JP3895782B2

JP3895782B2 - Chondroitinase composition and injectable preparation containing the same

Info

Publication number: JP3895782B2
Application number: JP31098092A
Authority: JP
Inventors: 愼一石川; 美佐子鳥飼; 勲宮地
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1992-10-26
Filing date: 1992-10-26
Publication date: 2007-03-22
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: JPH06135851A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コンドロイチナーゼ組成物および該組成物を含有する注射用製剤に関する。
本発明のコンドロイチナーゼ組成物は、安定性が高く、溶液状態で不溶物を生成せず、容器への吸着が防止され、注射用製剤に有用に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼＡＢＣ(Chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、ムコ多糖を不飽和糖を含む二糖に分解する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素である。
本酵素は、動物組織からムコ多糖類を除去したり、組織中のムコ多糖を同定するための研究用試薬として、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)等の細菌の産生する酵素商品が市販されている。
【０００３】
一方、ヒトの腰痛の病因として区分される椎間板ヘルニア症の治療に、植物パパイヤ由来の蛋白分解酵素キモパパインや、バクテリア由来の膠質分解酵素コラゲナ−ゼ等を、該ヘルニア症患者の椎間板腔に注入し、ヘルニアを溶解する椎間板溶解療法（ＩＤ療法）が開発され、欧米に於いては、キモパパインが医薬品（商品名、キモダイアクチン）として市販されている。
然るに、上記蛋白分解酵素を用いるＩＤ療法は、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず、周辺の構造組織の蛋白部分をも分解し、神経麻痺や、アレルギー発現等、副作用を生じやすい欠点を有する。
近年、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣを椎間板腔に直接投与して椎間板ヘルニアを治療する試みが行なわれており椎間板ヘルニアの治療薬としての用途が期待されている〔米国特許 4696816号明細書、 Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990) 〕
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチナ−ゼは溶液状態でガラス容器やプラスチック容器に吸着して溶液中の酵素活性が減少し、品質管理において重大な問題であった。特に低濃度溶液ではその影響が大きい。また、本酵素は不安定であって、水溶液の保存、凍結あるいは凍結乾燥の操作中および凍結乾燥後の保存において、とりわけ凍結乾燥を行う際の乾燥操作において容易に活性が減じ、また凍結乾燥品を再溶解した際に濁りを認める等の問題点を有し、医療用等に用いる上ではなはだ不都合であることを見いだした。
本発明は、このような欠点を改善することを目的としてなされたものである。すなわち、本発明の課題は、安定性が高く、溶液状態で不溶物を生成せず、容器への吸着が防止され得る精製コンドロイチナーゼ組成物を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、このような組成物を含有する注射用製剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる事実に鑑み、本発明者らは、コンドロイチナ−ゼの容器への吸着を防止し、さらに保存時の安定性を向上させることについて研究を重ねたところ、コンドロイチナ−ゼにある種の成分を添加すると、容器への吸着が防止できること、さらに保存時の安定性が向上すること、乾燥物を再溶解した際に濁り生じないことを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、比活性が300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼと血清アルブミンまたはゼラチンとよりなるコンドロイチナ−ゼ組成物を提供するものである。
また、該組成物の好ましい態様として、溶液状態としたときｐＨ５〜９を示すように調整されているコンドロイチナ−ゼ組成物を提供するものである。
さらに本発明は上記コンドロイチナ−ゼ組成物を含有する注射用製剤を提供するものである。
【０００６】
以下本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明において、コンドロイチナーゼとは、コンドロイチン硫酸リアーゼを意味し、具体的にはコンドロイチナーゼＡＢＣ〔EC 4.2.2.4〕またはコンドロイチナーゼＡＣ〔EC 4.2.2.5〕が包含されるが、コンドロイチナーゼＡＢＣが好ましく、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)由来の酵素がより好ましい。
また、比活性が300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼとは、比活性が300U（ユニット；単位）/mg 蛋白以上であり、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下であるコンドロイチナーゼをいい、とりわけ比活性が300U/mg 以上であり、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下であるコンドロイチナーゼＡＢＣが好ましい。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは後述の参考例および特願平４−１９２８８２号の特許出願明細書に記載の方法で得ることができる新規な酵素である。参考例の方法で得られるコンドロイチナーゼＡＢＣは次の特性を有する。
(i) 分子量が、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による測定（還元および非還元のいずれにおいても）およびゲル濾過法による測定において約100,000 である。
(ii) 等電点が約pH 8.2および約pH 8.5である。
(iii) 至適pHは 8.0〜8.2(基質：コンドロイチン硫酸Ｃ，緩衝液：トリス−塩酸緩衝液) 、至適温度は37℃である。
(iv) Zn²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、およびCu²⁺によって活性が阻害される。
(v) Ｎ末端アミノ酸がアラニンであり、Ｃ末端アミノ酸がプロリンである。
コンドロイチナーゼＡＢＣの末端は、次のアミノ酸残基よりなる。
Ｎ末端アミノ酸：アラニンＣ末端アミノ酸：プロリン
(vi) SDS-PAGEにより単一のバンドを示し、高速液体クロマトグラフィー (ゲル濾過およびカチオン交換) においても単一のピークを示す。
(vii) エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下である。
(viii)結晶化し得る。
(ix) 比活性が300U/mg 以上である。
【０００７】
本発明の組成物を製造する際には、以下に説明する添加成分を含有し、ｐＨを調整した水溶液を用意し、これに例えば比活性300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼを混和して10U/mL以上、好ましくは40〜400U/mL 含有する水性溶液とし、必要に応じて除菌濾過を行い、溶液状の組成物とするか、あるいはこの溶液状の組成物を凍結乾燥法等の非加熱条件での乾燥処理に付して乾燥物状の組成物（好ましくは凍結乾燥物）とすることができる。さらに、溶液状の組成物を例えば
− 80 〜−20℃で凍結させてもよい。
【０００８】
本発明の組成物において、精製コンドロイチナ−ゼに配合される必須の添加成分は、血清アルブミンまたはゼラチンのような蛋白質であり、これらを併用してもよい。
血清アルブミンとしてはヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物の血清アルブミンが例示される。特にヒトに投与する注射用製剤として使用する場合には非経口投与に使用可能なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が好ましい。例えば、健常人血漿を原料としてコーン（Cohn）のエタノール分画法によって分画精製されたものが用いられる。特に好ましくは血清アルブミンを加熱処理（好ましくは60℃、10時間程度）して肝炎ウィルス等の不活化処理を行ったものが使用される。なお、ＨＳＡには安定化剤としてＮ−アセチルトリプトファンナトリウムまたは／およびカプリル酸ナトリウムが添加されていても差し支えない。
ゼラチンとしてはウシ、ブタなどの動物由来のものが例示される。なお、ここでゼラチンとは動物の皮、骨等から得たコラーゲンを適当な前処理により可溶化して得られるもので、鉱酸（pH１〜３程度の塩酸、硫酸、亜硫酸、りん酸等）で処理した等電点7.0 〜9.0 の酸処理ゼラチン（Ａ型）および石灰等のアルカリで処理した等電点4.5 〜5.0 のアルカリ処理ゼラチン（Ｂ型）が例示される。本発明に用いるゼラチンとしては、酸処理ゼラチンが好ましい。
【０００９】
また、本発明の組成物は溶液状態で通常ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８を示すように調整する。このために該ｐＨ領域に維持可能な緩衝剤を通常含有する。緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されないが、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、りん酸、りん酸二水素カリウム、りん酸水素二カリウム、りん酸二水素ナトリウム、りん酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノ−ルアミン、アルギニンまたはエチレンジアミンの一種以上を含有する緩衝剤が例示される。特にりん酸塩緩衝液（剤）が好ましい。なお、ｐＨ５より低い場合および９より高い場合にはコンドロイチナーゼが失活したり、溶液状態で不溶物が生成することがある。
【００１０】
前記した添加成分の添加量は、蛋白質についてはコンドロイチナーゼの蛋白質の 0.001倍重量以上で効果が認められるが、好ましくは0.01〜 100倍重量、特に好ましくは0.05〜10倍重量の割合で配合される。なお、 100倍重量以上であっても本発明の効果を達成することはできるが、単位重量あたりの酵素活性が低くなる。組成物中の緩衝剤の濃度は１〜100mM 、好ましくは10〜50mMである。
さらに本発明の組成物には等張化剤、賦形剤、保存剤あるいは無痛化剤などの医薬品製剤に通常含まれる添加剤を含んでいてもよい。例えば賦形剤は、注射剤に通常使用されるものであれば特に限定されないが、クレアチニン、乳糖、マンニトール、精製白糖、キシロース等が好ましい。
【００１１】
本発明の組成物は、主にコンドロイチナーゼを有効成分とする注射用製剤またはその原料として使用される。溶液状の組成物をアンプル、バイアル等の容器に充填し、そのまま流通させ、あるいは保存し、注射剤として投与に供することができ、また、適当な容器中で乾燥または凍結させた組成物を流通、保存し、投与時に注射用蒸留水、生理食塩水等で溶解し、または融解させて投与に供することができる。このような注射剤は、コンドロイチナーゼを有効成分とする椎間板ヘルニア治療剤として使用することができる。この治療剤を、ヘルニア症患者の椎間板腔に注入し、ヘルニアを溶解して治療する椎間板溶解療法に用いることができる。使用量は、症状、年令等によって異なり、一概には特定できたないが、コンドロイチナーゼＡＢＣの場合、通常１回10〜100U程度を注入する。
なお、本発明におけるコンドロイチナーゼＡＢＣの力価はコンドロイチン硫酸を基質にして、37℃で反応させた時に生成する紫外部に顕著な吸収を有する不飽和二糖類を吸光光度法で測定することにより求めた。
なおまた、コンドロイチナ−ゼＡＢＣの１単位(U) は、１分間に不飽和二糖を１マイクロモル遊離させる酵素量である。
【００１２】
【実施例】
以下実施例および参考例によって本発明を具体的に説明する。
実施例１
ガラスおよびプラスチック容器への吸着防止効果（溶液）：
参考例とほぼ同様の方法で製造したコンドロイチナ−ゼＡＢＣ（比活性 300U/mg）５単位（U)を含む溶液に表１および２に示すとおりゼラチン（酸処理ゼラチン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を酵素蛋白量の 0.001〜 100倍量添加し、さらに50mMりん酸カリウム塩緩衝液でｐＨを7.0 に調整し、溶液状のコンドロイチナ−ゼＡＢＣ組成物を得た。この溶液をガラス製およびプラスチック（ポリプロピレン）製バイアル瓶に入れ、４℃、24時間保存後の溶液中の酵素活性を測定して容器への吸着防止効果を調べた。ガラス製バイアル瓶での結果を表１に、プラスチック製バイアル瓶での結果を表２に示す。なお、結果は保存前の溶液中の活性に対する保存後の活性の百分率で表した。
【００１３】
【表１】

【００１４】
【表２】

【００１５】
実施例２
再溶解時の不溶物生成防止効果および活性保存効果（凍結乾燥物）：
参考例で得たコンドロイチナ−ゼＡＢＣ（比活性380U/mg)５０単位を含む溶液に表３および４に示すような物質を酵素蛋白量の 0.001〜10倍量添加し、さらにりん酸ナトリウム塩緩衝液でｐＨを 6.5 (20mM) に調整した。この溶液に賦形剤としてクレアチニン(10mg/ml) を加え、バイアル瓶に入れ、凍結乾燥して乾燥物状のコンドロイチナーゼＡＢＣ組成物を得た。この組成物を、バイアル瓶中、40℃で１ケ月保存し、保存後の組成物の性状を観察したが、着色および崩れ等の異常はなかった。また、注射用蒸留水を加えて、再溶解時の性状を観察し、さらに活性を測定して添加剤の活性保存効果を調べた。その結果を表３および表４に示す。なお、表３は再溶解した際の不溶物の生成の有無を肉眼的に観察した結果であり、表４の結果は保存前の活性に対する保存後の活性の百分率で表した。
また、上記と同様の方法でクレアチニンを添加しない組成物（コンドロイチナーゼＡＢＣ（比活性380U/mg)50単位；ＨＳＡ，酵素蛋白質の0.05倍量）も調製し、同様に保存後の性状および活性を測定したが、溶状は無色澄明で、活性の残存率は80％であった。
【００１６】
【表３】

【００１７】
【表４】

【００１８】
以上の実施例の実験結果から、ゼラチン，ＨＳＡ，ＢＳＡを精製コンドロイチナーゼに配合し、溶液状態でほぼ中性付近になるようにすると、精製コンドロイチナーゼの容器への吸着を防止し、溶解後無色澄明な状態となり、さらに保存後の活性を低下させることなく維持することができる。
この効果は、特にゼラチン、ＨＳＡ，ＢＳＡを精製コンドロイチナーゼ酵素蛋白量の0.05〜10倍量使用したときに顕著にあらわれる。また、この際、参考例に示されるような高度に精製され、比活性が高いコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、これをゼラチン，ＨＳＡ，ＢＳＡとともにpH５〜９、好ましくは６〜８のりん酸ナトリウム塩緩衝液に溶解し（りん酸ナトリウム塩緩衝液濃度として10〜50mM) 、凍結乾燥して得られ、溶解状態にしたときに前記ｐＨの範囲になるコンドロイチナーゼ組成物を用いることが望ましい。
【００１９】
【参考例】
次に、本発明に使用する精製コンドロイチナーゼＡＢＣの製造法の一例について参考例を挙げて具体的に説明する。
プロテウス・ブルガリス（NCTC 4636, ATCC 6896, IFO 3988) を従来知られている通常の方法(J.Biol.Chem.,243 (7), 1523-1535(1968)）で培養して湿菌体を得た。この湿菌体200gに５mMりん酸緩衝液 (pH6.5 〜7.0)600ml を加えて懸濁させ、 Dino-Millにより菌体を破砕し遠心分離して、酵素抽出液を得た（工程1)。
この菌体抽出液から核酸を除くために硫酸プロタミンを用いた。上記酵素抽出液に最終濃度 0.5％となるように５％硫酸プロタミン溶液を加え、４℃で約30分間撹拌し、生じた沈澱を遠心分離によって除去し、上澄液を得た（工程2)。
得られた上澄液に約５倍量の水を加えカラムクロマトグラフィーで精製した。すなわち、ＣＭセファロースを充填したカラムに５mMりん酸緩衝液(pH6.5〜7.0)を流して平衡状態とした後、上記上澄液を流し吸着させた。その後カラムを同じ緩衝液で洗浄し次いで 0.020〜 0.025M 食塩を含んだ同じ緩衝液で洗浄し、次に0.1Mの食塩を含んだ上記緩衝液で溶出し、酵素活性を有する画分を得た（工程3)。
この酵素活性画分に約５倍量の水を加え、予め５mMりん酸緩衝液(pH6.5〜7.0)で平衡化したＳ−セファロースカラムに吸着させた。その後、カラムを上記緩衝液で洗浄し、次いで 0.020〜0.025M食塩を含む上記緩衝液で洗浄し、次に 0.025〜約0.35Ｍの食塩を含む上記緩衝液で濃度勾配法により溶出した。
溶出したコンドロイチナーゼＡＢＣは単一バンド(SDS-PAGE)を示し、かつ核酸(DNA) 、プロテアーゼ等が除去されており、比活性は380U/mg であって、従来のコンドロイチナーゼＡＢＣにくらべて比活性は約３倍程度以上高く、高純度の酵素となった。
この酵素溶液（りん酸緩衝液（pH7.0)) に15％となるようにポリエチレングリコール (分子量 4,000) を添加し、室温で約１週間放置したところ、針状結晶状で白色乃至無色の結晶性コンドロイチナーゼＡＢＣが生成した。
上記各工程におけるコンドロイチナーゼＡＢＣの精製度を示すと表５に示すとおりとなる。
【００２０】
【表５】

【００２１】
また、各工程におけるエンドトキシンの含量および、プロテアーゼ残存量を表６に示す。
【表６】

* コンドロイチナーゼＡＢＣ 100単位(U) 当りのエンドトキシン含量；トキシカラーシステム (生化学工業（株）製) を用いて測定。EUはエンドトキシン単位(Endotoxin Unit)を示す。
** FITC−カゼインを基質として測定
【００２２】
工程４により得られた酵素溶液中のエンドトキシン含量は、上記のように 5.0pg/100U 程度の極微量で実質的に含有されておらず、また核酸（ＤＮＡ）についてスレッシュホールド法〔ＤＮＡ測定装置：スレッシュホールド（モレキュラーデバイス社製）〕で測定したが、ＤＮＡは検出されなかった（検出限界以下）。
【００２３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明では精製コンドロイチナ−ゼ、特に、比活性が300U/mg 以上であるような高度に精製されたコンドロイチナ−ゼＡＢＣを用い、これに血清アルブミンまたはゼラチンという特定の蛋白質を添加し、さらに溶液状態でのｐＨを通常ｐＨ５〜９の範囲に調整したコンドロイチナーゼ組成物とすることにより、コンドロイチナーゼのガラス製、プラスチック製等の容器への吸着が防止され、さらに安定性を向上させることができる。また、乾燥物状の上記組成物を再溶解する際に不溶物の生成を防止することもできる。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a chondroitinase composition and an injectable preparation containing the composition.
The chondroitinase composition of the present invention has high stability, does not produce insoluble matter in a solution state, is prevented from adsorbing to a container, and can be usefully used for an injectable preparation.
[0002]
[Prior art]
Chondroitinase ABC (EC 4.2.2.4) is an enzyme that degrades mucopolysaccharides into disaccharides containing unsaturated sugars. Chondroitin sulfate A derived from mammalian cartilage, chondroitin sulfate C derived from shark cartilage, and mammals. It is an enzyme that strongly catalyzes the degradation of chondroitin sulfate B (dermatan sulfate) derived from animal skin and weakly catalyzes the degradation of hyaluronic acid.
Enzyme products produced by bacteria such as Proteus vulgaris are commercially available as research reagents for removing mucopolysaccharides from animal tissues and identifying mucopolysaccharides in tissues. Yes.
[0003]
On the other hand, for the treatment of herniated disc that is classified as the etiology of low back pain in humans, plant papaya-derived proteolytic enzyme chymopapain, bacteria-derived degrading enzyme collagenase, etc. are injected into the disc space of the patient with hernia. Intervertebral disc therapy (ID therapy) that dissolves hernia has been developed, and in Europe and the United States, chymopapain is marketed as a pharmaceutical product (trade name, chymodiactin).
However, ID therapy using the above-mentioned proteolytic enzyme has a drawback that it tends to cause side effects such as nerve paralysis and allergic manifestation by degrading not only the hernia portion of the spine and intervertebral disc but also the protein portion of the surrounding structural tissue.
In recent years, attempts have been made to treat intervertebral hernia by administering chondroitinase ABC or chondroitinase AC directly into the intervertebral disc space, and use as a therapeutic agent for intervertebral disc herniation is expected [US Pat. No. 4696816] , Clinical Orthopedics, 253, 301-308 (1990))
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
Chondroitinase was adsorbed to a glass container or a plastic container in a solution state to reduce the enzyme activity in the solution, which was a serious problem in quality control. In particular, the effect is large in a low concentration solution. In addition, this enzyme is unstable, and its activity is easily reduced during storage of an aqueous solution, during freezing or lyophilization operations, and after lyophilization, especially during lyophilization. It has been found that it has problems such as turbidity when redissolved and is inconvenient for medical use.
The present invention has been made for the purpose of improving such drawbacks. That is, an object of the present invention is to provide a purified chondroitinase composition that has high stability, does not generate insoluble matter in a solution state, and can be prevented from adsorbing to a container.
Furthermore, the subject of this invention is providing the formulation for injection containing such a composition.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
In view of this fact, the present inventors conducted research on preventing the adsorption of chondroitinase to the container and further improving the stability during storage, and added a certain component to chondroitinase. As a result, the inventors have found that adsorption to the container can be prevented, that the stability during storage is improved, and that the turbidity does not occur when the dried product is re-dissolved.
That is, the present invention provides a chondroitinase composition comprising a purified chondroitinase having a specific activity of 300 U / mg or more and serum albumin or gelatin.
Moreover, as a preferable embodiment of the composition, a chondroitinase composition adjusted to show pH 5 to 9 when in a solution state is provided.
Furthermore, this invention provides the formulation for injection containing the said chondroitinase composition.
[0006]
The present invention will be described in further detail below.
In the present invention, chondroitinase means chondroitin sulfate lyase, and specifically includes chondroitinase ABC [EC 4.2.2.4] or chondroitinase AC [EC 4.2.2.5]. The enzyme ABC is preferred, and an enzyme derived from Proteus vulgaris is more preferred.
A purified chondroitinase with a specific activity of 300 U / mg or more is a specific activity of 300 U (unit; unit) / mg protein or more, substantially free of endotoxin, and nucleic acid and protease content below the detection limit. A chondroitinase ABC is preferred, particularly chondroitinase ABC, which has a specific activity of 300 U / mg or more, substantially does not contain endotoxin, and has nucleic acid and protease contents below the detection limit. Such a chondroitinase ABC is a novel enzyme that can be obtained by the method described in the reference examples described later and the patent application specification of Japanese Patent Application No. 4-192882. Chondroitinase ABC obtained by the method of the reference example has the following characteristics.
(i) The molecular weight is about 100,000 as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (both reduced and non-reduced) and by gel filtration.
(ii) The isoelectric point is about pH 8.2 and about pH 8.5.
(iii) The optimum pH is 8.0 to 8.2 (substrate: chondroitin sulfate C, buffer: Tris-HCl buffer), and the optimum temperature is 37 ° C.
(iv) Activity is inhibited by Zn ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ and Cu ²⁺ .
(v) The N-terminal amino acid is alanine and the C-terminal amino acid is proline.
The end of chondroitinase ABC consists of the following amino acid residues.
N-terminal amino acid: alanine C-terminal amino acid: proline
(vi) A single band is shown by SDS-PAGE, and a single peak is also shown in high performance liquid chromatography (gel filtration and cation exchange).
(vii) It is substantially free of endotoxin and the nucleic acid and protease contents are below the detection limit.
(viii) Crystallization is possible.
(ix) Specific activity is 300 U / mg or more.
[0007]
In producing the composition of the present invention, an aqueous solution containing the following additional components and adjusted in pH is prepared, and, for example, purified chondroitinase having a specific activity of 300 U / mg or more is mixed with 10 U. or an aqueous solution containing 40 to 400 U / mL, and if necessary, perform sterilization filtration to obtain a solution-like composition, or use this solution-like composition as a non-freezing method such as a lyophilization method. A dry treatment composition (preferably a lyophilized product) can be obtained by subjecting it to a drying treatment under heating conditions. Further, the solution composition may be frozen at, for example, -80 to -20 ° C.
[0008]
In the composition of the present invention, an essential additive component blended in the purified chondroitinase is a protein such as serum albumin or gelatin, and these may be used in combination.
Examples of serum albumin include serum albumin of mammals such as humans, cows, horses, pigs, sheep and goats. In particular, human serum albumin (HSA) that can be used for parenteral administration is preferred when used as an injectable preparation for administration to humans. For example, a product obtained by fractionating and purifying by the ethanol fractionation method of corn (Cohn) using healthy human plasma as a raw material is used. Particularly preferably, serum albumin is subjected to heat treatment (preferably at 60 ° C. for about 10 hours) to inactivate hepatitis virus or the like. HSA may contain N-acetyltryptophan sodium and / or sodium caprylate as a stabilizer.
Examples of gelatin include those derived from animals such as cows and pigs. Here, gelatin is obtained by solubilizing collagen obtained from animal skins, bones, etc. by an appropriate pretreatment, and mineral acids (hydrochloric acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid, etc. having a pH of about 1 to 3). Examples include acid-treated gelatin (A type) having an isoelectric point of 7.0 to 9.0 treated with 1, and alkali-treated gelatin (B type) having an isoelectric point of 4.5 to 5.0 treated with an alkali such as lime. As the gelatin used in the present invention, acid-treated gelatin is preferable.
[0009]
Moreover, the composition of this invention is adjusted so that pH may show normally 5-9, preferably 6-8 in a solution state. For this purpose, it usually contains a buffer which can be maintained in the pH range. The buffer is not particularly limited as long as it is physiologically acceptable, but hydrochloric acid, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, phosphoric acid Sodium dihydrogen, disodium hydrogen phosphate, aminoacetic acid, sodium benzoate, citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, tartaric acid, sodium tartrate, lactic acid, sodium lactate, ethanolamine, arginine or ethylenediamine The containing buffer is illustrated. Particularly preferred is a phosphate buffer (agent). When the pH is lower than 5 or higher than 9, chondroitinase may be deactivated or insoluble matter may be generated in a solution state.
[0010]
The added amount of the above-described additive components is effective when the protein is 0.001 times or more by weight of the protein of chondroitinase, preferably 0.01 to 100 times by weight, particularly preferably 0.05 to 10 times by weight. The Although the effects of the present invention can be achieved even when the weight is 100 times or more, the enzyme activity per unit weight is lowered. The concentration of the buffering agent in the composition is 1 to 100 mM, preferably 10 to 50 mM.
Furthermore, the composition of the present invention may contain additives usually contained in pharmaceutical preparations such as isotonic agents, excipients, preservatives or soothing agents. For example, the excipient is not particularly limited as long as it is usually used for injections, but creatinine, lactose, mannitol, purified sucrose, xylose and the like are preferable.
[0011]
The composition of the present invention is mainly used as an injectable preparation containing chondroitinase as an active ingredient or a raw material thereof. A solution-like composition can be filled into a container such as an ampoule or a vial and distributed as it is or stored and used for administration as an injection, or a composition dried or frozen in a suitable container can be distributed. These can be stored and dissolved in distilled water for injection, physiological saline or the like at the time of administration, or dissolved before use. Such an injection can be used as a therapeutic agent for intervertebral disc herniation containing chondroitinase as an active ingredient. This therapeutic agent can be used for intervertebral disc therapy, in which the hernia is injected into the disc space and the hernia is dissolved. The amount used varies depending on symptoms, age, etc., and cannot be specified in general, but in the case of chondroitinase ABC, usually about 10 to 100 U is injected once.
In addition, the titer of chondroitinase ABC in the present invention is determined by measuring the unsaturated disaccharide having a remarkable absorption in the ultraviolet region produced by reacting at 37 ° C. with chondroitin sulfate as a substrate by spectrophotometry. Asked.
One unit (U) of chondroitinase ABC is the amount of enzyme that liberates 1 micromole of unsaturated disaccharide per minute.
[0012]
【Example】
The present invention will be specifically described below with reference to examples and reference examples.
Example 1
Anti-adsorption effect on glass and plastic containers (solution):
As shown in Tables 1 and 2, gelatin (acid-treated gelatin) and human serum albumin (HSA) were prepared in a solution containing 5 units (U) of chondroitinase ABC (specific activity 300 U / mg) produced by the same method as in the Reference Example. Alternatively, bovine serum albumin (BSA) was added in an amount of 0.001 to 100 times the amount of the enzyme protein, and the pH was adjusted to 7.0 with 50 mM potassium phosphate buffer to obtain a solution-like chondroitinase ABC composition. This solution was placed in a glass and plastic (polypropylene) vial, and the enzyme activity in the solution after storage at 4 ° C. for 24 hours was measured to examine the effect of preventing adsorption to the container. Table 1 shows the results with glass vials and Table 2 shows the results with plastic vials. The results were expressed as a percentage of the activity after storage with respect to the activity in the solution before storage.
[0013]
[Table 1]

[0014]
[Table 2]

[0015]
Example 2
Insoluble matter formation prevention effect and active preservation effect upon re-dissolution (lyophilized product) :
To the solution containing 50 units of chondroitinase ABC (specific activity 380 U / mg) obtained in Reference Example, 0.001 to 10 times the amount of enzyme protein was added as shown in Tables 3 and 4, and sodium phosphate buffer The pH was adjusted to 6.5 (20 mM) with the solution. Creatinine (10 mg / ml) was added to this solution as an excipient, placed in a vial, and lyophilized to obtain a dried chondroitinase ABC composition. This composition was stored in a vial at 40 ° C. for 1 month, and the properties of the composition after storage were observed, but there were no abnormalities such as coloring and collapse. Further, distilled water for injection was added, the properties at the time of re-dissolution were observed, and the activity was further measured to examine the activity preserving effect of the additive. The results are shown in Tables 3 and 4. Table 3 shows the results of macroscopic observation of the presence or absence of insoluble matter when redissolved, and the results in Table 4 are expressed as a percentage of the activity after storage with respect to the activity before storage.
In addition, a composition not containing creatinine (chondroitinase ABC (specific activity 380 U / mg) 50 units; HSA, 0.05 times the amount of enzyme protein) was also prepared in the same manner as above. The solution was colorless and clear, and the residual activity rate was 80%.
[0016]
[Table 3]

[0017]
[Table 4]

[0018]
From the experimental results of the above examples, when gelatin, HSA, and BSA are mixed with purified chondroitinase so as to be almost neutral in the solution state, the adsorption of purified chondroitinase to the container is prevented and dissolved. After that, it becomes colorless and clear, and can be maintained without lowering the activity after storage.
This effect is particularly prominent when gelatin, HSA, and BSA are used in an amount of 0.05 to 10 times the amount of purified chondroitinase enzyme protein. At this time, highly purified chondroitinase ABC as shown in the reference example is used, and this is mixed with gelatin, HSA, BSA, pH 5-9, preferably 6-8 phosphate sodium salt. It is desirable to use a chondroitinase composition that is dissolved in a buffer solution (sodium phosphate buffer concentration of 10 to 50 mM), lyophilized, and in the pH range when dissolved.
[0019]
[Reference example]
Next, an example of a method for producing purified chondroitinase ABC used in the present invention will be specifically described with reference to a reference example.
Proteus vulgaris (NCTC 4636, ATCC 6896, IFO 3988) is cultured in the conventional manner (J. Biol. Chem., 243 (7), 1523-1535 (1968)) Got. Add 200 ml of 5 mM phosphate buffer (pH 6.5-7.0) to 200 g of this wet cell, suspend it, crush the cell with Dino-Mill, and centrifuge to obtain an enzyme extract (step 1). .
Protamine sulfate was used to remove nucleic acids from this bacterial cell extract. A 5% protamine sulfate solution was added to the enzyme extract to a final concentration of 0.5%, the mixture was stirred at 4 ° C. for about 30 minutes, and the resulting precipitate was removed by centrifugation to obtain a supernatant (Step 2). .
About 5 times the amount of water was added to the resulting supernatant and the residue was purified by column chromatography. That is, after 5 mM phosphate buffer (pH 6.5 to 7.0) was allowed to flow through a column packed with CM Sepharose to achieve an equilibrium state, the supernatant was allowed to flow for adsorption. The column was then washed with the same buffer, then with the same buffer containing 0.020-0.025M sodium chloride, and then eluted with the above buffer containing 0.1M sodium chloride to obtain a fraction having enzyme activity. (Process 3).
About 5 times the amount of water was added to this enzyme activity fraction and adsorbed on an S-Sepharose column equilibrated in advance with a 5 mM phosphate buffer (pH 6.5-7.0). The column was then washed with the buffer, then washed with the buffer containing 0.020-0.025 M sodium chloride, and then eluted by a concentration gradient method with the buffer containing 0.025 to about 0.35 M sodium chloride.
The eluted chondroitinase ABC shows a single band (SDS-PAGE), nucleic acid (DNA), protease, etc. are removed, and the specific activity is 380 U / mg, which is higher than that of the conventional chondroitinase ABC. The specific activity was about 3 times higher, and the enzyme was highly pure.
Polyethylene glycol (molecular weight 4,000) was added to this enzyme solution (phosphate buffer solution (pH 7.0)) to 15% and left at room temperature for about 1 week. Sex chondroitinase ABC was produced.
Table 5 shows the degree of purification of chondroitinase ABC in each of the above steps.
[0020]
[Table 5]

[0021]
Table 6 shows the endotoxin content and the remaining amount of protease in each step.
[Table 6]

* Endotoxin content per 100 units (U) of chondroitinase ABC; measured using Toxicolor System (manufactured by Seikagaku Corporation). EU stands for Endotoxin Unit.
** Measured using FITC-casein as substrate
As described above, the endotoxin content in the enzyme solution obtained in step 4 is not substantially contained in a trace amount of about 5.0 pg / 100 U, and the threshold method [DNA measuring apparatus: Threshold (manufactured by Molecular Devices)], but no DNA was detected (below the detection limit).
[0023]
【The invention's effect】
As described above, in the present invention, purified chondroitinase, particularly highly purified chondroitinase ABC having a specific activity of 300 U / mg or more is used, and a specific protein such as serum albumin or gelatin is used for this. Addition and further making the chondroitinase composition in which the pH in the solution state is usually adjusted to the range of pH 5 to 9, the adsorption of chondroitinase to glass or plastic containers is prevented and further stable Can be improved. In addition, when the dry composition is redissolved, the formation of insoluble matter can be prevented.

Claims

The purified chondroitinase is a purified chondroitinase ABC having the following characteristics derived from Proteus vulgaris NCTC 4636, adjusted to show pH 5-9 when in solution, and having a specific activity It contains 300 U / mg or more of purified chondroitinase and at least 0.001 times the weight of serum albumin or gelatin with respect to purified chondroitinase, thereby reducing the adsorptivity to the container and making it insoluble when used as a solution. A chondroitinase composition in which product formation is prevented.
(I) The molecular weight is about 100,000 as measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) (both reducing and non-reducing) and by gel filtration.
(Ii) The isoelectric point is about pH 8.2 and about 8.5.
(Iii) The optimum pH is 8.0 to 8.2 (substrate: chondroitin sulfate C, buffer: Tris-HCl buffer), and the optimum temperature is 37 ° C.
(Iv) Activity is inhibited by Zn ²⁺ , Ni ²⁺ , Fe ³⁺ , and Cu ²⁺ .
(V) The N-terminal amino acid is alanine and the C-terminal amino acid is proline.
(Vi) A single band is shown by SDS-PAGE, and a single peak is also shown in high performance liquid chromatography (gel filtration and cation exchange).
(Vii) It is substantially free of endotoxin and the nucleic acid and protease contents are below the detection limit.
(Viii) It can be crystallized.

The chondroitinase composition according to claim 1, which is a solution or a dried product.

The chondroitinase composition according to any one of claims 1 and 2, wherein the composition is adjusted to show pH 5 to 9 when in a solution state by containing 1 to 100 mM of a physiologically acceptable buffer.

Buffering agents are hydrochloric acid, sodium hydroxide, sodium carbonate, sodium bicarbonate, phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, aminoacetic acid, sodium benzoate 4. A buffer containing a component selected from the group consisting of citric acid, sodium citrate, acetic acid, sodium acetate, tartaric acid, sodium tartrate, lactic acid, sodium lactate, ethanolamine, arginine, and ethylenediamine. Chondroitinase composition.

An injectable preparation comprising the chondroitinase composition according to any one of claims 1 to 4.