JP3820601B2

JP3820601B2 - Active oxygen scavenger

Info

Publication number: JP3820601B2
Application number: JP06760495A
Authority: JP
Inventors: 弘櫻井; 吉朗大津; 八重野有馬
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-03-27
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2021-09-13
Also published as: JPH08259438A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、活性酸素消去剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
生体にとって、酸素はエネルギー産生、代謝等生命の維持に必要不可欠である。該酸素はエネルギー産生系での反応、酵素反応、紫外線、放射線等による反応で酸素アニオンラジカル、過酸化イオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、次亜塩素酸イオン、一重項酸素等の所謂活性酸素種となる。該活性酸素種は酸素添加酵素、白血球の殺菌作用等生体にとり有用である反面、生体に豊富に存在するオレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸等の生体膜のリン脂質を形成する不飽和脂肪酸の過酸化を促進し、過酸化脂質を形成する。この過酸化脂質は、上記活性酸素種と同様にアルコキシラジカルやヒドロキシラジカルの発生を惹起し、生体膜を攻撃し、膜障害及び種々の有用酵素類の失活を招く〔代謝、１５（１０）、１９７８年特集活性酸素参照〕。しかるに生体内には例えばスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の上記活性酸素種の代謝失活に関与する酵素類が存在しており、またα−トコフェロール（ビタミンＥ）を始めとする各種の抗酸化能を有するビタミン類等が存在しており、之等の作用により通常正常な生体維持がなされているが、何らかの理由により上記酵素類、ビタミン類等により適切な防御機構に欠損が生じたり、又は之等防御機構の能力を越える活性酸素種の発生や過酸化脂質の生成、蓄積が起ることがしばしば認められる。斯かる防御機構の欠損等が生じた場合、過酸化反応の連鎖反応的進行に伴い重大な障害例えば血小板凝集による種々の疾病、炎症、肝障害、動脈硬化、溶血、老化乃至老人性痴呆症、網膜症、肺障害、ある種の薬物による心及び肺障害、虚血性血管疾患等が発生する。
【０００３】
また、活性酸素種のうちで、酵素のキサンチンオキシダーゼ等によってＯ₂から生成されるＯ₂ ^-とＨ₂Ｏ₂が反応して生じる・ＯＨが生体内に大きな障害を与えることが知られているが、Ｈ₂Ｏ₂を消去する化合物としては、カタラーゼと称される酵素が知られているだけであり、それ以外に有用な化合物は見出されていない。
【０００４】
本発明の目的は、上記各種障害の主要因と考えられる活性酸素種を除去（スカベンジ）し、過酸化脂質の生体内における生成・蓄積を防止又は低下させる作用を有する活性酸素消去剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、活性酸素種の放出を抑制するか、或いは活性酸素種を除去する活性を有する新しい薬剤を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、α−ツヤプリシン又はその塩、及びγ−ツヤプリシン又はその塩にこのような活性が認められ、しかもこれらの成分は、安定性が良好で、持続性に優れ、副作用がないことを見出した。また、これらの成分のうちで、α−ツヤプリシン又はその塩は、特に、過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）及び一重項酸素（¹Ｏ₂）の消去作用が非常に優れていることを見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明は、α−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩から選ばれた少なくとも一種の成分を有効成分とする活性酸素消去剤に係る。
【０００７】
本発明において有効成分として用いられるα−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩は既知化合物であり、例えば特開昭６０−２２８４１４号公報には斯かるトロポロン誘導体及びその塩が１２−リポキシゲナーゼ代謝産物に起因する疾患の予防治療剤として使用され得ることが開示されている。
【０００８】
本発明において有効成分として用いられるα−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩から選ばれた少なくとも一種の成分は、活性酸素種として一般に知られている全ての成分、例えば、酸素アニオンラジカル、過酸化イオン、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、次亜塩素酸イオン、一重項酸素等の活性酸素種の放出を抑制するか、或いは放出された活性酸素種を除去し、過酸化脂質の生体内生成防止乃至低下作用を有する。従って本発明の活性酸素消去剤は活性酸素種の過剰発生、過酸化脂質の生体内蓄積、或いは之等に対する防御機構の欠損に起因する各種障害乃至疾患の予防及び治療剤として、例えば抗動脈硬化剤、発癌予防剤、制癌剤、抗炎症剤、鎮痛剤、自己免疫疾患治療剤、血小板凝集抑制剤、降圧剤、抗高脂血症剤、未熟児網膜症及び白内障予防及び治療剤等の医薬として有用である。また本発明の活性酸素消去剤は、例えば心筋梗塞や不整脈等の心臓虚血疾患に対する治療剤、移植・微小循環不全等による障害に対する肝及び腎機能改善剤、胃潰瘍等の消化器性潰瘍に対する治療剤、脳出血、脳梗塞、一過性脳虚血疾患に対する治療剤、例えば皮膚脈管炎、乾癬、多形性紅疹、ベーチェット病、水痘性皮膚炎、セメント皮膚炎、日焼け症、日焼け予防、神経皮膚炎、湿疹、肛門性器そう痒症、ヒトの皮膚炎等の皮膚疾患、白血球の減少、脱毛や皮膚の発赤、吐き気、食欲不振等のＸ線、α線、β線、γ線、中性子線、加速電子線等の放射線による放射線被爆障害の治療、ヒト以外の哺乳動物（犬、猫等のペットや牛、馬等の家畜等）の皮膚疾患、糖尿病、眼球鉄症、網膜炎、色素沈着症等の眼疾患、肺気腫、成人呼吸窮迫症候群、関節炎、悪性リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン氏病、レイノー氏病等の他、しみ、そばかすや色素沈着防止、火傷、外傷、疲労等の治療薬として有用である。更に本発明の活性酸素消去剤は上記医薬品としてのみならず、例えば加工食品等に含まれる油脂の抗酸化剤等としての用途にも有効なものである。
【０００９】
本発明の活性酸素消去剤の有効成分の内で、特に、α−ツヤプリシン又はその塩は、活性酸素種のうちで過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）及び一重項酸素（¹Ｏ₂）を消去する活性が非常に優れたものである。
【００１０】
α−ツヤプリシンの塩、及びγ−ツヤプリシンの塩としては、例えばナトリウム、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、Ｃｕ塩、Ｚｎ塩等の金属塩類等の無機塩、ジエタノールアミン塩、２−アミノ−２−エチル−１，３−プロパンジオール塩、トリエタノールアミン塩等のアルカノールアミン塩、モルホリン塩、ピペラジン塩、ピペリジン塩等、アンモニウム塩、アルギニン塩、リジン塩、ヒスチジン塩等の塩基性アミノ酸塩等の有機塩類を挙げることができる。塩基性アミノ酸としては、Ｄ体、Ｌ体又は之等の混合物のいずれも使用できる。
【００１１】
本発明では、α−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩から選ばれた成分を、一種単独で或いは二種以上を混合して用いることができる。
【００１２】
本発明の活性酸素消去剤は、通常、一般的な医薬製剤の形態で用いられる。製剤は通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の稀釈剤或いは賦形剤を用いて調製される。この医薬製剤としては各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等の他、ローション、クリーム、軟膏等の外用剤等でも使用可能である。
【００１３】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来より広く使用されているものがいずれも使用可能であり、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン未、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第四級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等が例示できる。更に錠剤は必要に応じて通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣剤、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠或いは二重錠、多層錠とすることができる。
【００１４】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体としてこの分野で従来公知のものを広く使用でき、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノール等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等が例示できる。
【００１５】
坐剤の形態に成形するに際しては、担体として従来公知のものを広く使用でき、例えば、ポリエチレングリコール、カカオ脂、高級アルコールのエステル類、ゼラチン、半合成グリセライド等を挙げることができる。
【００１６】
更に注射剤として調製される場合には、液剤、乳剤及び懸濁剤は殺菌され、かつ血液と等張であるのが好ましく、これら液剤、乳剤及び懸濁剤の形態に成形するのに際しては、希釈剤としてこの分野において慣用されているものをすべて使用でき、例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等を挙げることができる。尚、この場合等張性の溶液を調製するに充分な量の食塩、ブドウ糖或いはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、緩衝剤、無痛化剤等を、更に必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を該製剤中に含有せしめてもよい。
【００１７】
ペースト、クリーム及びゲルの形態に成形するに際しては、希釈剤として例えば、白色ワセリン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト等を使用できる。
【００１８】
また本発明の活性酸素消去剤は、皮膚に適用される皮膚料として洗浄用化粧料、化粧水、クリーム、乳液、メイクアップクリーム、化粧用オイル、パック等の基礎化粧料、ファンデーション、口紅、頬紅、アイライナー、マスカラ、アイシャドー、マニキュア、白粉等の仕上げ化粧料、整髪剤、養毛剤等の頭髪用化粧料、浴用剤、美白剤、サンスクリーン剤、ニキビ用剤等の各種形態とすることができ、これらはこの分野で慣用されている方法に従って製造することができる。その際、公知の各種化粧料基剤を使用でき、更に必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲内で各種の油脂、ロウ、炭化水素、脂肪酸、高級アルコール、エステル油、金属石ケン等の油脂原料、動物・植物抽出液、ビタミン剤、ホルモン剤等の薬効剤、界面活性剤、色素、染料、顔料、香料、防腐剤、殺菌剤、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、金属封鎖剤、紫外線吸収剤、その他の添加剤を適宜組み合わせて使用し得る。
【００１９】
本発明の活性酸素消去剤に含有されるα−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩から選ばれた少なくとも一種の成分の量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択されるが、通常医薬製剤中１〜７０重量％程度とするのがよい。
【００２０】
本発明の活性酸素消去剤の投与方法は特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等に応じた方法で投与される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤の場合には経口投与される。また注射剤の場合には単独で或いはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更には必要に応じて単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。坐剤の場合には直腸内投与される。更に、ローション、クリーム、軟膏等の外用剤の場合には塗布投与される。
【００２１】
上記医薬製剤の投与量は用法、患者の年齢、性別その他の条件、疾患の程度等により適宜選択されるが、通常、本発明活性酸素消去剤の有効成分であるα−ツヤプリシン及びその塩、並びにγ−ツヤプリシン及びその塩から選ばれた少なくとも一種の成分の量は１日当り体重１ｋｇ当り１〜１０ｍｇ程度、好ましくは２〜５ｍｇ程度とするのがよく、１日に１〜２回に分けて投与することができる。
【００２２】
【発明の効果】
本発明の活性酸素消去剤は、活性酸素の放出を抑制するか、或いは放出された活性酸素種を除去し、過酸化脂質の生体内生成防止乃至低下作用を有し、しかも安定性が良好で、持続性に優れ、副作用を有しないものである。
【００２３】
本発明の活性酸素消去剤のうちで、α−ツヤプリシン又はその塩を有効成分とする活性酸素消去剤は、特に、過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）及び一重項酸素（¹Ｏ₂）の消去剤として非常に優れた活性を有するものである。
【００２４】
【実施例】
以下、本発明を更に詳細に説明するため、本発明活性酸素消去剤の製剤例を挙げ、更に有効成分化合物の試験例を挙げる。
【００２５】
製剤例１
α−ツヤプリシン１５０ｇ
アビセル（商標名，旭化成社製）４０ｇ
コーンスターチ３０ｇ
ステアリン酸マグネシウム２ｇ
ヒドロキシプロピルメチルセルロース１０ｇ
ポリエチレングリコール−６０００３ｇ
ヒマシ油４０ｇ
エタノール４０ｇ
α−ツヤプリシン、アビセル、コーンスターチ及びステアリン酸マグネシウムを混合研磨後、糖衣Ｒ１０ｍｍのキネで打錠する。得られた錠剤をヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレングリコール−６０００、ヒマシ油及びエタノールからなるフィルムコーティング剤で被覆を行ない、フィルムコーティング錠を製造する。
【００２６】
製剤例２
α−ツヤプリシン１５０ｇ
クエン酸１．０ｇ
ラクトース３３．５ｇ
リン酸二カルシウム７０．０ｇ
プルロニックＦ−６８３０．０ｇ
ラウリル硫酸ナトリウム１５．０ｇ
ポリビニルピロリドン１５．０ｇ
ポリエチレングリコール
（カルボワックス１５００）４．５ｇ
ポリエチレングリコール
（カルボワックス６０００）４５．０ｇ
コーンスターチ３０．０ｇ
乾燥ステアリン酸ナトリウム３．０ｇ
乾燥ステアリン酸マグネシウム３．０ｇ
エタノール適量
α−ツヤプリシン、クエン酸、ラクトース、リン酸二カルシウム、プルロニックＦ−６８及びラウリル硫酸ナトリウムを混合する。
【００２７】
上記混合物をＮo.６０スクリーンでふるい、ポリビニルピロリドン、カルボワックス１５００及び同６０００を含むアルコール製溶液で湿式粒状化する。必要に応じてアルコールを添加して粉末をペースト状塊にする。コーンスターチを添加し、均一な粒子が形成されるまで混合を続ける。混合物をＮo.１０スクリーンを通過させ、トレイに入れ、１００℃のオーブンで１２〜１４時間乾燥する。乾燥粒子をＮo.１６スクリーンでふるい、乾燥ラウリル硫酸ナトリウム及び乾燥ステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、打錠機で所望の形状に圧縮する。
【００２８】
上記の芯部をワニスで処理し、タルクを散布し、湿気の吸収を防止する。芯部の周囲に下塗り層を被覆する。内服用のために充分な回数のワニス被覆を行なう。錠剤を完全に丸く且つ平滑にするために更に下塗り層及び平滑被覆が適用される。所望の色合が得られるまで着色被覆を行なう。乾燥後、被覆錠剤を磨いて均一な光沢の錠剤にする。
【００２９】
製剤例３
γ−ツヤプリシン５ｇ
ポリエチレングリコール
（分子量：４０００）０．３ｇ
塩化ナトリウム０．９ｇ
ポリオキシエチレン−ソルビタンモノ
オレエート０．４ｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム０．１ｇ
メチル−パラベン０．１８ｇ
プロピル−パラベン０．０２ｇ
注射用蒸留水１０．０ｍｌ
上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを攪拌しながら８０℃で上記の約半量の蒸留水に溶解させる。得られた溶液を４０℃まで冷却し、γ−ツヤプリシン、次いでポリエチレングリコール及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを、上記溶液中に溶解させる。次にその溶液に注射用蒸留水を加えて最終の容量に調製し、適当なフイルターペーパーを用いて滅菌濾過することにより滅菌して、注射剤を調製する。
【００３０】
次に本発明の活性酸素消去剤を皮膚料として使用する場合の製剤例を示す。尚、以下において「％」は全て「重量％」を意味する。
【００３１】
製剤例４（バニシングクリーム）

（ａ）上記（１）〜（６）の成分を８０〜８５℃に加温し、均一に溶解した。
【００３２】
（ｂ）上記（７）及び（８）の成分と（11）の精製水を８０〜８５℃に加温し、均一に溶解した。
【００３３】
（ｃ）次いで、８０℃で上記（ａ）に上記（ｂ）を少量ずつ添加し、均一に乳化した後、攪拌下４５℃まで冷却した。
【００３４】
（ｄ）４５℃で（ｃ）に上記（９）と（10）の混合物を添加後、均一に攪拌し、更に攪拌下室温まで冷却した。
【００３５】
製剤例５（クレンジングクリーム）

上記（１）〜（11）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のクレンジングクリームを得た。
【００３６】
製剤例６（ミルクローション）

上記（１）〜（９）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のミルクローションを得た。
【００３７】
製剤例７（メイクアップクリーム）

上記（１）〜（12）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のメイクアップクリームを得た。
【００３８】
製剤例８（栄養クリーム）

上記（１）〜（10）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のメイクアップクリームを得た。
【００３９】
製剤例９（Ｗ／Ｏ型クリーム）

上記（１）〜（８）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のＷ／Ｏ型クリームを得た。
【００４０】
製剤例１０（パック（ピールオフ型））

上記（６）の精製水に一部のエチルアルコールで湿潤した成分（１）のポリビニルアルコールと成分（２）のポリビニルピロリドンを加えた後、８０℃に加温し時々攪拌しながら均一に混合後、室温下一夜放置する。翌日成分（４）及び（５）と成分（６）の残部を加え６０℃に加温し均一に混合した後、攪拌下室温まで冷却し、目的のパックを得た。
【００４１】
製剤例１１（化粧水）

（ａ）上記エチルアルコールに上記（２）〜（４）の成分を加え、均一に溶解した。
【００４２】
（ｂ）上記（９）の精製水に上記（５）〜（７）を加え、均一に溶解した。
【００４３】
（ｃ）次いで、上記（ａ）に上記（ｂ）を加え、均一に混合し可溶化した後上記（８）の色素で着色し化粧水を得た。
【００４４】
製剤例１２（粉白粉）

上記（１）〜（７）の成分を均一に混合し、常法に従って粉白粉を得た。
【００４５】
製剤例１３（サンスクリーン乳液）

上記（１）〜（13）の成分を製剤例４に準じて添加し、適宜加温、攪拌、冷却後、目的のサンスクリーン乳液を得た。
【００４６】
製剤例１４（リップクリーム）

上記（１）〜（10）の成分を加温（８５℃）し均一相とした後、脱泡後型に流し込み急冷してスティック状とし、目的のリップスティックを得た。
【００４７】
製剤例１５（親水軟膏）

上記（１）〜（４）の成分を加温し均一に溶融した後７５℃に保ち、これに予め上記成分（５）及び（６）を上記成分（７）に溶解した後７５℃に加温した液を加え、均一に攪拌後、攪拌下冷却し、目的の親水軟膏を得た。
【００４８】
製剤例１６（ヘアトニック）

（ａ）上記（１）のエチルアルコールに上記（２）〜（５）の成分を加え、均一に溶解した。
【００４９】
（ｂ）上記（８）の精製水に上記（６）及び（７）を加え、均一に溶解した。
【００５０】
（ｃ）次いで、上記（ａ）に上記（ｂ）を加え、均一に混合し目的のヘアトニックを得た。
【００５１】
薬理試験（化学発光法による活性酸素消去活性の測定）
１．試験溶液の調製方法
１）１ｍＭ α−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液
α−ツヤプリシン（高砂香料工業（株）製）０．０３２９ｇに０．１ＭＮａＯＨ水溶液２ｍｌを正確に加え、均一混合、溶解後、精製水を加えて正確に２００ｍｌとした。
【００５２】
２）１ｍＭ γ−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液
γ−ツヤプリシン（高砂香料工業（株）製）０．０３２９ｇに０．１ＭＮａＯＨ水溶液２ｍｌを正確に加え、均一混合、溶解後、精製水を加えて正確に２００ｍｌとした。
【００５３】
３）１００ｍＭ α−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液
α−ツヤプリシン（高砂香料工業（株）製）０．８２１０ｇに１ＭＮａＯＨ水溶液５ｍｌを正確に加え、均一混合、溶解後、精製水を加えて正確に５０ｍｌとした。
【００５４】
４）１００ｍＭ γ−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液
γ−ツヤプリシン（高砂香料工業（株）製）０．８２１０ｇに１ＭＮａＯＨ水溶液５ｍｌを正確に加え、均一混合、溶解後、精製水を加えて正確に５０ｍｌとした。
【００５５】
２．測定装置
化学発光は、アロカ（Ａｌｏｋａ）社製、ルミネッセンスリーダー（ＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＣＥＲＥＡＤＥＲ）（ＢＬＲ−２０１）を用いて測定した。
【００５６】
３．試験方法
（１）Ｈ₂Ｏ₂消去活性
小試験管に５００μＭルミノール２００μｌ（ｐＨ１１．０，０．１Ｍホウ酸バッファーに溶解）及び１５０μＭヘマチン２００μｌ（上記バッファーに溶解）を入れて混合し、約１時間静置した。この液に種々の濃度の試験用サンプル１００μｌずつを入れて混合し、３０℃に温度設定しておいた測定装置にセットして、２００μＭＨ₂Ｏ₂１０μｌ（上記バッファーに溶解）をマイクロシリンジで注入し、化学発光を測定した。試験用サンプルとしては、測定の直前に上記１）の１ｍＭα−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液、又は上記２）の１ｍＭγ−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液を上記バッファーで希釈して各種濃度に調整したものを用いた。
【００５７】
測定は、１濃度につき３回ずつ行ない、平均値をデータとしてグラフを描いた（サンプル濃度０を含むグラフ）。このグラフからサンプル濃度０の時の化学発光を５０％消去するサンプル濃度、すなわち、ＩＣ₅₀を求めた。
【００５８】
同様の試験を３回行ない、３回の試験から得られたＩＣ₅₀を平均して、最終的なＩＣ₅₀値とした。
【００５９】
（２）・ＯＨ消去活性
Ａ）小試験管に２５０μＭルミノール１００μｌ（ｐＨ７．８，５０ｍＭリン酸バッファーに溶解）を入れ、約１時間静置した。この液に１００μＭ硫酸第１鉄５０μｌ（蒸留水で溶解し、１Ｍ硫酸１V/V ％を添加）、２．５ｍＭジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）５０μｌ（上記バッファーに溶解）、ｐＨ７．８の５０ｍＭリン酸バッファー３００μｌ、及び種々の濃度の試験用サンプル１００μｌを入れて混合し、３０℃に温度設定しておいた測定装置にセットし、６ｍＭＨ₂Ｏ₂１０μｌ（上記バッファーに溶解）をマイクロシリンジで注入し、化学発光を測定した。試験用サンプルとしては、測定の直前に上記１）の１ｍＭα−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液、又は上記２）の１ｍＭγ−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液を上記バッファーで希釈して各種濃度に調整したものを用いた。
【００６０】
Ｂ）上記Ａ）と同様の方法で、ｐＨ７．８の５０ｍＭリン酸バッファー３００μｌの代わりに、エタノール３００μｌを入れ、化学発光を測定した。
【００６１】
Ｃ）上記Ａ）の測定値から上記Ｂ）の測定値を差し引いて、データとした。
【００６２】
測定は、１濃度につき３回ずつ行ない、平均値をデータとしてグラフを描いた（サンプル濃度０を含むグラフ）。このグラフからサンプル濃度０の時の化学発光を５０％消去するサンプル濃度、すなわち、ＩＣ₅₀を求めた。
【００６３】
同様の試験を３回行ない、３回の試験から得られたＩＣ₅₀を平均して、最終的なＩＣ₅₀値とした。
【００６４】
（３）¹Ｏ₂消去活性
小試験管に２．２μＭウミホタルミフェリン（ＣＬＡ）１００μｌ（ｐＨ４．５，０．１Ｍ酢酸バッファーに溶解）、５．５ｍＭＤＴＰＡ１００μｌ（上記バッファーに溶解）、４００ｍＭＨ₂Ｏ₂２００μｌ（上記バッファーに溶解）及び種々の濃度の試験用サンプル１００μｌを入れて混合し、３０℃に温度設定しておいた測定装置にセットして、１０Ｍ次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）１０μｌ（上記バッファーに溶解）をマイクロシリンジで注入し、化学発光を測定した。試験用サンプルとしては、測定の直前に上記３）の１００ｍＭα−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液、又は上記４）の１００ｍＭγ−ツヤプリシンＮａＯＨ水溶液を上記バッファーで希釈して各種濃度に調整したものを用いた。
【００６５】
測定は、１濃度につき３回ずつ行ない、平均値をデータとしてグラフを描いた（サンプル濃度０を含むグラフ）。このグラフからサンプル濃度０の時の化学発光を５０％消去するサンプル濃度、すなわち、ＩＣ₅₀を求めた。
【００６６】
同様の試験を３回行ない、３回の試験から得られたＩＣ₅₀を平均して、最終的なＩＣ₅₀値とした。
【００６７】
以上の結果を下記表１に示す。
【００６８】
【表１】

【００６９】[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an active oxygen scavenger.
[0002]
[Prior art and problems to be solved by the invention]
For living bodies, oxygen is indispensable for maintaining life such as energy production and metabolism. The oxygen is a so-called reactive oxygen species such as oxygen anion radical, peroxide ion, hydroxy radical, hydrogen peroxide, hypochlorite ion, singlet oxygen, etc. by reaction in energy production system, enzyme reaction, ultraviolet ray, radiation, etc. It becomes. The reactive oxygen species is useful for living organisms, such as oxygenated enzymes and leukocyte bactericidal activity, but is unsaturated that forms phospholipids in biological membranes such as oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and arachidonic acid that are abundant in living organisms. Promotes peroxidation of fatty acids and forms lipid peroxides. This lipid peroxide causes the generation of alkoxy radicals and hydroxy radicals as in the above-mentioned reactive oxygen species, attacks biological membranes, and causes membrane damage and inactivation of various useful enzymes [metabolism, 15 (10) 1978, Special Feature Active Oxygen Reference]. However, there are enzymes involved in metabolic inactivation of the above active oxygen species such as superoxide dismutase (SOD), catalase, glutathione peroxidase in the living body, and also α-tocopherol (vitamin E). There are various types of vitamins that have anti-oxidant activity, and normal living organisms are usually maintained by their actions. However, for some reason, the above-mentioned enzymes, vitamins, etc. are deficient in the proper defense mechanism. It is often observed that the generation of reactive oxygen species or the generation and accumulation of lipid peroxides that occur or exceed the capabilities of such defense mechanisms occur. When such a defense mechanism deficiency or the like occurs, various disorders such as platelet aggregation, inflammation, liver damage, arteriosclerosis, hemolysis, aging or senile dementia associated with the progression of the chain reaction of the peroxidation reaction, Retinopathy, lung disorders, heart and lung disorders caused by certain drugs, ischemic vascular diseases, etc. occur.
[0003]
Moreover, among the active oxygen species, O ₂ generated from the O ₂ by xanthine oxidase enzymes such as ^- is known to give a H ₂ O ₂ major failure · OH generated by the reaction of the body However, as a compound that eliminates H ₂ O ₂ , only an enzyme called catalase is known, and no other useful compound has been found.
[0004]
An object of the present invention is to provide an active oxygen scavenger having an action of removing (scavenging) reactive oxygen species considered to be the main cause of the above-mentioned various obstacles and preventing or reducing lipid peroxide generation and accumulation in vivo. There is.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of earnest research to provide a new drug having the activity of suppressing the release of reactive oxygen species or removing the reactive oxygen species, the present inventor has obtained α-tyaprisin or a salt thereof, and γ-tyaprisin or The salt was found to have such activity, and these components were found to have good stability, excellent durability and no side effects. Further, among these components, α-tyaprisin or a salt thereof has been found to be particularly excellent in the scavenging action of hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) and singlet oxygen ( ¹ O ₂ ), This led to the completion of the present invention.
[0006]
That is, the present invention relates to an active oxygen scavenger comprising as an active ingredient at least one component selected from α-tyaprisin and a salt thereof, and γ-tyaprisin and a salt thereof.
[0007]
Α-Tyaprisin and its salt and γ-Tyapricin and its salt used as active ingredients in the present invention are known compounds. For example, JP-A-60-228414 discloses such a tropolone derivative and its salt as 12-lipoxygenase. It is disclosed that it can be used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases caused by metabolites.
[0008]
At least one component selected from α-tyaprisin and a salt thereof, and γ-tjaprisin and a salt thereof used as an active ingredient in the present invention is any component generally known as an active oxygen species, for example, an oxygen anion radical Inhibits the release of reactive oxygen species such as peroxide ions, hydroxy radicals, hydrogen peroxide, hypochlorite ions, singlet oxygen, or removes released active oxygen species, and the lipid peroxide in vivo Has the effect of preventing or reducing the generation. Accordingly, the active oxygen scavenger of the present invention is used as a prophylactic and therapeutic agent for various disorders or diseases caused by excessive generation of reactive oxygen species, in vivo accumulation of lipid peroxides, or lack of defense mechanisms, etc. As a drug for the prevention, treatment and treatment of retinopathy of prematurity and cataract, anti-hyperlipidemic agent, anti-hyperlipidemic agent, anti-hyperlipidemic agent, anti-hyperlipidemic agent, anti-inflammatory agent, anti-inflammatory agent, analgesic agent Useful. In addition, the active oxygen scavenger of the present invention is a therapeutic agent for cardiac ischemic diseases such as myocardial infarction and arrhythmia, liver and kidney function improving agent for disorders due to transplantation / microcirculation failure, etc., and treatment for digestive ulcers such as gastric ulcer Agent, treatment for cerebral hemorrhage, cerebral infarction, transient cerebral ischemic disease, such as dermatological vasculitis, psoriasis, polymorphic erythema, Behcet's disease, varicella dermatitis, cement dermatitis, sunburn, sun protection, Neurodermatitis, eczema, genital pruritus, human dermatitis and other skin diseases, leukocyte depletion, hair loss and redness of the skin, nausea, loss of appetite, alpha rays, beta rays, gamma rays, neutrons Treatment of radiation exposure damage caused by radiation such as X-rays and accelerated electron beams, skin diseases of mammals other than humans (pets such as dogs and cats, livestock such as cattle and horses), diabetes, ocular iron disease, retinitis, pigments Eye diseases such as deposition disease, emphysema, adult respiratory distress symptoms , Arthritis, malignant arthritis, ulcerative colitis, Crohn's disease, other Raynaud's disease, etc., stains, freckles and pigmentation prevention, burns, trauma, are useful as therapeutic agents of fatigue and the like. Furthermore, the active oxygen scavenger of the present invention is effective not only as the above-mentioned pharmaceutical, but also as an antioxidant for fats and oils contained in processed foods, for example.
[0009]
Among the active ingredients of the active oxygen scavenger of the present invention, in particular, α-tuaplysin or a salt thereof scavenges hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) and singlet oxygen ( ¹ O ₂ ) among the active oxygen species. It has a very good activity.
[0010]
Examples of salts of α-tyaprisin and γ-tyaprisin include inorganic salts such as alkali metal salts such as sodium and potassium salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts, metal salts such as Cu salts and Zn salts, Alkanolamine salts such as diethanolamine salt, 2-amino-2-ethyl-1,3-propanediol salt, triethanolamine salt, morpholine salt, piperazine salt, piperidine salt, ammonium salt, arginine salt, lysine salt, histidine salt And organic salts such as basic amino acid salts. As the basic amino acid, any of D-form, L-form, or a mixture of these can be used.
[0011]
In the present invention, components selected from α-tyaprisin and its salt, and γ-tyaprisin and its salt can be used singly or in admixture of two or more.
[0012]
The active oxygen scavenger of the present invention is usually used in the form of a general pharmaceutical preparation. The preparation is prepared using a commonly used diluent or excipient such as a filler, a filler, a binder, a moistening agent, a disintegrant, a surfactant, a lubricant and the like. Various forms of this pharmaceutical preparation can be selected according to the purpose of treatment. Representative examples thereof include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, injections ( In addition to liquids, suspensions, etc., external preparations such as lotions, creams, ointments and the like can also be used.
[0013]
Any of those conventionally used in this field as carriers can be used for forming into a tablet form. For example, lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, calcium carbonate, kaolin, crystals Excipients such as cellulose and silicic acid, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution, starch solution, gelatin solution, binders such as carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, potassium phosphate, polyvinylpyrrolidone, dry starch, alginic acid Disintegrating agents such as sodium, agar, not laminaran powder, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, stearic acid monoglyceride, starch, lactose, sucrose, stearin, cocoa butter, Disintegration inhibitors such as additive oils, absorption accelerators such as quaternary ammonium bases and sodium lauryl sulfate, humectants such as glycerin and starch, adsorbents such as starch, lactose, kaolin, bentonite and colloidal silicic acid, purification Examples thereof include lubricants such as talc, stearate, boric acid powder, and polyethylene glycol. Furthermore, the tablet can be made into a tablet coated with a normal coating as necessary, for example, a sugar coating, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric-coated tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet.
[0014]
In molding into a pill form, conventionally known carriers can be widely used as carriers, such as glucose, lactose, starch, cocoa butter, hydrogenated vegetable oil, kaolin, talc and other excipients, gum arabic powder, Examples thereof include binders such as tragacanth powder, gelatin and ethanol, and disintegrants such as laminaran and agar.
[0015]
In molding into a suppository, conventionally known carriers can be widely used, and examples thereof include polyethylene glycol, cacao butter, higher alcohol esters, gelatin, and semi-synthetic glyceride.
[0016]
Further, when prepared as an injection, solutions, emulsions and suspensions are preferably sterilized and isotonic with blood. In forming these solutions, emulsions and suspensions, Any of those commonly used in this field can be used as the diluent, and examples thereof include water, ethyl alcohol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. . In this case, a sufficient amount of sodium chloride, glucose or glycerin to prepare an isotonic solution may be contained in the pharmaceutical preparation, and a normal solubilizer, buffer, soothing agent, etc. If necessary, colorants, preservatives, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, and other pharmaceuticals may be included in the preparation.
[0017]
When forming into the form of paste, cream and gel, for example, white petrolatum, paraffin, glycerin, cellulose derivatives, polyethylene glycol, silicon, bentonite and the like can be used as a diluent.
[0018]
In addition, the active oxygen scavenger of the present invention is a cosmetic for washing, a lotion, a cream, a milky lotion, a makeup cream, a cosmetic oil, a basic cosmetic such as a pack, a foundation, a lipstick, and a blusher. Finishing cosmetics such as eyeliner, mascara, eye shadow, nail polish, white powder, hair cosmetics such as hair conditioners, hair nourishing agents, bath preparations, whitening agents, sunscreen agents, acne preparations, etc. These can be prepared according to methods conventionally used in this field. At that time, various known cosmetic bases can be used, and various fats, waxes, hydrocarbons, fatty acids, higher alcohols, ester oils, metal soaps, etc., as long as the effects of the present invention are not impaired as required. Oil and fat ingredients, animal and plant extracts, vitamins, hormones and other medicinal agents, surfactants, pigments, dyes, pigments, fragrances, preservatives, bactericides, moisturizers, thickeners, antioxidants, metals A blocking agent, an ultraviolet absorber, and other additives can be used in appropriate combination.
[0019]
The amount of at least one component selected from α-tyaprisin and its salt, and γ-tjaprisin and its salt contained in the active oxygen scavenger of the present invention is not particularly limited and is appropriately selected from a wide range. In general, it is recommended to be about 1 to 70% by weight in the pharmaceutical preparation.
[0020]
The administration method of the active oxygen scavenger of the present invention is not particularly limited, and is administered by a method according to various preparation forms, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, and the like. For example, tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules are orally administered. In the case of an injection, it is administered intravenously alone or mixed with a normal fluid such as glucose or amino acid, and further administered alone intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally as necessary. In the case of a suppository, it is administered intrarectally. Furthermore, in the case of external preparations such as lotions, creams and ointments, they are applied and administered.
[0021]
The dosage of the above pharmaceutical preparation is appropriately selected depending on the usage, patient age, sex and other conditions, the degree of disease, etc., but usually α-tyaprisin and its salt, which are active ingredients of the present active oxygen scavenger, and The amount of at least one component selected from γ-tyaprisin and its salt is about 1 to 10 mg, preferably about 2 to 5 mg per kg body weight per day, and is divided into 1 to 2 times per day. can do.
[0022]
【The invention's effect】
The active oxygen scavenger of the present invention suppresses the release of active oxygen or removes the released active oxygen species to prevent or reduce the formation of lipid peroxide in vivo, and has good stability. It is excellent in sustainability and has no side effects.
[0023]
Among the active oxygen scavengers of the present invention, the active oxygen scavenger having α-tyaprisin or a salt thereof as an active ingredient is particularly an scavenger of hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) and singlet oxygen ( ¹ O ₂ ). It has very excellent activity as an agent.
[0024]
【Example】
Hereinafter, in order to describe the present invention in more detail, formulation examples of the active oxygen scavenger of the present invention are given, and further test examples of active ingredient compounds are given.
[0025]
Formulation Example 1
α-tsuyaprisin 150g
Avicel (trade name, manufactured by Asahi Kasei) 40g
Corn starch 30g
Magnesium stearate 2g
Hydroxypropyl methylcellulose 10g
Polyethylene glycol-6000 3g
Castor oil 40g
Ethanol 40g
After α-tsuyaprisin, Avicel, corn starch and magnesium stearate are mixed and polished, they are tableted with a sugar-coated R10 mm kine. The obtained tablets are coated with a film coating agent comprising hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene glycol-6000, castor oil and ethanol to produce film-coated tablets.
[0026]
Formulation Example 2
α-tsuyaprisin 150g
Citric acid 1.0g
Lactose 33.5g
Dicalcium phosphate 70.0g
Pluronic F-68 30.0g
Sodium lauryl sulfate 15.0g
Polyvinylpyrrolidone 15.0g
Polyethylene glycol (Carbowax 1500) 4.5g
Polyethylene glycol (Carbowax 6000) 45.0g
Cornstarch 30.0g
3.0g dry sodium stearate
Dry magnesium stearate 3.0g
Ethanol Appropriate amount α-Tyapricin, citric acid, lactose, dicalcium phosphate, Pluronic F-68 and sodium lauryl sulfate are mixed.
[0027]
The mixture is sieved with a No. 60 screen and wet granulated with an alcoholic solution containing polyvinylpyrrolidone, carbowax 1500 and 6000. Alcohol is added as necessary to make the powder into a pasty mass. Add corn starch and continue mixing until uniform particles are formed. The mixture is passed through a No. 10 screen, placed in a tray and dried in an oven at 100 ° C. for 12-14 hours. The dried particles are sieved through a No. 16 screen, dried sodium lauryl sulfate and dried magnesium stearate are added and mixed, and compressed into the desired shape on a tablet press.
[0028]
Treat the core with varnish, spray talc and prevent moisture absorption. An undercoat layer is coated around the core. Apply varnish a sufficient number of times for internal use. Further subbing layers and smooth coatings are applied to make the tablet completely round and smooth. Color coating is performed until the desired color is obtained. After drying, the coated tablet is polished to a uniform gloss tablet.
[0029]
Formulation Example 3
γ-Tjapricin 5g
Polyethylene glycol (molecular weight: 4000) 0.3g
Sodium chloride 0.9g
0.4 g of polyoxyethylene-sorbitan monooleate
Sodium metabisulfite 0.1g
Methyl-paraben 0.18g
Propyl-paraben 0.02g
Distilled water for injection 10.0ml
The parabens, sodium metabisulfite and sodium chloride are dissolved in about half of the distilled water at 80 ° C. with stirring. The resulting solution is cooled to 40 ° C. and γ-Tyapricin, then polyethylene glycol and polyoxyethylene sorbitan monooleate are dissolved in the solution. Next, distilled water for injection is added to the solution to prepare a final volume, and sterilized by sterilizing filtration using an appropriate filter paper to prepare an injection.
[0030]
Next, formulation examples when the active oxygen scavenger of the present invention is used as a skin material will be shown. In the following, “%” means “% by weight”.
[0031]
Formulation Example 4 (vanishing cream)

(A) The above components (1) to (6) were heated to 80 to 85 ° C. and dissolved uniformly.
[0032]
(B) The above components (7) and (8) and purified water (11) were heated to 80 to 85 ° C. and dissolved uniformly.
[0033]
(C) Next, the above (b) was added little by little to the above (a) at 80 ° C. and uniformly emulsified, and then cooled to 45 ° C. with stirring.
[0034]
(D) After adding the mixture of (9) and (10) to (c) at 45 ° C., the mixture was stirred uniformly and further cooled to room temperature with stirring.
[0035]
Formulation Example 5 (cleansing cream)

The components (1) to (11) above were added according to Formulation Example 4, and the desired cleansing cream was obtained after appropriately heating, stirring and cooling.
[0036]
Formulation Example 6 (milk lotion)

The above components (1) to (9) were added according to Formulation Example 4, and the desired milk lotion was obtained after appropriately heating, stirring and cooling.
[0037]
Formulation Example 7 (Makeup Cream)

The above components (1) to (12) were added according to Formulation Example 4, and after appropriately heating, stirring and cooling, the desired makeup cream was obtained.
[0038]
Formulation Example 8 (nutrition cream)

The above components (1) to (10) were added according to Formulation Example 4, and after appropriately heating, stirring and cooling, the desired makeup cream was obtained.
[0039]
Formulation Example 9 (W / O type cream)

The above components (1) to (8) were added according to Formulation Example 4, and the desired W / O cream was obtained after appropriately heating, stirring and cooling.
[0040]
Formulation Example 10 (Pack (Peel-off type))

After adding the polyvinyl alcohol of component (1) and the polyvinyl pyrrolidone of component (2) wetted with a part of ethyl alcohol to the purified water of (6) above, heat to 80 ° C. and mix evenly with occasional stirring Let stand at room temperature overnight. On the next day, the remainder of components (4) and (5) and component (6) was added, heated to 60 ° C. and mixed uniformly, and then cooled to room temperature with stirring to obtain the desired pack.
[0041]
Formulation Example 11 (Lotion)

(A) The above components (2) to (4) were added to the ethyl alcohol and dissolved uniformly.
[0042]
(B) The above (5) to (7) were added to the purified water of (9) above and dissolved uniformly.
[0043]
(C) Next, the above (b) was added to the above (a), mixed and solubilized uniformly, and then colored with the above-mentioned pigment (8) to obtain a lotion.
[0044]
Formulation Example 12 (powdered white powder)

The above components (1) to (7) were uniformly mixed, and powdered white powder was obtained according to a conventional method.
[0045]
Formulation Example 13 (Sunscreen emulsion)

The above components (1) to (13) were added according to Formulation Example 4, and the desired sunscreen emulsion was obtained after appropriately heating, stirring and cooling.
[0046]
Formulation Example 14 (lip balm)

The above components (1) to (10) were heated (85 ° C.) to obtain a uniform phase, then poured into a mold after defoaming and rapidly cooled to obtain a stick shape to obtain the desired lipstick.
[0047]
Formulation Example 15 (hydrophilic ointment)

The components (1) to (4) are heated and uniformly melted and then maintained at 75 ° C. The components (5) and (6) are previously dissolved in the component (7) and then heated to 75 ° C. A warm solution was added, and the mixture was stirred uniformly and then cooled with stirring to obtain the desired hydrophilic ointment.
[0048]
Formulation Example 16 (hair tonic)

(A) The components (2) to (5) were added to the ethyl alcohol (1) and dissolved uniformly.
[0049]
(B) The above (6) and (7) were added to the purified water of (8) above and dissolved uniformly.
[0050]
(C) Next, the above (b) was added to the above (a) and mixed uniformly to obtain the desired hair tonic.
[0051]
Pharmacological test (measurement of active oxygen scavenging activity by chemiluminescence method)
1. Test Solution Preparation Method 1) Add exactly 2 ml of 0.1M NaOH aqueous solution to 0.0329 g of 1 mM α-Tyaprisin NaOH aqueous solution α-Tyaprisin (manufactured by Takasago Kagaku Kogyo Co., Ltd.), mix and dissolve, and then add purified water. It was exactly 200 ml.
[0052]
2) 2 mM of 0.1 M NaOH aqueous solution was accurately added to 0.0329 g of 1 mM γ-Tyaprisin NaOH aqueous solution γ-Tyaprisin (manufactured by Takasago Kagaku Kogyo Co., Ltd.), uniformly mixed, dissolved, and purified water was added to make exactly 200 ml. .
[0053]
3) 5 ml of 1M NaOH aqueous solution was accurately added to 0.8210 g of 100 mM α-Tyaprisin NaOH aqueous solution α-Tyaprisin (manufactured by Takasago Kagaku Kogyo Co., Ltd.), uniformly mixed and dissolved, and purified water was added to make exactly 50 ml.
[0054]
4) 100 ml of γ-Tyaprisin NaOH aqueous solution γ-Tyaprisin (manufactured by Takasago International Corporation) was accurately added to 5 ml of 1M NaOH aqueous solution, and after homogeneous mixing and dissolution, purified water was added to make exactly 50 ml.
[0055]
2. Measuring device chemiluminescence was measured using a Luminescence Reader (BLR-201) manufactured by Aloka.
[0056]
3. Test Method (1) H ₂ O ₂ erasing activity In a small test tube, 200 μl of 500 μM luminol (pH 11.0, dissolved in 0.1 M borate buffer) and 200 μl of 150 μM hematin (dissolved in the above buffer) were added and mixed. Let stand for hours. 100 μl of test samples of various concentrations are mixed in this solution, set in a measuring device set at 30 ° C., and 10 μl of 200 μMH ₂ O ₂ (dissolved in the above buffer) is injected with a microsyringe. Then, chemiluminescence was measured. As the test sample, those prepared by diluting the 1 mM α-tyaprisin NaOH aqueous solution of 1) above or the 1 mM γ-tyaprisin NaOH aqueous solution of 2) above with the buffer just before the measurement were used.
[0057]
The measurement was performed three times for each concentration, and a graph was drawn using the average value as data (a graph including a sample concentration of 0). From this graph, the sample concentration at which chemiluminescence at the sample concentration of 0 was eliminated by 50%, that is, IC ₅₀ was obtained.
[0058]
Performed 3 times the same test, on average an IC ₅₀ obtained from three tests were the final an IC ₅₀ value.
[0059]
(2) OH-erasing activity A) 100 μl of 250 μM luminol (dissolved in pH 7.8, 50 mM phosphate buffer) was placed in a small test tube and allowed to stand for about 1 hour. 50 μl of 100 μM ferrous sulfate (dissolved in distilled water and added 1 V / V% of 1 M sulfuric acid), 50 μl of 2.5 mM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) (dissolved in the above buffer), pH 7.8, 50 mM phosphoric acid 300 μl of buffer and 100 μl of test samples of various concentrations were mixed and set in a measuring device set at 30 ° C., and 10 μl of 6 mM H ₂ O ₂ (dissolved in the above buffer) was injected with a microsyringe. The chemiluminescence was measured. As the test sample, those prepared by diluting the 1 mM α-tyaprisin NaOH aqueous solution of 1) above or the 1 mM γ-tyaprisin NaOH aqueous solution of 2) above with the buffer just before the measurement were used.
[0060]
B) In the same manner as in A) above, 300 μl of ethanol was added instead of 300 μl of 50 mM phosphate buffer having a pH of 7.8, and chemiluminescence was measured.
[0061]
C) Data obtained by subtracting the measurement value of B) from the measurement value of A).
[0062]
The measurement was performed three times for each concentration, and a graph was drawn using the average value as data (a graph including a sample concentration of 0). From this graph, the sample concentration at which the chemiluminescence at the sample concentration of 0 was eliminated by 50%, that is, IC ₅₀ was obtained.
[0063]
Performed 3 times the same test, on average an IC ₅₀ obtained from three tests were the final an IC ₅₀ value.
[0064]
(3) ¹ O ₂ scavenging activity a small test tube to 2.2μM Cypridina Mi Fe phosphorus (CLA) 100 [mu] l (dissolved in pH4.5,0.1M acetate buffer), 5.5mMDTPA100μl (dissolved in the above buffer), 400mMH _₂ O ₂ 200 μl (dissolved in the above buffer) and 100 μl of test samples of various concentrations were mixed and set in a measuring apparatus set at 30 ° C., and 10 μl of 10M sodium hypochlorite (NaOCl) (above (Dissolved in buffer) was injected with a microsyringe, and chemiluminescence was measured. As the test sample, one prepared by diluting the 100 mM α-tyaprisin NaOH aqueous solution of 3) above or the 100 mM γ-tyaprisin NaOH aqueous solution of 4) above with the buffer just before the measurement was used.
[0065]
The measurement was performed three times for each concentration, and a graph was drawn using the average value as data (a graph including a sample concentration of 0). From this graph, the sample concentration at which the chemiluminescence at the sample concentration of 0 was eliminated by 50%, that is, IC ₅₀ was obtained.
[0066]
Performed 3 times the same test, on average an IC ₅₀ obtained from three tests were the final an IC ₅₀ value.
[0067]
The above results are shown in Table 1 below.
[0068]
[Table 1]

[0069]

Claims

A scavenger for hydrogen peroxide and singlet oxygen in vivo containing at least one component selected from α-tyaprisin and salts thereof (however, a therapeutic and preventive agent for arteriosclerosis, and a therapeutic and preventive agent for inflammation) Excluding agents) .