の▲１▼の記載の通りに調製を行い、従来のアルブミン測定試薬の第１試薬を調製した。
【０１５０】
▲２▼ 第２試薬の調製
前記参考例の（１）の▲２▼の記載の通りに調製を行い、従来のアルブミン測定試薬の第２試薬を調製した。
【０１５１】
（２）試料
１２種類のヒト血清を用意し、試料とした。
これらの各試料の脂肪酸濃度を遊離脂肪酸測定試薬「ラボサットＮＥＦＡ」（シノテスト社）で測定したところ、次の通りであった。
【０１５２】
試料１：４５７μＥｑ／Ｌ
試料２：４８３μＥｑ／Ｌ
試料３：５６９μＥｑ／Ｌ
試料４：６４４μＥｑ／Ｌ
試料５：６７０μＥｑ／Ｌ
試料６：７３４μＥｑ／Ｌ
試料７：７９３μＥｑ／Ｌ
試料８：１，８５９μＥｑ／Ｌ
試料９：２，０６８μＥｑ／Ｌ
試料１０：２，６８７μＥｑ／Ｌ
試料１１：３，３１２μＥｑ／Ｌ
試料１２：３，３８５μＥｑ／Ｌ
【０１５３】
（３）試料中のアルブミンの測定
前記（２）の１２種類の試料のそれぞれについて、前記（１）で調製した本発明及び従来のアルブミン測定の第１試薬並びに第２試薬を用い、アルブミンの測定を行った。
【０１５４】
この測定は７１７０Ｓ形自動分析装置（日立製作所社）を使用して行い、前記（２）で調製した試料の３μＬに、前記（１）の〔１〕の▲１▼で調製した本発明のアルブミン測定試薬の第１試薬１８０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記（１）の〔１〕の▲２▼で調製した本発明のアルブミン測定試薬の第２試薬６０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
第２試薬添加直前と添加５分後の主波長６００ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
【０１５５】
この測定を連続して２回繰り返して行い、その平均値を求めた。
なお、純水を試料として、上記の通りに測定を行い、得られた吸光度を試薬盲検値として、前記の測定で得られた吸光度より差し引いた。
【０１５６】
そして、アルブミン濃度が既知の試料（標準物質）について、前記の通り測定を行い、この濃度既知の試料の測定値（吸光度値）と前記試料の測定値（吸光度値）とを比較し比例計算することにより、前記の試料中のアルブミン濃度を求めた。〔試料中のアルブミン濃度＝（試料測定時の吸光度値÷標準物質測定時の吸光度値）×標準物質中のアルブミン濃度〕
【０１５７】
以上の測定を、前記（２）で調製した各試料について行った。
また、前記（１）の〔２〕の▲１▼で調製した従来のアルブミン測定試薬の第１試薬、及び前記（１）の〔２〕の▲２▼で調製した従来のアルブミン測定試薬の第２試薬を用いて、上記の通りに測定を行った。
【０１５８】
（４）測定結果
前記（３）において、本発明及び従来のアルブミン測定試薬により試料中のアルブミンの測定を行って得られた測定値（アルブミン濃度）を表３に示した。
【０１５９】
【表３】

【０１６０】
なお、この表における括弧内の数値は、カプリン酸ナトリウムを含有させたアルブミン測定試薬の第１試薬を用いて測定を行った場合の測定値（アルブミン濃度）を１００％としたときの、各測定値（アルブミン濃度）の相対比率を表す。
【０１６１】
（５）考察
この表より、試料中のアルブミン測定時の干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させた本発明のアルブミン測定試薬を用いて測定を行った場合に比べ、脂肪酸を含有させない従来のアルブミン測定試薬を用いて測定を行った場合は、試料中の脂肪酸濃度が高い試料においては、得られる測定値（アルブミン濃度）が高くなってしまっていることが分かる。
すなわち、従来のアルブミン測定試薬による測定では、試料中の脂肪酸濃度が高くなるにつれ正の誤差を受けるようになることが分かる。
【０１６２】
これに対して、干渉物質と同じ機能を有する物質である脂肪酸を含有させた本発明のアルブミン測定試薬による測定では、この脂肪酸がカプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、又はリノール酸ナトリウムのいずれの場合においても、試料に含まれる干渉物質（脂肪酸）の干渉作用を抑制し、測定値に誤差が生じるのを防ぎ、そして正確な測定対象物質の測定値が得られることが確かめられた。
【０１６３】
【発明の効果】
本発明の試料中の測定対象物質の測定方法及び測定試薬、並びに試料中に含まれる干渉物質による影響の回避方法では、試料中に含まれる干渉物質と同じ機能を有する物質を存在させて測定を行い、又は測定試薬に含有させることにより、干渉物質による影響を回避し、正確な測定値を得ることができるという効果を有するものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention uses an interfering substance contained in a sample when measuring a substance to be measured in the sample.Avoid impactAnd a measuring reagent and a measuring reagent for the substance to be measured, capable of obtaining an accurate measured value, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleAbout.
Main departureClearlyTherefore, for example, even when a metal chelating agent is contained in a sample, C-reactive protein can be accurately measured without error.
[0002]
The present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, immunology, and medicine, the field of chemistry such as analytical chemistry, the field of food hygiene, and the field of environmental health.
[0003]
[Prior art]
Measurement of substances to be measured contained in samples such as blood and urine is very useful in diagnosing diseases. In clinical tests, for example, an enzymatic measurement method using an enzyme reaction, antigen and antibody An immunological measurement method using an antigen-antibody reaction between them, a method for measuring the generation of a signal when a specific substance is bound to a measurement target substance, and the like have become widespread, and various measurement methods have been developed.
[0004]
For example, in the immunological measurement method, by measuring the presence or absence of binding between a measurement target substance contained in a sample and a specific binding substance that specifically binds to the measurement target substance, Measurement of the presence or absence of a measurement target substance contained in a sample [qualitative measurement] or measurement of its content (concentration) [quantitative measurement] is performed.
In this immunological measurement method, in particular, a turbidimetric measurement reagent containing an antibody against a measurement target substance is brought into contact with a sample containing the measurement target substance, and generated by an antigen-antibody reaction between the antibody against the measurement target substance and the measurement target substance. An immunoturbidimetric method (TIA) that quantifies the measurement target substance in a sample by measuring the turbidity generated by the aggregate of the measurement target substance and the antibody is frequently used.
[0005]
In addition, a turbidimetric measurement reagent containing an antibody or antigen for a measurement target substance immobilized on a carrier (latex particles or the like) is brought into contact with a sample containing the measurement target substance, and the measurement target substance immobilized on the carrier By measuring the turbidity produced by the aggregate of “[carrier = antibody or antigen against the substance to be measured]-[measuring substance]” produced by the antigen-antibody reaction between the antibody or antigen against the substance and the substance to be measured, A turbidimetric method (in the case where the carrier is latex particles, “latex immunoturbidimetric method”) that quantifies the substance to be measured is also frequently used.
These quantitative measurements are used for quantification of C-reactive protein (hereinafter sometimes abbreviated as CRP), immunoglobulin, complement components, and the like.
[0006]
In addition, for example, in the enzymatic measurement method, a signal is generated by a catalytic reaction with an enzyme using a measurement target substance contained in a sample as a substrate, and optionally further, and the presence or absence of the generated signal or the signal By measuring the amount, the presence or absence of a measurement target substance contained in the sample is measured [qualitative measurement], or the content (concentration) thereof is measured [quantitative measurement].
[0007]
In addition, when the substance to be measured contained in the sample is an enzyme, a substance that is a substrate for this enzyme is brought into contact with it, and a signal is generated by a catalytic reaction with the enzyme and possibly further reaction. Enzymatic measurement methods that measure the presence or absence of a measurement target substance contained in a sample [qualitative measurement] or measure its content (concentration) [quantitative measurement] by measuring the presence or absence of a signal or the amount of signal It is.
[0008]
Examples include glucose measurement methods using hexokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, and alkaline phosphatase activity measurement methods using 4-nitrophenyl phosphate as a substrate.
[0009]
Furthermore, for example, a method for measuring the generation of a signal when a specific substance is bound to a measurement target substance is a substance that generates a signal when bound to the measurement target substance in the measurement target substance contained in the sample. And measuring the presence or absence of a signal to be measured contained in a sample (qualitative measurement) by measuring the presence or absence of a signal or the amount of signal generated by contact and binding between the measurement target substance and the signal generating substance, Alternatively, the content (concentration) is measured [quantitative measurement].
[0010]
As an example, a divalent copper ion is brought into contact with a protein as a measurement target substance under alkalinity, and a purple-colored color is generated by forming a complex of a peptide bond and a copper ion in the protein, and this is measured. The burette method can be mentioned. Further, as an example, a method of measuring a change in color tone by bringing a dye (such as bromocresol purple (BCP) or bromocresol green (BCG)) into contact with albumin which is a measurement target substance and binding the dye to albumin is exemplified. be able to.
[0011]
In these measurement methods, it is known that when an interfering substance is present in the measurement reaction solution, the interfering substance affects the measurement value of the measurement target substance, and accurate measurement may not be performed.
[0012]
For example, in the measurement of CRP in a sample, the presence of interfering substances such as EDTA in the sample affects the CRP measurement value, making it impossible to perform accurate measurement.
[0013]
This CRP is a protein that exhibits a precipitation reaction with the C polysaccharide of Streptococcus pneumoniae, and the presence of CRP in a sample such as serum indicates that the patient is suffering from an infectious disease or inflammation in the body. It becomes proof of being.
For this reason, CRP is used as a marker of various inflammations for the diagnosis of diseases such as infectious diseases or inflammation.
This CRP measurement method includes a method for observing a specific reaction with a C polysaccharide, an anti-human CRP antibody as a reagent, and an antigen-antibody reaction between a CRP in a sample and an anti-CRP antibody in a reagent. Examples thereof include a method for producing a complex.
At present, capillary methods, immunoturbidimetric methods, latex immunoturbidimetric methods, and the like, which are methods for producing antigen-antibody complexes with anti-CRP antibodies, are widely used in daily examinations.
However, when CRP is measured using this anti-CRP antibody, if a metal chelating agent such as EDTA is present in the sample, the measured value will be lower than when it is not present, and CRP may not be measured accurately. there were.
[0014]
CRP is a calcium ion (Ca²⁺) And a binding site with Ca²⁺It has been found that CRP bound to phenotype changes a part of its three-dimensional structure (antigenicity) (see, for example, Non-Patent Document 1).
[0015]
[Non-Patent Document 1]
"Clinical Pathology", Vol. 32, No. 2, pp. 223-224, published in 1984
[0016]
For example, when an animal is inoculated with CRP to obtain an antiserum, the CRP becomes Ca in the animal's blood.²⁺To form Ca-bound CRP, and an antibody against this Ca-bound CRP is produced.
It is known that many of these antibodies can react with both Ca-bound CRP and non-Ca-bound CRP, but the remaining part cannot react with Ca-unbound CRP.
Here, when CRP in a sample is measured using the obtained antibody, if EDTA is present in the sample, the measured value is reduced compared to the case where EDTA is not present (negative influence). There was a problem.
This is because Ca bound to the Ca-binding CRP in the sample.²⁺This is considered to be due to binding of EDTA to Ca non-binding CRP, which changes the antigenicity of CRP and makes it impossible for some of the antibodies to react.
[0017]
In addition, the measurement of albumin in samples such as serum is regarded as important as an indicator of abnormal protein metabolism in the body.
In the measurement of albumin, conventionally, the BCG method using bromcresol green (BCG) as a dye that changes the color tone by binding to albumin has often been used.
However, this BCG method has a problem that it measures not only albumin but also globulin.
[0018]
As the inventors proceeded to study the BCP method using bromcresol purple (BCP) as a dye that changes the color tone by binding to albumin without measuring globulin, it has not been known so far. I realized that.
That is, as the fatty acid concentration in the sample increased, it was noticed that a positive error occurred in the measured albumin value in the sample.
That is, when measuring albumin in a sample by the BCP method, the fatty acid contained in the sample becomes an interfering substance, interferes with the measurement reaction in the BCP method, and causes a positive error (positive influence) in the albumin measurement value. is there.
[0019]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide means capable of avoiding the influence of interference substances contained in a sample on measurement values, which is observed in conventional measurement of a measurement target substance in a sample, and performing accurate measurement. It is.
[0020]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that the presence of a substance having the same function as the interference substance in the measurement reaction solution can avoid the influence of this interference substance. The present invention has been completed.
[0021]
That is, the present invention is based on the interference substance contained in the sample when the measurement target substance in the sample is measured.Avoid impact and make accurate measurementsTherefore, the measurement is performed in the presence of a substance having the same function as the interference substance during the measurement reaction.No,Obtain the content (concentration) of the target substance by proportional calculation of the measured value of the target substance in the sample and the measured value of the standard substance with a known concentration.This is a method for measuring a substance to be measured in a sample.
[0022]
The present invention also provides a measurement reagent for a substance to be measured in a sample, which contains a substance having the same function as an interfering substance contained in the sample.The content (concentration) of the measurement target substance is obtained by proportional calculation of the measurement value of the measurement target substance in the sample and the measurement value of the standard substance with a known concentration.It is a measurement reagent for a substance to be measured in a sample.
Furthermore, the present invention performs measurement in the presence of a substance having the same function as the interference substance contained in the sample during the measurement reaction of the substance to be measured in the sample, and the measured value and known concentration of the substance to be measured in the sample are measured. In this method, the content (concentration) of the substance to be measured is obtained by proportional calculation with the measured value of the standard substance, and the influence of the interference substance contained in the sample is avoided.
[0023]
In the measurement method and measurement reagent of the measurement target substance in the sample of the present invention, and the method of avoiding the influence of the interference substance contained in the sample, the measured value of the measurement target substance in the sample and the standard substance of known concentration When calculating the content (concentration) of the measurement target substance by proportional calculation with the measurement value, the absorbance value at the time of sample measurement as the measurement value of the measurement target substance in the sample, and the standard substance measurement as the measurement value of the standard substance of known concentration The hourly absorbance values can be mentioned respectively.
And the measuring method and measuring reagent of the substance to be measured in the sample of the present invention, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleIn this case, this interfering substance can be cited as a substance having the same function as the interfering substance.
[0024]
Furthermore, a measuring method and measuring reagent for a substance to be measured in the sample of the present invention, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleIn the method, the measurement of a substance to be measured in a sample can be performed using an antigen-antibody reaction.
[0025]
Further, a measuring method and a measuring reagent for a substance to be measured in the sample of the present invention, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleIn the method, the measurement of the measurement target substance in the sample can be performed using an enzymatic reaction.
[0026]
Furthermore, a measuring method and measuring reagent for a substance to be measured in the sample of the present invention, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleIn the method, the measurement of the substance to be measured in the sample may be one that measures the generation of a signal when a specific substance is bound to the substance to be measured.
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
1. Interfering substances
In the present invention, the interference substance refers to a substance that gives a positive or negative error to the measurement value of the measurement target substance due to the presence of the interference substance in the sample in the measurement of the measurement target substance in the sample. .
[0028]
Examples of such substances include metal chelating agents or fatty acids.
[0029]
In the present invention, it is particularly suitable when the interference substance is a metal chelating agent.
[0030]
Here, the metal chelating agent is an organic compound that is a multidentate ligand that coordinates to a metal ion and forms a cyclic structure (chelate ring) containing a metal by coordination to the metal ion.
For example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diaminocyclohexanetetraacetic acid (CyDTA), dihydroxyethylglycine (DHEG), diaminopropanoltetraacetic acid (DPTA-OH), diethylene (triamine) pentaacetic acid (DTPA), ethylenediaminediacetic acid (EDDA) , Ethylenediamine dipropionic acid (EDDP), ethylenediamine bismethylenephosphonic acid (EDDPO), hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid (EDTA-OH), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) (EDTPO), glycol etherdiaminetetraacetic acid (GEDTA), bis (Hydroxybenzyl) ethylenediaminediacetic acid (HBED), hexamethylenediaminetetraacetic acid (HDTA), hydroxyethyliminodiacetic acid (HIDA) Iminodiacetic acid (IDA), diaminopropanetetraacetic acid (Methyl-EDTA), nitrilotriacetic acid (NTA), nitrilotripropionic acid (NTP), nitrilotris (methylenephosphonic acid) (NTPO), triethylenetetramine hexaacetic acid (TTHA) ) Etc. or a salt thereof.
In addition, as said salt, a salt with alkali metals, such as sodium, potassium, or lithium, ammonium salt, hydrochloride, etc. can be mentioned.
[0031]
In the present invention, it is particularly suitable when the interference substance is a fatty acid.
[0032]
Here, the fatty acid refers to an aliphatic monocarboxylic acid, an aliphatic dicarboxylic acid, or a salt thereof.
[0033]
For example, saturated fatty acids such as butyric acid, caproic acid, caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid or lignoceric acid, or salts thereof, or decenoic acid, palmitoolein Examples thereof include unsaturated fatty acids such as acid, oleic acid, erucic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid or eicosapentaenoic acid, or salts thereof.
Examples of the salt include a salt with an alkali metal such as sodium, potassium or lithium, or a salt with an alkaline earth metal such as calcium or magnesium.
[0034]
2. Substances that have the same function as interfering substances
In the present invention, in the measurement of the substance to be measured in the sample, a substance having the same function as the interfering substance contained in the sample is contained or present.
Here, the substance having the same function as the interfering substance means the same substance as the interfering substance, or a substance that causes the same action although part or all of the structure is different.
[0035]
For example, when the interfering substance is ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), which is a kind of metal chelating agent, EDTA itself or another metal chelating agent having the same function as EDTA is included in the measurement reagent or present at the time of measurement. You can do it.
[0036]
In the present invention, when a metal chelating agent is contained or present as a substance having the same function as the interference substance contained in the sample, it is preferable to contain or present EDTA or a salt thereof. This is because EDTA is a hexadentate ligand and can be stably bonded to various metal ions, and since it is a very general metal chelating agent, it is easily available and economical.
[0037]
In addition, for example, when the interference substance is a fatty acid, one or more of the above fatty acids (free fatty acid or fatty acid salt) may be contained in the measurement reagent or may be present at the time of measurement.
[0038]
In the present invention, as a substance having the same function as an interfering substance contained in a sample, when a fatty acid is contained or present as described above, a fatty acid having an aliphatic chain having 10 or more carbon atoms (free fatty acid or A fatty acid salt) is preferably contained or present. Of these, capric acid, lauric acid, oleic acid, linoleic acid, or salts thereof are more preferably contained or present due to their solubility. For the same reason, it is particularly preferable that capric acid or a salt thereof is contained or present.
[0039]
Moreover, as a method of using a substance having the same function as the interference substance in the present invention, for example, a substance having the same function as the interference substance contained in a buffer solution or the like is used.Before measuring the target substancePre-contact with the sampleWhoThe law can be mentioned.
Alternatively, a substance having the same function as the interference substance of the present invention is contained in the measurement reagent, and the measurement reaction is performed by bringing the measurement reagent into contact with the sample. The method of coexisting the substance which has the same function as a substance can be mentioned.
Or the method etc. which combined these two methods can be mentioned.
[0040]
Furthermore, in the present invention, the concentration of the substance having the same function as the interference substance differs depending on the mixing ratio of the measurement reagent and the sample, the action mechanism of the interference substance, etc.Avoiding the effects of interfering substances in the sampleIt is sufficient to set a concentration sufficient for the purpose.
[0041]
For example, when a metal chelating agent is used as the substance having the same function as the interference substance, the lower limit concentration in the final reaction solution is preferably 0.001 mM or more, more preferably 0.01 mM or more, and 0.1 mM or more. Particularly preferred. The upper limit concentration is not limited as long as it does not affect the measurement reaction. However, from the viewpoint of cost, 500 mM or less is preferable, 100 mM or less is more preferable, and 50 mM or less is particularly preferable.
[0042]
For example, when using fatty acid as a substance having the same function as the interference substance, the lower limit concentration in the final reaction solution is preferably 0.01 mM or more, more preferably 0.1 mM or more, and 0.2 mM or more. Particularly preferred. The upper limit concentration is not limited as long as it does not affect the measurement reaction. However, from the viewpoint of cost, it is preferably 50 mM or less, more preferably 10 mM or less, and particularly preferably 5 mM or less.
[0043]
3. Substance to be measured
In the present invention, the substance to be measured is a substance whose presence or presence in the sample or the content (concentration) is to be measured, and the measurement value is particularly affected by the interference substance. Not limited.
Examples of the substance to be measured include organic substances such as proteins, carbohydrates, lipids, nucleic acids and the like, or inorganic substances such as metals.
[0044]
In the present invention, examples of the substance to be measured include a substance that changes its antigenicity by binding to a metal ion.
Here, the change in antigenicity specifically means that the metal ion binds to or desorbs from the metal binding site of the substance to be measured, thereby changing the environment such as the three-dimensional structure or charge of the antibody binding site. This means that the binding to the antibody changes.
[0045]
And as a metal ion, for example, calcium ion (Ca²⁺), Magnesium ion (Mg²⁺), Sodium ion (Na⁺), Potassium ion (K⁺), Iron ions (Fe²⁺), Copper ions (Cu²⁺), Zinc ion (Zn²⁺) Or nickel ions (Ni²⁺And the like.
[0046]
Examples of the substance whose antigenicity is changed by binding to this metal ion include C-reactive protein, troponin, calmodulin, lactoferrin, deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA), metallothionein and the like.
[0047]
In the present invention, a C-reactive protein can be exemplified as the substance to be measured.
[0048]
In the present invention, examples of the substance to be measured include proteins such as albumin or total protein, peptides, and the like. In particular, albumin can be mentioned as a substance to be measured.
[0049]
4). sample
In the present invention, the sample refers to a sample in which the above-mentioned measurement target substance may exist and the presence / absence of the measurement target substance or the content (concentration) is to be measured.
For example, human or animal blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, sweat, tears, ascites, amniotic fluid, or other body fluids; human or animal brain or other organs, hair, skin, nails, muscles, or Extracts or suspensions of stool from human or animals; extracts of cells or cells; extracts of plants; extracts of plants; foods such as grains, vegetables, fruits, seafood, meat or processed foods; Examples include beverages such as water, tea, coffee, milk, or fruit juice; reagents or pharmaceuticals; and samples for environmental analysis such as drinking water, river water, lake water, seawater, or soil suspensions.
[0050]
5). Measuring method
The method for measuring a substance to be measured in a sample according to the present invention uses an interfering substance contained in the sample when measuring the substance to be measured in the sample.Avoid impactTherefore, the measurement is performed in the presence of a substance having the same function as the interference substance during the measurement reaction.
[0051]
Examples of the measurement method of the measurement target substance in the sample in the present invention include an enzymatic measurement method using an enzyme reaction, an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction between an antigen and an antibody, and a measurement target substance. Examples include a measurement method for measuring the generation of a signal when a specific substance is bound.
[0052]
The method for measuring a substance to be measured in a sample of the present invention is suitable for an immunological measurement method using an antigen-antibody reaction.
Examples of the immunological measurement method include latex immunoturbidimetry; indirect aggregation reaction measurement method such as latex agglutination measurement method; enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, or luminescence immunoassay Immunoassay using a labeling substance such as labeled immunoassay; Western blotting; ELSA method (enzyme-linked ligand assay) shown by Dahlbeack et al. [Thromb. Haemost. 79, 767-772, 1998, and WO 98/23963]; immunochromatography method; or specific to the test substance described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132819 Using a carrier having a surface on which a specific binding substance is immobilized and coated, and particles having a specific binding substance immobilized on the test substance, and the particles are coated with a specific binding substance immobilized on the test substance on the carrier. A method of performing measurement depending on whether or not they gather on the surface can be mentioned.
[0053]
In the labeled immunoassay, the present invention can be applied to any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method).
In addition, this measurement may be performed by a method, or may be performed using an apparatus such as an analyzer. In addition, this measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method) or by a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
[0054]
In the method for measuring a substance to be measured in a sample of the present invention, a method for causing a substance having the same function as an interfering substance to exist during a measurement reaction is described in “2. Substance having the same function as an interfering substance”. It can be used by appropriately selecting from the existing methods.
[0055]
For example, when measuring CRP using latex immunoturbidimetry as a measurement principle, a substance having the same function as an interfering substance is used as a first reagent consisting of a buffer solution when measuring by a two-step method. Containing,Before making CRP measurementsPre-contact with the sampleTouchAlternatively, a substance having the same function as the interfering substance of the present invention may be contained in the second reagent in which latex particles to which the anti-CRP antibody or the like is immobilized are present, and the second reagent, the sample, and the second reagent A measurement reaction may be performed by bringing a mixture of one reagent into contact, and a substance having the same function as the interference substance of the present invention may coexist during the measurement reaction of CRP in a sample. Alternatively, these two methods may be used in combination.
[0056]
When a measurement method using a carrier is used as the measurement method, the type and shape of the carrier are not particularly limited, and are typically used in immunological measurement methods, immunological measurement reagents, etc. as described below, for example. The support | carrier currently used can be mentioned.
[0057]
Examples of the carrier include latex particles used in latex immunoturbidimetry, particles usable in latex immunoturbidimetry, and the like.
Examples of such latex particles include polystyrene / latex particles, styrene / styrene sulfonate copolymer / latex particles, acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer / latex particles, vinyl chloride / acrylate copolymer / Latex particles, vinyl acetate-acrylic acid copolymer / latex particles, polyacrolein / latex particles, styrene-methacrylic acid copolymer / latex particles, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer / latex particles, heavy methacrylate Examples thereof include latex particles in which synthetic polymer particles such as coalescence / latex particles or acrylic acid polymer / latex particles are uniformly suspended.
[0058]
Further, as the carrier, for example, particles used in indirect agglutination reaction measurement methods such as particle agglutination reaction measurement method using latex particles or latex agglutination reaction measurement method, or can be used in this indirect agglutination reaction measurement method Examples thereof include particles.
Examples of such particles include particles made of an organic polymer material such as polystyrene, liposome, latex, gelatin, polyacrylamide, microcapsule or emulsion, and particles made of an inorganic polymer material such as glass, silica gel, carbon or bentonite. Or other artificial carriers can be mentioned.
Further, as the particles, particles colored by coating a dye or by dispersing or encapsulating the dye in the particles may be used.
[0059]
There is no particular limitation on the particle size of the particles that are used or can be used in these indirect aggregation reaction measurement methods.
However, the particle diameter of these particles is preferably in the range of 0.01 to 100 μm and more preferably in the range of 0.1 to 10 μm.
Further, the specific gravity of these particles is preferably in the range of 1 to 10, more preferably in the range of 1 to 2.
[0060]
Examples of the carrier include a container used for the indirect agglutination reaction measurement method or a container that can be used for the indirect agglutination reaction measurement method.
Examples of such containers include test tubes, microplates (microtiter plates) or trays made of glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, or the like.
In addition, it is preferable that the bottom surface of the solution storage portion (such as a well of a microplate) of the container has an inclined shape from the center to the periphery of the bottom surface such as a U shape, a V shape, or a UV shape.
[0061]
Further, as the carrier, for example, an immunoassay using a labeling substance such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay, that is, a carrier used in a labeled immunoassay, Or the support | carrier etc. which can be used for this labeled immunoassay can be mentioned.
Examples of such a carrier include materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, and glass. There may be mentioned particles, microcapsules, beads, microplates (microtiter plates), test tubes, sticks or test pieces.
[0062]
Further, as a carrier, for example, a surface on which a specific binding substance for a test substance (measuring substance) described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919 is immobilized and coated is used. And a carrier used in a measurement method using particles in which a specific binding substance to a test substance (substance to be measured) is immobilized, or a carrier that can be used in this measurement method, etc. .
Examples of such a carrier include non-water-absorbing materials such as polystyrene, glass, polyvinyl chloride, polyacrylate, polypropylene, nylon, polyethylene, polycarbonate, and polymethacrylate.
[0063]
Also, a magnetic carrier prepared by coating the above-described carrier with a ferromagnetic material or containing a ferromagnetic material at the time of carrier molding can be used.
[0064]
Furthermore, the method for measuring a substance to be measured in a sample of the present invention is suitable for a measurement method for measuring the generation of a signal when a specific substance is bound to the substance to be measured.
[0065]
In this measurement method, a measurement target substance contained in a sample is brought into contact with a substance that generates a signal when bound to the measurement target substance, and is generated by contacting and binding the measurement target substance and the signal generation substance. By measuring the presence / absence of the signal or the amount of signal, the presence / absence of the substance to be measured contained in the sample is measured [qualitative measurement], or the content (concentration) thereof is measured [quantitative measurement].
[0066]
In addition, the signal is generated by continuing other reactions in addition to the contact and binding between the measurement target substance and the substance that generates a signal when bound to the measurement target substance (signal generation substance). There may be.
[0067]
In addition, this signal is generated by contact and binding of the measurement target substance and a substance that generates a signal when bound to the measurement target substance (signal generation substance). This means that it is possible to detect that a signal (signal) in a target or other energy or the like is generated or changed.
[0068]
For example, the absorbance, transmittance, or fluorescence intensity may change due to contact and binding between the measurement target substance and the signal generating substance, or the light absorption curve may be changed. By measuring the amount of change in transmittance or fluorescence intensity or light absorption curve, the production of the signal can be measured.
[0069]
Examples of combinations of the measurement target substance and the signal generation substance are given below.
When the measurement target substance is albumin, examples of the signal generating substance include bromcresol purple (BCP) and bromcresol green (BCG).
[0070]
When bromcresol purple (BCP) is used, the color tone changes from yellow-green to blue-purple due to contact with and binding to albumin, so measurement of signal generation can be measured by measuring the increase in absorbance around 570-630 nm. Do.
[0071]
In addition, when bromcresol green (BCG) is used, the color tone changes from yellowish brown to blue-green color due to contact and binding with albumin. Measure.
[0072]
And when a measuring object substance is a total protein, a bivalent copper ion etc. can be mentioned as said signal production | generation substance.
When divalent copper ions are used, the increase in absorbance in the vicinity of 500 to 600 nm should be measured because the color tone changes from blue to red due to the contact and binding of protein peptide bonds and divalent copper ions. To measure signal generation.
[0073]
In the present invention, it is particularly suitable when the substance to be measured is albumin and the signal generating substance is bromcresol purple (BCP).
[0074]
In addition, this measuring method may be performed by a method, or may be performed using an apparatus such as an analyzer.
In addition, this measurement method may be performed by a one-step method (one-reagent method) or a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
[0075]
Further, in this measurement method, as a method for causing a substance having the same function as the interfering substance to exist during the measurement reaction, the method described in "2. Substance having the same function as the interfering substance" is appropriately selected and used. For example, in the case where albumin in a sample is measured by the BCP method, for example, the first reagent consisting of a buffer solution or the like contains a fatty acid that is a substance having the same function as the interference substance,Before performing the measurement reaction between albumin contained in the sample and BCP contained in the second reagentPre-contact with the sampleTouchIt may be allowed.
Alternatively, fatty acid, which is a substance having the same function as the interference substance of the present invention, is contained in the second reagent containing BCP, and the measurement reaction is performed by bringing the mixture of the second reagent, the sample and the first reagent into contact with each other. In addition, a substance having the same function as the interference substance of the present invention may be allowed to coexist during the measurement reaction of albumin in the sample.
Alternatively, these two methods may be combined, and both the first reagent and the second reagent may contain a fatty acid that is a substance having the same function as the interference substance of the present invention.
[0076]
6). Reagent
The measurement reagent for the substance to be measured in the sample of the present invention contains a substance having the same function as the interference substance contained in the sample.
[0077]
In the measurement reagent of the measurement target substance in the sample in the present invention, the measurement method as described in “5. Measurement method” is measured except that a substance having the same function as the interference substance contained in the sample is included. In principle, a method for measuring a signal generated by contacting and binding a substance that generates a signal when bound to an enzymatic measurement reagent, immunological measurement reagent, or measurement target substance to the measurement target substance in a sample. What is necessary is just a composition used in the measurement reagent etc. which are used in.
[0078]
The measurement reagent for the measurement target substance in the sample of the present invention is an immunological measurement reagent using an antigen-antibody reaction, or a substance that generates a signal when bound to the measurement target substance as the measurement target substance in the sample. It is suitable for a measurement reagent in a method for measuring a signal generated by contact, binding and formation.
[0079]
The measurement reagent of the present invention includes, for example, a buffer solution, a sample dilution solution, a reagent dilution solution, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or calibration (calibration). Reagents or the like containing substances to be performed may be included.
[0080]
In addition, when the measurement reagent in this invention is a liquid state, various aqueous solvents can be used as the solvent.
Examples of the aqueous solvent include purified water, physiological saline, or various buffer solutions such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline. .
About the pH of this buffer solution, an appropriate pH may be appropriately selected and used. Although there is no particular limitation, it is general to select and use a pH within the range of pH 3-12.
[0081]
When the present invention is carried out in an immunological measurement reagent, in addition to a carrier on which an antigen or antibody is immobilized, a protein such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof Various salts; various sugars; skim milk powder; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics; activating substances; reaction promoting substances; sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; nonspecific You may contain 1 type, or 2 or more types, such as a reaction inhibitory substance suitably.
And the density | concentration at the time of making these contain in a measuring reagent is although it does not specifically limit, 0.001-10% (w / v) is preferable, and 0.01-5% (w / v) is especially preferable. .
[0082]
Further, when the present invention is carried out in a measuring reagent other than an immunological measuring reagent, proteins of various types and concentrations that do not affect the measurement of the substance to be measured; various salts; various sugars; various preservatives such as antibiotics One or two or more of activator, reaction accelerator, stabilizer and the like may be appropriately contained.
And the density | concentration at the time of making these contain in a measuring reagent is although it does not specifically limit, 0.001-10% (w / v) is preferable, and 0.01-5% (w / v) is especially preferable. .
[0083]
[Action]
In the present invention, a measuring method and a measuring reagent for a substance to be measured in a sampleLeaveBy the presence or inclusion of a substance having the same function as the interference substance in the sample,Avoid impact and make accurate measurementsbe able to.
[0084]
This action mechanism will be described by taking as an example the case where the interference substance contained in the sample is EDTA and the measurement reagent containing EDTA is used to measure CRP in the sample.
[0085]
CRP in a biological sample is calcium ion (Ca²⁺) And Ca-binding CRP.
When EDTA (interfering substance) was mixed in this sample, Ca bound to Ca-bound CRP²⁺Is bound to EDTA that has been mixed and lost, so Ca-bound CRP becomes Ca-unbound CRP (the antigenicity of CRP changes).
[0086]
When measuring CRP in a sample using a conventional CRP measurement reagent that does not contain EDTA (conventional measurement reagent), if the sample contains EDTA, the anti-CRP antibody in the measurement reagent Since some cannot react with Ca non-binding CRP, the absorbance obtained is lower than when the sample does not contain EDTA.
[0087]
Here, the measured value of CRP is obtained by a proportional calculation with the absorbance when a CRP standard substance having a known concentration is measured. [Measurement substance concentration in sample = (Absorbance value at the time of sample measurement ÷ Absorbance value at the time of measurement of standard substance) x Concentration of the measurement target substance in the standard substance]
Since CRP in the standard substance exists as Ca-bound CRP, when CRP in the standard substance is measured using a conventional measurement reagent, the anti-CRP antibody in the measurement reagent is all of the standard substance. Since it can react with CRP, there is no decrease in absorbance.
That is, the CRP measurement value in the sample containing EDTA, which is obtained by proportional calculation with the absorbance obtained by measuring the standard substance, is lower than the actual measurement value.
[0088]
In contrast, when CRP in this sample is measured using a measurement reagent containing EDTA (the measurement reagent of the present invention), the Ca binding in the sample is mixed at the stage where the sample and the measurement reagent are mixed. Ca bound to type CRP²⁺Ca binds to EDTA in the measurement reagent, so that Ca-bound CRP (which was included in the sample) is not Ca-bound, whether or not EDTA is included in the sample. CRP (CRP antigenicity changes).
[0089]
Here, when CRP in a sample is measured using the measurement reagent of the present invention, the Ca-bound CRP (contained in the sample) is a non-Ca-bound CRP, that is, the CRP is Since all of them are Ca non-binding CRP, the absorbance obtained is the same whether the sample contains EDTA or not. (It will also be a reduced value.)
[0090]
Furthermore, in the measurement of CRP standard substance at a known concentration, when this standard substance is mixed with the measurement reagent, Ca bound to the Ca-binding CRP in the standard substance.²⁺Will bind to EDTA in the measurement reagent, so all the Ca-bound CRP (contained in the standard solution) becomes Ca-unbound CRP, and the CRP in the standard substance is converted using the measurement reagent of the present invention. Also in the measurement, since a part of the anti-CRP antibody in the measurement reagent cannot react with the Ca non-binding CRP, the obtained absorbance is lowered.
[0091]
As described above, the CRP measurement value in the sample is obtained by proportional calculation with the absorbance obtained by measuring the standard substance. [Measurement substance concentration in sample = (Absorbance value at the time of sample measurement ÷ Absorbance value at the time of measurement of standard substance) x Concentration of the measurement target substance in the standard substance]
Therefore, when the measurement reagent of the present invention is used, the absorbance of the standard substance and the absorbance of CRP in the sample are reduced to the same extent. Therefore, the CRP concentration in the sample obtained by proportional calculation is The difference is canceled out to the original density (true value).
[0092]
From the above, there is no difference in the measured value (CRP concentration) between when the sample contains EDTA and when it does not contain EDTA.
That is, it can be said that the measurement method and the measurement reagent of the present invention are not affected by an interference substance such as EDTA. (The CRP contained in the standard substance and the CRP contained in the sample are all measured as non-Ca-bound type, and therefore the influence of EDTA contained in the sample does not occur.)
[0093]
Further, the case where the interference substance contained in the sample is fatty acid and albumin in the sample is measured using a measurement reagent containing fatty acid will be described as an example.
[0094]
As mentioned earlier, the inventors have noticed that as the fatty acid concentration in the sample increases, a positive error occurs in the measured albumin value in the sample.
[0095]
That is, when measuring albumin in a sample by the BCP method, if the concentration of fatty acid in the sample is a normal concentration, there is no error in the albumin measurement value, but if the fatty acid in the sample is high, It was found that a positive error occurred in the albumin measurement value depending on the concentration.
[0096]
That is, if a high concentration of fatty acid is present during the measurement reaction of albumin in the sample, the degree of increase in absorbance resulting from a change in color tone due to the binding of albumin and BCP will be higher than when there is no high concentration of fatty acid. A value higher than the original measured albumin value (albumin concentration) is obtained. That is, a positive error occurs in the measured value.
[0097]
When measuring albumin in a sample using a conventional albumin measurement reagent that does not contain fatty acids (conventional measurement reagent), if the sample contains a high concentration of fatty acid, it is obtained by measurement. The absorbance obtained is higher than when the sample does not contain fatty acids.
[0098]
Here, the measured value of albumin is obtained by proportional calculation with the absorbance when measuring an albumin standard substance with a known concentration. However, the fatty acid concentration in this standard substance is not usually high, so conventional measurement reagents are used. Thus, when albumin in a standard substance is measured, an increase in absorbance due to the fatty acid in the standard substance does not occur or is negligible.
[0099]
Therefore, the measured value of albumin in a sample containing fatty acid, which is obtained by proportional calculation with the absorbance obtained by measuring the standard substance, is higher than the original measured value.
[0100]
On the other hand, when albumin in this sample is measured using a measurement reagent containing fatty acid (measurement reagent of the present invention), a high concentration of fatty acid is contained in the sample, Even in the case where the sample does not contain a high concentration of fatty acid, the measurement reagent reacts with albumin and a dye (such as BCP) in the presence of a high concentration of fatty acid because the measurement reagent contains fatty acid. And the absorbance is measured.
[0101]
In other words, even when the sample does not contain a high concentration of fatty acid, the presence of the fatty acid contained in the measurement reagent causes the absorbance to be the same as when the sample contains a high concentration of fatty acid. This eliminates the difference due to the level of fatty acid in the sample.
[0102]
As described above, the measured value of albumin (albumin concentration) in the sample is obtained by proportional calculation with the absorbance obtained by measuring the standard substance. [Measurement substance concentration in sample = (Absorbance value at the time of sample measurement ÷ Absorbance value at the time of measurement of standard substance) x Concentration of the measurement target substance in the standard substance]
Therefore, when the measurement reagent of the present invention is used, the absorbance obtained by measuring the standard substance and the absorbance obtained by measuring the sample both increase due to the presence of the fatty acid. As for the albumin concentration in the sample, the increase in absorbance is offset and the original albumin concentration (true value) is obtained.
[0103]
From the above, there is no difference in the measured value (albumin concentration) between when the sample contains fatty acid and when it does not contain fatty acid.
That is, it can be said that the measurement method and the measurement reagent of the present invention are not affected by interference substances such as fatty acids contained in the sample.
[0104]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited by these Examples.
[0105]
[Example 1]
Using the CRP measurement reagent of the present invention, the effect of avoiding the influence of the interference substance was confirmed.
[0106]
(1) Preparation of CRP measurement reagent
6. A solution in which an anti-CRP goat polyclonal antibody is mixed with 4.5 mM borate buffer (pH 8.2) at a concentration of 1.4 g / dL in 10.4 mL of a 10% latex suspension having an average particle size of 0.1 μm. 36 mL was added and stirred at 5 ° C. overnight.
After removing the supernatant by centrifugation, 10 mM borate buffer solution (pH 8.2) containing 0.85% bovine serum albumin was added to the precipitate, suspended, and stirred at room temperature for 30 minutes.
The precipitate was collected by centrifugation, and then suspended in a 0.05% aqueous sodium azide solution so that the absorbance at a wavelength of 585 nm was 14.8 OD, to prepare an anti-CRP antibody-immobilized particle suspension.
[0107]
Also, a 50 mM Tris buffer solution (pH 7.0) containing 1 M sodium chloride was prepared, mixed with the anti-CRP antibody-immobilized particle suspension so that the absorbance at a wavelength of 585 nm was 1.48 OD, and then disodium EDTA. Was added to a concentration of 0.5 mM or 5 mM to obtain a CRP measurement reagent. Moreover, the thing which does not add EDTA disodium was made into the comparative example.
[0108]
(2) Creation of magnetic card with calibration curve input
2.1 mL of the CRP measurement reagent prepared in (1) above was dispensed into a cell, which was set in a spectrophotometer and heated at 37 ° C. for 15 minutes.
To this cell, 30 μL of each of 7 types of recombinant CRP solutions having a CRP concentration of 0.3 to 15 mg / dL was added, and measurement was started.
Absorbance (OD7) 7 seconds after addition of the sample at a wavelength of 585 nm and absorbance (OD30) 30 seconds after addition of the sample were determined.
And the difference (OD30-OD7) of the light absorbency was calculated | required.
[0109]
The above operation was repeated 5 times, and the average value of the difference in absorbance was obtained.
A calibration curve was created with the difference in absorbance as X and the CRP concentration in the sample as Y, and this calibration curve was written on the magnetic card using a magnetic card writing device.
[0110]
(3) Sample preparation
Samples for CRP measurement were prepared by adding EDTA disodium to 1 or 2 mg / mL each of three sera with unknown CRP concentrations and those not adding EDTA disodium.
[0111]
(4) Measurement of CRP in the sample
CRP in the sample was measured using the CRP measurement reagent prepared in (1) above.
CRP was measured with Quick Turbo II (Sinotest).
[0112]
First, a calibration curve was input using the magnetic card created in (2).
[0113]
Next, 700 μL each of the CRP measurement reagent prepared in the above (1) was dispensed into a cuvette having an optical path length of 7 mm containing a cylindrical stirrer, and this was placed in a constant temperature bath (37 ° C.) of Quick Turbo II for 15 minutes. Warmed up.
[0114]
The cuvette was set in the measurement section, and 10 μL of the sample prepared in (3) was added to start measurement.
[0115]
Absorbance (OD7) 7 seconds after addition of the sample at a wavelength of 585 nm and absorbance (OD30) 30 seconds after addition of the sample were determined. And the difference (OD30-OD7) of the light absorbency was calculated | required, and the CRP density | concentration was computed with the analytical curve input beforehand by the magnetic card | curd.
[0116]
(5) Measurement results
The concentrations obtained by measuring CRP in the sample in (4) are shown in Table 1.
[0117]
[Table 1]

[0118]
(6) Consideration
From Table 1, when the CRP measurement reagent of the comparative example was used, 1.6 to 11.8% when the EDTA concentration in the sample was 1 mg / mL, and 7.9 to 17 when 2 mg / mL. The CRP measurement value decreased by .6%, and it can be seen that the CRP measurement value decreased due to the increase of EDTA in the sample.
[0119]
On the other hand, when the CRP measurement reagent of the present invention is used, the CRP measurement value hardly decreases and the EDTA in the sample increases regardless of the EDTA concentration in the sample. However, it can be seen that CRP can be measured without problems.
[0120]
Therefore, it was confirmed that the measurement target substance can be accurately measured by using the measurement method and the reagent of the present invention even if the sample contains an interference substance such as EDTA.
[0121]
In addition, since CRP has many opportunities to measure EDTA blood at the same time as blood count, if the influence on the measured value by EDTA can be avoided, CRP measurement with EDTA plasma becomes possible, and blood can be collected with one blood sampling. It is expected to perform arithmetic and CRP measurements.
[0122]
[Reference example]
In the conventional albumin measurement reagent, it was confirmed that a positive error occurred in the albumin measurement value as the fatty acid concentration in the sample increased.
[0123]
(1) Preparation of conventional albumin measuring reagent
A conventional reagent for measuring albumin (BCP method) was prepared.
[0124]
(1) Preparation of first reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a reagent having a pH of 5.5 (20 ° C.).
[0125]
Triton X-100 0.15%
Succinic acid (buffering agent) 125 mM
[0126]
(2) Preparation of second reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a reagent having a pH of 5.5 (20 ° C.).
[0127]
Bromcresol purple (BCP) 0.3 mM
Triton X-100 0.15%
Succinic acid (buffering agent) 125 mM
[0128]
(2) Sample preparation
Sodium oleate was added to human serum to prepare a human serum sample containing a high concentration of fatty acid.
[0129]
First, one type of human serum was prepared.
[0130]
Moreover, 2 mM sodium oleate aqueous solution was prepared and this was diluted with the pure water in five steps. (1/5, 2/5, 3/5, 4/5 and 5/5)
[0131]
Each of these was then mixed with the human serum in a 1: 9 ratio.
Separately, pure water and the human serum were mixed at a ratio of 1: 9.
As a result, six types of samples in which sodium oleate, which is a fatty acid, was added (or not added) to human serum were prepared. (All of these six samples have the same albumin concentration.)
[0132]
When the fatty acid concentration of each of these samples was measured with a free fatty acid measurement reagent “Labsat NEFA” (Sinotest), it was as follows.
[Incidentally, the reference range of the concentration of fatty acid (free fatty acid) in human serum is 140 to 850 μEq / L (enzymatic method). (Edited by Kanai, “Procedure for Clinical Examination Revised 31st Edition”, page 563, published by Kanbara Publishing Company, September 20, 1998)]
[0133]
Sample A: Sodium oleate / no addition (582 μEq / L)
Sample B: Sodium Oleate 1/5 (1,009 μEq / L)
Sample C: Sodium oleate 2/5 (1,385 μEq / L)
Sample D: Sodium oleate 3/5 (1,769 μEq / L)
Sample E: Sodium oleate 4/5 (2,189 μEq / L)
Sample F: Sodium oleate 5/5 (2,578 μEq / L)
[0134]
(3) Measurement of albumin in the sample
For each of the six types of samples prepared in (2), albumin was measured using the conventional first and second reagents for albumin measurement prepared in (1).
[0135]
This measurement is performed using a 7170S type automatic analyzer (Hitachi Ltd.), and 180 μL of the first reagent prepared in (1) above is added to 3 μL of the sample prepared in (2) above. After mixing, the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and then added with 60 μL of the second reagent prepared in (2) of (1) above, and reacted at 37 ° C. for 5 minutes.
Absorbance at a main wavelength of 600 nm and a sub-wavelength of 660 nm immediately before the addition of the second reagent and 5 minutes after the addition was measured, and the difference was obtained.
[0136]
This measurement was repeated twice in succession, and the average value was obtained.
It should be noted that the measurement was performed as described above using pure water as a sample, and the obtained absorbance was subtracted from the absorbance obtained in the above measurement as a reagent blind value.
The above measurement was performed for each sample prepared in (2).
[0137]
(4) Measurement results
Table 2 shows the absorbance values obtained by measuring albumin in the sample with the conventional albumin measurement reagent in (3) above.
[0138]
[Table 2]

[0139]
In addition, the numerical value in the parenthesis in this table represents the relative ratio of the measured value of each sample when the measured value (absorbance value) of the sample not added with sodium oleate (fatty acid concentration 582 μEq / L) is 100%. .
[0140]
(5) Consideration
From this table, it can be seen that the measurement value (absorbance value) obtained by albumin measurement increases as the fatty acid concentration in the human serum sample increases.
As a result, in the measurement with the conventional albumin measurement reagent, the fatty acid contained in the sample acts as an interference substance, and when the fatty acid concentration in the sample is high, a positive error occurs in the measurement, and an accurate albumin measurement value is obtained. It was confirmed that it could not be obtained.
[0141]
[Example 2]
Using an albumin measuring reagent containing a fatty acid that is a substance having the same function as the interfering substance, albumin in the sample was measured to confirm the effect of suppressing the interference action.
[0142]
(1) Preparation of albumin measuring reagent
[1] Preparation of albumin measuring reagent of the present invention
The reagent for measuring albumin of the present invention (BCP method) was prepared.
[0143]
(1) Preparation of first reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a reagent having a pH of 5.5 (20 ° C.).
[0144]
Fatty acid 0.5 mM
(A) Sodium caprate
(B) Sodium laurate
(C) sodium oleate or
(D) Sodium linoleate
[0145]
Triton X-100 0.15%
Succinic acid (buffering agent) 125 mM
[0146]
(2) Preparation of second reagent
The following components were dissolved in pure water so as to have the stated concentrations, respectively, to prepare a reagent having a pH of 5.5 (20 ° C.).
[0147]
Bromcresol purple (BCP) 0.3 mM
Triton X-100 0.15%
Succinic acid (buffering agent) 125 mM
[0148]
[2] Preparation of conventional reagent for albumin measurement
A conventional reagent for measuring albumin (BCP method) was prepared.
[0149]
(1) Preparation of first reagent
Preparation was carried out as described in (1) of the reference example (1) to prepare a conventional first reagent for albumin measurement.
[0150]
(2) Preparation of second reagent
Preparation was carried out as described in (2) of (1) of the reference example to prepare a second reagent of the conventional albumin measuring reagent.
[0151]
(2) Sample
Twelve types of human serum were prepared and used as samples.
When the fatty acid concentration of each of these samples was measured with a free fatty acid measurement reagent “Labsat NEFA” (Sinotest), it was as follows.
[0152]
Sample 1: 457 μEq / L
Sample 2: 483 μEq / L
Sample 3: 569 μEq / L
Sample 4: 644 μEq / L
Sample 5: 670 μEq / L
Sample 6: 734 μEq / L
Sample 7: 793 μEq / L
Sample 8: 1,859 μEq / L
Sample 9: 2,068 μEq / L
Sample 10: 2,687 μEq / L
Sample 11: 3,312 μEq / L
Sample 12: 3,385 μEq / L
[0153]
(3) Measurement of albumin in the sample
For each of the 12 samples of (2), albumin was measured using the first reagent and the second reagent of the present invention and the conventional albumin measurement prepared in (1).
[0154]
This measurement is performed using a 7170S type automatic analyzer (Hitachi Ltd.), and 3 μL of the sample prepared in (2) above is added to the albumin of the present invention prepared in (1) (1) of (1) above. After adding 180 μL of the first reagent of the measurement reagent and reacting at 37 ° C. for 5 minutes after mixing, 60 μL of the second reagent of the albumin measurement reagent of the present invention prepared in (1)-(2) above (1) Was added and allowed to react at 37 ° C. for 5 minutes after mixing.
Absorbance at a main wavelength of 600 nm and a sub-wavelength of 660 nm immediately before the addition of the second reagent and 5 minutes after the addition was measured, and the difference was obtained.
[0155]
This measurement was repeated twice in succession, and the average value was obtained.
It should be noted that the measurement was performed as described above using pure water as a sample, and the obtained absorbance was subtracted from the absorbance obtained in the above measurement as a reagent blind value.
[0156]
Then, a sample (standard substance) with a known albumin concentration is measured as described above, and the measured value (absorbance value) of the sample with a known concentration is compared with the measured value (absorbance value) of the sample to perform proportional calculation. Thus, the albumin concentration in the sample was determined. [Concentration of albumin in sample = (absorbance value at the time of sample measurement ÷ absorbance value at the time of measurement of standard substance) × albumin concentration in the standard substance]
[0157]
The above measurement was performed for each sample prepared in (2).
In addition, the first reagent of the conventional albumin measuring reagent prepared in (1) of [1] in (1) and the first reagent of the conventional albumin measuring reagent prepared in (2) of [2] of (1). Measurement was performed as described above using two reagents.
[0158]
(4) Measurement results
Table 3 shows the measured values (albumin concentration) obtained by measuring albumin in the sample using the present invention and the conventional albumin measuring reagent in the above (3).
[0159]
[Table 3]

[0160]
The numerical values in parentheses in this table are the respective measurements when the measurement value (albumin concentration) measured using the first reagent of the albumin measurement reagent containing sodium caprate is 100%. Represents the relative ratio of values (albumin concentration).
[0161]
(5) Consideration
From this table, conventional albumin containing no fatty acid is compared with the case where measurement is performed using the albumin measuring reagent of the present invention containing fatty acid, which is a substance having the same function as an interference substance at the time of measuring albumin in a sample. When the measurement is performed using the measurement reagent, it is understood that the measured value (albumin concentration) obtained is high in the sample having a high fatty acid concentration in the sample.
That is, it can be seen that the conventional measurement with an albumin measurement reagent receives a positive error as the fatty acid concentration in the sample increases.
[0162]
On the other hand, in the measurement using the albumin measurement reagent of the present invention containing a fatty acid that is a substance having the same function as the interference substance, this fatty acid is sodium caprate, sodium laurate, sodium oleate, or sodium linoleate. In any case, it was confirmed that the interference action of the interference substance (fatty acid) contained in the sample was suppressed, the measurement value was prevented from causing an error, and an accurate measurement value of the measurement target substance was obtained.
[0163]
【The invention's effect】
Method and reagent for measuring substance to be measured in sample of the present invention, And methods for avoiding the effects of interfering substances contained in the sampleThen, measurement is performed in the presence of a substance having the same function as the interfering substance contained in the sample, or it is included in the measurement reagent, so that it depends on the interfering substance.Avoid impactIn addition, an accurate measurement value can be obtained.

Claims

When measuring the measurement target substance in the sample, in order to avoid the influence of the interference substance contained in the sample and perform accurate measurement, measurement is performed in the presence of a substance having the same function as the interference substance in the measurement reaction. A method for measuring a substance to be measured in a sample, wherein the content of the substance to be measured is determined by proportional calculation of the measured value of the substance to be measured in the sample and the measured value of the standard substance having a known concentration .

The measured value of the target substance in the sample when calculating the content of the target substance by proportional calculation of the measured value of the target substance in the sample and the measured value of the standard substance of known concentration is the absorbance value at the time of sample measurement. The measurement method according to claim 1, wherein the measured value of the standard substance having a known concentration is an absorbance value at the time of measuring the standard substance.

The measurement method according to claim 1 or 2 , wherein a substance having the same function as the interference substance is the interference substance.

The measurement method according to any one of claims 1 to 3, wherein the measurement of the measurement target substance in the sample is performed using an antigen-antibody reaction.

The measurement method according to any one of claims 1 to 3, wherein the measurement of the substance to be measured in the sample is performed using an enzyme reaction.

The measurement method according to any one of claims 1 to 3, wherein the measurement of the measurement target substance in the sample is to measure generation of a signal when a specific substance is bound to the measurement target substance.

A measurement reagent for a measurement target substance in a sample containing a substance having the same function as an interfering substance contained in the sample, wherein the measurement reagent contains a measurement value of the measurement target substance in the sample and a standard substance having a known concentration. A reagent for measuring a substance to be measured in a sample, wherein the content of the substance to be measured is obtained by proportional calculation with the measured value .

The measured value of the target substance in the sample when calculating the content of the target substance by proportional calculation of the measured value of the target substance in the sample and the measured value of the standard substance of known concentration is the absorbance value at the time of sample measurement. The measurement reagent according to claim 7, wherein the measured value of the standard substance having a known concentration is an absorbance value at the time of measuring the standard substance.

The measurement reagent according to claim 7 or 8 , wherein a substance having the same function as the interference substance is the interference substance.

The measurement reagent according to any one of claims 7 to 9 , wherein the measurement of the measurement target substance in the sample is performed using an antigen-antibody reaction.

The measurement reagent according to any one of claims 7 to 9 , wherein the measurement of the substance to be measured in the sample is performed using an enzyme reaction.

The measurement reagent according to any one of claims 7 to 9, wherein the measurement of the measurement target substance in the sample measures the generation of a signal when a specific substance is bound to the measurement target substance.

During the measurement reaction of the measurement target substance in the sample, measurement is performed in the presence of a substance having the same function as the interference substance contained in the sample, and the measurement value of the measurement target substance in the sample and the measurement value of the standard substance of known concentration The method of avoiding the effects of interfering substances contained in a sample, by determining the content of the substance to be measured by proportional calculation.

The measured value of the target substance in the sample when calculating the content of the target substance by proportional calculation of the measured value of the target substance in the sample and the measured value of the standard substance of known concentration is the absorbance value at the time of sample measurement. 14. The method for avoiding the influence of an interfering substance contained in a sample according to claim 13, wherein the measured value of a standard substance having a known concentration is an absorbance value when the standard substance is measured.

The method for avoiding the influence of the interference substance contained in the sample according to claim 13 or 14, wherein the substance having the same function as the interference substance is the interference substance.

The method for avoiding the influence of an interfering substance contained in a sample according to any one of claims 13 to 15, wherein the measurement reaction of the measurement target substance in the sample is performed using an antigen-antibody reaction.

The measurement reaction of the target substance in the sample is performed using an enzyme reaction. The method of avoiding the influence by the interference substance contained in the sample of any one of Claims 13-15 which is a thing.

The measurement reaction of the measurement target substance in the sample is included in the sample according to any one of claims 13 to 15, which measures the generation of a signal when a specific substance is bound to the measurement target substance. To avoid the effects of interfering substances.