JP3901726B2 - ウイルス複製の選択的不活性化のための方法 - Google Patents

Description

本発明は、ウイルス感染の治療に有用な薬剤のスクリーニングのための方法、このようなスクリーニング方法を用いて同定される新規の薬剤、および抗ウイルス剤としてのそれらの使用に関する。
発明の背景
現在ではウイルス感染を防除するのに多様な薬剤が用いられている。これらの薬剤にはインターフェロンが含まれ、これは所定の選択されるウイルス性疾患の防除においていくらかの効果を有する天然に存在する蛋白質である。その上ＡＺＴのような薬剤が、ウイルスＨＩＶ−１により生じ、一般的にはＡＩＤＳとして引用される免疫不全性疾患の防除に用いられている。
Ｄｒｕｇ ａｎｄ Ｍａｒｋｅｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｖｏｌ ３、Ｎｏ．９、ｐｐ．１７４−１８０（２／１５／９３）は、抗ウイルス性薬物の開発を記載している。
それは以下のように述べている。
大半の感染の薬物治療時に遭遇する難題はウイルス感染と比較すると見劣りがしてしまう。例えば、少なくとも理論的には（そしてしばしば実際に）宿主を害することなく細菌を攻撃することが可能である。しかしながら細菌とは異なり、ウイルスは細胞内で複製し、そして複製のために宿主の細胞性機構を利用する。その結果、抗ウイルス性治療の開発は、好ましくはウイルスの死滅化もしくは少なくともウイルス複製の拘束と、宿主を害さないかもしくは悪くても最低限の損傷のみを与えることとの間の折衷案を意味することがしばしばであり、これは利得の可能性により判断することができる。
これは、以下に示すようなことを初めとしてウイルスに特異的な現象を標的化することができるということを述べており、それらは、
＊細胞膜へのウイルスの結合および細胞内への貫入、
＊ウイルスの脱コート化、
＊ウイルスの核酸合成、
＊ウイルスの蛋白質合成および成熟、ならびに
＊感染性粒子の組み立ておよび放出、
である。
ウイルスの蛋白質合成に関して著者は、具体的に以下のような記述を行っている。
核酸合成とは対照的に、ウイスルの蛋白質合成は宿主リボソーム（リボソームはｍＲＮＡの蛋白質への翻訳に必須な細胞構造物である）および大抵は宿主由来の補足因子を利用する。その結果、一般的には蛋白質合成インヒビターは、それらが抗ウイルス性効果を発揮するものであるのと同様に宿主毒性を示すようでもある。しかしながらアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウイルスの蛋白質合成を特異的に阻害する点で価値あるものである可能性がある。簡潔に述べると、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ（センス鎖）に相補的な短いＤＮＡ断片であり、そしてｍＲＮＡに結合することによりｍＲＮＡが指令する蛋白質合成を妨げることができる。ＲＮＡ分子もセンスＤＮＡ鎖（およびそれらに対応するｍＲＮＡ）のものに相補的な配列を含むように構築されている。アンチセンス構築物はインビトロでのウイルス性蛋白質合成を阻害することが示されているものの、インビボでのそれらの有効性は未だ決定的に証明されてはいない。オリゴヌクレオチド療法のための最近の試みにはとりわけ、ウイルス感染化細胞への輸送、インビボでのこのような分子の安定性、および体中全体への拡散が含まれる。
リボソーム不活化因子は、ウイルス性蛋白質合成阻害のための他の研究方法を意味する。ＧＬＱ２２３（Ｇｅｎｅｌａｂｓ社；Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）は、臨床テスト中のリボソーム不活化因子である（ＧＬＱ２２３はトリコサンチン（キュウリ植物の誘導体）の精製製剤である）。リボソーム不活化因子は細胞の翻訳機構を邪魔して新規のウイルス蛋白質の産生を効果的に妨害するであろう。
Ｓｏｎｅｎｂｕｒｇ、２ Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ４０２、１９９０、は、翻訳開始のレベルでのウイルス宿主相互作用を記載しており、そして２つの開始因子ｅＩＦ−２およびｅＩＦ−４Ｆが数々のウイルス宿主相互作用における有意な役割を担っていることを述べている。彼は、「これらのウイルス−宿主相互作用の原因となる機構の理解はウイルス性疾患の将来の治療的研究方法にとっては非常に重大なものである」と述べている。
発明の要約
本発明は、宿主細胞の感染中にウイルスにより使用される翻訳系を阻害するのに有効な薬剤をスクリーニングするための方法に関する。このスクリーニング方法は、有用である可能性のある薬剤を適切な巨大分子配列、例えばウイルス核酸配列もしくは関連蛋白質配列と接触させ、これらの薬剤がこれらの配列の使用を特異的に阻害しうるか否かを決定するプロトコールを利用する。ウイルスは宿主の翻訳系を借用するために多様な方法を使用し、そして本発明の方法により特異的に標的化することができるのはこれらの方法である。いったん単離したら、ウイルス特異的な薬剤を薬剤学的に許容される製剤中の治療的製品（もしくは予防的製品にさえ）に製剤することができ、そして未感染のウイルス宿主細胞に影響をほとんど及ぼさないかもしくは全く及ぼさずにウイルス性疾患の特異的治療に用いることができる。
具体的には、一つの態様においては出願者は、宿主ＲＮＡに勝るウイルス性ＲＮＡの優先的翻訳の原因となる標的ウイルス核酸配列もしくはドメインを選択プロトコールに用いるスクリーニング方法を提供する。このようなウイルス核酸配列もしくはドメインの数々の具体例を、ＩＲＥＳ要素、特異的ウイルス配列を含む５’−非翻訳領域、およびこのような配列を含む上流読み取り枠の形態で以下に提供するが、これらは他のウイルス核酸配列をこのようなプロトコールにおいて用いることができる一般方法を例示するためのみに用られるに過ぎない。細胞翻訳系内でのこれらのウイルス核酸配列の内のいずれか一つの使用は、抗ウイルス剤を発見することができる手法を提供する。
出願者は、特許請求される方法は、Ｄｉｎｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｃｈｎｅｒ、６６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ３６６９、１９９２；Ｊａｃｋｅ ｅｔ ａｌ．、３３１ Ｎａｔｕｒｅ ２８０、１９８８；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、５５ Ｃｅｌｌ １１５９、１９８８；Ｉｎｇｌｉｓ ａｎｄ Ｂｒｉｅｒｌｙ、国際公開第９０／１４４２２号；およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ ａｎｄ Ｚａｍｅｃｎｉｋ、国際公開第８７／０９３００号により記載されるようなフレームシフトに係わるウイルス性配列（これは、本明細書に特定される優先的に翻訳される標的核酸ではない）に対する薬剤の標的化を含みはしないということを特筆する。
このようなウイルス核酸に結合し、そして／またはウイルス性メッセージの翻訳の有意な減少を引き起こすいずれかの薬剤は、本発明に有用である可能性がある。このような薬剤をスクリーニングして、それらがウイルス翻訳系に特異的であり、かつ未感染宿主細胞翻訳系に何の影響も及ぼさず、そのためこの薬剤を治療的もしくは予防的様式で使用することができるということを確認することができる。このような薬剤が宿主細胞系にいくらかの影響を有する場合であっても、これらはなおも、特にＨＩＶ−１感染のような命を脅かす疾患における治療的処置に有効であることが可能である。
このような薬剤は、標的ウイルス核酸と直接的に相互作用することができるか、あるいは宿主ＲＮＡよりはむしろウイルスＲＮＡの翻訳を亢進するためにウイルスにより用いられる蛋白質のようなウイルス翻訳系の他の構成成分（すなわち、インビボでウイルスｍＲＮＡの翻訳を起こさせる核酸および／または蛋白質のいずれにせよ宿主および／またはウイルス構成成分のものである）と結合もしくは相互作用することができるかのいずれかである。しかしながら出願者は、有用な抗ウイルス剤として更に容易に製剤することができる低分子量（１０，０００を下回る、好ましくは５，０００を下回る、そして最も好ましくは１，０００を下回る）の薬剤の同定を特に考慮している。従ってある好ましい態様においては、本発明はこのような低分子量の薬剤を特徴とする。
従って第一態様においては、本発明は、抗ウイルス剤についてのスクリーニングのための方法を特徴とする。この方法には、ウイルス感染条件下での宿主ＲＮＡに比較するウイルスＲＮＡの優先的翻訳を可能にする標的ウイルス翻訳核酸配列を提供することが含まれる。この方法は、この核酸へのある薬剤の結合を検出するための単純なアッセイを必要とすることがある。しかしながら標的ウイルス翻訳核酸配列はレポーターポリペプチドをコードするＲＮＡに翻訳的に連結されることが好ましい。次にこの方法は、その薬剤の非存在下でのレポーターポリペプチドの合成を可能にする条件下で、標的ウイルス翻訳核酸配列を有望な抗ウイルス剤と接触させることを更に含む。この方法は後に、その薬剤がレポーターポリペプチドの翻訳レベルを減少するか否かを決定することを含む。このレベルを減少させるいずれかの薬剤は有用な抗ウイルス剤である可能性がある。
具体的にはこの方法は、ウイルス感染条件下で宿主ＲＮＡと比較するウイルスＲＮＡの優先的翻訳を可能にするもしくは妨害するウイルス性もしくは細胞性構成成分と、ある有望な薬剤が相互作用を行うか否かを決定すること、ならびにその薬剤とその構成成分との相互作用がウイルスのＲＮＡの翻訳レベルを減少させるか否かを決定することを含む。
「スクリーニング」とは、大多数の有用である可能性のある薬剤が本発明の方法で処理されるある過程を意味することが好ましい。これは一般的には、単一の薬剤を詳細に研究してその作用方法を決定する単一実験とは異なる過程である。
標的ウイルス翻訳核酸配列とは、ウイルス感染条件下での翻訳に関連するＲＮＡの優先的翻訳を可能にするいずれかの核酸を意味する。このような核酸は、関連するリボ核酸のキャップ非依存的翻訳を可能にするＩＲＥＳ要素、および関連するＲＮＡのキャップ依存的な優先的翻訳を可能にするインフルエンザウイルスＲＮＡの５’非翻訳領域により例示される。
優先的翻訳とは、ＲＮＡが、ウイルス感染条件下で宿主細胞ＲＮＡより速く翻訳されるかまたはより高い収率の蛋白質で翻訳されることを意味する。その上宿主細胞ＲＮＡは、非感染条件下と比較してより遅い速度で翻訳されるかまたはより低い蛋白質収率で翻訳されるであろう。このような優先的翻訳は以下に記載されるように容易に検出することができる。大半のウイルスの場合では、ウイルス性蛋白質の優先的発現は、ウイルス性蛋白質の合成が、例えばウイルス感染化細胞におけるパルスラベル実験により検出されるように、少なくとも５０％のデノボ総蛋白質合成を表すことを意味する。このような場合、ラベル化蛋白質をゲル電気泳動により分離したときウイルス蛋白質は通常主要バンドとして区別することができる。レトロウイルスの場合ではウイルス性蛋白質の優先的発現は、合成されるウイルス性蛋白質のレベルが合成されるウイルスＲＮＡのレベルを不均衡に上回ること意味する（Ｃｕｌｌｅｎ、Ｃｅｌｌ ４６：９７３、１９８６）。このような不均衡な増加は、例えばＲＮＡ合成についてのノザンブロットおよびヌクレアーゼ保護アッセイ、ならびにラベル化蛋白質についての免疫沈降およびゲル電気泳動により、感染化細胞内におけるウイルス性ＲＮＡおよび蛋白質合成のレベルを定量することにより検出することができる。
ウイルス感染条件とは単純にウイルスの翻訳系が作動するような標的ウイルスでの感染後の宿主細胞内での条件を意味する。このようなウイルス翻訳系は通常は宿主細胞蛋白質、核酸、および他の構成成分を含む。
レポーターポリペプチドとは単純に、所定の環境条件下における比色分析シグナルか、あるいは以下に記載するような通常の当業者によく知られる幾つかの他のシグナルのいずれかを提供することにより容易に検出可能なペプチドを意味する。
好ましい態様においてはこの構成成分は蛋白質もしくは核酸であり、この構成成分はウイルスによりコードされるかもしくは宿主細胞によりコードされ、この構成成分はＲＮＡ配列ドメイン、ＤＮＡ配列ドメイン、開始因子および伸長因子、停止因子、転写因子、リボソーム蛋白質、グリコシラーゼ、デグリコシラーゼ、ピレニル化および脱ピレニル化用酵素、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、シンセターゼ、ＡＤＰリボシル化用酵素、ＡＤＰリボシラーゼ、キナーゼ、リパーゼ、ミリスチル化もしくは脱ミリスチル化用酵素、ホスホリラーゼ、プロテアーゼ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボヌクレアーゼ、およびデオキシリボヌクレオアーゼから選択される巨大分子であり、ウイルス翻訳シグナル核酸配列は、ＩＲＥＳ要素、５’もしくは３’非翻訳領域、および上流読み取り枠、もしくは宿主細胞がウイルスにより感染する際の宿主細胞ｍＲＮＡに勝るウイルスｍＲＮＡの優先的翻訳を可能にするいずれかの他のウイルス標的翻訳核酸からなる群より選択され、そしてシグナルが選択されるウイルスは、ピコルナウイルスファミリー、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、およびサイトメガロウイルスから選択される。
他の好ましい態様においては、配列ドメインはレポーターポリペプチドをコードするＲＮＡに翻訳的に連結されており、そして第二決定段階はその薬剤がレポーターポリペプチドの翻訳レベルを変化させるか否かを決定することを含み、この構成成分は蛋白質もしくはポリペプチドであり、そしてこの決定段階は翻訳混合物中の構成成分にレポーターポリペプチドをコードするＲＮＡを提供すること、およびその薬剤がこのミックス中のそのレポーターポリペプチドの発現を変化させるか否かを決定することを含む。
より好ましい態様においては、この方法は更に、先の方法で活性な薬剤が非感染ウイルス宿主細胞の翻訳機構にほとんど影響を及ぼさないもしくは全く影響を及ぼさないか否かを決定し、そして更にその薬剤がインビボ条件下で活性であるか否かを決定することを含む。このような薬剤をその後に薬剤学的に許容される緩衝液中で製剤する。
薬剤学的に許容される緩衝液とは、保存およびその後の投与のために調製される薬剤学的組成物中に用いることができ、薬剤学的に許容される担体もしくは賦形剤中に本明細書に記載される薬剤の薬剤学的有効量を含むいずれかの緩衝液を意味する。治療的使用のための許容される担体もしくは賦形剤は薬剤学的技術においてよく知られており、かつ例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ、１９８５）に記載される。保存料、安定化剤、色素、および矯味・矯臭剤さえもこの薬剤学的組成物中に提供することができる。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを保存料として添加することができる。同書物の１４４９ページ。その上酸化防止剤および懸濁用試薬を使用することができる。同書物。
第二態様においては、本発明は、ウイルス翻訳シグナル核酸配列を有するウイルスに感染している被検体を、ウイルス翻訳シグナル核酸配列に生来関連するウイルスＲＮＡの翻訳を選択的に遮断することが可能な抗ウイルス剤の治療学的有効量をその被検体に投与することにより治療するための方法を特徴とする。
「治療学的有効量」とは、患者の疾患もしくは状態の内の一つもしくは複数の症状を緩和する（ある程度）量を意味する。その上「治療学的有効量」とは、ウイルス性疾患に関連するか、あるいはその原因である生理学的もしくは生化学的パラメータを部分的かもしくは完全かのいずれかで正常にもどす量を意味する。
一般的にはこれはその分子の約１ｎモルと１＿モルの間の量であり、そのＥＣ₅₀、ならびに患者に関連する年齢、サイズ、および疾患に依存する。
第三の関連態様においては、本発明は、先に記載される方法により発見される新規の抗ウイルス剤を特徴とする。この態様はまた、先に記載されるように発見され、かつ薬剤学的に許容される製剤中に製剤される抗ウイルス剤を含む新規の薬剤学的組成物をも含む。
第四態様においては、本発明は、抗ウイルス剤を発見するためのレポーターコード化配列に翻訳的に連結される単離ウイルス核酸を含む核酸構築物の使用、および抗ウイルス剤スクリーニング方法におけるこれらの構築物の使用のためのキットを特徴とする。
第五態様においては、本発明は、ウイルスｍＲＮＡ翻訳系に関連する他の非核酸巨大分子の活性を調節する活性について抗ウイルス剤をスクリーニングする方法を特徴とする。例えば、薬剤をスクリーニングするための方法には、ある細胞中のｐ６８キナーゼにその活性を発現させることができる試薬を例とするように、そのような巨大分子の活性を妨害するという点で巨大分子を阻害するのに役立つものを同定することを含む。本発明はまた、真核生物宿主細胞内のウイルスの複製を阻害するためにそのような薬剤を利用する方法を特徴とする。
従って本発明は宿主真核生物細胞内におけるウイルス複製を阻害する方法を含み、この場合例えばこのウイルスは、宿主細胞のインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼの活性化を妨害するウイルス性インヒビターを産生する。この方法は、細胞に対して、プロテインキナーゼの活性化を妨害するという点でのウイルス性インヒビターの効果を遮断することが可能な薬剤を投与することを含む。
関連態様においては、本発明は、プロテインキナーゼへの二本鎖ＲＮＡの結合を遮断することが可能なウイルス性インヒビターを産生するウイルスを特徴とし、そして投与される薬剤は、プロテインキナーゼへのウイルス性インヒビターの結合を遮断することが可能なものである。
この薬剤は、例えば、プロテインキナーゼ、ウイルス性インヒビター、およびその薬剤からなる混合物を形成し、その混合物の構成成分をウイルス性インヒビターの非存在下でのそのプロテインキナーゼの自己リン酸化に有効な条件下でインキュベートし、そのプロテインキナーゼ活性の存在についてその混合物を調査し、そしてその薬剤がプロテインキナーゼ活性の阻害を妨害可能である際にはそれを選択することにより、選択することができる。
具体的態様においては、このウイルスがアデノウイルスであり、かつウイルス性インヒビターがＶＡＩ ＲＮＡ分子（ＶＡ１およびＶＡ ＲＮＡ_Iとしても知られる）であり；このウイルスがヒトの免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）であり、かつウイルス性インヒビターがＨＩＶゲノムのＴＡＲ領域であり；そしてこのウイルスがエプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルスであり、かつウイルス性インヒビターがＥＢＥＲ−１ ＲＮＡである。
他の関連態様においては、ウイルス性インヒビターは、活性化形態においてプロテインキナーゼの活性化を遮断することができるか、あるいは既に活性化されているプロテインキナーゼの活性を遮断することが可能である宿主細胞のｐ５８蛋白質を活性化するのに有効であり、そしてこの薬剤はｐ５８蛋白質を介するキナーゼに対するウイルス性インヒビターの相互作用を遮断するものである。この薬剤は例えば、プロテインキナーゼ、ｐ５８蛋白質（活性形態）、およびその薬剤からなる混合物を形成し、そしてその後にその混合物の構成成分をｐ５８蛋白質の非存在下でのそのプロテインキナーゼを自己リン酸化するのに有効な条件下でインキュベートし、その混合物をプロテインキナーゼ活性の存在について調査し、そしてその薬剤がｐ５８が存在する際にプロテインキナーゼ活性の阻害を減少することが可能である場合にそれを選択することにより、選択することができる。
他の関連態様においては、本発明は、宿主真核生物細胞内でのウイルス複製を阻害するのに有効な薬剤をスクリーニングするための方法を含み、この場合ではウイルスは、宿主細胞のインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼの活性化を妨害するウイルス性インヒビターを産生することが可能であるものである。この方法は、そのプロテインキナーゼ、ウイルス性インヒビター、およびその検査されるべき薬剤を含む混合物を、そのウイルス性インヒビターがそのプロテインキナーゼの活性化を妨害するのに有効な条件下でインキュベートし、そして混合物におけるそのような妨害についての調査を行うことを含む。
他の関連態様においては、本発明の方法を、活性化形態においてはプロテインキナーゼの自己リン酸化を遮断するか、あるいはリン酸化されているキナーゼの活性を遮断するのに有効であるｐ５８宿主蛋白質を活性化するのに有効であるウイルス性インヒビターを産生するウイルスのウイルス複製を遮断するのに有効な薬剤をスクリーニングするのに使用する。ここでは形成される混合物はｐ５８宿主細胞蛋白質を含み、インキュベーション段階をこのプロテインキナーゼがｐ５８の非存在下で自己リン酸化されるであろう条件下で実施し、そしてこの混合物をプロテインキナーゼ活性の阻害の減少について調査する。
更に他の好ましい態様においては、本発明の方法は、（ｉ）ウイルスｍＲＮＡ構築物（このｍＲＮＡ構築物は（ａ）内部リボソーム貫入部位（ＩＲＥＳ）領域およびそのＩＲＥＳ領域の下流、第一レポーター蛋白質コーディング領域を含む）、（ｉｉ）リボソーム、および（ｉｉｉ）検査されるべき薬剤を含む蛋白質翻訳混合物を形成し、その翻訳混合物の構成成分を第一レポーター蛋白質コーディング領域からレポーター蛋白質を産生するのに有効な条件下でインキュベートし、そしてその混合物をこのような翻訳混合物により産生されるレポーター蛋白質の存在について調査することを含み、そしてこの薬剤の存在下で産生されるレポーター蛋白質がテスト薬剤の非存在下で産生されるレポーター蛋白質の量を下回る場合にはこの薬剤は有用な抗ウイルス剤である。
このＩＲＥＳ領域がピコルナウイルスのＩＲＥＳ領域配列から取得され、このＩＲＥＳ配列が、エンテロウイルス、リノウイルス、カルジオウイルス、およびアフトウイルスのＩＲＥＳＡ配列からなる群より選択され、このＩＲＥＳ領域が、Ａ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列、Ｂ型肝炎ウイルス配列、およびＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ配列からなる群より選択され、この蛋白質翻訳混合物が無細胞抽出物であり、ウイルスｍＲＮＡ構築物の５’末端が真核生物のｍＲＮＡの５’末端キャップおよび非翻訳領域（ＵＴＲ）、ならびにそのキャップおよびＵＴＲ領域の下流、第二レポーター蛋白質を含み、そしてその翻訳混合物が、ある細胞中に含まれることが好ましい。
関連態様においては、この薬剤は宿主真核生物細胞内のウイルス複製を阻害するのに有効であり、この場合この宿主細胞は宿主細胞のインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼの活性化を妨害するインヒビターを産生し、そしてこの方法は、プロテインキナーゼ、インヒビター、および検査されるべき薬剤を含む混合物を、インヒビターがプロテインキナーゼの活性化を妨害するのに有効な条件下でインキュベートし、そしてその混合物をそのような妨害について調査することを含む。
この方法が、活性化形態においてはプロテインキナーゼの活性もしくは活性化を遮断するのに有効なｐ５８宿主細胞蛋白質を活性化するのに有効なインヒビターを産生するウイルスのウイルス複製を遮断するのに有効な薬剤をスクリーニングすることにおける使用のためのものであり、そして形成される混合物がｐ５８宿主細胞蛋白質を含み、そしてインキュベーションをこのプロテインキナーゼがｐ５８の非存在下で活性化される条件下で実施し、そして調査はプロテインキナーゼ活性の阻害についてのその混合物の調査を含むことが好ましい。
本発明の他の特徴および利点は本発明の好ましい態様の以下の記載、および請求の範囲から明らかになるであろう。
図面の簡単な記載
図１は、アデノウイルスＶＡＩ ＲＮＡの末端ステム、中央ドメイン、および先端ステムループを示す（ＭＡ、Ｙ．およびＭ．Ｂ．Ｍａｔｈｅｗｓ．１９９３。Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＲＮＡｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６０５−６６１７）。
図２は、ＶＡＩ ＲＮＡの相補配列に対してアニールされるアンチセンスＶＡ（ａｖａ）オリゴデオキシヌクレオチド種ａｖａ１、ａｖａ２、ａｖａ３、およびａｖａ９を示す。
図３は、アンチセンス種および相補的ＶＡＩ ＲＮＡ領域、すなわちＶＡＩ ＲＮＡアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の配列を示す。
図４は、インビトロ翻訳アッセイの結果を示す。カラム１：（−）ｍＲＮＡ；
カラム２：（＋）ｍＲＮＡ；カラム３：（＋）ｍＲＮＡ、（＋）レオウイルスｄｓＲＮＡ；カラム４：（＋）ｍＲＮＡ、（＋）レオウイルスｄｓＲＮＡ、（＋）ＶＡＩ ＲＮＡ。カラム５〜９：（＋）ｍＲＮＡ、（＋）レオウイルスｄｓＲＮＡ、（＋）ＶＡＩ ＲＮＡ、ならびに以下のアンチセンス：カラム５：ａｖａ１；カラム６：ａｖａ２；カラム７：ａｖａ３；カラム８：ａｖａ９；カラム９：ａｖａ１５。
図５は、ヒトのリノウイルス１４の５’ＮＴＲ配列および予想される二次構造を示す（Ｌｅ、Ｓ．−Ｙ．、ａｎｄ Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１６、７２９−７４１）。ヌクレオチド（「ｎｔ」）６２５におけるポリ蛋白質のための開始用ＡＵＧ開始コドンを影付きボックスとして示し、非開始用ＡＵＧコドンを影なしボックスとして示す。ピコルナウイルスの全てのＩＲＥＳ要素内に見いだされるＹｎＸｍＡＵＧモチーフ、ならびにリノウイルスおよびエンテロウイルスの全てのＩＲＥＳ要素内に見いだされる２１塩基の保存配列に下線を施してある。リノウイルスゲノム上のヌクレオチドの位置に番号による印を付けてある。
図６は、インビトロ翻訳研究のために用いられるｍＲＮＡの該略図を示す。Ａ）ＣＡＴレポーター遺伝子の翻訳から得られる＿−グロビンの５’ＮＴＲを含むｂＣＲＬ ｍＲＮＡ、およびルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳から得られるリノウイルスのＩＲＥＳ。Ｂ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳から得られる＿−グロビンの５’ＮＴＲを含むｂＬ ｍＲＮＡ。実線は指示されるように、＿−グロビンの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）、リノウイルスのＩＲＥＳ、もしくは３’ＮＴＲを表す。ボックスはレポーター遺伝子ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）およびルシフェラーゼを表す。
図７は、ｂＬｕｃおよびｂＣＲＬ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳を示す。翻訳反応は、Ｌｅｅ、Ｋ．Ａ．Ｗ．、ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎ．（１９８２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７９、３４４７、により記載されるように二重検査で実施した。レーンＭ、標識蛋白質；レーン１〜２、ｍＲＮＡなし；レーン３〜４、ｂＬ ｍＲＮＡ；レーン５〜６、ｂＬ ｍＲＮＡとアンチ−ＩＲＥＳ−オリゴ：レーン７〜８、ｂＣＲＬ ｍＲＮＡ；レーン９〜１０、ｂＣＲＬ ｍＲＮＡとアンチ−ＩＲＥＡＳ−オリゴ。ルシフェラーゼおよびＣＡＴ翻訳産物に対応するバンドを、３０、４６、および６９ｋＤａの蛋白質マーカーと共に示す。
図８は、アンチセンス（アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴ）および対照（対照−オリゴ）デオキシオリゴヌクレオチドの非存在および存在下でのｂＬおよびｂＣＲＬ ｍＲＮＡの翻訳反応のルシフェラーゼ活性アッセイを示す。翻訳反応およびルシフェラーゼ活性アッセイは本文中に記載されるように実施した。２つの個別の複製物からの相対的光単位の平均値を求め、そしてｂＬおよびｂＣＲＬ翻訳物からのルシフェラーゼ活性を比較のために１００に標準化した。翻訳反応は、レーン１、ｍＲＮＡなし；レーン２、ｂＬ ｍＲＮＡ；レーン３、ｂＬ ｍＲＮＡとアンチ−ＩＲＥＳ−オリゴ；レーン４、ｂＬ ｍＲＮＡと対照−オリゴ；レーン５、ｂＣＲＬ ｍＲＮＡ；レーン６、ｂＣＲＬ ｍＲＮＡとアンチ−ＩＲＥＳ−オリゴ；レーン７、ｂＣＲＬ ｍＲＮＡと対照−オリゴ、を含む。
好ましい態様の説明
抗ウイルス剤
細菌のような一層複雑な生物体により生じる感染を治療するのに利用可能な多大な数の薬物があるとすると、いかに少数の薬物がウイルスとして知られる比較的単純な生物体の感染を治療するのに利用可能であるかが明白となるる。実際に、大半のウイルス性疾患は本質的には未治療のままである。抗ウイルス剤の開発における主要な難題は、細菌とは異なり、ウイルスは宿主細胞内で複製し、そしてそれらの細胞の機構を複製のために利用して、それらの宿主と多くの栄養要求性および合成経路を共有することである。その結果、宿主までを害することなくウイルスの複製を撲滅もしくは停止させる薬剤を同定することは困難である。ヒトにおける使用のために認可されている抗ウイルス剤でさえも、それらの利用性を制限する副作用を有することがしばしばである。
現存する抗ウイルス剤の大部分のものがヌクレオシドアナログ、あるいはヌクレオシドキナーゼあるいはポリメラーゼもしくはリバーストランスクリプターゼのような、ウイルス性遺伝物質の新しいコピーを産生するのに必要な酵素を介してそれらの効果を働かせる他の薬剤である。これらのアナログは典型的にはヌクレオチドアナログへと代謝され、これは例えばポリメラーゼを阻害するか、もしくはウイルス核酸の増殖の未成熟な鎖停止を生じることによリウイルス核酸の産生を阻害する。しかしながらウイルスと細胞の核酸代謝は非常に類似するため、ある程度宿主細胞酵素により用いられることがない抗ウイルス剤を発見することは困難である。このことが耐性であることが可能な抗ウイルス剤の用量を制限し、このことが次にはこの薬物の利用性を制限する可能性がある。
ある薬物が有効用量で耐性を示す場合においてさえ、その有効性は、比較的迅速に突然変異を起こして同じように有効にはその薬物を利用せず、またはその薬物によりさほど阻害されない新版のウイルス酵素を進化させるウイルスの能力により著しく減少されることがある。
従って宿主による耐性が示される用量で効果的であり、かつウイルスにとって突然変異による回避を行うことがより困難であろう新規の抗ウイルス剤についての明確な必要性が存在する。
本発明は、このような薬物を発見するため、かつ発見した薬物で疾病を治療するための新規の方法を提供する。本発明の方法は、ウイルスが感染する細胞内での蛋白質合成（メッセンジャーＲＮＡの翻訳）の制御を多くのウイルスが借用するという所見に基づく。ウイルス性蛋白質は感染化宿主内において宿主蛋白質に勝って優先的に合成される。ウイルス性蛋白質のこの優先的合成はウイルスの複製にとって重要である。従って、蛋白質合成のウイルスの借用を減少もしくは予防する薬物が有効な抗ウイルス剤である。
このような薬物は現行の抗ウイルス剤に勝る有意な利点を有する。先に記載するように、後者の大部分のものにとっての標的はウイルス核酸の合成に必要とされる酵素であり、そして宿主もまた核酸合成に作用する酵素を含むため、宿主のものをも攻撃することなくウイルスの酵素を攻撃することは困難である。類似の問題が、ウイルスおよび宿主細胞の両方により必要とされる物質の合成における活性触媒であるいずれかの薬剤標的について生じるらしい。本発明の方法においては、その薬剤の標的は合成経路内の活性触媒ではないために、これらの問題は回避される。それらの標的は、そのような経路内の触媒よりはむしろ合成経路（蛋白質合成）への優先的接近を確実に行うためウイルスにより用いられる装置である。ウイルスの宿主の攻撃の際にウイルスにより用いられる武器として、これらの装置は宿主内に類似物を有さない。従って、これらの装置を妨害する薬物は宿主において最少の副作用を有する。
このような薬物は、２つの理由のために現行の薬物よりも更に有効である。第一に、これらの最少副作用は、それらより高い用量でこれらを使用することを可能にする。第二に、これらの薬物は、その標的が宿主相同物を有する薬剤について耐性であるよりはそれらの標的に対して本質的により障害的であることが可能であり、これは後者の薬剤の障害性が本質的に強すぎる場合には、それらは宿主相同物をある程度害することがあるためである。
ウイルスはまた、ウイルスの翻訳略奪装置を標的にする薬物に対する抵抗性を進化させることがさほど可能ではない。これらの装置は蛋白質合成に関連する宿主細胞構成成分との相互作用を必要とするはずであり、そしてこれらの相互作用を保持することの必要性は、ウイルスはそれらがその略奪用装置を突然変異させることが可能な範囲内にウイルスが制限されることを意味する。ウイルスがある薬剤を回避するために余りにもかけ離れて突然変異する場合には、ウイルスはもはや蛋白質合成を略奪することができないであろう。この制限はウイルスにとっては殊に問題となるものである。これは先に記載するように、略奪遮断剤は本質的にその標的に対して一層障害的である可能性があるため、ウイルスは略奪遮断剤を回避するためには、その標的が宿主相同物を有する合成酵素である薬物を回避するよりは一層大きな変化を必要とする可能性があるためである。
まとめると、本発明は現行のこのような薬物に勝る重要な利点、すなわち一層少ない副作用を有し、耐性ウイルスの進化の可能性が少ない新規の抗ウイルス剤を発見および利用するための手段を提供する。
本発明の方法は、多くのウイルスはそれらが感染する細胞内の蛋白質合成の過程（ｍＲＮＡの翻訳）の調節を借用するという所見に基づく。ウイルスは、ウイルスＲＮＡの優先的翻訳を確実にする特別なウイルス核酸配列の使用（例えば、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ、８、１１０３−１１１２、１９８８；Ｔｒｏｎｏ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１、４４５−４４８；Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ ＆ Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈ、１９９０；Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ ＆ Ｋａｔｚｅ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７、９３８３−９３９０、１９９２、を参照せよ）、これらの特別な配列との相互作用への細胞性蛋白質の補充（例えば、Ｊａｎｇ ＳＫ ＆ Ｗｉｍｍｅｒ Ｅ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．４、１５６０−１５７２、１９９０、を参照せよ）、翻訳もしくはその調節に関与する宿主細胞構成成分の修飾もしくは分解（例えば、Ｋａｔｚｅ ＭＧ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６２、３７１０−３７１７、１９８８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、６２０８−６２１２、１９９０、を参照せよ）、ならびに感染に反応して開始する細胞性防御の無能化（例えば、Ｋａｔｚｅ ＭＧ、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．１２、２４１−２４８、１９９２、を参照せよ）、を初めとするがこれらには限定されない多様な機構を使用してこの借用を実施する。感染化細胞中の宿主細胞蛋白質と比較してウイルス蛋白質の優先的翻訳を確実にするためウイルスにより使用されるいずれかのこのような機構に本発明の方法を対応させることができる。
これらの方法は、ウイルスにより用いられる、（ｉ）ｐ６８プロテインキナーゼおよびインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼを初めとする多様な名称により知られる宿主酵素のウイルス妨害、および（ｉｉ）ウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因となるウイルス核酸配列、の２つの機構の記載により本明細書に例示される。これらの例の使用は、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
ｐ６８プロテインキナーゼとして知られる蛋白質はインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼである。このキナーゼは、典型的にはウイルス感染化細胞内に見いだされる二本鎖ＲＮＡにより活性化される。いったん活性化されたら、このキナーゼは開始因子ｅＩＦ−２のアルファーサブユニットをリン酸化し、この現象は迅速に翻訳の開始段階を遮断するに至る。この効果は細胞中の蛋白質合成を遮断して細胞を死に追いやることであり、これは多細胞感染化生物体は耐えられるが、ウイルスは耐えられないものである。感染化細胞中の継続的翻訳を確実に行うためには、様々なウイルスがｐ６８キナーゼの活性化を回避もしくは中和する様々な機構を進化させている（Ｋａｔｚｅ、１９９２、中に総説が書かれている）。これらには、アデノウイルス（Ｍａｔｈｅｗｓ ＭＢ ＆ Ｓｈｅｎｋ Ｔ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５、５６５７−５６６２、により総説が書かれている）、ＨＩＶ（Ｅｄｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ ５６、３０３−３１２、１９８９；Ｇｕｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７、８６８７−８６９１、１９９０；Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５、６３２−６４０、１９９１）、およびエプスタイン−バールウイルス（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １９３、６３５−６４１、１９９０；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、２４３−２４８、１９９１）により用いられ、そのキナーゼに結合し、かつ二本鎖ＲＮＡ活性化因子の結合を回避させるウイルス性ＲＮＡ、ワクシニアウイルスおよびレオウイルス（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８５、２０６−２１６、１９９１；Ｉｍａｉ ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、７８８７−７８９１、１９８８）により用いられ、二本鎖ＲＮＡに結合し、かつそのキナーゼへの結合を防止するウイルス性蛋白質、ワクシニアウイルス（Ｂｅａｔｔｉｅ ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８３、４１９−４２２、１９９１）により用いられ、そのキナーゼの偽基質として作用するウイルス性蛋白質、インフルエンザウイルス（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，１９９０）により用いられ、そのキナーゼの活性化を遮断し、かつ活性キナーゼを阻害するための細胞性蛋白質ｐ５８の補充、ならびにポリオウイルス（Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６７、７９１−８００、１９９３）により用いられ、ｐ６８を分解するＲＮＡ（可能であればウイルス性の二本鎖ＲＮＡ）との複合体への細胞性蛋白質の補充が含まれる。
ウイルスと相互作用する、先程記載されたｐ６８ならびにＲＮＡおよび蛋白質は、感染化細胞内の翻訳の調節のウイルスによる占領および抑留において必要とされることが示されている広域な種類の巨大分子の例である。本発明は、この広域な種類内に含まれる他の巨大分子をも同様に適用する。当業者には、他のこのような巨大分子を同定すること、およびウイルスとこれらの巨大分子との間の相互作用を回避もしくは調節することが可能な化合物を選択するための方法を設計することを当業者に可能にさせる多様な方法が利用可能である。一般的には、必要とされるこれらの段階は、翻訳が感染中に所定のウイルスにより調節されているか否かを確認すること、翻訳への影響を媒介する特異的巨大分子（一つもしくは複数）を同定すること、関連する他の細胞性および／またはウイルス性構成成分を同定すること、これらの化合物間の相互作用の特徴を決定すること、ならびにこの相互作用の破壊もしくは調節を検出することができるスクリーニング方法を設計することを含む。これらの段階の具体的詳細をここでこれ以降に示す。用いられる方法の内の多くのものは、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、（ｅｄｓ） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、のような引用文献内に収められている。
ウイルスが翻訳に影響を及ぼすことの決定
特別なウイルスによる感染中に翻訳が影響を受けるか否かを決定するためには数々の方法を用いることができる。感染化および非感染化細胞内での蛋白質合成の全体的速度は、このような細胞をラベル化アミノ酸の存在下でインキュベートし、そしてこのラベル化前駆体の蛋白質内への取り込みを測定することにより測定することが可能である。ラベル化アミノ酸は典型的には、［³⁵Ｓ］メチオニン、［³⁵Ｓ］システイン、［³Ｈ］ロイシン、もしくは［¹⁴Ｃ］ロイシンのような放射活性同位体原子を含むものであることができ、そしてその利用に続き、典型的に、トリクロロ酢酸沈殿可能蛋白質内への放射活性の取り込みを測定することが可能である。蛋白質合成の全体的速度と同様に、開始および伸長のような翻訳の個々の段階の速度を、ポリソームプロフィルおよび推移時間決定のような標準的な方法を用いて測定することができる。未処理細胞を放射ラベル化基質と共にインキュベートすることの別法として、抽出物を未感染化および感染化細胞から作成し、そしてこれらの基質と共にインビトロ翻訳に利用して、内因性ｍＲＮＡもしくはその細胞抽出物に添加されるテストｍＲＮＡの翻訳を調査することができる。
翻訳におけるウイルスの効果に関する追加的な重要情報を、未感染化および感染化細胞において産生される蛋白質の種類および相対量を調査することにより取得することができる。このことは、これらの細胞を、先に記載する放射ラベル化アミノ酸の存在下でインキュベートし、そしてその後にポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して得られる放射ラベル化蛋白質を分離することにより達成することができる。分離された蛋白質をオートラジオグラフィーによるか、あるいはホスホルイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ）装置を用いて検出し、そして電気泳動中、同じポリアクリルアミドゲル上に含まれる既知の分子量の標準ラベル化蛋白質との比較により分析することができる。速度決定の場合におけるのと同様に、蛋白質合成のこれらの研究を、未処理細胞それ自体ではなく細胞から作成される抽出物を使用して実施することもできる。
巨大分子の同定
研究中のウイルスでの感染により翻訳が影響を受けていることの証拠をいったん取得したら、翻訳もしくはその調節過程において直接的もしくは間接的に関与することが知られる全ての巨大分子の活性および濃度を未感染化および感染化細胞、ならびに／またはそのような細胞から作成される抽出物中で比較することができる。取得される証拠が、開始もしくは伸長のような特定の翻訳段階における影響を指摘する場合には、最初にこの段階に関与することが知られる巨大分子に注意が向くであろう。
翻訳におけるウイルスの影響に関与する構成成分を同定する他の研究法は、未感染化および感染化細胞から抽出物を作成し、そしてこれらの抽出物をインビトロ翻訳反応における影響を示す能力に基づいて分画化することである。すなわち、未感染化および感染化細胞からの抽出物を最初にインビトロ翻訳反応物内に並列に、しかし別々に添加し、そしてそれらの反応におけるそれらの抽出物の影響を比較する。その後にこの２つの種類の抽出物を当業者に知られる種々の方法を用いて並行して分画化し、そしてこの２つの抽出物からの対応分画をインビトロ翻訳反応におけるそれらの効果について並行して検査する。感染化細胞からの翻訳影響性構成成分を含むことが見いだされた分画をその後に、未感染化細胞からの対応する分画と並行して更に分画化し、そしてこの次回の分画化から取得される新規の分画もやはりインビトロ翻訳反応において検査する。この分画化およびテスト過程の反復繰り返しは、最終的に、翻訳に対するウイルスの観素される効果に関連する構成成分（一つもしくは複数）を含む感染化細胞からの比較的精製された分画を提供する。
関連する他の構成成分の同定
翻訳上のウイルス効果の詳細な調査は、しばしばその活性もしくは濃度がウイルス感染中に調節される一つもしくは複数の細胞性構成成分を明らかにすることができる。例えばそれは、感染化細胞内で分解されるか、あるいはリン酸化、脱リン酸化、そうでなければその活性を変化させる方式で修飾化される開始因子、もしくは伸長因子、あるいはそれらのサブユニットを同定することができる。いったん一つのこのような効果が観察されたら、その効果は関与する追加的な細胞性および／またはウイルス性構成成分を同定するための更に別の調査のための方法を指摘する。
翻訳における影響の原因となるウイルス性構成成分の同定は、天然に存在する突然変異体もしくは研究室で作成される突然変異体のいずれかである突然変異体ウイルスを調査することにより容易に行うことができる。後者は、突然変異誘発剤での化学的処理ならびにウイルス遺伝子もしくはウイルスゲノム内に挿入、置換、欠損、および点突然変異を作成するための分子生物学的技術の使用を初めとするがこれには限定されない当業者に知られる多様な方法により構築することができる。ウイルスと宿主細胞との翻訳の間の相互作用における多様な突然変異体の影響をその後に評定することができる。特別な突然変異体がウイルスが翻訳に及ぼす影響（一つもしくは複数）を変化もしくは消滅させる場合には、このことは、突然変異が生じる遺伝子もしくはゲノムはこれらの効果を媒介する上で重要であることの強い証拠を提供する。
突然変異分析なしでさえも、インビトロ転写および翻訳方法を使用して、ウイルスゲノムもしくはＲＮＡ、あるいはそれらのサブセットもしくは断片、あるいはそのような分子の翻訳産物の添加が翻訳に影響を及ぼすか否かを決定することができる。
翻訳における影響に関与するウイルス構成成分はまた、個々のウイルス性構成成分もしくはそれらをコードする遺伝子／ｃＤＮＡ、あるいは構成成分もしくは遺伝子／ｃＤＮＡの断片をインビトロ翻訳反応ではなく未処理細胞内に導入することにより同定することもできる。
この記載から、ウイルス感染化細胞において調節されていることが見いだされている構成成分と相互作用するウイルス性および細胞性構成成分を同定するためには多種多様な方法が当業者に利用可能であることが明らかである。
構成成分間の相互作用
翻訳に影響を与える細胞性およびウイルス性構成成分間の相互作用の特徴決定を行うためには多くの異なる方法が利用可能である。ｐＨ、イオン強度、温度、存在するアニオンおよびカチオンの性質および混合物、２つの構成成分の相対的濃度、これらの構成成分の絶対的濃度、補因子の利用可能性、エネルギー源の利用可能性、脂質、核酸、炭水化物、他の蛋白質、および／または他の添加物の存在もしくは非存在を変化させるこのような相互作用の感受性は全て、構成成分間の相互作用の特徴についての情報を提供することができる。一つもしくは両方の構成成分における切断、添加、置換、欠損、反転、および点突然変異の影響も有益である。これらの構造の変化を既に記述した一連の方法においてテストして、それらの変化が異なる構成成分間の相互作用および／または翻訳におけるこれらの構成成分の影響を変化もしくは廃止させるか否かを決定することができる。
有望な薬剤をスクリーニングするための方法
有望な薬剤を、翻訳におけるウイルス効果を破壊もしくは調節するそれらの能力についてスクリーニングするための方法を、ウイルス性および細胞性構成成分間の厳密な相互作用の詳細な知識なしでも設計することができるが、このような知識は確かに役に立つことが可能である。広域な範疇のインビトロでの選択方法においては、数々の種類の方法がテスト薬剤をスクリーニングするのに特に簡便および／または有用であるように思われる。これらは、二つもしくはそれを上回る数の構成成分間の結合相互作用を測定する方法、相互作用を行う構成成分の内の一つである酵素の活性を測定する方法、ならびにこれらの構成成分の内の一つの調節下に置かれている「レポーター」蛋白質、すなわちある酵素あるいは他の検出可能もしくは選択可能な蛋白質の活性もしくは発現を測定する方法を含むが、これらに限定はされない。
このようなアッセイにおけるレポーターとしての使用に適する蛋白質には、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼ、および分泌される胎児のアルカリホスファターゼのような容易にアッセイされる酵素、ホルモンおよびサイトカインのような免疫アッセイのために容易に利用可能な蛋白質、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ遺伝子の産物）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＨＡＴ培地と共に使用する場合）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）のような、選択的増殖上の利点を細胞に付与する蛋白質、ならびに栄養要求性突然変異体から失われている生合成能を提供する蛋白質、チミジンキナーゼ（ブロモデオキシウリジンを含む培地と共に用いる場合）、およびオロチジン−５’−リン酸エステルデカルボキシラーゼ（５−フルオロオロト酸と共に用いる場合）のような非毒性基質を毒性産物へと転化する酵素を例とする増殖上の欠点を細胞に付与する蛋白質、ならびにリシン、コレラ毒、もしくはジフテリア毒のような毒素である蛋白質を含むが、これらには限定されない。
前述の記載から、翻訳におけるウイルス効果に関与する構成成分の同定、これらの構成成分間の相互作用の特徴決定、およびこれらの構成成分間の相互作用を調節もしくは廃止する構成成分を選択するためのスクリーニングテストの実施における各段階では、当業者は多種多様な方法からの選択を行うことが可能であることが明白である。
プロテインキナーゼ
以下の記載は、本発明において有用な具体的スクリーニングプロトコールおよび関連プロトコールの更に詳細な概略である。ここの文節では、宿主真核生物細胞内でウイルス複製を阻害するのに有効な薬剤をスクリーニングするための方法を記載する。一つの詳細な実施例としては、選択される系は、ウイルスが、宿主細胞のインターフェロン誘導化二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼの活性を妨害するウイルス性インヒビターを産生することが可能であるものである。しかしながら先に記載するように、この実施例は本発明内における制限ではなく、そして単に本発明の広域な範囲を例示するに過ぎない。
この方法は一般的に、プロテインキナーゼ、ウイルス性インヒビター、およびテストされるべき化合物を、そのプロテインキナーゼの活性化のウイルス性インヒビター妨害を生じるのに有効な条件下でインキュベートし、そして妨害についてその混合物を調査する段階を含む。
Ａ．化合物のためのインビトロでのスクリーニング
ある実施例では、
インキュベーション段階は、ウイルス性インヒビターの非存在下でｐ６８キナーゼを活性化するのに有効な条件下でその混合物をインキュベートすることを含み、そして調査段階は、このインヒビターの存在下でのｐ６８キナーゼの活性を調査することを含む。
インキュベーションは、例えば精製もしくは部分精製されたｐ６８キナーゼ調製物を用いて実施することができ、そして調査段階は、そのキナーゼの自己リン酸化、あるいはそのキナーゼに対して提供されるｅＩＦ２−アルファーもしくはヒストン基質のリン酸化を測定することを含む。
別法ではインキュベーションを、ｐ６８キナーゼを含むインビトロ翻訳混合物中で実施することができ、そして調査段階が、特異的ｍＲＮＡの翻訳により産生されるレポーターポリペプチドの量を測定すること含む。第三の例においてはこの方法を、活性化形態においてはこのプロテインキナーゼの活性化を遮断するか、あるいは活性化されているキナーゼを阻害することが可能な宿主細胞構成成分を活性化するのに有効なウイルス性インヒビターを産生するあるウイルスのウイルス複製を遮断するのに有用な化合物をスクリーニングするために用いる。ここでは形成される混合物は宿主細胞構成成分（活性化形態をとる）を含み、インキュベーション段階を、活性化構成成分の非存在下でそのプロテインキナーゼが活性化される条件下で実施し、そして調査段階が、プロテインキナーゼ活性の阻害についてその混合物を調査することを含む。
以下に示す実施例は、先に記載されるスクリーニング方法をより詳細に説明するが、決して本発明の範囲を制限することを意図するのではない。
実施例１：組換え大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞からのｐ６８プロテインキナーゼの調製
ｐ６８は、ヒトのｐ６８キナーゼを発現する大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から、公開される方法（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０３５６）に従って調製される。簡潔に記載すると、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを、誘導可能プロモーターの調節下で野生型ｐ６８プロテインキナーゼのためのコーディング配列を含むプラスミドで形質転換させる。得られる大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株を対数期まで増殖させ、その後に誘導化を行ってｐ６８キナーゼを発現させる。細胞を遠心により収集し、そしてリゾチームにより溶菌させる。ｐ６８キナーゼを、公開される方法（Ｇａｌａｂｒｕ ｅｔ ａｌ．、１９８９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：５８１）に従って、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に結合されるｐ６８キナーゼに対するモノクローナル抗体を使用する親和性クロマトグラフィーによりその溶菌液から精製する。
実施例２：ＶＡＩ ＲＮＡの調製
ＶＡＩ ＲＮＡは公開される方法（Ｍｅｌｌｉｔｓ ｅｔ ａｌ．、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８、５４０１）に従って調製される。簡潔に記載すると、本明細書ではｐＴ７ＶＡと略称されるプラスミドｐＴ７ＶＡ／Ａｄ２Ｉは、Ａｄ２ ＶＡ ＲＮＡ₂の遺伝子の上流に融合されたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含むクローニングベクターｐＵＣ１１９の誘導体である。このプラスミドをＤｒａ Ｉでの消化により直線化させて、ＶＡＩ ＲＮＡの厳密なコピーであるランオフ転写物の調製を可能にする。転写は、３７．５μｇ／ｍｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、５０μｇ／ｍｌの直線化ｐＴ７ＶＡ ＤＮＡ、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１４ｍＭのＭｇＣｌ₂、２ｍＭのスペルミジン、５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、４ｍＭの各ｒＮＴＰ、および１単位／μｌのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む反応物中で実施する。４０℃で９０分インキュベートした後に、この反応を最終濃度２０ｍＭのＥＤＴＡの添加により停止させ、フェノール、次いでクロロホルムで抽出し、そしてＲＮＡをエタノールで沈殿させる。ＶＡ１ ＲＮＡは、再溶解させた沈殿物を変性させ、それを８％のポリアクリルアミド／７Ｍ尿素の配列決定用ゲル上で泳動させ、主要バンドを切り出し、そしてＲＮＡを標準的な方法により回収することにより精製する。ラベル化ＶＡ１ ＲＮＡを、［アルファー−³²Ｐ］ＵＴＰもしくはビオチニル化−ＵＴＰのいずれかが含まれること以外は記載されるように転写を実施することにより調製する。
実施例３：ｐ５８の調製
Ｉ． ｐ５８による阻害のためのアッセイ
このアッセイはｐ５８の精製を記録することを可能にする。ｐ５８の精製過程中に単離された分画を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００でのインターフェロン処理化２９３細胞の破壊により調製されたｐ６８含有性細胞抽出物と混合し、そして２０分間３０℃でインキュベートする。その後にこのｐ６８キナーゼを、２９３細胞からのヒトｐ６８を認識するがｐ５８の源であるインフルエンザウイルス感染化ＭＤＢＫ細胞中のウシ相同物は認識しない抗体を用いて免疫沈降させる。次に免疫沈降化させたｐ６８の活性を、［ガンマー−³²Ｐ］ＡＴＰを用い、そして基質として外因性ヒストンを添加して測定する。活性を定量化するためにヒストンをポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そしてゲルから切り出す。精製の後期段階においては純粋なｐ６８キナーゼおよびその天然の基質であるｅＩＦ−２を用いる追加的なアッセイを以下のように実施する。精製からの各分画を純粋なｐ６８キナーゼと共に、１０分間、３０℃で、緩衝液Ｃ（１７ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、７５ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ｍＭのジエチオスレイトール、ｍｌ当たり８μｇのアプロチニン、１．０ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、２ｍＭのＭｎＣｌ₂、ｍｌ当たり０．３ｍｇのウシ血清アルブミン、８％のグリセロール）中で予備インキュベートする。その後に活性化因子であるポリ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）（０．０１０μｇ／ｍｌ）を１ｍＭの［ガンマー−³²Ｐ］ＡＴＰ（４２４Ｃｉ／ｍモル；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）の存在下で添加し、そしてインキュベーションを追加的に１０分間継続する。最後には、０．５μｇの精製化ｅＬＦ−２を添加し、そしてインキュベーションを更に１０分間、３０℃で継続する。この反応は、２×破壊用緩衝液（１６０Ｍｍのトリス、ｐＨ６．８、１．０Ｍの２−メルカプトエタノール、４％のＳＤＳ、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール）の添加により停止し、この混合物を沸騰させ、そしてリン酸化された蛋白質をＳＤＳ／１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。
ＩＩ． ｐ５８のクローニング
Ａ． ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
精製化ｐ５８蛋白質から得られる３つのトリプシン消化ペプチドをミクロシークエンシングを行うことにより配列決定する。それらの配列の内の一つ（ＡＥＡＹＬＩＥＥＭＹＤＥＡＩＧＤＹＥＴＡ）を用いて、縮重オリゴヌクレオチドプローブ（５′−ＧＡＡ（Ｇ）ＧＡＡ（Ｇ）ＡＴＧＴＡＴ（Ｃ）ＧＡＴ（Ｃ）ＧＡＡ（Ａ）ＧＣ−３′）を設計した。これを用いてラムダーＺａｐＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中に作成されるＭＤＢＫ細胞株からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ａｒｌｉｎｇｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）への二重プラーク転移を行った。その後にフィルターを、３８℃で４時間、６×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ＝０．１８ＭのＮａＣｌ／１０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＳＤＳ、０．２％のウシ血清アルブミン、０．２％のポリビニルピロリドン）、ｍｌ当たり１００μｇの超音波処理を施しかつ変性させたサケ精子ＤＮＡ中で予備ハイブリダイズさせ、そして３８℃で２０時間、６×ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ、ｍｌ当たり１００μｇの超音波処理を施しかつ変性させたサケ精子ＤＮＡ中で、³²Ｐ−５’末端ラベル化プローブとハイブリダイズさせた。フィルターは６×ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ中で室温で１０分間を２回、３８℃で１５分間で１回洗浄し、そして−７０℃で増感用スクリーンを用いてＫｏｄａｋ社のＸ−Ｏｍａｔフィルムに露出させた。陽性のファージプラークを同定し、そして別に行う数回のプラークハイブリッド形成により精製する。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、製造元の説明書に従ってインビボで切り出した。４つの陽性クローンからのＥｃｏＲ Ｉ断片をｐ５８の部分的アミノ酸配列（ＱＤＹＥＴＡ）のアンチセンス鎖に相当する縮重オリゴヌクレオチドプローブｐ５８−３−２（５′−ＧＣＩＧＴＴ（Ｃ）ＴＣＡ（Ｇ）ＴＡＡ（Ｇ）ＴＣＴ（Ｃ）ＴＧ−３′；Ｉはイノシンを表す）を用いるサザンブロットハイブリッド形成により分析した。１４００ｂｐの挿入断片を含む一つの陽性クローンを取得し、そして制限酵素マッピングにより分析した。Ｍ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９内へとクローニングした後に、ｐ５８のｃＤＮＡ配列を、セクアナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）２．０（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖停止方法により決定した。配列番号１７を参照せよ。配列データはＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）社の配列分析プログラム（バージョン７．０）を用いて分析した。
Ｂ． ｐ５８ｃＤＮＡの３’末端領域の単離
単離された最初のクローンは長い読み取り枠を含んでいたが停止コドンが存在せず、３’末端が失われていることが示唆された。失われた３’末端領域を記載されるように（Ｉｎｎｉｓ、 ｅｔ ａｌ．、１９９０）ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｃＤＮＡの末端ポリメラーゼ連鎖反応の迅速増幅）を用いて単離した。ＭＤＢＫポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（１μｇ）をハイブリッドプライマー（５′−ＧＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ−（Ｔ）₁₇−３′）を用いて逆転写させた。ｃＤＮＡプールをアダプタープライマー（５′−ＧＡＣＧＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣ−３′）およびｐ５８遺伝子特異的プライマーＰ５８−５（５′ＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＡＡＧ−３′）の存在下、記載される（Ｉｎｎｉｓ、 ｅｔ ａｌ．、１９９０）条件下で、ＲＡＣＥ−ＰＣＲにより増幅した。サザンブロットにより増幅化産物を同定した後に、この産物をアガロースゲルから単離し、そしてＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９内にクローン化して増幅化領域の配列決定を行った。このことにより１６８０ｂｐを含む完全なｐ５８のｃＤＮＡの再構成が可能になった。もともとの１４００ｂｐのｃＤＮＡも用いてＭＤＢＫ ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして５′−および３′−ＵＴＲを共に含む完全なコーディング配列を含む３１４０ｂｐの他のクローンを導き出した。
Ｃ． 細菌中での融合蛋白質の発現
唯一のＮｄｅ Ｉ部位（ＣＡＴＡＴＧ）を、インビトロ突然変異誘発キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて、製造元のプロトコールに従って、ｐ５８遺伝子の開始用メチオニンコドンに導入した。部位特異的突然変異誘発後、ｐ５８遺伝子を含む１．６ｋｂのＮｄｅ Ｉ−ＢａｍＨ Ｉ断片を細菌の発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｔｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内にクローン化させた。ｐ５８は、０．２ｍＭのＩＰＴＧでの２時間３０℃の誘導化後に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内でヒスチジン−付加融合蛋白質として発現させた。大半の融合蛋白質が不溶性分画内に見いだされた。この分画を６Ｍのグアニジン−ＨＣｌ内で変性させた後に、融合蛋白質を、Ｎｉ（ＩＩ）−カラムを用い、製造元の説明書に従って精製した。精製化蛋白質（０．１ｍｇ／ｍｌ）は、ｍｌあたり０．１ｍｇのウシ血清アルブミンを含む透析用緩衝液（２０ｍＭのトリスーＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５ＭのＮａＣｌ、２０％のグリセロール）中で約５０倍に希釈し、そして透析用緩衝液内で４℃で６時間透析した後に再生させた。再生化蛋白質をアリコートに分け、そして−７０℃で保存した。
実施例４：スクリーニング方法：ｐ５８によるｐ６８の不活化
２μｌまでのｐ６８キナーゼ分画（用いられる厳密な容積は精製の度合いに依存する）を、５０ｍＭのＫＣＬ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、および１μＭのＰＭＳＦ、ｍｌ当たり０．１ｍｇのウシ血清アルブミンおよび０．１ｍｇのｔＲＮＡで１０μｌにまで希釈した。この希釈化キナーゼを、最終濃度で７５ｍＭのＫＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、（ｐＨ７．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１．０ｍＭのジチオスレイトール、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＡＴＰ、プロテアーゼインヒビター、および５〜１０°Ｃｉの［ガンマー³²Ｐ］ＡＴＰ（＞３，０００Ｃｉ／ｍモル；Ｄｕｐｏｎｔ社、ＮＥＮ）を含む２０μｌの反応混合物に添加する。適切であらば反応混合物に、活性化因子としてレオウイルスの二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡもしくは合成ｄｓＲＮＡ（例えば、ポリＩ：Ｃ）、およびインヒビターとしてのｐ５８を補充する。同じ反応内で用いる場合には，ｄｓＲＮＡとｐ５８とを同時に酵素ミックスに添加する。この反応物を３０℃で１５〜２５分間インキュベートし、その後にスロット−ブロットもしくはドット−ブロット装置中でニトロセルロースを通して濾過する。自己リン酸化によりｐ６８キナーゼ内に取り込まれた³²Ｐを液体シンチレーション計測もしくは露出化オートグラフィー用フィルムのレーザーデンシトメトリーにより定量する。典型的な一連のテストは以下の反応を含む。ａ）ｐ６８キナーゼ単独もしくはｐ５８単独での対照反応、ｂ）テスト化合物単独、あるいはｐ６８キナーゼもしくｐ５８のいずれかと一緒の対照反応、ｃ）ｐ６８キナーゼとｐ５８、ならびにｄ）ｐ６８キナーゼ、ｐ５８、およびテスト化合物。ｐ６８キナーゼへのｐ５８インヒビターの結合を妨害するテスト化合物については、反応（ｄ）で検出される自己リン酸化ｐ６８キナーゼの量は反応（ｃ）で検出されるものより多くなる。
実施例５：インビトロ翻訳アッセイ
以下の構成成分を連続的に１２μｌのミクロコッカスヌクレアーゼ処理化ウサギ網状赤血球溶菌物に添加する。２．５μｌの５０ｍＣｉ／ｍｌ［³⁵Ｓ］メチオニン、メチオニンを除く全てのアミノ酸１ｍＭを含む２．５μｌのアミノ酸混合物、２．５μｌの５０μｇ／ｍｌ ＶａＩ ＲＮＡ、２．５μｌの１００ｎｇ／ｍｌのレオウイルス二本鎖ＲＮＡ、および２μｌのテスト化合物もしくはＨ₂Ｏ。この混合物を３０℃で１５〜２０分間インキュベートして内因性ｐ６８キナーゼの活性化を可能にし、その後に１μｌの特異的レポーター遺伝子ｍＲＮＡを添加して１０μｇ／ｍｌの最終濃度を得る。その後にこの翻訳反応物を３０分間３０℃でインキュベートする。翻訳をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより、ＣＡＴもしくはルシフェラーゼ酵素アッセイ、あるいは用いたｍＲＮＡに適切な他のアッセイにより定量化する。典型的な一連のテストは以下の反応を含む。ａ）レオウイルスｄｓＲＮＡもしくはＶＡＩ ＲＮＡを含まない対照反応、ｂ）レオウイルスｄｓＲＮＡを含むがＶＡＩ ＲＮＡを含まない対照反応、ｃ）レオウイルスｄｓＤＮＡおよびＶＡＩ ＲＮＡ、ならびにｄ）レオウイルスｄｓＲＮＡ、ＶＡＩ ＲＮＡ、およびテスト化合物。ＶＡＩ ＲＮＡ機能を妨害するテスト化合物については、反応（ｄ）での翻訳は反応（ｃ）で検出されるものと比較すると減少している。
実施例６：アデノウイルスの遺伝子産物ＶＡＩ ＲＮＡの機能を妨害するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド分子の同定
ＶＡＩ ＲＮＡの既知の塩基配列、予想される二次構造（図１）、およびＶＡ機能への様々なステムおよびループの相対的重要性に基づいて、出願者は数々のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド分子を設計した（図２、３）。これらのアンチセンス種を先に記載されるインビトロ翻訳アッセイにおいて検査した。
Ａ．インビトロ翻訳アッセイ
インビトロ翻訳アッセイは９６ウエルプレート内で実施した。ウサギ網状赤血球溶菌物をｐ６８の源ならびにインビトロ翻訳系として使用した。ｐ６８はウサギ網状赤血球溶菌物内に存在し、そしてレオウイルスＲＮＡのようなｄｓＲＮＡの添加により活性化することができる。ｐ６８が活性化される際には翻訳が阻害される。
ＶａＩ ＲＮＡは、本出願の主要部において記載されるように調製した（実施例２：ＶＡＩ ＲＮＡの調製、を参照せよ）。以下の構成成分を順に添加し、そして指定されるように９６ウエルプレートの各ウエル内でインキュベートした。
４μｌのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（最終濃度はＶＡＩ ＲＮＡに対して２０倍モル過剰）
２μｌのＶＡＩ ＲＮＡ（最終濃度＝５μｇ／ｍｌ）
１ｍＭの完全なアミノ酸混合物を補足してある２０μｌのウサギ網状赤血球溶菌物
＊３０℃で１５分間インキュベートする。
２μｌのレオウイルスｄｓＲＮＡ（最終濃度＝１０ｎｇ／ｍｌ）
＊３０℃で１５分間インキュベートする。
２μｌのルシフェラーゼｍＲＮＡ（最終濃度：３０ｎｇ／ｍｌ）
＊３０℃で１５分間インキュベートする。
各ウエルをＤｙｎａｔｅｃｈ社のＭＬ３０００ルミノメーターおよびＡｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＬＡｂｓ社のＥｎｈａｃｅｄ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いてルシフェラーゼ活性について即座にアッセイした。設定値は：Ｅｎｈａｃｅｄ Ｆｌａｓｈ モード、Ｄｅｌａｙ＝２ｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅ＝５ｓ、５０μｌの基質Ｂと同時に注入する５０μｌの基質Ａ。
以下の対照物をこのアッセイにおいてインキュベートした。Ｈ₂Ｏを（−）により示されるようにｍＲＮＡ、レオウイルＲＮＡ、もしくはＶＡＩ ＲＮＡに置き換えた。
１）（−）ｍＲＮＡ （−）レオ （−）ＶＡ
２）（＋）ｍＲＮＡ （−）レオ （−）ＶＡ
３）（＋）ｍＲＮＡ （＋）レオ （−）ＶＡ
４）（＋）ｍＲＮＡ （＋）レオ （＋）ＶＡ
対照１は、ルシフェラーゼｍＲＮＡなしで陽性ルシフェラーゼシグナルを生じるであろう溶菌物中のものの存在について検査した。対照２は、このアッセイの翻訳の正常レベルを確認した。対照３は、ｐ６８のレオウイスＲＮＡ活性化の結果である翻訳の阻害のレベルを確認した。対照４は、活性化因子であるレオウイスＲＮＡの存在下でのｐ６８のインヒビターとしてのＶＡＩ ＲＮＡの救済機能を決定した。典型的な結果を図４に示す。相対的光単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｌｉｇｈｔ Ｕｎｉｔ）（「Ｒ．Ｌ．Ｕ．」）の産生はルシフェラーゼｍＲＮＡの添加に依存する（カラム１対２）。レオウイルスｄｓＲＮＡをこのアッセイに添加する際には、この溶菌物中の内因性ｐ６８が活性化され、そして翻訳が阻害される（カラム３）。ＶＡＩ ＲＮＡを添加した際には、翻訳が部分的に救済された（カラム４）。
Ｂ．アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの結果
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド種をアッセイに添加し、これらの結果も図４に示す。ａｖａ１はＶＡＩ ＲＮＡの効果を完全に逆転させることが見いだされた（カラム５）。ａｖａ９およびａｖａ１５はＶＡＩ ＲＮＡ機能に対しては部分的に拮抗的（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ）であった（カラム８、９）。ａｖａ２および３はＶＡＩ ＲＮＡ機能に有意な影響を与えなかった（カラム６、７）。末端のステム領域に相補的な種を含む他のアンチセンス種はＶＡＩ ＲＮＡ機能を妨害しなかった（データ非公開）。これらの後者の結果はａｖａ１による阻害の特異性を強調するが、それはＶＡＩ ＲＮＡ分子の幾つかの部分に対するアンチセンスが遮断機能において有効でないためである。
ａｖａ２はＶＡＩ ＲＮＡの中央ドメインの一部分に相補的である。ＶＡＩ ＲＮＡのこの相補的領域は一本鎖であるためａｖａ２は容易にアニールすることが予期され、そして中央ドメインは機能にとって重要であることが示されているため（Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｍ．Ｂ． ａｎｄ Ｔ．Ｓｈｅｎｋ．１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５６５７−５６６２。Ｍｅｌｌｉｔｓ、Ｋ．Ｈ．、Ｔ．Ｐｅｅｒｙ、ａｎｄ Ｍ．Ｂ．Ｍａｔｈｅｗｓ． １９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏ１．６６：２３６９−２３７７）ａｖａ２はＶＡＩ機能を妨害することが予期される。しかしながら、ａｖａ２はＶＡＩ活性に影響を与えなかった（図４）。
それとは対照的に、ａｖａ１５はＶＡＩ ＲＮＡの二本鎖領域に相補的である。この領域はオリゴデオキシヌクレオチドの結合を容易に可能することは予期されず、しかし、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドａｖａ１５は実際にＶＡＩ ＲＮＡ機能と拮抗する（図４）。出願者の方法を利用することにより、機能的であるものについてのオリゴヌクレオチドのスクリーニングを容易に達成することができる。より一般的には、ａｖａ２およびａｖａ１５の両方の挙動の予期されぬ性質の、出願者のスクリーニング方法による容易な検出は、ｐ６８のウイルス性インヒビターの拮抗剤を同定するための方法の利用性を証明している。
優先的翻訳を媒介する特異的ウイルス核酸配列
特異的ウイルス核酸配列がウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因であるか否かを決定するためには、種々の研究方法が利用可能である。これらには、優先的翻訳の原因である可能性のあるウイルス性核酸配列に翻訳的に連結される検出可能なレポーターポリペプチドを有するキメラＲＮＡを用いる研究、ウイルス核酸配列の天然の突然変異体および研究室の突然変異体の研究、ならびにトランスフェクション感染アッセイが含まれるが、これらに限定はされない。
有利な初期研究方法は、ウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因である可能性があるウイルス核酸配列に連結される検出可能なレポーターポリペプチドのためのコーディング配列を有するキメラＲＮＡを構築することであることがしばしばである。その後の検出可能なレポーターポリペチドの産生を、ウイルス核酸配列が確実にその翻訳を行わない限りこのレポーターが産生されないであろう翻訳条件下で調査する。対照として、このレポーターがテスト中のウイルス核酸配列に連結されていない類似構築物からの検出可能なレポーターポリペプチドの産生も同一な翻訳条件下で調査されるであろう。追加的対照として、各テスト物に添加されるキメラＲＮＡもしくは別法として第二ＲＮＡは、第一のものから識別され、かつ細胞性ｍＲＮＡの正常翻訳を確実に行う原因となるＲＮＡ配列に翻訳的に連結される第二検出可能レポーターポリペプチドのためのコーディング配列を含むことができる。
他の構成成分の同定
いったんウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因になるものとしてウイルス核酸配列を同定したら、このウイルス核酸配列の作用に関連する細胞性および／またはウイルス性構成成分を同定するためには多様な方法が利用可能である。
薬剤をスクリーニングするための方法の設計
ウイルスＲＮＡの優先的翻訳を破壊もしくは調節する能力について薬剤をスクリーニングするための方法は、関連するウイルス性および細胞性物質間の厳密な相互作用の詳細な知識なしでも設計することができるが、このような知識は確かに有用である可能性がある。
従って例えば、薬剤を細胞性および／またはウイルス性蛋白質とウイルス核酸配列との間の結合を防止もしくは減少させる能力についてスクリーニングすることができる。他のそして好ましい種類のアッセイにおいては、薬剤を検査して、そのレポーターのためのコーディング配列がウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因となるウイルス核酸配列に翻訳的に連結されるＲＮＡからの検出可能なレポーターポリペプチドの翻訳におけるそれらの影響が決定される。
先の記載は例示のためにのみ提供され、決して本発明の範囲を制限するものではない。当業者はウイルスＲＮＡの優先的翻訳の原因となるウイルス核酸配列を同定するため、関連する他の細胞性およびウイルス性構成成分を同定するため、ウイルスＲＮＡの優先的翻訳を可能にする様々なパートナー間の相互作用の特徴決定を行うため、そしてこのような相互作用を破壊もしくは廃止する能力について薬剤をスクリーニングするのに使用することができるテストを開発するためには多種多様な方法からの選択を行うことができることが明白である。以下のものは翻訳調節要素の活性を遮断する薬剤をスクリーニングするために用いられる方法の実施例である。
ＩＲＥＳ要素のスクリーニング
ＩＲＥＳ要素の活性を遮断する薬剤をスクリーニングするためのアッセイの開発は、２つの異なるレポーター遺伝子の存在を特徴とするジシストロン性（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡを構築することを必要とし、この場合一つの遺伝子の翻訳がＩＲＥＳ要素の調節下に置かれ、かつ他の遺伝子の翻訳が宿主細胞のキャップ構造（ｍ⁷ＧｐｐｐＧ）および細胞性５’−ＵＴＲ配列の調節下に置かれる。そのような構築物は、細胞非含有性アッセイもしくは細胞を基にするアッセイのいずれかを用いて、細胞がそれら自体のｍＲＮＡの翻訳を開始するのに使用する方法に不利な影響を及ぼすことなくＩＲＥＳ要素の活性を遮断するような薬剤を同定することを可能にする。従って本発明の好ましい態様は、利用者が、非特異的かつ毒性である可能性のある薬剤を同時に除去しながら所望の作用機構を有する薬剤を同定することを可能にする。
ジシストロン性レポーター遺伝子構築物を、インビトロもしくはインビボ薬剤スクリーニングのいずれかのために使用することができる。インビトロ（無細胞）アッセイフォーマットにおいては、ジシストロン性ｍＲＮＡ構築物は、バクテリオファージＴ７もしくはＳＰ６プロモーターにより例示される強力なプロモーターの調節下にあるその構築物の翻訳を指令するプラスミドＤＮＡ分子によりコードされている。予め形成されているキャップ構造の存在下で相同なＲＮＡポリメラーゼ（例えば７もしくはＳＰ６）を用いて精製およびインビトロ転写を行う場合には、このプラスミドは、「キャップを伴う」ジシストロン性レポーター構築物の大容量の合成を指令し、この構築物は一般的に実施される技術を用いて精製することができる。次にこのジシストロン性ｍＲＮＡを、商業的供給元から購入するか、あるいは科学的刊行物において利用可能な方法に従って調製されるかのいずれかである真核生物インビトロ翻訳系内の鋳型として利用する。
薬剤を、先のジシストロン性レポーター構成物を含む完全な細胞中でテストすることもできる。前記構築物を、１）その構築物の転写をＳＶ４０、ＣＭＶもしくは当業者により一般的に用いられる他のプロモーターのような強力な真核生物ウイルスプロモーターの調節下に置き、２）核内で作成されるＲＮＡの正確なプロセシングおよび輸送を確実にするためにＳＶ４０のスプライスシグナルのようなスプライスシグナルを含むようにし、そして３）レポーターｍＲＮＡが３’ポリアデニル化分子として合成されるように、この構築物の３’端にＳＶ４０シグナルのようなポリアデニル化シグナルを含むようにすること、により培養真核生物細胞中での使用のために改変する。
本発明に含まれるアッセイを用いて、新規の抗ウイルス剤を発見するために薬剤ライブラリーをスクリーニングすることができる。このようなライブラリーは、純粋な薬剤のコレクションもしくは薬剤混合物のコレクションのいずれかを含むことができる。純粋な薬剤の例には、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成もしくは半合成化学物質、および精製された天然産物が含まれるが、これらには限定されない。薬剤混合物の例には、原核生物もしくは真核生物細胞および組織の抽出物、ならびに発酵ブイヨンおよび細胞もしくは組織培養物上清が含まれるが、これらには限定されない。薬剤混合物の場合には、アッセイは所望の抗ウイルス活性を保持するこれらの未精製混合物を同定するのに用いられるばかりでなく、このアッセイは治療剤としての特徴決定および開発のための混合物から抗ウイルス性成分を精製する手段を提供をもする。具体的には、このように同定される混合物をその後に当業者に一般的に知られる方法により連続的に分画化することができる。得られる各サブフラクションを、純粋で生物学的に活性な薬剤が取得されるまで、もともとのアッセイを使用して抗ウイルス活性についてアッセイすることができる。
好ましい態様においては、抗ウイルス活性を検出するために設計されたアッセイを、先に記載されるライブラリーと組み合わせる高い処理能力の薬剤発見用スクリーニングに用いる。このアッセイは、例えば９６−ウエル変種の多重ウエルプレート内のような多重反応物の迅速調製および処理を可能にするいずれかのフォーマットで実施される。
他の態様においては、このアッセイを用いて、既に公有となっている技術、あるいはそうでなければ当業者に知られる技術のいずれかにより産生されるランダムペプチドもしくはオリゴヌクレオチドの広大なライブラリーをスクリーニングすることができる。サイズが大きいため、これらのライブラリーは主要薬剤の源でありそうであり、それはそれらが１０⁷〜１０¹⁰の化学的実在物を含むことができるためである。
以下の実施例は説明のためのものであって、決して本発明を制限することを意図するものではない。
実施例７：ＩＲＥＳ要素ＲＮＡ構築物の作成／単離
Ａ． ＰＣＲ反応
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびＴ７プロモーターをＰＣＲ断片の５’端に置くために設計されたプライマーを用いて、入手可能なプラスミドから選択されるＩＲＥＳ成分を増幅する。反応混合物は以下のものを含む。１μＭのプライマー＃１、１μＭのプライマー＃２、４０μＭのｄＡＴＰ、４０μＭのｄＧＴＰ、４０μＭのｄＣＴＰ、４０μＭのｄＴＴＰ、４μｇ／ｍｌの鋳型ＤＮＡ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのトリスーＨＣｌ ｐＨ８．３、２５℃、４０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、および０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン。
この反応混合物（総容量１００μｌ）を１００μｌの鉱油に重層する。鉱油中にチューブを浸し、そして断熱材中に入れ、空気バブルが出るようにさせる。パラメーター：９４℃で２分、４２℃で１分、７２℃で１分、２秒の自動延長。できる限る大量の油性上層を取り出す。１００μｌのＴＥを添加し、そしてＣＨＣｌ₃で、次いでフェノール／ＣＨＣｌ₃で、そして最後にＣＨＣｌ₃で抽出する。３０μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃを添加する。６００μｌの氷冷ＥｔＯＨを添加し、そして−２０℃で数時間放置する。３０分間１４Ｋ ｒｐｍでマイクロフュージ内で遠心し、その後に５μｌのＨ₂Ｏ中に再懸濁する。
Ｃ． ｐＢＬおよびｐＢＣＲＬプラスミドの構築
転写鋳型ｐＢＬを、β−グロビンおよびルシフェラーゼ配列のＰＣＲ増幅産物をプラスミドベクターｐＵＣ１９内に連結することにより構築した。β−グロビンのＰＣＲプライマー（配列番号１８、配列番号１９）は、β−グロビンの５′非翻訳領域（「ＮＴＲ」、未翻訳領域「ＵＴＲ」としても引用される）を増幅し、そして５’ＥｃｏＲ Ｉ制限部位、５’Ｔ７プロモーター、および３’Ｋｐｎ Ｉ制限部位を導入するように設計した。ＥｃｏＲ ＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位を用いてｐＵＣ１９内への連結し、中間体プラスミドｐＢを作成した。ルシフェラーゼのＰＣＲプライマー（配列番号２０、配列番号２１）を設計してルシフェラーゼのコーディング配列を増幅し、５’Ｐｓｔ Ｉ制限部位および３’Ｈｉｎｄ ＩＩＩ制限部位を導入し、ｐＢ内へ連結してｐＢＬを作成した。ＣＡＴのＰＣＲプライマー（配列番号２２、配列番号２３）を設計してＣＡＴのコーディング配列を増幅し、５’Ｋｐｎ Ｉ制限部位および３’Ｂａｍ ＨＩ制限部位を導入し、ｐＢＬ内へ連結して、ｐＢＣＬを作成した。リノウイルス１４の５’ＮＴＲのＰＣＲプライマー（配列番号２４、配列番号２５）を設計してリノウイルスの５’ＮＴＳＲを増幅し、５’Ｂａｍ ＨＩ制限部位および３’Ｐｓｔ Ｉ制限部位を導入し、これを用いてこの増幅産物をｐＢＣＬ内へ連結させた。＿−グロビンの５’ＮＴＲ、ＣＡＴ、リノウイルスのＩＲＥＳ、およびルシフェラーゼ配列を含む得られるプラスミドを大腸菌ＤＭＩ細胞内にトランスフォームすることにより、リノウイルスおよびルシフェラーゼの開始コドンは一直線に並ぶ。非メチル化プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＢｃｌ Ｉで消化し、この消化プラスミドを再連結させ、そして大腸菌ＤＨ５細胞内にトランスフォームさせてｐＢＣＲＬを産生する。
翻訳反応のたのキャップ付きＲＡＮの調製
プラスミドＤＮＡからのＴ７ポリメラーゼ転写は以下のとおりであった。
２００μｌの反応物は、５μｌのプラスミド、１ｍＭの各ＮＴＰ、５μｇの切断化プラスミドＤＮＡ（２０μｌ）、０．１％のＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏ（１２８μｌ）、１００ｍＭのＡＴＰ（２μｌ）、１０ｍＭのＧＴＰ（２μｌ）、１００ｍＭのＵＴＰ（２μｌ）、１０ｍＭのｍ⁷ＧｐｐｐＧ（２０μｌ）、ＲＮａｓｉｎ（１μｌ）、５×プラスミド緩衝液（４０μｌ）を含み、これを５分間３７℃でインキュベートする。４μｌのポリメラーゼ（２〜４μｌ）を添加し、６０分、３７℃でインキュベートする。１０μｌのＲＮａｓｅ非含有性ＤＮａｓｅを添加し、３７℃で１分間インキュベートする。５μｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡを添加する。フェノール／ＣＨＣｌ₃抽出する。ＣＨＣｌ₃抽出する。７０μｌの０．１％ＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏを添加する。３０μｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２を添加する。９００μｌのＥｔＯＨを添加する。−２０℃で一晩、もしくは−８０℃で３０分間放置し、２５μｌのＴＥ中に再懸濁する。Ａ₂₆₀を測定する。転写緩衝液：３７℃における２００ｍＭのトリス ｐＨ８．０、５０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのスペルミジン、２５０μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１％のＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏ（６５０μｌ）、１Ｍのトリス（２００μｌ）、（ｐＨ８．０＠３７℃、ｐＨ８．４＠２５℃）、１ＭのＤＴＴ（２５μｌ）、１００ｍＭのスペルミジン（５０μｌ）、１０μｇ／μｌのＢＳＡ（２５μｌ）、１ＭのＭｇＣｌ₂（５０μｌ）、−２０℃（１０００μｌ）で保存する。
トランスフェクションアッセイのためのモノ−およびジシストロン性プラスミドの構築
ジシストロン性プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ）を用いて細胞をトランスフェクトさせ、そしてテスト化合物の存在および非存在下でのインビボの翻訳のためのアッセイを行う。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰは順に、ＳＶ４０の複製起点、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子、選択されるＩＲＥＳ要素、分泌されるアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子、ＳＶ４０のスプライス部位、およびＳＶ４０のポリＡシグナルを含む。ｐＵＣ１１８を基にする２つの構築物（ｐＢ−ＳＥＡＰおよびｐＢ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ）を用いて構築物ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰを作成する。ｐＢ−ＳＥＡＰは順に、Ｔ７のポリメラーゼプロモーター、β−グロビンの５’非翻訳領域、およびＳＥＡＰレポーター遺伝子を含む。ｐＢ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰは順に、Ｔ７のポリメラーゼプロモーター、β−グロビンの５’非翻訳領域、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子、選択されるＩＲＥＳ要素、およびＳＥＡＰレポーター遺伝子を含む。ｐＢ−ＳＥＡＰおよびｐＢ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰの構築は、利用可能なプラスミドからβ−グロビンの５’ＮＴＲ、ルシフェラーゼのコーディング配列、ＩＲＥＳ要素、およびＳＥＡＰのコーディング配列を、非反復５’制限部位を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅することにより実施する。β−グロビンの５’ＮＴＲおよびＳＥＡＰのコーディング領域を含むＰＣＲ産物を制限消化し、そしてｐＵＣ１１８内に挿入してモノシストロン性構築物ｐＢ−ＳＥＡＰを産生する。ジシストロン性プラスミドｐＢ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰは、制限消化させたモノシストロン性プラスミドと、選択されるＩＲＥＳ要素およびルシフェラーゼのコーディング領域を含む制限消化させたＰＣＲ産物とを連結することにより作成する。細胞をトランスフェクトするのに用いたジシストロン性プラスミド（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰ）は、ｐＢ−Ｌｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰのＬｕｃ−ＩＲＥＳ−ＳＥＡＰコーディング領域を含む平滑末端化Ｋｐｎ Ｉ−Ａｐａ １断片と、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーターを含みＳＶ４０の複製起点、スプライス部位、およびポリＡシグナルを含むＥｃｏ ＲＶ消化させたプラスミドベクターｐｃＤＮＡＩ−ｎｅｏ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）とを連結させることにより構築する。
ＰＣＲ
Ｔ７プロモーター、β−グロビンの５’ＮＴＲ、ルシフェラーゼのレポーター遺伝子、ＩＲＥＳ要素、およびＳＥＡＰのレポーター遺伝子を、先に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および以下に示すプライマーを用いて増幅する。

実施例８：インビトロ翻訳スクリーニングアッセイ
テスト化合物を、ＩＲＥＳ要素−蛋白質コーディング領域含有性構築物、ウイルス翻訳に必要な選択される細胞性結合蛋白質、および細胞性翻訳構成成分（リボソームなど）を含む無細胞系内においてウイルス性ＩＲＥＳ指示蛋白質翻訳を阻害する能力についてスクリーニングする。
Ａ． インビトロ翻訳アッセイ
ＰＵＣ１１８を基にする２つの構築物（ｐＢＬおよびｐＢＣＲＬ、既述）を用いてテスト化合物の存在および非存在下で翻訳についてのアッセイを行う。ｐＢＬは順に、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター、β−グロビンの５’非翻訳領域、およびルシフェラーゼのレポーター遺伝子を含む。ｐＢＣＲＬは順に、Ｔ７ポリメラーゼのプロモーター、β−グロビンの５’非翻訳領域、ＣＡＴのレポーター遺伝子、ＩＲＥＳ要素、およびルフェラーゼのレポーター遺伝子を含む。テスト化合物を、構築物ｐＢＣＲＬを用いるとＩＲＥＳ要素により作動されるルシフェラーゼ合成は阻害するが、構築物ｐＢＣＲＬを用いるとβ−グロビンの５’ＮＴＲにより作動されるＣＡＴ合成は阻害せず、かつ構築物ｐＢＬを用いるとβ−グロビンの５’ＮＴＲにより作動されるルシフェラーゼ合成を阻害しない能力についてスクリーニングする。
Ｂ． 翻訳用のＨｅｌａ Ｓ３のＳ１０の調製：
材料／調製法
タイプＢのホモジナイザーをＥｔＯＨおよびＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏを用いてフード内ですすぐ。低張溶菌緩衝液：０．１１９ｇのＨｅｐｅｓ（５００μｌ １Ｍ）、０．０４９ｇのＫＯＡｃ（２５０μｌ ２Ｍ）、０．０１６ｇのＭｇＯＡｃ（７４μｌ １Ｍ）、５０ｍｌにするまでのＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏ。１ＭのＫＯＨでｐＨを７．４に調節する。新規に調製した１０ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液中の２５μｌの１Ｍ ＤＴＴを添加する。透析緩衝液：２．８３８ｇのＨｅｐｅｓ、８．８３３ｇのＫＯＡｃ、１．５ｍｌの１Ｍ ＭｇＯＡｃ、１ＬにするまでのＨ₂Ｏ（非−ＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏで十分であろう）。１ＭのＫＯＨでｐＨを７．４に調節し、１０ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液中の２５ｍｌの１Ｍ ＤＴＴを添加する。オートクレーブもしくはフィルター滅菌処理を行い、そして４℃に保存する。１２０００〜１４０００カットオフ型のチューブに入れて透析する。２×ロード用色素：１２５μＬの１Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８、４００μｌの１０％ＳＤＳ、１００μｌのメルカプトエタノール、３７５μｌの５０％グリセロール。微量のブロモフェノールブルーを添加する。
対数期にある２ＬのＨｅＬａ Ｓ３細胞を取得する（５×１０⁵細胞／ｍｌ）。細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄する（各２０ｍｌのＰＢＳで行い、最初の洗浄には１０ｍｌのＰＢＳ／Ｌ細胞、２回目の洗浄には１５ｍｌのＰＢＳ／Ｌ、そして３回目の洗浄には１０ｍｌのＰＢＳ／Ｌを用いる）。２Ｋ ｒｐｍで１０分間遠心する。３度目の遠心には３０ｍｌのコレックス試験管およびＨＢ４ローターを使用する。低張緩衝液で１．５×のパック化細胞容積にするように再懸濁させ、そして氷上で１０分間膨潤させる。低張緩衝液（ＲＮａｓｅ非含有性）：１０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４ １Ｍ保存液、１０ｍＭのＫＯＡ ４Ｍ保存液、１．５ｍＭのＭｇＯＡｃ（１Ｍ）保存液、２．５ｍＭのＤＴＴ（使用前に添加する）。タイプＢホモジナイザーの１５〜４５ストロークでホモジナイズする。１０、１５、２０、２５などのストローク後に肉眼的にかあるいは色素液排除アッセイのいずれかにより細胞破壊を確認する。細胞が破壊されていれば破片が見えるであろう。５分間２Ｋ ｒｐｍで遠心する（核を除去する）。上清を取り出し、そして２０分間１０Ｋ ｒｐｍで遠心する。滅菌コレックス試験管を使用する。２時間１Ｌ（１００培容積）の透析緩衝液（１０ｍＭのＫ−ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、９０ｍＭのＫＯＡｃ、１．５ｍＭのＭｇＯＡｃ、２．５ｍＭのＤＴＴ）に対して透析して除濁および緩衝液の置換を行う。２．５ｍｌの１Ｍ ＤＴＴを使用直前に添加する。−８０℃で一晩凍結させ、２５℃で約３０分間解凍させ、即座に氷上に置く。１０Ｋ ｒｐｍで１０分間、ミクロフュージ内で遠心する。２００μｌの５０％グリセロール／８００μｌ溶菌液上清を添加する。１ｍｌの抽出物当たりに７．５μｌ（２ｍｇ／ｍｌ）のミクロコッカスヌクレアーゼおよび７．５μｌの１００ｍＭ ＣａＣｌ₂を添加する。２５℃で５分間インキュベートする。１５μＬの２００ｍＭ ＥＧＴＡ／ｍｌの抽出物を添加する。１５０μｌ／試験管のアリコートに分け、−８０℃に保存する。
Ｃ．翻訳反応
１０×翻訳ミックス：１ｍＭのＡＴＰ、５０μＭのＧＴＰ、１０ｍＭのクレアチンリン酸エステル、２４μｇ／ｍｌのＣＰＫ、１８ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＤＴＴ、２４μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、１２μＭのアミノ酸ミックス、２４０μＭのスペルミジン。アリコートに分け、そして−８０℃に保存する。混合物は以下のものを含む。４０μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、６μｌの４０ｍＭ ＧＴＰ、４０μｌの１Ｍクレアチンリン酸エステル（−２０℃に保存）、Ｈｅｐｅｓ中の１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ（−２０℃に保存）、７６μｌのＫ−Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．６、８μｌの１Ｍ ＤＴＴ（３７℃で解凍）、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのウシ肝臓のｔＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）、５０μｌのアミノ酸ミックスーメチオニン、１０μｌの１００ｍＭスペルミジン、および２５０μｌのＨ₂Ｏで５００μｌにする。
マスターミックス（新しく調製する）：混合物は以下のものを含む。１５０μｌのミクロコッカスヌクレアーゼ処理化ＨｅＬａ抽出物、５０μｌの翻訳ミックス、２２μｌの２Ｍ ＫＯＡｃ、３μｌの５０ｍＭのＭｇＯＡｃ、１６μｌの２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｌの３５Ｓ−ｍｅｔ（２０μＣｉ／μｌ）。これは２８回分の翻訳に十分な量であって、より少ない量の試料の場合には量を減らす。
翻訳：混合物は以下のものを含む。８．０μｌのマスターミックス、ＤＥＰＣ Ｈ₂Ｏ中の４．５μｌの１μＭ ＲＮＡ、＋／−１０μｌのテスト化合物。３０℃で３時間インキュベートする。４０μｌの２×ロード色素、２８μｌのＨ₂Ｏを添加し、５分間沸騰させ、２０μｌを１２％のゲルに乗せ、固定、増強化、ＸＲＰフィルムへの露出を行う。増強化には１Ｍのサリチル酸ナトリウム１６ｇ／１００ｍｌを試す。
Ｄ． ルシフェラーゼアッセイ
ＤｅＷｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７、７２５−７２７）により記載されるとおり。Ｄ−ルシフェリンの１ｍＭ保存溶液は２．８ｍｇのルシフェリン（酸非含有性−氷上および暗所に維持する）を９．８ｍｌのＨ₂Ｏに添加することにより調製し、ボルテックスミキサーにかけて塊を除去し、１００μＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を添加し（黄緑色を生じ、いくぶんかの沈殿を生じることがある）、１００μｌの１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｈ₂Ｏを添加し（溶液は透明）、アリコートに分け、そして−２０℃に保存する。１〜１０ｍｇ／ｍｌでＨ₂Ｏ中のルシフェラーゼの保存液を作成し、アリコートに分け、−２０℃に保存する。＜１ｍｇ／ｍｌでトリシン緩衝液、ＤＴＴ、ＭｇＳＯ₄、および０．１％のＢＳＡ中に溶解させた市販のルシフェラーゼをアリコートに分け、−２０℃に保存する。トランスフェクトさせた細胞（非溶菌化）を−２０℃に保存する。１００μｌの溶菌液をアリコートに分け、４℃に２〜４週間保存する。インビトロ翻訳物を−２０℃に保存する。アッセイを実施するためには、３５０μｌのアッセイ緩衝液を２５℃で使用し、１００μｌの溶菌液からの１０〜５０μｌの冷却細胞懸濁液、もしくは２０μｌのインビトロ翻訳反応物からの１〜１０μｌを添加する。１００μｌのルシフェラーゼ溶液を注入する。アッセイ緩衝液（新鮮なものを使用する）：１２５μｌの１００ｍＭ ＡＴＰ、７５μｌの１Ｍ ＭｇＳＯ₄、４６７５μｌの超音波処理用緩衝液（１００ｍＭのＫ₂ＨＰＯ₄［二塩基物］ｐＨ７．８、１ｍＭのＤＴＴ）。
Ｅ．細胞性アッセイ
２つの異なるレポーター蛋白質の合成を指示するジシストロン性構築物を細胞内にトランスフェクトさせ、細胞をテスト化合物に露出し、その後にこれを各々のレポーター蛋白質を産生する能力についてテストする。両方のレポーター蛋白質の産生は可視化させるか、あるいは好ましくは同時にもしくは別法では連続して同じ細胞内で検出する。レポーター蛋白質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、分泌胎児アルカリホスファターゼ、ＣＡＴ、β−グルクロニダーゼの内のいずれかか、あるいは当業者に知られる他の適切な蛋白質でありうる。
選択的にウイルスの翻訳を阻害する化合物はレポーター蛋白質２の産生を阻害するが、レポーター蛋白質１の産生は阻害せず、細胞にとって一般的に毒性である化合物はレポーター蛋白質１の合成、および恐らくはレポーター蛋白質２の合成を阻害する。
実施例９：アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドインヒビターでのリノウイルス翻訳の阻害
オリゴピリミジンの区域（ｔｒａｃｔ）が全てのピコルナウイルスＩＲＥＳ要素の３’端付近に見いだされている（図５、ｎｔ５７２〜５８０）。様々なオリゴピリミジン区域のより厳密な調査により、下流のＡＵＧトリプレットの存在が明らかになった（図５５、ｎｔ５９１〜５９３）。この保存要素は「Ｙ_nＸ_mＡＵＧ」モチーフと称され、Ｙ_nは長さｎのピリミジン区域に相当し、この式中ｎは４〜１２に変化することができ、そして最も好ましくは５〜９のヌクレオチドであり、そしてＸ_mは長さｍのランダムスペーサー配列に相当し、この式中ｍは５〜３０に変化し、そして最も好ましくは１０〜２０ヌクレオチドである（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ．、４４ Ｅｎｚｙｍｅ ２９２、１９９０）。
リノウイルスＩＲＥＳ要素により用いられる開始コドンは、「Ｙ_nＸ_mＡＵＧ」モチーフの約３１ヌクレオチド下流に位置している。
出願者は、リノウイルスＩＲＥＳ要素の３’端を標的とし、かつリノウイルスＩＲＥＳ−依存的翻訳を阻害するアンセンスデオキシオリゴヌクレオチドを設計した。ＩＲＥＳのこの領域は「Ｙ_nＸ_mＡＵＧ」モチーフおよび先に記載される保存化２１塩基配列の両方を含むためにこの領域が選択され、そしてこれを図１に示す。リノウイルスＩＲＥＳ要素のアンチセンスデオキシオリゴヌクレオチド阻害は［³⁵Ｓ］−メチオニン取り込みアッセイ（図７）およびルシフェラーゼ活性アッセイ（図８）を用いてアッセイした。この領域を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドの例はアンチ−ＩＲＥＳ−オリゴであり、これはリノウイルス１４のＩＲＥＳのｎｔ５１８〜５５１にアニールする。アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴ（配列番号２６）の配列は、５’ＡＧＴＡＧＴＣＧＧＴＣＣＣＧＴＣＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＧＣＡＴＴＡＣＧ３’である。
アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴの存在および非存在下でのモノシストロン性ｂＬｕｃ ｍＲＮＡ（図６Ａ）およびジシストロン性のｂＣＲＬ ｍＲＮＡ（図６Ｂ）の翻訳を決定した。予期されるように、アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴはｂＬｕｃ ｍＲＮＡからのルシフェラーゼの翻訳（図７、レーン５〜６に対してレーン３〜４におけるルシフェラーゼ翻訳を比較せよ）もしくはｂＣＲＬからのＣＡＴの翻訳（図７、レーン９〜１０に対してレーン７〜８におけるＣＡＴの翻訳を比較せよ）を阻害しなかった。しかしながら、アンチ−ＩＲＥＳはｂＣＥＬ ｍＲＮＡからのルシフェラーゼの翻訳を劇的に阻害した（図７、レーン７〜８とレーン９〜１０におけるルシフェラーゼ翻訳を比較せよ）。従って、アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴは特異的にリノウイルスＩＲＥＳ一依存的翻訳を阻害する。その上、修飾化核酸もしくは核酸アナログも本実施例の方法に利用することができる。
ルシフェラーゼ活性アッセイを実施して、アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴによるｂＬおよびｂＣＲＬ ｍＲＮＡからのルシフェラーゼの翻訳阻害を定量化した。³⁵Ｓ−メチオニン取り込みアッセイの結果と一致して、アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴはｂＬ ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ翻訳を阻害しなかったが（図８、レーン２および３を比較せよ）、一方でこれはｂＣＲＬ ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ翻訳を約９５％阻害した（図８、レーン５および６を比較せよ）。対照デオキシオリゴヌクレオチド（対照−オリゴ、非表示）を、アンチ−ＩＲＥＳ−オリゴに対して逆転させてあり、かつ相補的である配列を用いて合成した。従って対照デオキシオリゴヌクレオチドはおおよそ同じＧ−ＣおよびＡ−Ｔ組成を有するが、リノウイルス１４のＩＲＥＳのｎｔ５１８〜５５１にアニールすることができない。対照−オリゴはｂＬもしくはｂＣＲＬのｍＲＮＡの翻訳に何の影響も及ぼさなかった（図８、レーン４とレーン２を、そしてレーン７とレーン５を比較せよ）。従ってアンチ−ＩＲＥＳ−オリゴはリノウイルスのＩＲＥＳにより作動される翻訳を特異的に阻害するように思われる。
薬剤の投与
本発明の方法を実施する際には、組成物を単独もしくは互いに組み合わせてか、あるいは他の治療剤もしくは診断剤と組み合わせて用いることができる。これらの組成物はインビボで、通常は哺乳類において、好ましくはヒトにおいて、あるいはインビトロで利用することができる。これらをインビボで利用する際には、組成物を、非経口的、静脈内的、皮下的、筋肉内的、経結腸的、経直腸的、経膣的、経鼻的、経口的、経皮的、局所的、経眼的、腹膜内的を初めとする数々の方法において、もしくは数々の投与剤形態を利用する適切に製剤化される外科用移植片として哺乳類に投与することができる。当業者には容易に明白であろうが、投与すべき有用なインビボ用量および投与の特別な様式は、治療される哺乳類の種、利用する具体的な組成物、およびこれらの組成物を利用する特異的な用途に依存して変化するであろう。効果的な用量レベルとは所望される結果を達成するのに必要な用量レベルであり、この決定は当業者の技術範囲内に含まれるであろう。典型的には組成物の適応はより低い用量レベルで開始され、用量レベルを所望の効果が達成されるまで増加する。
本発明の組成物のための用量は、所望の効果および治療上の指示に依存して広域な範囲に及ぶことができる。典型的には用量は、約０．０１μｌと１００ｍｇ／ｋｇとの間、好ましくは約０．０１と１０ｍｇ／ｋｇ（体重）との間であろう。投与は毎日もしくは必要に応じての経口投与であることが好ましい。
選択される事例においては、薬物輸送用賦形剤を全身的もしくは局所的投与のために利用することができる。これらは徐放性リザーバーとして作用するようにか、あるいは標的細胞に直接それらの内容物を輸送するように設計することができる。
薬物の局所投与が有利であり、それは最少の全身的吸収を伴う投与部位での局在濃縮が可能になるためである。
薬剤を全身的に投与することもできる。全身吸収は、血流における薬物の蓄積およびその後の体全体への拡散を意味する。全身投与につながる投与経路には、経口投与、静脈内投与、皮下投与、腹膜内投与、経鼻投与、包膜内投与、および経眼投与がある。
本明細書に引用される全ての刊行物は、各刊行物内に列挙される核酸配列を含めて本明細書内の引用により本明細書に取り込まれる。
他の態様は以下の請求の範囲内に含まれる。
【配列表】
配列番号1:
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配列番号20:
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配列番号21:
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配列番号22:
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配列番号23:
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配列番号24:
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配列番号25:
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配列番号26:
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（xi）配列:SEQ ID NO:26:

Claims (11)

1. 組換え核酸を含む、抗ウイルス剤を同定するためのスクリーニングアッセイにおける使用のための細胞であって、組換え核酸が、
   ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
   上記ＩＲＥＳの上流の真核ｍＲＮＡ−５’末端キャップ及び非翻訳（ＵＴＲ）領域；及びレポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチド
   を含み、但し、上記ＩＲＥＳが上記ポリヌクレオチドに対して作動可能なように結合している、組換え核酸含有細胞。
2. 組換え核酸が、さらに、上記キャップ及びＵＴＲ領域に作動可能に連結された第二レポーター蛋白質をコードする、請求項１記載の細胞。
3. ＩＲＥＳがピコナルウイルスのＩＲＥＳである、請求項１記載の細胞。
4. ＩＲＥＳがＨＩＶのＩＲＥＳである、請求項１記載の細胞。
5. 組換え核酸がＲＮＡである、請求項１記載の細胞。
6. 抗ウイルス剤をスクリーニングするための方法であって、
   ａ）試験薬剤を、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；及び
   レポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチド
   を含み、上記ＩＲＥＳが上記ポリヌクレオチドに対して作動可能なように結合している組換え核酸を含む細胞と接触させ；そして
   ｂ）レポーター蛋白質の生産を評価するが
   但し、試験薬剤の存在下でのレポーター蛋白質の生産が試験薬剤の不存在下でのレポーター蛋白質の生産に比較して低下しているならば、試験薬剤は抗ウイルス剤である、方法。
7. レポーター蛋白質の光放射活性を評価することによりレポーター蛋白質の量を測定する、請求項６記載の方法。
8. Ｃ型肝炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）；
   上記Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳの上流の真核ｍＲＮＡ−５’末端キャップ及び非翻訳（ＵＴＲ）領域；及び
   レポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチド
   を含み、上記ＩＲＥＳが上記ポリヌクレオチドに対して作動可能なように結合している組換え核酸を含む細胞。
9. ＩＲＥＳがピコナルウイルスのＩＲＥＳである、請求項６記載の方法。
10. ＩＲＥＳがＨＩＶのＩＲＥＳである、請求項６記載の方法。
11. ＩＲＥＳがＣ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳである、請求項６記載の方法。

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