JP4087339B2

JP4087339B2 - 新規ペプチドｓｙ

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Publication number: JP4087339B2
Application number: JP2003556431A
Authority: JP
Inventors: 克裕筬島; 泰徳大石
Original assignee: 仙味エキス株式会社
Priority date: 2001-12-25
Filing date: 2002-12-24
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2022-12-24
Also published as: EP1460084A1; US20040087504A1; EP1460084A4; CA2442194A1; KR20040067859A; WO2003055901A1; CA2442194C; PT1460084E; ES2298415T3; AU2002360002A1; JPWO2003055901A1; US6905704B2; EP1460084B1; ATE383369T1; DE60224576D1; DE60224576T2; KR100960843B1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ペプチドＳＹ及びその血圧降下用途である血圧降下剤や血圧降下性機能食品に関するものである。更には、ペプチドＳＹに含まれるペプチドＳＹ−ＭＤとその分離方法にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
先に、本発明者らは、魚肉を熱変性処理し、自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理することによってＡＣＥ（Angiotensin I-converting enzyme:アンジオテンシンＩ変換酵素）阻害活性を有する新規ペプチドα−１０００を開発するのに成功し、既に特許権を得ている（特許第３１１７７７９号：特開平５−２７１２９７号）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
生活習慣病の増加にともない、新しい高血圧発症予防ないし血圧降下に有効な成分の新たな開発が当業界で希求されており、本発明はこの当業界の要望に応える目的でなされたものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために各方面から検討の結果、本発明者らが開発したＡＣＥ阻害ペプチドα−１０００に再度着目し、各種の分画画分について鋭意研究の結果、ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを高度に含有する画分ほどＡＣＥ阻害性が高いことをはじめて見出し、このＶａｌ−Ｔｙｒを降圧ペプチドの本体のひとつであると同定した。
上記した有用新知見に基づき、Ｖａｌ−Ｔｙｒ含量が高いだけでなく、苦味が少なく呈味性及び安定性にもすぐれた新しいペプチドを新たに開発することとし、魚肉を蛋白分解酵素で処理して得たペプチド（すなわち、ペプチドα−１０００）をペプチド吸着樹脂（ＯＤＳ樹脂）処理し、水溶出、エタノール水溶出、水溶出の三段階溶出を行ったところ、最初の水溶出の後画分、１１〜１８V/V％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分に、魚肉ペプチド中のほとんどのＶａｌ−Ｔｙｒが回収されているという有用新知見を得た。
このように、最初の水溶出の後画分、１１〜１８V/V％エタノール水溶液溶出画分及び最後の水溶出画分の混合物はＶａｌ−Ｔｙｒ含量が高いだけでなく、苦味が少なく、呈味性にすぐれ、安定性にもすぐれており、全く新規な降圧機能性ペプチドであることを確認し、これを新規ペプチドと同定して、ここに、ペプチドＳＹと命名した。
更に、本発明において、上記の１１〜１８V/V％エタノール水溶液溶出画分のみを単離して調べたところ、Ｎａ含量が０．１〜０．２％程度(ペプチドＳＹでは、Ｎａは１〜３％程度)と極めてＮａ含量の少ない新たなぺプチドが得られたので、この画分をペプチドＳＹ−ＭＤと命名した。
【０００５】
本発明においては、ペプチドα−１０００を原料として、できるだけ多くのＶａｌ−Ｔｙｒを含むペプチドを連続的に回収することを目的に研究を行った。
その結果、α−１０００をＯＤＳ樹脂処理した後、水を加えて水で溶出する画分の一部（後の方の画分）を得た後、ひき続き、連続してエタノール水溶液を加えてエタノール水溶液で溶出する画分を得るのであるが、その際、水溶出(1)に使用した水が一部残っているために、エタノール濃度は１１〜１８V/V％、好ましくは１４〜１６V/V％程度が好適であることをつきとめた。
そして更に、ペプチドＳＹを取得するに当り、目的とする水溶出(1)の後画分を分取する際の分取開始点の設定、その終了点（即ち、エタノール溶出の開始点）、その終了点（水溶出(2)の開始点）、その終了点について、分画時間、塩分濃度、Ｂｘ、波長２８０ｎｍのＵＶ吸収の測定、モニタリングによってそれぞれ特定ないし判断して、一種の連続システムによるペプチドＳＹの製造法も確立し、これらの有用新知見に基づき、更に研究の結果、遂に本発明の完成に至ったものである。
【０００６】
本発明のペプチドＳＹの理化学的性質は次に示される。
ペプチドＳＹの理化学的性質
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫＧＳ−３２０高速液体クロマトグラフィーによる）：図２
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５W/W％（常圧加熱乾燥法）
；蛋白質８４〜９４W/W％（ミクロケルダール法）
；脂質０．５W/W％以下（ソックスレー抽出法）
；灰分４±２W/W％（直接灰化法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、ＡＣＥ阻害活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図３
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図４
（Ｊ）比旋光度：[α]_D ²⁰＝−４０°〜−５１°
【０００７】
そして、本発明のペプチドＳＹは次の通りに製造される。
即ち、ペプチド原液をペプチド吸着樹脂による溶出分画処理により得られるペプチド成分であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１で例示する溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出(1)の後画分、１１〜１８V/V％エタノール溶出画分（図１では１５％エタノールでの溶出を示す）及び水溶出(2)画分を分取混合してペプチドＳＹは製造される。
（１）水溶出(1)の後画分：展開液として水を用い、水溶出(1)のペプチド（ペプチドＳＹ）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出(1)の後画分の最終分取点までの画分。
（２）１１〜１８V/V％エタノール溶出画分：次に、１１〜１８V/V％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。（この画分のみを単離したものをペプチドＳＹ−ＭＤとした。）
（３）水溶出(2)画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となる迄に得られる画分。
【０００８】
次に、本発明のペプチドＳＹの原料となるペプチドα−１０００について説明する。
ペプチドα−１０００は、魚介類を原料として製造するものであって、例えば特許第３１１７７７９号にしたがって製造することができ、先ず、魚介類を採肉機、デボーナー等によって処理して魚肉質を分離する。原料は出来る限り新鮮なものが好ましい。分離した魚肉は、１０ｋｇ程度のすり身に分割し、このまま次の処理に使用してもよいが、−２０〜−５０℃、例えば−３０℃程度の冷気を吹き付けて急速凍結し、−２０〜−２５℃に保存しておき、必要に応じてこれを適宜使用することにしてもよい。
魚介類としては、イワシ、アジ、マグロ、カツオ、サンマ、サバ等赤身魚；ヒラメ、タイ、キス、コノシロ、タラ、ニシン、ブリ等白身魚；サメ、エイ等軟骨魚肉；ワカサギ、コイ、イワナ、ヤマメ等淡水魚肉；アイザメ、アンコウ等深海魚肉のほか、エビ、カニ、タコ、アミ類等も適宜使用できる。
採肉した後、粉砕機等によって魚介類を粉砕し、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましくは等量〜１０倍量の加水を行った後、加熱処理し、もって、自己消化酵素を失活させ、且つ細菌を死滅させるとともに、タンパク質を熱変性させて後に行う酵素反応効率を上昇せしめる。加熱条件としては、このような作用が奏される条件であればすべての条件が利用できるが、例えば６５℃以上、２〜６０分、好ましくは８０℃以上、５〜３０分とするのがよい。
次いで、アンモニア水か、水酸化ナトリウム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、（例えばアルカリプロテアーゼの場合は、ｐＨ７．５以上、好ましくは８以上）、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、２０〜６５℃、アルカリプロテアーゼの場合は３５〜６０℃、好ましくは４０〜５５℃）に加温し、蛋白分解酵素を加えて３０分〜３０時間（アルカリプロテアーゼの場合は３０分〜２５時間、好ましくは１〜１７時間）処理する。
蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植物のほかに微生物にも求めることができ、ペプシン、レニン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プロメレインのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用することができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％程度でもよい。
次いで必要あれば中和処理を行った後、７０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるとともに後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、バイブスクリーン等によって粗分離し、必要によりジエクター処理した後、超遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物を除去する。
次に、ケイソウ土等濾過助剤（例えばセライト）を用いて濾過し、濾液を活性炭処理（０．０５〜２０％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１〜１０％Ｗ／Ｖ使用、２０〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、１５分〜４時間、好ましくは３０分〜２時間）して、脱臭、脱色、精製する。
これを減圧濃縮（０〜５０℃）その他常法にしたがって濃縮（３０Ｂｘ程度にまで）した後、必要あれば再度（超）遠心分離又は濾過してペプチド原液を得る。このようにして得たペプチド原液は、殺菌（ＵＨＴＳＴその他常法による）した後、容器に充填した製品（α−１０００（液体））とする。また、希望するのであれば、更に濃縮したりあるいは逆に希釈したり、また、噴霧乾燥、凍結乾燥等の常法によって６０メッシュ程度に粉末化し、これを袋等の容器に充填して製品（α−１０００（粉末））とすることもできる。これらの製品は、液体は冷蔵ないし冷凍保管、粉末は乾燥冷暗所保管する。
このようにして得た、液状、ペースト状ないし粉末状のペプチドがα−１０００である。
【０００９】
ペプチドα−１０００（スプレードライ粉末）の物理化学的性質は、下記に示すとおりである。
ペプチドα−１０００（粉末）の理化学的性質
（Ａ）分子量；
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５カラムクロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点；１１９℃で着色（分解点）
（Ｃ）比旋光度
[α]_D ²⁰＝−２２°
（Ｄ）溶剤に対する溶解性；
水に易溶；エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（Ｅ）酸性、中性、塩基性の区別；
中性ｐＨ６．０〜８．０（１０％溶液）
（Ｆ）紫外線吸収スペクトル：図５
（Ｇ）赤外線吸収スペクトル：図６
（Ｈ）外観、成分；
白色粉末；水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（Ｉ）特性；
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。
【００１０】
（Ｊ）アミノ酸組成；
下記に示すとおり。
──────────────────────
分析試験項目結果（％）
──────────────────────
全アミノ酸
アルギニン３．３４
リジン６．８６
ヒスチジン３．３４
フェニルアラニン２．３３
チロシン２．０１
ロイシン６．３５
イソロイシン３．２７
メチオニン２．２６
バリン４．１６
アラニン５．１７
グリシン３．５９
プロリン２．１５
グルタミン酸１２．３５
セリン３．３０
スレオニン３．７０
アスパラギン酸８．３６
トリプトファン０．３２
シスチン０．４７
全量７３．３３
──────────────────────
分析方法：アミノ酸自動分析法による（但し、シスチンは、過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解し測定した。トリプトファンは、高速液体クロマトグラフ法を用いた。）
【００１１】
このようにして調製したペプチドα−１０００は、液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した後、これをペプチド原液としてＯＤＳ樹脂その他ペプチド吸着性樹脂に通し、図１の「原液負荷」を行う。なお、樹脂としては、ペプチド吸着性樹脂であればすべてのタイプの樹脂が使用可能であって、例えば各種ＯＤＳ樹脂、ＹＭＣＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ５０（商品名）、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ２０７（三菱化学（株）製商品名）等が適宜使用される。
本発明は、魚肉を蛋白分解酵素処理して得た降圧ペプチド（例えばα−１０００）の中から、Ｖａｌ−Ｔｙｒ含量が高く且つ苦味が少なく呈味性及び安定性にすぐれたペプチドについて、各方面から検討の結果、上記した各種画分の中から目的とする画分を分取混合するのにはじめて成功したものであって、このようにして分取混合した新規降圧ペプチドをペプチドＳＹと命名した。
【００１２】
ペプチドＳＹは、上記した溶出画分から分取、製造することができる。各種溶出液の溶出パターンの１例を図１に示す。
本発明に係るペプチドＳＹは、図１に示す如く、ペプチド吸着樹脂に、例えばα−１０００を加え（原液負荷）、次いで水で溶出し（水溶出(1)）、その水溶出(1)の後画分、と、１１〜１８V/V％エタノール溶液で溶出する１１〜１８V/V％エタノール溶出画分、と、更に水で溶出する水溶出(2)画分を混合することにより製造することができる。ペプチドＳＹ画分の分取スタート時点の設定、溶出液の切り変え時期の設定等は、Ｂｘ、塩分、ＵＶ（２８０ｎｍ吸収）、Ｎａの少なくともひとつの測定値に基づき、あるいは分画時間に基づいて適宜決定すればよく、これらの項目をリアルタイム等適宜モニターして、コンピュータによって実施することも可能である。
例えば、図１の溶出パターンにおいてペプチドＳＹの水溶出(2)の後画分の分画スタート時点は、塩分値を測定し、次のようにしてこれを決定することができる。
ｉ）水溶出開始後０分時点から取ると、Ｎａ含量が４ｇ／１００ｇ以上となってしまうので、高Ｎａ素材となり降圧剤としては好ましくない。
ii）分取時間を水溶出開始後２０分後の時は、Ｎａ含量として１〜３ｇ／１００ｇで許容範囲である。
iii）これ以降の分取開始とすると、更にＮａ含量は少なくなるが、今度は塩分含量が少なすぎるため濃縮時にペプチドＳＹに含まれるグアニンが析出しやすくなりオリが発生することがあって好ましくない。
【００１３】
iv）したがって分取開始時間を水溶出開始後２０分とし、Ｎａ量を１〜３ｇ／１００ｇ付近とした。
また、水溶出(1)画分の最終分取点はＮａ量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる点とした。
次に、この点から水にかえて１１〜１８V/V％エタノール水溶液が添加され、ペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するところでエタノール水溶液の添加を止め、ここに得られる画分を１１〜１８V/V％エタノール溶出画分とした。（この１１〜１８V/V％エタノール溶出画分のみを単離したものがＮａをほとんど含まないペプチドＳＹ−ＭＤとなる。）
１１〜１８V/V％エタノール水溶液の添加を停止し、水の添加に切り換える時期は、水溶出(2)のスタート時点でもあるが、全ペプチド量を示す波長２８０ｎｍのＵＶ吸収値が急激に低下しはじめ、ピークの半分程度になった時期とし、エンドポイントは、ＵＶ吸収値がゼロになって定常状態に入った時期とすればよい。ここに得られた画分を水溶出(2)画分とした。
ここに得られる（１）水溶出(1)の後画分、（２）１１〜１８V/V％エタノール溶出画分、（３）水溶出(2)画分を、各別に又は連続して分取混合したものが本発明のペプチドＳＹである。
このようにして、水溶出(1)画分の途中からの後画分から、１１〜１８V/V％エタノール溶出画分を経て、水溶出(2)画分までの画分を、本発明に係るペプチドＳＹとして得ることができる（図１においては、サーデンペプチドＳＹと表示）。
また、図１において「１５％エタノール溶出」としたところが、ペプチドＳＹ−ＭＤに相当する。
【００１４】
ペプチドＳＹは、本発明者らによって降圧ペプチドの本体のひとつとしてはじめて確認されたジペプチド（バリル−チロシン（Ｖａｌｙｌ−Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）：以下、Ｖａｌ−Ｔｙｒ又はＶＹということもある）を高濃度に含有し（ＶＹ回収率：α−１０００を１００％としたとき、ＳＹは９０〜９５％、これに対してＳＹ−ＭＤは６５〜７５％である）、非常に高いＡＣＥ阻害活性を示すだけでなく、呈味性も大幅に改良されている。しかしながら、ペプチドＳＹ−ＭＤは水溶出(1)の後画分を含まないので、苦味が残るが、Ｎａをほとんど含まないので、Ｎａ摂取不可のひとにとっては有用な降圧剤となるのである。
すなわち、「原液負荷」部分は呈味性は強いが、原料由来の魚臭も幾分含まれており、Ｎａ含量も多い。これに対して、水溶出(1)の後画分は原料由来の魚臭が少なく、味も非常に良好である。
従って水溶出(1)の後画分を組み入れることによって、ペプチドＳＹ−ＭＤより、ＶＹを多量に回収でき、かつ呈味性と安定性に優れたペプチド素材「ペプチドＳＹ」が得られることになるのである。
また、ペプチドＳＹやペプチドＳＹ−ＭＤには、血圧抑制作用のほか、カルシウムや鉄分の吸収促進作用、コレステロール抑制作用、血糖値抑制作用等の機能性も認められるのである。
【００１５】
ペプチドＳＹの理化学的性質は次のとおりである：
ペプチドＳＹの理化学的性質
（Ａ）分子量；２００〜１０，０００（図２）
（Ｂ）融点；１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５W/W％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質８４〜９４W/W％（ミクロケルダール法）
：脂質０．５W/W％以下（ソックスレー抽出法）
：灰分４±２W/W％（直接灰化法）
：Ｎａ１〜３W/W％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、ＡＣＥ阻害活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図３
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：図４
（Ｊ）比旋光度：[α]_D ²⁰＝−４０°〜−５１°
（Ｋ）ＡＣＥ阻害活性値（ＩＣ₅₀）：２００μｇ／ｍｌ以下（Ｃｕｓｈｍａｎ
の変法による）
【００１６】
（Ｌ）主要なアミノ酸組成
─────────────────────
アミノ酸分析値（％）
─────────────────────
アスパラギン酸８．０〜９．２
グルタミン酸９．５〜１２．０
バリン４．５〜５．５
メチオニン２．５〜３．８
イソロイシン４．５〜５．２
ロイシン７．３〜８．５
チロシン３．４〜４．８
フェニルアラニン４．５〜５．５
ヒスチジン３．０〜３．８
リジン６．５〜７．８
アルギニン５．０〜６．０
─────────────────────
（分析方法：アミノ酸自動分析法による）
【００１７】
また、ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質はつぎのとおりである。
ペプチドＳＹ−ＭＤの理化学的性質
（Ａ）分子量；２００〜１０，０００
（Ｂ）融点；１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分２〜６W/W％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質９０〜９８W/W％（ミクロケルダール法）
：脂質０．５W/W％以下（ソックスレー抽出法）
：灰分３．０W/W％以下（直接灰化法）
：Ｎａ０．１〜０．２W/W％（原子吸光光度法）
（Ｇ）紫外線吸収スペクトル：図７
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：図８
本発明に係るペプチドＳＹ又はペプチドＳＹ−ＭＤは、いずれも従来未知の新規ペプチド混合物であり、すぐれた血圧降下活性を示し、しかも安全性についても問題はないので、血圧降下剤ないし血圧降下を目的として特定保健用食品向けペプチドとしても使用することができる。したがって本ペプチドは、調味料、栄養強化用食品といった食品ないしは動物飼料添加剤として使用されるほか、上記した独特の生理活性の故に、高血圧性疾病の予防、ある場合には治療のために、医薬として、または輸液、健康食品、臨床栄養食品等としても巾広く使用することができる。
食品として使用する場合には、ペプチドをそのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医薬として使用する場合には、経口又は非経口投与することができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたがい、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤、ドリンク剤とすることができ、又、非経口投与の場合には、例えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することができる。
【００１８】
以下、本発明を参考例及び実施例によって更に詳しく説明する。
【００１９】
【参考例】
新鮮イワシをデボーナーで処理して採肉した。採肉した魚肉質を１０ｋｇのすり身に分割し、これを−３０℃以下で急速凍結した後、粉砕機で粉砕した後等量の水を加え、これをタンクに送り、１００℃で１０分間加熱して自己消化酵素を失活させ、熱変性させた。次いでアンモニア水を加えてｐＨを９．５に調整した。
これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の０．１％液を加え、５０℃に１７．５時間保持して酵素分解を行った。次いで１５分間煮沸して酵素を失活せしめた。
これをバイブスクリーン（１５０メッシュ）に通し５０００ｒｐｍでジエクター処理した後、シャープレス遠心分離機で処理し（１５０００ｒｐｍ）、ケイソウ土を濾過助剤として用い、濾過処理したものをペプチド原液とした。
上記で得たペプチド原液に活性炭を１％Ｗ／Ｖ加え、３０℃で６０分間攪拌した後濾過して濾液を得た。これを常法にしたがって減圧濃縮（２０℃）した後、常法にしたがってＵＨＴＳＴ殺菌を行って、α−１０００（液体）製品を得、これを更に常法にしたがって噴霧乾燥して粒径６０メッシュのα−１０００（粉末）製品を得、それぞれこれらの製品は冷凍保管した。
【００２０】
【実施例１】
参考例で得られたペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、次に、図１の溶出パターンにしたがい、水、１５％エタノール水溶液、次いで水、各５００ｍｌを加えて、図１におけるサーデンペプチドＳＹの全画分、即ち、水溶出(1)の後画分、１５％エタノール溶出画分、水溶出(2)画分を分取混合し、凍結乾燥し、ペプチドＳＹ（粉末）２．１ｇを得た。ペプチドＳＹのＮａ含量は１．４５W/W％であった。（原子吸光光度法による）
【００２１】
【実施例２】
参考例で得られたペプチドα−１０００（粉末）５ｇを５００ｍｌの脱イオン水で溶解して原液とし、疎水性吸着樹脂ＳＥＰＡＢＥＡＤＳＳＰ２０７（三菱化学（株）製）カラム（３．５×１３ｃｍ）に流してカラムをα−１０００溶液で満たし（原液負荷）、図１の溶出パターンに示されたサーデンペプチドＳＹの全画分のうち、１５％エタノール溶出画分のみを単離分取し、これを凍結乾燥し、ペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）１．７ｇを得た。ペプチドＳＹ−ＭＤのＮａ含量は０．１２４W/W％であった。（原子吸光光度法による）
【００２２】
【実施例３】
（ドリンクの製造）
――――――――――――――――――――――
１００ｍｌドリンク配合表
――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖４．５ｇ
糖アルコール１ｇ
酸味料０．２ｇ
香料０．１３ｇ
甘味料（ステビア）０．０３ｇ
カラメル色素０．０２ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）０．５ｇ
（実施例１で得た）
精製水全量を１００ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
５０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖１０ｇ
香料０．３ｇ
酸味料０．１６ｇ
甘味料（ステビア）０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）０．５ｇ
（実施例１で得た）
精製水全量を５０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
３０ｍｌドリンク配合表
―――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖５ｇ
香料０．２５ｇ
酸味料０．１ｇ
甘味料（ステビア）０．０１５ｇ
ペプチドＳＹ（粉末）０．５ｇ
（実施例１で得た）
精製水全量を３０ｍｌに定容
―――――――――――――――――――――――
上記配合を６０℃で混合溶解した後、１２８℃、１０秒のプレート殺菌とした。次いでこれを充分に洗浄した１００ｍｌ、５０ｍｌ、３０ｍｌの各容量褐色ビンに９０℃で充填し、室温で放冷後、流水水槽中で急冷し、ドリンクを製造した。
【００２３】
【実施例４】
（錠剤の製造）
次の配合により錠剤を製造した。
実施例１で得たペプチドＳＹ（粉末）５００ｇ、還元麦芽糖水飴３５６ｇ、結晶セルロース１００ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４０ｇ、甘味料（ステビア）４ｇを混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して素錠（２５０ｍｇ×４０００個）を作製した。この素錠に、１錠当たり７．５ｍｇのセラック溶液をコーティングし、４錠当たりペプチドＳＹ（粉末）を５００ｍｇ含有する錠剤４０００個を製造した。
【００２４】
【実施例５】
実施例３で製造したドリンクの服用例を示す。
（１）３０ｍｌドリンクの場合
ペプチドＳＹを０．５ｇ／本とし、軽症高血圧者に対し、無作為二重盲検法によりペプチド投与群とプラセボ群に分けて臨床試験を実施。毎日１本ずつ摂取、４週間後にペプチド投与群のみ上の血圧が平均値で１０．６ｍｍＨｇ、下の血圧が５．６ｍｍＨｇ有意に下がった。
（２）５０ｍｌドリンクの場合
同様に軽症高血圧者に対し、無作為二重盲検法によりベプチド投与群とプラセボ群に分けて臨床試験を実施。毎日１本ずつ摂取、４週間後にペプチド投与群のみ上の血圧が平均値で１０．２ｍｍＨｇ、下の血圧が３．８ｍｍＨｇ有意に下がった。
（３）１００ｍｌドリンクの場合
同様に実施し、４週間後にペプチド投与群のみ上の血圧が平均値で８．２ｍｍＨｇ、下の血圧が３．０ｍｍＨｇ有意に下がった。
以上のように、いずれの場合もペプチドＳＹを０．５ｇ／本含むドリンクを１日１回摂取する事によって、軽症高血圧者の血圧を自他覚症状に影響を与えることなく、危険率１％以下で有意に低下させることが確認された。
【００２５】
【実施例６】
実施例４で製造した錠剤の服用例を示す。
正常高値血圧者及び軽症高血圧者８８名に対してプラセボ対照二重盲検摂取試験を行った。
当該錠剤を一日４錠づつ（ペプチドＳＹとして０．５ｇ／日）摂取したところ、ペプチドＳＹ投与群（４４名）は試験開始時、上の血圧（収縮期血圧）が１４８±１１ｍｍＨｇ、下の血圧（拡張期血圧）が９２±１４ｍｍＨｇだったものが、上の血圧は４週間後１３８±１２ｍｍＨｇ、８週間後１３４±９ｍｍＨｇまで下がり、下の血圧も４週間後８４±１１ｍｍＨｇ、８週間後８３±１０ｍｍＨｇと有意に下がった。プラセボ群（４４名）には有意な変動は見られず、また両群とも空咳などの副作用は一切観察されなかったことから、ペプチドＳＹを含む本錠剤の正常高値血圧者・軽症高血圧者に対する血圧抑制効果が確認された。
【００２６】
【実施例７】
（ドリンクの製造）
――――――――――――――――――――――
１００ｍｌドリンク配合表
――――――――――――――――――――――
果糖ブドウ糖液糖４．５ｇ
糖アルコール１ｇ
酸味料０．２ｇ
香料０．１３ｇ
甘味料（ステビア）０．０３ｇ
カラメル色素０．０２ｇ
ペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）０．５ｇ
（実施例２で得た）
精製水全量を１００ｍｌに定容
この１００ｍｌドリンクは、ペプチドＳＹ−ＭＤを５００ｍｇ／本含み、成分は、水分９６．７ｇ、タンパク質０．５ｇ、糖質４．５ｇ、熱量１９Ｋcal、ナトリウム７．４ｍｇ、ソルビトール０．６６ｇであった。
このペプチドＳＹ−ＭＤを０．５ｇ／本含むドリンクを１本／日用いて、収縮期血圧１３０〜１４０ｍｍＨｇ、拡張期血圧８０〜９０ｍｍＨｇの正常高値血圧者及び収縮期血圧１４０〜１６０ｍｍＨｇ、拡張期血圧９０〜１００ｍｍＨｇの軽症高血圧者のボランティアに対し二重盲検比較対照試験を行った。
その結果、プラセボ飲料摂取群は血圧変動に有意差はなかったが、ペプチド飲料摂取群は４週間後に収縮期血圧が摂取前と比べ１４．７ｍｍＨｇ、拡張期血圧が７．６ｍｍＨｇと有意に低下し、有効性を確認した。
【００２７】
【実施例８】
（錠剤の製造）
次の配合により錠剤を製造した。
実施例２で得たペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）５００ｇ、還元麦芽糖水飴３５６ｇ、結晶セルロース１００ｇ、ショ糖脂肪酸エステル４０ｇ、甘味料（ステビア）４ｇを混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して素錠（２５０ｍｇ×４０００個）を作製した。この素錠に、１錠当たり７．５ｍｇのセラック溶液をコーティングし、４錠当たりペプチドＳＹ−ＭＤ（粉末）を５００ｍｇ含有する錠剤４０００個を製造した。
その成分は、１００ｇ中、水分３．３ｇ、タンパク質４４．２ｇ、糖質３．５ｇ、灰分１．６ｇ、炭水化物４７．４ｇ、ナトリウム５６６ｍｇでエネルギー量は３９８Ｋcalであった。
この錠剤を一日４錠づつ（ペプチドＳＹ−ＭＤとして０．５ｇ／日摂取）用い、ペプチドＳＹ−ＭＤを含まないプラセボを対照として１２週間の二重盲検比較対照試験を実施、４０名の正常高値血圧者と軽症高血圧者のボランティアにおいて、ペプチドＳＹ−ＭＤ含有錠剤摂取群は、摂取前に比べ収縮期血圧（ＳＢＰ）、拡張期血圧（ＤＢＰ）共に有意な血圧降下を示した。すなわちＳＢＰは摂取前が１４５．４ｍｍＨｇ、ＤＢＰが８６．８ｍｍＨｇであったのに対し、試験終了時にはＳＢＰが１３４．７ｍｍＨｇ、ＤＢＰが８３．０ｍｍＨｇに下がった。プラセボ群には有意な血圧変動は認められず、１２週間を通して副作用などの自覚症状も生じなかった。
【００２８】
【発明の効果】
本発明に係るペプチドＳＹやペプチドＳＹ−ＭＤは、降圧成分として、すなわち降圧ペプチドの本体として新たに見出したＶａｌ−Ｔｙｒを高濃度に含有しているため降圧機能性にすぐれているだけでなく、更にペプチドＳＹにおいては水溶出画分の一部を組み入れたことによって、苦味がなく呈味性及び安定性にすぐれているという特徴を有する。本発明に係る新規にして著効を有するペプチドＳＹは、上記した特徴を有するので、飲食品自体ないし添加物として使用できるだけでなく、すぐれたＡＣＥ阻害活性を有するので、保健用食品として血圧上昇を抑制ないし予防のために使用することができ、また、ＡＣＥ阻害剤ないし血圧降下剤として各種の剤型に製剤化して医薬としても有利に使用できる。
新規ペプチドＳＹやペプチドＳＹ−ＭＤは、既述したところからも明らかなように、すぐれた血圧降下活性を示し、また、本来、魚肉由来であるため、安全性には問題がないので（現に、ラットに対して１日当り５００ｍｇを強制的に経口投与したところ、１０日経過後においても急性毒性は認められなかった。）、血圧降下剤ないし血圧降下を目的として特定保健用食品向けペプチドとしても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は実施例１におけるペプチドＳＹ溶出パターンのグラフである。
【図２】図２はペプチドＳＹの分子量を示す。
【図３】図３はペプチドＳＹの赤外線吸収スペクトルを示す。
【図４】図４はペプチドＳＹの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図５】図５はペプチドα−１０００紫外線吸収スペクトルを示す。
【図６】図６はペプチドα−１０００の赤外線吸収スペクトルを示す。
【図７】図７はペプチドＳＹ−ＭＤの紫外線吸収スペクトルを示す。
【図８】図８はペプチドＳＹ−ＭＤの赤外線吸収スペクトルを示す。

Claims

下記の理化学的性質を有するペプチド混合物。
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫＧＳ−３２０（登録商標）高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質８４〜９４Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
：脂質０．５Ｗ／Ｗ％以下（ソックスレー抽出法）
：灰分４±２Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
：Ｎａ１〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、ＡＣＥ阻害活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：９５０ｎｍ付近、１４３０ｎｍ付近、１４９０ｎｍ付近、２５９０ｎｍ付近、にピークを持つことを特徴とする赤外吸収スペクトルを有する（図３）。
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：２６２ｎｍ付近、２９２ｎｍ付近、に変曲点を持ち、明瞭なピークを認めないことを特徴とする紫外吸収スペクトルを有する（図４）。
（Ｊ）由来：魚肉由来である。
ペプチド原液をペプチド吸着樹脂を用いて溶出分画処理することによってペプチド混合物を製造する方法であって、該溶出分画処理が展開溶液として水、エタノール水溶液及び水の順に用い、図１の溶出パターンにおいて、それぞれの展開溶液により得られる下記で規定される水溶出（１）の後画分、１１〜１８Ｖ／Ｖ％エタノール溶出画分及び水溶出（２）画分を分取混合してなること、を特徴とする下記の理化学的性質を有するペプチド混合物の製造方法。
（１）水溶出（１）の後画分：展開液として水を用い、溶出ペプチド画分全体（ペプチド混合物）におけるナトリウム（Ｎａ）の量が１〜３ｇ／１００ｇとなる時点から、ナトリウムの量が実質的に０ｇ／１００ｇとなる水溶出（１）の後画分の最終分取点までの画分。
（２）エタノール溶出画分：次に、１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分。
（３）水溶出（２）画分：次に、展開液として水を用い、溶出分画処理が終点となるまでに得られる画分。
（ペプチド混合物の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡＫＧＳ−３２０（登録商標）高速液体クロマトグラフィーによる）
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分１〜５Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質８４〜９４Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
：脂質０．５Ｗ／Ｗ％以下（ソックスレー抽出法）
：灰分４±２Ｗ／Ｗ％（直接灰化法）
：Ｎａ１〜３Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
（Ｇ）生理的性質：ジペプチドＶａｌ−Ｔｙｒを含有し、ＡＣＥ阻害活性を有する。
（Ｈ）赤外線吸収スペクトル：９５０ｎｍ付近、１４３０ｎｍ付近、１４９０ｎｍ付近、２５９０ｎｍ付近、にピークを持つことを特徴とする赤外吸収スペクトルを有する（図３）。
（Ｉ）紫外線吸収スペクトル：２６２ｎｍ付近、２９２ｎｍ付近、に変曲点を持ち、明瞭なピークを認めないことを特徴とする紫外吸収スペクトルを有する（図４）。
（Ｊ）由来：魚肉由来である。
ペプチド原液として、魚肉由来で、下記の理化学的性質を有するペプチドα−１０００の水溶液を用いて製造すること、を特徴とする請求項２に記載の方法。
（ａ）分子量：
２００〜１０，０００（セファデックスＧ−２５（商標）カラムクロマトグラフィーによる）
（ｂ）融点：１１９℃で着色（分解点）
（ｃ）溶剤に対する溶解性：
水に易溶、エタノール、アセトン、ヘキサンにはほとんど溶解しない。
（ｄ）酸性、中性、塩基性の区別：
中性
（ｅ）外観、成分：
白色粉末：水分５．１４％（減圧加熱乾燥法）；蛋白質８７．５％（ケルダール法、窒素・蛋白質換算係数６．２５）；脂質０％（ソックスレー抽出法）；灰分５．０％（直接灰化法）。
（ｆ）特性：
魚肉由来であり、加熱によって自己消化酵素を失活させ、蛋白分解酵素で加水分解して得たペプチドである。
請求項２の（２）における１１〜１８Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール水溶液を展開液としてペプチドの溶出量がピークを過ぎてピークの半量程度に低減するまでに得られる画分のみを単離分取すること、を特徴とする下記の理化学的性質を有するペプチド混合物の製造方法。
（ペプチド混合物の理化学的性質）
（Ａ）分子量：２００〜１０，０００
（Ｂ）融点：１３８±３℃で着色、分解する。
（Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。
（Ｄ）外観性状：白色〜淡黄色粉末
（Ｅ）液性（ｐＨ）：４．０〜６．０
（Ｆ）成分：水分２〜６Ｗ／Ｗ％（常圧加熱乾燥法）
：蛋白質９０〜９８Ｗ／Ｗ％（ミクロケルダール法）
：脂質０．５Ｗ／Ｗ％以下（ソックスレー抽出法）
：灰分３０Ｗ／Ｗ％以下（直接灰化法）
：Ｎａ０．１〜０．２Ｗ／Ｗ％（原子吸光光度法）
請求項１に記載のペプチド混合物を有効成分としてなること、を特徴とする血圧降下剤。
請求項１に記載のペプチド混合物自体からなること、あるいは、ペプチド混合物を含有してなること、を特徴とする血圧降下性機能食品。
該食品が液状又は固状の形状であること、を特徴とする請求項６に記載の食品。