JP3714921B2

JP3714921B2 - Blood test method

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Publication number: JP3714921B2
Application number: JP2002106040A
Authority: JP
Inventors: 昇堀口; 裕堀口
Original assignee: 昇堀口
Priority date: 2002-04-09
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2005-11-09
Anticipated expiration: 2022-04-09
Also published as: JP2003302405A; TW200513645A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】
本願発明は、血液の所定細胞内成分を簡便に取り出し、生化学的に検査することにより、早期に正確な病態把握を行うことができるようにした血液の検査方法に関するものである。
【従来の技術】
【０００３】
従来から、血液の液体部分である血漿中の成分を取り出して生化学的に分析する血液検査は、患者の病態を把握する有効な検体検査方法の一つとして、多くの医療現場で実施されている。
【０００４】
このような血液検査によって把握しようとする病態には種々のものがあるが、例えば糖尿病の場合を例にとると、患者の空腹時および食事後における血液中（血漿中）のブドウ糖の濃度が測定される。そして、同測定されたブドウ糖の濃度、すなわち血糖値が所定値以上に高いと、糖尿病ないし糖尿病が進行している可能性が高いと判定される。また、例えば慢性呼吸器疾患や心不全、腎不全の場合だと、血液中（血漿中）の乳酸濃度が測定され、同測定された乳酸濃度が所定値以上に高いと、慢性呼吸器疾患や心不全、腎不全が進行している可能性が高いと判定される。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
周知のように人間の細胞は、ブドウ糖を主たるエネルギー源としており、夜間も脳、神経、血球、筋肉など、全身の細胞が糖を利用している。一方、肝臓は脂肪やアミノ酸から糖を作って放出している。通常は肝臓の糖放出率と全身細胞の糖利用率が一致しているから、血糖値は一定値（１０９ｍｇ／ｄＬ）以下にある。
【０００６】
そして、そのように全身細胞にブドウ糖を取り込ませ、有効に利用させているのがインスリンというホルモンである。食事を摂ると、糖質はブドウ糖となって小腸から急速に吸収され、血液中に入って全身をめぐる。そして、それにより血糖値が上昇すると、膵臓から瞬時に十分な量のインスリンが分泌される。すると、肝臓は糖の放出を停止する。一方、全身の細胞が糖を取り込むようになり、上記食事後上昇した血糖値は速やかに食事前の値に戻る。これを繰り返しているのが、健康な人の血糖値の動きである。
【０００７】
しかし、食事後血糖値が上昇したのに、「インスリンがゆっくりとしか分泌されないし、分泌量も少ない」という体質の人に、さらに運動不足や過食などが加わってインスリンの働きが低下してくると、上記ブドウ糖が細胞内に取り込まれにくくなって、血液中に過剰なブドウ糖がだぶついてくる。そして、食事後相当な時間が経過しても血糖値が低下しなくなる。
【０００８】
このような状況が「高血糖」状態であり、上記従来一般の生化学的な血液検査方法では、該高血糖状態を把握しようとする場合、上述のように空腹時の血糖値（ＦＢＳ）と食事後の血糖値との両方の測定が血液中の血漿成分を検体として行われる。その結果、例えば空腹時の血漿中の血糖値が１４０ｍｇ／ｄＬ以上であったり、食事後の同血糖値が２００ｍｇ／ｄＬ以上あると、一般に糖尿病（２型糖尿病）と診断される。そして、そのような高血糖状態が長期間持続すると、網膜症や腎症などの糖尿病に特有の血管障害が発症してくる。そして、同血糖値が高ければ高いほど、またその時間が長ければ長いほど、網膜症や腎症が悪化する。
【０００９】
ところが、最近では、上記のような従来一般の生化学的な血液検査、すなわち血漿成分中の血糖値検査では、未だ糖尿病と診断されるほどには血糖値が高くない患者に、心筋梗塞が発症するケースが多くなっている。すなわち、糖尿病予備軍といわれる早期、軽症の糖尿病患者にも動脈硬化症が発症し、進展することが確認されてきている。
【００１０】
例えば食事前の血糖値は正常域にあり、健常である。しかし、毎食事後に血糖値が異常に高くなるといったケースが見られる（いわゆる軽症２型糖尿病）。このように食事前の血糖値が正常域にあっても、食事後に異常に血糖値が高くなると、インスリンが当該血糖値の上昇に遅れて、しかし高血糖に刺激されて過剰に分泌される。もちろん運動習慣を有する患者の場合には、上記膵臓から分泌されるインスリンによってブドウ糖は筋に取り込まれるが、運動不足の患者の場合には脂肪細胞に取り込まれる。脂肪細胞に取り込まれた糖は脂肪に変わり、肥満が促進され、高脂血症が引き起こされる。そして、高インスリン血症の持続は、高血圧症をもたらす。
【００１１】
この結果、上述のインスリン分泌パターンが遅延型という体質を有する人の場合、「軽い糖尿病（軽症２型）」、「僅かな肥満」、「軽度高脂血症」、「軽い高血圧」といった悪条件が揃うことにより、動脈硬化症が進行しやすいことが頸動脈壁のエコー検査等により証明されている。事実、最近の日本の研究で、糖尿病と診断されたばかりの住民を１０年間観察すると、１０人に１人が心筋梗塞を、もう１人が脳梗塞を発症することも報告されている。したがって、肉親に糖尿病の人がいたら、糖尿病と診断される前に過食や運動不足に留意すべきである、と言われる位、糖尿病に関して事前の認識、早期の病態把握の必要性が要請されている。
【００１２】
しかし、上記血液の血漿成分を検体とする従来の生化学的な検査方法では、血漿中のブドウ糖濃度を先行的に支配する血液細胞である赤血球内の成分状態の変化（ブドウ糖濃度の上昇、代謝状態等）そのものの分析を行うことができず、同成分が血液の細胞である赤血球中から外部に滲み出し血漿中に表象して初めて分析判定されるにすぎないから、どうしても判定が遅くなり、上記のような早期病態把握の要請には、必ずしも有効に応えられていない問題がある。
【００１３】
そのことが、上述のような低血糖診断を受けながらも、高脂血症、心不全等の症例を招いていると考えられる。したがって、本来早期の病態把握を可能とするためには、血液の細胞成分であり、血漿中に取り込まれたブドウ糖を解糖分解する代謝機能を有し、血漿中の血糖値を上流側で先行的に支配する赤血球細胞内のブドウ糖濃度（血糖値状態）を知ることが肝要である。
【００１４】
また、一方上記のような糖尿病その他の病態にある患者の血液中の酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定すると、病態時は酸化還元電位が酸化状態にあり、他方健康時には還元状態にあることが見出される。したがって、これらのことも上記早期の病態把握を可能にする有益な判定パラメータになるが、この場合にも当該酸化還元電位の決定に上記赤血球中の乳酸濃度が大きく影響しており、上記の場合と同様に、同赤血球内の酸化還元電位とともに糖質代謝物としてのピルビン酸濃度や乳酸濃度を知ることが肝要である。
【００１５】
しかし、これまで臨床的に行われている赤血球の検査には、赤血球数やヘマトクリット値、ヘモグロビン量の測定、網状赤血球、異常ヘモグロビンの検査などがあるだけで、赤血球中の細胞内液成分を取り出して生化学的に簡便に検査する血液の検査方法は、未だ提案されていないのが実情である。
【００１６】
本願発明は、このような事実に着目し、特に血液の赤血球細胞内のブドウ糖濃度や乳酸濃度、ピルビン酸濃度、さらには酸化還元電位等を測定し、それらの各々により又はそれらの各々を総合して適切に病態把握を行うようにすることにより、一般に血液の生化学検査が有効とされている各種の病態について、早期軽症の段階から正確かつ的確な病態把握を行えるようにした血液の検査方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本願各発明は、上記の目的を達成するために、次のような課題解決手段を備えて構成されている。
【００１８】
（１）請求項１の発明
この発明の血液の検査方法は、次のａ〜ｉの工程により構成されている。
【００１９】
（ａ）先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００２０】
（ｂ）次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する。
【００２１】
（ｃ）次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する。
【００２２】
（ｄ）次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、同食塩水中の赤血球数が４００万／μｌ前後の赤血球浮遊液を作る。
【００２３】
（ｅ）次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する。
【００２４】
（ｆ）次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる。
【００２５】
（ｇ）次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する。
【００２６】
（ｈ）次に、該上澄み成分を生化学自動分析装置にかけて、同上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を測定する。
【００２７】
（ｉ）次に、該測定した上記上澄み成分中のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度に基づいて、所定の計算方法により最終的に赤血球内のブドウ糖濃度又はピルビン酸濃度、乳酸濃度を求める。
【００２８】
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、同血漿中の成分状態を先行的に支配する血液の細胞である赤血球内の成分から、血糖値又はピルビン酸値、乳酸値を測定することができるようになり、時間的に先行し未だ血漿側には表われていない赤血球細胞内の血糖値の上昇やピルビン酸値、乳酸値の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００２９】
そのため、該検査方法によれば、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００３０】
（２）請求項２の発明
この発明の血液の検査方法は、次のａ〜ｉの工程により構成されている。
【００３１】
（ａ）先ず、血液凝固防止剤を入れた採血管を用いて所定量の静脈血を採血し、所定時間遠心することによって血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００３２】
（ｂ）次に、そのようにして取り出された血球部分に、所定濃度の分離促進剤を加え、さらに所定時間遠心することによって、白血球、血小板等のバフィーコートを除去する。
【００３３】
（ｃ）次に、該白血球、血小板等のバフィーコートが除去された赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに所定時間遠心することによって洗浄する。
【００３４】
（ｄ）次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、ヘマトクリット値が５０％の赤血球浮遊液を作る。
【００３５】
（ｅ）次に、該赤血球浮遊液を所定時間遠心することによって、その上澄み分（ＰＢＳ）を除去する。
【００３６】
（ｆ）次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として所定濃度の食塩水を加え、ほぼ人の体温と同じ温度の下で、所定時間インキュベーションすることによって、赤血球細胞内の成分を浸透圧により浮遊液側に滲み出させる。
【００３７】
（ｇ）次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに所定時間遠心して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出た上澄み成分を採取する。
【００３８】
（ｈ）次に、該上澄み成分を酸化還元電位計にかけて、同成分中の酸化還元電位を測定する。
【００３９】
（ｉ）次に、同一被験者から別途採取した血清を用いて検量線を作成し、上記実測した上澄み成分中の酸化還元電位から、最終的に赤血球細胞内の酸化還元電位を求める。
【００４０】
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、同血漿中の酸化還元状態を先行的に支配する血液の細胞である赤血球内の成分から、酸化還元電位を測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない赤血球細胞内の酸化還元電位を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００４１】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種の病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【発明の効果】
【００４２】
以上の結果、本願発明の血液検査方法によると、血液の細胞外成分である血漿から血糖値、ピルビン酸値、乳酸値等を測定して糖尿病等の病態を判定する従来の血液検査方法では正確な病態判定ができなかった正常血糖値状態や、正常ピルビン酸値又は低ピルビン酸値状態、正常乳酸値又は低乳酸値状態の患者の真の病態をも正確に判定することが可能になり、より的確な早期診断、早期治療が可能となる。
【発明の実施の形態】
【００４３】
（実施の形態１）
先ず本願発明の実施の形態１に係る血液の検査方法の詳細について説明する。
【００４４】
この実施の形態では、血球細胞の一つである赤血球内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）および乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）を測定するようにしたことを特徴としている。
【００４５】
すなわち、この実施の形態の血液の検査方法は、次の（ａ）〜（ｉ）の工程により構成されている。
【００４６】
（ａ）先ず、赤血球の凝固を防止するための血液凝固防止剤として例えばヘパリン（又はＥＤＴＡ）を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血２ｍｌを採血し、例えば５分間遠心（例えば遠心力１５０ｇ程度）することにより、その内の血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分（赤血球、白血球、血小板）のみを取り出す。
【００４７】
すなわち、上記ヘパリン（又はＥＤＴＡ）により赤血球が固まらないようにしておいて、上記採決した２ｍｌの血液を、１５０ｇ程度の遠心力で、５分間ほど遠心分離すると、その内の血漿成分が除かれて、赤血球、白血球、血小板等の血球成分のみになる。
【００４８】
（ｂ）次に、そのようにして取り出された血球成分に、赤血球とそれ以外の血球成分、すなわち白血球、血小板等のバフィーコートを分離させやすくするための分離促進剤として、例えば濃度２５％前後のメトリザマイト０．２ｍｌ程度を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１０００ｇ）することによって、白血球、血小板等のバフィーコートをできるだけ確実に除去する。
【００４９】
すなわち、赤血球、白血球、血小板よりなる血球成分を上記のようにメトリザマイトを加えて１０００ｇ程度の大きな遠心力で遠心分離すると、赤血球のほうが当該血球中の他の成分よりも重いので、下方へ沈む。この沈んだ赤い層が赤血球となる。
【００５０】
このようにして、血球成分中から白血球、血小板等のバフィーコートを確実に除去するようにすると、赤血球のみを効率良く取り出すことができ、以後の工程において、より高精度に赤血球中の成分が取り出し易くなり、より正確な赤血球内ブドウ糖、乳酸濃度の測定が可能となる。
【００５１】
（ｃ）次に、該白血球、血小板等のバフィーコートを除去した赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって洗浄する。
【００５２】
これにより、さらに赤血球の表面に付着している血漿成分や白血球、血小板が確実に除かれる。
【００５３】
（ｄ）次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、同生理食塩水中の赤血球数が例えば４００万／μｌ前後の赤血球浮遊液２ｍｌを作る。
【００５４】
このようにして、後述するブドウ糖濃度および乳酸濃度の測定に必要な赤血球を壊されにくく、かつ細胞内成分を取り出しやすい安定した状態に保存する。
【００５５】
（ｅ）次に、該赤血球浮遊液を、例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって、そのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の上澄み分を除去する。
【００５６】
（ｆ）次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として例えば濃度５％程度の食塩水（ＮａＣｌ）を、上記除去した上澄み分に代替させる形で加えることによって全量を２ｍｌとし、ほぼ人の体温と同じ程度の保温温度３７℃の下で、例えば１０分間程度インキュベーションする。
【００５７】
この結果、赤血球細胞内と赤血球浮遊液との間に作用する浸透圧により、同食塩水を含む浮遊液内の赤血球中からブドウ糖や乳酸成分を含む内液成分が水分とともに、同食塩水を含む浮遊液側に滲み出して行く。
【００５８】
（ｇ）次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに例えば１０分間程度遠心（例えば遠心力１７５０ｇ）して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出した上澄み成分を採取する。
【００５９】
（ｈ）次に、該上澄み成分を生化学自動分析装置にかけて、同上澄み成分中の、ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）Ａ、乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）Ｂを各々測定する。
【００６０】
（ｉ）次に、該測定した上澄み成分中のブドウ糖濃度Ａおよび乳酸濃度Ｂに基づいて、次に述べる所定の計算方法により、最終的に赤血球内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）、乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）を求め、対応する糖尿病、慢性呼吸器疾患等の病態の判定を行う。
【００６１】
同最終的な赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）および乳酸濃度（Ｌ−乳酸濃度）は、例えば次のようにして求められる。
【００６２】
ブドウ糖濃度又は乳酸濃度＝測定値A又はB×(赤血球浮遊液全量[ml]／全赤血
球容積[ml])
＝測定値A又はB×{赤血球浮遊液全量[2ml]／2(赤血
球浮遊液濃度[万/μl]×10³×平均赤血球容積[fl]
×10^-15×10³)｝
このような構成によれば、従来のような血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、血液中に取り込まれたブドウ糖の代謝解糖機能を有し、同血漿中の血糖値等成分状態を先行的に支配する血液細胞である赤血球内の成分から、血糖値、乳酸値を正確に測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない血糖値の上昇や乳酸値の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００６３】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００６４】
−実施例−
例えばインスリン非依存性糖尿病患者（ＮＩＤＤＭ患者）３７名と健常成人５２名の任意の時刻における赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）を上記の方法で、また同血液の血漿中の血糖値を従来と同様の方法で各々測定した。
【００６５】
その結果、インスリン非依存性糖尿病患者の場合、血漿中の血糖値が高いと赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）も高く、血糖値が３５０ｍｇ／ｄｌ位で赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）は５０ｍｇ／ｄｌにも達した。すなわち、両者の間には正の相関が認められた。
【００６６】
一方、健常成人の場合には、血糖値１５０ｍｇ／ｄｌ位までで、赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）は最大１０ｍｇ／ｄｌであり、やはり正の相関が認められた。
【００６７】
これらインスリン非依存性患者と健常成人のすべてのデータから見ても、血漿中の血糖値と赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）との間には、明らかに正の相関が認められる。
【００６８】
したがって、この実施例からも、上記本実施の形態に係る血液検査方法の検査精度、早期病態把握の有効性が確認される。
【００６９】
（実施の形態２）
次に本願発明の実施の形態２に係る血液の検査方法の詳細について説明する。
【００７０】
この実施の形態では、血球内細胞の一つである赤血球内液の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を測定するようにしたことを特徴としている。
【００７１】
この実施の形態の血液の検査方法は、次の（ａ）〜（ｉ）の工程により構成されている。
【００７２】
（ａ）先ず、赤血球の凝固を防止するための血液凝固防止剤としてヘパリン（又はＥＤＴＡ）を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血２ｍｌを採血し、例えば５分間遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することにより、血漿成分を除去し、血液中の細胞成分である血球部分のみを取り出す。
【００７３】
すなわち、ヘパリン（又はＥＤＴＡ）により赤血球が固まらないようにしておいて、採決した２ｍｌの血液を、１５０ｇ程度の遠心力で、５分間ほど遠心分離すると、その内の血漿成分が除かれて、赤血球、白血球、血小板等の血球成分のみになる。
【００７４】
（ａ′）血液凝固促進剤および血清分離剤を所定量入れた採血管を用いて、被検者から、例えば静脈血４ｍｌを採血し、例えば３０００ｒｐｍで１０分間ほど遠心して血清を採取する。
【００７５】
なお、この（ａ′）の静脈血４ｍｌの採血と上記（ａ）の静脈血２ｍｌの採血とは、必ずしも別々に行う必要はなく、例えば６ｍｌの採血を２ｍｌと４ｍｌに分けて使用するようにしても良いことは言うまでもない。
【００７６】
（ｂ）次に、上記（ａ）のようにして取り出された血球成分に、赤血球とそれ以外の血球成分、すなわち白血球、血小板等のバフィーコートを分離させやすくする分離促進剤として、例えば濃度２５％前後のメトリザマイト０．２ｍｌ程度を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１０００ｇ）することによって、上記白血球、血小板等のバフィーコートをできるだけ確実に除去する。
【００７７】
すなわち、赤血球、白血球、血小板よりなる血球成分に上記のようにメトリザマイトを加えて上記１０００ｇ程度の大きな遠心力で遠心分離すると、赤血球のほうが当該血球中の他の成分よりも重いので、下方へ沈む。この沈んだ赤い層が赤血球となる。
【００７８】
このようにして、白血球、血小板等のバフィーコートを確実に除去するようにすると、赤血球のみを効率良く取り出すことができ、以後の工程において、より高精度に赤血球中の成分が取り出し易くなる。
【００７９】
（ｃ）次に、該白血球、血小板等のバフィーコートを除去した赤血球に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、さらに例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって洗浄する。
【００８０】
これにより、さらに赤血球の表面に付着している血漿成分や白血球、血小板が確実に除かれる。
【００８１】
（ｄ）次に、該洗浄後、再度リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、かつ自動血球計算器を用いて、ヘマトクリット値が５０％の赤血球浮遊液２ｍｌを作る。
【００８２】
このようにして、後述する酸化還元電位の測定に必要な赤血球を壊されにくく、かつ細胞内成分を取り出しやすい安定した状態に保存する。
【００８３】
（ｅ）次に、該赤血球浮遊液を、例えば５分間程度遠心（例えば遠心力１５０ｇ）することによって、上記リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の上澄み分を除去する。
【００８４】
（ｆ）次に、赤血球細胞内の成分を取り出しやすくするために、高張液として例えば濃度５％程度の食塩水（ＮａＣｌ）を上記除去したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）分だけ加えることによって全量を同じ２ｍｌとし、ほぼ人の体温と同じ程度の保温温度３７℃の下で、例えば１０分間程度インキュベーションする。
【００８５】
この結果、赤血球細胞内と赤血球浮遊液との間に作用する浸透圧により、同食塩水を含む浮遊液内の赤血球中からブドウ糖や乳酸成分を含む内液成分が水分とともに、同食塩水を含む浮遊液側に滲み出して行く。
【００８６】
（ｇ）次に、該インキュベーション終了後、同赤血球浮遊液を、さらに例えば１０分間程度遠心（例えば遠心力１７５０ｇ）して、上記赤血球細胞内の成分が滲み出した上澄み成分を採取する。
【００８７】
（ｈ）次に、該上澄み成分を酸化還元電位計（ＯＲＰ計）にかけて、同成分中の酸化還元電位（ＯＲＰ）を測定する。
【００８８】
（ｉ）次に、例えば図２に示すように、同一被検者から採取した上記（ａ′）の血清を用いて、例えば図１に示すような検量線を作成し、上記酸化還元電位計による実測の酸化還元電位（ＯＲＰ）から、最終的な赤血球細胞内の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を求める。
【００８９】
ここで図１のような検量線を作成するのは、次のような理由によっている。
【００９０】
すなわち、本来は、直接赤血球の細胞内液の酸化還元電位を測定したいところである。しかし、赤血球細胞内に刺入して測定できる、針電極はない。そこで、上記赤血球の細胞内液を細胞の外へ漏出させ、それを測定することが考えられる。しかし、機械的に赤血球を圧縮したのでは、赤血球膜や赤血球内のヘモグロビン等が壊され、細胞内液に混じってしまう。それでは細胞内液の純粋な酸化還元電位を測定したことにはならない。
【００９１】
そこで、細胞内液のみが純粋に抽出されるようにするために、赤血球を浮遊させている溶液を細胞内液よりも高張液にすると、細胞内液は浸透圧により高張液側へ移動することになる。
【００９２】
しかし、それによって得られた溶液は、細胞内液と高張液との混合液である。そのため、その酸化還元電位は細胞内液のみの酸化還元電位ではなく、高張液との混合液の酸化還元電位になる。そこで、通常の状態では細胞内液と細胞外液（血清）とは細胞膜を介して互いに出入りしていると考えられるので、同一被検者ならば細胞内液と血清の基本的性質は同じと考えられる。無論、細胞内でより多くの活性酸素が発生したり乳酸やピルビン酸等の酸性物質が産生されたりするので、酸性酸化状態は、細胞内液において圧倒的に強いわけであるが、体液としては、同一被検者における細胞内液も細胞外液も同じ性質と考えられる。したがって、細胞外液である血清の酸化還元電位の正又は負の方向の延長線上に、細胞内液の酸化還元電位があると考えられる。
【００９３】
上述のように赤血球を５％食塩水に浸すことによって、細胞内液が高張液側に全部漏出されてきたとすれば、その混合液、すなわち遠心分離後の上澄み分のうち、細胞内液が５０％、高張液が５０％ということになる。
【００９４】
もちろん、このことは上記実験行程の中で５％食塩水を用いてヘマトクリット値５０％の赤血球浮遊液を作成したことに起因している。そこで、血清の酸化還元電位と５％食塩水で２倍に希釈したその血清の酸化還元電位とをそれぞれ求め、これらにより決まる点を図示Ａ点とする。次に、もとの血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した血清の酸化還元電位と、同リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍に希釈した血清をさらに５％食塩水で２倍に希釈した血清の酸化還元電位とによって得られたのが図示Ｂ点である。なぜ血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈できるかについては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、リン酸緩衝生理食塩水自体の性質として、その血清の基本的な性質は変えないのでこれを用いたわけである。同様にＣ点はもとの血清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４倍に希釈したものの酸化還元電位と、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４倍に希釈した血清を５％食塩水で２倍に希釈したものの酸化還元電位とによって求められた点である。これらＡ，Ｂ，Ｃの各点を結んで正又は負の方向へ延長線を引き、これを検量線とする。そして、細胞内液と上記５％食塩水の混合液における酸化還元電位の実測値を、先程の検量線のＹ軸（血清を５％食塩水で希釈して求めた酸化還元電位の目盛りの軸）に当てはめ、Ｘ軸の目盛りから推測される細胞内液の酸化還元電位を読み取る。すなわち、血清酸化還元電位の正又は負の延長線上に細胞内液の酸化還元電位があると考えるわけである。
【００９５】
（ｊ）最後に、該赤血球細胞内の酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）に基いて所定の処理を行ない対応する病態の判定を行う。
【００９６】
なお、以上の工程（ｈ）において、上記酸化還元電位計（ＯＲＰ計）で、酸化還元電位（ＯＲＰ）を求めるには、測定値に対して比較電極の電位を加える。この比較電極の電位は、その時の上澄み成分の温度に応じて決定され、例えば同温度が０〜６０℃の間では、図３の表のようになっている。
【００９７】
このような構成によれば、従来の血球外の液体成分である血漿成分を用いた血液検査方法と異なり、血液中に取り込まれたブドウ糖の代謝解糖機能を有し、同血漿中の成分状態を先行的に支配する血球中の細胞である赤血球の内液成分から、酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）を測定することができるようになり、未だ血漿側には表われていない酸化還元電位（Ｒｃ−ＯＲＰ）の変化を血漿側に表われるよりも早く知ることができる。
【００９８】
そのため、糖尿病や慢性呼吸器疾患、心不全、腎不全などの各種病態を可及的早期に診断して、的確に対応治療することができるようになる。
【００９９】
（実施の形態３）
上記実施の形態１に関する実施例においても示されるように、例えばインスリン非依存性患者（ＮＩＤＤＭ患者）の場合、血漿中の血糖値が高いほど赤血球細胞内のブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）も高いが、これは何らかの理由で赤血球細胞内でのブドウ糖代謝機能が抑制されているからであると考えられる。
【０１００】
一方、本件発明者の知見によると、同患者に対して、例えば所定量のマイナスイオンを照射した後、血漿中の血糖値および赤血球細胞内のブドウ糖濃度を測定すると、血漿中の血糖値の減少とともに赤血球細胞内のブドウ糖濃度が減少し、反対に赤血球細胞内及び血液中のピルビン酸濃度や乳酸濃度が増加した。
【０１０１】
このことは赤血球細胞がＴＣＡ回路を持たず、嫌気的解糖系のみであることを考えれば、マイナスイオンによってブドウ糖代謝が促進したためと推測される。その作用機序は、マイナスイオンの本質が電子（ｅ^-）であり、血液ｐＨを上昇（Ｈ⁺＋ｅ^-→Ｈ）させたことが結果的に赤血球細胞内ｐＨの上昇につながり、それが嫌気的解糖系でのグルコース代謝に関わる酵素、例えばホスホフルクトキナーゼなどの活性を高め、ブドウ糖代謝が促進したものと考えられる。
【０１０２】
このようなマイナスイオンの作用は、細胞内へのブドウ糖の取り込みにインスリンを必要とする骨格筋や脂肪細胞においても同じであると考えられる。
【０１０３】
先ず、インスリン受容体にインスリンが結合すると、細胞膜のＮａ⁺／Ｈ⁺チャンネルが活性化され、細胞外のＮａ⁺が細胞内へ、細胞内のＨ⁺が細胞外へくみ出される。しかし、細胞間質液ｐＨが低下していると、例えばインスリンが存在していてもＮａ⁺／Ｈ⁺エクスチェンジャーが十分活性化されない。
【０１０４】
すでに、上記マイナスイオンは、細胞間質液ｐＨを上昇させることが判明しており、結果としてマイナスイオンがインスリンのＮａ⁺／Ｈ⁺チャンネルの活性化を促し、細胞内ｐＨを上昇させることからブドウ糖代謝酵素の活性が高まり、ブドウ糖代謝が亢進すると推測される。
【０１０５】
上記インスリン非依存性（ＮＩＤＤＭ患者）で赤血球細胞内のブドウ糖代謝が低下している理由は、不明である。しかし、糖尿病における酸性体質が細胞間質液ｐＨの低下と細胞内ｐＨの低下とを招いており、これが赤血球細胞内でのブドウ糖代謝酵素の活性を低下させ、解糖を阻害していると指摘する研究者もいる。同研究者によると、ストレプトゾトシン投与で糖尿病にしたラットにマイナスイオンを照射すると、細胞間質液ｐＨが上昇することを証明し、これが糖尿病状態の改善につながるとしている。
【０１０６】
そこで、これを確認するために、例えば上記インスリン非依存性患者（ＮＩＤＤＭ患者）にマイナスイオンを照射して、その血液ｐＨと赤血球細胞内ブドウ糖濃度（Ｄ−グルコース濃度）の変化を調べ、同時にＴＣＡ回路をもたず嫌気的解糖系のみを有する赤血球細胞の場合、ブドウ糖代謝の終末産物であるピルビン酸や乳酸値が同赤血球細胞内で実際に変化するか否かを判定することが考えられるが、そのための同ピルビン酸濃度の測定に際しても、上記実施の形態１の（ａ）〜（ｉ）の濃度測定方法を全く同様に適用して、同様に測定することができる。
【０１０７】
ピルビン酸は赤血球以外の細胞、すなわちＴＣＡ回路（クレブス回路又はクエン酸回路）をもつ細胞では、アセチルＣｏＡを介してＴＣＡサイクルに入り、酸化過程を経て最終的にＡＴＰエネルギーが産生される。
【０１０８】
しかし、赤血球細胞内ではＴＣＡサイクルをもたないため、乳酸デヒトロキナーゼ（乳酸脱水素酵素）のもとで乳酸に変化する。しかし、同時にピルビン酸の乳酸への変化は化学的にはピルビン酸の還元が行われたことになり、その還元作用をもつのが解糖系の中間段階で作られるＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）である。
【０１０９】
ところが赤血球細胞の中には、酸素を運ぶためのヘモグロビンが存在し、このヘモグロビンが、しばしば酸素あるいは活性酸素によって酸化され、メトヘモグロビンになる。メトヘモグロビンは酸素を結合することができないので、抹消組織での酸素欠乏状態が生じることになる。
【０１１０】
そこで、ヘモグロビンが酸化されないために、上述の解糖の中間段階で生じるＮＡＤＨが用いられる。しかしそうなった場合には、上記ピルビン酸が乳酸に変わることができなくなるために、細胞内のピルビン酸濃度が上昇する。しかし、ピルビン酸は乳酸と並んで酸性物質であり、細胞内ｐＨが低下しやすくなる。細胞内ｐＨが低下すると解糖系に必要な酵素活性が失活し、ブドウ糖代謝（グルコース代謝）が阻害される。すなわち、細胞内のブドウ糖濃度が上昇しやすくなる。この時、細胞内酸化還元電位は酸素又は活性酸素が多いと上昇しやすくなるが、細胞内の還元性を有する物質すなわちＮＡＤＨ、還元型グルタチオン、還元型アスコルビン酸等の総和量が多いと酸化還元電位は低く保たれる。
【０１１１】
したがって、メトヘモグロビンの発生量と細胞内酸化還元電位との明らかな相関はない。
【０１１２】
しかし、細胞内酸化還元電位が高いとヘモグロビンが酸化されやすいことは容易に想像されるし、もし乳酸脱水素酵素欠損症という病気がないならば、ピルビン酸濃度上昇の原因は、上記ＮＡＤＨがメトヘモグロビンの還元に利用されているためであると推測することができる。
【０１１３】
一方、細胞内酸化還元電位の上昇は、赤血球細胞膜の過酸化を促進し、そのため細胞膜を介して物質の移動ができなくなると考えられる。これらのことが糖尿病をはじめさまざまな病気を引き起こすと考えられる。
【０１１４】
したがって、このような理由から、臨床的にも病態把握上ピルビン酸濃度の測定を行う意義がある。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本願発明の実施の形態２に係る血液の検査方法において作成される検量線を示す図である。
【図２】図２は、同図１の検量線を作成するための測定ファクターをＸ−Ｙ各軸のパラメータで示した図表である。
【図３】図３は、同検査方法における酸化還元電位計を用いた酸化還元電位の算出に使用される外気温度に応じた比較電極の電位加算表である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
[0002]
The present invention relates to a blood test method that enables accurate pathological grasp at an early stage by simply taking out a predetermined intracellular component of blood and biochemically testing it.
[Prior art]
[0003]
Traditionally, blood tests that extract and biochemically analyze plasma components, which are the liquid part of blood, have been carried out in many medical settings as one of the effective specimen testing methods for understanding the pathology of patients. Yes.
[0004]
There are various pathological conditions to be grasped by such blood tests. For example, in the case of diabetes, the concentration of glucose in the blood (plasma) is measured when the patient is fasting and after a meal. Is done. If the measured glucose concentration, that is, the blood glucose level is higher than a predetermined value, it is determined that there is a high possibility that diabetes or diabetes is progressing. For example, in the case of chronic respiratory disease, heart failure, or renal failure, the lactic acid concentration in blood (plasma) is measured, and if the measured lactic acid concentration is higher than a predetermined value, chronic respiratory disease or heart failure It is determined that there is a high possibility that renal failure has progressed.
[Problems to be solved by the invention]
[0005]
As is well known, human cells use glucose as the main energy source, and cells throughout the body, such as the brain, nerves, blood cells, and muscles, use sugar at night. On the other hand, the liver makes sugar from fat and amino acids and releases it. Normally, the sugar release rate of the liver and the sugar utilization rate of the whole body cells match, so the blood glucose level is below a certain value (109 mg / dL).
[0006]
And it is a hormone called insulin that takes glucose into the whole body cells and uses it effectively. When you eat, carbohydrates are rapidly absorbed from the small intestine as glucose and enter the blood for circulation throughout the body. And when a blood glucose level rises thereby, sufficient amount of insulin is secreted instantaneously from pancreas. The liver then stops releasing sugar. On the other hand, the cells of the whole body take in sugar, and the blood sugar level that has risen after the meal quickly returns to the value before the meal. It is the movement of blood sugar levels of healthy people that repeats this.
[0007]
However, even though the blood glucose level increased after meals, people with a constitution that “only insulin is secreted slowly and the amount is secreted” are further added to the lack of exercise and overeating, and the function of insulin decreases. Then, it becomes difficult for the above-mentioned glucose to be taken into the cells, and excessive glucose is accumulated in the blood. And even if considerable time passes after a meal, a blood glucose level does not fall.
[0008]
Such a situation is a “hyperglycemia” state, and in the conventional general biochemical blood test method, when trying to grasp the hyperglycemia state, as described above, the fasting blood glucose level (FBS) Both blood glucose levels after meals are measured using blood plasma components as samples. As a result, diabetes (type 2 diabetes) is generally diagnosed when, for example, the blood glucose level in plasma during fasting is 140 mg / dL or more, or the blood glucose level after meal is 200 mg / dL or more. When such a hyperglycemic state persists for a long period of time, vascular disorders peculiar to diabetes such as retinopathy and nephropathy develop. And the higher the blood glucose level and the longer the time, the worse the retinopathy and nephropathy.
[0009]
However, in recent years, myocardial infarction has developed in patients who have not yet been diagnosed with diabetes by conventional biochemical blood tests as described above, that is, blood glucose levels in plasma components. There are more cases to do. In other words, it has been confirmed that arteriosclerosis develops and progresses even in early and mild diabetic patients called diabetic reserves.
[0010]
For example, blood sugar levels before meals are in a normal range and are healthy. However, there are cases where blood glucose levels become abnormally high after every meal (so-called mild type 2 diabetes). Thus, even if the blood glucose level before a meal is in a normal range, if the blood glucose level becomes abnormally high after a meal, insulin is delayed by an increase in the blood glucose level, but is stimulated by hyperglycemia and excessively secreted. Of course, in the case of a patient having exercise habits, glucose is taken into muscles by insulin secreted from the pancreas, but in the case of a patient with insufficient exercise, it is taken up into fat cells. The sugar taken up by fat cells is changed to fat, obesity is promoted, and hyperlipidemia is caused. And the persistence of hyperinsulinemia results in hypertension.
[0011]
As a result, in the case of a person having a constitution that the above-mentioned insulin secretion pattern is delayed, adverse conditions such as “mild diabetes (mild type 2)”, “slightly obese”, “mild hyperlipidemia”, “mild hypertension” It is proved by the echo examination of the carotid artery wall that arteriosclerosis is easy to progress. In fact, in a recent Japanese study, it has been reported that one in 10 people develops myocardial infarction and another one develops cerebral infarction when observing residents who have just been diagnosed with diabetes for 10 years. Therefore, it is said that if there is a relative who has diabetes, attention to overeating and lack of exercise should be taken into account before being diagnosed with diabetes. Yes.
[0012]
However, in the conventional biochemical test method using the plasma component of blood as a specimen, changes in the component state in erythrocytes, which are blood cells that predominate the glucose concentration in plasma (increased glucose concentration, metabolism) Condition etc.) itself can not be analyzed, it is only analyzed and judged only when the same component oozes out from the red blood cells that are blood cells and is represented in the plasma, so the judgment is inevitably delayed, There is a problem that the request for grasping the early pathological condition as described above is not always effectively answered.
[0013]
This is considered to have caused cases such as hyperlipidemia and heart failure while undergoing the above hypoglycemia diagnosis. Therefore, in order to make it possible to grasp the pathological condition at an early stage, it is a cellular component of blood, has a metabolic function of glycolytically degrading glucose taken in plasma, and precedes blood glucose levels in plasma upstream. It is important to know the glucose concentration (blood glucose level state) in the red blood cells that governs the environment.
[0014]
On the other hand, when the redox potential (ORP) in the blood of a patient with diabetes or other pathologies as described above is measured, it is found that the redox potential is in an oxidized state during the pathological state and is in a reduced state during health. It is. Therefore, these are also useful determination parameters that enable the early understanding of the pathological condition, but in this case as well, the lactic acid concentration in the red blood cells has a great influence on the determination of the redox potential. Similarly, it is important to know the pyruvate concentration and lactic acid concentration as carbohydrate metabolites as well as the redox potential in the erythrocytes.
[0015]
However, red blood cell tests that have been clinically performed so far include measurement of red blood cell count, hematocrit value, hemoglobin content, reticulocyte, abnormal hemoglobin, etc. In fact, no method has been proposed yet for blood testing methods that are biochemically simple.
[0016]
The present invention pays attention to such facts, and in particular, measures glucose concentration, lactate concentration, pyruvate concentration, redox potential, etc. in red blood cells of blood, and combines each of them or each of them. Blood test method that enables accurate and accurate understanding of the pathological condition from the early stage of mildness for various pathological conditions for which blood biochemical tests are generally effective. Is intended to provide.
[Means for Solving the Problems]
[0017]
In order to achieve the above object, each invention of the present application includes the following problem solving means.
[0018]
(1) Invention of Claim 1
The blood test method of the present invention comprises the following steps a to i.
[0019]
(A) First, a predetermined amount of venous blood is collected using a blood collection tube containing a blood coagulation inhibitor, and the plasma component is removed by centrifuging for a predetermined time, and only the blood cell portion that is a cell component in the blood is taken out. .
[0020]
(B) Next, a separation promoter of a predetermined concentration is added to the blood cell portion thus taken out, and further, the buffy coat such as leukocytes and platelets is removed by centrifuging for a predetermined time.
[0021]
(C) Next, washing is performed by adding phosphate buffered saline (PBS) to the erythrocytes from which the buffy coat such as leukocytes and platelets has been removed, and further centrifuging for a predetermined time.
[0022]
(D) Next, after the washing, phosphate buffered saline (PBS) is added again, and using an automatic hemocytometer, an erythrocyte suspension having a red blood cell count of about 4 million / μl is prepared. .
[0023]
(E) Next, the erythrocyte suspension is centrifuged for a predetermined time to remove the supernatant (PBS).
[0024]
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, a predetermined concentration of saline is added as a hypertonic solution, and incubation is carried out for a predetermined time at a temperature almost equal to the human body temperature. These components are oozed out to the suspended liquid side by osmotic pressure.
[0025]
(G) Next, after completion of the incubation, the erythrocyte suspension is further centrifuged for a predetermined time to collect a supernatant component from which the components in the erythrocyte have exuded.
[0026]
(H) Next, the supernatant component is applied to a biochemical automatic analyzer, and the glucose concentration, pyruvic acid concentration, and lactic acid concentration in the supernatant component are measured.
[0027]
(I) Next, based on the measured glucose concentration, pyruvic acid concentration, and lactic acid concentration in the supernatant component, the glucose concentration, pyruvic acid concentration, and lactic acid concentration in erythrocytes are finally obtained by a predetermined calculation method.
[0028]
According to such a configuration, unlike a blood test method using a plasma component that is a liquid component outside the blood cell as in the prior art, in the erythrocytes that are blood cells that predominate the component state in the plasma. The blood glucose level, pyruvic acid level, and lactic acid level can be measured from the components, and the blood glucose level rises in the erythroid cells, pyruvic acid level, The change in value can be known earlier than it appears on the plasma side.
[0029]
Therefore, according to the test method, various pathological conditions such as diabetes, chronic respiratory disease, heart failure, and renal failure can be diagnosed as early as possible, and appropriate treatment can be performed.
[0030]
(2) Invention of Claim 2
The blood test method of the present invention comprises the following steps a to i.
[0031]
(A) First, a predetermined amount of venous blood is collected using a blood collection tube containing a blood coagulation inhibitor, and the plasma component is removed by centrifuging for a predetermined time, and only the blood cell portion that is a cell component in the blood is taken out. .
[0032]
(B) Next, a separation promoter of a predetermined concentration is added to the blood cell portion thus taken out, and further, the buffy coat such as leukocytes and platelets is removed by centrifuging for a predetermined time.
[0033]
(C) Next, washing is performed by adding phosphate buffered saline (PBS) to the erythrocytes from which the buffy coat such as leukocytes and platelets has been removed, and further centrifuging for a predetermined time.
[0034]
(D) Next, after the washing, phosphate buffered saline (PBS) is added again, and an erythrocyte suspension having a hematocrit value of 50% is prepared using an automatic hemocytometer.
[0035]
(E) Next, the erythrocyte suspension is centrifuged for a predetermined time to remove the supernatant (PBS).
[0036]
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, a predetermined concentration of saline is added as a hypertonic solution, and incubation is carried out for a predetermined time at a temperature almost equal to the human body temperature. These components are oozed out to the suspended liquid side by osmotic pressure.
[0037]
(G) Next, after completion of the incubation, the erythrocyte suspension is further centrifuged for a predetermined time to collect a supernatant component from which the components in the erythrocyte have exuded.
[0038]
(H) Next, the supernatant component is subjected to an oxidation-reduction potentiometer, and the oxidation-reduction potential in the same component is measured.
[0039]
(I) Next, a calibration curve is prepared using serum separately collected from the same subject, and finally the oxidation-reduction potential in red blood cells is obtained from the measured oxidation-reduction potential in the supernatant component.
[0040]
According to such a configuration, unlike a blood test method using a plasma component that is a liquid component outside the blood cell as in the prior art, the inside of erythrocytes, which are blood cells that predominate the redox state in the plasma. From this component, the redox potential can be measured, and the redox potential in red blood cells that have not yet appeared on the plasma side can be known earlier than the redox potential appears on the plasma side.
[0041]
Therefore, various pathological conditions such as diabetes, chronic respiratory disease, heart failure, and renal failure can be diagnosed as early as possible, and appropriate treatment can be performed.
【The invention's effect】
[0042]
As a result of the above, according to the blood test method of the present invention, the conventional blood test method for determining a disease state such as diabetes by measuring blood glucose level, pyruvate level, lactic acid level, etc. from plasma which is an extracellular component of blood is accurate. It is possible to accurately determine the true pathological state of patients with normal blood glucose level, normal pyruvate level or low pyruvate level, normal lactic acid level or low lactic acid level, which could not be determined accurately, More accurate early diagnosis and early treatment are possible.
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
[0043]
(Embodiment 1)
First, details of the blood test method according to the first embodiment of the present invention will be described.
[0044]
This embodiment is characterized in that glucose concentration (D-glucose concentration) and lactic acid concentration (L-lactic acid concentration) in erythrocytes, which are one of blood cells, are measured.
[0045]
That is, the blood test method according to this embodiment includes the following steps (a) to (i).
[0046]
(A) First, using a blood collection tube containing a predetermined amount of heparin (or EDTA) as a blood coagulation inhibitor for preventing erythrocyte coagulation, for example, 2 ml of venous blood is collected from the subject, for example, 5 By centrifuging for a minute (for example, a centrifugal force of about 150 g), plasma components therein are removed, and only blood cell portions (red blood cells, white blood cells, and platelets) that are cell components in blood are taken out.
[0047]
That is, when the red blood cells are not hardened by the heparin (or EDTA) and the 2 ml of the selected blood is centrifuged at a centrifugal force of about 150 g for about 5 minutes, the plasma components therein are removed. It becomes only blood cell components such as red blood cells, white blood cells, and platelets.
[0048]
(B) Next, as a separation accelerator for facilitating separation of buffy coat such as red blood cells and other blood cell components, that is, white blood cells, platelets, etc., from the blood cell component thus extracted, for example, a concentration of about 25% The buffy coat such as leukocytes and platelets is removed as reliably as possible by adding about 0.2 ml of the methlyzite and further centrifuging for about 5 minutes (for example, 1000 g of centrifugal force).
[0049]
That is, when a blood cell component composed of red blood cells, white blood cells, and platelets is added with metrizite as described above and centrifuged with a large centrifugal force of about 1000 g, the red blood cells are heavier than the other components in the blood cells, and thus sink downward. This sunken red layer becomes red blood cells.
[0050]
In this way, if the buffy coat such as white blood cells and platelets is reliably removed from the blood cell components, only the red blood cells can be efficiently extracted, and the components in the red blood cells can be extracted with higher accuracy in the subsequent steps. This facilitates measurement of glucose and lactic acid concentrations in erythrocytes more accurately.
[0051]
(C) Next, phosphate buffered saline (PBS) is added to the erythrocytes from which the buffy coat such as leukocytes and platelets have been removed, and the erythrocytes are further washed by, for example, centrifuging for about 5 minutes (for example, centrifugal force 150 g).
[0052]
As a result, plasma components, white blood cells, and platelets adhering to the surface of red blood cells are reliably removed.
[0053]
(D) Next, after the washing, phosphate buffered saline (PBS) is added again, and using an automatic hemocytometer, the number of red blood cells in the physiological saline is, for example, about 4 million / μl. Make 2 ml.
[0054]
In this way, the red blood cells necessary for the measurement of glucose concentration and lactic acid concentration, which will be described later, are stored in a stable state that is difficult to be destroyed and in which intracellular components are easily extracted.
[0055]
(E) Next, the supernatant of the phosphate buffered saline (PBS) is removed by, for example, centrifuging the erythrocyte suspension for about 5 minutes (for example, a centrifugal force of 150 g).
[0056]
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, 2 ml of a total volume of 2 ml is added by adding, for example, a saline solution (NaCl) having a concentration of about 5% as a hypertonic solution in the form of replacing the removed supernatant. Incubate for about 10 minutes, for example, at a temperature of 37 ° C., which is approximately the same as the human body temperature.
[0057]
As a result, due to the osmotic pressure acting between the red blood cells and the red blood cell suspension, the internal liquid components including glucose and lactic acid components from the red blood cells in the suspension containing the saline contain the saline together with the water. It oozes out to the suspended liquid side.
[0058]
(G) Next, after the incubation is completed, the erythrocyte suspension is further centrifuged, for example, for about 10 minutes (for example, a centrifugal force of 1750 g), and a supernatant component from which the components in the erythrocyte are exuded is collected.
[0059]
(H) Next, the supernatant component is applied to a biochemical automatic analyzer, and glucose concentration (D-glucose concentration) A and lactic acid concentration (L-lactic acid concentration) B in the supernatant component are measured.
[0060]
(I) Next, based on the measured glucose concentration A and lactic acid concentration B in the supernatant component, the glucose concentration (D-glucose concentration) and lactic acid concentration in the erythrocytes are finally determined by a predetermined calculation method described below. (L-lactic acid concentration) is determined, and the corresponding pathological conditions such as diabetes and chronic respiratory diseases are determined.
[0061]
The final glucose concentration (D-glucose concentration) and lactic acid concentration (L-lactic acid concentration) in the red blood cells are obtained, for example, as follows.
[0062]
Glucose concentration or lactic acid concentration = measured value A or B x (total amount of red blood cell suspension [ml] / total red blood
Ball volume [ml])
= Measured value A or B × {Erythrocyte suspension total amount [2 ml] / 2 (red blood
Sphere suspension concentration [10,000 / μl] × 10 ^Three × Average red blood cell volume [fl]
× 10 ^-15 × 10 ^Three )}
According to such a configuration, unlike the conventional blood test method using plasma components that are liquid components outside blood cells, it has a metabolic glycolytic function of glucose taken into blood, Blood glucose and lactic acid levels can be accurately measured from the components in red blood cells, which are blood cells that predominate the component state such as blood glucose level. Increases and changes in lactic acid levels can be known faster than they appear on the plasma side.
[0063]
Therefore, various pathological conditions such as diabetes, chronic respiratory disease, heart failure, and renal failure can be diagnosed as early as possible, and appropriate treatment can be performed.
[0064]
-Example-
For example, the glucose concentration in the red blood cells (D-glucose concentration) at any time of 37 non-insulin dependent diabetic patients (NIDDM patients) and 52 healthy adults can be determined by the above method, and the blood glucose level in the plasma of the blood can be determined. Each measurement was performed in the same manner as in the prior art.
[0065]
As a result, in the case of a non-insulin dependent diabetic patient, when the blood glucose level in plasma is high, the glucose concentration in red blood cells (D-glucose concentration) is also high, and when the blood glucose level is about 350 mg / dl, the glucose concentration in red blood cells (D -Glucose concentration) reached 50 mg / dl. That is, a positive correlation was recognized between the two.
[0066]
On the other hand, in the case of healthy adults, the blood glucose level was up to about 150 mg / dl, and the erythrocyte intracellular glucose concentration (D-glucose concentration) was 10 mg / dl at the maximum, and a positive correlation was also observed.
[0067]
From all the data of these non-insulin dependent patients and healthy adults, a positive correlation is clearly observed between the blood glucose level in plasma and the glucose concentration in red blood cells (D-glucose concentration).
[0068]
Therefore, also from this example, the test accuracy of the blood test method according to the present embodiment and the effectiveness of grasping the early pathological condition are confirmed.
[0069]
(Embodiment 2)
Next, details of the blood test method according to Embodiment 2 of the present invention will be described.
[0070]
This embodiment is characterized in that the redox potential (Rc-ORP) of the erythrocyte fluid, which is one of the cells in the blood cell, is measured.
[0071]
The blood test method according to this embodiment includes the following steps (a) to (i).
[0072]
(A) First, using a blood collection tube containing a predetermined amount of heparin (or EDTA) as a blood coagulation inhibitor for preventing erythrocyte coagulation, for example, 2 ml of venous blood is collected from the subject, for example, for 5 minutes. By centrifuging (for example, centrifugal force 150 g), the plasma component is removed, and only the blood cell portion which is a cell component in the blood is taken out.
[0073]
That is, keeping red blood cells from solidifying with heparin (or EDTA) and centrifuging the selected 2 ml of blood with a centrifugal force of about 150 g for about 5 minutes, the plasma components in them are removed, and the red blood cells are removed. It becomes only blood cell components such as leukocytes and platelets.
[0074]
(A ′) Using a blood collection tube containing a predetermined amount of a blood coagulation promoter and a serum separating agent, for example, 4 ml of venous blood is collected from the subject and centrifuged at 3000 rpm for about 10 minutes to collect serum.
[0075]
It should be noted that the collection of 4 ml of venous blood (a ′) and the collection of 2 ml of venous blood (a) are not necessarily performed separately. For example, 6 ml of blood collection is divided into 2 ml and 4 ml. Needless to say.
[0076]
(B) Next, as a separation accelerator that facilitates separation of buffy coats such as red blood cells and other blood cell components, that is, white blood cells, platelets, etc., from the blood cell component extracted as described in (a) above, for example, concentration 25 Add about 0.2 ml of about 0.1% of metrimazite and further centrifuge for about 5 minutes (for example, centrifugal force 1000 g) to remove the buffy coat such as leukocytes and platelets as reliably as possible.
[0077]
That is, when metrizamide is added to the blood cell component consisting of red blood cells, white blood cells, and platelets as described above and centrifuged with a large centrifugal force of about 1000 g, the red blood cells are heavier than the other components in the blood cells, and therefore sink downward. . This sunken red layer becomes red blood cells.
[0078]
Thus, if the buffy coat such as white blood cells and platelets is reliably removed, only red blood cells can be efficiently extracted, and components in red blood cells can be easily extracted with higher accuracy in the subsequent steps.
[0079]
(C) Next, phosphate buffered saline (PBS) is added to the erythrocytes from which the buffy coat such as leukocytes and platelets have been removed, and the erythrocytes are further washed by, for example, centrifuging for about 5 minutes (for example, centrifugal force 150 g).
[0080]
As a result, plasma components, white blood cells, and platelets adhering to the surface of red blood cells are reliably removed.
[0081]
(D) Next, after the washing, phosphate buffered saline (PBS) is added again, and 2 ml of erythrocyte suspension having a hematocrit value of 50% is prepared using an automatic hemocytometer.
[0082]
In this way, the red blood cells necessary for the measurement of the redox potential described later are stored in a stable state that is difficult to be destroyed and in which intracellular components can be easily taken out.
[0083]
(E) Next, the supernatant of the phosphate buffered saline (PBS) is removed by, for example, centrifuging the erythrocyte suspension for about 5 minutes (for example, a centrifugal force of 150 g).
[0084]
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, for example, a saline solution (NaCl) having a concentration of about 5% is added as a hypertonic solution for the amount of the phosphate buffered saline solution (PBS). The total volume is the same 2 ml, and the incubation is carried out, for example, for about 10 minutes at a temperature of 37 ° C., which is almost the same as the human body temperature.
[0085]
As a result, due to the osmotic pressure acting between the red blood cells and the red blood cell suspension, the internal liquid components including glucose and lactic acid components from the red blood cells in the suspension containing the saline contain the saline together with the water. It oozes out to the suspended liquid side.
[0086]
(G) Next, after the incubation is completed, the erythrocyte suspension is further centrifuged, for example, for about 10 minutes (for example, a centrifugal force of 1750 g), and a supernatant component from which the components in the erythrocyte are exuded is collected.
[0087]
(H) Next, the supernatant component is applied to an oxidation-reduction potentiometer (ORP meter), and the oxidation-reduction potential (ORP) in the same component is measured.
[0088]
(I) Next, as shown in FIG. 2, for example, a calibration curve as shown in FIG. 1 is prepared using the serum of (a ′) collected from the same subject, and the oxidation-reduction potentiometer is used. The final redox potential (Rc-ORP) in red blood cells is determined from the actually measured redox potential (ORP).
[0089]
Here, the calibration curve as shown in FIG. 1 is created for the following reason.
[0090]
That is, it is originally intended to directly measure the redox potential of the intracellular fluid of erythrocytes. However, there is no needle electrode that can be measured by inserting into red blood cells. Therefore, it is conceivable to leak the intracellular fluid of the erythrocytes out of the cells and measure it. However, if the red blood cells are mechanically compressed, the red blood cell membrane and hemoglobin in the red blood cells are broken and mixed with the intracellular fluid. This does not mean that the pure redox potential of the intracellular fluid has been measured.
[0091]
Therefore, in order to ensure that only the intracellular fluid is extracted, if the solution in which erythrocytes are suspended is made hypertonic than the intracellular fluid, the intracellular fluid will move to the hypertonic solution due to osmotic pressure. become.
[0092]
However, the solution obtained thereby is a mixture of intracellular fluid and hypertonic solution. Therefore, the oxidation-reduction potential is not the oxidation-reduction potential of only the intracellular fluid but the oxidation-reduction potential of the mixed solution with the hypertonic solution. Therefore, in normal conditions, intracellular fluid and extracellular fluid (serum) are considered to enter and exit from each other through the cell membrane, so that the basic properties of intracellular fluid and serum are the same for the same subject. Conceivable. Of course, more active oxygen is generated in the cell and acidic substances such as lactic acid and pyruvic acid are produced, so the acidic oxidation state is overwhelmingly strong in the intracellular fluid, but as a body fluid In the same subject, the intracellular fluid and the extracellular fluid are considered to have the same properties. Therefore, it is considered that the redox potential of the intracellular fluid is on the extension line in the positive or negative direction of the redox potential of serum that is the extracellular fluid.
[0093]
Assuming that all the intracellular fluid has leaked to the hypertonic solution side by immersing red blood cells in 5% saline as described above, 50% of the intracellular fluid is 50% of the mixed solution, that is, the supernatant after centrifugation. %, Hypertonic solution is 50%.
[0094]
Of course, this is because the erythrocyte suspension having a hematocrit value of 50% was prepared using 5% saline in the above experimental process. Accordingly, the oxidation-reduction potential of serum and the oxidation-reduction potential of the serum diluted twice with 5% saline are obtained, and the point determined by these is designated as point A in the figure. Next, the oxidation-reduction potential of serum diluted 2-fold with phosphate buffered saline (PBS) and serum diluted 2-fold with phosphate buffered saline (PBS) are further increased to 5 The point B shown in the figure is obtained by the redox potential of the serum diluted 2-fold with% saline. As for why serum can be diluted with phosphate buffered saline (PBS), phosphate buffered saline (PBS) changes the basic properties of its serum as a property of phosphate buffered saline itself. I used this because it was not. Similarly, point C is the redox potential of the original serum diluted 4 times with phosphate buffered saline (PBS) and 5% of serum diluted 4 times with phosphate buffered saline (PBS). This is a point determined by the redox potential of the sample diluted twice with saline. An extension line is drawn in the positive or negative direction by connecting these points A, B, and C, and this is used as a calibration curve. Then, the actual value of the oxidation-reduction potential in the mixed solution of the intracellular solution and the 5% saline solution is expressed as the Y-axis (the axis of the redox potential scale obtained by diluting serum with 5% saline). ) And the redox potential of the intracellular fluid estimated from the X-axis scale is read. That is, it is considered that the redox potential of the intracellular fluid is on the positive or negative extension line of the serum redox potential.
[0095]
(J) Finally, a predetermined process is performed based on the redox potential (Rc-ORP) in the red blood cells to determine the corresponding pathological condition.
[0096]
In the above step (h), in order to obtain the oxidation-reduction potential (ORP) with the oxidation-reduction potentiometer (ORP meter), the potential of the reference electrode is added to the measured value. The potential of the reference electrode is determined according to the temperature of the supernatant component at that time. For example, when the temperature is 0 to 60 ° C., the potential is as shown in the table of FIG.
[0097]
According to such a configuration, unlike a blood test method using a plasma component that is a liquid component outside the blood cell, it has a metabolic glycolytic function of glucose taken into the blood, and the component state in the plasma The redox potential (Rc-ORP) can be measured from the internal fluid components of erythrocytes, which are cells in the blood cell that predominately control the redox potential (Rc-ORP) that has not yet appeared on the plasma side. The change in (Rc-ORP) can be known earlier than it appears on the plasma side.
[0098]
Therefore, various pathological conditions such as diabetes, chronic respiratory disease, heart failure, and renal failure can be diagnosed as early as possible, and appropriate treatment can be performed.
[0099]
(Embodiment 3)
As shown in the examples related to the first embodiment, for example, in the case of an insulin-independent patient (NIDDM patient), the higher the blood glucose level in plasma, the higher the glucose concentration (D-glucose concentration) in red blood cells. However, this is thought to be because glucose metabolism function in red blood cells is suppressed for some reason.
[0100]
On the other hand, according to the knowledge of the present inventor, when the blood glucose level in plasma and the glucose concentration in red blood cells are measured, for example, after irradiating the patient with a predetermined amount of negative ions, the blood glucose level in plasma decreases. At the same time, the glucose concentration in the red blood cells decreased, and conversely, the pyruvate concentration and the lactic acid concentration in the red blood cells and in the blood increased.
[0101]
This is presumably because glucose metabolism was promoted by negative ions, considering that red blood cells do not have a TCA cycle and are only anaerobic glycolysis. The mechanism of action is that the essence of negative ions is electrons (e ^- ) And increase blood pH (H ⁺ + E ^- → H) resulted in an increase in the red blood cell pH, which increased the activity of enzymes involved in glucose metabolism in anaerobic glycolysis, such as phosphofructokinase, and promoted glucose metabolism. It is considered a thing.
[0102]
Such anion action is considered to be the same in skeletal muscle and fat cells that require insulin for glucose uptake into cells.
[0103]
First, when insulin binds to the insulin receptor, Na in the cell membrane ⁺ / H ⁺ The channel is activated and extracellular Na ⁺ Into the cell, H in the cell ⁺ Is pumped out of the cell. However, if the cell interstitial fluid pH decreases, for example, even if insulin is present, Na ⁺ / H ⁺ The exchanger is not fully activated.
[0104]
Already, it has been found that the negative ions increase the pH of the interstitial fluid, and as a result, the negative ions become Na of insulin. ⁺ / H ⁺ It is presumed that the activation of the channel promotes the activation of the channel and raises the intracellular pH, thereby increasing the activity of glucose metabolizing enzymes and promoting glucose metabolism.
[0105]
The reason why glucose metabolism in red blood cells is reduced due to the above-mentioned insulin independence (NIDDM patient) is unknown. However, it is pointed out that the acidic constitution in diabetes causes a decrease in cell interstitial fluid pH and a decrease in intracellular pH, which decreases the activity of glucose metabolizing enzymes in red blood cells and inhibits glycolysis. Some researchers do. According to the researcher, it has been demonstrated that irradiation of rats with streptozotocin-treated diabetic ions with negative ions raises the cell interstitial fluid pH, which leads to improvement of the diabetic state.
[0106]
Therefore, in order to confirm this, for example, the non-insulin-dependent patient (NIDDM patient) is irradiated with negative ions, and the change in blood pH and red blood cell glucose concentration (D-glucose concentration) is examined. In the case of red blood cells that do not have a circuit and have only anaerobic glycolysis, it may be possible to determine whether pyruvate and lactate, which are end products of glucose metabolism, actually change in the red blood cells. However, when measuring the concentration of the pyruvic acid for that purpose, the concentration measurement method of (a) to (i) of the first embodiment can be applied in exactly the same manner and measured in the same manner.
[0107]
Pyruvate enters a TCA cycle via acetyl CoA in cells other than erythrocytes, that is, cells having a TCA cycle (Krebs cycle or citrate cycle), and finally ATP energy is produced through an oxidation process.
[0108]
However, since it does not have a TCA cycle in erythrocytes, it changes to lactic acid under lactate dehitokinase (lactate dehydrogenase). At the same time, however, the change from pyruvic acid to lactic acid chemically resulted in the reduction of pyruvic acid, and NADH (nicotinamide adenine dinucleotide produced in the intermediate stage of glycolysis has the reducing action. ).
[0109]
However, hemoglobin for carrying oxygen exists in red blood cells, and this hemoglobin is often oxidized by oxygen or active oxygen to become methemoglobin. Methemoglobin cannot bind oxygen, resulting in an oxygen deficient state in the peripheral tissue.
[0110]
Therefore, since the hemoglobin is not oxidized, NADH generated in the above intermediate stage of glycolysis is used. However, in such a case, the pyruvic acid cannot be changed to lactic acid, so that the concentration of intracellular pyruvic acid increases. However, pyruvic acid is an acidic substance along with lactic acid, and the intracellular pH tends to decrease. When intracellular pH falls, the enzyme activity required for glycolysis is deactivated, and glucose metabolism (glucose metabolism) is inhibited. That is, the intracellular glucose concentration tends to increase. At this time, the intracellular redox potential is likely to increase when there is a large amount of oxygen or active oxygen. However, if the total amount of intracellular reducing substances such as NADH, reduced glutathione, and reduced ascorbic acid is large, the redox potential is increased. The potential is kept low.
[0111]
Therefore, there is no clear correlation between the amount of methemoglobin generated and the intracellular redox potential.
[0112]
However, it is easily imagined that hemoglobin is easily oxidized when the intracellular redox potential is high, and if there is no illness of lactate dehydrogenase deficiency, the cause of the increase in pyruvate concentration is that NADH is metotoxin It can be assumed that this is because it is used for the reduction of hemoglobin.
[0113]
On the other hand, an increase in the intracellular redox potential promotes peroxidation of the erythrocyte cell membrane, and thus it is considered that the substance cannot move through the cell membrane. These are thought to cause various diseases including diabetes.
[0114]
Therefore, for such reasons, it is meaningful to measure pyruvic acid concentration clinically for grasping the disease state.
[Brief description of the drawings]
[0115]
FIG. 1 is a diagram showing a calibration curve created in a blood test method according to Embodiment 2 of the present invention.
FIG. 2 is a chart showing measurement factors for creating the calibration curve of FIG. 1 by parameters of the XY axes.
FIG. 3 is a potential addition table of reference electrodes according to the outside air temperature used for calculating the oxidation-reduction potential using the oxidation-reduction potentiometer in the inspection method.

Claims

(A) First, a predetermined amount of venous blood is collected using a blood collection tube containing a blood coagulation inhibitor, and the plasma component is removed by centrifuging for a predetermined time, and only the blood cell portion that is a cellular component in the blood is removed. a step of be out,
(B) Next, the manner in blood cell portion was taken out, and added separation enhancing agent of a predetermined concentration, by further predetermined time centrifuge, you remove leukocytes, the buffy coat platelets step,
(C) Next, the white blood cells, the erythrocytes buffy coat was removed platelets, etc., and phosphate buffered saline (PBS) was added, in the wash by further predetermined time centrifugation step,
(D) Next, after the washing, phosphate buffered saline (PBS) is added again, and an erythrocyte suspension is prepared using an automatic hemocytometer with a red blood cell count of about 4 million / μl. And the process
(E) Next, by a predetermined time centrifuge the erythrocyte suspension, a step you remove the supernatant fraction and (PBS),
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, a predetermined concentration of saline is added as a hypertonic solution, and incubation is carried out for a predetermined time at a temperature almost equal to the human body temperature. a step of Ru was bleeding out on the suspension side by the components osmotic pressure,
(G) Next, after the completion of the incubation, the same red cell suspension, and centrifuged further predetermined time, the steps you collecting the supernatant component component exuded in the red blood cells,
(H) Next, the said supernatant components subjected automatic biochemical analyzer, glucose concentration or pyruvic acid concentration in the supernatant components, measure the lactate concentration step,
(I) Next, glucose concentration or pyruvic acid concentration in the supernatant ingredients the measurement, based on the lactic acid concentration, the final glucose concentration or pyruvic acid concentration in the erythrocytes by a predetermined calculation method, Ru calculated lactate concentrations Process,
A method for testing blood.

(A) First, a predetermined amount of venous blood is collected using a blood collection tube containing a blood coagulation inhibitor, and the plasma component is removed by centrifuging for a predetermined time, and only the blood cell portion that is a cellular component in the blood is removed. a step of be out,
(B) Next, the manner in blood cell portion was taken out, and added separation enhancing agent of a predetermined concentration, by further predetermined time centrifuge, you remove leukocytes, the buffy coat platelets step,
(C) Next, the white blood cells, the erythrocytes buffy coat was removed platelets, etc., and phosphate buffered saline (PBS) was added, in the wash by further predetermined time centrifugation step,
(D) Next, and after the cleaning, phosphate-buffered saline (PBS) was added again, and using an automatic haemocytometer, hematocrit Ru create a 50% erythrocyte suspension process,
(E) Next, by a predetermined time centrifuge the erythrocyte suspension, a step you remove the supernatant fraction and (PBS),
(F) Next, in order to make it easy to take out the components in the red blood cells, a predetermined concentration of saline is added as a hypertonic solution, and incubation is carried out for a predetermined time at a temperature almost equal to the human body temperature. a step of Ru was bleeding out on the suspension side by the components osmotic pressure,
(G) Next, after the completion of the incubation, the same red cell suspension, and centrifuged further predetermined time, the steps you collecting the supernatant component component exuded in the red blood cells,
(H) Next, the supernatant component subjected redox potential meter, a step that measuring the redox potential in the same component,
(I) Next, a calibration curve using the sera collected separately from the same subject, the steps from the redox potential in the actual measurement with supernatant component, asking you to finally redox potential of the red blood cells,
A method for testing blood.