JP3881731B2

JP3881731B2 - Enzyme reaction sensor and manufacturing method thereof

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Publication number: JP3881731B2
Application number: JP27121596A
Authority: JP
Inventors: 征夫軽部
Original assignee: Gunze Ltd
Current assignee: Gunze Ltd
Priority date: 1996-04-19
Filing date: 1996-10-14
Publication date: 2007-02-14
Anticipated expiration: 2016-10-14
Also published as: JPH102875A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は，臨床用携帯型マルチタイプグルコースセンサー等の酵素反応を利用したセンサーに関し，詳しくは，酵素反応を用いて血液中・尿中のグルコース濃度等を測定するセンサーと，その製造方法とに関する。
【０００２】
【従来の技術】
成人病の１つである糖尿病疾患は１日に数回血糖値を測定し，インスリンの投与のコントロールや，食事のコントロールをしなければならない。現在グルコース測定法としては，比色法・酵素反応法等がある。
【０００３】
この比色法としては還元法（Somogyi-Nelson法）が一般的である。この方法は以下の手順を経て測定される。まず，硫酸亜鉛と水酸化バリウムを使って妨害物である蛋白質を除く（除蛋白）。その後，遠心，ろ過し還元反応・呈色反応を起こさせる。その他の比色法としては縮合法（ｏ−トルイジン・ホウ酸法）がある。この方法は，糖を酸性条件下，ｏ−トルイジンとともに加熱すると青緑色を呈することを利用するものである。これら比色定量法は，それぞれ反応物質に特有な波長の吸収光を当てて吸光度を測り，その結果からグルコース濃度を測定する方法である。
【０００４】
一方，酵素反応を用いる測定法としては，グルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）等の酵素を用いてグルコースが反応したときに発生する過酸化水素等の生成物を測定するか，または，減少する物質（酵素）を定量することによって，グルコースを定量する方法がある。実際に検出手段としては，電極を用いる方法（サイクリックボルトアンメトリ）と比色測定法とが存在する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
比色法は，一般に前処理が必要でありまた分光学的な測定法を用いることから検出部が大型になる。また上記したように吸光光度法では，測定物質の固有波長に近似した波長を有する他の物質による影響を受けるため正確な測定値が得られないことがある。
【０００６】
一方，現在の酵素法による装置は，酵素の基質選択性を利用することから前処理の必要等はないが多数のサンプルを測定するためにはポンプ，反応槽等の装置を取り付ける必要があり，装置が大型化し低コスト化・量産化が困難となる。また，測定検体のグルコース濃度を即時に検出し，携帯性・多数サンプル測定という条件を満たすには問題が残る。
【０００７】
そこで，本発明の技術的課題は，例えば，血液や尿中に存在しているグルコース濃度を小型装置で多数回測定することを可能にし，かつ半導体加工技術の利点である量産性の高いことを利用した酵素反応センサーとその製造方法とを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は，マイクロマシン技術を用いて円形のシリコンウエハー等の半導体基板上に，例えば，放射状に溝と白金電極膜を多数作製し，その後，半導体基板とパイレックスガラス等のガラス板とを一体化させてキャピラリーを形成させ，内部にグルコースオキシダーゼ等の酵素を固定化する。以上の様にキャピラリー，電極を単一の半導体基板上に多数作製しマルチタイプグルコースセンサー等の酵素センサを構築する事から上記の様な小型化・多数サンプル測定・量産性という課題を解決している。
【０００９】
即ち、（１）本発明によれば、一対の互いに重ね合わせられる基板と、前記一対の基板の内の少なくとも一方の基板の一表面に形成された複数の溝と、前記複数の溝に対応して、前記一対の基板の内のいずれかに形成された貴金属からなる少なくとも２個の電極膜とを備え、前記一対の基板の内の前記電極膜が形成された基板は、円形形状のプラスチックスからなり、前記複数の溝は、前記プラスチックス基板の一面に半径方向に沿って形成され、前記一対の基板の内の前記電極膜が形成されていない基板は、前記電極膜が形成されている基板の一部が露出するような大きさもしくは形状を備え、前記露出した基板の部分には、前記電極膜から延在する電極取出部が設けられており、前記溝及び前記基板とによって形成されたキャピラリー内部に酵素を固定化したことを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１０】
また，（２）本発明によれば，前記酵素反応センサーにおいて，前記酵素は，グルコースオキシダーゼであることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１２】
また、（３）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーにおいて、前記貴金属は白金からなることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１３】
また、（４）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーにおいて、前記複数の電極膜は、一本の溝に対応して３個ずつ形成されていることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１４】
また、（５）本発明によれば、前記いずれかにの酵素反応センサーにおいて、前記一対の基板は、互いに接合されていることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１５】
また、（６）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーにおいて、前記一対の基板は、プラズマ重合膜を接合面に備え、当該プラズマ重合膜の溶接によって互いに接合されていることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００１６】
また、（７）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーにおいて、前記酵素固定は、少なくとも前記キャピラリーの内壁面に存在するアミノ基を有するモノマーのプラズマ重合膜の前記アミノ基と前記酵素に存在するアミノ基とを架橋試薬によって結合させたものであることを特徴とする酵素反応センサーが得られる。
【００２０】
また、（８）本発明によれば、マイクロマシン技術を用いて、円形形状のプラスチックスからなる一枚の基板上に溝を複数形成し、更に、円形形状のプラスチックスからなる他の一枚の基板上に前記溝に対応して貴金属からなる少なくとも一対の電極膜群を夫々形成し、前記一対の基板は、円形形状のプラスチックスからなり、前記一対の基板の内の前記電極膜が形成されていない基板は、前記電極膜群が形成されている基板の一部が露出するような大きさもしくは形状を有し、前記露出した基板の部分には、前記電極膜から延在する電極取出部が設けられており、前記溝と前記貴金属とを対応させて前記一対の基板を重ね合わせて接合し一体化させて、キャピラリーを形成し、前記キャピラリー内部に、酵素を固定化することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２１】
また、（９）本発明によれば、前記酵素反応センサーの製造方法において、前記酵素として、グルコースオキシダーゼを化学結合・包括法によって固定化することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２３】
また、（１０）本発明によれば、前記酵素反応センサーの製造方法において、前記一枚基板に、前記溝を半径方向に形成するとともに、前記電極膜が形成されていない基板の中央に前記電極取出部が露出するように開口部を形成することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２４】
また、（１１）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーの製造方法において、前記貴金属は白金からなり、前記少なくとも一対の電極膜を、スパッタリング法及びイオンミリング法によって形成し、前記基板の中心寄りに前記電極取出部を形成することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２５】
また、（１２）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーの製造方法において、前記一対の基板はアクリル樹脂からなり、互いに接合されて一体化することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２６】
また、（１３）本発明によれば、前記いずれかの酵素反応センサーの製造方法において、前記一枚の基板に溝を形成した後、及び前記他の一枚の基板に電極群を形成する前に、前記夫々の基板の互いに接合される面の表面に、アミノ基を含むプラズマ重合膜を形成することを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００２７】
また、（１４）本発明によれば、前記酵素反応センサーの製造方法において、前記酵素はアミノ基を備え、前記酵素の固定化は、前記プラズマ重合膜のアミノ基と前記酵素のアミノ基との架橋試薬の作用により結合させることを含むことを特徴とする酵素反応センサーの製造方法が得られる。
【００３４】
【発明の実施の形態】
以下，本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。本発明の実施の形態においては，酵素反応センサーとして，グルコースセンサの例を示したが，本発明はこれらに限定されるものではないことは明らかである。
【００３５】
図１（ａ）は本発明の第１の実施の形態によるグルコースセンサーを示す組立分解斜視図，（ｂ）は平面図である。図１（ａ）及び（ｂ）を参照すると，グルコースセンサー１０は集積化センサーデバイスであり，シリコン基板１の一面上には，溝２が半径方向に形成されている。この溝２には，白金電極膜３，４が形成され，パイレックスガラス板５に覆われている。このパイレックスガラス板とシリコン基板１とは，接合され一体化しており，溝２部分はパイレックス板に覆われてキャピラリー６を形成している。このキャピラリー６には，グルコースオキシダーゼが固定化される。
【００３６】
図１（ｂ）に示すグルコースセンサーを次に示す手順で作成した。
【００３７】
まず，直径２インチ，結晶格子１００面，片面鏡面仕上げのシリコンウエハー１に対しＲＣＡ社の方法に準じた洗浄を行った後，水素燃焼法の熱酸化で約０．８オングストロームの酸化膜を形成させた。これにフォトレジストをスピンコートしフォトマスクでパターニングを行い，フッ化水素酸，フッ化アンモニウム溶液で酸化膜のエッチングを行いＥＰＷ溶液（エチレンジアミン−ピロカテコール−水）のエッチング溶液を用い結晶異方性ウエットエッチング法により長さ１２ｍｍ，幅１ｍｍ，深さ５６μｍの放射状の溝２を１６本作成した。シリコンウエハー１は，大気中に放置もしくは，直接加熱することによって，表面に絶縁性を備えた被膜が形成されている。この溝２を多数作成したシリコンウエハー１全面に対し，スパッタリング装置を用いて白金膜を厚さ約２００オングストローム形成しフォトレジストをスピンコートし，白金膜のパターニングを行った後イオンミリング装置で，ドライエッチングを行い白金電極膜３，４をそれぞれの溝に対して１対（２電極）形成させた（単一あたりの電極面積１ｍｍ²）。さらにこのシリコンウエハー１とパイレックス製で外径２インチ内径１．２インチのガラス基板５とを陽極接合することにより立体構造を形成させた。以上の操作を経て微細管構造−キャピラリー６と白金電極膜３，４を成形した。なお，キャピラリーの内側に電極取出部３ａ，４ａがそれぞれ露出して形成されている。
【００３８】
次に，酵素固定化方法について述べる。酵素としてのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は，ガラスやシリコン表面をアミノ化し架橋剤にグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用いてこれを酵素のアミノ基と架橋させる方法で固定化した。製作したキャピラリー６に３−アミノプロピルトリエトキシシラン(aminopropyltrietoxysilane, γ−ＡＰＴＥＳ）のトルエン溶液１０μｌを室温で通過させ終夜１１５℃に加熱した。２．５％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド（ＧＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）でカラムを満たし１時間保持し，これを排出後リン酸緩衝液を通過させて洗浄し，１０％（ｗ／ｖ）のＧＯＤ（Type II ，Sigma ）を含むリン酸緩衝液でカラムを満たし終夜保持し内部に，グルコースオキシダーゼを固定化した。
【００３９】
次に，本発明の第１の実施の形態によるグルコースセンサーの測定原理について説明する。
【００４０】
本発明の第１の実施の形態によるマルチタイプグルコースセンサーは，グルコース溶液および検査試料を毛細血管現象によりシリコンウエハー先端のキャピラリー６から内部に導入される。導入されたグルコース溶液は，キャピラリー内部で固定化されたＧＯＤの触媒作用により下記化１式に示すように，グルコノラクトンと過酸化水素に変換される。
【００４１】
【化１】

【００４２】
生成した過酸化水素はキャピラリー内の白金電極膜で，下記化２式の電極反応に従って電気化学的に検出される。
【００４３】
【化２】

【００４４】
電気化学検出は，酸素や過酸化水素など多くの酵素反応の基質や生成物が電気化学的に活性であり又それぞれの化学種は電気化学的に分別定量可能でありこれらの電気化学検出が有効な測定デバイスになる。また一般的に，分光学的検出での検出対象がサイズの３乗に比例して減少していくのに対して，電気化学検出ではサイズの２乗に比例して減少する。本発明によるグルコースセンサを用いた検出法では，電気化学検出法を採用しているため，微小化に伴い相対的に電気化学検出法の効率が高くなる。更に微小化により試薬や試料の消費量を抑えることができる，すなわち測定時間の短縮を図ることができる。生成した過酸化水素は白金電極膜の片方の電極−アノード電極により酸化されアノード電流が観測される。以上のことから過酸化水素濃度の電流値変化を観測することからグルコースの定量が可能となった。
【００４５】
次に，本発明の第１の実施の形態によるグルコースセンサーを用いたグルコースの測定例について説明する。
【００４６】
ＧＯＤを用いてグルコースを測定するとき，通常生成する酸化還元種は過酸化水素である。過酸化水素を製作したデバイスで定量的に検出することができるかを確認するためにデバイスのグルコースの検出に先立って，過酸化水素溶液を導入して電気化学反応を行わせた。それぞれの濃度の調整した過酸化水素溶液でキャピラリーセルを満たし，サイクリックボルタンメトリーを行った。デバイス内の２つの電極間に，０から１０００ｍＶまでの電位をスキャンした時の電流値変化を図２に示す。図２に示すように，８００ｍＶ付近の電流値に，過酸化水素由来の酸化電流が観測された。過酸化水素濃度と電流値の間で相対的な関係が認められ，製作したデバイスが過酸化水素検出用の電気化学セルとして機能することが判明した。同様の方法で今度は試料導入用の穴からグルコース溶液を導入する。キャピラリー内のＧＯＤによりグルコースが酸化され，このとき溶存酸素が過酸化水素になる。下記表１はこれら試料を導入した場合の応答値を表す。
【００４７】
【表１】

【００４８】
図３は本発明の第２の実施の形態によるグルコースセンサーのガラス板を取り除いた状態を示す平面図である。図３に示すように，シリコン基板１上に，溝１２が形成され，白金電極膜１３，１４が夫々形成されている。本発明の第１の実施の形態においては，溝数，即ち，キャピラリー数が１６本であったが，第２の実施の形態によるものは，溝数７２本と密度が高められている。また，そのために，電極取出部分も一対づつ並んで形成されている。
【００４９】
本発明の第１及び第２の実施の形態によるグルコースセンサーは，その使用に際しては，白金電極膜にボルタンメータを備えた測定装置を接続したものを用意し，採血した血液を一滴，センサーのキャピラリーに毛管現象によって吸い込ませて，測定すれば良い。
【００５０】
採血に際しては，例えば，消毒綿で指先を消毒し，乾燥させた後，採血器等を用いて穿刺して，血液を一滴しぼりだす等で良い。
【００５１】
第２の実施の形態によるグルコースセンサーも第１の実施の形態によるものと同様に，ガラス板を重ねて陽極接合して一体化した後，酵素固定化されても用いられる。
【００５２】
図４は本発明の第３の実施の形態によるグルコースセンサーを示す分解組み立て斜視図であり，（ａ）は第１のアクリル板，（ｂ）は第２のアクリル板を示している。図４（ａ）を参照すると，第１のアクリル板２１は，中央に孔部２２を有し，一面２３には，外周からこの孔部２２に向かって断面角型の溝２４が半径方向に複数設けられている。
【００５３】
図４（ｂ）を参照すると，第２のアクリル板２５は，表面に，先端部が直角に屈曲した白金電極２７，２８，２９が，半径方向に途中で段を為し延在して夫々設けられている。この白金電極２７，２８，２９は，スパッタリングに，よって形成され，この３本の電極２７，２８，２９の内の電極２８の基部は，この第２のアクリル板２５の中心部付近で，中心電極３０に夫々接続されている。
【００５４】
これらの第１及び第２のアクリル板２１及び２５は，図に示されている一面を，エチレンジアミンのプラズマ重合によって処理され，互いに張り合わされたのち，後に詳しく述べるように，半径方向に形成されたキャピラリー内に酵素が固定化される。
【００５５】
図５（ａ），図５（ｂ）及び図５（ｃ）は，図４（ａ）及び図４（ｂ）の第１及び第２のアクリル板２１及び２５の一部を示す斜視図である。
【００５６】
図５（ａ）に示すように，厚さ２ｍｍ，半径３０ｍｍ，内径２０ｍｍのドーナツ型の円板の一面に，深さ１ｍｍ，幅１ｍｍの溝２４が半径方向に複数本形成されている。
【００５７】
図５（ｂ）に示すように，厚さ２ｍｍ，半径３０ｍｍの円板の一面で，溝２４に対応するように，半径方向に電極２７，２８，２９が形成されている。この溝２４は，電極の周方向に長い先端部２７ｂ，２８ｂ，２９ｂが夫々横断する。なお、符号２７ａ，２８ａ，２９ａは電極取出部である。
【００５８】
図５（ｃ）に示すように，図５（ａ）の第１のアクリル板及び図５（ｂ）の第２のアクリル板を図に示された一面を互いに合わせることによって，第１のアクリル板２１の溝２４は，第２のアクリル板２５の一面によって，蓋がなされ，半径方向にキャピラリー３１が形成される。
【００５９】
次に，本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーの製造方法について図６乃至図９を参照して説明する。
【００６０】
図６はプラズマ重合を行う装置の概略を示している。図６に示すように，装置は，装置本体５０内の上部にサンプルステージ６０が設けられ，その上にプラズマ発生器５３が設けられている。プラズマ発生器５３には，発振器５２及び整合器５１が接続されている。サンプルステージの下側のチャンバー内には，エチレンジアミン等の原料を蓄えるリザーバ５９と，これに接続され，バルブを備えた配管からなる流路６２と，流路６２の一端に設けられた流量調整器５８を介して，チャンバー内に導入管５５が接続されている。
【００６１】
一方，チャンバー内のガスを排気するために，チャンバーには，拡散ポンプ５６及びロータリーポンプ５７に接続された排気管５４が設けられている。この装置は，アミノ基導入のため，プラズマ重合膜のモノマー原料としてはエチレンジアミンを使用する。プラズマ重合の条件は，以下の表２の通りである。
【００６２】
【表２】

【００６３】
上記表２の条件で，プラズマ重合膜の成膜速度は，１０００オングストローム／ｍｉｎであり，プラズマの重合膜の厚さは１０００オングストロームである。
【００６４】
次に，具体的手順を説明する。
【００６５】
まず，図７（ａ）及び図８（ａ）に示すように，外径３０ｍｍ，厚さ２ｍｍのアクリル基板と外径３０ｍｍ，内径２０ｍｍ，厚さ２ｍｍのアクリル板を用意する。図７（ｂ）に示すように，アクリル板２１の表面にキャピラリー形成用の溝２４を機械加工により，半径方向に長さ１０ｍｍ，深さｌｍｍ，幅１ｍｍの溝２４を複数本形成する。図７（ｃ）に示すように，アクリル板の一面にエチレンジアミンプラズマ処理によりアクリル基板表面にアミノ基を導入する。ここで，エチレンジアミンプラズマ重合膜の作製について，詳細に説明する。プラズマとは，電離によってできた電子と正イオンがほぼ等しい密度となって全体として中性になっている物質の状態のことである。プラズマ重合法は，このプラズマ中で重合し高分子合成を行う方法である。この方法あるいはこの方法で得られた膜は，（ア）どのようなモノマーでも製膜可能であること，（イ）ピンホールフリーの非晶質であること，（ウ）薄膜形成（〜１０ｎｍ）可能であり均質であること，（エ）膜形成だけでなく，プラズマガスの種類を変えることにより表面改質，修飾（例えば官能基導入）が可能であること，（オ）ドライプロセスであるので半導体技術との融合が容易であることなどの利点を備えている。
【００６６】
一方，図８（ｂ）に示すように，アクリル板の一面に，図６に示した装置を用いるエチレンジアミンプラズマ処理によりアミノ基を導入する。
【００６７】
図８（ｃ）に示すように，溝を形成していないアクリル基板上にスパッタリングによって白金電極パターン３２を形成する。ここで，スパッタリングとは，素材の金属等をプラズマ状態にまで持っていき，対向する基板上に付着させる技術であり，主に電極形成用の金属薄膜に用いられるプロセスである。白金膜の付着速度は，毎秒数オングストロームであり，膜厚は時間により制御可能である。ここでは，前記のプラズマ重合処理をしたアクリル基板の上にスパッタリングで白金電極を形成する。電極パターン作製にはメタルマスクを使用し，１対の電極パ夕ーン当たり３電極を夫々同時に形成する。また，スパッタリングの条件は以下の表３の通りである。
【００６８】
【表３】

【００６９】
上記表２の条件で，白金膜の成膜速度は１００オングストローム／ｍｉｎであり，白金膜の厚さは１０００オングストロームとなる。
【００７０】
次に図９（ａ）に示すように，キャピラリー及び電極対を一体化させるため，基板間に１，２−ジクロロエタンを塗布し，アクリル基板同士の溶接接合を行う。続いて，図９（ｂ）に示すように，グルタルアルデヒドによって形成されたキャピラリー３１内に酵素を固定化する。
【００７１】
酵素固定化は，プラズマ重合膜表面にあるアミノ基と酵素に存在するアミノ基を二価の架橋試薬であるグルタルアルデヒドを用いて行う。この反応は，次の化３式で示される。
【００７２】
【化３】

【００７３】
また，酵素固定化の詳細な手順は以下のようにして行う。
【００７４】
まず，（ｉ）２．５％（ｖ／ｖ）のグルタルアルデヒド（ＧＡ）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）を用意し，前記のプラズマ処理を行ったキャピラリー内に塗布して３０分放置する。（ii) これをリン酸酸緩衝溶液で洗浄後，１０％（Ｗ／Ｖ）のＧＯＤ（Type II ，Sigma)を含むリン酸緩衝液を塗布したのち，３０分室温で保持する。（iii)リン酸緩衝液で物理的吸着している酵素を洗い流す。
【００７５】
図１０は，本発明の第３の実施の形態によるキャピラリー電極による過酸化水素の電極応答を示すサイクリックボルタモグラムである。図１０において，横軸に電位Ｅ（ｍＶ），縦軸に電流値（Ａ）を示している。
【００７６】
（ａ）の状態では，まったく電流が流れない，即ち，回路のショートがない。
【００７７】
（ｂ）の状態では，４００〜８００ｍＶにおいて目立った電流変化が観測されない。
【００７８】
（ｃ）の過酸化水素を入れると，３００〜８００ｍＶにおいて酸化電流が観測され，過酸化水素が検出できる事が分かる。測定条件等は図１０に示されている通り，リン酸バッファ（ｐＨ５．６）２０ｍＭ，走査速度（Scan rate)１００ｍＶ／ｓｅｃのＣＶ測定で，室温（２７℃）により行われている。
【００７９】
図１１は本発明の第３の実施の形態によるキャピラリー電極によるグルコースの電極応答のサイクリックボルタモグラムである。測定条件は図１０と同様に行われており，溶液導入後３分後に測定を開始している。
【００８０】
図１１に示すように，バッファ溶液のみの時では，目立った電流値が観測されないが，（ｄ）グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）によりグルコノラクトンと過酸化水素に変換され，この過酸化水素が検出できた事が分かる。また，このＣＶ図での６００ｍＶにおける電流値の度合いを測る事によって，グルコースの定量が可能となる。
【００８１】
図１２は本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーのグルコース濃度による電流値変化（検量線）を示す図であり，図１１において得られた最適な電位（６００ｍＶ）におけるグルコース濃度を変化させた時の電流変化を示している。図１２を参照すると，グルコース０〜１０ｍＭの範囲において０〜０．８μＡの電流値変化が観測された。
【００８２】
ここで，この検量線は，電流値をＹとおくと以下の数１式のように示される。
【００８３】
【数１】

【００８４】
図１３は本発明の第３の実施の形態によるデバイスに設けられた任意の４つのキャピラリー（夫々Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊと呼ぶ）を用いて，それぞれのキャピラリーによるグルコース濃度による依存性を測定した結果を示している。測定条件は，図１２と同様に行った。
【００８５】
図１３に示すように，それぞれ０〜１０ｍＭのグルコース溶液において，０〜１．５μＡの範囲で変化していることが判る。
【００８６】
【発明の効果】
以上，説明したように，本発明では，マイクロマシン技術を用いることによって，シリコン基板とガラスとで構成されるマイクロ酵素反応キャピラリーと電気化学測定用電極を製作し，一体化及び集積化を行い，迅速かつ簡便であるという長所を持つバイオセンサーを微小化・一体化・集積化・量産化が可能なバイオセンサーシステムを構築することができ，さらに広い範囲に適用することができる酵素反応センサーとその製造方法とを提供することができる。
【００８７】
また，本発明においては，液体クロマトグラフィー等の測定装置では，試料溶液の導入用にポンプなどの輸送系が必要となるが，システム中のデバイスはすべてキャピラリー構造が必要であり，この構造を持たせるために異方性エッチングによる溝を持つシリコン基板とガラスとの接合により得られるシリコンキャピラリーを採用し，シリコンキャピラリーを酵素反応カラムとしても用いることとしたので，キャピラリー自身が微小化による毛細管現象により試料輸送を担当し，内面の化学修飾により酵素を固定化することが可能となり，微量なグルコース溶液に対しても十分な応答を示したことから製作したデバイスがマイクロ酵素センサーとして機能する酵素反応センサーを提供することができる。
【００８８】
さらに，本発明によれば，単一のシリコンウエハー上に各々のデバイスを放射状に配列・多数のセンサーを組み込む事によって，各々のデバイスはディスポーザブルタイプのセンサーとして使用可能で，かつシリコンウエハー単位として組み込んだデバイスの数だけ連続使用可能な酵素反応センサーを提供することができる。
【００８９】
また，本発明によれば，プラスチック基板を用いているために，機械的な加工が容易であるとともに，製造コストの低廉価ができる酵素反応センサーを提供することができる。
【００９０】
また，本発明によれば，プラズマ重合処理を行っているために，基板同士の接合が容易であるとともに，酵素の固定化がさらに容易である酵素反応センサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）は本発明の第１の実施の形態によるグルコースセンサーのガラス板とシリコンウエハーとの接合前の状態を示す分解組立斜視図である。
（ｂ）はグルコースセンサーの平面図である。
【図２】過酸化水素濃度と，電流値増加量との特性を示すグラフ，表は緩衝溶液およびグルコース溶液に対する電流値を示す図である。
【図３】本発明の第２の実施の形態による酵素反応センサーのガラス板とシリコンウエハとの接合前の状態を示す平面図である。
【図４】本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーを示す分解組立斜視図であり，（ａ）は第１のアクリル板，（ｂ）は第２のアクリル板を示している。
【図５】（ａ），（ｂ），及び（ｃ）は図４（ａ），（ｂ），に示したアクリル板２１及び２５の一部を示す斜視図である。
【図６】プラズマ重合を行う装置の概略を示す図である。
【図７】（ａ），（ｂ），及び（ｃ）は本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーの製造方法を示す図である。
【図８】（ａ），（ｂ），及び（ｃ）は本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーの製造方法を示す図である。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーの製造方法を示す図である。
【図１０】本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーのキャピラリー電極による過酸化水素の電極応答を示すサイクリックボルタモグラムである。
【図１１】本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーのキャピラリー電極による過酸化水素の電極応答を示すサイクリックボルタモグラムである。
【図１２】本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーのグルコース濃度による電流値変化（検量線）を示す図である。
【図１３】本発明の第３の実施の形態による酵素反応センサーのキャピラリー（Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ）によるグルコース濃度による依存性を測定した結果を示す図である。
【符号の説明】
１シリコン基板
２溝
３，４白金電極膜
３ａ，４ａ電極取出部
５ガラス板
６キャピラリー
１０グルコースセンサー
１１シリコン基板
１２溝
１３，１４白金電極膜
１３ａ，１４ａ電極取出部
２１第１のアクリル板
２２孔部
２３一面
２４溝
２５第２のアクリル板
２７，２８，２９電極
３０中心電極
５０チャンバー
５１整合器
５２発振器
５３プラズマ発生器
５４排気管
５５導入管
５６拡散ポンプ
５７ロータリポンプ
５８流量調整器
５９リザーバー
６０サンプルステージ
６１導線
６２流路[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sensor using an enzyme reaction, such as a clinical portable multi-type glucose sensor, and more particularly to a sensor for measuring glucose concentration in blood and urine using an enzyme reaction and a method for producing the same. .
[0002]
[Prior art]
Diabetes, which is an adult disease, requires blood glucose levels to be measured several times a day to control insulin administration and diet. Currently, glucose measurement methods include colorimetric methods, enzyme reaction methods, and the like.
[0003]
The colorimetric method is generally a reduction method (Somogyi-Nelson method). This method is measured through the following procedure. First, using zinc sulfate and barium hydroxide to remove the obstructing proteins (deproteinization). After that, it is centrifuged and filtered to cause reduction and color reaction. As another colorimetric method, there is a condensation method (o-toluidine / boric acid method). This method makes use of the fact that when a sugar is heated together with o-toluidine under acidic conditions, a blue-green color is exhibited. These colorimetric methods are methods in which the absorbance is measured by applying absorption light having a wavelength specific to each reactant, and the glucose concentration is measured from the result.
[0004]
On the other hand, as a measuring method using an enzyme reaction, a product such as hydrogen peroxide generated when glucose reacts with an enzyme such as glucose oxidase (GOD) or a substance (enzyme) that decreases. There is a method for quantifying glucose by quantifying glucose. Actually, there are a method using an electrode (cyclic volt amperometry) and a colorimetric measurement method as detection means.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The colorimetric method generally requires pre-processing and uses a spectroscopic measurement method, so that the detection unit becomes large. In addition, as described above, in the absorptiometric method, an accurate measurement value may not be obtained because it is affected by another substance having a wavelength approximate to the natural wavelength of the measurement substance.
[0006]
On the other hand, the current enzymatic method does not require pretreatment because it uses the substrate selectivity of the enzyme, but in order to measure a large number of samples, it is necessary to install equipment such as a pump and a reaction tank. Larger equipment makes it difficult to reduce costs and mass production. In addition, a problem remains in that the glucose concentration of the measurement sample is detected immediately and the conditions of portability and multiple sample measurement are satisfied.
[0007]
Therefore, the technical problem of the present invention is that, for example, it is possible to measure the glucose concentration present in blood and urine many times with a small device, and that mass production is an advantage of semiconductor processing technology. It is an object of the present invention to provide an enzyme reaction sensor and a manufacturing method thereof.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In the present invention, for example, a large number of grooves and platinum electrode films are formed radially on a semiconductor substrate such as a circular silicon wafer using micromachine technology, and then the semiconductor substrate and a glass plate such as Pyrex glass are integrated. Then, a capillary is formed, and an enzyme such as glucose oxidase is immobilized inside. As described above, since many capillaries and electrodes are fabricated on a single semiconductor substrate and an enzyme sensor such as a multi-type glucose sensor is constructed, the above-mentioned problems of downsizing, multiple sample measurement, and mass productivity are solved. Yes.
[0009]
  That is, (1) according to the present invention, a pair of substrates to be superposed on each other, a plurality of grooves formed on one surface of at least one of the pair of substrates, and the plurality of grooves. And at least two electrode films made of a noble metal formed on any one of the pair of substrates,The substrate on which the electrode film of the pair of substrates is formed is made of circular plastics, and the plurality of grooves are formed along one surface of the plastics substrate along a radial direction,Of the pair of substrates, the substrate on which the electrode film is not formed has a size or a shape such that a part of the substrate on which the electrode film is formed is exposed. There is provided an enzyme reaction sensor characterized in that an electrode extraction part extending from the electrode film is provided, and an enzyme is immobilized inside a capillary formed by the groove and the substrate.
[0010]
(2) According to the present invention, there is obtained an enzyme reaction sensor characterized in that the enzyme is glucose oxidase in the enzyme reaction sensor.
[0012]
  Also,(3)According to the present invention, in any one of the enzyme reaction sensors, an enzyme reaction sensor is obtained, wherein the noble metal is made of platinum.
[0013]
  Also,(4)According to the present invention, in any one of the enzyme reaction sensors, the plurality of electrode films include three corresponding to one groove.One by oneAn enzyme reaction sensor characterized by being formed is obtained.
[0014]
  Also,(5)According to the present invention, in any one of the enzyme reaction sensors, an enzyme reaction sensor is obtained in which the pair of substrates are bonded to each other.
[0015]
  Also,(6)According to the present invention, in any one of the enzyme reaction sensors, the pair of substrates includes a plasma polymerization film on a bonding surface and is bonded to each other by welding the plasma polymerization film. Is obtained.
[0016]
  Also,(7)According to the present invention, in any one of the enzyme reaction sensors, the enzyme immobilization includes at least the amino group of the plasma polymerization film of the monomer having an amino group present on the inner wall surface of the capillary and the amino group present in the enzyme. Can be obtained by binding an enzyme with a crosslinking reagent.
[0020]
  Also,(8)According to the present invention, using micromachine technology,Made of circular plasticone sheetofForming a plurality of grooves on the substrate;Made of circular plasticAt least a pair of electrode film groups made of a noble metal is formed on the other substrate corresponding to the grooves, and the pair of substrates is made of a circular plastic, and the pair of substrates is the one of the pair of substrates. The substrate on which the electrode film is not formed has such a size or shape that a part of the substrate on which the electrode film group is formed is exposed, and the exposed part of the substrate extends from the electrode film. An electrode extraction portion is provided, and the pair of substrates are overlapped and joined together in correspondence with the groove and the noble metal to form a capillary, and an enzyme is immobilized inside the capillary Thus, a method for producing an enzyme reaction sensor can be obtained.
[0021]
  Also,(9)According to the present invention, in the method for producing an enzyme reaction sensor, there can be obtained a method for producing an enzyme reaction sensor, wherein glucose oxidase is immobilized as the enzyme by a chemical binding / entrapment method.
[0023]
  Also,(10)According to the present invention,FermentingIn the elemental reaction sensor manufacturing method, the groove is formed in the radial direction in the single substrate, and an opening is formed in the center of the substrate where the electrode film is not formed so that the electrode extraction portion is exposed. Thus, a method for producing an enzyme reaction sensor can be obtained.
[0024]
  Also,(11)According to the present invention, any one of the aforementioned enzymesreactionIn the sensor manufacturing method, the noble metal is made of platinum, the at least one pair of electrode films is formed by a sputtering method and an ion milling method, and the electrode extraction portion is formed near the center of the substrate. A method for producing a reaction sensor is obtained.
[0025]
  Also,(12)According to the present invention, in any one of the methods for producing an enzyme reaction sensor, the pair of substrates are made of an acrylic resin, and are joined to each other to be integrated.
[0026]
  Also,(13)According to the present invention, in any one of the methods for producing an enzyme reaction sensor, after forming a groove in the one substrate and before forming an electrode group on the other substrate, A method for producing an enzyme reaction sensor is obtained, wherein a plasma polymerized film containing amino groups is formed on the surfaces of the surfaces to be joined to each other.
[0027]
  Also,(14)According to the present invention, in the method for producing an enzyme reaction sensor, the enzyme has an amino group, and the enzyme is immobilized by the action of a crosslinking reagent between the amino group of the plasma polymerized film and the amino group of the enzyme. It is possible to obtain a method for producing an enzyme reaction sensor characterized by comprising binding.
[0034]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings. In the embodiment of the present invention, an example of a glucose sensor is shown as an enzyme reaction sensor, but it is clear that the present invention is not limited to these.
[0035]
FIG. 1A is an exploded perspective view showing a glucose sensor according to the first embodiment of the present invention, and FIG. Referring to FIGS. 1A and 1B, a glucose sensor 10 is an integrated sensor device, and a groove 2 is formed in a radial direction on one surface of a silicon substrate 1. In this groove 2,

platinum electrode films

3 and 4 are formed and covered with a Pyrex glass plate 5. The Pyrex glass plate and the silicon substrate 1 are joined and integrated, and the groove 2 is covered with the Pyrex plate to form a capillary 6. Glucose oxidase is immobilized on the capillary 6.
[0036]
The glucose sensor shown in FIG. 1B was prepared by the following procedure.
[0037]
First, a silicon wafer 1 having a diameter of 2 inches, a crystal lattice of 100, and a single-sided mirror finish is cleaned according to the RCA method, and then an oxide film of about 0.8 angstroms is formed by thermal oxidation using a hydrogen combustion method. I let you. This is spin coated with a photoresist, patterned with a photomask, etched with an oxide film using hydrofluoric acid or ammonium fluoride solution, and crystal anisotropic using an etching solution of EPW solution (ethylenediamine-pyrocatechol-water). Sixteen radial grooves 2 having a length of 12 mm, a width of 1 mm, and a depth of 56 μm were formed by wet etching. The silicon wafer 1 is left in the atmosphere or directly heated to form a coating having an insulating property on the surface. A platinum film having a thickness of about 200 angstroms is formed on the entire surface of the silicon wafer 1 on which a large number of grooves 2 are formed by using a sputtering apparatus, a photoresist is spin-coated, the platinum film is patterned, and then dried by an ion milling apparatus. Etching was performed to form a pair (two electrodes) of the

platinum electrode films

3 and 4 for each groove (electrode area per single 1 mm)²). Further, a three-dimensional structure was formed by anodically bonding the silicon wafer 1 and a glass substrate 5 made of Pyrex and having an outer diameter of 2 inches and an inner diameter of 1.2 inches. The fine tube structure-capillary 6 and

platinum electrode films

3 and 4 were formed through the above operation. In addition, the electrode extraction parts 3a and 4a are respectively exposed and formed inside the capillary.
[0038]
Next, the enzyme immobilization method is described. Glucose oxidase (GOD) as an enzyme was immobilized by a method in which the surface of glass or silicon was aminated and glutaraldehyde (GA) was used as a crosslinking agent to crosslink with the amino group of the enzyme. To the manufactured

capillary

6, 10 μl of a toluene solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (γ-APTES) was passed at room temperature and heated to 115 ° C. overnight. Fill the column with phosphate buffer (pH 7.1) containing 2.5% (v / v) glutaraldehyde (GA), hold it for 1 hour, discharge it, and wash it by passing through phosphate buffer. The column was filled with a phosphate buffer containing 10% (w / v) GOD (Type II, Sigma) and held overnight to immobilize glucose oxidase.
[0039]
Next, the measurement principle of the glucose sensor according to the first embodiment of the present invention will be described.
[0040]
In the multi-type glucose sensor according to the first embodiment of the present invention, a glucose solution and a test sample are introduced into the inside of the capillary 6 at the tip of the silicon wafer by capillary action. The introduced glucose solution is converted into gluconolactone and hydrogen peroxide by the catalytic action of GOD immobilized inside the capillary as shown in the following formula 1.
[0041]
[Chemical 1]

[0042]
The generated hydrogen peroxide is detected electrochemically by the platinum electrode film in the capillary according to the electrode reaction of the following formula 2.
[0043]
[Chemical formula 2]

[0044]
In electrochemical detection, substrates and products of many enzyme reactions such as oxygen and hydrogen peroxide are electrochemically active, and each chemical species can be electrochemically fractionated and quantified. A good measuring device. In general, the number of detection targets in spectroscopic detection decreases in proportion to the cube of the size, whereas in electrochemical detection, it decreases in proportion to the square of the size. Since the detection method using the glucose sensor according to the present invention employs the electrochemical detection method, the efficiency of the electrochemical detection method is relatively increased as the size is reduced. Further, the consumption of reagents and samples can be suppressed by miniaturization, that is, the measurement time can be shortened. The produced hydrogen peroxide is oxidized by one electrode-anode electrode of the platinum electrode film, and an anode current is observed. From the above, it was possible to quantify glucose by observing changes in the current value of the hydrogen peroxide concentration.
[0045]
Next, an example of measuring glucose using the glucose sensor according to the first embodiment of the present invention will be described.
[0046]
When measuring glucose using GOD, the redox species that is usually produced is hydrogen peroxide. In order to confirm whether hydrogen peroxide can be quantitatively detected by the manufactured device, an electrochemical reaction was performed by introducing a hydrogen peroxide solution prior to detection of glucose in the device. The capillary cell was filled with the hydrogen peroxide solution of each concentration and cyclic voltammetry was performed. FIG. 2 shows a change in current value when a potential of 0 to 1000 mV is scanned between two electrodes in the device. As shown in FIG. 2, an oxidation current derived from hydrogen peroxide was observed at a current value near 800 mV. A relative relationship was observed between the hydrogen peroxide concentration and the current value, and it was found that the fabricated device functions as an electrochemical cell for hydrogen peroxide detection. In the same manner, the glucose solution is introduced from the sample introduction hole. Glucose is oxidized by GOD in the capillary, and dissolved oxygen becomes hydrogen peroxide. Table 1 below shows response values when these samples are introduced.
[0047]
[Table 1]

[0048]
FIG. 3 is a plan view showing a state in which the glass plate of the glucose sensor according to the second embodiment of the present invention is removed. As shown in FIG. 3, a groove 12 is formed on the silicon substrate 1, and

platinum electrode films

13 and 14 are formed, respectively. In the first embodiment of the present invention, the number of grooves, that is, the number of capillaries is 16, but according to the second embodiment, the density is increased to 72 grooves. For this purpose, electrode extraction portions are also formed side by side.
[0049]
The glucose sensor according to the first and second embodiments of the present invention is prepared by using a platinum electrode membrane connected with a measuring device equipped with a voltammeter. One drop of collected blood is put in the capillary of the sensor. It can be measured by inhalation by capillary action.
[0050]
When collecting blood, for example, the fingertip may be sterilized with disinfecting cotton, dried, and then punctured with a blood collecting device to squeeze out a drop of blood.
[0051]
Similarly to the first embodiment, the glucose sensor according to the second embodiment can be used even if the enzyme is immobilized after the glass plates are stacked and anodically joined together.
[0052]
FIG. 4 is an exploded perspective view showing a glucose sensor according to a third embodiment of the present invention, in which (a) shows a first acrylic plate and (b) shows a second acrylic plate. Referring to FIG. 4A, the first acrylic plate 21 has a hole 22 at the center, and a groove 24 having a square cross section in the radial direction extends from the outer periphery toward the hole 22 on one surface 23. A plurality are provided.
[0053]
Referring to FIG. 4 (b), the second acrylic plate 25 has

platinum electrodes

27, 28, and 29 whose tips are bent at right angles on the surface, and extend in steps along the radial direction. Is provided. The

platinum electrodes

27, 28, and 29 are formed by sputtering, and the base of the electrode 28 among the three

electrodes

27, 28, and 29 is centered around the center of the second acrylic plate 25. Each is connected to the electrode 30.
[0054]
These first and second

acrylic plates

21 and 25 were formed in the radial direction as described in detail later after one side shown in the figure was processed by plasma polymerization of ethylenediamine and bonded together. Enzyme is immobilized in the capillary.
[0055]
5 (a), 5 (b) and 5 (c) are perspective views showing a part of the first and second

acrylic plates

21 and 25 of FIGS. 4 (a) and 4 (b). is there.
[0056]
As shown in FIG. 5A, a plurality of grooves 24 having a depth of 1 mm and a width of 1 mm are formed in the radial direction on one surface of a donut-shaped disk having a thickness of 2 mm, a radius of 30 mm, and an inner diameter of 20 mm.
[0057]
As shown in FIG. 5B,

electrodes

27, 28, and 29 are formed in the radial direction so as to correspond to the grooves 24 on one surface of a disk having a thickness of 2 mm and a radius of 30 mm. The groove 24 is traversed by

tip portions

27b, 28b and 29b which are long in the circumferential direction of the

electrode.Reference numerals

27a, 28a, and 29a denote electrode extraction portions.
[0058]
As shown in FIG. 5C, the first acrylic plate in FIG. 5A and the second acrylic plate in FIG. The groove 24 of the plate 21 is covered with one surface of the second acrylic plate 25 to form a capillary 31 in the radial direction.
[0059]
Next, a method for manufacturing an enzyme reaction sensor according to the third embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS.
[0060]
FIG. 6 shows an outline of an apparatus for performing plasma polymerization. As shown in FIG. 6, the apparatus is provided with a sample stage 60 in the upper part of the apparatus main body 50 and a plasma generator 53 thereon. An oscillator 52 and a matching unit 51 are connected to the plasma generator 53. In the lower chamber of the sample stage, a reservoir 59 that stores raw materials such as ethylenediamine, a flow path 62 that is connected to the reservoir 59 and includes a valve, and a flow rate regulator provided at one end of the flow path 62 are provided. An introduction pipe 55 is connected to the chamber via 58.
[0061]
On the other hand, in order to exhaust the gas in the chamber, the chamber is provided with an exhaust pipe 54 connected to a diffusion pump 56 and a rotary pump 57. This apparatus uses ethylenediamine as a monomer raw material for the plasma polymerization film for introducing amino groups. The conditions for plasma polymerization are as shown in Table 2 below.
[0062]
[Table 2]

[0063]
Under the conditions shown in Table 2, the deposition rate of the plasma polymerized film is 1000 Å / min, and the thickness of the plasma polymerized film is 1000 Å.
[0064]
Next, a specific procedure will be described.
[0065]
First, as shown in FIGS. 7A and 8A, an acrylic substrate having an outer diameter of 30 mm and a thickness of 2 mm and an acrylic plate having an outer diameter of 30 mm, an inner diameter of 20 mm, and a thickness of 2 mm are prepared. As shown in FIG. 7B, a plurality of grooves 24 having a length of 10 mm, a depth of 1 mm, and a width of 1 mm in the radial direction are formed on the surface of the acrylic plate 21 by machining. As shown in FIG. 7C, amino groups are introduced into the surface of the acrylic substrate by ethylenediamine plasma treatment on one surface of the acrylic plate. Here, the production of the ethylenediamine plasma polymerized film will be described in detail. Plasma is a state of a substance that is neutral as a whole, with electrons and positive ions formed by ionization at approximately the same density. The plasma polymerization method is a method for polymerizing in this plasma to synthesize a polymer. This method or the film obtained by this method can be (a) film-forming with any monomer, (b) pinhole-free amorphous, (c) thin film formation (-10 nm) Because it is possible and homogeneous, (d) not only film formation, but also surface modification and modification (for example, introduction of functional groups) by changing the type of plasma gas, (e) because it is a dry process It has advantages such as easy integration with semiconductor technology.
[0066]
On the other hand, as shown in FIG. 8B, amino groups are introduced into one surface of the acrylic plate by ethylenediamine plasma treatment using the apparatus shown in FIG.
[0067]
As shown in FIG. 8C, a platinum electrode pattern 32 is formed by sputtering on an acrylic substrate on which no groove is formed. Here, sputtering is a technique for bringing a material metal or the like to a plasma state and depositing it on an opposing substrate, and is a process mainly used for a metal thin film for electrode formation. The deposition rate of platinum film is several angstroms per second, and the film thickness can be controlled by time. Here, a platinum electrode is formed by sputtering on the acrylic substrate subjected to the plasma polymerization treatment. A metal mask is used for producing the electrode pattern, and three electrodes are formed simultaneously for each pair of electrode patterns. The sputtering conditions are as shown in Table 3 below.
[0068]
[Table 3]

[0069]
Under the conditions shown in Table 2, the deposition rate of the platinum film is 100 angstroms / min, and the thickness of the platinum film is 1000 angstroms.
[0070]
Next, as shown in FIG. 9A, in order to integrate the capillary and the electrode pair, 1,2-dichloroethane is applied between the substrates, and the acrylic substrates are welded together. Subsequently, as shown in FIG. 9B, the enzyme is immobilized in the capillary 31 formed of glutaraldehyde.
[0071]
Enzyme immobilization is performed using glutaraldehyde, which is a divalent cross-linking reagent, for the amino group on the surface of the plasma polymerization film and the amino group present in the enzyme. This reaction is represented by the following chemical formula 3.
[0072]
[Chemical Formula 3]

[0073]
The detailed procedure for enzyme immobilization is as follows.
[0074]
First, (i) a phosphate buffer solution (pH 5.6) containing 2.5% (v / v) glutaraldehyde (GA) is prepared, and applied to the above-mentioned plasma-treated capillary for 30 minutes. put. (Ii) After washing with a phosphate buffer solution, a phosphate buffer solution containing 10% (W / V) GOD (Type II, Sigma) is applied and then kept at room temperature for 30 minutes. (Iii) Wash off the physically adsorbed enzyme with phosphate buffer.
[0075]
FIG. 10 is a cyclic voltammogram showing the electrode response of hydrogen peroxide by the capillary electrode according to the third embodiment of the present invention. In FIG. 10, the horizontal axis represents the potential E (mV), and the vertical axis represents the current value (A).
[0076]
In the state (a), no current flows, that is, there is no short circuit.
[0077]
In the state (b), no conspicuous current change is observed at 400 to 800 mV.
[0078]
When hydrogen peroxide (c) is added, an oxidation current is observed at 300 to 800 mV, indicating that hydrogen peroxide can be detected. As shown in FIG. 10, the measurement conditions and the like are measured at room temperature (27 ° C.) by CV measurement with a phosphate buffer (pH 5.6) of 20 mM and a scan rate of 100 mV / sec.
[0079]
FIG. 11 is a cyclic voltammogram of the electrode response of glucose by the capillary electrode according to the third embodiment of the present invention. The measurement conditions are the same as in FIG. 10, and the measurement is started 3 minutes after the introduction of the solution.
[0080]
As shown in FIG. 11, when only the buffer solution is used, no conspicuous current value is observed, but (d) glucose oxidase (GOD) is converted into gluconolactone and hydrogen peroxide, and this hydrogen peroxide can be detected. I understand that. Further, glucose can be quantified by measuring the degree of current value at 600 mV in this CV diagram.
[0081]
FIG. 12 is a diagram showing a current value change (calibration curve) according to the glucose concentration of the enzyme reaction sensor according to the third embodiment of the present invention. The glucose concentration at the optimum potential (600 mV) obtained in FIG. 11 is changed. It shows the current change when Referring to FIG. 12, a current value change of 0 to 0.8 μA was observed in the range of 0 to 10 mM glucose.
[0082]
Here, this calibration curve is represented by the following equation 1, where Y is the current value.
[0083]
[Expression 1]

[0084]
FIG. 13 shows the measurement of the dependence due to the glucose concentration by each of four capillaries (referred to as G, H, I, and J, respectively) provided in the device according to the third embodiment of the present invention. Shows the results. The measurement conditions were the same as in FIG.
[0085]
As shown in FIG. 13, it can be seen that each of the 0 to 10 mM glucose solutions changes within a range of 0 to 1.5 μA.
[0086]
【The invention's effect】
As described above, in the present invention, by using micromachine technology, a microenzyme reaction capillary composed of a silicon substrate and glass and an electrode for electrochemical measurement are manufactured, integrated and integrated, and quickly. Biosensor system capable of miniaturization, integration, integration, and mass production of biosensors that have the advantage of being simple and easy, and enzyme reaction sensors that can be applied to a wider range and their manufacture A method can be provided.
[0087]
In the present invention, a liquid chromatography and other measuring apparatus requires a transport system such as a pump for introducing a sample solution. However, all devices in the system require a capillary structure, and this structure is used. In order to achieve this, a silicon capillary obtained by bonding a silicon substrate with a groove by anisotropic etching and glass was adopted, and the silicon capillary was also used as an enzyme reaction column. Responsible for sample transport, the enzyme can be immobilized by chemical modification of the inner surface, and the device that has been produced functions sufficiently as a micro-enzyme sensor because it shows a sufficient response to a small amount of glucose solution. Can be provided.
[0088]
Furthermore, according to the present invention, by arranging each device radially on a single silicon wafer and incorporating a large number of sensors, each device can be used as a disposable type sensor and incorporated as a silicon wafer unit. It is possible to provide an enzyme reaction sensor that can be used continuously for as many devices as possible.
[0089]
In addition, according to the present invention, since a plastic substrate is used, it is possible to provide an enzyme reaction sensor that can be easily machined and can be manufactured at low cost.
[0090]
In addition, according to the present invention, since the plasma polymerization process is performed, it is possible to provide an enzyme reaction sensor that facilitates the bonding of substrates and further facilitates enzyme immobilization.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is an exploded perspective view showing a state before joining a glass plate and a silicon wafer of a glucose sensor according to a first embodiment of the present invention.
(B) is a top view of a glucose sensor.
FIG. 2 is a graph showing the characteristics of the hydrogen peroxide concentration and the amount of increase in current value, and the table shows current values for the buffer solution and the glucose solution.
FIG. 3 is a plan view showing a state before joining a glass plate and a silicon wafer of an enzyme reaction sensor according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 4 is an exploded perspective view showing an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention, where (a) shows a first acrylic plate and (b) shows a second acrylic plate.
5 (a), (b), and (c) are perspective views showing a part of the

acrylic plates

21 and 25 shown in FIGS. 4 (a) and 4 (b).
FIG. 6 is a diagram schematically showing an apparatus for performing plasma polymerization.
FIGS. 7A, 7B, and 7C are diagrams showing a method for manufacturing an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention. FIGS.
FIGS. 8A, 8B, and 8C are diagrams showing a method for manufacturing an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention. FIGS.
FIGS. 9A and 9B are views showing a method for producing an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 10 is a cyclic voltammogram showing an electrode response of hydrogen peroxide by a capillary electrode of an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 11 is a cyclic voltammogram showing an electrode response of hydrogen peroxide by a capillary electrode of an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 12 is a diagram showing a current value change (calibration curve) depending on glucose concentration of the enzyme reaction sensor according to the third embodiment of the present invention.
FIG. 13 is a diagram showing the results of measuring the dependence due to glucose concentration by capillaries (G, H, I, J) of an enzyme reaction sensor according to a third embodiment of the present invention.
[Explanation of symbols]
1 Silicon substrate
2 grooves
3,4 Platinum electrode membrane
3a, 4a Electrode extraction part
5 Glass plate
6 Capillary
10 Glucose sensor
11 Silicon substrate
12 grooves
13,14 Platinum electrode membrane
13a, 14a Electrode extraction part
21 First acrylic board
22 holes
23 One side
24 groove
25 Second acrylic board
27, 28, 29 electrodes
30 Center electrode
50 chambers
51 Matching device
52 Oscillator
53 Plasma Generator
54 Exhaust pipe
55 Introduction pipe
56 Diffusion pump
57 Rotary pump
58 Flow regulator
59 Reservoir
60 sample stages
61 Conductor
62 flow path

Claims

One of the pair of substrates corresponding to the plurality of grooves, a plurality of grooves formed on one surface of at least one of the pair of substrates, And at least two electrode films made of a noble metal formed on the substrate, the substrate on which the electrode film is formed of the pair of substrates is made of a circular plastic, and the plurality of grooves are made of the plastic The substrate formed on one surface of the substrate along the radial direction and not formed with the electrode film of the pair of substrates is sized such that a part of the substrate on which the electrode film is formed is exposed. Alternatively, the exposed substrate portion is provided with an electrode extraction portion extending from the electrode film, and the enzyme is immobilized in the capillary formed by the groove and the substrate. Special Enzyme reaction sensor to.

2. The enzyme reaction sensor according to claim 1, wherein the enzyme is glucose oxidase.

3. The enzyme reaction sensor according to claim 1 , wherein the noble metal is platinum.

4. The enzyme reaction sensor according to claim 1 , wherein three of the plurality of electrode films are formed corresponding to one groove. 5.

The enzyme reaction sensor according to any one of claims 1 to 4 , wherein the pair of substrates are bonded to each other.

The enzyme reaction sensor according to any one of claims 1 to 5 , wherein the pair of substrates includes a plasma polymerization film on a bonding surface, and is bonded to each other by welding of the plasma polymerization film. Enzyme reaction sensor.

7. The enzyme reaction sensor according to claim 1, wherein the enzyme immobilization crosslinks at least the amino group of the plasma polymerized film of the monomer having an amino group present on the inner wall surface of the capillary and the amino group present in the enzyme. An enzyme reaction sensor characterized by being bound by a reagent.

Using micromachine technology, the grooves form a plurality on a single substrate made of plastics circular, further a noble metal in correspondence with the grooves in the other one substrate made of plastic circular shape Forming at least a pair of electrode film groups, wherein the pair of substrates are made of circular plastics, and the electrode film group is formed on a substrate of the pair of substrates on which the electrode film is not formed. The exposed substrate portion has a size or shape such that a portion of the exposed substrate is exposed, and an electrode extraction portion extending from the electrode film is provided on the exposed substrate portion, and the groove and the noble metal And a pair of substrates are overlapped and joined together to form a capillary, and an enzyme is immobilized inside the capillary.

9. The method for producing an enzyme reaction sensor according to claim 8 , wherein glucose oxidase is immobilized as the enzyme by a chemical bond / inclusive method.

10. The method for producing an enzyme reaction sensor according to claim 8 , wherein the groove is formed in the radial direction in the single substrate, and the electrode extraction portion is exposed at the center of the substrate on which the electrode film is not formed. A method for producing an enzyme reaction sensor, wherein the opening is formed as described above.

The method for producing an enzyme reaction sensor according to any one of claims 8 to 10 , wherein the noble metal is made of platinum, and the at least one pair of electrode films is formed by a sputtering method and an ion milling method, A method for producing an enzyme reaction sensor, wherein the electrode extraction part is formed near the center of a substrate.

12. The method for producing an enzyme reaction sensor according to claim 8 , wherein the pair of substrates are made of an acrylic resin, and are joined and integrated with each other.

In the method for producing an enzyme reaction sensor according to any one of claims 8 to 12 , after forming a groove on the one substrate and before forming an electrode group on the other substrate, A method for producing an enzyme reaction sensor, comprising: forming a plasma polymerized film containing an amino group on a surface of each substrate to be bonded to each other.

14. The method for producing an enzyme reaction sensor according to claim 8 , wherein the enzyme has an amino group, and the enzyme is immobilized by the action of a crosslinking reagent between the amino group of the plasma polymerized film and the amino group of the enzyme. The manufacturing method of the enzyme-reaction sensor characterized by including combining by.