JP3854307B2 - 細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、一般に増殖因子に関し、特に過剰な細胞外マトリックスの生産におけるトランスフォーミング増殖因子βの影響に関する。
種々の病変は、細胞外マトリックス物質の有害な蓄積に特徴がある。例えば、進行性の糸球体の病気において、細胞外マトリックスが、糸球体間質中に、または糸球体基底膜に沿って蓄積し、その結果、末期の病気および尿毒症を引き起こす。同様に、成人または急性呼吸促進症候群(ARDS)は、肺でのマトリックス物質の蓄積をも含み、一方、肝硬変は、肝臓中の瘢痕によって証明される有毒なマトリックスの蓄積に特徴がある。
糖尿病は、現在、進行性の腎不全が最も一般的な原因であり、これも細胞外マトリックス成分の有害な蓄積によって特徴がある状態になる。インスリンの導入は、糖尿病の治療を革新し、劇的に患者の生存期間を長くした。しかしながら、インスリンは糖尿病性ネフロパシーのような重度の合併症には効果がなかった。血液中のグルコースの厳密なコントロール、高血圧の治療、および飲食物のタンパク質の制限は、腎臓機能が消失する速度を遅らせ得るが、末期段階の病気へ着実に進行する。
糖尿病性ネフロパシーの中心となる病理学的特徴は、糸球体中の細胞外マトリックスの蓄積である。細胞外マトリックスの蓄積の原因となる糖尿病環境における因子は、十分に理解されていない。
細胞外マトリックスは、プロテオグリカン、糖タンパク質、およびコラーゲンの混合物で、集合した複雑な超構造を形成する。様々な免疫学的な、血液力学的な、および毒性の因子が、実験的に糸球体病を誘起するために用いられたが、これらの因子のどれもが、細胞外マトリックス成分の合成または分解に直接的な影響を示さなかった。それ故、急性の細胞傷害と糸球体の細胞外マトリックスの構築との間には、別の介在過程があるようである。
従って、腎臓病のような病理学的段階におけるマトリックス成分の有害な蓄積を調節する因子を決定する必要がある。さらに、不適切なマトリックスの蓄積を含む病理学的状態を防止、制限、または治療するための因子を制御する必要がある。本発明は、これらの必要性を満足し、さらに、関連する有利点も提供する。
発明の要旨
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)の活性を抑制する薬剤と組織を接触させることによって、組織中に細胞外マトリックス成分の蓄積を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は、また同化を促進し、繊維症および脈管形成を誘導するペプチド増殖因子である、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)の活性を抑制する薬剤を提供することによって、細胞外マトリックス成分の蓄積に特徴がある病変の進行を防止または治療する方法を提供する。薬剤は、例えば、抗TGF-β抗体、血小板由来の成長因子(PDGF)、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、またはバイグリカン(biglycan)のような機能的に等しいものであり得る。治療され得る病変には、糸球体腎炎、ARDS、肝硬変、線維症性ガン、肺の線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症、血管形成後再狭窄、腎臓間質性線維症、瘢痕および、糖尿病性ネフロパシーのような糖尿病関連病変を含む、様々な線維症性の病気が含まれる。
本発明は、さらに、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織病変、特に糖尿病性ネフロパシーの存在を検出する方法に関する。この方法は、組織中のTGF-βのレベルを測定し、次いでこのレベルを正常細胞中のTGF-βのレベルと比較することによって、行われる。
本発明は、さらに、インスリンおよびTGF-βの活性を抑制する薬剤を投与することによって糖尿病を治療する方法を提供する。また、そのような薬剤を含む、本発明の方法に有用な組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、mRNAのノーザンブロッティングの結果を示す。このmRNAは、ラットの糸球体から単離され、(Ａ) TGF-β1、(Ｂ)バイグリカン、および(Ｃ)グリセルアルデヒド-3-デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(これはラット糸球体中で本質的に発現した酵素)に対するcDNAプローブとハイブリダイズされた。コントロールラット(Ｃ)、インスリンで治療したコントロールラット(ＣＩ)、糖尿病ラット(Ｄ)、および糖尿病を誘起してから15週間後にインスリンで治療した糖尿病ラット(ＤＩ)から単離した糸球体から調製した。分子量マーカーを左側に示す。
図２は、コントロールラットおよび糖尿病ラットの糸球体中に、フィブロネクチン、フィブロネクチンEDA+(図2A)、およびテネイシン(図2B)の交互に結合した形の定量を示す。＊印は、同じ時点における正常コントロール(Ｃ)と比較した、糖尿病ラット(Ｄ)、およびインスリンで治療した糖尿病ラット(DI)について、ｐ＜0.01を示す。インスリンで治療した正常コントロールラット(CI)を比較のために含む。インスリンで治療しなかった糖尿病動物は、37週間以降は生存しなかった。従って、40週間目のデータは無い。値は平均±標準偏差である。
図３は、抗TGF-β1抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)正常コントロールラットの糸球体の染色。(Ｂ)糖尿病を誘導した15週間後にインスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体の染色は、TGF-β1に対して陽性の細胞数の著しい増加を示す。陽性の細胞を糸球体の糸球体間質および上皮細胞として同定した。糖尿病の糸球体では、コントロールラットからの糸球体と比較して、糸球体１個当りに著しく陽性の細胞があり、それは*32±１対25±１（値は、平均±標準偏差、*ｐ＜0.01）であった。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図４は、抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)40週間インスリンで治療した、正常コントロールラットの糸球体が、かすかに染色されたことを示す。(Ｂ)40週間インスリンで治療した、糖尿病のラットからの糸球体の染色は、著しく染色が増加することを示す。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図５は、抗TGF-β1抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)正常な腎臓からの糸球体のかすかな染色、および(Ｂ)最小の病状変化を有する患者の腎臓からの糸球体のかすかな染色。(ＣおよびＤ)進行した糖尿病の糸球体硬化症の徴候である、重症のマトリックス蓄積のみられる２人の患者からの糸球体は、免疫反応性のTGF-β1タンパク質で鮮やかに染色されることを示す。マトリックスの蓄積が少ない初期の糖尿病の腎症の他の症例では、染色パターンは、進行したヒトの疾患のこうした場合にみられるパターンと、図3Bに示した、発病15週の糖尿病ラットにみられるパターンとの中間であり、それは、TGF-β1染色パターンが疾患の重篤さで連続していることを示唆し、最初は個々の細胞の染色を示し、そして後に細胞毎の染色が曖昧になる程度まで増加する。(Ｄ)この顕微鏡写真は、糸球体を含む上皮嚢（ボーマン嚢）における染色を示す。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図６は、抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光を示す。(Ａ)正常な腎臓からの糸球体、および(Ｂ)最小の病状変化を有する患者からの糸球体は、わずかに染色される。(ＣおよびＤ)一方、糖尿病の糸球体硬化症の２人の患者は、異常糸球体内およびその周りの嚢（ボーマン嚢）で強い染色を示した。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。
図７は、TGF-β1、2、3の活性の、組換えヒトデコリンによる中和を示す。増殖阻害を測定するミンクの肺細胞アッセイを、イソ型のTGF-βの活性を中和する組換えデコリンの能力をアッセイするために使用した。[3Ｈ]チミジンの取り込みを、Yamaguchiら、Nature 346:281 (1990)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、TGF-βの存在、およびデコリン(○)またはウシ血清アルブミン(BSA)(●)の濃度の増加で決定した。データは、TGF-β1で誘導した増殖阻害の中和のパーセントを表す。[3Ｈ]チミジンの取り込みが、TGF-βおよびデコリンのどちらにも無い場合を、100％と定義する（TGF-β1およびTGF-β3については125,000cpm；TGF-β2については107,000cpm）。TGF-βには取り込みが存在するが、デコリンには存在しない場合を、０％と定義する（TGF-β1については57,000cpm；TGF-β2については78,000cpm；TGF-β3については59,000cpm）。それぞれの点は二連の試料からの結果の平均を表す。
図８は、デコリンで治療した糸球体腎炎のラットの糸球体におけるフィブロネクチンの堆積を示す。(Ａ)リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、蛋白アルブミン(OVA)、アグレカン(aggrecan)(AGC)、またはウシ血清アルブミン(BSA)、または様々な量のデコリンを６回注射した、正常コントロールラット、およびコントロール糸球体腎炎ラットからの糸球体中のフィブロネクチン染色の定量。デコリンを４回または６回注射して治療したラットは、同じ治療を行った疾患コントロールラットまたはデコリンで治療しなかった疾患コントロールラットあるいはデコリンを２回注射して治療した疾患コントロールラットよりも、糸球体中に堆積したフィブロネクチンは、著しく少なかった（ｐ＜0.01）。(Ｂ)抗フィブロネクチン抗体で染色した、糸球体腎炎ラットからの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。ラットをデコリン注射で治療しなかった(ND)(すなわちPBSのみ)、または２日間デコリン注射で治療した(2D)、４日間デコリン注射で治療した(4D)または６日間デコリン注射で治療した(6D)。いずれの動物の場合も、糸球体の数の平均の最大標準誤差は、低い糸球体間の変数を示す0.16であった。例示した糸球体のマトリックス数は：ND, 3.5; 2D, 3.5; 4D, 2.0; 5D, 2.0である。写真を40秒の露光時間、同一条件下で撮影した。
倍率×500。
図９は、デコリンで治療した糸球体腎炎ラットの糸球体中の、EDA+フィブロネクチン、およびテネイシンの蓄積を示す。
(Ａ)糸球体におけるEDA+フィブロネクチン染色の定量。符号は、図8Aに記載の通りである。デコリンの注射を４回または６回したラットは、他の全ての糸球体腎炎群と比較して、EDA+フィブロネクチンの堆積から有意に保護されていた(Ｐ＜0.01)。(Ｂ)抗EDAフィブロネクチン抗体で染色した糸球体腎炎ラットからの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。符号は、図8Bに記載の通りである。いずれの動物の場合も、糸球体の数の平均の最大標準誤差は、低い糸球体間の変数を示す0.11であった。例示した糸球体の最大数は：ND, 4.0; 2D, 3.5; 4D, 1.0; 6D, 1.5である。写真を60秒の露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。抗テネイシン抗体で染色した、糸球体腎炎ラットからの糸球体の、免疫蛍光の顕微鏡写真もまた、得た。ラットをデコリンを４回または６回注射して治療したところ、ラットは、デコリンで治療しなかったラットまたはデコリンを２回注射して治療したラットが有するよりも少ないテネイシンを糸球体中に有していた。EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンはどちらも、デコリンで治療しなかったラットまたはデコリンを２回注射して治療したラットの腎炎の糸球体において、著しく増加していた。
発明の詳細な説明
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）の活性を抑制する薬剤と組織とを接触させることによって、組織中の細胞外マトリックス成分の蓄積を阻害する方法を提供する。本発明はまた、細胞外マトリックスが産生するTGF-βの活性を抑制するのに有効な量の薬剤と組織とを接触させることによって、組織中の細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある病変を治療する方法を提供する。薬剤は、抗TGF-β抗体、PDGF、またはArg-Gly-Aspを含有するペプチドであり得る。好ましくは、このようなArg-Gly-Aspを含有するペプチドは、４と５０との間のアミノ酸の長さである。
薬剤はまた、デコリン、デコリン類似体、またはデコリンと機能的に同等なものであり得る。本明細書中で用いる「デコリン」は、KrusiusおよびRuoslahti、PNAS (USA) 83:7638(1986)中のプロテオグリカンに帰属される構造的特徴を実質的に有するプロテオグリカンを指す。ヒト線維芽細胞デコリンは、KrusiusおよびRuoslahti、上述に示されるアミノ酸配列を実質的に有する。「デコリン」は、天然の組成物、および、デコリンフラグメントのような実質的に機能的特徴を保持しているデコリン改変物の両方を指す。デコリンコアタンパク質は、もはや、実質的にグリコサミノグリカンで置換されてなく、そしてデコリンの定義に含まれないデコリンを指す。酵素処理、突然変異、または、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質に結合できない細胞中で、組換えデコリンを産生するような他の手段によって、グリコサミノグリカンを含まないデコリンを得られ得る。
デコリンと機能的に同等なものとしては、デコリンの機能的特徴を保持するデコリン改変物、および、バイグリカンおよびフィブロモジュリンのようなデコリンと同族で、例えばデコリンと類似の機能的活性を有する分子を含む。改変物は、例えば、デコリンコアタンパク質の機能的活性を妨げない１つまたはそれ以上の側鎖を含み得る。
上記の薬剤に加えて、本発明は、そのような薬剤の同族体および類似物の使用を包含することを意図する。本明細書中で、同族体とは、上記薬剤と実質的に類似の構造を有する分子であり、類似物とは、構造的類似にかかわらず実質的に生物学的類似性を有する分子である。
機能的な同等物、同族体、または類似物が、本発明の目的に対して機能するかどうかは、当業者であれば、それを本明細書中で提供される実施例に置き換えることによって容易に決定し得る。
接触は、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。インビトロでの接触は、細胞を有効な量の薬剤と共にインキュベートし得る。インビボでの接触では、薬剤を単独または担体と共に投与し得る。投与方法は、当業者にはよく知られており、静脈内注射または筋肉内注射を含むが、これらに限定されない。薬剤を、連続的または断続的に投与し得る。
有効な量は、病変および治療する固体に依存して変わる。本発明の方法は、哺乳動物、最も好ましくはヒトの治療または防護に有用である。
本発明は、さらに、組織中のTGF-βのレベルを測定し、そして組織中のTGF-βのレベルを正常組織中のTGF-βのレベルと比較することによって、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織の種々の病変の存在を検出する方法に関する。組織中のTGF-βレベルの上昇は、そのような病変を示す。また、組織中のフィブロネクチンEDA+および/またはテネイシンの検出は、非直接的に、TGF-βの過度の活性を示す。
本発明の方法で治療し得る病変は、細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある。これらの病気は、一般に線維症性の病気であり、例えば、糸球体腎炎、成人または急性呼吸促進症候群(ARDS)、および肝硬変を含む。また、類線維腫、線維腫、線維線腫、および線維肉腫を含む、例えば、胸、子宮、または膵臓の線維症性ガン、ならびに、線維細胞の病気、線維硬化症、および線維症も含まれる。さらに、本方法は、肺線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症、および血管形成後再狭窄のような線維症状態、ならびに腎臓間質性線維症の治療に用いられ得る。本方法はまた、ケロイド性瘢痕のような過度の瘢痕形成、および外傷、火傷、または外科手術による瘢痕の治療または防止にも用いられ得る。本方法はまた、糖尿病性腎臓病のような糖尿病関連の病変を防止または阻害するのにも用いられ得る。しかしながら、これらの病変は、単なる代表例にすぎず、当業者であれば、本方法が細胞外マトリックスの蓄積に関連するあらゆる病変に有用であることは容易に理解される。
増殖因子の多様性は、細胞外マトリックス産生において役割を担っていることが示唆された。しかしながら、マトリックス成分の病理学的蓄積におけるそれらの影響は明らかでなかった。本発明は、病理学的にマトリックスの蓄積をしやすい組織は、特にプロテオグリカンを合成するという発見に基づく。TGF-βと反応する抗体のような、TGF-βの活性を阻害する薬剤は、プロテオグリカン産生に対するTGF-βの刺激効果をブロックすることが見いだされた。この点で、TGF-βはテストした増殖因子の中では独特であり、したがって、このTGF-βの特異的効果を操作することは、種々の病変におけるマトリックス成分の不適切で望ましくない蓄積を制御または治療する上で有用である。
TGF-βは、組織の傷害後の修復および再生を調節するのに重要な役割を担っている多機能性サイトカインである。TGF-βの３つのイソ型、TGF-β1、2、および3が、哺乳動物で発現され、現在までインビトロで類似の特性を示す。血小板は、高濃度のTGF-βを含有し、そして、傷害部位での脱顆粒においてTGF-βを周囲の組織に放出する。続いて、TGF-βは、(1)単球、好中球、および線維芽細胞の化学吸引、(2)TGF-β産生の自動誘導、ならびに、インターロイキン１(IL-1)、腫瘍壊死因子、および他のサイトカインを分泌する単球の刺激、(3)脈管形成および細胞増殖の誘導、(4)効力のある免疫抑制剤および過酸化物放出のインヒビターとして作用することによる炎症および細胞毒性の制御、および、(5)細胞外マトリックスの増加した堆積を含む、治療を促進する一連のイベントを開始する。
細胞外マトリックスに対するTGF-βの効果は、その機能的活性の重要な特徴である。Edwardら、EMBO 6:1899(1987)およびLaihoら、J.Biol.Chem. 262:17467(1987)に記載されているように、TGF-βは、フィブロネクチン、コラーゲン、およびプロテオグリカンのような個々のマトリックス成分の合成を刺激し、同時に、プロテアーゼの合成を減少させ、プロテアーゼインヒビターのレベルを増加させることによってマトリックスの分解をブロックする。TGF-βはまた、インテグリンの発現を増加させ、そして、IgnotzおよびMassague、Cell 51:189(1987)に報告されているように、マトリックスへの接着を促進し得るような方法で細胞表面上のインテグリンの相対割合を変化させる。
TGF-βの成熟形態は、それぞれが112アミノ酸の２つの同様の鎖からなる。TGF-βは、種々の病変で見られる細胞外マトリックスの増加した合成の原因である。TGF-βのアミノ酸配列を次に示す：
特定の腎臓病変は、細胞外マトリックス成分の増加した蓄積に特徴がある。例えば、糸球体間質細胞は、腎糸球体を構成する１つの細胞タイプである。正常な糸球体では、糸球体間質細胞は、細胞外マトリックスで囲まれている。高細胞質を伴うまたは伴わない糸球体間質マトリックス量の増加は、糸球体腎炎の多くの形態および糖尿病性ネフロパシーにおける、最も初期の組織学的知見である。培養糸球体間質細胞は、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、トロンボスポンジン、およびコラーゲンI型、III型、IV型、およびV型を含む、数種のマトリックス成分を分泌することが知られている。しかしながら、糸球体間質マトリックスの正確な組成および超分子的構築は、その合成アセンブリおよび分解を制御する因子と同様に知られていない。
糸球体間質マトリックスの組成を制御する因子を研究するために、培養中の糸球体間質細胞を、IL-1、PDGF、腫瘍壊死因子(TNF)、およびTGF-βで処理した。培地の分析は、TGF-βはプロテオグリカンとして同定されるバイオグリカンおよびデコリンの２つの成分の量を増加させることを示した。PDGF、IL-1、およびTNFは、コントロールを越える顕著な効果を示さなかった。
糸球体間質細胞への特定の免疫学的傷害によって、糸球体腎炎を誘起し得る。糸球体細胞障害を伴う動物から単離した糸球体は、バイグリカンおよびデコリンの産生の増加を示す。さらに、培養した腎炎糸球体からの馴化培地は、正常糸球体間質細胞のバイグリカンおよびデコリンの合成を刺激する。
同等の刺激効果を、外因性のTGF-βの添加によって引き起こされ得る。さらに、抗TGF-β抗血清のようなTGF-βの効果をブロックする薬剤は、外因性のTGF-βの刺激効果をブロックする。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、PDGF、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、あるいはそれと機能的に同等なものを含む、このような薬剤を、有害なマトリックスプロテオグリカン合成を特異的に制御または治療するのに用い得る。従って、このような薬剤を、例えば、瘢痕形成のような細胞外マトリックス蓄積に関連するあらゆる状態を防止すること、または、組織をTGF-β活性を抑制する薬剤と接触させることによって組織中の細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする病変を治療することに用い得る。
TGF-βにおけるデコリンの効果を、糸球体腎炎モデルを用いて研究した。デコリンは、TGF-βの本来の調節剤であるようなので、このモデルにおいてインビボで活性であるべきであり、もしそうであるなら、TGF-βの作用に拮抗させて治療的に用いるための理想的な分子である。組換えヒトデコリンおよびウシ組織から精製したデコリンの静脈内投与を用いて、糸球体腎炎のラットの腎臓における、プロテオグリカンがマトリックス蓄積を抑制する能力をテストした。糸球体中に存在するフィブロネクチンの量を用いて、糸球体腎炎における、デコリンのマトリックス堆積をブロックする能力を定量的に評価した。フィブロネクチンは、ラットおよびヒトの正常な糸球体間質マトリックスに豊富に存在するタンパク質であり、そして、ヒトでは糸球体間質増殖性糸球体腎炎に伴って大きく増加する。Courtoyら、J.Cell.Biol. 87:691(1980)、Courtoyら、J.Histochem.Cytochem. 30:874(1982)、Oomuraら、Virchows Archiv.A Pathol.Anat. 415:151(1989)、Border、Kidney Int. 34:419(1988)。マトリックスのマーカーとして染色したフィブロネクチンを用いることにより、ラット糸球体腎炎モデルにおいて７日までに起こる急性マトリックス構築を、デコリンが顕著に防止することが見いだされた。EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンは、TGF-β活性およびマトリックス蓄積に対するより特異的なマーカーを提供した。なぜなら、これらのタンパク質は、正常な成熟ラット腎臓ではほとんど検出できないからであり、そして、それらはTGF-βによって強く誘起されるからである。両方のマーカーとも、腎炎糸球体中で増加し、そして両方ともデコリンの注射によって抑制された。結局、マトリックス構築に対する効果が、事実上治療的であったということが、本明細書中に参照として援用されているGinsbergら、N.Engl.J.Med. 309:1543(1983)に記載されているように、ヒトの糸球体損傷の指標として広く用いられるタンパク尿が平行して減少することによって示された。
急性糸球体間質増殖性糸球体腎炎をもまた、動物モデルにおいて、全体参照として援用されている米国特許出願第07/416,656号に記載の抗胸腺細胞血清ラットに注射することによって誘起した。傷害糸球体は、正常糸球体よりも、TGF-βmRNAを多く発現し、より多くのTGF-βタンパク質を合成し、そしてより多くのフィブロネクチンおよびプロテオグリカンを分泌することが見いだされた。TGF-βの活性を中和し得る抗血清の腎炎ラットへの注射は、糸球体によるマトリックス成分の産生を抑制し、そして糸球体間質マトリックスの構築を防止した。
糖尿病性ネフロパシー（すなわち糖尿病性腎臓病）の進行は、最も頻繁に起こる重度の糖尿病合併症であり、インスリンでの治療にもかかわらず約半分の患者で最終的に起こる。糖尿病性ネフロパシーの顕著な組織学的特徴は、結果として毛細管閉塞および硬化症を伴う、糸球体の糸球体間質領域における細胞外マトリックスの膨張である。糸球体間質マトリックスの膨張は、タンパク尿、高血圧、および腎不全の臨床的徴候と強く相関している。
細胞外マトリックスの蓄積が病的になる、糸球体腎炎と糖尿病ネフロパシーとのマトリックス異常の類似性は、TGF-βが糖尿病性腎臓病に関わっている可能性を示唆した。本発明によって、ストレプトゾトシンの注射によって糖尿病になったラットの糸球体が、TGF-β1mRNAおよびTGF-β1タンパク質の発現の著しい増加を含むことが示される。糸球体はまた、細胞外マトリックスタンパク質の択一的にスプライシングされた形態である、フィブロネクチンおよびテネイシンの堆積の増加を示した。これらの成分は両方とも、TGF-βによって誘導されることが知られている。これらの結果は、TGF-βはまた、糖尿病性ネフロパシーの進行に寄与していることを示している。
本発明に関係する研究において、インスリン欠乏を生じる化学物質であるストレプトゾトシンの投与によって糖尿病になったラットの腎臓を試験した。ストレプトゾトシンモデルは、両方とも本明細書中で参照として援用されている、Velasquezら、FASEB 4:2850(1990)およびMauerら、Diabetes 25:850(1976)に記載されているように、動物が、ヒトの糖尿病性ネフロパシーに似た腎臓病を進行させるので広く用いられている。ラットを、処置を受けていない群、または、実施例IIに記載のように毎日インスリンの注射で血中のグルコースを減少させる処置を受けた群に分けた。正常で年齢のそろった雄ラットをコントロールとして用い、これらも処置を受けない群または糖尿病ラットと同じインスリン養生法で処置された群に分けた。糖尿病におけるTGF-βの発現を評価するために、糖尿病ラットおよびコントロールラットの糸球体中の、TGF-β mRNAおよびTGF-β1タンパク質のレベルを試験した。mRNA分析は、コントロールに比べて糖尿病ラットの糸球体中のTGF-β1 mRNAレベルが上昇していることを示した（図1A）。TGF-β1 mRNAのレベルは、糖尿病の徴候後の時間と共に増加し、表１に示すように、未処置の糖尿病ラットではインスリンを投与されたラットに比較してより高かった。
新しく合成されたTGF-β1を認識すると考えられる抗体を用いた糸球体の染色では、コントロールよりも糖尿病ラットの細胞の方が著しく陽性を示した（図3Aおよび3Bを参照）。TGF-β1陽性細胞は、単球/マクロファージまたはリンパ球のマーカーでは染色されなかったが、糸球体間質および/または上皮細胞に特徴的な染色パターンを示した。
糖尿病ラットの糸球体中に発現するTGF-βは、細胞外マトリックス産生を刺激する活性があるかどうか研究するため、そのような糸球体を、フィブロネクチン（フィブロネクチンEDA+）およびテネイシンの択一的にスプライシングされた形態を検出する抗体で染色した。これらのマトリックス成分は、Borderら、Kidney Int. 37:689(1990)およびNakamuraら、Kidney Int. 41:1213(1992)に記載されるように、TGF-βによって誘導される。マトリックス成分はまた、組織修復部位に現れる。Wangら、J.Biol.Chem. 266:15598(1991)およびPearsonら、EMBO J. 7:2977(1988)。また、フィブロネクチンEDA+およびテネイシンは両方とも、光学顕微鏡検査によると腎臓組織学的に正常である時期である、高血糖症進行後６週間もの早期に糖尿病ラットの糸球体中で顕著に増加し、そして時間と共に蓄積し続けることが見いだされた（図1Aおよび2B）。
NerlichおよびSchleicher、Am J.Pathol. 139:889(1991)に記載されているように、間質性コラーゲンIII型は、糖尿病性ネフロパシーに伴ってヒトの硬化性の糸球体中で見いだされるが、正常なヒトまたはラット糸球体中では見いだされない。III型コラーゲンを、6、15、および40週時の糖尿病ラットの糸球体中に堆積しているのを見いだした。TGF-βを、正常なラットの糸球体間質細胞または上皮細胞の培養物に加えると、TGF-βと結合してその活性を中和し得るプロテオグリカンである、デコリンおよびバイグリカンの産生を誘導することが知られている。ラットデコリンmRNAとは異なるラットバイグリカンは、対応するヒトcDNAプローブと交差ハイブリダイズするので、バイグリカンmRNAレベルをテストした。バイグリカンmRNAレベルの上昇を、図1Bおよび表1に示すように、糖尿病ラットの糸球体において検出した。これらの結果は、TGF-βが積極的にそして特異的に糖尿病ラットの糸球体におけるマトリックス成分の産生を誘導しているということをさらに示す。
表１は、糸球体でのTGF-β1 mRNAおよびバイグリカンmRNAの発現を示す。図１に記載のように、ノーザンブロッティング分析を、各群の動物から単離した糸球体から調製したRNAを用いて行った。３つの時点で、各実験群を、２つの独立した実験を行うために用いる２つの等しい群に分けた。フィルムを、レーザー密度計を用いてスキャンした。定量的比較をするために、TGF-β1およびバイグリカンmRNAと、同じレーン中のコントロールのグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAバンドとの密度比を算出した。続いて、結果を、正常コントロール動物(C)の比を1.0としたときの比の相対変化として表した。値は、２つの実験の平均である。
これらの結果は、糖尿病糸球体中のマトリックスの拡大と傷のような組織損傷後の修復過程との間で類似していることをさらに示す。両方の過程においても、細胞外マトリックスの局所的産生の増加に関連するTGF-β mRNAおよびTGF-βタンパク質の初期の発現がある。TGF-βによって誘導されるマトリックス成分である、フィブロネクチンEDA+およびテネイシンが、傷の治療中および糖尿病糸球体中に優先的に発現される。III型コラーゲンは、正常な糸球体中では見いだされないが、糖尿病糸球体中および治療している傷に現れる。傷の修復の重要な特徴は、過度の瘢痕を避けるために過程を終わらせる必要性である。
糖尿病患者では、腎臓への波及は、Knowles、Kidney Int.Suppl. 1:S2(1974);Dormanら、Diabetes 33:271(1984):およびMauerら、J.Clin.Invest. 74:1143(1984)に記載されているように糖尿病発病の10年から20年後に起こり、糸球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のストレプトゾトシンモデルでは、光学顕微鏡で糸球体異常が見えるようになるには、６カ月またはそれ以上必要であり、ヒトでは20年またはそれ以上に相当する期間が必要である。従って、糖尿病の患者および実験動物における糸球体硬化症は、組織修復過程の調節または終結の慢性的不全を示唆し、おそらくTGF-βの持続した活性を包含している。糖尿病における、組織修復への刺激は、インスリン治療にもかかわらず起こる慢性的な関連性のない高血糖症であるようである。高血糖症は、腎臓での血行力学的変化およびグリコシル化タンパク質の血中レベルの上昇ような、多くの器官特異的および全身的変化を引き起こすことが知られている。
従って、本発明はさらに、糖尿病患者のTGF-βの活性を阻害することによって糖尿病性ネフロパシーを防止する方法に関する。TGF-β活性の阻害は、例えば、糖尿病腎臓組織を、抗TGF-β抗血清、PDGF、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、またはそれと機能的に同等なもののようなTGF-βの効果をブロックする有効量の薬剤と接触させることによって成し遂げられる。
さらに本発明は、有効量のインスリン、および、上述のようなTGF-βの効果をブロックする有効量の薬剤を投与することによって、糖尿病を治療する方法を提供する。
本発明の方法に有用な組成物もまた提供される。このような組成物は、TGF-βの活性を抑制する薬剤を含み、上述の薬剤および担体を含有する。本発明の１つの実施態様では、組成物は薬学的組成物である。薬学的に受容可能な担体には、例えば、ヒアルロン酸および水溶液（重炭酸酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、リンゲル液および所望によって5%デキストロース、またはヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水など）が含まれる。当業者に知られる他の担体もまた考慮される。薬学的組成物はまた、細胞外マトリックスの蓄積に特徴があるかまたは関連する種々の病変の防止または治療に有用な他の薬剤を含有し得る。例えば、糖尿病の場合、薬学的組成物は任意にインスリンを含み得る。
糖尿病ラットで得られた結果とヒト糖尿病性ネフロパシーとの関連を示すために、６症例の糖尿病性糸球体硬化症（糖尿病性ネフロパシーの末期）、３症例の正常コントロール、ならびに３症例の最小の病状変化および３症例の薄基底膜疾患からなる６症例の疾患コントロールを試験した。コントロールの病気は、タンパク尿および/または血尿を引き起こすが、これまでにほとんど糸球体硬化症にならないことが知られている糸球体障害であるため、それらを選んだ。糖尿病性糸球体硬化症の６症例のすべての糸球体が、図５および６に示す２症例のように、TGF-β1およびフィブロネクチンEDA+に対して強く陽性であった。組織の量が限られているため、研究をこれら２つのマーカーに限った。これとは対照的に、正常および病気の各コントロールは陰性またはほんのわずかな染色を示した（図５および６）。
これらの知見は、糖尿病性ネフロパシー中の糸球体マトリックスの膨張と実験的糸球体腎炎との間の類似、および、病気と傷のような組織損傷に続く修復過程との間の連結を確立する。両方とも、細胞外マトリックスの局所的産生の増加に関連するTGF-β mRNAおよびTGF-βタンパク質の早い発現がある。TGF-β、フィブロネクチンEDA+、およびテネイシンによって誘導されるマトリックス成分は、治療している傷、および、この研究で示されるような糖尿病ラット糸球体中で優先的に発現される。傷の修復の重要な特徴は、過度の瘢痕を避けるために、この過程を終結させる必要性である。糖尿病患者の糸球体硬化症の進行は、TGF-βの持続した活性を生じる、組織修復過程の調節または終結の慢性的不全を示唆し、そして、TGF-βの発現が一時的で、そして病気が元に戻り得る糸球体腎炎モデルにおける本発明者らの知見と対照をなす。糖尿病患者では、腎臓への波及は、糖尿病発病の10年またはそれ以上の後に起こり、糸球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のストレプトゾトシンモデルでは、糸球体異常が見えるようになるまでに、数カ月が必要であり、ヒトでは10年またはそれ以上の期間が必要である。
以下の実施例は例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。
実施例 Ｉ
糸球体間質細胞および糸球体上皮細胞によって生成される細胞外マトリックスに対する増殖因子βの特異的効果
Ａ．成長因子および抗体
ブタのTGF-β1を、R&D Systems.Inc.（Minneapolis,MN）から入手した。ヒト血小板由来の成長因子（PDGF）および組換えヒトインターロイキン-1（IL-1）、アルファおよびベータを、Collaborative Research,Inc.（Bedford,MA）から入手した。組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）は、Amgen（Thousand Oaks,CA）から入手した。ヤギ抗ヒトI型コラーゲン抗体、およびヤギ抗ヒトIII型コラーゲン抗体を、Southern Biotechnology Associates,Inc.（Birmingham,AL）から購入した。ウサギ抗マウスフィブロネクチン、およびコラーゲンI型、コラーゲンIII型、コラーゲンIV型、およびコラーゲンVI型、および抗ラットラミニン抗体は、すでに述べている。簡潔に言えば、ウサギポリクローナル抗体を、完全フロントアジュバントに乳化した各精製タンパク質をニュージーランドウサギに皮下注射することにより生成した。最初の免疫感作の3週間後に、不完全フロントアジュバントに乳化した精製タンパク質を連続して１週間ごとに筋肉内注射した。２回目の注射を、耳の動脈からの50mlの血液と共に行った。血液を凝結し、血清を遠心分離によって集めた。ラットに対するモノクローナル抗体Thy-1を、Accurate Chemicals（Westbury,N.Y.）から入手し、そしてヤギ抗ヒト第VIII因子を、Miles Laboratory Inc.（Kankokee,IL）から入手した。
ウサギ抗ラットFx1A抗体を、Edgingtonの方法に従って、Sprague-Dawleyラットの腎臓から調製したFX1Aで免疫感作することによって生成した。簡潔に言えば、ウサギを、超遠心分離によって単離した、腎臓近位尿細管の刷子縁内に富化した調製物によって、上記のように免疫感作した。FITCおよび標識したアルカリホスファターゼ、または抗ウサギIgGおよび抗ヤギIgGを、Cappel（Melvern,PA）から入手した。
Ｂ．細胞培養
糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、６から８週齢のSprague-Dawleyラットから得た、未処理の糸球体の外殖部分(outgrowth)から得た。糸球体間質細胞の単離および培養を、以下のように行った。
雄Sprague/Dawleyラット（100g-140g、単離物につき２匹のラットを使用）を、ケタミン（10mg/ラット100g）およびRompum（0.5mg/ラット）を用いて麻酔し、そしてベタジン（betadine）を用いて滅菌した。腎臓を外科的に露出させ、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて灌流した。次いで、腎臓を取り出し、滅菌し氷冷したPBS中に入れた。
腎臓を２等分し、そして皮質を外科的に除去した。残存組織を外科用メスを用いて１mm3小片に刻んだ。次いで、刻んだ腎臓組織をPBSで連続して洗浄して、一連のふるい（149メッシュおよび105メッシュ）にかけた。次いで、105メッシュのふるいにかけた物質を、74メッシュのふるい上に集めた。これは糸球体画分を表す。
この画分を臨床用遠心分離機で10分間遠心分離し、そしてペレットを20％のウシ胎児血清、0.66単位／mlのインスリン、および抗生物質を含有するRPMI 1640培地（Cell-Gro,Washington,D.C.）中に再懸濁した。糸球体を腎臓２個相当分、T75（75cm2）フラスコ中の12mlの培地中に入れた。糸球体間質細胞を約３週間培養した後接着した糸球体から培養した。新鮮な培地をこの培養期間中、3-4日毎に添加する。
上皮細胞を単離するために、未処理の糸球体をVitrogenTM（Collagen Corporation,Palo Alto,CA）でコートしたフラスコ中に入れた。増殖培地は、20％の加熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone,Logan,UT),50U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.66U/mlのインスリンおよび300mg/mlのL-グルタミンで捕捉したRPMI 1640（Cell-Gro,Washington,D.C.）であった。７日後、外殖細胞を0.025％のトリプシン-0.5MのEDTA（Folw Labs,McLean,VA）で分離した。この物質を30-メッシュスクリーンを通すことにより、糸球体の破片を除去した。間接パンニング技法を用いることにより、非常に富化した上皮細胞集合体を生成した。とりわけ、糸球体を上記のように単離し、そして0.15mg/mlのラットの尾部コラーゲンI型で前もってコートした組織培養皿上にプレートした。皿を室温で１時間コートし、次いでPBSで２回洗浄した。１週間培養後、細胞の外殖部分（主として上皮細胞）および糸球体を、0.05%のトリプシン-0.53mMのEDTAを用いてトリプシン処理を行った。細胞懸濁液を30メッシュを通して、糸球体小片を除去した。残存細胞懸濁液を、Thy 1抗原に対するモノクローナル抗体であらかじめコートした皿上にプレートした。糸球体間質細胞は抗原を発現するが、上皮細胞は抗原を発現せず、従って懸濁液中に残るので、糸球体間質細胞のみがThy 1抗体に結合する。この手順により、糸球体間質細胞を優先して取り出した。プレートを４℃で24時間抗体（約100μg/ml）でコートした。細胞を抗Thy 1抗体でコートした皿上で、37℃で１時間インキュベートした。結合していない細胞を集めて、再びプレートした。糸球体間質細胞を、マウス抗Thy-1抗体で４℃で12時間前もってコートした、60×15mmのポリスチレンプレートに添加した。接着していない細胞を取り出し、そしてラミニン（Collaborative Research, Bedford, MA)で前もってコートした6-ウェルプレートに入れた。
糸球体上皮細胞を、以下により同定した：１）特性ポリゴナル形態学；２）FX1A（Heymann抗原）に対する抗体での均一染色；３）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感度；４）抗Thy-1あるいは抗第VIII因子抗体で染色されないこと。近位尿細管細胞による糸球体上皮細胞の汚染を、アルカリホスファターゼ染色により検査し、そして２％未満の細胞がアルカリホスファターゼ陽性であった。それに対して、糸球体間質細胞を以下により同定した：１）典型的星状外観；２）抗Thy-1抗体での均一染色；３）抗FX1A、または抗第VIII因子抗体で染色されないこと；および４）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感度がないこと。
Ｃ．生合成放射標識
通常のプレート、またはラミニンでコートした６ウェルの多ウェルプレートに、糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、１ウェル当り５×105個の細胞の濃度で添加し、そして無血清RPMI 1640培地中で24時間培養して、細胞増殖を停止した。接着していない細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄することにより、除去した。血清および抗生物質を含有していないRPMI 1640を35Ｓ硫酸塩標識の低硫酸塩培地として、および35Ｓメチオニン標識のメチオニン（Flow Labs,McLean,VA）を含有しないRPMI 1640として添加した。増殖因子を48時間、以下の濃度で、培地に添加した：TGF-β(25ng/ml)、PDGF(2U/ml)、IL-1α(5U/ml)、IL-1β(5U/ml)およびTNF(500U/ml)。本実験終了18時間前に、タンパク質を標識するために35Ｓメチオニン（100μCi/ml)を、またはプロテオグリカンを標識するために35Ｓ硫酸塩（200μCi/ml）を、培養物に添加した。
アイソトープをNew England Nuclear(Boston, MA)から購入した。馴化培地、および細胞層を、上記のように採取し、処理した。細胞増殖を、3Ｈ-チミジンの取り込みにより試験した。ラミニンでコートした12ウェルのプレートに、２×１０5／ウェルの濃度で、細胞を添加した。24時間後、無血清培地内で、10μCi/mlの3Ｈ-チミジン溶液25μlを、それぞれのウェルに添加した。24時間インキュベーションを行った。培養培地を捨て、細胞層を５％のTCA溶液で２回洗浄し、そして６ＮのHCl溶液700μlで15分間インキュベートした。3Ｈ-チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンター（Beckman, Irvine, CA）中のそれぞれの細胞層をカウントすることにより測定し、そしてBCAタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）によって測定した、それぞれの細胞層のタンパク質含量を用いて、較正した。
Ｄ．マトリックス分子の固定
マトリックス糖タンパク質を免疫沈降によって同定し、そしてプロテオグリカンを酵素での消化によって同定した。抗血清100μlを、馴化培地500μlに、または増殖因子を添加した、あるいはしなかった重複ウェルから収集した細胞抽出液300μlに添加することにより、免疫沈降を行った。重複ウェル中で、細胞を分離し、そして細胞数の均一性を確認するためにカウントした。予め免疫を有する血清を、並行したコントロール実験において用いた。試料をウシ血清アルブミン（BSA）で前もってコートした４mlのコニカルチューブ内で混合しながら、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡセファロースビーズ（Sigma, St.Louis, MO）を22℃で60分間、新鮮なRPMIと前もってインキュベートした。抗原-抗体複合体を沈降するために、懸濁したプロテインＡセファロース50μlを、試料に添加し、そして４℃で120分間混合した。試料を2000×Ｇで10分間、遠心分離し、そして上澄み液を除去した。ペレットを、0.5M NaCl、0.1％ Triton X-100(pH7.4)を含有する、氷冷したPBS １mlで10回洗浄した。最終的に、ペレットを氷冷したPBSで洗浄し、新しいチューブに移し、再度遠心分離し、そして３回PBSで洗浄した。ペレットを、３％のSDS、および10％のβメルカプトエタノール（Sigma, St.Louis, MO）を含有するSDS-PAGE試料用緩衝液40μl中に溶解し、５分間煮沸した。
グリコサミノグリカン分解酵素での消化を、TGF-βによって調節したプロテオグリカンの型を決定するために用いた。生合成標識を行った後、馴化培地上で消化を行った。培地のアリコート25μlを、コンドロイチナーゼABCまたはコンドロイチナーゼACの100ミリ単位(両者は100mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM酢酸カルシウム、2mg/ml BSA中)あるいはヘパリナーゼII 100ミリ単位(50mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM塩化カルシウム、5mM酢酸カルシウム中)と混合した。全ての試料に、１mM PMSF、５mMベンズアミジン、100μg/mlダイズトリプシンインヒビター、10μg/mlロイペプチン、および10μg/mlアンチパインも、添加した。全ての物質は、Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO)より入手した。コンドロイチナーゼを含有する混合物を、37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベーション終了後に、試料をSDS-PAGEのために調製した。
大きなプロテオグリカンを、ゲル濾過によって特徴付けした。セファロースCL-6Bカラムからの、35Ｓ硫酸塩で標識した画分を、蒸留水で透析し、凍結乾燥した。試料を、上記のプロテアーゼインヒビターを含有する、0.1M酢酸ナトリウム、0.1M tris(pH7.3)２mlに溶解した。次いで、コンドロイチナーゼABC溶液（1.25単位／ml）0.2mlを、試料1.8mlに添加し、37℃で24時間消化を行った。次いで、試料をCL-6Bカラム上で分画し、蒸留水で透析し、凍結乾燥し、そして低pH(1.0)条件下で亜硝酸で処理した。亜硝酸処理後、試料をCL-6Bカラム上で再度クロマトグラフィーを行った。
TGF-βによって誘導される、プロテオグリカン生成の増加を定量するために、馴化培地３mlをセファロースCL-6Bカラム（1.3×100cm）にのせた。カラムを、４M尿素、0.15M NaCl、50mM Tris HCl(pH7.2)、0.1％(v/V)Triton X-100で、流速20ml/時間で溶出し、そして３ml/チューブの画分を収集した。それぞれの溶出画分の放射活性を、Beckman LS 2800液体シンチレーションカウンターによって測定した。
Ｅ．電気泳動法
試料を、以下の実施例IIに記載のように、フルオログラフィー、およびデンシトメトリーによるSDS-PAGEによって、分析した。
Ｆ．結果
前述の研究結果によって、TGF-βは、上皮細胞によるバイグリカン、フィブロネクチン、およびIV型コラーゲンの生成を調節する一方、培養した糸球体間質細胞により生成するプロテオグリカンに、TGF-βのみが作用する、ということが示される。従って、TGF-βによって調節された上皮細胞による、マトリックス生成の生合成プロフィルは、糸球体間質細胞による場合と異なる。より具体的には、これらの結果から、糸球体中のTGF-βが放出されることによって糸球体間質マトリックスが、蓄積し、そして糸球体底膜を形成する、マトリックス分子の生成において増加することが、証明される。この結果を表２に要約する。
実施例 II
Ａ．ラットにおける糖尿病の誘導
Velasquezら、FASEB 4:2850(1990)、およびMauerら、Diabetes 25:850(1976)(これらは共に本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、6.5mg/体重100gで、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシン（Sigma Chemical Co.,St.Louis, MO)を単回静脈内注射することにより、150グラムの体重の雄Sprague-Dawleyラットに糖尿病を誘導した。血中のグルコースレベルが＞300mg/dLである48匹の糖尿病ラットを、２つの群に分けた。第１の糖尿病の群（Ｄ）には、治療を施さず、第２の群（DI）には、毎日3.5UのNPHインスリン（Eli Lilly, Indianapolis, IN）を皮下注射することにより治療した。48匹の成熟した雄ラットを、コントロールとして用い、そしてインスリンを与えない群（Ｃ）に分割するか、または糖尿病ラットと同様にインスリン摂取により治療した（CI）。
それぞれの群の血中グルコースレベルを、10週間後、一晩絶食させた後の、8:00 a.m.に測定し、そしてmg/dLでの値を表３に報告する。値は、平均±標準偏差である。
1、6、15および40週間後、それぞれの群の６匹のラットを、腎臓を切除するために、10mg/体重100gの１M塩酸ケタミン、および0.5mg/体重100gのキシラジン（xylazine）で麻酔した。インスリンを投与しない糖尿病ラット（Ｄ）は、37週間以降生存せず、従って40週間目の分析は欠けている。全ての技法の間中、腎臓はインサイチュで、冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4で灌流し、次いで切除した。皮質の小片を、免疫学的試験のために取り出し、そして、Okudaら、J. Clin. Invest. 86:453(1990)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、糸球体をmRNA検出のために、残存組織から単離した。マトリックス成分を免疫蛍光法で数えた群とTGF-β1陽性細胞との差異を、ｔ試験によって分析した。
Ｂ．全RNAの調製および検出
１％2-メルカプトエタノールおよび0.5％ラウリルサルコシルを含む、グアニジンイソチオシアネート（GITC）溶液（4M GITC: 0.5％w/v N-イソリルサルコシン、0.1％消泡剤Ａ、0.1M β-メルカプトエタノール、25mM Tris-HCl(pH7.0))3-4ml中の単離糸球体（8-9×104個の細胞）を溶解することにより、全RNAを調製した。溶解物を、塩化セシウムの密度グラジエントクッションで、150,000×gで超遠心分離した。遠心分離後、チューブの底の層からRNAを回収した。40μgのRNAを、それぞれの時点の群毎にプールし、そして2.2Mホルムアルデヒドおよび0.2M MOPS（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）pH7.0を含む、１％アガロースゲルで電気泳動し、そして0.2ミクロンのナイロンメンブレン(ICN Radiochemicals, Inc., Irvine, CA)に、キャピラリーブロッティングにより一晩トランスファーする。
RNA（40μg）相当量を、260nmでの吸光度に基づいてロードした。メンブレンを、５×SSC（１リットルの最終量に対して、20×SSC：175.3g NaCl、88.2gクエン酸ナトリウム、10N NaOHでpH7.0にする）、５×デンハート溶液（50×溶液：5gフィコール、5gポリビニルピロリドン、5g BSA、H2(0〜500ml)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)、0.1％SDS、250μg/mlの音波処理による変性サケ精子DNA(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)、および50％ホルムアミド）中で、37℃で５時間プレハイブリダイズした。
マウスcDNAを得るために、マウスTGF-β1 cDNAからのHinc IIで消化したpBluescript SKII+(Stratagene, La Jolla, CA)に、280bpのPvu IIフラグメントをサブクローン化した。このマウスTGF-β1 cDNAは、Dr. R. Derynckから得、そして、Derynckら、J. Biol. Chem. 261:4377(1986)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載されている。成熟TGF-β1の298-390位のアミノ酸をコードする、挿入物の位置付けを決定し、そして、プラスミドを、塩化セシウムの濃度遠心分離により精製した。この濃度遠心分離は、Kondaiahら、J. Biol. Chem. 263:18313(1988)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように行われた。
マウスcDNAプローブ、ラットGAPDH cDNAプローブ（これはDr. M. B. Sporn, National Institute of Health (NIH)より得た)、およびヒトバイグリカンcDNAプローブ(プラスミドp16)(これはDr. L. W. Fisher, NIHより得た)を、ランダムプライマー法(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)により32P-CTP（シトシン三リン酸）で標識し、そして42℃で一晩ハイブリダイズした。メンブレンを、２×SSC、0.1％SDSで、室温で５分間ずつ、３回洗浄し、そして0.1×SSC、0.1％SDSで、50℃で15分間ずつ３回洗浄した。標準法によりオートラジオグラフィーを行った。フィルムをレーザーデンシトメーター（LKB, Bromma, Sweden）を用いてスキャンした。定量的な比較のために、同じゲルレーン中のGAPDH mRNAバンドの濃度に対するTGF-β1およびバイグリカンmRNAバンドの濃度の比を算出した。次いで、正常のコントロール動物（Ｃ）の比が、1.0であった場合も、比の相関的な変化として、結果を表した。
この分析結果を図１に示し、そして表１に要約する。GAPDH mRNAのレベルに対する比によって標準を決めた場合、インスリンで治療をしなかった糖尿病ラット内に、TGF-β1 mRNAが3.4倍増加して、そして、バイグリカンmRNAが2.3倍増加する。インスリンで治療した糖尿病ラットは、TGF-β1およびテネイシンmRNAの増加がいっそう少ないことを示した。
Ｃ．糖尿病糸球体中におけるTGF-βの検出
糸球体組織を、液体窒素中で素早く凍結し、アセトン中で固定し、そして成熟TGF-β1の最初の30個のアミノ酸に対応する合成ペプチドに対して製造した抗体（50μg/ml）で、４μmの断片を染色した。この抗体(抗LC)(Drs. K. C. FlandersおよびM. B. Sporn, National Institutes of Healthから供与)で、細胞内TGF-β1を染色する。抗LC抗体は、Flandersら、Biochem. 27:739（1988）中に公表されており、その教示内容は本明細書中に参考として援用されている。ウサギIgGまたは、またはリサミンローダミンロバF(ab')2抗ウサギIgG(Jackson Immunology Lab, West Grove, PA）に対するフルオレセインイソチオシアネート複合抗血清（×500）を、1:300の希釈で、２次抗体として用いた。
TGF-β1陽性細胞を、フルオレセインおよびローダミン複合２次抗体を用いた、２重染色免疫蛍光技法によって同定した。この場合２次抗体は、ED1（単核細胞／マイクロファージ）、OX19（リンパ球）、およびビメンチン、デスミン、およびα−平滑筋アクチン（Jackson Immunoresearch Lab）に対するモノクローナル抗体を用いて１次染色されていた。コントロール群、および糖尿病群の６匹の動物それぞれから調製したコード部分で、不規則に選択した20個の糸球体中のTGF-β1陽性細胞の数を、カウントした。
インスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体(糖尿病を誘導してから15週間後）を染色することにより、TGF-β1陽性細胞数の著しい増加が示された。糖尿病の糸球体では、コントロールラットからの糸球体と比較して、糸球体１個当りに著しく陽性な細胞があり、それは*32±２対25±１（値は、平均±標準偏差、*ｐ＜0.001）である。
Ｄ．糖尿病ラットの糸球体中のフィブロネクチンEDA+およびテネイシン沈澱物の定量
免疫蛍光法のための組織を、上記のように調製した。ヒトフィブロネクチンEDA+に対して調製した、マウスモノクローナル抗体は、Dr. L. Zardi, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italyより提供され、そしてBalzaら、FEBS Letters 228:42(1988)、およびSekiguichiら、J. Biol. Chem. 260:5104-5114(1985)に記載されている。これらの開示内容は、共に本明細書中に参考として援用されている。ウサギ抗ヒトテネイシンを、Telios Pharmaceuticals Inc.(La Jolla, CA)より得た。Bourdonら、Cancer Res. 43:2796-2805(1983)(これらは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、テネイシンを、ヒト神経膠芽細胞腫U251細胞から単離した。フルオレセインイソチオシアネート抗ウサギIgGおよびラットF(ab')2抗マウスIgG（これらは共にJackson Immunology Lab, West Grove, PAから得られた）を、２次抗体として用いた。
テネイシンに対する免疫蛍光法（IF）染色において、４μmの組織断片を、4-5分間アセトンに浸した。乾燥せずに、固定化断片を、室温で約10分間PBS(pH7.4)に浸した。次いで、スライド上に水の小滴がほんの少しだけ残っている状態まで、約５分間送風機を用いて、断片を緩やかに乾燥した。ウサギポリクローナル抗ヒトテネイシン抗体（Telios Pharmaceuticals, La Jolla, CA）を、0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで、1:15から1:20までに希釈した。PBS溶液約10μlから15μlを、組織に添加し、そしてその後、湿った容器中で37℃で約45分間インキュベートした。次いで、直接その部分にPBSをかけるのではなく、スライドを傾けて、PBSを緩やかに流すようにして、PBS洗浄する。次いで、断片を振とうしながら室温で５分間ずつ３回PBSに浸した。次いで、断片を送風機を用いて乾燥した。0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで、1:400に希釈した、FITC結合アフィニティー精製ロバf(ab')2抗ウサギIgG（Jackson Immuno. Lab, 711-096-132, #14620）を、スライドに添加した。上記のように、スライドをPBSで３回洗浄した。Bartels緩衝化グリセロール封入剤FA（Baxter Laboratories）を用いて、カバーガラスで組織を固定した。
上記手順に続き、フィブロネクチンEDA+のIF染色を行った。適切なマウスモノクローナル抗体抗ヒトフィブロネクチンEDAを、１次抗体として用い、そしてFITC結合アフィニティー精製F(ab')2ラット抗マウスIgG（Jackson Immunoresearch Lab. #16381）を0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで1:30に希釈したものを、２次抗体として用いた。
定量アッセイ結果を図２に示す。それぞれの実験群の６匹の動物から調製したコード部分から、不規則に選択した20個の糸球体中の０から４の尺度（０＝染色されず、４＝最大に強く染色された）を用いて免疫蛍光法染色を数えた。それぞれの時点で、糖尿病動物中に２種のマトリックス成分の堆積物が、著しく増加する。
抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色された糸球体の免疫蛍光クロマトグラフによるコントロール糸球体および糖尿病糸球体におけるフィブロネクチンEDA+の蓄積物の検出において、40週間インスリンで治療した、正常のコントロールラットの糸球体は、ほのかに染色されることを示したが、一方、40週間インスリンで治療した、糖尿病のラットからの糸球体は、染色が目だって増強することを示す。
実施例 III
ARG-GLY-ASP含有ペプチドでのプロテオグリカン合成の阻害
Harperら、Kidney International 26:875(1984)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)の方法に従って、４から６週齢のSprague-Dawleyラットの未処理の糸球体から、糸球体間質細胞を得た。使用した増殖培地は、20％の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone, Logan, UT)、50U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.66U/mlインスリン、および300mg/ml Ｌ−グルタミンで補足したRPMI 1640(Cell-Gro, Washington,D.C.)であった。15日から20日の間で、0.025％トリプシン−0.5mM EDTA溶液（Flow Labs,McLean, VA）で、１次培養物を分離し、そして２×106個の細胞をフラスコに加えた。細胞は７日毎に継代が代わり、そして全ての実験を３継代目と７継代目との間の細胞に対して行った。
ラットの糸球体間質細胞は6-ウェルのマルチプレート中で、準集密(subconfluency)まで成長した。培養物を24時間無血清にして、そして、0.3、0.1、0.03、0.01、または0.003mg/mlでのGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（GRGDSP）、または、0.3mg/mlでのGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro（GRGESP）と共にTGF-β1を25ng/mlで添加した。PierschbacherおよびRuoslahti, J. Biol. Chem., 292:1794-1798(1987)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、製造業者のプロトコルに従って、Applied Biosystems Peptide Synthesizerでペプチドを合成した。30時間後、培養物を35Ｓ硫酸塩で代謝的に標識し、そして18時間後、馴化培地をSDS-PAGEおよび蛍光光度法によって分析した。フルオログラムをレーザーデンシトメーターでスキャンした。以下のものは、プロテオグリカンバンドの相対的な比重単位を表す。
これらのデータは、GRGDSPのより多い用量の用量反応効果により、コントロールペプチドGRGESPの効果無しでのTGF-β1-誘導プロテオグリカン生成が阻害されることを示す。
実施例 IV
腎臓生検材料からの腎臓組織、または、University of Utah Medical Centerの糖尿病患者、または外科手術を行った患者から得た腎摘出試料を研究した。分析は、糖尿病性の腎症の６つの症例、最小の病状変化の３つの症例、薄い基底膜疾患の３つの症例、および正常な腎臓３つを包含していた。４つまたはそれ以上の糸球体が、それぞれの試料には存在し、そして従来の臨床的尺度および病理学的尺度を用いて、最新の研究には加わっていない医師によって、それぞれの症例の診断法が確立された。実験モデルについて実施例IIに記載のように免疫蛍光法顕微鏡検査によって、凍結組織をTGF-β1タンパク質およびフィブロネクチンEDA+の存在について研究した。ヒトおよび動物の研究は、Institutional Review Board of the University of Utah School of Medicineによって承認された。
糖尿病性の糸球体硬化症の６つの症例を示す糸球体の全てが、図５および６に示した２つの症例と同様に、TGF-β1およびフィブロネクチンEDA+に対して強い陽性を示した。組織の定量限界のために、研究をこれら２つのマーカーに限った。それに対して、正常および疾患コントロールの糸球体はそれぞれ、陰性またはほんの微量な染色を示しただけであった（図５および６）。
実施例 Ｖ
組換え体のヒトデコリンによるＴＧＦ−Ｂ１、２、および３の活性の中和
Ａ． 試薬
精製したヒトTGF-β１および２は、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得られ、そしてTGF-β３は、National Institutes of HealthのDrs. A. RobertsおよびM. Spornから供与された。
Yamaguchiら、(前出)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、チャイニーズハムスターの卵巣細胞系クローン62の培養培地から、組換え体ヒトデコリンを調製した。デコリンを、Q-セファロース上でのイオン交換と、オクチル-セファロース上での疎水クロマトグラフィーとを組み合わせた、改変した手順によって精製した。この手順は、Choiら、J. Biol. Chem. 264:2876(1989)に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。オクチル-セファロースカラムから4M塩酸グアニジンによって溶出した後、調製物をPBS(pH7.4)で透析し、そしてデコリン濃度を１ml当り0.9mgに調整した。
卵白アルブミンおよびウシ血清アルブミンを、Sigma(St. Louis, MO)から得、そしてデコリン精製に使用した条件と同じ条件下で調製した。
Ｂ．細胞培養
増殖阻害を測定するミンク肺細胞のアッセイを、イソ型のTGF-βの活性を中和する組換えデコリンの効力をアッセイするのに使用した。[3Ｈ]チミジンの取り込みをYamaguchiら、（前出）に記載のように、TGF-βの存在、およびデコリン（○）またはウシ血清アルブミン(BSA)(●)の濃度の増加で決定した。TGF-βを、[3Ｈ]チミジンの取り込みを50％阻害する濃度で添加した；これらの濃度は、TGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3に対して、それぞれ0.2ng/ml、0.1 ng/mlおよび0.05ng/mlであった。図７に示したデータは、TGF-β1で誘導された増殖阻害を中和したパーセントを表す。[3Ｈ]チミジンの取り込みが、TGF-βおよびデコリンのどちらにも無い場合を100％と定義する（TGF-β1およびTGF-β3については125,000cpm; TGF-β2については107,000cpm）。TGF-βには取り込みが存在するが、デコリンには存在しない場合を、０％と定義する（TGF-β1については57,000cpm; TGF-β2については78,000cpm; TGF-β3については59,000cpm）。それぞれの点は、二連の試料からの結果の平均を表す。
図７に示したように、デコリンは３種のTGF-βのそれぞれの増殖阻害活性を中和した。
Borderら、Nature 346:371(1990)に記載のように、上記で糸球体腎炎を回復させるのに用いた抗TGF-β1血清もまた、試験した。この抗血清は、TGF-β1を中和したが、TGF-β2もTGF-β3も中和しなかった（データは示さず）。従って、デコリンは、抗TGF-β1よりも、TGF-βに対する広い結合反応活性を有する。
実施例 VI
組換えヒトデコリンの静脈内投与
組換えヒトデコリン、およびウシの組織から精製したデコリンの静脈内投与を、糸球体腎炎のラットの腎臓中にマトリックスが蓄積するのを抑制する、プロテオグリカンの能力を検査するのに用いた。糸球体中に存在するフィブロネクティン量を、糸球体腎炎でのマトリックスの蓄積をブロックするデコリンの能力を評価するために、定量的に用いた。
Ａ．プロトコル
Okuda,ら、(前出)に記載のように、抗胸腺細胞血清を静脈内注射することによって、糸球体腎炎をSprague-Dawleyラット(４−６週齢)に誘起した。同齢のラットを正常コントロールとして使用した。組換えヒトデコリン(これは、実施例Ｖ．Ａ．に記載のように調製された)およびウシデコリンを、以下のプロトコルに従った同定実験以外は、別々に試験した。
８匹のラットを、それぞれ２匹ずつ４つの群に分け、そして抗胸腺細胞血清を注射した。１時間後、PBS 0.5ml中の組換えヒトデコリンまたはウシデコリン0.45mgを、あるいはコントロールとして0.5mlのPBSだけを、１回静脈内注射することにより、治療を開始した（注射するためにラットを押さえつけたが、麻酔はしなかった）。関節の軟骨から、4M塩酸グアニジンおよびプロテアーゼインヒビターで24時間抽出することにより、ウシデコリンを単離した。次いで、実施例Ｖ．Ａ．に記載のように精製した。以下のようにデコリンまたはPBSを１日１回注射することで治療を続けた：デコリンを第１群には２日間、第２群には４日間、第３群には６日間投与した。第４群にはPBSのみを６日間投与した。第１群および第２群においてデコリン投与を中止したとき、PBSを代わりに投与して、全ての動物に６日間注射を行った。７日目に全ての治療を中止し、24時間尿を採取し、その後動物を殺して腎臓を取り出した。
上記プロトコールに従って、以下に示すコントロール調製物を試験した：８匹のラットに抗胸腺細胞血清を注射し、それぞれ２匹ずつの群に分け、そして0.5mlのPBSのみ、またはアグレカン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミンを含むPBSを、１日１回６日間注射した。アグレカンおよびデコリンの炭水化物含量を決定し、そしてPBS中のアグレカンを、デコリンと同様の炭水化物濃度で注射した。別の４匹のラットには、抗胸腺細胞血清の代わりにPBSを１回注射し、正常なコントロールとして使用した。全ての動物を、上記のように24時間尿を採取した後に殺し、そして尿タンパク質およびクレアチニンを、Okudaら(前出)に記載のように測定した。
全ての技法を行うために、腎臓をインサイチュで冷PBSで灌流し、次いで切除した。腎臓組織を、Okudaら(前出)(これは、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、光および免疫蛍光顕微鏡検査のために調製した。
Ｂ．フィブロネクチン染色
フルオレセインイソチオシアネート結合ヒツジ抗ヒトフィブロネクチンは、Binding Site, Inc. (San Diego, CA)からのものであった。フィブロネクチンに対する免疫蛍光染色を、それぞれの動物から調製したコード部分で不規則に選択した20個の糸球体において、０から４までの尺度（０＝染色されず、４＝最大に濃く染色された）を用いて、組織起源を認識せずに数えた。群の間の相違を、Okudaら(前出)に記載のt試験によって分析した。
Ｃ．EDA+およびテネイシン染色
糸球体を、EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンを検出する抗体で染色した；これらのマトリックス成分はTGF-βによって比較的特異的に誘導される。特別のドメインＡ(EDA+)を含有するヒトフィブロネクチンに対して調製されたマウスモノクローナル抗体は、Dr. L. Zardi, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italyより提供された。ウサギ抗ヒトテネイシンを、Telios Pharmaceuticals, Inc.(La Jolla, CA)から得た。フルオレセインイソチオシアネートで結合のラットF(ab')2抗マウスIgGおよびロバF(ab')2抗ウサギIgGを、２次抗体（Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, PA）として用いた。マトリックスを数える技法、およびEDA+フィブロネクチンおよびテネイシン染色に対する統計学的分析方法は、上記のフィブロネクチンに対するものと同じである。
Ｄ．結果
図８は、組換えデコリン、またはウシデコリンを４日間あるいは６日間毎日注射することで、フィブロネクチンの蓄積が、正常のラットに見いだされるレベルと大きく違わないレベルにまで抑制されることを示す。コントロール注射物は、緩衝液だけ、異なるプロテオグリカン、および２種のタンパク質から成る。軟骨のプロテオグリカン、アグレガンを、デコリンのグリコサミノグリカン鎖をコントロールする負に帯電した分子として用いた；アグレガンは、Yamaguchiら(前出)に記載のように、TGF-βを阻害しない。卵白アルブミンを、デコリンのコアタンパク質に対するコントロールとして用いた。なぜなら、これらのタンパク質の両者は、ほとんど同じ分子サイズだからである。血清アルブミンを、無関係なタンパク質コントロールとして用いた。図８は、プロテオグリカンおよびタンパク質コントロールが、緩衝液のみを注射した糸球体腎炎ラットとは、区別され得ないことを示す。疾患の早期にデコリンを２回注射することも、フィブロネクチンの蓄積には、何ら効果が無かった。
図９に定量的に示したように、EDA+フィブロネクチンは、正常なラットの糸球体に痕跡量存在するのみであり、テネイシンに対しても、同様の検出物が得られた。結果は、EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンの両者が、デコリンを全く注射しない、または２回注射して治療した、ラットの腎炎の糸球体中で、非常に増加したことを示す。しかし、フィブロネクチン全体の場合のように、デコリンを４回または６回注射することにより、TGF-β活性のこれら２つのマーカーの堆積が、非常に減少した（図９）。過ヨウ素酸−シッフで染色した、同じ腎臓の断片の組織学的分析により、疾患中に生じる糸球体中の細胞外マトリックスおよび関連する糸球体腫脹の増加を防止するデコリンに匹敵する効果が示された。
４日間または６日間デコリンを投与することもまた、タンパク尿の進行を抑制した。尿タンパク質濃度と尿のクリアチニン濃度との比を、タンパク尿を評価するのに用いた。なぜなら、この方法はGinsbergら(前出)に記載のように、タンパク質排出量に関する尿量の差の影響を、最小にするからである。正常ラット、疾患コントロールラット、低用量デコリン(２回注射)で治療したラット、および高用量デコリン(４回および６回注射)で治療したラットに対する平均値はそれぞれ、0.7、15.2、14.8、および2.4であった（疾患コントロールに比較した高用量に対して、ｐ＜0.01である）。
これらの結果は、デコリンが、腎炎ラットからの傷ついた糸球体中に、細胞外マトリックスが堆積することを防止するのに、著しい効果をあげることを示す。糸球体腎炎において細胞外マトリックスが蓄積することは、TGF-βの過剰生成が原因であることが、以前に示されている（Okudaら(前出)Borderら、(1990)(前出)）。このモデルにおけるマトリックスの蓄積を、デコリンの注射により防止したことは、TGF-βを抑制するデコリンのインビボにおける活性を証明する。
本発明を、種々の実施態様に関して記載してきたが、本発明の主旨から逸脱することなく種々の改変を施すのは可能である、ということを理解すべきである。従って、本発明は、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。
本発明は、一般に増殖因子に関し、特に過剰な細胞外マトリックスの生産におけるトランスフォーミング増殖因子βの影響に関する。
種々の病変は、細胞外マトリックス物質の有害な蓄積に特徴がある。例えば、進行性の糸球体の病気において、細胞外マトリックスが、糸球体間質中に、または糸球体基底膜に沿って蓄積し、その結果、末期の病気および尿毒症を引き起こす。同様に、成人または急性呼吸促進症候群(ARDS)は、肺でのマトリックス物質の蓄積をも含み、一方、肝硬変は、肝臓中の瘢痕によって証明される有毒なマトリックスの蓄積に特徴がある。
糖尿病は、現在、進行性の腎不全が最も一般的な原因であり、これも細胞外マトリックス成分の有害な蓄積によって特徴がある状態になる。インスリンの導入は、糖尿病の治療を革新し、劇的に患者の生存期間を長くした。しかしながら、インスリンは糖尿病性ネフロパシーのような重度の合併症には効果がなかった。血液中のグルコースの厳密なコントロール、高血圧の治療、および飲食物のタンパク質の制限は、腎臓機能が消失する速度を遅らせ得るが、末期段階の病気へ着実に進行する。
糖尿病性ネフロパシーの中心となる病理学的特徴は、糸球体中の細胞外マトリックスの蓄積である。細胞外マトリックスの蓄積の原因となる糖尿病環境における因子は、十分に理解されていない。
細胞外マトリックスは、プロテオグリカン、糖タンパク質、およびコラーゲンの混合物で、集合した複雑な超構造を形成する。様々な免疫学的な、血液力学的な、および毒性の因子が、実験的に糸球体病を誘起するために用いられたが、これらの因子のどれもが、細胞外マトリックス成分の合成または分解に直接的な影響を示さなかった。それ故、急性の細胞傷害と糸球体の細胞外マトリックスの構築との間には、別の介在過程があるようである。
従って、腎臓病のような病理学的段階におけるマトリックス成分の有害な蓄積を調節する因子を決定する必要がある。さらに、不適切なマトリックスの蓄積を含む病理学的状態を防止、制限、または治療するための因子を制御する必要がある。本発明は、これらの必要性を満足し、さらに、関連する有利点も提供する。
発明の要旨
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)の活性を抑制する薬剤と組織を接触させることによって、組織中に細胞外マトリックス成分の蓄積を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は、また同化を促進し、繊維症および脈管形成を誘導するペプチド増殖因子である、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)の活性を抑制する薬剤を提供することによって、細胞外マトリックス成分の蓄積に特徴がある病変の進行を防止または治療する方法を提供する。薬剤は、例えば、抗TGF-β抗体、血小板由来の成長因子(PDGF)、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、またはバイグリカン(biglycan)のような機能的に等しいものであり得る。治療され得る病変には、糸球体腎炎、ARDS、肝硬変、線維症性ガン、肺の線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症、血管形成後再狭窄、腎臓間質性線維症、瘢痕および、糖尿病性ネフロパシーのような糖尿病関連病変を含む、様々な線維症性の病気が含まれる。
本発明は、さらに、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織病変、特に糖尿病性ネフロパシーの存在を検出する方法に関する。この方法は、組織中のTGF-βのレベルを測定し、次いでこのレベルを正常細胞中のTGF-βのレベルと比較することによって、行われる。
本発明は、さらに、インスリンおよびTGF-βの活性を抑制する薬剤を投与することによって糖尿病を治療する方法を提供する。また、そのような薬剤を含む、本発明の方法に有用な組成物も提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、mRNAのノーザンブロッティングの結果を示す。このmRNAは、ラットの糸球体から単離され、(Ａ) TGF-β1、(Ｂ)バイグリカン、および(Ｃ)グリセルアルデヒド-3-デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(これはラット糸球体中で本質的に発現した酵素)に対するcDNAプローブとハイブリダイズされた。コントロールラット(Ｃ)、インスリンで治療したコントロールラット(ＣＩ)、糖尿病ラット(Ｄ)、および糖尿病を誘起してから15週間後にインスリンで治療した糖尿病ラット(ＤＩ)から単離した糸球体から調製した。分子量マーカーを左側に示す。
図２は、コントロールラットおよび糖尿病ラットの糸球体中に、フィブロネクチン、フィブロネクチンEDA+(図2A)、およびテネイシン(図2B)の交互に結合した形の定量を示す。＊印は、同じ時点における正常コントロール(Ｃ)と比較した、糖尿病ラット(Ｄ)、およびインスリンで治療した糖尿病ラット(DI)について、ｐ＜0.01を示す。インスリンで治療した正常コントロールラット(CI)を比較のために含む。インスリンで治療しなかった糖尿病動物は、37週間以降は生存しなかった。従って、40週間目のデータは無い。値は平均±標準偏差である。
図３は、抗TGF-β1抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)正常コントロールラットの糸球体の染色。(Ｂ)糖尿病を誘導した15週間後にインスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体の染色は、TGF-β1に対して陽性の細胞数の著しい増加を示す。陽性の細胞を糸球体の糸球体間質および上皮細胞として同定した。糖尿病の糸球体では、コントロールラットからの糸球体と比較して、糸球体１個当りに著しく陽性の細胞があり、それは*32±１対25±１（値は、平均±標準偏差、*ｐ＜0.01）であった。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図４は、抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色した糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)40週間インスリンで治療した、正常コントロールラットの糸球体が、かすかに染色されたことを示す。(Ｂ)40週間インスリンで治療した、糖尿病のラットからの糸球体の染色は、著しく染色が増加することを示す。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図５は、抗TGF-β1抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光法の顕微鏡写真を示す。(Ａ)正常な腎臓からの糸球体のかすかな染色、および(Ｂ)最小の病状変化を有する患者の腎臓からの糸球体のかすかな染色。(ＣおよびＤ)進行した糖尿病の糸球体硬化症の徴候である、重症のマトリックス蓄積のみられる２人の患者からの糸球体は、免疫反応性のTGF-β1タンパク質で鮮やかに染色されることを示す。マトリックスの蓄積が少ない初期の糖尿病の腎症の他の症例では、染色パターンは、進行したヒトの疾患のこうした場合にみられるパターンと、図3Bに示した、発病15週の糖尿病ラットにみられるパターンとの中間であり、それは、TGF-β1染色パターンが疾患の重篤さで連続していることを示唆し、最初は個々の細胞の染色を示し、そして後に細胞毎の染色が曖昧になる程度まで増加する。(Ｄ)この顕微鏡写真は、糸球体を含む上皮嚢（ボーマン嚢）における染色を示す。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。
図６は、抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色したヒト糸球体の免疫蛍光を示す。(Ａ)正常な腎臓からの糸球体、および(Ｂ)最小の病状変化を有する患者からの糸球体は、わずかに染色される。(ＣおよびＤ)一方、糖尿病の糸球体硬化症の２人の患者は、異常糸球体内およびその周りの嚢（ボーマン嚢）で強い染色を示した。写真を60秒の同じ露光時間、同一条件下で撮影した。
図７は、TGF-β1、2、3の活性の、組換えヒトデコリンによる中和を示す。増殖阻害を測定するミンクの肺細胞アッセイを、イソ型のTGF-βの活性を中和する組換えデコリンの能力をアッセイするために使用した。[3Ｈ]チミジンの取り込みを、Yamaguchiら、Nature 346:281 (1990)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、TGF-βの存在、およびデコリン(○)またはウシ血清アルブミン(BSA)(●)の濃度の増加で決定した。データは、TGF-β1で誘導した増殖阻害の中和のパーセントを表す。[3Ｈ]チミジンの取り込みが、TGF-βおよびデコリンのどちらにも無い場合を、100％と定義する（TGF-β1およびTGF-β3については125,000cpm；TGF-β2については107,000cpm）。TGF-βには取り込みが存在するが、デコリンには存在しない場合を、０％と定義する（TGF-β1については57,000cpm；TGF-β2については78,000cpm；TGF-β3については59,000cpm）。それぞれの点は二連の試料からの結果の平均を表す。
図８は、デコリンで治療した糸球体腎炎のラットの糸球体におけるフィブロネクチンの堆積を示す。(Ａ)リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、蛋白アルブミン(OVA)、アグレカン(aggrecan)(AGC)、またはウシ血清アルブミン(BSA)、または様々な量のデコリンを６回注射した、正常コントロールラット、およびコントロール糸球体腎炎ラットからの糸球体中のフィブロネクチン染色の定量。デコリンを４回または６回注射して治療したラットは、同じ治療を行った疾患コントロールラットまたはデコリンで治療しなかった疾患コントロールラットあるいはデコリンを２回注射して治療した疾患コントロールラットよりも、糸球体中に堆積したフィブロネクチンは、著しく少なかった（ｐ＜0.01）。(Ｂ)抗フィブロネクチン抗体で染色した、糸球体腎炎ラットからの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。ラットをデコリン注射で治療しなかった(ND)(すなわちPBSのみ)、または２日間デコリン注射で治療した(2D)、４日間デコリン注射で治療した(4D)または６日間デコリン注射で治療した(6D)。いずれの動物の場合も、糸球体の数の平均の最大標準誤差は、低い糸球体間の変数を示す0.16であった。例示した糸球体のマトリックス数は：ND, 3.5; 2D, 3.5; 4D, 2.0; 5D, 2.0である。写真を40秒の露光時間、同一条件下で撮影した。
倍率×500。
図９は、デコリンで治療した糸球体腎炎ラットの糸球体中の、EDA+フィブロネクチン、およびテネイシンの蓄積を示す。
(Ａ)糸球体におけるEDA+フィブロネクチン染色の定量。符号は、図8Aに記載の通りである。デコリンの注射を４回または６回したラットは、他の全ての糸球体腎炎群と比較して、EDA+フィブロネクチンの堆積から有意に保護されていた(Ｐ＜0.01)。(Ｂ)抗EDAフィブロネクチン抗体で染色した糸球体腎炎ラットからの糸球体の免疫蛍光の顕微鏡写真。符号は、図8Bに記載の通りである。いずれの動物の場合も、糸球体の数の平均の最大標準誤差は、低い糸球体間の変数を示す0.11であった。例示した糸球体の最大数は：ND, 4.0; 2D, 3.5; 4D, 1.0; 6D, 1.5である。写真を60秒の露光時間、同一条件下で撮影した。倍率×500。抗テネイシン抗体で染色した、糸球体腎炎ラットからの糸球体の、免疫蛍光の顕微鏡写真もまた、得た。ラットをデコリンを４回または６回注射して治療したところ、ラットは、デコリンで治療しなかったラットまたはデコリンを２回注射して治療したラットが有するよりも少ないテネイシンを糸球体中に有していた。EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンはどちらも、デコリンで治療しなかったラットまたはデコリンを２回注射して治療したラットの腎炎の糸球体において、著しく増加していた。
発明の詳細な説明
本発明は、トランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）の活性を抑制する薬剤と組織とを接触させることによって、組織中の細胞外マトリックス成分の蓄積を阻害する方法を提供する。本発明はまた、細胞外マトリックスが産生するTGF-βの活性を抑制するのに有効な量の薬剤と組織とを接触させることによって、組織中の細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある病変を治療する方法を提供する。薬剤は、抗TGF-β抗体、PDGF、またはArg-Gly-Aspを含有するペプチドであり得る。好ましくは、このようなArg-Gly-Aspを含有するペプチドは、４と５０との間のアミノ酸の長さである。
薬剤はまた、デコリン、デコリン類似体、またはデコリンと機能的に同等なものであり得る。本明細書中で用いる「デコリン」は、KrusiusおよびRuoslahti、PNAS (USA) 83:7638(1986)中のプロテオグリカンに帰属される構造的特徴を実質的に有するプロテオグリカンを指す。ヒト線維芽細胞デコリンは、KrusiusおよびRuoslahti、上述に示されるアミノ酸配列を実質的に有する。「デコリン」は、天然の組成物、および、デコリンフラグメントのような実質的に機能的特徴を保持しているデコリン改変物の両方を指す。デコリンコアタンパク質は、もはや、実質的にグリコサミノグリカンで置換されてなく、そしてデコリンの定義に含まれないデコリンを指す。酵素処理、突然変異、または、グリコサミノグリカン鎖をコアタンパク質に結合できない細胞中で、組換えデコリンを産生するような他の手段によって、グリコサミノグリカンを含まないデコリンを得られ得る。
デコリンと機能的に同等なものとしては、デコリンの機能的特徴を保持するデコリン改変物、および、バイグリカンおよびフィブロモジュリンのようなデコリンと同族で、例えばデコリンと類似の機能的活性を有する分子を含む。改変物は、例えば、デコリンコアタンパク質の機能的活性を妨げない１つまたはそれ以上の側鎖を含み得る。
上記の薬剤に加えて、本発明は、そのような薬剤の同族体および類似物の使用を包含することを意図する。本明細書中で、同族体とは、上記薬剤と実質的に類似の構造を有する分子であり、類似物とは、構造的類似にかかわらず実質的に生物学的類似性を有する分子である。
機能的な同等物、同族体、または類似物が、本発明の目的に対して機能するかどうかは、当業者であれば、それを本明細書中で提供される実施例に置き換えることによって容易に決定し得る。
接触は、インビトロまたはインビボにおいて行われ得る。インビトロでの接触は、細胞を有効な量の薬剤と共にインキュベートし得る。インビボでの接触では、薬剤を単独または担体と共に投与し得る。投与方法は、当業者にはよく知られており、静脈内注射または筋肉内注射を含むが、これらに限定されない。薬剤を、連続的または断続的に投与し得る。
有効な量は、病変および治療する固体に依存して変わる。本発明の方法は、哺乳動物、最も好ましくはヒトの治療または防護に有用である。
本発明は、さらに、組織中のTGF-βのレベルを測定し、そして組織中のTGF-βのレベルを正常組織中のTGF-βのレベルと比較することによって、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積に特徴がある組織の種々の病変の存在を検出する方法に関する。組織中のTGF-βレベルの上昇は、そのような病変を示す。また、組織中のフィブロネクチンEDA+および/またはテネイシンの検出は、非直接的に、TGF-βの過度の活性を示す。
本発明の方法で治療し得る病変は、細胞外マトリックスの蓄積に特徴がある。これらの病気は、一般に線維症性の病気であり、例えば、糸球体腎炎、成人または急性呼吸促進症候群(ARDS)、および肝硬変を含む。また、類線維腫、線維腫、線維線腫、および線維肉腫を含む、例えば、胸、子宮、または膵臓の線維症性ガン、ならびに、線維細胞の病気、線維硬化症、および線維症も含まれる。さらに、本方法は、肺線維症、動脈硬化症、後部心筋梗塞、心臓性線維症、および血管形成後再狭窄のような線維症状態、ならびに腎臓間質性線維症の治療に用いられ得る。本方法はまた、ケロイド性瘢痕のような過度の瘢痕形成、および外傷、火傷、または外科手術による瘢痕の治療または防止にも用いられ得る。本方法はまた、糖尿病性腎臓病のような糖尿病関連の病変を防止または阻害するのにも用いられ得る。しかしながら、これらの病変は、単なる代表例にすぎず、当業者であれば、本方法が細胞外マトリックスの蓄積に関連するあらゆる病変に有用であることは容易に理解される。
増殖因子の多様性は、細胞外マトリックス産生において役割を担っていることが示唆された。しかしながら、マトリックス成分の病理学的蓄積におけるそれらの影響は明らかでなかった。本発明は、病理学的にマトリックスの蓄積をしやすい組織は、特にプロテオグリカンを合成するという発見に基づく。TGF-βと反応する抗体のような、TGF-βの活性を阻害する薬剤は、プロテオグリカン産生に対するTGF-βの刺激効果をブロックすることが見いだされた。この点で、TGF-βはテストした増殖因子の中では独特であり、したがって、このTGF-βの特異的効果を操作することは、種々の病変におけるマトリックス成分の不適切で望ましくない蓄積を制御または治療する上で有用である。
TGF-βは、組織の傷害後の修復および再生を調節するのに重要な役割を担っている多機能性サイトカインである。TGF-βの３つのイソ型、TGF-β1、2、および3が、哺乳動物で発現され、現在までインビトロで類似の特性を示す。血小板は、高濃度のTGF-βを含有し、そして、傷害部位での脱顆粒においてTGF-βを周囲の組織に放出する。続いて、TGF-βは、(1)単球、好中球、および線維芽細胞の化学吸引、(2)TGF-β産生の自動誘導、ならびに、インターロイキン１(IL-1)、腫瘍壊死因子、および他のサイトカインを分泌する単球の刺激、(3)脈管形成および細胞増殖の誘導、(4)効力のある免疫抑制剤および過酸化物放出のインヒビターとして作用することによる炎症および細胞毒性の制御、および、(5)細胞外マトリックスの増加した堆積を含む、治療を促進する一連のイベントを開始する。
細胞外マトリックスに対するTGF-βの効果は、その機能的活性の重要な特徴である。Edwardら、EMBO 6:1899(1987)およびLaihoら、J.Biol.Chem. 262:17467(1987)に記載されているように、TGF-βは、フィブロネクチン、コラーゲン、およびプロテオグリカンのような個々のマトリックス成分の合成を刺激し、同時に、プロテアーゼの合成を減少させ、プロテアーゼインヒビターのレベルを増加させることによってマトリックスの分解をブロックする。TGF-βはまた、インテグリンの発現を増加させ、そして、IgnotzおよびMassague、Cell 51:189(1987)に報告されているように、マトリックスへの接着を促進し得るような方法で細胞表面上のインテグリンの相対割合を変化させる。
TGF-βの成熟形態は、それぞれが112アミノ酸の２つの同様の鎖からなる。TGF-βは、種々の病変で見られる細胞外マトリックスの増加した合成の原因である。TGF-βのアミノ酸配列を次に示す：
糸球体間質マトリックスの組成を制御する因子を研究するために、培養中の糸球体間質細胞を、IL-1、PDGF、腫瘍壊死因子(TNF)、およびTGF-βで処理した。培地の分析は、TGF-βはプロテオグリカンとして同定されるバイオグリカンおよびデコリンの２つの成分の量を増加させることを示した。PDGF、IL-1、およびTNFは、コントロールを越える顕著な効果を示さなかった。
糸球体間質細胞への特定の免疫学的傷害によって、糸球体腎炎を誘起し得る。糸球体細胞障害を伴う動物から単離した糸球体は、バイグリカンおよびデコリンの産生の増加を示す。さらに、培養した腎炎糸球体からの馴化培地は、正常糸球体間質細胞のバイグリカンおよびデコリンの合成を刺激する。
同等の刺激効果を、外因性のTGF-βの添加によって引き起こされ得る。さらに、抗TGF-β抗血清のようなTGF-βの効果をブロックする薬剤は、外因性のTGF-βの刺激効果をブロックする。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、PDGF、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、あるいはそれと機能的に同等なものを含む、このような薬剤を、有害なマトリックスプロテオグリカン合成を特異的に制御または治療するのに用い得る。従って、このような薬剤を、例えば、瘢痕形成のような細胞外マトリックス蓄積に関連するあらゆる状態を防止すること、または、組織をTGF-β活性を抑制する薬剤と接触させることによって組織中の細胞外マトリックスの蓄積を特徴とする病変を治療することに用い得る。
TGF-βにおけるデコリンの効果を、糸球体腎炎モデルを用いて研究した。デコリンは、TGF-βの本来の調節剤であるようなので、このモデルにおいてインビボで活性であるべきであり、もしそうであるなら、TGF-βの作用に拮抗させて治療的に用いるための理想的な分子である。組換えヒトデコリンおよびウシ組織から精製したデコリンの静脈内投与を用いて、糸球体腎炎のラットの腎臓における、プロテオグリカンがマトリックス蓄積を抑制する能力をテストした。糸球体中に存在するフィブロネクチンの量を用いて、糸球体腎炎における、デコリンのマトリックス堆積をブロックする能力を定量的に評価した。フィブロネクチンは、ラットおよびヒトの正常な糸球体間質マトリックスに豊富に存在するタンパク質であり、そして、ヒトでは糸球体間質増殖性糸球体腎炎に伴って大きく増加する。Courtoyら、J.Cell.Biol. 87:691(1980)、Courtoyら、J.Histochem.Cytochem. 30:874(1982)、Oomuraら、Virchows Archiv.A Pathol.Anat. 415:151(1989)、Border、Kidney Int. 34:419(1988)。マトリックスのマーカーとして染色したフィブロネクチンを用いることにより、ラット糸球体腎炎モデルにおいて７日までに起こる急性マトリックス構築を、デコリンが顕著に防止することが見いだされた。EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンは、TGF-β活性およびマトリックス蓄積に対するより特異的なマーカーを提供した。なぜなら、これらのタンパク質は、正常な成熟ラット腎臓ではほとんど検出できないからであり、そして、それらはTGF-βによって強く誘起されるからである。両方のマーカーとも、腎炎糸球体中で増加し、そして両方ともデコリンの注射によって抑制された。結局、マトリックス構築に対する効果が、事実上治療的であったということが、本明細書中に参照として援用されているGinsbergら、N.Engl.J.Med. 309:1543(1983)に記載されているように、ヒトの糸球体損傷の指標として広く用いられるタンパク尿が平行して減少することによって示された。
急性糸球体間質増殖性糸球体腎炎をもまた、動物モデルにおいて、全体参照として援用されている米国特許出願第07/416,656号に記載の抗胸腺細胞血清ラットに注射することによって誘起した。傷害糸球体は、正常糸球体よりも、TGF-βmRNAを多く発現し、より多くのTGF-βタンパク質を合成し、そしてより多くのフィブロネクチンおよびプロテオグリカンを分泌することが見いだされた。TGF-βの活性を中和し得る抗血清の腎炎ラットへの注射は、糸球体によるマトリックス成分の産生を抑制し、そして糸球体間質マトリックスの構築を防止した。
糖尿病性ネフロパシー（すなわち糖尿病性腎臓病）の進行は、最も頻繁に起こる重度の糖尿病合併症であり、インスリンでの治療にもかかわらず約半分の患者で最終的に起こる。糖尿病性ネフロパシーの顕著な組織学的特徴は、結果として毛細管閉塞および硬化症を伴う、糸球体の糸球体間質領域における細胞外マトリックスの膨張である。糸球体間質マトリックスの膨張は、タンパク尿、高血圧、および腎不全の臨床的徴候と強く相関している。
細胞外マトリックスの蓄積が病的になる、糸球体腎炎と糖尿病ネフロパシーとのマトリックス異常の類似性は、TGF-βが糖尿病性腎臓病に関わっている可能性を示唆した。本発明によって、ストレプトゾトシンの注射によって糖尿病になったラットの糸球体が、TGF-β1mRNAおよびTGF-β1タンパク質の発現の著しい増加を含むことが示される。糸球体はまた、細胞外マトリックスタンパク質の択一的にスプライシングされた形態である、フィブロネクチンおよびテネイシンの堆積の増加を示した。これらの成分は両方とも、TGF-βによって誘導されることが知られている。これらの結果は、TGF-βはまた、糖尿病性ネフロパシーの進行に寄与していることを示している。
本発明に関係する研究において、インスリン欠乏を生じる化学物質であるストレプトゾトシンの投与によって糖尿病になったラットの腎臓を試験した。ストレプトゾトシンモデルは、両方とも本明細書中で参照として援用されている、Velasquezら、FASEB 4:2850(1990)およびMauerら、Diabetes 25:850(1976)に記載されているように、動物が、ヒトの糖尿病性ネフロパシーに似た腎臓病を進行させるので広く用いられている。ラットを、処置を受けていない群、または、実施例IIに記載のように毎日インスリンの注射で血中のグルコースを減少させる処置を受けた群に分けた。正常で年齢のそろった雄ラットをコントロールとして用い、これらも処置を受けない群または糖尿病ラットと同じインスリン養生法で処置された群に分けた。糖尿病におけるTGF-βの発現を評価するために、糖尿病ラットおよびコントロールラットの糸球体中の、TGF-β mRNAおよびTGF-β1タンパク質のレベルを試験した。mRNA分析は、コントロールに比べて糖尿病ラットの糸球体中のTGF-β1 mRNAレベルが上昇していることを示した（図1A）。TGF-β1 mRNAのレベルは、糖尿病の徴候後の時間と共に増加し、表１に示すように、未処置の糖尿病ラットではインスリンを投与されたラットに比較してより高かった。
糖尿病ラットの糸球体中に発現するTGF-βは、細胞外マトリックス産生を刺激する活性があるかどうか研究するため、そのような糸球体を、フィブロネクチン（フィブロネクチンEDA+）およびテネイシンの択一的にスプライシングされた形態を検出する抗体で染色した。これらのマトリックス成分は、Borderら、Kidney Int. 37:689(1990)およびNakamuraら、Kidney Int. 41:1213(1992)に記載されるように、TGF-βによって誘導される。マトリックス成分はまた、組織修復部位に現れる。Wangら、J.Biol.Chem. 266:15598(1991)およびPearsonら、EMBO J. 7:2977(1988)。また、フィブロネクチンEDA+およびテネイシンは両方とも、光学顕微鏡検査によると腎臓組織学的に正常である時期である、高血糖症進行後６週間もの早期に糖尿病ラットの糸球体中で顕著に増加し、そして時間と共に蓄積し続けることが見いだされた（図1Aおよび2B）。
NerlichおよびSchleicher、Am J.Pathol. 139:889(1991)に記載されているように、間質性コラーゲンIII型は、糖尿病性ネフロパシーに伴ってヒトの硬化性の糸球体中で見いだされるが、正常なヒトまたはラット糸球体中では見いだされない。III型コラーゲンを、6、15、および40週時の糖尿病ラットの糸球体中に堆積しているのを見いだした。TGF-βを、正常なラットの糸球体間質細胞または上皮細胞の培養物に加えると、TGF-βと結合してその活性を中和し得るプロテオグリカンである、デコリンおよびバイグリカンの産生を誘導することが知られている。ラットデコリンmRNAとは異なるラットバイグリカンは、対応するヒトcDNAプローブと交差ハイブリダイズするので、バイグリカンmRNAレベルをテストした。バイグリカンmRNAレベルの上昇を、図1Bおよび表1に示すように、糖尿病ラットの糸球体において検出した。これらの結果は、TGF-βが積極的にそして特異的に糖尿病ラットの糸球体におけるマトリックス成分の産生を誘導しているということをさらに示す。
表１は、糸球体でのTGF-β1 mRNAおよびバイグリカンmRNAの発現を示す。図１に記載のように、ノーザンブロッティング分析を、各群の動物から単離した糸球体から調製したRNAを用いて行った。３つの時点で、各実験群を、２つの独立した実験を行うために用いる２つの等しい群に分けた。フィルムを、レーザー密度計を用いてスキャンした。定量的比較をするために、TGF-β1およびバイグリカンmRNAと、同じレーン中のコントロールのグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAバンドとの密度比を算出した。続いて、結果を、正常コントロール動物(C)の比を1.0としたときの比の相対変化として表した。値は、２つの実験の平均である。
これらの結果は、糖尿病糸球体中のマトリックスの拡大と傷のような組織損傷後の修復過程との間で類似していることをさらに示す。両方の過程においても、細胞外マトリックスの局所的産生の増加に関連するTGF-β mRNAおよびTGF-βタンパク質の初期の発現がある。TGF-βによって誘導されるマトリックス成分である、フィブロネクチンEDA+およびテネイシンが、傷の治療中および糖尿病糸球体中に優先的に発現される。III型コラーゲンは、正常な糸球体中では見いだされないが、糖尿病糸球体中および治療している傷に現れる。傷の修復の重要な特徴は、過度の瘢痕を避けるために過程を終わらせる必要性である。
糖尿病患者では、腎臓への波及は、Knowles、Kidney Int.Suppl. 1:S2(1974);Dormanら、Diabetes 33:271(1984):およびMauerら、J.Clin.Invest. 74:1143(1984)に記載されているように糖尿病発病の10年から20年後に起こり、糸球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のストレプトゾトシンモデルでは、光学顕微鏡で糸球体異常が見えるようになるには、６カ月またはそれ以上必要であり、ヒトでは20年またはそれ以上に相当する期間が必要である。従って、糖尿病の患者および実験動物における糸球体硬化症は、組織修復過程の調節または終結の慢性的不全を示唆し、おそらくTGF-βの持続した活性を包含している。糖尿病における、組織修復への刺激は、インスリン治療にもかかわらず起こる慢性的な関連性のない高血糖症であるようである。高血糖症は、腎臓での血行力学的変化およびグリコシル化タンパク質の血中レベルの上昇ような、多くの器官特異的および全身的変化を引き起こすことが知られている。
従って、本発明はさらに、糖尿病患者のTGF-βの活性を阻害することによって糖尿病性ネフロパシーを防止する方法に関する。TGF-β活性の阻害は、例えば、糖尿病腎臓組織を、抗TGF-β抗血清、PDGF、Arg-Gly-Aspを含有するペプチド、デコリン、またはそれと機能的に同等なもののようなTGF-βの効果をブロックする有効量の薬剤と接触させることによって成し遂げられる。
さらに本発明は、有効量のインスリン、および、上述のようなTGF-βの効果をブロックする有効量の薬剤を投与することによって、糖尿病を治療する方法を提供する。
本発明の方法に有用な組成物もまた提供される。このような組成物は、TGF-βの活性を抑制する薬剤を含み、上述の薬剤および担体を含有する。本発明の１つの実施態様では、組成物は薬学的組成物である。薬学的に受容可能な担体には、例えば、ヒアルロン酸および水溶液（重炭酸酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、リンゲル液および所望によって5%デキストロース、またはヒト血清アルブミンを補給した生理食塩水など）が含まれる。当業者に知られる他の担体もまた考慮される。薬学的組成物はまた、細胞外マトリックスの蓄積に特徴があるかまたは関連する種々の病変の防止または治療に有用な他の薬剤を含有し得る。例えば、糖尿病の場合、薬学的組成物は任意にインスリンを含み得る。
糖尿病ラットで得られた結果とヒト糖尿病性ネフロパシーとの関連を示すために、６症例の糖尿病性糸球体硬化症（糖尿病性ネフロパシーの末期）、３症例の正常コントロール、ならびに３症例の最小の病状変化および３症例の薄基底膜疾患からなる６症例の疾患コントロールを試験した。コントロールの病気は、タンパク尿および/または血尿を引き起こすが、これまでにほとんど糸球体硬化症にならないことが知られている糸球体障害であるため、それらを選んだ。糖尿病性糸球体硬化症の６症例のすべての糸球体が、図５および６に示す２症例のように、TGF-β1およびフィブロネクチンEDA+に対して強く陽性であった。組織の量が限られているため、研究をこれら２つのマーカーに限った。これとは対照的に、正常および病気の各コントロールは陰性またはほんのわずかな染色を示した（図５および６）。
これらの知見は、糖尿病性ネフロパシー中の糸球体マトリックスの膨張と実験的糸球体腎炎との間の類似、および、病気と傷のような組織損傷に続く修復過程との間の連結を確立する。両方とも、細胞外マトリックスの局所的産生の増加に関連するTGF-β mRNAおよびTGF-βタンパク質の早い発現がある。TGF-β、フィブロネクチンEDA+、およびテネイシンによって誘導されるマトリックス成分は、治療している傷、および、この研究で示されるような糖尿病ラット糸球体中で優先的に発現される。傷の修復の重要な特徴は、過度の瘢痕を避けるために、この過程を終結させる必要性である。糖尿病患者の糸球体硬化症の進行は、TGF-βの持続した活性を生じる、組織修復過程の調節または終結の慢性的不全を示唆し、そして、TGF-βの発現が一時的で、そして病気が元に戻り得る糸球体腎炎モデルにおける本発明者らの知見と対照をなす。糖尿病患者では、腎臓への波及は、糖尿病発病の10年またはそれ以上の後に起こり、糸球体が細胞外マトリックスによって機能しなくなるまで進行する。糖尿病のストレプトゾトシンモデルでは、糸球体異常が見えるようになるまでに、数カ月が必要であり、ヒトでは10年またはそれ以上の期間が必要である。
以下の実施例は例示を意図するものであって、本発明を限定するものではない。
実施例 Ｉ
糸球体間質細胞および糸球体上皮細胞によって生成される細胞外マトリックスに対する増殖因子βの特異的効果
Ａ．成長因子および抗体
ブタのTGF-β1を、R&D Systems.Inc.（Minneapolis,MN）から入手した。ヒト血小板由来の成長因子（PDGF）および組換えヒトインターロイキン-1（IL-1）、アルファおよびベータを、Collaborative Research,Inc.（Bedford,MA）から入手した。組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）は、Amgen（Thousand Oaks,CA）から入手した。ヤギ抗ヒトI型コラーゲン抗体、およびヤギ抗ヒトIII型コラーゲン抗体を、Southern Biotechnology Associates,Inc.（Birmingham,AL）から購入した。ウサギ抗マウスフィブロネクチン、およびコラーゲンI型、コラーゲンIII型、コラーゲンIV型、およびコラーゲンVI型、および抗ラットラミニン抗体は、すでに述べている。簡潔に言えば、ウサギポリクローナル抗体を、完全フロントアジュバントに乳化した各精製タンパク質をニュージーランドウサギに皮下注射することにより生成した。最初の免疫感作の3週間後に、不完全フロントアジュバントに乳化した精製タンパク質を連続して１週間ごとに筋肉内注射した。２回目の注射を、耳の動脈からの50mlの血液と共に行った。血液を凝結し、血清を遠心分離によって集めた。ラットに対するモノクローナル抗体Thy-1を、Accurate Chemicals（Westbury,N.Y.）から入手し、そしてヤギ抗ヒト第VIII因子を、Miles Laboratory Inc.（Kankokee,IL）から入手した。
ウサギ抗ラットFx1A抗体を、Edgingtonの方法に従って、Sprague-Dawleyラットの腎臓から調製したFX1Aで免疫感作することによって生成した。簡潔に言えば、ウサギを、超遠心分離によって単離した、腎臓近位尿細管の刷子縁内に富化した調製物によって、上記のように免疫感作した。FITCおよび標識したアルカリホスファターゼ、または抗ウサギIgGおよび抗ヤギIgGを、Cappel（Melvern,PA）から入手した。
Ｂ．細胞培養
糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、６から８週齢のSprague-Dawleyラットから得た、未処理の糸球体の外殖部分(outgrowth)から得た。糸球体間質細胞の単離および培養を、以下のように行った。
雄Sprague/Dawleyラット（100g-140g、単離物につき２匹のラットを使用）を、ケタミン（10mg/ラット100g）およびRompum（0.5mg/ラット）を用いて麻酔し、そしてベタジン（betadine）を用いて滅菌した。腎臓を外科的に露出させ、リン酸緩衝化生理食塩水を用いて灌流した。次いで、腎臓を取り出し、滅菌し氷冷したPBS中に入れた。
腎臓を２等分し、そして皮質を外科的に除去した。残存組織を外科用メスを用いて１mm3小片に刻んだ。次いで、刻んだ腎臓組織をPBSで連続して洗浄して、一連のふるい（149メッシュおよび105メッシュ）にかけた。次いで、105メッシュのふるいにかけた物質を、74メッシュのふるい上に集めた。これは糸球体画分を表す。
この画分を臨床用遠心分離機で10分間遠心分離し、そしてペレットを20％のウシ胎児血清、0.66単位／mlのインスリン、および抗生物質を含有するRPMI 1640培地（Cell-Gro,Washington,D.C.）中に再懸濁した。糸球体を腎臓２個相当分、T75（75cm2）フラスコ中の12mlの培地中に入れた。糸球体間質細胞を約３週間培養した後接着した糸球体から培養した。新鮮な培地をこの培養期間中、3-4日毎に添加する。
上皮細胞を単離するために、未処理の糸球体をVitrogenTM（Collagen Corporation,Palo Alto,CA）でコートしたフラスコ中に入れた。増殖培地は、20％の加熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone,Logan,UT),50U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.66U/mlのインスリンおよび300mg/mlのL-グルタミンで捕捉したRPMI 1640（Cell-Gro,Washington,D.C.）であった。７日後、外殖細胞を0.025％のトリプシン-0.5MのEDTA（Folw Labs,McLean,VA）で分離した。この物質を30-メッシュスクリーンを通すことにより、糸球体の破片を除去した。間接パンニング技法を用いることにより、非常に富化した上皮細胞集合体を生成した。とりわけ、糸球体を上記のように単離し、そして0.15mg/mlのラットの尾部コラーゲンI型で前もってコートした組織培養皿上にプレートした。皿を室温で１時間コートし、次いでPBSで２回洗浄した。１週間培養後、細胞の外殖部分（主として上皮細胞）および糸球体を、0.05%のトリプシン-0.53mMのEDTAを用いてトリプシン処理を行った。細胞懸濁液を30メッシュを通して、糸球体小片を除去した。残存細胞懸濁液を、Thy 1抗原に対するモノクローナル抗体であらかじめコートした皿上にプレートした。糸球体間質細胞は抗原を発現するが、上皮細胞は抗原を発現せず、従って懸濁液中に残るので、糸球体間質細胞のみがThy 1抗体に結合する。この手順により、糸球体間質細胞を優先して取り出した。プレートを４℃で24時間抗体（約100μg/ml）でコートした。細胞を抗Thy 1抗体でコートした皿上で、37℃で１時間インキュベートした。結合していない細胞を集めて、再びプレートした。糸球体間質細胞を、マウス抗Thy-1抗体で４℃で12時間前もってコートした、60×15mmのポリスチレンプレートに添加した。接着していない細胞を取り出し、そしてラミニン（Collaborative Research, Bedford, MA)で前もってコートした6-ウェルプレートに入れた。
糸球体上皮細胞を、以下により同定した：１）特性ポリゴナル形態学；２）FX1A（Heymann抗原）に対する抗体での均一染色；３）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感度；４）抗Thy-1あるいは抗第VIII因子抗体で染色されないこと。近位尿細管細胞による糸球体上皮細胞の汚染を、アルカリホスファターゼ染色により検査し、そして２％未満の細胞がアルカリホスファターゼ陽性であった。それに対して、糸球体間質細胞を以下により同定した：１）典型的星状外観；２）抗Thy-1抗体での均一染色；３）抗FX1A、または抗第VIII因子抗体で染色されないこと；および４）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感度がないこと。
Ｃ．生合成放射標識
通常のプレート、またはラミニンでコートした６ウェルの多ウェルプレートに、糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、１ウェル当り５×105個の細胞の濃度で添加し、そして無血清RPMI 1640培地中で24時間培養して、細胞増殖を停止した。接着していない細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄することにより、除去した。血清および抗生物質を含有していないRPMI 1640を35Ｓ硫酸塩標識の低硫酸塩培地として、および35Ｓメチオニン標識のメチオニン（Flow Labs,McLean,VA）を含有しないRPMI 1640として添加した。増殖因子を48時間、以下の濃度で、培地に添加した：TGF-β(25ng/ml)、PDGF(2U/ml)、IL-1α(5U/ml)、IL-1β(5U/ml)およびTNF(500U/ml)。本実験終了18時間前に、タンパク質を標識するために35Ｓメチオニン（100μCi/ml)を、またはプロテオグリカンを標識するために35Ｓ硫酸塩（200μCi/ml）を、培養物に添加した。
アイソトープをNew England Nuclear(Boston, MA)から購入した。馴化培地、および細胞層を、上記のように採取し、処理した。細胞増殖を、3Ｈ-チミジンの取り込みにより試験した。ラミニンでコートした12ウェルのプレートに、２×１０5／ウェルの濃度で、細胞を添加した。24時間後、無血清培地内で、10μCi/mlの3Ｈ-チミジン溶液25μlを、それぞれのウェルに添加した。24時間インキュベーションを行った。培養培地を捨て、細胞層を５％のTCA溶液で２回洗浄し、そして６ＮのHCl溶液700μlで15分間インキュベートした。3Ｈ-チミジンの取り込みを、液体シンチレーションカウンター（Beckman, Irvine, CA）中のそれぞれの細胞層をカウントすることにより測定し、そしてBCAタンパク質アッセイキット（Pierce, Rockford, IL）によって測定した、それぞれの細胞層のタンパク質含量を用いて、較正した。
Ｄ．マトリックス分子の固定
マトリックス糖タンパク質を免疫沈降によって同定し、そしてプロテオグリカンを酵素での消化によって同定した。抗血清100μlを、馴化培地500μlに、または増殖因子を添加した、あるいはしなかった重複ウェルから収集した細胞抽出液300μlに添加することにより、免疫沈降を行った。重複ウェル中で、細胞を分離し、そして細胞数の均一性を確認するためにカウントした。予め免疫を有する血清を、並行したコントロール実験において用いた。試料をウシ血清アルブミン（BSA）で前もってコートした４mlのコニカルチューブ内で混合しながら、４℃で一晩インキュベートした。プロテインＡセファロースビーズ（Sigma, St.Louis, MO）を22℃で60分間、新鮮なRPMIと前もってインキュベートした。抗原-抗体複合体を沈降するために、懸濁したプロテインＡセファロース50μlを、試料に添加し、そして４℃で120分間混合した。試料を2000×Ｇで10分間、遠心分離し、そして上澄み液を除去した。ペレットを、0.5M NaCl、0.1％ Triton X-100(pH7.4)を含有する、氷冷したPBS １mlで10回洗浄した。最終的に、ペレットを氷冷したPBSで洗浄し、新しいチューブに移し、再度遠心分離し、そして３回PBSで洗浄した。ペレットを、３％のSDS、および10％のβメルカプトエタノール（Sigma, St.Louis, MO）を含有するSDS-PAGE試料用緩衝液40μl中に溶解し、５分間煮沸した。
グリコサミノグリカン分解酵素での消化を、TGF-βによって調節したプロテオグリカンの型を決定するために用いた。生合成標識を行った後、馴化培地上で消化を行った。培地のアリコート25μlを、コンドロイチナーゼABCまたはコンドロイチナーゼACの100ミリ単位(両者は100mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM酢酸カルシウム、2mg/ml BSA中)あるいはヘパリナーゼII 100ミリ単位(50mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM塩化カルシウム、5mM酢酸カルシウム中)と混合した。全ての試料に、１mM PMSF、５mMベンズアミジン、100μg/mlダイズトリプシンインヒビター、10μg/mlロイペプチン、および10μg/mlアンチパインも、添加した。全ての物質は、Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO)より入手した。コンドロイチナーゼを含有する混合物を、37℃で1.5時間インキュベートした。インキュベーション終了後に、試料をSDS-PAGEのために調製した。
大きなプロテオグリカンを、ゲル濾過によって特徴付けした。セファロースCL-6Bカラムからの、35Ｓ硫酸塩で標識した画分を、蒸留水で透析し、凍結乾燥した。試料を、上記のプロテアーゼインヒビターを含有する、0.1M酢酸ナトリウム、0.1M tris(pH7.3)２mlに溶解した。次いで、コンドロイチナーゼABC溶液（1.25単位／ml）0.2mlを、試料1.8mlに添加し、37℃で24時間消化を行った。次いで、試料をCL-6Bカラム上で分画し、蒸留水で透析し、凍結乾燥し、そして低pH(1.0)条件下で亜硝酸で処理した。亜硝酸処理後、試料をCL-6Bカラム上で再度クロマトグラフィーを行った。
TGF-βによって誘導される、プロテオグリカン生成の増加を定量するために、馴化培地３mlをセファロースCL-6Bカラム（1.3×100cm）にのせた。カラムを、４M尿素、0.15M NaCl、50mM Tris HCl(pH7.2)、0.1％(v/V)Triton X-100で、流速20ml/時間で溶出し、そして３ml/チューブの画分を収集した。それぞれの溶出画分の放射活性を、Beckman LS 2800液体シンチレーションカウンターによって測定した。
Ｅ．電気泳動法
試料を、以下の実施例IIに記載のように、フルオログラフィー、およびデンシトメトリーによるSDS-PAGEによって、分析した。
Ｆ．結果
前述の研究結果によって、TGF-βは、上皮細胞によるバイグリカン、フィブロネクチン、およびIV型コラーゲンの生成を調節する一方、培養した糸球体間質細胞により生成するプロテオグリカンに、TGF-βのみが作用する、ということが示される。従って、TGF-βによって調節された上皮細胞による、マトリックス生成の生合成プロフィルは、糸球体間質細胞による場合と異なる。より具体的には、これらの結果から、糸球体中のTGF-βが放出されることによって糸球体間質マトリックスが、蓄積し、そして糸球体底膜を形成する、マトリックス分子の生成において増加することが、証明される。この結果を表２に要約する。
Ａ．ラットにおける糖尿病の誘導
Velasquezら、FASEB 4:2850(1990)、およびMauerら、Diabetes 25:850(1976)(これらは共に本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、6.5mg/体重100gで、クエン酸緩衝液中のストレプトゾトシン（Sigma Chemical Co.,St.Louis, MO)を単回静脈内注射することにより、150グラムの体重の雄Sprague-Dawleyラットに糖尿病を誘導した。血中のグルコースレベルが＞300mg/dLである48匹の糖尿病ラットを、２つの群に分けた。第１の糖尿病の群（Ｄ）には、治療を施さず、第２の群（DI）には、毎日3.5UのNPHインスリン（Eli Lilly, Indianapolis, IN）を皮下注射することにより治療した。48匹の成熟した雄ラットを、コントロールとして用い、そしてインスリンを与えない群（Ｃ）に分割するか、または糖尿病ラットと同様にインスリン摂取により治療した（CI）。
それぞれの群の血中グルコースレベルを、10週間後、一晩絶食させた後の、8:00 a.m.に測定し、そしてmg/dLでの値を表３に報告する。値は、平均±標準偏差である。
Ｂ．全RNAの調製および検出
１％2-メルカプトエタノールおよび0.5％ラウリルサルコシルを含む、グアニジンイソチオシアネート（GITC）溶液（4M GITC: 0.5％w/v N-イソリルサルコシン、0.1％消泡剤Ａ、0.1M β-メルカプトエタノール、25mM Tris-HCl(pH7.0))3-4ml中の単離糸球体（8-9×104個の細胞）を溶解することにより、全RNAを調製した。溶解物を、塩化セシウムの密度グラジエントクッションで、150,000×gで超遠心分離した。遠心分離後、チューブの底の層からRNAを回収した。40μgのRNAを、それぞれの時点の群毎にプールし、そして2.2Mホルムアルデヒドおよび0.2M MOPS（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO）pH7.0を含む、１％アガロースゲルで電気泳動し、そして0.2ミクロンのナイロンメンブレン(ICN Radiochemicals, Inc., Irvine, CA)に、キャピラリーブロッティングにより一晩トランスファーする。
RNA（40μg）相当量を、260nmでの吸光度に基づいてロードした。メンブレンを、５×SSC（１リットルの最終量に対して、20×SSC：175.3g NaCl、88.2gクエン酸ナトリウム、10N NaOHでpH7.0にする）、５×デンハート溶液（50×溶液：5gフィコール、5gポリビニルピロリドン、5g BSA、H2(0〜500ml)、50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)、0.1％SDS、250μg/mlの音波処理による変性サケ精子DNA(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)、および50％ホルムアミド）中で、37℃で５時間プレハイブリダイズした。
マウスcDNAを得るために、マウスTGF-β1 cDNAからのHinc IIで消化したpBluescript SKII+(Stratagene, La Jolla, CA)に、280bpのPvu IIフラグメントをサブクローン化した。このマウスTGF-β1 cDNAは、Dr. R. Derynckから得、そして、Derynckら、J. Biol. Chem. 261:4377(1986)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載されている。成熟TGF-β1の298-390位のアミノ酸をコードする、挿入物の位置付けを決定し、そして、プラスミドを、塩化セシウムの濃度遠心分離により精製した。この濃度遠心分離は、Kondaiahら、J. Biol. Chem. 263:18313(1988)(これは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように行われた。
マウスcDNAプローブ、ラットGAPDH cDNAプローブ（これはDr. M. B. Sporn, National Institute of Health (NIH)より得た)、およびヒトバイグリカンcDNAプローブ(プラスミドp16)(これはDr. L. W. Fisher, NIHより得た)を、ランダムプライマー法(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)により32P-CTP（シトシン三リン酸）で標識し、そして42℃で一晩ハイブリダイズした。メンブレンを、２×SSC、0.1％SDSで、室温で５分間ずつ、３回洗浄し、そして0.1×SSC、0.1％SDSで、50℃で15分間ずつ３回洗浄した。標準法によりオートラジオグラフィーを行った。フィルムをレーザーデンシトメーター（LKB, Bromma, Sweden）を用いてスキャンした。定量的な比較のために、同じゲルレーン中のGAPDH mRNAバンドの濃度に対するTGF-β1およびバイグリカンmRNAバンドの濃度の比を算出した。次いで、正常のコントロール動物（Ｃ）の比が、1.0であった場合も、比の相関的な変化として、結果を表した。
この分析結果を図１に示し、そして表１に要約する。GAPDH mRNAのレベルに対する比によって標準を決めた場合、インスリンで治療をしなかった糖尿病ラット内に、TGF-β1 mRNAが3.4倍増加して、そして、バイグリカンmRNAが2.3倍増加する。インスリンで治療した糖尿病ラットは、TGF-β1およびテネイシンmRNAの増加がいっそう少ないことを示した。
Ｃ．糖尿病糸球体中におけるTGF-βの検出
糸球体組織を、液体窒素中で素早く凍結し、アセトン中で固定し、そして成熟TGF-β1の最初の30個のアミノ酸に対応する合成ペプチドに対して製造した抗体（50μg/ml）で、４μmの断片を染色した。この抗体(抗LC)(Drs. K. C. FlandersおよびM. B. Sporn, National Institutes of Healthから供与)で、細胞内TGF-β1を染色する。抗LC抗体は、Flandersら、Biochem. 27:739（1988）中に公表されており、その教示内容は本明細書中に参考として援用されている。ウサギIgGまたは、またはリサミンローダミンロバF(ab')2抗ウサギIgG(Jackson Immunology Lab, West Grove, PA）に対するフルオレセインイソチオシアネート複合抗血清（×500）を、1:300の希釈で、２次抗体として用いた。
TGF-β1陽性細胞を、フルオレセインおよびローダミン複合２次抗体を用いた、２重染色免疫蛍光技法によって同定した。この場合２次抗体は、ED1（単核細胞／マイクロファージ）、OX19（リンパ球）、およびビメンチン、デスミン、およびα−平滑筋アクチン（Jackson Immunoresearch Lab）に対するモノクローナル抗体を用いて１次染色されていた。コントロール群、および糖尿病群の６匹の動物それぞれから調製したコード部分で、不規則に選択した20個の糸球体中のTGF-β1陽性細胞の数を、カウントした。
インスリンで治療しなかった糖尿病ラットからの糸球体(糖尿病を誘導してから15週間後）を染色することにより、TGF-β1陽性細胞数の著しい増加が示された。糖尿病の糸球体では、コントロールラットからの糸球体と比較して、糸球体１個当りに著しく陽性な細胞があり、それは*32±２対25±１（値は、平均±標準偏差、*ｐ＜0.001）である。
Ｄ．糖尿病ラットの糸球体中のフィブロネクチンEDA+およびテネイシン沈澱物の定量
免疫蛍光法のための組織を、上記のように調製した。ヒトフィブロネクチンEDA+に対して調製した、マウスモノクローナル抗体は、Dr. L. Zardi, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italyより提供され、そしてBalzaら、FEBS Letters 228:42(1988)、およびSekiguichiら、J. Biol. Chem. 260:5104-5114(1985)に記載されている。これらの開示内容は、共に本明細書中に参考として援用されている。ウサギ抗ヒトテネイシンを、Telios Pharmaceuticals Inc.(La Jolla, CA)より得た。Bourdonら、Cancer Res. 43:2796-2805(1983)(これらは本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、テネイシンを、ヒト神経膠芽細胞腫U251細胞から単離した。フルオレセインイソチオシアネート抗ウサギIgGおよびラットF(ab')2抗マウスIgG（これらは共にJackson Immunology Lab, West Grove, PAから得られた）を、２次抗体として用いた。
テネイシンに対する免疫蛍光法（IF）染色において、４μmの組織断片を、4-5分間アセトンに浸した。乾燥せずに、固定化断片を、室温で約10分間PBS(pH7.4)に浸した。次いで、スライド上に水の小滴がほんの少しだけ残っている状態まで、約５分間送風機を用いて、断片を緩やかに乾燥した。ウサギポリクローナル抗ヒトテネイシン抗体（Telios Pharmaceuticals, La Jolla, CA）を、0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで、1:15から1:20までに希釈した。PBS溶液約10μlから15μlを、組織に添加し、そしてその後、湿った容器中で37℃で約45分間インキュベートした。次いで、直接その部分にPBSをかけるのではなく、スライドを傾けて、PBSを緩やかに流すようにして、PBS洗浄する。次いで、断片を振とうしながら室温で５分間ずつ３回PBSに浸した。次いで、断片を送風機を用いて乾燥した。0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで、1:400に希釈した、FITC結合アフィニティー精製ロバf(ab')2抗ウサギIgG（Jackson Immuno. Lab, 711-096-132, #14620）を、スライドに添加した。上記のように、スライドをPBSで３回洗浄した。Bartels緩衝化グリセロール封入剤FA（Baxter Laboratories）を用いて、カバーガラスで組織を固定した。
上記手順に続き、フィブロネクチンEDA+のIF染色を行った。適切なマウスモノクローナル抗体抗ヒトフィブロネクチンEDAを、１次抗体として用い、そしてFITC結合アフィニティー精製F(ab')2ラット抗マウスIgG（Jackson Immunoresearch Lab. #16381）を0.01％のアジ化ナトリウムを含むPBSで1:30に希釈したものを、２次抗体として用いた。
定量アッセイ結果を図２に示す。それぞれの実験群の６匹の動物から調製したコード部分から、不規則に選択した20個の糸球体中の０から４の尺度（０＝染色されず、４＝最大に強く染色された）を用いて免疫蛍光法染色を数えた。それぞれの時点で、糖尿病動物中に２種のマトリックス成分の堆積物が、著しく増加する。
抗フィブロネクチンEDA+抗体で染色された糸球体の免疫蛍光クロマトグラフによるコントロール糸球体および糖尿病糸球体におけるフィブロネクチンEDA+の蓄積物の検出において、40週間インスリンで治療した、正常のコントロールラットの糸球体は、ほのかに染色されることを示したが、一方、40週間インスリンで治療した、糖尿病のラットからの糸球体は、染色が目だって増強することを示す。
実施例 III
ARG-GLY-ASP含有ペプチドでのプロテオグリカン合成の阻害
Harperら、Kidney International 26:875(1984)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)の方法に従って、４から６週齢のSprague-Dawleyラットの未処理の糸球体から、糸球体間質細胞を得た。使用した増殖培地は、20％の熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Hyclone, Logan, UT)、50U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、0.66U/mlインスリン、および300mg/ml Ｌ−グルタミンで補足したRPMI 1640(Cell-Gro, Washington,D.C.)であった。15日から20日の間で、0.025％トリプシン−0.5mM EDTA溶液（Flow Labs,McLean, VA）で、１次培養物を分離し、そして２×106個の細胞をフラスコに加えた。細胞は７日毎に継代が代わり、そして全ての実験を３継代目と７継代目との間の細胞に対して行った。
ラットの糸球体間質細胞は6-ウェルのマルチプレート中で、準集密(subconfluency)まで成長した。培養物を24時間無血清にして、そして、0.3、0.1、0.03、0.01、または0.003mg/mlでのGly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro（GRGDSP）、または、0.3mg/mlでのGly-Arg-Gly-Glu-Ser-Pro（GRGESP）と共にTGF-β1を25ng/mlで添加した。PierschbacherおよびRuoslahti, J. Biol. Chem., 292:1794-1798(1987)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、製造業者のプロトコルに従って、Applied Biosystems Peptide Synthesizerでペプチドを合成した。30時間後、培養物を35Ｓ硫酸塩で代謝的に標識し、そして18時間後、馴化培地をSDS-PAGEおよび蛍光光度法によって分析した。フルオログラムをレーザーデンシトメーターでスキャンした。以下のものは、プロテオグリカンバンドの相対的な比重単位を表す。
実施例 IV
腎臓生検材料からの腎臓組織、または、University of Utah Medical Centerの糖尿病患者、または外科手術を行った患者から得た腎摘出試料を研究した。分析は、糖尿病性の腎症の６つの症例、最小の病状変化の３つの症例、薄い基底膜疾患の３つの症例、および正常な腎臓３つを包含していた。４つまたはそれ以上の糸球体が、それぞれの試料には存在し、そして従来の臨床的尺度および病理学的尺度を用いて、最新の研究には加わっていない医師によって、それぞれの症例の診断法が確立された。実験モデルについて実施例IIに記載のように免疫蛍光法顕微鏡検査によって、凍結組織をTGF-β1タンパク質およびフィブロネクチンEDA+の存在について研究した。ヒトおよび動物の研究は、Institutional Review Board of the University of Utah School of Medicineによって承認された。
糖尿病性の糸球体硬化症の６つの症例を示す糸球体の全てが、図５および６に示した２つの症例と同様に、TGF-β1およびフィブロネクチンEDA+に対して強い陽性を示した。組織の定量限界のために、研究をこれら２つのマーカーに限った。それに対して、正常および疾患コントロールの糸球体はそれぞれ、陰性またはほんの微量な染色を示しただけであった（図５および６）。
実施例 Ｖ
組換え体のヒトデコリンによるＴＧＦ−Ｂ１、２、および３の活性の中和
Ａ． 試薬
精製したヒトTGF-β１および２は、R&D Systems（Minneapolis, MN）から得られ、そしてTGF-β３は、National Institutes of HealthのDrs. A. RobertsおよびM. Spornから供与された。
Yamaguchiら、(前出)(この開示内容は、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、チャイニーズハムスターの卵巣細胞系クローン62の培養培地から、組換え体ヒトデコリンを調製した。デコリンを、Q-セファロース上でのイオン交換と、オクチル-セファロース上での疎水クロマトグラフィーとを組み合わせた、改変した手順によって精製した。この手順は、Choiら、J. Biol. Chem. 264:2876(1989)に記載されており、その開示内容は、本明細書中に参考として援用されている。オクチル-セファロースカラムから4M塩酸グアニジンによって溶出した後、調製物をPBS(pH7.4)で透析し、そしてデコリン濃度を１ml当り0.9mgに調整した。
卵白アルブミンおよびウシ血清アルブミンを、Sigma(St. Louis, MO)から得、そしてデコリン精製に使用した条件と同じ条件下で調製した。
Ｂ．細胞培養
増殖阻害を測定するミンク肺細胞のアッセイを、イソ型のTGF-βの活性を中和する組換えデコリンの効力をアッセイするのに使用した。[3Ｈ]チミジンの取り込みをYamaguchiら、（前出）に記載のように、TGF-βの存在、およびデコリン（○）またはウシ血清アルブミン(BSA)(●)の濃度の増加で決定した。TGF-βを、[3Ｈ]チミジンの取り込みを50％阻害する濃度で添加した；これらの濃度は、TGF-β1、TGF-β2、およびTGF-β3に対して、それぞれ0.2ng/ml、0.1 ng/mlおよび0.05ng/mlであった。図７に示したデータは、TGF-β1で誘導された増殖阻害を中和したパーセントを表す。[3Ｈ]チミジンの取り込みが、TGF-βおよびデコリンのどちらにも無い場合を100％と定義する（TGF-β1およびTGF-β3については125,000cpm; TGF-β2については107,000cpm）。TGF-βには取り込みが存在するが、デコリンには存在しない場合を、０％と定義する（TGF-β1については57,000cpm; TGF-β2については78,000cpm; TGF-β3については59,000cpm）。それぞれの点は、二連の試料からの結果の平均を表す。
図７に示したように、デコリンは３種のTGF-βのそれぞれの増殖阻害活性を中和した。
Borderら、Nature 346:371(1990)に記載のように、上記で糸球体腎炎を回復させるのに用いた抗TGF-β1血清もまた、試験した。この抗血清は、TGF-β1を中和したが、TGF-β2もTGF-β3も中和しなかった（データは示さず）。従って、デコリンは、抗TGF-β1よりも、TGF-βに対する広い結合反応活性を有する。
実施例 VI
組換えヒトデコリンの静脈内投与
組換えヒトデコリン、およびウシの組織から精製したデコリンの静脈内投与を、糸球体腎炎のラットの腎臓中にマトリックスが蓄積するのを抑制する、プロテオグリカンの能力を検査するのに用いた。糸球体中に存在するフィブロネクティン量を、糸球体腎炎でのマトリックスの蓄積をブロックするデコリンの能力を評価するために、定量的に用いた。
Ａ．プロトコル
Okuda,ら、(前出)に記載のように、抗胸腺細胞血清を静脈内注射することによって、糸球体腎炎をSprague-Dawleyラット(４−６週齢)に誘起した。同齢のラットを正常コントロールとして使用した。組換えヒトデコリン(これは、実施例Ｖ．Ａ．に記載のように調製された)およびウシデコリンを、以下のプロトコルに従った同定実験以外は、別々に試験した。
８匹のラットを、それぞれ２匹ずつ４つの群に分け、そして抗胸腺細胞血清を注射した。１時間後、PBS 0.5ml中の組換えヒトデコリンまたはウシデコリン0.45mgを、あるいはコントロールとして0.5mlのPBSだけを、１回静脈内注射することにより、治療を開始した（注射するためにラットを押さえつけたが、麻酔はしなかった）。関節の軟骨から、4M塩酸グアニジンおよびプロテアーゼインヒビターで24時間抽出することにより、ウシデコリンを単離した。次いで、実施例Ｖ．Ａ．に記載のように精製した。以下のようにデコリンまたはPBSを１日１回注射することで治療を続けた：デコリンを第１群には２日間、第２群には４日間、第３群には６日間投与した。第４群にはPBSのみを６日間投与した。第１群および第２群においてデコリン投与を中止したとき、PBSを代わりに投与して、全ての動物に６日間注射を行った。７日目に全ての治療を中止し、24時間尿を採取し、その後動物を殺して腎臓を取り出した。
上記プロトコールに従って、以下に示すコントロール調製物を試験した：８匹のラットに抗胸腺細胞血清を注射し、それぞれ２匹ずつの群に分け、そして0.5mlのPBSのみ、またはアグレカン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブミンを含むPBSを、１日１回６日間注射した。アグレカンおよびデコリンの炭水化物含量を決定し、そしてPBS中のアグレカンを、デコリンと同様の炭水化物濃度で注射した。別の４匹のラットには、抗胸腺細胞血清の代わりにPBSを１回注射し、正常なコントロールとして使用した。全ての動物を、上記のように24時間尿を採取した後に殺し、そして尿タンパク質およびクレアチニンを、Okudaら(前出)に記載のように測定した。
全ての技法を行うために、腎臓をインサイチュで冷PBSで灌流し、次いで切除した。腎臓組織を、Okudaら(前出)(これは、本明細書中に参考として援用されている)に記載のように、光および免疫蛍光顕微鏡検査のために調製した。
Ｂ．フィブロネクチン染色
フルオレセインイソチオシアネート結合ヒツジ抗ヒトフィブロネクチンは、Binding Site, Inc. (San Diego, CA)からのものであった。フィブロネクチンに対する免疫蛍光染色を、それぞれの動物から調製したコード部分で不規則に選択した20個の糸球体において、０から４までの尺度（０＝染色されず、４＝最大に濃く染色された）を用いて、組織起源を認識せずに数えた。群の間の相違を、Okudaら(前出)に記載のt試験によって分析した。
Ｃ．EDA+およびテネイシン染色
糸球体を、EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンを検出する抗体で染色した；これらのマトリックス成分はTGF-βによって比較的特異的に誘導される。特別のドメインＡ(EDA+)を含有するヒトフィブロネクチンに対して調製されたマウスモノクローナル抗体は、Dr. L. Zardi, Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Italyより提供された。ウサギ抗ヒトテネイシンを、Telios Pharmaceuticals, Inc.(La Jolla, CA)から得た。フルオレセインイソチオシアネートで結合のラットF(ab')2抗マウスIgGおよびロバF(ab')2抗ウサギIgGを、２次抗体（Jackson Immunoresearch Lab, West Grove, PA）として用いた。マトリックスを数える技法、およびEDA+フィブロネクチンおよびテネイシン染色に対する統計学的分析方法は、上記のフィブロネクチンに対するものと同じである。
Ｄ．結果
図８は、組換えデコリン、またはウシデコリンを４日間あるいは６日間毎日注射することで、フィブロネクチンの蓄積が、正常のラットに見いだされるレベルと大きく違わないレベルにまで抑制されることを示す。コントロール注射物は、緩衝液だけ、異なるプロテオグリカン、および２種のタンパク質から成る。軟骨のプロテオグリカン、アグレガンを、デコリンのグリコサミノグリカン鎖をコントロールする負に帯電した分子として用いた；アグレガンは、Yamaguchiら(前出)に記載のように、TGF-βを阻害しない。卵白アルブミンを、デコリンのコアタンパク質に対するコントロールとして用いた。なぜなら、これらのタンパク質の両者は、ほとんど同じ分子サイズだからである。血清アルブミンを、無関係なタンパク質コントロールとして用いた。図８は、プロテオグリカンおよびタンパク質コントロールが、緩衝液のみを注射した糸球体腎炎ラットとは、区別され得ないことを示す。疾患の早期にデコリンを２回注射することも、フィブロネクチンの蓄積には、何ら効果が無かった。
図９に定量的に示したように、EDA+フィブロネクチンは、正常なラットの糸球体に痕跡量存在するのみであり、テネイシンに対しても、同様の検出物が得られた。結果は、EDA+フィブロネクチンおよびテネイシンの両者が、デコリンを全く注射しない、または２回注射して治療した、ラットの腎炎の糸球体中で、非常に増加したことを示す。しかし、フィブロネクチン全体の場合のように、デコリンを４回または６回注射することにより、TGF-β活性のこれら２つのマーカーの堆積が、非常に減少した（図９）。過ヨウ素酸−シッフで染色した、同じ腎臓の断片の組織学的分析により、疾患中に生じる糸球体中の細胞外マトリックスおよび関連する糸球体腫脹の増加を防止するデコリンに匹敵する効果が示された。
４日間または６日間デコリンを投与することもまた、タンパク尿の進行を抑制した。尿タンパク質濃度と尿のクリアチニン濃度との比を、タンパク尿を評価するのに用いた。なぜなら、この方法はGinsbergら(前出)に記載のように、タンパク質排出量に関する尿量の差の影響を、最小にするからである。正常ラット、疾患コントロールラット、低用量デコリン(２回注射)で治療したラット、および高用量デコリン(４回および６回注射)で治療したラットに対する平均値はそれぞれ、0.7、15.2、14.8、および2.4であった（疾患コントロールに比較した高用量に対して、ｐ＜0.01である）。
これらの結果は、デコリンが、腎炎ラットからの傷ついた糸球体中に、細胞外マトリックスが堆積することを防止するのに、著しい効果をあげることを示す。糸球体腎炎において細胞外マトリックスが蓄積することは、TGF-βの過剰生成が原因であることが、以前に示されている（Okudaら(前出)Borderら、(1990)(前出)）。このモデルにおけるマトリックスの蓄積を、デコリンの注射により防止したことは、TGF-βを抑制するデコリンのインビボにおける活性を証明する。
本発明を、種々の実施態様に関して記載してきたが、本発明の主旨から逸脱することなく種々の改変を施すのは可能である、ということを理解すべきである。従って、本発明は、以下の請求項の範囲によってのみ限定される。
Claims (7)
- ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性を抑制する薬剤の使用することを特徴とする糖尿病性ネフロパシーを防止または治療するための医薬を調製するための方法であって、該薬剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド、バイグリカンおよびフィブロモデュリンからなる群より選択される、方法。
- デコリンまたはバイグリカンの使用することを特徴とする細胞外マトリックスの蓄積により特徴付けられる糖尿病性ネフロパシーを防止または治療するための医薬を調製する方法であって、ここで、該蓄積が、ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性に起因する、方法。
- インスリンおよびＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性を抑制する薬剤の使用を特徴とする、糖尿病性ネフロパシーを防止または治療するための医薬を調製する方法であって、該薬剤は、抗ＴＧＦ−β抗体、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ含有ペプチド、バイグリカンおよびフィブロモデュリンからなる群より選択される、方法。
- インスリンおよびデコリンまたはバイグリカンの使用を特徴とする細胞外マトリックスの蓄積により特徴付けられる糖尿病性ネフロパシーを防止または治療するための医薬を調製する方法であって、ここで、該蓄積が、ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性に起因する、方法。
- デコリンまたはバイグリカンを含む、細胞外マトリックスの蓄積により特徴付けられる糖尿病性ネフロパシーを防止または治療するための薬学的組成物であって、ここで、該蓄積が、ＴＧＦ−βの細胞外マトリックス産生活性に起因する、組成物。
- インスリンおよびデコリンまたはバイグリカンを含む、糖尿病性ネフロパシーを治療するための薬学的組成物。
- 前記薬剤が抗ＴＧＦ−β抗体である、請求項１または３に記載の方法。
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