JP3723517B2 - Electrophoresis device - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動装置に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
分子生物学、生化学、医学、薬学等の分野では、電気泳動装置を用いた各種遺伝子解析等が広く行われている。
【0003】
例えば、IGCR法(In Gel Competitive Reassociation法)は、ガン遺伝子等の探索に極めて有効であり、現在、大きな注目を集めている。この方法は、ゲノムサブトラクション法の一種であり、ゲル(泳動媒体)中で、ゲノムサブトラクションを行うことを大きな特徴とする。
【0004】
このIGCR法は、例えば数kb以上の塩基の欠失等、比較的大きな遺伝子の変異を特定するのに有利である。このため、この方法は、正常細胞の遺伝子とガン細胞の遺伝子との間で、大きな相違を発見する場合等に、極めて有用である。実際に、IGCR法は、胃ガン関連の遺伝子の発見で、実績を挙げている。
このIGCR法の概略を、ガン遺伝子を探索する場合の一例を説明すると、下記のようになる。
【0005】
1)まず、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAと(例えば制限酵素処理されたもの)を用意する。
2)次に、正常細胞由来のDNAをビオチン化する。
【0006】
3)次に、ガン細胞由来のDNAに対して正常細胞由来のDNAがはるかに高い濃度となるように(例えば1:50程度)、ガン細胞由来のDNAと正常細胞由来のDNAとを混合する。
4)次に、この混合物に対して、ゲル電気泳動を行う。
【0007】
5)電気泳動後、ゲルを取り出し、このゲルをアルカリ性の溶液(変性液)に浸漬させた後、ゲルを中性の溶液(会合液)に浸漬させることにより、ゲル中でDNAを変性させた後、再会合させる。
IGCR法の大きな特徴は、工程3)〜5)にある。かかる工程を経ることにより、ガン細胞にのみ特異的に存在する遺伝子を検出、分離することが、可能となる。この原理を、以下、模式的に説明する。
【0008】
例えば、正常細胞は、遺伝子Aと遺伝子Bとを有しているとする。また、ガン細胞は、遺伝子Aと、変異した遺伝子B’とを有しているとする。この遺伝子B’は、遺伝子Bよりも鎖長が短くなっているとする。なお、ガン細胞の遺伝子Aと正常細胞の遺伝子Aとは、同じ(identical)とする。また、遺伝子Aは、遺伝子Bよりも長いものとする。
【0009】
この場合、前記工程4)において電気泳動を行うと、ゲル中で、バンドは、例えば、遺伝子A、遺伝子Bおよび遺伝子B’に分かれることとなる。
【0010】
このとき、遺伝子Aのバンドは、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとを含んでいることとなる。したがって、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとの比は、50:1である。
また、遺伝子Bのバンドは、正常細胞由来のDNAのみを含んでいることとなる。すなわち、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとの比は、100:0である。
これに対し、遺伝子B’のバンドは、ガン細胞由来のDNAのみを含んでいることとなる。すなわち、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとの比は、0:100である。
【0011】
ここで、前記工程5)のDNAの変性、再会合を行うと、遺伝子Aのバンドでは、下記のA1〜A4の4種類の遺伝子が、2500:50:50:1の割合で生成される。
A1:正常細胞由来のDNAのみで構成された遺伝子、
A2:正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとで構成された遺伝子(タイプ1)、
A3:正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとで構成された遺伝子(タイプ2)、
A4:ガン細胞由来のDNAのみで構成された遺伝子。
したがって、遺伝子Aのバンドでは、ガン細胞由来のDNAのみで構成された遺伝子(遺伝子A4)は、極めて少量となる。
【0012】
一方、遺伝子Bのバンドでは、相変わらず、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとの比は、100:0のままである。
同様に、遺伝子B’のバンドでは、正常細胞由来のDNAとガン細胞由来のDNAとの比は、0:100のままである。
【0013】
次いで、ゲルを切り出し、ゲル中からDNAを抽出(回収)し、かかるDNAをアビジンと接触させると、アビジンはビオチンと結合する性質を有しているため、正常細胞由来のDNAを含む遺伝子は、アビジンに吸着される。
これに対し、ガン細胞由来のDNAのみで構成された遺伝子は、アビジンに吸着されない。
【0014】
したがって、遺伝子Bは、前述したように正常細胞由来のDNAのみで構成されているので、アビジンに吸着されることとなる。
これに対し、遺伝子B’は、ガン細胞由来のDNAのみで構成されているので、アビジンに吸着されず、取り出されることとなる。
【0015】
遺伝子Aでは、遺伝子A1、A2およびA3がアビジンに吸着され、遺伝子A4は、アビジンに吸着されない。ところで、前述したように、遺伝子Aでは、A1:A2:A3:A4の割合が、2500:50:50:1となっている。換言すれば、遺伝子A4の存在量は、ごく微量なものとなっている。
【0016】
したがって、アビジンに吸着されず取り出された遺伝子に、例えば、アダプターDNAを結合し、このアダプターDNAと相補的な塩基配列を有するプライマーを用いてPCR法を行い、遺伝子を増幅すると、遺伝子B’だけが、好適に検出されることとなる。
【0017】
このように、IGCR法は、優れた遺伝子探索法である。しかしながら、IGCR法では、人手による工程数が多く、しかも時間のかかる工程が多いため、所要時間が長く(例えば1週間程度)、作業に手間と時間とを要するという欠点がある。
【0018】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、例えばIGCR法における作業の手間と時間とを軽減することができる電気泳動装置を提供することにある。
【0019】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記(1)〜(13)の本発明により達成される。
【0020】
(1) 核酸と、電気泳動性を有するマーカーとを含む検体を電気泳動させる泳動媒体と、
前記泳動媒体へ通電し、かつ、その極性を反転することができる通電手段と、
前記泳動媒体の温度を調整する温度調整手段であって、少なくとも前記泳動媒体を加熱する加熱手段を有する温度調整手段と、
電気泳動された前記マーカーの前記泳動媒体中での位置を検出する検出手段とを備え、
前記通電手段により前記泳動媒体へ通電を行い、前記検体を前記泳動媒体中で電気泳動させることにより、前記核酸を前記泳動媒体中で分離させるとともに、前記検出手段により前記マーカーが前記泳動媒体中の所定位置に到達したのを検出した後、前記泳動媒体への通電を停止し、
次いで、前記加熱手段により前記泳動媒体を加熱した後、前記泳動媒体を冷却することにより、分離後の核酸を前記泳動媒体中で変性させた後、再会合させ、
その後、前記通電手段により極性を反転させて前記泳動媒体へ通電を行い、再会合後の核酸を前記泳動媒体中で前記電気泳動の方向と逆方向に電気泳動させ、前記泳動媒体中から回収するよう構成されていることを特徴とする電気泳動装置。
(2) 核酸と、電気泳動性を有するマーカーとを含む検体を電気泳動させる泳動媒体と、
前記泳動媒体へ通電し、かつ、その極性を反転することができる通電手段と、
前記泳動媒体の温度を調整する温度調整手段であって、前記泳動媒体を加熱する加熱手段と、前記泳動媒体を冷却する冷却手段とを有する温度調整手段と、
電気泳動された前記マーカーの前記泳動媒体中での位置を検出する検出手段とを備え、
前記通電手段により前記泳動媒体へ通電を行い、前記検体を前記泳動媒体中で電気泳動させることにより、前記核酸を前記泳動媒体中で分離させるとともに、前記検出手段により前記マーカーが前記泳動媒体中の所定位置に到達したのを検出した後、前記泳動媒体への通電を停止し、
次いで、前記加熱手段により前記泳動媒体を加熱した後、前記冷却手段により前記泳動媒体を強制的に冷却することにより、分離後の核酸を前記泳動媒体中で変性させた後、再会合させ、
その後、前記通電手段により極性を反転させて前記泳動媒体へ通電を行い、再会合後の核酸を前記泳動媒体中で前記電気泳動の方向と逆方向に電気泳動させ、前記泳動媒体中から回収するよう構成されていることを特徴とする電気泳動装置。
【0021】
(3) 前記マーカーの泳動速度は、前記核酸のうちの最も泳動速度の速いものとほぼ同等であるか、または、前記核酸のうちの最も泳動速度の速いものより若干速い上記(1)または(2)に記載の電気泳動装置。
【0022】
(4) 前記マーカーは、分子量が100〜2000である上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0023】
(5) 前記マーカーは、荷電を帯びた蛍光物質、荷電を帯びた発光物質または荷電を帯びた色素のいずれかである上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0024】
(6) 前記マーカーは、蛍光物質、発光物質または色素のいずれかを核酸に付与したものである上記(1)ないし(4)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0025】
(7) 前記検出手段は、前記泳動媒体へ光を照射する照射手段と、
前記泳動媒体からの光を受光する受光手段とを有する上記(1)ないし(6)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0026】
(8) 前記温度調整手段は、前記泳動媒体の周囲に設けられ、前記泳動媒体に対して熱伝達を行う伝熱部を有する上記(1)ないし(7)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0027】
(9) 前記泳動媒体の長手方向の全長をLとしたとき、前記伝熱部は、前記泳動媒体を、その長手方向の中央から両端に向って、それぞれ、0.45Lの範囲を覆うよう構成されている上記(8)に記載の電気泳動装置。
【0032】
(10) 前記泳動媒体の長手方向の全長をLとしたとき、前記検出手段は、前記マーカーが電気泳動開始位置から0.9L以上の範囲に到達したのを検出する上記(1)ないし(9)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0033】
(11) 前記再会合後の核酸を、核酸吸着剤を用いて回収する上記(1)ないし(10)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0034】
(12) 前記泳動媒体は、複数併設されている上記(1)ないし(11)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0035】
(13) 前記泳動媒体は、中空部材に収納されている上記(1)ないし(12)のいずれかに記載の電気泳動装置。
【0036】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の電気泳動装置を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
【0037】
図1は、本発明の電気泳動装置の実施形態を示す模式図であり、図2は、図1に示す電気泳動装置が備える電気泳動部付近の構成を示す部分縦断面図であり、図3は、図1に示す電気泳動装置が備える上部バッファー槽の構成を示す斜視図であり、図4は、図1に示す電気泳動装置が備える温度調整手段の構成を示す側面図であり、図5は、図1に示す電気泳動装置の動作手順を示すフローチャートである。なお、以下の説明では、図2および図3中、上側を「上端」、下側を「下端」と言う。
【0038】
図1に示す電気泳動装置1は、電気泳動部2と、通電手段3と、温度調整手段4と、制御手段5と、検出手段6とを備えている。
【0039】
以下、電気泳動装置1を、各構成要素ごとに説明する。
図1および図2に示すように、電気泳動部2は、主に、複数(本実施形態では、3つ)の上部バッファー槽(第1のバッファー槽)21と、下部バッファー槽(第2のバッファー槽)22と、これらを支持する基台23とを有する装置本体200と、ゲル(泳動媒体)100を収納した複数(本実施形態では、3つ)の管体(管状の中空部材)20とを有している。
【0040】
各上部バッファー槽21は、それぞれ、泳動媒体100(管体20)に対応して設けられ、上端(上部)に開口を有する箱状の部材で構成されている。これらの上部バッファー槽21の内部(貯留空間)には、それぞれ、例えば、トリスバッファー、トリス・ホウ酸バッファーのようなバッファー液(緩衝液)が貯留されている。
【0041】
バッファー液の液量は、例えば、各上部バッファー槽21に、それぞれ管体20を装着(設置)した状態で、各管体20の上端が液面から突出しない程度とされる。
【0042】
本実施形態では、各上部バッファー槽21の構成は同一であるので、以下では、1つを代表して説明する。
【0043】
上部バッファー槽21は、その長手方向のほぼ中央部に形成され、バッファー液を貯留する貯留空間を、第1の空間210aと第2の空間210bとに画成する隔壁210を有している。
【0044】
第1の空間210aには、後述する通電手段3が備える電極32aがバッファー液に浸る(接触する)ようにして設置され、一方、第2の空間210bには、泳動媒体100(管体20)の上端(一端)が位置している。
【0045】
第1の空間210a側の上部バッファー槽21の底部(底面)211には、装着孔212が厚さ方向(図2および図3中、上下方向)に貫通して形成されている。装着孔212には、管体20を保持する保持部材213が液密に固着(装着)されている。
【0046】
保持部材213は、ほぼ筒状の部材で構成され、下端側には、装着孔212に嵌合可能な装着部213aが形成されている。この装着部213aが装着孔212内に挿入、嵌合することにより、保持部材213は、上部バッファー槽21の底部211に液密に固定(固着)されている。
【0047】
この保持部材213は、特に限定されないが、例えば、各種ゴム材料、各種熱可塑性エラストマー等の弾性材料で構成されている。
【0048】
また、保持部材213の内腔部には、後述する管体20の上端側が挿入(挿通)されている。
【0049】
隔壁210は、第2の空間210b側の厚さが小さくなっており、この部分には、上側(上方)に開放する開口を有する凹部214が形成されている。すなわち、凹部214は、第2の空間210bと連通している。この凹部214内には、ゲル100から離脱したDNA(核酸)を吸着可能な核酸吸着剤(DNA吸着剤)Rが収納(設置)されている。すなわち、本実施形態では、核酸吸着剤Rは、ゲル100と電極32aとの間に設けられている。
【0050】
この核酸吸着剤Rの構成材料としては、例えば、イオン交換樹脂、各種ガラス、アルミナ、リン酸カルシウムのようなセラミックス材料、アモルファスシリカ、アルキルシリカのようなシリカ化合物、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンのような樹脂材料等が挙げられる。これらの中でも、核酸吸着剤Rは、イオン交換樹脂を含む材料で構成されているのが好ましく、イオン交換樹脂を主材料として構成されているものがより好ましい。このような核酸吸着剤Rは、DNAの吸着能が高く、また、かかる核酸吸着剤Rからは、吸着したDNAを容易に回収することができる。
【0051】
また、イオン交換樹脂としては、例えば、アガロース、セルロース、ニトロセルロース等に対して、各種荷電を有する基(例えば、スルフォン基、カルボキシル基、トリメチルアンモニオメチル基等)を導入したものが挙げられ、これらのうちの1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。このようなイオン交換樹脂を用いて核酸吸着剤Rを構成することにより、核酸吸着剤RのDNAの吸着能を、特に優れたものとすることができるとともに、DNAの回収効率を向上させることができる。
【0052】
また、核酸吸着剤Rの形状としては、特に限定されないが、例えば、顆粒状、メッシュ状、スポンジ状等が挙げられ、これらの中でも、特に、顆粒状が好ましい。核酸吸着剤Rを顆粒状とすることにより、DNAの吸着に有効な表面積を増大させることができ、DNAの吸着効率を上昇させることができる。
【0053】
この場合、顆粒状の核酸吸着剤Rの平均粒径は、20〜2000μm程度とするのが好ましく、35〜1000μm程度とするのがより好ましく、50〜150μm程度とするのがさらに好ましい。平均粒径を前記範囲とすることにより、DNAの吸着効率をより向上させることができる。
【0054】
また、隔壁210には、凹部214と第1の空間210aとを連通する連通孔215が形成されている。
【0055】
この連通孔215は、第2の空間210b側より第1の空間210a側が高くなるよう傾斜して形成されている。これにより、顆粒状の核酸吸着剤Rを使用する場合、凹部214内に収納された核酸吸着剤Rが第1の空間210a側に流出するのを好適に防止することができる。
【0056】
この場合、連通孔215と上部バッファー槽21の底部211とのなす角度(図3中θ)は、特に限定されないが、45〜80°程度とするのが好ましく、60〜80°程度とするのがより好ましい。これにより、前記効果がより向上する。
【0057】
また、連通孔215の内径は、特に限定されないが、例えば、1〜5mm程度とされる。
【0058】
このような上部バッファー槽21は、複数(3つ)が一体化され、その両側部(図2中、紙面奥側および紙面手前側)には、対向配置された脚部216、216が、図示しない接続部を介して基台23に連結(設置)されている。これにより、各上部バッファー槽21は、基台23に固定されている。
【0059】
基台23は、各上部バッファー槽21、下部バッファー槽22および後述する伝熱ブロック42を支持するためのものであり、平板状の部材で構成されている。
【0060】
この基台23の上端(上面)には、下部バッファー槽22が設置されている。下部バッファー槽22は、箱状の部材で構成されている。この下部バッファー槽22の内部には、バッファー液(緩衝液)が貯留されており、後述する通電手段3が有する電極32bがバッファー液に浸る(接触する)ようにして設置されている。
【0061】
このバッファー液は、前記の上部バッファー槽21の内部に収納されるバッファー液で挙げたものと同様のものを用いることができる。
【0062】
下部バッファー槽22の上端縁部付近(図2中、右上側)には、上方に向って突出する導入口221が一体的に形成されており、この導入口221を介して、下部バッファー槽22内にバッファー液を導入(収納)することができる。
【0063】
また、下部バッファー槽22の上端(上面)には、複数の挿通孔222が厚さ方向(図2中、上下方向)に貫通して形成されている。各挿通孔222には、それぞれ、管体20の下端側が挿入(挿通)されている。
【0064】
なお、この状態で、下部バッファー槽22内には、管体20の下端が浸る程度の液量のバッファー液が貯留されている。
【0065】
この下部バッファー槽22、前記の各上部バッファー槽21および前記の基台23の構成材料としては、特に限定されないが、それぞれ、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ−(4−メチルペンテン−1)、ポリカーボネート、アクリル樹脂、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ブタジエン−スチレン共重合体、ポリアミド(例えば、ナイロン6、ナイロン6・6、ナイロン6・10、ナイロン12)のような各種樹脂材料を用いることができる。
【0066】
なお、下部バッファー槽22および各上部バッファー槽21は、内部の視認性を確保するために、それぞれ、実質的に透明であるのが好ましい。
【0067】
各上部バッファー槽21と下部バッファー槽22との間には、複数(本実施形態では、3本)の管体(管状の中空部材)20が、それぞれ、保持部材213を介して上部バッファー槽21に固定、支持(設置)され、その一端が上部バッファー槽21内に貯留されたバッファー液に接触し、その他端が下部バッファー槽22内に貯留されたバッファー液に接触している。
【0068】
この管体20の構成材料としては、特に限定されないが、熱伝達に優れているという点、および、十分な強度が得られるという点において、例えば、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレン等の各種樹脂材料、各種ガラス材料等が好ましく用いられる。
【0069】
管体20の寸法としては、特に限定されないが、例えば、内径が3〜8mm程度、外径が5〜10mm程度とされる。
【0070】
各管体20の内部には、ゲル(泳動媒体)100が充填(収納)され、それぞれ、所定距離(例えば、10〜40mm程度)離間して併設されている。換言すれば、複数のゲル100が所定距離離間して併設されている。このように複数のゲル100を併設することにより、電気泳動装置1は、一度に処理できる検体の量を増大させることができる。
【0071】
また、各管体20の上端部内側には、それぞれ、ゲル100が充填されていない部分が設けられており、該部分には、検体が充填(アプライ)される。
【0072】
ゲル100は、例えば、アクリルアミド、アガロース等で構成され、DNA(核酸)を含む検体を電気泳動させ、これにより、DNAを鎖長の差(分子量の差)により分離させる。
【0073】
このゲル100は、管体20に収納されることにより、ほぼ円柱状(棒状)をなしている。
【0074】
ゲル100の長手方向の全長(図2中、長さL)は、特に限定されないが、通常、10〜1000mm程度であるのが好ましく、50〜200mm程度であるのがより好ましく、100〜150mm程度であるのがさらに好ましい。ゲル100の長手方向の全長をこのような範囲内とすることにより、DNAを好適に分離させることができる。
【0075】
また、検体には、電気泳動性を有するマーカーが含まれている。このようなマーカーを検体中に添加しておくと、検体を電気泳動させた際に、電気泳動されたマーカーのゲル100中での位置を検出することにより、検体中に含まれるDNA(DNA断片)の分離が正常に進行しているのか否かを正確に把握することができる。
【0076】
特に、マーカーは、その泳動速度(電気泳動性)が、検体中に含まれるDNAのうちの最も泳動速度の速い(電気泳動性が高い)ものと、ほぼ同等であるか、または、これより若干速いのが好ましい。このようなマーカーを用いれば、かかるマーカーが先行してゲル100中を移動する(電気泳動される)ので、このマーカーのゲル100中での位置を検出することにより、電気泳動を終了するタイミング(ゲル100への通電を停止するタイミング)を的確に把握すること、すなわち、DNA(DNA断片)を必要かつ十分に分離させた状態で電気泳動を終了することができる。
【0077】
この場合、マーカーの分子量は、特に限定されないが、100〜2000程度であるのが好ましく、300〜800程度であるのがより好ましい。前記範囲の分子量のマーカーを用いることにより、前記効果をより向上させることができる。
【0078】
このようなマーカーとしては、荷電を帯びた(負に帯電した)蛍光物質、荷電を帯びた発光物質、または、荷電を帯びた色素(例えば、ブロモフェノールブルー等)のいずれか、あるいは、蛍光物質、発光物質または色素のいずれかを核酸に付与(例えば、結合等)したものが好適に使用される。かかるマーカーを使用することにより、大がかりな装置を必要とせず、比較的容易にマーカーのゲル100中での位置(泳動位置)を検出することができる。なお、マーカーとしては、放射性物質を核酸に付与したもの等の各種標識化物質を用いることもできる。また、マーカーに用いる核酸としては、例えば、DNA、RNA、合成オリゴヌクレオチド等のいずれであってもよい。
【0079】
マーカーとして、蛍光物質、発光物質または色素のいずれかを核酸に付与したものを用いる場合、核酸自体が荷電を帯びているため、核酸に付与する蛍光物質、発光物質および色素は、それぞれ、荷電を帯びたもの、そうでないもののいずれであってもよい。これらの具体例としては、特に限定されないが、例えば、次のようなものが挙げられる。
【0080】
蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、置換ローダミンイソチオシアネート(XRITC)、ローダミンBイソチオシアネート、ジクロロトリアジンフルオレセイン(DTAF)、Cy3、Cy5等が挙げられる。
【0081】
また、発光物質としては、例えば、ルミノール、イソルミノール、アルリジウムエステル、または、これらの誘導体等が挙げられる。
【0082】
また、色素としては、例えば、フタロシアニン系顔料、アゾ系顔料、アントラキノン系顔料、アゾメチン系顔料、キノフタロン系顔料、イソインドリン系顔料、ニトロソ系顔料、ペリノン系顔料、キナクリドン系顔料、ペリレン系顔料、ピロロピロール系顔料、ジオキサジン系顔料のような顔料、アゾ系染料、アントラキノン系染料、インジゴイド系染料、トリフェニルメタン系染料、ピラゾロン系染料、スチルベン系染料、ジフェニルメタン系染料、キサンテン系染料、アリザリン系染料、アクリジン系染料、キノンイミン系染料、金属錯体色素のような染料等が挙げられる。
【0083】
なお、前述したようなマーカーは、必要に応じて任意の2種以上を組み合わせて用いるようにしてもよい。
【0084】
そして、この電気泳動されたマーカーのゲル100中での位置(泳動位置)は、検出手段6により検出される。
【0085】
このマーカーの検出位置は、ゲル100の長手方向の全長をLとしたとき、電気泳動開始位置から0.9L以上の範囲とするのが好ましく、0.95以上の範囲とするのがより好ましい。前記範囲にマーカーが到達したのを検出した後、電気泳動を終了するようにすることにより、DNA(DNA断片)をより精度よく分離させることができる。
【0086】
この検出手段6は、図1および図2に示すように、ゲル100へ光(例えば、レーザー光)を照射する光源(照射手段)61と、ゲル100からの光を受光(検知)する受光素子(受光手段)62とを有している。
【0087】
光源61は、後述する伝熱ブロック42の側部下方の所定位置に設置されている。光源61から照射された光は、伝熱ブロック42に形成され、挿通孔421に連通する側孔422(図1参照)を通過してゲル100に入射する。
【0088】
照射光の波長は、用いるマーカーの種類等により適宜選択され、特に限定されない。
【0089】
また、照射光としてレーザー光を用いる場合、光源61としては、例えば、半導体レーザー、固定レーザー、気体レーザー、色素レーザー、エキシマレーザー、自由電子レーザー、色中心レーザー等を用いることができる。
また、照射光は、連続光、パルス光のいずれであってもよい。
【0090】
なお、本実施形態では、照射手段は、光源61で構成されているが、これに限定されず、例えば、光源61とゲル100との間に照射光の光量(照射強度)を調整するフィルター(光学フィルター)等を有するような構成であってもよい。
【0091】
また、マーカーとして、荷電を帯びた発光物質、あるいは、発光物質を核酸に付与したものを用いる場合には、光を受けることを必要とせず、発光物質自体が光を発するため、光源61は、省略してもよい。
【0092】
受光素子62は、ゲル100からの光を受光し、光電変換して、受光光量に応じた信号を出力する。具体的には、受光素子62は、▲1▼マーカーとして、荷電を帯びた蛍光物質または発光物質、あるいは、蛍光物質または発光物質を核酸に付与したものを用いる場合には、マーカーから発せられた蛍光光(またはりん光光)を、また、▲2▼マーカーとして、荷電を帯びた色素または色素を核酸に付与したものを用いる場合には、特定の波長の光の一部がマーカーにより吸収され、光量が変化した照射光を、それぞれ、受光することとなる。
【0093】
この受光素子62は、高さ方向において光源61に対応した位置で、かつ、光源61とほぼ90°をなす位置に設置されている。ゲル100からの光は、後述する伝熱ブロック42に形成され、挿通孔421に連通する側孔423(図2参照)を通過して受光素子62に入射する。
【0094】
なお、本実施形態では、受光手段は、受光素子62で構成されているが、これに限定されず、例えば、ゲル100と受光素子62との間に、ゲル100からの光を集光するレンズ、集光された光の光量を調整する絞り等を有するような構成であってもよい。
【0095】
また、受光素子62は、高さ方向において光源61に対応した位置に設けられていればよく、本実施形態の場合、ゲル100の周方向に対しては、図示の構成に限らず、任意の位置に設置可能である。
【0096】
また、光源61および受光素子62は、固定されていてもよいし、上下方向に移動可能に設置されていてもよい。後者の場合、これらは、互いに対応して上下方向に移動可能に設置すればよい。また、この場合、検体中に、前記マーカーとは別に、種々の分子量を有するマーカーを添加しておき、これらのマーカーを検出(スキャン)することにより、例えばDNAの分離が正常に行われているか否かをより正確に把握できるという利点がある。
【0097】
さて、ゲル100は、通電手段3により通電される。
この通電手段3は、ゲル100へ通電し、かつ、その極性を反転することができるものであり、図1に示すように、泳動用電源部31と、各上部バッファー槽21に対応して設けられた複数の電極(個別電極)32aと、これらに対向する電極(共通電極)32bとを備えている。これらの泳動用電源部31と、各電極32aおよび電極32bとは、それぞれ、導線により、接続されている。
【0098】
各電極32aおよび電極32bは、それぞれ、例えば、金属(アルミニウム等)などの導電性材料で構成されている。また、前述したように、各電極32aは、それぞれ上部バッファー槽21(第1の空間210a)内に、電極32bは、下部バッファー槽22内に設置されている。
【0099】
また、ゲル100は、温度調整手段4により温度が調整される。
温度調整手段4は、図4に示すように、ゲル100を加熱する加熱手段43と、ゲル100を冷却する冷却手段44と、加熱手段43および冷却手段44とゲル100との間で熱伝達を行う伝熱ブロック(伝熱部)42と、ゲル100の温度を検知する温度感知手段45とを有している。
【0100】
なお、後述する加熱手段43が有するドライバー432と、冷却手段44が有するドライバー444と、温度感知手段45が有するA/Dコンバーター452とで、温度調整手段4の温度コントローラー41が構成されている。
【0101】
この温度調整手段4は、加熱手段43によりゲル100を加熱した後、冷却手段44によりゲル100を強制的に冷却することにより、ゲル100中でDNAを変性させた後、再会合させる。
【0102】
加熱手段43は、発熱し、ゲル100を加熱する面ヒーター431と、コンピューター51からの信号に基づき、面ヒーター431を駆動、制御するドライバー432とを有している。
【0103】
冷却手段44は、ゲル100等からの熱を放熱して、ゲル100を冷却する冷却器441と、冷却器441を駆動するドライバー444とを有している。
【0104】
冷却器441は、ゲル100等からの熱を放熱するヒートシンク442と、ヒートシンク442での放熱を促進するファン443とを有している。
【0105】
ヒートシンク442は、例えば、金属(アルミニウム等)などの熱伝導性の物質で構成されている。このヒートシンク442は、例えば薄板が多数立設されたような構成の放熱部446を有している。この放熱部446では、表面積、すなわちヒートシンク442と空気との接触面積が増大しており、熱が効率よく、大気に放出されるようになっている。
【0106】
このような放熱を、ファン443は、促進することができる。ファン443は、風を発生させる羽根448と、羽根448を回転させるモーター447とを有している。ファン443が駆動する場合には、ヒートシンク442に埋設されたモーター447が回転し、この駆動力が羽根448に伝達される。その結果、羽根448が回転し、風が生じる。そして、この風により、放熱部446での放熱が、促進される。
【0107】
ヒートシンク442の放熱部446と反対側の面には、前述した面ヒーター431が、ヒートシンク442に密着するように設けられている。さらには、温度調整手段4では、この面ヒーター431に密着するように、伝熱ブロック42が設けられている。
【0108】
伝熱ブロック42は、面ヒーター431で発生した熱を、ゲル100に伝達し、また、ゲル100の熱をヒートシンク442に伝達することができる。この伝熱ブロック42は、例えば、金属(アルミニウム等)などの熱伝導性の物質で構成されている。
【0109】
このような伝熱ブロック42を介して、温度感知手段45は、ゲル100の温度を検知することができる。温度感知手段45は、ゲル100の温度を検知する温度センサー451と、温度センサーからのアナログ信号をデジタル信号に変換するA/Dコンバーター452とを有している。この温度感知手段45では、温度センサー451は、伝熱ブロック42に埋設されるように、設置されている。このため、温度センサー451は、伝熱ブロック42の温度を直接検知することができる。これにより、伝熱ブロック42の温度はゲル100の温度とほぼ対応しているので、温度センサー451は、ゲル100の温度を検知することができる。
【0110】
また、伝熱ブロック42の面ヒーター431と反対側の部分には、その長手方向(図2中、上下方向)に貫通して、複数(本実施形態では、3つ)の挿通孔421が形成されている。各挿通孔421は、それぞれ、その内径が管体20の外径とほぼ等しく設定され、その内部には、管体20が挿通されている。すなわち、伝熱ブロック42は、各ゲル100の全周(周囲)を囲むように設けられている。
【0111】
これにより、ゲル100を周方向に均等(均一)に加熱および冷却することができるので、分離されたDNA間での変性および再会合を均一に行うことができる。
【0112】
また、伝熱ブロック42は、ゲル100中で分離されたDNA(バンド)が存在する範囲にほぼ対応して、ゲル100の長手方向の範囲を覆うように構成されているのが好ましい。
【0113】
すなわち、伝熱ブロック42は、その長手方向の長さは、特に限定されないが、例えば、ゲル100の長手方向の全長をLとしたとき、ゲル100を、その長手方向の中央から両端(上端および下端)に向って、0.45L程度の範囲(図2中、長さMの範囲)を覆うように構成されているのが好ましく、0.4L程度の範囲を覆うように構成されているのがより好ましい。
【0114】
これにより、ゲル100を長手方向に均等(均一)に加熱および冷却を行うことができるので、分離されたDNA(バンド)間で、均等(均一)に変性および再会合させることができる。
【0115】
また、本実施形態では、伝熱ブロック42を、ゲル100の全周を囲むように設け、かつ、ゲル100中で分離されたDNAが存在する範囲にほぼ対応して、ゲル100の長手方向の範囲を覆うように構成したことにより、これらの相乗効果により、分離されたDNA(バンド)間で、均等(均一)、迅速かつ確実に変性および再会合させることができる。
【0116】
以上のように、本実施形態では、温度調整手段4は、加熱手段43と冷却手段44とを有しているが、本発明では、冷却手段44は、省略されていてもよい。この場合、温度調整手段4は、加熱手段43によりゲル100を加熱した後、加熱手段43によるゲル100の加熱を停止して、ゲル100を放冷(自然冷却)することにより、ゲル100中で、DNAを変性させた後、再会合させることができる。
【0117】
なお、本実施形態のように、冷却手段44によりゲル100を強制的に冷却する場合には、ゲル100を放冷(自然冷却)する場合に比べて、変性後のDNAをより迅速かつ効率よく(精度よく)再会合させることができるという利点がある。
【0118】
以上述べた通電手段3、温度調整手段4および検出手段6は、それぞれ、コンピューター51で構成された制御手段5により、制御される。
【0119】
コンピューター51には、通電手段3の泳動用電源部31と、温度調整手段4の温度コントローラー41(ドライバー432、ドライバー444、A/Dコンバーター452)と、検出手段6の光源61および受光素子62とが、それぞれ、信号線を介して接続されている。
【0120】
コンピューター51は、泳動用電源部31を制御して、各電極32aと電極32bとの間に電圧を印加することにより、ゲル100に通電し、また、泳動用電源部31を制御して、各電極32aと電極32bとの極性を反転することができる。
【0121】
また、コンピューター51は、ドライバー432およびドライバー444を介して、面ヒーター431およびファン443を制御することができる。また、コンピューター51は、A/Dコンバーター452を介して、温度センサー451から、ゲル100の温度情報を、取得することができる。
【0122】
また、コンピューター51は、光源61を制御して、ゲル100へ光を照射する。また、コンピューター51は、受光素子62からの出力信号を取得することができる。
【0123】
以下、図5を参照しつつ、電気泳動装置1の使用方法(作用)について、IGCR法を実施する場合を一例に説明する。
【0124】
[1] まず、IGCR法を行う作業者(電気泳動装置1の使用者)は、ゲル100が充填(収納)された管体20を、図2に示すように、各上部バッファー槽21と下部バッファー槽22との間に設置して、図示しない電源スイッチをオンする。これにより、電気泳動装置1を使用可能な状態(作動状態)として、電気泳動装置1の準備を完了する。
【0125】
また、作業者は、DNA(核酸)と、マーカーとして、例えば蛍光物質を付与したDNA(分子量:約700)とを含むサンプル(検体)を用意する。このサンプルは、検査対象となる細胞由来のDNAと正常細胞由来のDNA(例えば制限酵素処理されたもの)とを、例えば1:50程度の比で含んでいる。このときのDNAの濃度は、電気泳動を行うサンプル量によっても若干異なるが、0.1〜100μM程度とするのが好ましい。
なお、正常細胞由来のDNAには、ビオチン化が施されている。
【0126】
[2] 次に、作業者は、コンピューター51を操作して、後述する各工程[4]〜[10]における諸条件(各種設定条件)を入力する。
【0127】
[3] 次に、作業者は、前記工程[1]で用意したサンプルを各管体20の上端部内側(ゲル100の上面)に充填(アプライ)する。
【0128】
[4] 次に、作業者が開始ボタン(図示せず)を押圧操作すると、コンピューター51は、通電手段3の泳動用電源部31を駆動する(図5のステップS101)。
【0129】
泳動用電源部31は、コンピューター51からの信号に基づいて、各電極32aが陰極(負極)、電極32bが陽極(正極)となるように、各電極32aと電極32bとの間に所定電圧(定電圧)を印加して、ゲル100へ通電する。
【0130】
この所定電圧は、ゲルの組成等により適宜設定され、特に限定されないが、25〜100V程度とするのが好ましい。
【0131】
これにより、サンプル(DNAおよびマーカー)をゲル100中で下方(下端)に向かって電気泳動(移動)させ、DNAをそれらの鎖長の差(分子量の差)により、ゲル100中で分離させる。このとき、これらの分離されたDNA(DNA断片)は、それぞれ、ゲル100中でバンド(泳動バンド)を形成する。
【0132】
なお、泳動用電源部31は、各電極32aと電極32bとの間を定電圧に維持(保持)するのに代わり、ゲル100に所定電流(定電流)を流すように制御(設定)されていてもよい。
【0133】
この場合、この所定電流は、特に限定されないが、1〜10mA程度とするのが好ましい。
【0134】
[5] 次に、所定時間が経過すると、コンピューター51は、検出手段6の光源61を駆動する(図5のステップS102)。
【0135】
光源61は、例えば所定波長のレーザー光を発生、出射する。そして、このレーザー光は、側孔422を通過してゲル100の所定位置に入射する。
【0136】
次いで、ゲル100のレーザー光が入射している位置にまで、マーカーが到達する(電気泳動される)と、マーカーにレーザー光が当たる。
【0137】
このとき、マーカーが有する蛍光物質は、レーザー光を吸収して、励起状態となる。その後、励起状態の蛍光物質が基底状態に戻る際に、蛍光光(またはりん光光)を発生する。
【0138】
マーカーから発せられた蛍光光(ゲル100からの光)の一部は、側孔423を通過して受光素子62に入射する。受光素子62は、蛍光光を受光し、光電変換して、受光光量に応じた信号をコンピューター51に送信(出力)する。
【0139】
なお、レーザー光のゲル100への照射は、前記工程[4]とほぼ同時に開始するようにしてもよい。
【0140】
[6] 次に、コンピューター51は、受光素子62からの出力信号を取得すると、通電手段3の泳動用電源部31および検出手段6の光源61の駆動を停止する(図5のステップS103)。
【0141】
泳動用電源部31は、各電極32aと電極32bとの間への電圧の印加を停止して、ゲル100への通電を停止する。これにより、DNAおよびマーカーのゲル100中での電気泳動を停止させる。
【0142】
[7] 次に、コンピューター51は、温度調整手段4の温度コントローラー41を駆動する(図5のステップS104)。
【0143】
まず、ドライバー432は、コンピューター51からの信号に基づいて、面ヒーター431を駆動し、発熱させる。面ヒーター431で発生した熱は、伝熱ブロック42および管体20を介して、ゲル100に伝達され、ゲル100を加熱する。
【0144】
これにより、ゲル100中で分離後のDNAを変性させ、一本鎖のDNAを生成させる。
【0145】
その後、ゲル100の温度が所定温度(設定温度)に近づいたら、ドライバー432は、コンピューター51からの信号に基づいて、面ヒーター431の出力を弱める。
【0146】
さらに、ゲル100の温度が所定温度に到達したら、ドライバー432は、コンピューター51からの信号に基づいて、面ヒーター431の駆動を停止する。
【0147】
なお、この所定温度(最高温度)は、特に限定されないが、60〜90℃程度とするのが好ましい。また、ゲル100の温度を、前記の温度範囲に保持する時間は、特に限定されないが、30秒〜30分程度とするのが好ましい。これにより、分離後のDNAを効率よく(精度よく)変性させることができる。
【0148】
次いで、ドライバー444は、コンピューター51からの信号に基づいて、ファン443を駆動し、ヒートシンク442による放熱を促進させる。ゲル100の熱は、管体20および面ヒーター431を介して、ヒートシンク442に伝達される。
【0149】
そして、この熱は、放熱部446から、発散される。このとき、ファン443が回転していると、羽根448から放熱部446に風が送られてくる。この風により、放熱部446では、放熱が促進され、ゲル100からヒートシンク442への熱移動も促進される。
【0150】
これにより、ゲル100の温度を徐々に低下させ、このゲル100の温度低下に伴って、変性後のDNA(一本鎖のDNA)を再会合(ハイブリダイズ)させる。
【0151】
その後、ゲル100の温度が所定温度に近づいたら、ドライバー444は、コンピューター51からの信号に基づいて、ファン443の駆動を停止する。
【0152】
[8] 次に、コンピューター51は、ゲル100の温度が所定温度に達したら、温度調整手段4の温度コントローラー41の駆動を停止する(図5のステップS105)。
【0153】
なお、所定温度(最低温度)は、特に限定されないが、40℃以下とするのが好ましく、10〜40℃程度とするのがより好ましい。これにより、変性後のDNAを効率よく(精度よく)再会合させることができる。
【0154】
[9] 次に、コンピューター51は、通電手段3の泳動用電源部31を駆動する(図5のステップS106)。
【0155】
泳動用電源部31は、コンピューター51からの信号に基づいて、電極32bが陰極(負極)、各電極32aが陽極(正極)となるように(極性を反転させて)、各電極32aと電極32bとの間に所定電圧(定電圧)を印加して、ゲル100へ通電する。
【0156】
すなわち、泳動用電源部31は、前記工程[4]における電気泳動の方向と逆方向に、ゲル100へ通電する。
【0157】
この所定電圧は、特に限定されないが、25〜100V程度とするのが好ましい。
【0158】
これにより、再会合後のDNAを、ゲル100中で上方(上端)に向かって電気泳動させ、それぞれ、各ゲル100中から各上部バッファー槽21のバッファー液中に放出させる。
【0159】
各電極32aと電極32bとの間への電圧の印加を継続すると、各ゲル100から離脱した再会合後のDNAは、それぞれ、各上部バッファー槽21内のバッファー液中を、各電極32aに向かって移動する(引き寄せられる)。すなわち、再会合後のDNAは、第2の空間210bから、凹部214および連通孔215を介して、第1の空間210aへ移動しようとする。
【0160】
このとき、凹部214内には、核酸吸着剤Rが収納(設置)されているので、再会合後のDNAは、凹部214を通過する際に、核酸吸着剤Rに順次吸着される。
【0161】
このように、核酸吸着剤Rを、ゲル100と電極32aとの間で、かつ、ゲル100から離脱した再会合後のDNAが電極32aに移動する移動路(凹部214および連通孔215)の途中に設けることにより、より確実に再会合後のDNAを核酸吸着剤Rに吸着させることができる。
【0162】
なお、泳動用電源部31は、各電極32aと電極32bとの間を定電圧に維持(保持)するのに代わり、ゲル100に所定電流(定電流)を流すように制御(設定)されていてもよい。
【0163】
この場合、この所定電流は、特に限定されないが、1〜10mA程度とするのが好ましい。
【0164】
[10] 次に、所定時間が経過すると、コンピューター51は、通電手段3の泳動用電源部31の駆動を停止する(図5のステップS107)。
【0165】
泳動用電源部31は、各電極32aと電極32bとの間への電圧の印加を停止して、ゲル100への通電を停止する。
【0166】
なお、この所定時間は、ゲルの組成等により適宜設定され、特に限定されないが、0.5〜2時間程度とするのが好ましい。
【0167】
[11] 次に、作業者は、各上部バッファー槽21の核酸吸着剤Rを、それぞれ、別に用意した容器(図示せず)に回収して、再会合後のDNAを抽出する操作を行う。
【0168】
これは、核酸吸着剤Rと、高い塩濃度(例えば、0.01〜10mol/L程度)のバッファー液とを接触させることにより行うことができる。これにより、再会合後のDNAは、核酸吸着剤Rから遊離(離脱)して、バッファー液中に移行する。
【0169】
なお、このバッファー液としては、前述したようなバッファー液と同様の組成のものを用いることができる。
【0170】
このように、核酸吸着剤Rを用いて、再会合後のDNAの回収を行うことにより、この回収操作をより迅速に行うことができ、IGCR法における作業の時間の短縮に有利である。また、ゲル100から離脱した再会合後のDNAを、無駄なく回収することもできる。
【0171】
さらに、作業者は、再会合後のDNAを含むバッファー液をアビジンと接触させ、アビジンに吸着されず取り出された再会合後のDNAをPCR法に供する。
【0172】
以上説明したように、本実施形態の電気泳動装置1では、通電手段3によりゲル100へ通電を行い、サンプルをゲル100中で電気泳動させることにより、DNAをゲル100中で分離させるとともに、検出手段6によりマーカーがゲル100中の所定位置に到達したのを検出した後、ゲル100への通電を停止し、次いで、加熱手段43によりゲル100を加熱した後、冷却手段44によりゲル100を強制的に冷却することにより、分離後のDNAをゲル100中で変性させた後、再会合させ、その後、通電手段3により極性を反転させてゲル100へ通電を行い、再会合後のDNAをゲル100中で前記電気泳動の方向と逆方向に電気泳動させ、ゲル100から離脱した再会合後のDNAを核酸吸着剤Rに吸着させて回収するよう構成(制御)されている。
【0173】
特に、マーカーがゲル100中の所定位置に到達したのを検出した後、DNAのゲル100中での電気泳動を終了(すなわち、ゲル100への通電を停止)するよう構成することにより、単に所定時間が経過した時点で、かかる操作を終了する場合に比べて、ゲル100中でのDNAの分離をより精度よく行うことができる。
【0174】
また、DNAのゲル100中での電気泳動を時間設定により終了する場合には、用いるゲル100の組成、濃度等により、適宜(その都度)、時間設定の変更が必要となるといった手間を要するが、マーカーがゲル100中の所定位置に到達したのを検出した後、DNAのゲル100中での電気泳動を終了するよう構成することにより、かかる手間を省略することができるという利点もある。
【0175】
また、再会合後のDNAを電気泳動により強制的にゲル100中から放出させるように構成することにより、別途、ゲル100から再会合後のDNAを抽出する操作を省略することができ、再会合後のDNAをより迅速かつ確実にゲル100中から回収することができる。
【0176】
また、再会合後のDNAを電気泳動させる方向は、DNAを分離させる際の電気泳動の方向と同一方向としてもよいが、再会合後のDNAを電気泳動させる方向を、DNAを分離させる際の電気泳動の方向と逆方向とすることにより、泳動速度の遅い(移動度の小さい)DNAのゲル100中での泳動距離を短くすることができるので、再会合後のDNAをさらに迅速にゲル100中から放出させることができる。
【0177】
また、再会合後のDNAを電気泳動させる方向を、DNAを分離させる際の電気泳動の方向と逆方向とすることにより、ゲル100へのサンプルのアプライと、ゲル100中からの再会合後のDNAの放出(回収)とを同じ側(すなわち、上部バッファー槽21のバッファー液中)とし、かつ、上部バッファー槽21をゲル100に対応するように独立して複数設けたので、複数の異なる種類の(異なる被験者からの)サンプルを同時に処理することができるという利点がある。
【0178】
なお、同一の種類の(同一の被験者からの)サンプルを処理する場合には、上部バッファー槽21は、1つの共通のものであってもよい。この場合、多量のサンプルを処理することができるという利点がある。
【0179】
また、同一の種類のサンプルを処理する場合、再会合後のDNAを電気泳動させる方向を、DNAを分離させる際の電気泳動の方向と同一方向として、再会合後のDNAをゲル100中から下部バッファー槽22のバッファー液中に放出させるようにしてもよい。この場合、核酸吸着剤Rは、下部バッファー槽22内において、各ゲル(泳動媒体)100と電極32bとの間に位置するように設置すすればよい。
【0180】
このような電気泳動装置1は、コンピューター51(制御手段5)の制御により、ゲル100中でのDNAの分離および終了、ゲル100中での分離後のDNAの変性および再会合、および、再会合後のDNAのゲル100中からの回収を行うことができるため、IGCR法における作業の手間と時間とを軽減することができ、IGCR法の実施の自動化に貢献する。
【0181】
また、このような電気泳動装置1は、ゲル100中でDNAを分離させる工程(前記工程[4]〜[6])、ゲル100中で分離後のDNAを変性および再会合させる工程(前記工程[7]および[8])、および、再会合後のDNAをゲル100中から回収する工程(前記工程[9]および[10])における諸条件(各種設定条件)が、コンピューター51(制御手段5)により好適に制御されているので、前記の各工程における時間短縮および精度の向上を図ることができる。
【0182】
以上、本発明の電気泳動装置を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明は、これに限定されるものではなく、例えば、各部の構成は、同様の機能を発揮し得る任意の構成のものに置換することができる。
【0183】
泳動媒体は、例えば、親水性ポリマー、バッファー液(緩衝液)を含浸させた吸水性材料等で構成することもできる。
【0184】
また、泳動媒体は、図示の構成では、3つ設置されていたが、これに限定されず、泳動媒体の設置数としては、例えば、1つ、2つ、または4つ以上であってもよい。
【0185】
また、泳動媒体の全体形状としては、円柱状(棒状)のものに限定されず、例えば、平板状のもの等であってもよい。
【0186】
また、検出手段は、図示の構成では、1つの泳動媒体にのみ対応して設置されていたが、複数の泳動媒体のそれぞれに対応して、複数設置するようにしてもよい。
【0187】
また、温度調整手段が有する冷却手段には、例えば、ペルチェ素子等を用いてもよい。
【0188】
なお、以上述べた説明では、DNAを核酸の代表として説明したが、本発明では、例えば、RNA、合成オリゴヌクレオチド等、DNA以外の核酸を用いることもできる。
【0189】
また、本発明の電気泳動装置は、IGCR法を実施する場合のみでなく、各種遺伝子解析等を実施する場合に使用することができることは、言うまでもない。
【0190】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の電気泳動装置によれば、例えばIGCR法における作業の手間と時間とを軽減することができ、特に、その実施の自動化に貢献する。
【0191】
特に、マーカーが泳動媒体中の所定位置に到達したのを検出した後、泳動媒体への通電を停止するよう構成することにより、泳動媒体中での核酸の分離をより精度よく行うことができる。
【0192】
また、温度調整手段により泳動媒体の温度を調整する前後において、通電手段がその極性を反転させるよう構成することにより、核酸の回収に要する時間を短縮することができる。
【0193】
また、泳動媒体を複数設置した場合には、一度に処理することができる検体の数や量を増大させることができる。
【0194】
このようなことから、本発明の電気泳動装置を用いることにより、例えばガン遺伝子等の探索を、より迅速かつ効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の電気泳動装置の実施形態を示す模式図である。
【図2】図1に示す電気泳動装置が備える電気泳動部付近の構成を示す部分縦断面図である。
【図3】図1に示す電気泳動装置が備える上部バッファー槽の構成を示す斜視図である。
【図4】図1に示す電気泳動装置が備える温度調整手段の構成を示す側面図である。
【図5】図1に示す電気泳動装置の動作手順を示すフローチャートである。
【符号の説明】
1 電気泳動装置
2 電気泳動部
200 装置本体
20 管体
21 上部バッファー槽
210 隔壁
210a 第1の空間
210b 第2の空間
211 底部
212 装着孔
213 保持部材
213a 装着部
214 凹部
215 連通孔
216 脚部
22 下部バッファー槽
221 導入口
222 挿通孔
23 基台
3 通電手段
31 泳動用電源部
32a、32b 電極
4 温度調整手段
41 温度コントローラー
42 伝熱ブロック
421 挿通孔
422 側孔
423 側孔
43 加熱手段
431 面ヒーター
432 ドライバー
44 冷却手段
441 冷却器
442 ヒートシンク
443 ファン
444 ドライバー
446 放熱部
447 モーター
448 羽根
45 温度感知手段
451 温度センサー
452 A/Dコンバーター
5 制御手段
51 コンピューター
6 検出手段
61 光源
62 受光素子
100 ゲル
S101〜S107 ステップ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrophoresis apparatus.
[0002]
[Prior art]
In the fields of molecular biology, biochemistry, medicine, pharmacy and the like, various gene analyzes using an electrophoresis apparatus are widely performed.
[0003]
For example, the IGCR method (In Gel Competitive Reassociation method) is extremely effective in searching for oncogenes and the like, and is currently attracting much attention. This method is a kind of genome subtraction method, and is characterized by performing genome subtraction in a gel (electrophoresis medium).
[0004]
This IGCR method is advantageous for identifying relatively large gene mutations such as deletion of bases of several kb or more. For this reason, this method is extremely useful when, for example, a large difference is found between a normal cell gene and a cancer cell gene. In fact, the IGCR method has been successful in discovering genes related to gastric cancer.
An outline of the IGCR method will be described below as an example of searching for an oncogene.
[0005]
1) First, DNA derived from normal cells and DNA derived from cancer cells (for example, those treated with restriction enzymes) are prepared.
2) Next, normal cell-derived DNA is biotinylated.
[0006]
3) Next, the cancer cell-derived DNA and the normal cell-derived DNA are mixed so that the normal cell-derived DNA has a much higher concentration than the cancer cell-derived DNA (eg, about 1:50). .
4) Next, gel electrophoresis is performed on this mixture.
[0007]
5) After electrophoresis, the gel was taken out, the gel was immersed in an alkaline solution (denaturing solution), and then the gel was immersed in a neutral solution (associating solution) to denature the DNA in the gel. Later, we will re-associate.
The major features of the IGCR method are steps 3) to 5). Through this process, it is possible to detect and isolate genes that are specifically present only in cancer cells. This principle will be schematically described below.
[0008]
For example, it is assumed that a normal cell has a gene A and a gene B. Further, it is assumed that the cancer cell has a gene A and a mutated gene B ′. This gene B ′ has a shorter chain length than the gene B. In addition, the gene A of cancer cells and the gene A of normal cells are the same (identical). Gene A is longer than gene B.
[0009]
In this case, when electrophoresis is performed in the step 4), the bands are divided into, for example, gene A, gene B, and gene B ′ in the gel.
[0010]
At this time, the band of gene A contains DNA derived from normal cells and DNA derived from cancer cells. Therefore, the ratio of DNA derived from normal cells to DNA derived from cancer cells is 50: 1.
The band of gene B contains only normal cell-derived DNA. That is, the ratio of normal cell-derived DNA to cancer cell-derived DNA is 100: 0.
On the other hand, the band of gene B ′ contains only cancer cell-derived DNA. That is, the ratio of normal cell-derived DNA to cancer cell-derived DNA is 0: 100.
[0011]
Here, when the denaturation and reassociation of DNA in the step 5) is performed, the following four genes A1 to A4 are generated at a ratio of 2500: 50: 50: 1 in the band of gene A.
A1: a gene composed only of DNA derived from normal cells,
A2: a gene (type 1) composed of DNA derived from normal cells and DNA derived from cancer cells,
A3: a gene (type 2) composed of DNA derived from normal cells and DNA derived from cancer cells,
A4: A gene composed only of DNA derived from cancer cells.
Therefore, in the band of gene A, the amount of gene (gene A4) composed only of cancer cell-derived DNA is extremely small.
[0012]
On the other hand, in the band of gene B, the ratio of DNA derived from normal cells to DNA derived from cancer cells remains 100: 0 as before.
Similarly, in the gene B ′ band, the ratio of DNA derived from normal cells to DNA derived from cancer cells remains 0: 100.
[0013]
Next, the gel is cut out, DNA is extracted (collected) from the gel, and when such DNA is brought into contact with avidin, since avidin has a property of binding to biotin, the gene containing DNA derived from normal cells is Adsorbed to avidin.
In contrast, a gene composed only of cancer cell-derived DNA is not adsorbed to avidin.
[0014]
Therefore, since the gene B is composed only of DNA derived from normal cells as described above, it is adsorbed to avidin.
On the other hand, since gene B ′ is composed only of DNA derived from cancer cells, it is not adsorbed to avidin and is extracted.
[0015]
In gene A, genes A1, A2 and A3 are adsorbed to avidin, and gene A4 is not adsorbed to avidin. By the way, as described above, in the gene A, the ratio of A1: A2: A3: A4 is 2500: 50: 50: 1. In other words, the abundance of gene A4 is extremely small.
[0016]
Therefore, for example, when the adapter DNA is bound to the gene taken out without being adsorbed by avidin, PCR is performed using a primer having a base sequence complementary to the adapter DNA, and the gene is amplified. Is preferably detected.
[0017]
Thus, the IGCR method is an excellent gene search method. However, the IGCR method has many disadvantages that it requires many manual steps and many time-consuming processes, and therefore requires a long time (for example, about one week), and requires time and labor for the work.
[0018]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an electrophoresis apparatus capable of reducing labor and time of work in, for example, the IGCR method.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
Such an object is achieved by the present inventions (1) to (13) below.
[0020]
(1) an electrophoresis medium for electrophoresis of a specimen containing a nucleic acid and an electrophoretic marker;
Energizing means capable of energizing the electrophoresis medium and reversing its polarity;
A temperature adjusting means for adjusting the temperature of the electrophoresis medium, the temperature adjusting means having at least a heating means for heating the electrophoresis medium;
Detecting means for detecting the position of the electrophoresed marker in the electrophoresis medium,
The electrophoretic medium is energized by the energizing means, and the sample is electrophoresed in the electrophoretic medium, whereby the nucleic acid is separated in the electrophoretic medium, and the marker is contained in the electrophoretic medium by the detecting means. After detecting the arrival at a predetermined position, the energization to the electrophoresis medium is stopped,
Next, after the electrophoresis medium is heated by the heating means, the electrophoresis medium is cooled to denature the separated nucleic acid in the electrophoresis medium, and then reassociate.
Thereafter, the polarity is reversed by the energization means, the energization medium is energized, and the nucleic acid after reassociation is electrophoresed in the electrophoresis medium in the direction opposite to the electrophoresis direction and recovered from the electrophoresis medium. An electrophoretic device configured as described above.
(2) an electrophoresis medium for electrophoresis of a specimen containing a nucleic acid and an electrophoretic marker;
Energizing means capable of energizing the electrophoresis medium and reversing its polarity;
Temperature adjusting means for adjusting the temperature of the electrophoresis medium, the temperature adjusting means having heating means for heating the electrophoresis medium, and cooling means for cooling the electrophoresis medium;
Detecting means for detecting the position of the electrophoresed marker in the electrophoresis medium,
The electrophoretic medium is energized by the energizing means, and the sample is electrophoresed in the electrophoretic medium, whereby the nucleic acid is separated in the electrophoretic medium, and the marker is contained in the electrophoretic medium by the detecting means. After detecting the arrival at a predetermined position, the energization to the electrophoresis medium is stopped,
Next, after the electrophoresis medium is heated by the heating means, the electrophoresis medium is forcibly cooled by the cooling means to denature the separated nucleic acid in the electrophoresis medium, and then reassociate.
Thereafter, the polarity is reversed by the energization means, the energization medium is energized, and the nucleic acid after reassociation is electrophoresed in the electrophoresis medium in the direction opposite to the electrophoresis direction and recovered from the electrophoresis medium. An electrophoretic device configured as described above.
[0021]
(3) The migration speed of the marker is substantially the same as that of the nucleic acid having the fastest migration speed, or slightly faster than the fastest migration speed of the nucleic acids (1) or ( The electrophoresis apparatus according to 2).
[0022]
(4) The electrophoresis apparatus according to any one of (1) to (3), wherein the marker has a molecular weight of 100 to 2000.
[0023]
(5) The electrophoresis apparatus according to any one of (1) to (4), wherein the marker is any one of a charged fluorescent substance, a charged luminescent substance, and a charged dye.
[0024]
(6) The electrophoretic device according to any one of (1) to (4), wherein the marker is a fluorescent substance, a luminescent substance, or a dye imparted to a nucleic acid.
[0025]
(7) The detection means includes an irradiation means for irradiating the electrophoresis medium with light,
The electrophoretic device according to any one of (1) to (6), further including a light receiving unit that receives light from the electrophoretic medium.
[0026]
(8) The electrophoretic device according to any one of (1) to (7), wherein the temperature adjusting unit includes a heat transfer unit that is provided around the electrophoretic medium and performs heat transfer to the electrophoretic medium. .
[0027]
(9) When the total length in the longitudinal direction of the electrophoresis medium is L, the heat transfer section is configured to cover the range of 0.45 L from the center in the longitudinal direction toward both ends. The electrophoresis apparatus according to the above (8).
[0032]
(10) When the total length in the longitudinal direction of the electrophoresis medium is L, the detection means detects that the marker has reached 0.9 L or more from the electrophoresis start position. ).
[0033]
(11) The electrophoresis apparatus according to any one of (1) to (10), wherein the nucleic acid after the reassociation is recovered using a nucleic acid adsorbent.
[0034]
(12) The electrophoresis device according to any one of (1) to (11), wherein a plurality of the electrophoresis media are provided side by side.
[0035]
(13) The electrophoresis device according to any one of (1) to (12), wherein the electrophoresis medium is housed in a hollow member.
[0036]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the electrophoresis apparatus of the present invention will be described in detail based on preferred embodiments shown in the accompanying drawings.
[0037]
FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of the electrophoresis apparatus of the present invention, and FIG. 2 is a partial longitudinal sectional view showing a configuration in the vicinity of the electrophoresis unit included in the electrophoresis apparatus shown in FIG. FIG. 4 is a perspective view showing a configuration of an upper buffer tank provided in the electrophoresis apparatus shown in FIG. 1, and FIG. 4 is a side view showing a configuration of temperature adjusting means provided in the electrophoresis apparatus shown in FIG. These are flowcharts which show the operation | movement procedure of the electrophoresis apparatus shown in FIG. In the following description, in FIGS. 2 and 3, the upper side is referred to as “upper end” and the lower side is referred to as “lower end”.
[0038]
The electrophoretic device 1 shown in FIG. 1 includes an
[0039]
Hereinafter, the electrophoresis apparatus 1 will be described for each component.
As shown in FIGS. 1 and 2, the
[0040]
Each
[0041]
The amount of the buffer solution is, for example, such that the upper end of each
[0042]
In this embodiment, since the structure of each
[0043]
The
[0044]
In the
[0045]
A mounting
[0046]
The holding
[0047]
Although this holding
[0048]
Further, the upper end side of the
[0049]
The
[0050]
Examples of the constituent material of the nucleic acid adsorbent R include ion exchange resins, various glasses, ceramic materials such as alumina and calcium phosphate, silica compounds such as amorphous silica and alkyl silica, resin materials such as polystyrene, polyethylene, and polypropylene. Etc. Among these, the nucleic acid adsorbent R is preferably composed of a material containing an ion exchange resin, and more preferably composed of an ion exchange resin as a main material. Such a nucleic acid adsorbent R has a high ability to adsorb DNA, and the adsorbed DNA can be easily recovered from the nucleic acid adsorbent R.
[0051]
Examples of the ion exchange resin include those in which groups having various charges (for example, sulfone group, carboxyl group, trimethylammoniomethyl group, etc.) are introduced into agarose, cellulose, nitrocellulose and the like. One or more of these can be used in combination. By constituting the nucleic acid adsorbent R using such an ion exchange resin, the DNA adsorbing ability of the nucleic acid adsorbent R can be made particularly excellent, and the recovery efficiency of DNA can be improved. it can.
[0052]
In addition, the shape of the nucleic acid adsorbent R is not particularly limited, and examples thereof include granules, meshes, sponges, etc. Among these, granules are particularly preferable. By making the nucleic acid adsorbent R granular, the surface area effective for DNA adsorption can be increased, and the efficiency of DNA adsorption can be increased.
[0053]
In this case, the average particle diameter of the granular nucleic acid adsorbent R is preferably about 20 to 2000 μm, more preferably about 35 to 1000 μm, and further preferably about 50 to 150 μm. By making the average particle diameter within the above range, the DNA adsorption efficiency can be further improved.
[0054]
Further, the
[0055]
The
[0056]
In this case, the angle (θ in FIG. 3) formed by the
[0057]
Further, the inner diameter of the
[0058]
A plurality (three) of such
[0059]
The
[0060]
A
[0061]
As this buffer solution, the same buffer solution as mentioned above for the buffer solution stored in the
[0062]
In the vicinity of the upper edge of the lower buffer tank 22 (upper right side in FIG. 2), an
[0063]
A plurality of
[0064]
In this state, the
[0065]
The constituent materials of the
[0066]
In addition, it is preferable that the
[0067]
Between each
[0068]
The constituent material of the
[0069]
Although it does not specifically limit as a dimension of the
[0070]
Each
[0071]
Further, a portion not filled with the
[0072]
The
[0073]
The
[0074]
The total length of the
[0075]
The sample includes a marker having electrophoretic properties. If such a marker is added to the sample, the DNA contained in the sample (DNA fragment) is detected by detecting the position of the electrophoresed marker in the
[0076]
In particular, the marker has an electrophoresis speed (electrophoretic property) that is substantially the same as or slightly higher than that of the DNA having the fastest electrophoresis speed (high electrophoretic property). Fast is preferred. When such a marker is used, the marker moves in advance in the gel 100 (electrophoresis). Therefore, by detecting the position of the marker in the
[0077]
In this case, the molecular weight of the marker is not particularly limited, but is preferably about 100 to 2000, and more preferably about 300 to 800. The effect can be further improved by using a marker having a molecular weight in the above range.
[0078]
As such a marker, either a charged (negatively charged) fluorescent substance, a charged luminescent substance, or a charged dye (such as bromophenol blue), or a fluorescent substance In addition, those obtained by imparting (for example, binding) a nucleic acid to a nucleic acid are preferably used. By using such a marker, the position (electrophoretic position) of the marker in the
[0079]
When using a fluorescent substance, a luminescent substance or a dye imparted to a nucleic acid as a marker, since the nucleic acid itself is charged, the fluorescent substance, the luminescent substance and the dye imparted to the nucleic acid are each charged. It may be either tinged or not. Specific examples of these are not particularly limited, and examples thereof include the following.
[0080]
Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC), substituted rhodamine isothiocyanate (XRITC), rhodamine B isothiocyanate, dichlorotriazine fluorescein (DTAF), Cy3, and Cy5. .
[0081]
Examples of the luminescent substance include luminol, isoluminol, alridium ester, or derivatives thereof.
[0082]
Examples of the dye include phthalocyanine pigments, azo pigments, anthraquinone pigments, azomethine pigments, quinophthalone pigments, isoindoline pigments, nitroso pigments, perinone pigments, quinacridone pigments, perylene pigments, pyrrolo. Pyrrole pigments, pigments such as dioxazine pigments, azo dyes, anthraquinone dyes, indigoid dyes, triphenylmethane dyes, pyrazolone dyes, stilbene dyes, diphenylmethane dyes, xanthene dyes, alizarin dyes, Examples include acridine dyes, quinoneimine dyes, and dyes such as metal complex dyes.
[0083]
In addition, you may make it use the marker as mentioned above combining arbitrary 2 or more types as needed.
[0084]
The position (electrophoretic position) of the electrophoresed marker in the
[0085]
The detection position of this marker is preferably in the range of 0.9 L or more, more preferably in the range of 0.95 or more from the electrophoresis start position, where L is the total length in the longitudinal direction of the
[0086]
As shown in FIGS. 1 and 2, the detection means 6 includes a light source (irradiation means) 61 that irradiates light (for example, laser light) to the
[0087]
The
[0088]
The wavelength of irradiation light is appropriately selected depending on the type of marker used and the like, and is not particularly limited.
[0089]
Moreover, when using a laser beam as irradiation light, as the
Further, the irradiation light may be either continuous light or pulsed light.
[0090]
In the present embodiment, the irradiating means is composed of the
[0091]
Further, when using a charged luminescent substance or a luminescent substance provided with a nucleic acid as a marker, it is not necessary to receive light, and the luminescent substance itself emits light. It may be omitted.
[0092]
The
[0093]
The
[0094]
In the present embodiment, the light receiving means is configured by the
[0095]
In addition, the
[0096]
Moreover, the
[0097]
Now, the
The energization means 3 is capable of energizing the
[0098]
Each of the
[0099]
The temperature of the
As shown in FIG. 4, the temperature adjusting unit 4 is configured to transfer heat between the
[0100]
The
[0101]
The temperature adjusting means 4 heats the
[0102]
The heating means 43 includes a
[0103]
The cooling means 44 has a cooler 441 that dissipates heat from the
[0104]
The cooler 441 includes a
[0105]
The
[0106]
The
[0107]
The
[0108]
The
[0109]
Through such a
[0110]
Further, a plurality (three in this embodiment) of
[0111]
Thereby, since the
[0112]
Moreover, it is preferable that the
[0113]
That is, the length of the
[0114]
Thereby, since the
[0115]
In the present embodiment, the
[0116]
As described above, in the present embodiment, the temperature adjusting unit 4 includes the
[0117]
In addition, when the
[0118]
The energizing means 3, the temperature adjusting means 4, and the detecting means 6 described above are controlled by the control means 5 constituted by the
[0119]
The
[0120]
The
[0121]
Further, the
[0122]
The
[0123]
Hereinafter, the usage method (action) of the electrophoresis apparatus 1 will be described as an example with reference to FIG. 5 in the case where the IGCR method is performed.
[0124]
[1] First, an operator who performs the IGCR method (a user of the electrophoresis apparatus 1) sets the
[0125]
In addition, the worker prepares a sample (specimen) including DNA (nucleic acid) and, for example, DNA (molecular weight: about 700) provided with a fluorescent substance as a marker. This sample contains DNA derived from cells to be tested and DNA derived from normal cells (for example, those subjected to restriction enzyme treatment) in a ratio of, for example, about 1:50. The DNA concentration at this time is slightly different depending on the amount of sample to be subjected to electrophoresis, but is preferably about 0.1 to 100 μM.
The normal cell-derived DNA is biotinylated.
[0126]
[2] Next, the operator operates the
[0127]
[3] Next, the operator fills (applies) the sample prepared in the step [1] on the inner side of the upper end of each tubular body 20 (the upper surface of the gel 100).
[0128]
[4] Next, when an operator presses a start button (not shown), the
[0129]
Based on the signal from the
[0130]
The predetermined voltage is appropriately set depending on the gel composition and the like, and is not particularly limited, but is preferably about 25 to 100V.
[0131]
Thus, the sample (DNA and marker) is electrophoresed (moved) downward (lower end) in the
[0132]
The
[0133]
In this case, the predetermined current is not particularly limited, but is preferably about 1 to 10 mA.
[0134]
[5] Next, when a predetermined time elapses, the
[0135]
The
[0136]
Next, when the marker reaches the position where the laser beam of the
[0137]
At this time, the fluorescent material included in the marker is in an excited state by absorbing the laser light. Thereafter, when the excited fluorescent substance returns to the ground state, fluorescent light (or phosphorescent light) is generated.
[0138]
A part of the fluorescent light emitted from the marker (light from the gel 100) passes through the
[0139]
In addition, you may make it start irradiation to the
[0140]
[6] Next, when the
[0141]
The electrophoretic
[0142]
[7] Next, the
[0143]
First, the
[0144]
As a result, the separated DNA is denatured in the
[0145]
Thereafter, when the temperature of the
[0146]
Further, when the temperature of the
[0147]
The predetermined temperature (maximum temperature) is not particularly limited, but is preferably about 60 to 90 ° C. The time for maintaining the temperature of the
[0148]
Next, the
[0149]
This heat is dissipated from the
[0150]
Thereby, the temperature of the
[0151]
Thereafter, when the temperature of the
[0152]
[8] Next, when the temperature of the
[0153]
In addition, although predetermined temperature (minimum temperature) is not specifically limited, It is preferable to set it as 40 degrees C or less, and it is more preferable to set it as about 10-40 degreeC. As a result, the denatured DNA can be re-associated efficiently (accurately).
[0154]
[9] Next, the
[0155]
Based on the signal from the
[0156]
That is, the electrophoresis
[0157]
The predetermined voltage is not particularly limited, but is preferably about 25 to 100V.
[0158]
As a result, the DNA after reassociation is electrophoresed upward (upper end) in the
[0159]
When voltage application between each
[0160]
At this time, since the nucleic acid adsorbent R is accommodated (installed) in the
[0161]
As described above, the nucleic acid adsorbent R is moved between the
[0162]
The
[0163]
In this case, the predetermined current is not particularly limited, but is preferably about 1 to 10 mA.
[0164]
[10] Next, when a predetermined time has elapsed, the
[0165]
The electrophoretic
[0166]
The predetermined time is appropriately set depending on the composition of the gel and is not particularly limited, but is preferably about 0.5 to 2 hours.
[0167]
[11] Next, the operator performs an operation of collecting the nucleic acid adsorbent R in each
[0168]
This can be performed by bringing the nucleic acid adsorbent R into contact with a buffer solution having a high salt concentration (for example, about 0.01 to 10 mol / L). Thereby, the DNA after the reassociation is released (detached) from the nucleic acid adsorbent R and transferred into the buffer solution.
[0169]
In addition, as this buffer solution, the thing of the composition similar to the buffer solution as mentioned above can be used.
[0170]
Thus, by using the nucleic acid adsorbent R to recover the DNA after reassociation, this recovery operation can be performed more quickly, which is advantageous in reducing the work time in the IGCR method. In addition, DNA after reassociation that has detached from the
[0171]
Further, the operator contacts the buffer solution containing the DNA after reassociation with avidin, and uses the DNA after reassociation taken out without being adsorbed by avidin for the PCR method.
[0172]
As described above, in the electrophoresis apparatus 1 according to the present embodiment, the
[0173]
In particular, by detecting that the marker has reached a predetermined position in the
[0174]
Further, when the electrophoresis of the DNA in the
[0175]
In addition, by configuring the DNA after reassociation to be forcibly released from the
[0176]
The direction of electrophoresis of the DNA after reassociation may be the same as the direction of electrophoresis when separating the DNA, but the direction of electrophoresis of the DNA after reassociation may be the same as that when separating the DNA. By making the direction opposite to the direction of electrophoresis, the migration distance of the DNA having a low migration speed (low mobility) in the
[0177]
In addition, the direction of electrophoresis of the DNA after reassociation is opposite to the direction of electrophoresis when separating the DNA, so that the sample is applied to the
[0178]
In the case of processing samples of the same type (from the same subject), the
[0179]
When processing the same type of sample, the direction of electrophoresis of the DNA after reassociation is the same direction as the direction of electrophoresis when separating the DNA, and the DNA after reassociation is moved from the
[0180]
Such an electrophoresis apparatus 1 is controlled by the computer 51 (control means 5) to separate and terminate DNA in the
[0181]
In addition, such an electrophoresis apparatus 1 includes a step of separating DNA in the gel 100 (the above steps [4] to [6]), a step of denaturing and reassociating the separated DNA in the gel 100 (the above step). [7] and [8]), and various conditions (various setting conditions) in the step of recovering the DNA after reassociation from the gel 100 (the above steps [9] and [10]) are the computer 51 (control means). Since the control is suitably performed according to 5), it is possible to shorten the time and improve the accuracy in each of the above steps.
[0182]
The electrophoretic device of the present invention has been described based on the illustrated embodiment. However, the present invention is not limited to this, and for example, the configuration of each unit is an arbitrary configuration that can exhibit the same function. Can be substituted.
[0183]
The electrophoresis medium can be composed of, for example, a hydrophilic polymer, a water-absorbing material impregnated with a buffer solution (buffer solution), or the like.
[0184]
Further, although three migration media are installed in the illustrated configuration, the number of migration media is not limited to this. For example, the number of migration media may be one, two, or four or more. .
[0185]
Further, the overall shape of the electrophoresis medium is not limited to a cylindrical (bar) shape, and may be, for example, a flat plate.
[0186]
In the configuration shown in the figure, the detection means is installed corresponding to only one electrophoresis medium. However, a plurality of detection means may be installed corresponding to each of the plurality of electrophoresis media.
[0187]
Further, for example, a Peltier element or the like may be used as the cooling means included in the temperature adjusting means.
[0188]
In the above description, DNA has been described as a representative nucleic acid. However, in the present invention, nucleic acids other than DNA, such as RNA and synthetic oligonucleotides, can also be used.
[0189]
Needless to say, the electrophoresis apparatus of the present invention can be used not only when the IGCR method is performed, but also when various gene analyzes are performed.
[0190]
【The invention's effect】
As described above, according to the electrophoresis apparatus of the present invention, for example, the labor and time of the IGCR method can be reduced, and in particular, it contributes to the automation of the implementation.
[0191]
In particular, by detecting that the marker has reached a predetermined position in the electrophoresis medium and then stopping the energization of the electrophoresis medium, the nucleic acid in the electrophoresis medium can be more accurately separated.
[0192]
In addition, the time required for recovering the nucleic acid can be shortened by configuring the energizing means to reverse the polarity before and after adjusting the temperature of the electrophoresis medium by the temperature adjusting means.
[0193]
Further, when a plurality of electrophoresis media are installed, the number and amount of specimens that can be processed at a time can be increased.
[0194]
For this reason, by using the electrophoresis apparatus of the present invention, for example, searching for an oncogene or the like can be performed more quickly and efficiently.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of an electrophoresis apparatus of the present invention.
2 is a partial longitudinal sectional view showing a configuration in the vicinity of an electrophoresis unit provided in the electrophoresis apparatus shown in FIG.
3 is a perspective view showing a configuration of an upper buffer tank provided in the electrophoresis apparatus shown in FIG. 1. FIG.
4 is a side view showing a configuration of temperature adjusting means provided in the electrophoresis apparatus shown in FIG. 1. FIG.
FIG. 5 is a flowchart showing an operation procedure of the electrophoresis apparatus shown in FIG.
[Explanation of symbols]
1 Electrophoresis device
2 electrophoresis part
200 Device body
20 tube
21 Upper buffer tank
210 Bulkhead
210a first space
210b second space
211 bottom
212 Mounting hole
213 Holding member
213a wearing part
214 recess
215 communication hole
216 legs
22 Lower buffer tank
221 inlet
222 Insertion hole
23 base
3 Energizing means
31 Power supply for electrophoresis
32a, 32b electrode
4 Temperature adjustment means
41 Temperature controller
42 Heat transfer block
421 insertion hole
422 side hole
423 side hole
43 Heating means
431 side heater
432 Driver
44 Cooling means
441 Cooler
442 heat sink
443 fans
444 driver
446 Heat dissipation part
447 motor
448 feathers
45 Temperature sensing means
451 Temperature sensor
452 A / D converter
5 Control means
51 computer
6 detection means
61 Light source
62 Light receiving element
100 gel
Steps S101 to S107
Claims (13)
前記泳動媒体へ通電し、かつ、その極性を反転することができる通電手段と、
前記泳動媒体の温度を調整する温度調整手段であって、少なくとも前記泳動媒体を加熱する加熱手段を有する温度調整手段と、
電気泳動された前記マーカーの前記泳動媒体中での位置を検出する検出手段とを備え、
前記通電手段により前記泳動媒体へ通電を行い、前記検体を前記泳動媒体中で電気泳動させることにより、前記核酸を前記泳動媒体中で分離させるとともに、前記検出手段により前記マーカーが前記泳動媒体中の所定位置に到達したのを検出した後、前記泳動媒体への通電を停止し、
次いで、前記加熱手段により前記泳動媒体を加熱した後、前記泳動媒体を冷却することにより、分離後の核酸を前記泳動媒体中で変性させた後、再会合させ、
その後、前記通電手段により極性を反転させて前記泳動媒体へ通電を行い、再会合後の核酸を前記泳動媒体中で前記電気泳動の方向と逆方向に電気泳動させ、前記泳動媒体中から回収するよう構成されていることを特徴とする電気泳動装置。An electrophoresis medium for electrophoresis of a specimen containing a nucleic acid and an electrophoretic marker;
Energizing means capable of energizing the electrophoresis medium and reversing its polarity;
A temperature adjusting means for adjusting the temperature of the electrophoresis medium, the temperature adjusting means having at least a heating means for heating the electrophoresis medium;
Detecting means for detecting the position of the electrophoresed marker in the electrophoresis medium,
The electrophoretic medium is energized by the energizing means, and the sample is electrophoresed in the electrophoretic medium, whereby the nucleic acid is separated in the electrophoretic medium, and the marker is contained in the electrophoretic medium by the detecting means. After detecting the arrival at a predetermined position, the energization to the electrophoresis medium is stopped,
Next, after the electrophoresis medium is heated by the heating means, the electrophoresis medium is cooled to denature the separated nucleic acid in the electrophoresis medium, and then reassociate.
Thereafter, the polarity is reversed by the energization means, the energization medium is energized, and the nucleic acid after reassociation is electrophoresed in the electrophoresis medium in the direction opposite to the electrophoresis direction and recovered from the electrophoresis medium. An electrophoretic device configured as described above.
前記泳動媒体へ通電し、かつ、その極性を反転することができる通電手段と、
前記泳動媒体の温度を調整する温度調整手段であって、前記泳動媒体を加熱する加熱手段と、前記泳動媒体を冷却する冷却手段とを有する温度調整手段と、
電気泳動された前記マーカーの前記泳動媒体中での位置を検出する検出手段とを備え、
前記通電手段により前記泳動媒体へ通電を行い、前記検体を前記泳動媒体中で電気泳動させることにより、前記核酸を前記泳動媒体中で分離させるとともに、前記検出手段により前記マーカーが前記泳動媒体中の所定位置に到達したのを検出した後、前記泳動媒体への通電を停止し、
次いで、前記加熱手段により前記泳動媒体を加熱した後、前記冷却手段により前記泳動媒体を強制的に冷却することにより、分離後の核酸を前記泳動媒体中で変性させた後、再会合させ、
その後、前記通電手段により極性を反転させて前記泳動媒体へ通電を行い、再会合後の核酸を前記泳動媒体中で前記電気泳動の方向と逆方向に電気泳動させ、前記泳動媒体中から回収するよう構成されていることを特徴とする電気泳動装置。An electrophoresis medium for electrophoresis of a specimen containing a nucleic acid and an electrophoretic marker;
Energizing means capable of energizing the electrophoresis medium and reversing its polarity;
Temperature adjusting means for adjusting the temperature of the electrophoresis medium, the temperature adjusting means having heating means for heating the electrophoresis medium, and cooling means for cooling the electrophoresis medium;
Detecting means for detecting the position of the electrophoresed marker in the electrophoresis medium,
The electrophoretic medium is energized by the energizing means, and the sample is electrophoresed in the electrophoretic medium, whereby the nucleic acid is separated in the electrophoretic medium, and the marker is contained in the electrophoretic medium by the detecting means. After detecting the arrival at a predetermined position, the energization to the electrophoresis medium is stopped,
Next, after the electrophoresis medium is heated by the heating means, the electrophoresis medium is forcibly cooled by the cooling means to denature the separated nucleic acid in the electrophoresis medium, and then reassociate.
Thereafter, the polarity is reversed by the energization means, the energization medium is energized, and the nucleic acid after reassociation is electrophoresed in the electrophoresis medium in the direction opposite to the electrophoresis direction and recovered from the electrophoresis medium. An electrophoretic device configured as described above.
前記泳動媒体からの光を受光する受光手段とを有する請求項1ないし6のいずれかに記載の電気泳動装置。The detection means includes irradiation means for irradiating light to the electrophoresis medium;
The electrophoretic device according to claim 1, further comprising a light receiving unit that receives light from the electrophoresis medium.
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