JP3717582B2

JP3717582B2 - 微粒子

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Publication number: JP3717582B2
Application number: JP04963996A
Authority: JP
Inventors: 孝行鈴木; 英子大川; 茂田島
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1996-02-14
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2016-02-14
Also published as: JPH09221314A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は疾病の診断に用いられる抗原−抗体反応等を利用する診断試薬用の微粒子等として有用な微粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、免疫診断試薬用微粒子としては、ポリスチレン微粒子などの合成ポリマーの微粒子が用いられてきたが、ポリマーは本質的に無色ないし淡色であり、近年、微粒子を着色することにより凝集像が鮮明で判定が容易になるよう試みられている。しかし、ポリスチレン微粒子の比重は小さいため、これを用いたマイクロタイター法用の診断試薬は、判定に時間がかかるという欠点がある。
特公平５ー４８２４５号公報及び特開昭６４ー１４８号公報には、ポリアクロレイン微粒子またはポリアクロレイン微粒子を染料にて染色した着色微粒子が提案されており、これをマイクロタイター法用の診断試薬に使用した場合、ポリスチレン微粒子よりは比重が大きいため判定時間は短くはなるが、マイクロタイター法用の診断試薬は、沈降時間が検査の律速となるため、より比重が高く、沈降時間を更に短縮できる微粒子が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、特にマイクロタイター法用の診断試薬に使用でき、該試薬を用いた場合の判定時間の短縮を可能とする微粒子を提供することを目的としている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意研究し本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明は、
（１）ポリアクロレインで被覆された無機微粒子からなる微粒子、
（２）無機微粒子がシリカ微粒子である上記（１）記載の微粒子、
（３）シランカップリング剤で処理したシリカ微粒子の存在下にアクロレインを重合して得られる上記（２）記載の微粒子、
（４）染料にて染色されている上記（１）、（２）又は（３）記載の微粒子、
（５）診断試薬用の上記（１）、（２）、（３）又は（４）記載の微粒子、
（６）マイクロタイター法に用いるための上記（５）記載の微粒子、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
無機微粒子としては、例えば、シリカ（二酸化ケイ素）、アルミナ、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、硫酸バリウム等の微粒子が挙げられ、特にシリカ微粒子が好ましい。無機微粒子の平均粒径は０. ０５〜１０μｍであることが好ましく
、特に０. ２〜５μｍであることが好ましい。
【０００７】
無機微粒子を被覆しているポリアクロレインの量は、核となる無機微粒子１００重量部に対して５〜３０重量部の範囲であることが好ましく、特に８〜２０重量部の範囲であることが好ましい。
本発明の微粒子（ポリアクロレインで被覆された無機微粒子）の平均粒径は０. ０５〜１２μｍであることが好ましく、特に０. ２〜７μｍであることが好ましい。
【０００８】
本発明の微粒子は、無機微粒子の表面にアミノ基、ビニル基、メタアクリル基等の官能基を導入し、表面に官能基が導入された無機微粒子の存在下にアクロレインを水、アルコール水溶液等の溶媒中で重合することにより得ることができる。
無機微粒子の表面に官能基を導入する方法としては、例えば、無機微粒子をシランカップリング剤で処理する方法、ハロゲン化する方法等がある。
【０００９】
ここで、例として、無機微粒子をシランカップリング剤で処理する方法について説明する。この処理は、水、アルコール水溶液、アセトン水溶液、トルエン等の媒体中で無機微粒子とシランカップリング剤を混合することにより行うことができる。この処理は、ｐＨ３〜７であることが好ましく、特にｐＨ３〜５で行うのが好ましい。
【００１０】
シランカップリング剤は、無機微粒子に対して１〜５０重量％使用するのが好ましく、特に１０〜４０重量％使用するのが好ましい。
一般的にシランカップリング剤で無機材料を処理する場合、表面を単分子膜で被覆したときに最高の効果が発揮され、無機材料に対して、次の計算式で導き出される量用いるのが適当とされている。

しかしながら、本発明の微粒子を得る場合は、上記の計算式より導き出される量よりも多い量のシランカップリング剤を用いるのが好ましく、特に、上記の計算式で導き出される量の３〜７倍量のシランカップリング剤を用いるのが好ましい。これにより、無機微粒子を多量のポリアクロレインで被覆することが可能となり、染料にて染色した場合、効率良く濃染色が可能になる。
【００１１】
シランカップリング剤としては、例えばアミノ基を有するシランカップリング剤（γーアミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−β( アミノエチル) γーアミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−β( アミノエチル) γーアミノプロピルトリメトキシシラン等）、ビニル基を有するシランカップリング剤（ビニルエトキシシラン、ビニルトリス( βーメトキシエトキシ) シラン等）、メタアクリル基を有するシランカップリング剤（γーメタアクリロキシプロピルトリメトキシシラン等）が挙げられる。但し、ビニル基を有するシランカップリング剤やメタアクリル基を有するシランカップリング剤による処理はトルエン等の有機溶媒中で行うため、カップリング処理後の溶剤洗浄と乾燥に難点があり、適正な設備、機器等が必要となる。
【００１２】
シランカップリング剤による処理等により表面に官能基が導入された無機微粒子（以下
、「処理済無機微粒子」という）の存在下に溶媒中でアクロレインを重合する際、アクロレインは処理済無機微粒子に対して５０〜２００重量％用いるのが好ましく、特に７５〜１５０重量％用いるのが好ましい。又、アクロレインは溶媒に対しては１０〜３０重量％の範囲になるようにするのが好ましい。更に、アクロレインの重合を促進し、得られる微粒子のアクロレインの刺激臭を減少させ、未反応アクロレイン及び副性する可溶性重合体の除去を容易にするために重合開始剤を使用するのが好ましい。重合開始剤はアクロレインに対して０. ０１〜２重量％用いるのが好ましく、重合開始剤としては、過硫酸塩、アゾ化合物、過酸化ベンゾイル等、公知の重合開始剤が使用できる。
【００１３】
このようにして得られる本発明の微粒子は、更に他の共重合可能なモノマーを共重合させることもできる。他の共重合可能なモノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２ーエチルヘキシル（メタ）アクリレート、スチレン、（メタ）アクリレート等が挙げられる。微粒子に他の共重合可能なモノマーを共重合する場合、アクロレインの重合途中又は重合がほとんど終了した後に反応系に該モノマーを加え重合開始剤で重合させればよい。この際に用いる重合開始剤は、過硫酸塩、アゾ化合物、過酸化ベンゾイル等が適当である。
【００１４】
本発明の微粒子を染料にて染色したものを用いて得た診断試薬（特にマイクロタイター法用の）は凝集像が鮮明で判定が容易になる。微粒子の染色に使用される染料は染色可能な染料なら何でも良く酸性染料、直接染料、分散染料、反応染料等の大部分の染料は使用できる。染料について、具体的に染料名を挙げると、
ＫａｙａｒｕｓＳｕｐｒａＢｌｕｅＢＲＬ
ＫａｙａｒｕｓＳｕｐｒａＲｅｄ６ＢＬ
ＫａｙａｃｒｙｌＢｌｕｅＧＲＬ
ＫａｙａｎｏｌＭｉｌｌｉｎｇＲｅｄ６ＢＷ
ＫａｙａｌｏｎＰｏｌｙｅｓｔｅｒＢｌｕｅ２Ｒ−ＳＦ
ＫａｙａｌｏｎＰｏｌｙｅｓｔｅｒＲｕｂｉｎｅＧＬ−ＳＥ
ＫａｙａｃｉｏｎＲｅｄＡ−３Ｂ
ＫａｙａｃｉｏｎＢｌｕｅＡ−５Ｒ
（以上日本化薬（株）製）
等が挙げられる。しかし、染料はブルー系、赤系に限られるものではなく、例えば、ＫａｙｌｏｎＰｏｙｅｓｔｅｒＬｉｇｈｔＹｅｌｌｏｗ５ＧＳ（黄色）、Ｆｕｃｈｓｉｎ（赤系）、ＭａｌａｃｈｉｔｅＧｒｅｅｎ（緑系）、（以上和光純薬（株）製）
等でも当然非常に良く染色できる。また染料の混合によって中間色に染色することも可能である。
【００１５】
微粒子を染色する方法は、織布を染色するときと同様にして行なうことができる。染料は０. ００１〜５％重量％の濃度となるように水に溶かすか又は分散させて用いるのが好ましく、被染色物である微粒子の濃度は０. １〜２０重量％の範囲とするのが好ましい。染色温度は常温〜１００℃が好ましく、３０分〜５時間で染色される。
【００１６】
本発明の微粒子に、例えば抗原又は抗体を感作することにより診断試薬が得られる。抗原又は抗体による感作は、一般的な感作方法によって行なうことができる。即ち、リン酸等の緩衝生理食塩水中で微粒子と抗原又は抗体を接触させることにより感作を行なうことができる。
【００１７】
本発明の特に染料で染色した微粒子に抗原又は抗体を感作して得たものを診断試薬としてマイクロタイター法で検査した場合、判定の凝集像が鮮明で判定が容易になる。また、染料で染色した微粒子を長期保存した場合、染色前のものより分散性は良好であり、診断試薬にした場合も染料で染色したものを用いた場合の方が長期安定性が良好である。即ち、染色することで保存安定性が向上する。これは、微粒子表面が染料で覆われることにより安定化したためと思われる。これは、アクロレインモノマーの重合に際してビニル重合のみならず共役するカルボニル二重結合も重合に関与した結果として、構造が複雑になり不安定な結合を持ち、これが染料によって表面処理され、染料分子と結合したり、染料による強い親和力等によって安定化したためと考えられる。
【００１８】
本発明の染料で染色された微粒子は比重が高く（例えば、実施例３で得られる微粒子の比重は１. ８）、そのため、これを用いて得た診断試薬をマイクロタイター法で使用した場合、判定時間は３０分〜１時間程度で短時間判定が可能になる。従来の着色したポリアクロレイン微粒子は比重１. ３２のため判定時間は１時間〜２. ５時間必要であった。
【００１９】
本発明の染料で染色された微粒子は、マイクロタイター法のみならず、粒径の小さい微粒子を用いることでラテックス凝集比濁法、スライドテスト法にも応用することが可能である。
【００２０】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２１】
製造例１
シリカ微粒子（シーホスターＫＥ−Ｐ１００，平均粒径1.０μｍ，日本触媒（株）製）１０ｇを含有する５０％エタノール水溶液５０ｇにシランカップリング剤としてγーアミノプロピルトリエトキシシランを２ｇ添加し、酢酸でｐＨ４. ６に調整後、４０℃で２時間攪拌する。その後、エタノール水溶液を除去するため、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）によりカップリング処理したシリカ微粒子のみ沈殿させ蒸留水で２回洗浄後、１００℃で乾燥してカップリング処理したシリカ微粒子を得た。
【００２２】
製造例２
シリカ微粒子（シーホスターＫＥ−Ｐ１００，平均粒径1.０μｍ，日本触媒（株）製）１０ｇを含有するトルエン５０ｇにシランカップリング剤としてγーメタアクリロキシプロピルトリメトキシシランを１ｇ添加し、８０℃で２時間攪拌する。冷却後、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により上清のトルエンを除去する。沈渣のカップリング処理したシリカ微粒子を５０％エタノール５０ｇ中に添加し攪拌し、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により５０％エタノールによる上清の交換を２回行いトルエンの洗浄を行う。次に沈殿物に蒸留水５０ｇ添加し、同様の操作でエタノール洗浄を行った後、１００℃で乾燥してカップリング処理したシリカ微粒子を得た。
【００２３】
実施例１
製造例１で得たカップリング処理したシリカ微粒子１０ｇを含有する水１００ｇにアクロレインモノマー１５ｍｌを添加し、窒素ガスを導入して酸素を追い出し、２％過硫酸アンモニウム水溶液１ｍｌ添加し、５０℃で５時間反応させ、更に２％過硫酸アンモニウム水溶液１ｍｌ添加後、７０℃で２時間、後反応を行う。得られた微粒子中の少量の未反応アクロレイン及び可溶性重合体を除去するため、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により微粒子のみ沈殿させ分散媒を水と交換してポリアクロレインで被覆された微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％に調製しておく）が得られた。得られた微粒子の平均粒径は１. ０８μｍであり、ポリアクロレイン量はシリカ微粒子に対して１４. ２重量％であった。
【００２４】
実施例２
製造例２で得たカップリング処理したシリカ微粒子１０ｇを用い、実施例１と同様にして反応を行いポリアクロレインで被覆された微粒子が得られた。得られた微粒子の平均粒径は１. ０７μｍであり、ポリアクロレイン量はシリカ微粒子に対して１３. ３重量％であった。
【００２５】
実施例３
実施例１で得たポリアクロレインで被覆された微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％）１００ｇに対して、ＫａｙａｌｏｎＰｏｌｙｅｓｔｅｒＲｕｂｉｎｅＧＬ−ＳＥ（日本化薬（株）製）０. ４ｇを１００ｍｌの蒸留水に溶解したものを混合して酢酸でｐＨ５に調整後、９５℃で２時間攪拌した。冷却後、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により蒸留水による上清の交換を３回行い、その後沈殿物を酢酸１ｍｌを含む蒸留水２００ｍｌ中に分散し、９５℃で３０分攪拌した。冷却後、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により蒸留水による上清の交換を５回行い洗浄して、濃赤色に着色した微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％に調製しておく）が得られた。
【００２６】
実施例４
実施例２で得たポリアクロレインで被覆された微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％）１００ｇを実施例３と同様に染色して、濃赤色に着色した微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％に調製しておく）が得られた。
【００２７】
実施例５
実施例１で得たポリアクロレインで被覆された微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％）１００ｇに対して、ＫａｙａｎｏｌＭｉｌｌｉｎｇＲｅｄ６ＢＷ（日本化薬（株）製）０. ２ｇを用い、実施例３と同様に染色して、濃赤色に着色した微粒子（固形分濃度１０ｗｔ％に調製しておく）が得られた。
【００２８】
試験例
着色微粒子の診断試薬への応用として梅毒抗体検査法を例として説明する。但し、これらの検査項目に限定されるものではない。
【００２９】
１．梅毒抗原の調製
ＴＰ菌（Ｎｉｃｈｏｌｓ株）をウサギ睾丸内で増殖させ、摘出した睾丸からクエン酸緩衝液で抽出、円心分画して集菌し、菌数１〜２×１０⁹Cells／ｍｌとなるようにＰＢＳに再浮遊した。このＴＰ菌浮遊液５ｍｌをＰＢＳで１０倍に希釈し、超音波破砕器（久保田商事（株）２０１型）を用い、９ｋＨｚ、１８０Ｗで２０分処理してＴＰ菌体成分を含む抗原液を得た。
【００３０】
２．抗原感作、試薬の調製
着色微粒子（固形分１０ｗｔ％）１ｍｌをＰＢＳ１０ｍｌに分散させ、ＴＰ抗原液４ｍｌ添加し３７℃で３０分間ゆっくり攪拌した。その後、２ｗｔ％牛血清アルブミン（ＢＳＡと略す）ーＰＢＳ１０ｍｌをさらに添加し、３７℃で１時間ゆっくり攪拌した。
これを、遠心分離機（１５００ｒｐｍ×５分）により分離し上清を捨て、０. ５ｗｔ％ＢＳＡーＰＢＳで２回同様に遠心して沈渣を洗浄する。その後、この沈渣に０. ５ｗｔ％ＢＳＡーＰＢＳ４０ｍｌ添加し、よく攪拌して固形分０. ２５ｗｔ％のＴＰ抗原感作微粒子分散液（試薬）を得た。
【００３１】
なお、着色微粒子としては、前記実施例３〜５で得た着色微粒子及び特開昭６４ー１４８号公報の実施例４と同様にして作製した従来の着色ポリアクロレイン微粒子を使用した。得られた試薬を以下のとおり、それぞれＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄとした。
試薬Ａ：実施例３の着色微粒子（固形分１０ｗｔ％）を用いたもの試薬Ｂ：実施例４の着色微粒子（固形分１０ｗｔ％）を用いたもの試薬Ｃ：実施例５の着色微粒子（固形分１０ｗｔ％）を用いたもの試薬Ｄ：従来の着色ポリアクロレイン微粒子（固形分１０ｗｔ％）を用いたもの
【００３２】
３．感作微粒子の評価
ＴＰ抗原感作微粒子を用いてマイクロタイター法にて検査を行った。Ｕ型マイクロプレートの第１管目に０. ５ｗｔ％ＢＳＡーＰＢＳを１００μｌ、２管目以降に２５μｌずつ滴下し、第１管目に血清２５μｌを加えた。これをダイリューターにて１管目より連続２倍希釈した。ＴＰ抗原感作微粒子（試薬Ａ〜Ｄ）を第２管目以降に２５μｌずつ滴下し、プレートミキサーで１分間振とう後、フタをして静置した。管底の凝集像で陰性か陽性を判定した。この場合、最終希釈倍数は、２管目が２０倍、第３管目以降は倍々の希釈倍数となり、ＴＰＨＡと同様に４０倍をカットオフ値とした。８０倍以上で凝集が認められたものは陽性となる。結果は表１に示した。
【００３３】
【表１】

【００３４】
４．結論
上記結果から明らかなように、本発明の着色微粒子を用いたＴＰ抗原感作微粒子は、赤血球を担体としたＴＰＨＡと同等の感度に判定され大幅に判定時間を短縮した。
【００３５】
【発明の効果】
本発明の微粒子を用いることにより、従来品に比べ保存安定性が良好で、大幅に判定時間の短縮した診断試薬を提供することができる。

Claims

シランカップリング剤で処理したシリカ微粒子をポリアクロレインで被覆し、染料にて染色した診断試薬用の微粒子。
マイクロタイター法に用いるための請求項１記載の微粒子。