JP3799410B2

JP3799410B2 - Nonspecific reaction inhibitory peptide, and nonspecific reaction inhibitory method and antibody measuring method using the same

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Publication number: JP3799410B2
Application number: JP2002145225A
Authority: JP
Inventors: 義則東; 奈穂千葉; 雄樹中村
Original assignee: Shino Test Corp
Current assignee: Shino Test Corp
Priority date: 2002-05-20
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2006-07-19
Anticipated expiration: 2022-05-20
Also published as: JP2003337134A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、トレポネーマ・パリダム（ＴｒｅｐｏｎｅｍａＰａｌｌｉｄｕｍ；以下ＴＰと略すこともある）抗原を使用した抗ＴＰ抗体の測定において非特異反応を抑制する物質、該物質を用いる非特異反応抑制方法、該物質を含む抗ＴＰ抗体測定試薬及びこれらを用いる抗ＴＰ抗体測定方法に関する。
本発明は、臨床検査、免疫学及び医学などの生命科学分野、分析化学などの化学分野、食品衛生分野、並びに環境衛生分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
梅毒は、トレポネーマ・パリダムにより引き起こされる感染症であり、梅毒に感染しているか否かは、主に梅毒血清反応による梅毒抗体の検出により判断されている。この梅毒血清反応には、カルジオリピン又はレシチン等のリン脂質を抗原として用いる抗脂質抗体測定方法（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｔｅｓｔｆｏｒｓｙｐｈｉｌｉｓ；以下ＳＴＳ法と略すこともある）及びＴＰ菌体又は菌体成分を抗原として用いる抗ＴＰ抗体測定方法がある。
【０００３】
ＳＴＳ法としては、ガラス板法、ＲＰＲ法等が、抗ＴＰ抗体測定方法としては、蛍光抗体法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｔｒｅｐｏｎｅｍａａｎｔｉｂｏｄｙａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｔｅｓｔ；ＦＴＡ−ＡＢＳ法）、受身赤血球凝集反応（ＴＰｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔ；ＴＰＨＡ法）、粒子凝集法（ＴｒｅｐｏｎｅｍａＰａｌｌｉｄｕｍＰａｒｔｉｃｌｅＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；ＴＰＰＡ法）、酵素免疫測定方法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ法）、ラテックス凝集法（ＴＰｌａｔｅｘａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ；ＴＰＬＡ法）及びイムノクロマトグラフィー法等が日常検査に利用されている。特にＴＰ抗原を用いる抗ＴＰ抗体測定方法は梅毒に対する特異性が高く、日常検査に広く利用されている。
【０００４】
この抗ＴＰ抗体測定方法に使用されるＴＰ抗原は、従来よりＴＰ菌体から精製されたものが用いられている。例えば、ＴＰ抗原の表面抗原タンパク質を抗原として用いることができる。このような表面抗原タンパク質としては、１５Ｋダルトン抗原タンパク質、１７Ｋダルトン抗原タンパク質及び４７Ｋダルトン抗原タンパク質等の存在が知られており、これらを使用することができる。
【０００５】
また、近年では遺伝子組み換え技術を用いて、ＴＰ抗原を大腸菌等の宿主細胞に産生させることも行われている。これら表面抗原タンパク質のアミノ酸配列やその遺伝子の塩基配列は既に報告されているので（１５Ｋダルトン抗原タンパク質：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ４巻、１３７１〜１３７９頁、１９９０年；１７Ｋダルトン抗原タンパク質：ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ６１巻、１２０２〜１２１０頁、１９９３年；４７Ｋダルトン抗原タンパク質：ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ６０巻、１５６８〜１５７６頁、１９９２年）、遺伝子組み換え技術を用いてこれらの表面抗原タンパク質を産生することが可能となっている。
【０００６】
しかしながら、これらのＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体測定方法においては、測定する試料によっては、試料中に抗ＴＰ抗体が存在しないにも関わらず非特異反応により偽陽性を示すことがあり、患者などの疾病の診断を誤らせる危険性があった。この現象は、検体中に含まれる抗体以外の成分が抗原等に反応することによって引き起こされるものと考えられる。
【０００７】
この非特異反応を抑制する方法として、種々の方法が提供されている。例えば、特開昭５８−１４４７４８号公報には、非特異反応を抑制するために試薬中にウシ血清アルブミンやウマ血清アルブミン等を添加する技術が示されており、特開平８−１０５８９７号公報には、非特異反応を抑制するために塩化ナトリウムを添加する技術が示されている。特開平８−１７６１９５号公報には、非特異反応を抑制するために化学修飾した還元アルブミンをブロッキング剤として使用する方法が示されている。また、特公平３−５９３８２号公報には、非特異反応を抑制するために遺伝子組み換えに用いたものと同種であるが遺伝子組み換え操作が行われていない宿主細菌成分を用いる技術が示されている。更に、特許第３２０６３１１号公報には、抗原をコードする遺伝子を含まない、抗原産生に用いたものと同種のベクターを組み込んだ培養細胞成分を用いる技術が示されている。しかし、これらの技術は、非特異反応を抑制するには必ずしも充分なものとはいえなかった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
前記したように、ＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体の測定においては、測定する試料によっては、試料中に抗ＴＰ抗体が存在しないにも関わらず、非特異反応により、偽陽性を示すことがあるという問題があった。
従って、本発明の課題は、ＴＰ抗原を使用した抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制し、梅毒の診断の場において正確な測定を行うことにより、診断を誤ることを防止する手段を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＴＰ抗原タンパク質の抗原性を示さないが非特異反応抑制効果を有しているＴＰ抗原タンパク質の断片を非特異反応抑制剤として用いることにより、前記課題が解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）配列番号４〜３６のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１１】
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなり配列番号１における少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含み、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１２】
（３）配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部からなり配列番号２における少なくとも５個の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、又は該ペプチドを含み、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１３】
（４）配列番号１に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１４】
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有するペプチド。
【００１５】
（６）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を示さない、（１）〜（５）のいずれかに記載のペプチド。
（７）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを含む非特異反応抑制剤。
【００１６】
（８）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において使用するための、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬。
（９）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質をさらに含む、（８）に記載の試薬。
【００１７】
（１０）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、（９）に記載の試薬。
（１１）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを試料と接触させて非特異反応を抑制する方法。
【００１８】
（１２）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法であって、（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチドを試料と接触させることを含む免疫測定方法。
（１３）トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質が遺伝子組み換え技術を用いて産生される、（１２）に記載の免疫測定方法。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載のペプチド及びトレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化した担体を含む抗トレポネーマ・パリダム抗体測定用の免疫測定キット。
【００１９】
【発明の実施の形態】
本発明のペプチドは、トレポネーマ・パリダム抗原タンパク質を用いて試料中の抗ＴＰ抗体を測定する免疫測定方法において、非特異反応を抑制する活性を有する。本発明のペプチドを使用できる免疫測定方法は、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の使用を含む方法であれば特に限定されない。本発明において免疫測定方法とは、当技術分野における通常の意味を有し、抗原と抗体との抗原抗体反応を利用して、試料中の抗ＴＰ抗体の検出を行う免疫測定方法を意味する。
【００２０】
このような免疫測定方法としては、例えば、ラテックス比濁法；ラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法；酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる標識免疫測定法；ウエスタンブロット法；ＥＬＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）〔Ｄａｈｌｂｅａｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻、７６７〜７７２頁、１９９８年；ＷＯ９８／２３９６３号公報〕；イムノクロマトグラフィー法；又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された、被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体における上記面に集まるか否かにより測定を行う方法等を挙げることができる。標識免疫測定法を用いる場合は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの方法においても本発明を適用することができる。本発明では、ラテックス比濁法、又は特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された、被検物質に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用い、該粒子が担体における上記面に集まるか否かにより測定を行う方法を用いるのが好ましい。
【００２１】
測定は、用手法によって行ってもよいし、分析装置等の装置を用いて行ってもよい。測定は、１ステップ法（１試薬法）により実施してもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップを含む方法によって実施してもよい。
【００２２】
本発明において、上記のような抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において使用するＴＰ抗原は、少なくともＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質が含まれているものであれば特に限定されない。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質に加えて、その他の抗原タンパク質を含んでいてもよい。トレポネーマ・パリダムの表面抗原タンパク質、例えば、ＴＰ１５Ｋダルトン抗原タンパク質又はＴＰ１７Ｋダルトン抗原タンパク質を含むのが好ましい。抗原として用いる抗原タンパク質は、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質１種類でも又は数種類の抗原タンパク質の混合物でもよいが、数種類の抗原タンパク質の混合物を使用するのが好ましい。これらの抗原タンパク質が複数結合した状態のものを用いてもよい。これらの抗原タンパク質は、トレポネーマ・パリダム菌体から精製したものであってもよいし、遺伝子組み換え技術を用いて得られたものであってもよい。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質は、均質なものが継続的かつ安価に調製できることから、遺伝子組み換え技術を用いて得られたものを使用するのが好ましい。
【００２３】
遺伝子組み換え技術を用いて抗原タンパク質を産生する場合には、当技術分野で通常用いられている方法を用いることができる。例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込み、この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより目的のタンパク質を発現させることができる。遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。
【００２４】
そして、この遺伝子組み換え技術により人為的に調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質は、他のタンパク質と融合しているものであってもよい。融合させる他のタンパク質としては、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク質、プロテインＡ又はジーン１０等を挙げることができる。
【００２５】
トレポネーマ・パリダム菌体から抗原タンパク質を精製する場合は、界面活性剤や超音波破砕等で菌体から抽出することによって得ることができる。更に、菌体から抽出した抗原タンパク質をゲルろ過、イオン交換、又はハイドロキシアパタイト等で精製することによって得ることもできる。
【００２６】
本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を含むアミノ酸数３以上、好ましくは３〜２００、より好ましくは５０〜２００のペプチドであって、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、ＴＰ抗原タンパク質の抗原性を有しないペプチドに関する。ここで配列番号１に記載のアミノ酸配列は、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列における１２６〜２９５番目に相当するアミノ酸配列である。このようなペプチドとしては、以下の配列番号４〜３６に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。
（１）ＥＧＡＶＡＬＡＤＲＡ（配列番号４）
（２）ＬＡＤＲＡＳＳＦＭＶ（配列番号５）
（３）ＳＳＦＭＶＤＳＥＥＹ（配列番号６）
（４）ＤＳＥＥＹＫＩＴＮＶ（配列番号７）
（５）ＫＩＴＮＶＫＶＨＧＭ（配列番号８）
（６）ＫＶＨＧＭＫＦＶＰＶ（配列番号９）
（７）ＫＦＶＰＶＡＶＰＨＥ（配列番号１０）
（８）ＡＶＰＨＥＬＫＧＩＡ（配列番号１１）
（９）ＬＫＧＩＡＫＥＫＦＨ（配列番号１２）
（１０）ＫＥＫＦＨＦＶＥＤＳ（配列番号１３）
（１１）ＦＶＥＤＳＲＶＴＥＮ（配列番号１４）
（１２）ＲＶＴＥＮＴＮＧＬＫ（配列番号１５）
（１３）ＴＮＧＬＫＴＭＬＴＥ（配列番号１６）
（１４）ＴＭＬＴＥＤＳＦＳＡ（配列番号１７）
（１５）ＤＳＦＳＡＲＫＶＳＳ（配列番号１８）
（１６）ＲＫＶＳＳＭＥＳＰＨ（配列番号１９）
（１７）ＭＥＳＰＨＤＬＶＶＤ（配列番号２０）
（１８）ＤＬＶＶＤＴＶＧＴＧ（配列番号２１）
（１９）ＴＶＧＴＧＹＨＳＲＦ（配列番号２２）
（２０）ＹＨＳＲＦＧＳＤＡＥ（配列番号２３）
（２１）ＧＳＤＡＥＡＳＶＭＬ（配列番号２４）
（２２）ＡＳＶＭＬＫＲＡＤＧ（配列番号２５）
（２３）ＫＲＡＤＧＳＥＬＳＨ（配列番号２６）
（２４）ＳＥＬＳＨＲＥＦＩＤ（配列番号２７）
（２５）ＲＥＦＩＤＹＶＭＮＦ（配列番号２８）
（２６）ＹＶＭＮＦＮＴＶＲＹ（配列番号２９）
（２７）ＮＴＶＲＹＤＹＹＧＤ（配列番号３０）
（２８）ＤＹＹＧＤＤＡＳＹＴ（配列番号３１）
（２９）ＤＡＳＹＴＮＬＭＡＳ（配列番号３２）
（３０）ＮＬＭＡＳＹＧＴＫＨ（配列番号３３）
（３１）ＹＧＴＫＨＳＡＤＳＷ（配列番号３４）
（３２）ＳＡＤＳＷＷＫＴＧＲ（配列番号３５）
（３３）ＷＫＴＧＲＶＰＲＩＳ（配列番号３６）
【００２７】
上記のペプチドのうち、トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列における１６５〜２４４番目に相当する配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むペプチドが好ましく。配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むペプチドがより好ましい。本発明のペプチドには、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列又はその一部からなるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加、置換又は修飾を有するアミノ酸配列からなるペプチドであって、トレポネーマ・パリダム４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原を用いる抗トレポネーマ・パリダム抗体の免疫測定方法において非特異反応を抑制する活性を有し、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の抗原性を有しないペプチドも包含される。ここで数個とは１〜１０個、好ましくは１〜５個を意味する。これらのペプチドの長さは、特に限定されないが、アミノ酸数３以上、好ましくはアミノ酸数３〜２００、より好ましくはアミノ酸数５０〜２００である。
本発明においてペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。
【００２８】
更に、本発明に使用されるペプチドは、非特異反応抑制効果が維持され、かつ融合体自体が非特異反応を起こさないものであれば、他のタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質残基又はアミノ酸等が結合しているものであってもよい。ここで、他のタンパク質としては、本発明のペプチドを効率よく発現又は精製等させるためのタンパク質、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースバインディングプロテイン（ＭＢＰ）、チオレドキシン、β−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ、ビオチン化タンパク、プロテインＡ又はジーン１０等を挙げることができる。
【００２９】
上記のような本発明のペプチドは、当技術分野で通常用いられる方法で調製することができ、このような方法としては特に限定されないが、例えば、化学合成法、遺伝子組み換え技術等の方法を用いることができる。
遺伝子組み換え技術を用いる場合は、例えば、まず目的とするペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質転換体を培養することにより目的のペプチドを発現させることができる。
【００３０】
遺伝子をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。例えば、ＰＣＲ法を用いる場合には、目的とする塩基配列をプライマーを用いて増幅させることができる。
【００３１】
例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全体からなるペプチドを発現させるためには、まず、ＰＣＲ法を用いてＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質のアミノ酸配列中における配列番号１のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を、プライマーを用いて増幅することにより得る。このようにして得られた遺伝子の塩基配列をライゲーション法等により発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを大腸菌に導入し、得られた形質転換体を培養することにより、配列番号１に記載のアミノ酸配列の全体に一致するアミノ酸配列からなるペプチドを発現させることができる。
【００３２】
本発明のペプチドを用いて抗体測定における非特異反応を抑制する場合の、該ペプチドの使用方法は、測定しようとする試料と本発明の非特異反応抑制ペプチドを接触させることができれば特に限定されない。例えば、緩衝液等に含有させた本発明のペプチドを、抗体測定反応の前に試料と接触させ、あらかじめ非特異反応を抑制させる方法が挙げられる。又は、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む抗原が存在する試薬中に本発明のペプチドを含有させ、この試薬と試料を接触させて抗体測定反応を行い、試料中の抗ＴＰ抗体と抗原との反応の際に本発明のペプチドを共存させる方法でもよい。あるいは、これらの２つの方法を組み合わせた方法でもよい。
【００３３】
本発明において試料とは、抗ＴＰ抗体が存在する可能性があり、かつ抗ＴＰ抗体の存在の有無又は含有量（濃度）の測定を行う対象を意味し、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、唾液等の体液等を挙げることができる。
使用するペプチドの量は、抗ＴＰ抗体測定時に生じる非特異反応の強さに応じて変えることができ、非特異反応を吸収するのに充分な濃度を適宜設定すればよい。例えば、抗体測定時に存在する本発明のペプチドの濃度が、好ましくは０．０００１％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）の濃度となるような量で使用するのが好ましい。
【００３４】
本発明のペプチドを含有させる上記緩衝液は、特に限定されないが、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。緩衝液中に反応促進剤及び安定剤等の添加剤をさらに含有させてもよい。従来技術において使用されているような別の非特異反応抑制物質等と共に使用することもできる。
【００３５】
例えば、抗ＴＰ抗体測定方法としてラテックス比濁法を使用して２ステップ法により測定を行う場合は、緩衝液からなる第１試薬に本発明のペプチドを含有させ、これをあらかじめ試料と接触させることにより、抗ＴＰ抗体の測定を行う前に非特異反応を抑制させ、その後これをＴＰ抗原が固定化されたラテックス粒子が存在する第２試薬と接触させることができる。また、ＴＰ抗原が固定化されたラテックス粒子が存在する第２試薬中に本発明のペプチドを含有させ、この第２試薬を、試料と第１試薬との混合物に接触させて抗体測定反応を行い、抗ＴＰ抗体の測定反応時に本発明のペプチドを共存させてもよい。あるいは、これらの２つの方法を組み合わせて使用してもよい。
抗体測定方法として担体を用いる測定方法を使用する場合、使用する担体の種類や形状は特に限定されず、当技術分野で通常使用されるものを用いることができる。
【００３６】
ラテックス比濁法に使用可能な担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン・ラテックス粒子、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体・ラテックス粒子、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体・ラテックス粒子、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体・ラテックス粒子、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、ポリアクロレイン・ラテックス粒子、スチレン−メタクリル酸共重合体・ラテックス粒子、スチレン−グリシジル（メタ)アクリル酸共重合体・ラテックス粒子、メタクリル酸重合体・ラテックス粒子、又はアクリル酸重合体・ラテックス粒子などの合成高分子粒子を均一に懸濁させたラテックス粒子等を挙げることができる。
【００３７】
粒子凝集反応測定法又はラテックス凝集反応測定法などの間接凝集反応測定法において使用可能な担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、リポソーム、ラテックス、ゼラチン、ポリアクリルアミド、マイクロカプセル若しくはエマルジョン等の有機高分子物質よりなる粒子、ガラス、シリカゲル、カーボン若しくはベントナイト等の無機高分子物質よりなる粒子又はその他の人工担体等を挙げることができる。
【００３８】
上記の担体粒子は、色素を被覆するか又は色素を粒子中に分散若しくは封入させることにより着色したものでもよい。担体粒子の粒径については、特に限定されないが、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．１〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。また、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
【００３９】
また、間接凝集反応測定法においては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等の容器を担体として使用することもできる。このような容器の溶液収容部分、すなわち、マイクロプレートのウェル等の底面の形状は、特に限定されないが、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型のように底面中央から周辺にかけて傾斜をもつ形状であることが好ましい。
【００４０】
また、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる標識免疫測定法において使用できる担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース若しくはガラス等の材質よりなる粒子、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等を挙げることができる。
【００４１】
また、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された、被検物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定化され被覆された面を有する担体並びに被検物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定化された粒子を用いる測定法において使用できる担体としては、特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメタクリレート等の非吸水性の材料からなる担体が挙げられる。
本発明においては、上記の担体を強磁性体で被覆するか又は担体成型時に強磁性体を含有させて調製した磁性担体等を用いることもできる。
【００４２】
標識免疫測定法において使用される標識は、当技術分野で通常用いられるものであれば、特に限定されないが、酵素標識を用いるのが好ましい。酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、リゾチーム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレアーゼ等が挙げられる。
【００４３】
本発明において抗ＴＰ抗体測定試薬とは、前記した抗ＴＰ抗体の免疫測定方法において使用するための試薬を意味する。抗ＴＰ抗体測定試薬としては、本発明のペプチドを含む試薬、さらにＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を含む試薬が挙げられる。抗原タンパク質は担体に固定化されていてもよい。抗ＴＰ抗体測定試薬は、その他の抗原タンパク質などのさらなる成分を含んでいてもよい。抗ＴＰ抗体測定試薬に含まれる本発明のペプチドの量は、抗ＴＰ抗体の測定における反応を阻害せず、非特異反応抑制効果を有するのであれば特に限定されないが、好ましくは０．０００１〜１％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）である。
【００４４】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬は、特にこれらに限定するものではないが、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有していてもよい。これらの成分の抗ＴＰ抗体測定試薬における濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
【００４５】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬の製造においては、その溶媒として各種の水系溶媒を用いることができる。水系溶媒としては、特に限定されないが、例えば、精製水、生理食塩水、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
【００４６】
抗ＴＰ抗体測定試薬のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨが選択される。本発明においては、アルカリ性領域のｐＨを用いるのが好ましい。ｐＨがｐＨ７．３以上、例えば、ｐＨ８〜１０であるとより好ましい。
【００４７】
本発明の抗ＴＰ抗体測定試薬は、そのもの単独でも又はその他の試薬と組み合わせて使用してもよい。他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬又はキャリブレーションを行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
本発明における抗ＴＰ抗体測定試薬を用いて、試料中の抗ＴＰ抗体の測定を行うには、使用する免疫測定方法の測定原理に基づく操作法に従って操作を行えばよい。
【００４８】
本発明はまた、抗ＴＰ抗体測定試薬、上記の他の試薬及び担体等を、使用する測定法の原理に基づいて適宜組み合わせた免疫測定用のキットを包含する。このようなキットとしては、例えば、標識免疫測定法で使用する場合は、抗ＴＰ抗体測定試薬と標識抗原及び抗体希釈液等を含むものが好ましく、間接凝集反応測定法で使用する場合は、抗ＴＰ抗体測定試薬と粒子分散液等を含むものが好ましい。
以下、本発明を実施例により更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４９】
【実施例】
〔実施例１〕
非特異反応を抑制する活性を有するペプチドの調製
トレポネーマ・パリダムを継代培養したウサギ睾丸の破砕物より、トレポネーマ・パリダム菌体を抽出し、遺伝子を抽出した。ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の塩基配列は、既述のように既に知られており、その全アミノ酸配列は配列番号３に示すとおりである。このアミノ酸配列を下記に示す５つの領域に分け、各々のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片を以下の方法により調製した。
実施例１：配列番号３の１２６〜２９５番目の配列からなるペプチド
比較例１：配列番号３の１〜１６４番目の配列からなるペプチド
比較例２：配列番号３の２４４〜４１５番目の配列からなるペプチド
比較例３：配列番号３の１〜２９５番目の配列からなるペプチド
比較例４：配列番号３の１２６〜４１５番目の配列からなるペプチド
【００５０】
まず、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片をコードする塩基配列の両端の２０塩基程度のオリゴヌクレオチドを各々プライマーとして合成した。ここで５つの領域に分けた前記の塩基配列を鋳型とし、上記のプライマーを用いて、ＰＣＲ法により５種類のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片をコードする塩基配列を増幅した。次に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をコードする塩基配列を含むベクター（ファルマシア社製；ｐＧＥＸ４Ｔ３）に、得られた５種類の塩基配列を各々挿入した。このベクターを大腸菌に導入し、菌体の培養を行った。その後、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の断片が十分に発現した大腸菌を超音波処理により破砕し、これを遠心分離しその沈殿を８Ｍ尿素で可溶化し、その後透析して尿素を除去した。これをさらに遠心分離し、その上清を回収することによって純度５０％以上のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質の断片５種類を得た。
【００５１】
〔実施例２〕
トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）の測定における、上記ペプチド断片の非特異反応抑制効果を、ＥＬＩＳＡ法を用いて確認した。
（１）ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製
▲１▼ 洗浄液の調製
０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、洗浄液とした。
▲２▼ ブロッキング液の調製
０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、ブロッキング液とした。
▲３▼ ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの調製
【００５２】
トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、Ｌ．Ｗｅｉｇｅｌ，Ｍ．Ｎｏｒｇａｒｄらの方法（ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ、６０巻、１５６８〜１５７６頁，１９９２年）に従い、遺伝子組み換え技術により調製した。このＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、２μｇ／ｍＬとなるように、リン酸緩衝生理食塩水に加えた。これを９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェルに各５０μＬずつ分注し、その後４℃で一晩放置して、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質を各ウェルの内壁に固定化させた。
【００５３】
次に、この９６穴プレートの各ウェル内の液を除き、前記▲１▼の洗浄液で２回洗浄した。その後、各ウェルに前記▲２▼のブロッキング液を２００μＬずつ分注して、各ウェルのブロッキングを行った。そして、このプレートの各ウェル内の液を除き、前記洗浄液で２回洗浄を行った。以上の操作により調製したものを、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートとした。
【００５４】
（２）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体の調製
ＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液（ダコ社製；Ｐ０４０６）を０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水で１０００倍に希釈した。
【００５５】
（３）試料希釈液の調製
０．５％（ｗ／ｖ）カゼインナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水を調製し、これに実施例１で調製した実施例１及び比較例１〜４のペプチド断片を終濃度で０．０２％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、いずれのペプチドも添加しないものを対照例とした。
【００５６】
（４）抗ＴＰ抗体測定における非特異反応抑制効果
（３）で調製した試料希釈液で２００倍希釈した偽陽性血清（１試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１４試料）５０μＬずつを、前記（１）で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化プレートの各ウェルに添加し、３７℃で４時間反応させた。その後、このプレートのウェル内の血清液を除き、前記洗浄液で洗浄した。
更に、前記（２）で調製したＰＯＤ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で４時間反応させた。次いで、各ウェルを前記洗浄液にて洗浄した。
【００５７】
この後、発色液（４ｍＭ ο−フェニレンジアミン、１０３ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４９ｍＭクエン酸を含む緩衝液１ｍＬに対して３３μＬの０．３％過酸化水素を使用直前に添加したもの）１００μＬを各ウェルに添加し、室温で２０分間反応させた後、４Ｎ硫酸水溶液５０μＬを各ウェルに添加し、反応を停止させた。
その後、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製；３５５０型）を用いて各ウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度を、表１に示す。
【００５８】
【表１】

【００５９】
（５）考察
表１より、比較例１及び比較例２のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、比較例１では、８６．４％、比較例２では、８５．９％となっており、非特異反応を抑制できていないことが分かる。更に、陽性試料を測定した場合には、試料によっては、陽性試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまっているために、対照例と比較して吸光度が減少してしまっている。すなわち比較例１及び比較例２のペプチドは、非特異反応を抑制する活性がなく、しかも、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性が残っているために感度の低下を引き起こし、正確な測定ができていないことが分かる。
【００６０】
また、比較例３及び比較例４のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、比較例３では、３５．６％、比較例４では、１４．５％となっており、非特異反応を抑制できているが、陽性試料を測定した場合には、試料によっては、陽性試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまっているために、対照例と比較して吸光度が減少してしまっている。すなわち比較例３及び比較例４のペプチドには、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性が残っており、このために感度の低下を引き起こし、正確な測定ができていないことが分かる。
【００６１】
これに対して、実施例１のペプチドを使用した場合には、偽陽性試料を測定した場合の試料との反応性は、対照例を１００％とした場合に、２０．４％となっており、非特異反応を抑制できていることが分かる。更に、陽性試料を測定した場合にも、試料によるばらつきはあるものの、陽性試料との反応性が維持されており、本発明のペプチドにはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は殆ど残っていないことが分かる。
【００６２】
従って、本発明のペプチドを使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれている抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００６３】
また、本発明、比較例１及び比較例２の結果から、本発明のペプチドのアミノ酸配列のうち、比較例１及び比較例２のＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質断片のアミノ酸配列に含まれない１６５〜２４４番目に相当する配列が、非特異反応の抑制に関与していると考えられる。
【００６４】
〔実施例３〕
特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報等に記載された測定方法を用い、トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）測定における本発明のペプチドの非特異反応抑制効果を確認した。
【００６５】
（１）ペプチドの調製
実施例１と同様にして、本発明のペプチド（実施例１）を調製した。
（２）抗ＴＰ抗体測定器具の作製
アクリル樹脂押出板１（幅１０ｍｍ、奥行き３８ｍｍ、厚さ１ｍｍ）〔アクリサンデー社製〕の手前の端から１５ｍｍより１８ｍｍの部分（図１の３の位置）に、実施例２の（１）の▲３▼と同じ方法で遺伝子組み換えにより調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質２μｇ／ｍＬをピペットを用いて載せ、３７℃で３時間静置することにより抗原の固定化を行った。
【００６６】
次いで、溶液をピペットで吸引除去後、０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５，５０ｍＭ）（以下、これを希釈液Ａという）０．３ｍＬをここに加えて、４℃で一晩放置し、これをピペットで吸引除去することによりマスキングを行い、判定部３とした。
【００６７】
次に、図１のＡに示すように、中央に２本の枠４（奥行き１６ｍｍ、高さ０．５ｍｍ、枠間の間隔５ｍｍ）を形成した透明板よりなるカバー２（幅１２ｍｍ、奥行き４０ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）及び試料吸収部８（ベルクリンＥ２、鐘紡社製、厚さ２ｍｍのものを幅４ｍｍ、奥行き５ｍｍに裁断したもの）を、前記のアクリル樹脂押出板１の上に、図２のＡに示すように組み合わせることにより、図２のＡに示すアクリル樹脂押出板１とカバー２で囲まれた高さ０．５ｍｍ、奥行き１６ｍｍ、幅５ｍｍの空間を有する通路６を設けた。そして、カバー２に設けられた開口部５（幅５ｍｍ、奥行き２ｍｍ、厚さ２．５ｍｍ）が試料供給部５となる。なお、図１のＢはカバー２の横断面図、図１のＣはカバー２を裏側から見た図である。
【００６８】
更に、図１のＡに示すように、中央部に前記試料供給部と同じ大きさの穴を有し、かつ、この穴の片側面が上部にかけて広がるように成型した透明な障害物７（幅７ｍｍ、奥行き８ｍｍ、高さ１ｍｍ）を、前記試料供給部５の上にアクリル接着剤で張り付けた。これを抗ＴＰ抗体測定器具とした。図２のＢは抗ＴＰ抗体測定器具の縦断面図である。
【００６９】
（３）ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子の調製
粒子（磁性粒子）〔ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ｕｎｃｏａｔｅｄ、ダイナル社製、粒径：４．５μｍ、粒径のＣ．Ｖ．５％以下、比重１．５、濃度６％（ｗ／ｖ）〕と実施例２の（１）の▲３▼と同じ方法で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質（ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液に濃度１００μg／ｍＬで溶解したもの）１ｍＬを混合し、３７℃で１時間反応させた。これに０．５％（ｗ／ｖ）カゼインを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）を約２０倍量加えてマスキングを行い、得られた粒子を希釈液Ａにて洗浄した。この粒子を濃度が約０．２％（ｗ／ｖ）となるようにグリシン緩衝液（ｐＨ９．５、５０ｍＭ）に再分散させた。このようにして、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液を調製した。
【００７０】
（４）抗ＴＰ抗体測定におけるペプチドの非特異反応抑制効果
前記（３）で調製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液に前記（１）で調製したペプチドを終濃度で０．２％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、ペプチドを添加しないものを、対照例とした。
偽陽性血清（３試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１試料）５０μＬずつを、上記（２）で作製した抗ＴＰ抗体測定器具の各試料供給部５にピペットを用いて載せることにより、判定部３に接触させた。
【００７１】
これにより試料は、前記測定器具の通路６内を移動して判定部３に接触した後、試料吸収部８に吸収される。
この判定部３に接触させた偽陽性試料又は陽性試料が試料吸収部８に吸収除去された後、上記(３)で作製したＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子分散液を、この抗ＴＰ抗体測定器具の各試料供給部５にピペットを用いて載せることにより、判定部３に接触させた。
【００７２】
その後、この抗ＴＰ抗体測定器具の判定部３が形成された側面方向に磁石を配置することにより、ＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質固定化粒子が移動するよう、試料供給部５から試料吸収部８の方向に磁束密度４０〜６０ガウスの磁場を発生させた。
【００７３】
磁場を発生させてから１分後の判定結果を表２に示す。なお、＋は判定部３に粒子の像が認められた場合、＋Ｗは判定部３に粒子の弱い像が認められた場合、−は判定部３に粒子の像が認められなかった場合を示している。
【００７４】
【表２】

【００７５】
（５）考察
表２に示したとおり、対照例では、偽陽性試料１の判定結果は＋（判定部３に粒子の像が認められた）を示し、偽陽性試料２及び３の判定結果は＋Ｗ（判定部３に粒子の弱い像が認められた）を示しており、非特異反応を抑制できていないことが確かめられた。
【００７６】
これに対して、本発明のペプチドを用いた場合は、偽陽性試料１〜３の全ての判定結果が−（判定部３に粒子の像が認められなかった）を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。更に、陽性試料を測定した場合の判定結果も＋を示しており、本発明の非特異反応抑制ペプチドにはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は残っていないことが分かる。
【００７７】
従って、本発明のペプチドを使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００７８】
〔実施例４〕
トレポネーマ・パリダムに対する抗体（抗ＴＰ抗体）測定における、本発明のペプチドの非特異反応抑制効果をラテックス凝集法を用いて確認した。
（１）第１試薬の調製
試料の希釈液として、下記の第１試薬を調製した。
４％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に実施例１で調製した本発明のペプチドを各々終濃度で０．００８％（ｗ／ｖ）又は０．０８％（ｗ／ｖ）となるように添加した。また、ペプチドを添加しないものを、対照例とした。
【００７９】
（２）第２試薬の調製
▲１▼ トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、Ｌ．Ｗｅｉｇｅｌ，Ｍ．Ｎｏｒｇａｒｄらの方法（ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ６０巻、１５６８〜１５７６頁、１９９２年）に従い、遺伝子組み換え技術により調製した。
▲２▼ 前記▲１▼にて調製したトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を、最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に添加し、溶解させた。
【００８０】
▲３▼ ラテックス粒子〔積水化学社製、平均粒径０．４μｍ、ポリスチレン〕を、０．５％（ｗ／ｖ）となるように、５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）に添加し、懸濁させた。
▲４▼ 前記▲２▼のトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の溶液の０．２ｍＬと、前記▲３▼のラテックス粒子の懸濁液の０．２ｍＬを混合した。
その後、３７℃で３時間静置して、前記トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質の前記ラテックス粒子への固定化を行った。
【００８１】
▲５▼ 前記▲４▼のトレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化したラテックス粒子の懸濁液に、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）の１ｍＬを添加し、３７℃で２時間静置して、担体であるラテックス粒子の表面のブロッキング処理（マスキング処理）を行った。
【００８２】
▲６▼ 前記▲５▼のブロッキング処理（マスキング処理）の後、回転数１４，０００ｒｐｍで、１０℃にて２０分間遠心分離を行った。
遠心分離後、デカンテーションにより上清を除き、沈殿物であるラテックス粒子（トレポネーマ・パリダムの４７Ｋダルトン抗原タンパク質を固定化したラテックス粒子）を得た。
▲７▼ ０．２５％（ｗ／ｖ）の前記▲６▼で調製したラテックス粒子を含む、３００ｍＭ塩化ナトリウム、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び１５ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を調製し、第２試薬とした。
【００８３】
（３）抗ＴＰ抗体測定におけるペプチドの非特異反応抑制効果
▲１▼ ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェルに前記の第１試薬の８７．５μＬを添加し、次にこれに偽陽性血清（２試料）又は抗ＴＰ抗体陽性血清（１試料）１０μＬずつを加え混合した。
▲２▼ このウェルに更に、前記の第２試薬の１２．５μＬを添加し、混合した後、直ちに、このウェル内の混合液の吸光度（主波長：４９０ｎｍ、副波長：６５５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（３３５０型、バイオラッド社製）で測定した。
【００８４】
▲３▼ 前記の吸光度の測定の後、直ぐに前記マイクロタイタープレートを３７℃で静置した。
▲４▼ 前記▲２▼における吸光度の測定から１０分後に、前記のウェル内の反応混合液の吸光度を前記▲２▼の場合と同様にして測定した。
▲５▼ 前記▲４▼において測定した吸光度から前記▲２▼において測定した吸光度を差し引き、吸光度差を得た。この吸光度差は試料に含まれる抗ＴＰ抗体の量（濃度）に比例することとなる。
【００８５】
（４）測定結果
前記（３）において、試料中の抗ＴＰ抗体の測定を行って得られた吸光度差を、表３に示す。
【００８６】
【表３】

【００８７】
（５）考察
表３に示したとおり、対照例では、吸光度差が偽陽性試料１では０．００２１、偽陽性試料２では０．００６９を示し、非特異反応を抑制できていないことが確かめられた。
【００８８】
これに対して、本発明のペプチドを用いた場合は、偽陽性試料１では、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．０００１、濃度が０．０８％の場合には吸光度差が−０．０００１を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。また、偽陽性試料２では、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．００４４であるが、濃度を０．０８％に増加した場合には吸光度差が０．０００６を示しており、非特異反応を抑制できていることが確かめられた。更に、陽性試料を測定した場合は、本発明のペプチドの濃度が０．００８％の場合には吸光度差が０．００３２であり、濃度が０．０８％の場合も０．００３４を示している。これは、本発明のペプチドを含有しない対照例での吸光度差（０．００３０）とほぼ同じ値であり、本発明の非特異反応抑制剤にはＴＰ４７Ｋダルトン抗原タンパク質としての抗原性は残っていないことが分かる。
【００８９】
従って、本発明の非特異反応抑制剤を使用することにより、非特異反応を抑制することができ、かつ試料に含まれていた抗ＴＰ抗体を吸収してしまうことがなく感度を高く保つことができるので、試料中の抗ＴＰ抗体を正確に測定できることが確かめられた。
【００９０】
【発明の効果】
本発明により、抗ＴＰ抗体の測定において非特異反応を抑制することができ、さらに、測定において抗ＴＰ抗体を吸収して免疫反応を阻害することもないため、疾患の診断等の場において正確な測定を行うことができる。
【００９１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】Ａは本発明の抗ＴＰ抗体測定器具の分解斜視図を表す。Ｂはカバー２の横断面図、Ｃはカバー２を裏側から見た図である。
【図２】本発明の抗ＴＰ抗体測定器具の斜視図及び縦断面図を表す。
【図３】表１の結果を、対照例の反応性に対する反応性％としてグラフに表したものである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a substance that suppresses a nonspecific reaction in measurement of an anti-TP antibody using a Treponema Pallidum (hereinafter also abbreviated as TP) antigen, a method for suppressing a nonspecific reaction using the substance, The present invention relates to an anti-TP antibody measurement reagent and an anti-TP antibody measurement method using these.
The present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, immunology and medicine, the field of chemistry such as analytical chemistry, the field of food hygiene, and the field of environmental health.
[0002]
[Prior art]
Syphilis is an infection caused by Treponema pallidum, and whether or not it is infected with syphilis is determined mainly by detection of syphilis antibodies by syphilis serum reaction. In this syphilis serum reaction, an antilipid antibody measurement method using a phospholipid such as cardiolipin or lecithin as an antigen (hereinafter, sometimes abbreviated as STS method) and an anti-lipid antibody using a TP cell or a cell component as an antigen There is a TP antibody measurement method.
[0003]
As the STS method, a glass plate method, an RPR method and the like are used, and as a method for measuring an anti-TP antibody, a fluorescent antibody method (fluorescent resonance antibody test; FTA-ABS method), a passive hemagglutination test (TP hemagglutination test; TPHA method), The particle aggregation method (Trepone Pallidum Particle Aggregation; TPPA method), the enzyme immunoassay method (Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA method), the latex agglutination method (TP platex agglutination; TPLA method) and the immunochromatography method are used. ing. In particular, an anti-TP antibody measurement method using a TP antigen has high specificity for syphilis and is widely used in daily examinations.
[0004]
The TP antigen used in this anti-TP antibody measurement method has been conventionally purified from TP cells. For example, a surface antigen protein of TP antigen can be used as the antigen. As such surface antigen proteins, the existence of 15K dalton antigen protein, 17K dalton antigen protein, 47K dalton antigen protein, and the like is known, and these can be used.
[0005]
In recent years, TP antigens have been produced in host cells such as Escherichia coli using genetic recombination techniques. Since the amino acid sequences of these surface antigen proteins and the base sequences of the genes have already been reported (15 K Dalton antigen protein: Molecular Microbiology 4, 1371-1379, 1990; 17 K Dalton antigen protein: Infection and Immunity 61, 1202-1210, 1993; 47 K Dalton antigen protein: Infection and Immunity 60, 1568-1576, 1992), it is possible to produce these surface antigen proteins using genetic recombination techniques.
[0006]
However, in the anti-TP antibody measurement methods using these TP antigens, depending on the sample to be measured, there may be a false positive due to a nonspecific reaction even though the anti-TP antibody is not present in the sample. There was a risk of misdiagnosis of the disease. This phenomenon is considered to be caused by the reaction of components other than antibodies contained in the specimen with antigens and the like.
[0007]
Various methods are provided as methods for suppressing this non-specific reaction. For example, Japanese Patent Laid-Open No. 58-144748 discloses a technique for adding bovine serum albumin, horse serum albumin, etc. to a reagent in order to suppress non-specific reactions. Shows a technique of adding sodium chloride to suppress non-specific reactions. Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-176195 discloses a method of using reduced albumin chemically modified to suppress non-specific reactions as a blocking agent. Japanese Examined Patent Publication No. 3-59382 discloses a technique using a host bacterial component that is the same type as that used for gene recombination in order to suppress non-specific reactions but has not been subjected to gene recombination. . Furthermore, Japanese Patent No. 3306111 discloses a technique using a cultured cell component that does not contain a gene encoding an antigen and incorporates the same kind of vector as that used for antigen production. However, these techniques are not always sufficient to suppress nonspecific reactions.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, in the measurement of anti-TP antibody using TP antigen, depending on the sample to be measured, although there is no anti-TP antibody in the sample, it may show false positive due to non-specific reaction There was a problem.
Accordingly, an object of the present invention is to prevent non-diagnostic errors by suppressing non-specific reactions in an anti-TP antibody immunoassay method using a TP antigen and performing an accurate measurement in the diagnosis of syphilis. Is to provide.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have suppressed nonspecific reaction of TP antigen protein fragments that do not show the antigenicity of TP antigen protein but have nonspecific reaction suppression effect. By using it as an agent, the inventors have found that the above problems can be solved, and have completed the present invention.
[0010]
That is, the present invention includes the following inventions.
(1) Suppressing non-specific reaction in an immunoassay method for anti-Treponema paridum antibody using an antigen comprising the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 4 to 36 and comprising an antigen containing Treponema paridum 47K dalton antigen protein A peptide having the activity of
[0011]
(2) A peptide comprising all or part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and comprising at least 5 consecutive amino acid sequences in SEQ ID NO: 1, or an antigen comprising the peptide and comprising the Treponema paridum 47K Dalton antigen protein A peptide having an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method for anti-treponema pallidum antibody using
[0012]
(3) A peptide comprising at least 5 consecutive amino acid sequences in SEQ ID NO: 2 consisting of all or part of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, or an antigen containing the peptide and comprising the Treponema paridum 47K Dalton antigen protein A peptide having an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method for anti-treponema pallidum antibody using
[0013]
(4) A peptide comprising an amino acid sequence having the deletion, addition, substitution, or modification of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a part thereof, wherein Treponema A peptide having an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method for an anti-treponema paridum antibody using an antigen containing a paridum 47K dalton antigen protein.
[0014]
(5) A peptide comprising an amino acid sequence having the deletion, addition, substitution, or modification of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or a part thereof, comprising treponema A peptide having an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method for an anti-treponema paridum antibody using an antigen containing a paridum 47K dalton antigen protein.
[0015]
(6) The peptide according to any one of (1) to (5), which does not show the antigenicity of Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein.
(7) A nonspecific reaction inhibitor containing the peptide according to any one of (1) to (6) for use in an immunoassay method for an anti-Treponema paridum antibody using Treponema paridum 47K dalton antigen protein.
[0016]
(8) Anti-Treponema pallidum antibody measurement reagent containing the peptide according to any one of (1) to (6) for use in an immunoassay method of anti-Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein .
(9) The reagent according to (8), further comprising Treponema pallidum 47K dalton antigen protein.
[0017]
(10) The reagent according to (9), wherein the Treponema pallidum 47K dalton antigen protein is produced using a gene recombination technique.
(11) In the immunoassay method of anti-Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K dalton antigen protein, the method according to any one of (1) to (6) is brought into contact with a sample to suppress a nonspecific reaction .
[0018]
(12) An immunoassay method for anti-Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein, which comprises contacting the peptide according to any one of (1) to (6) with a sample .
(13) The immunoassay method according to (12), wherein the Treponema pallidum 47K dalton antigen protein is produced using a gene recombination technique.
(14) An immunoassay kit for measuring an anti-Treponema paridum antibody comprising a carrier according to any one of (1) to (6) and a carrier on which the Treponema paridum 47K dalton antigen protein is immobilized.
[0019]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The peptide of the present invention has an activity of suppressing a non-specific reaction in an immunoassay method for measuring an anti-TP antibody in a sample using Treponema pallidum antigen protein. The immunoassay method in which the peptide of the present invention can be used is not particularly limited as long as it includes the use of Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein. In the present invention, the immunoassay method has an ordinary meaning in this technical field, and means an immunoassay method for detecting an anti-TP antibody in a sample by utilizing an antigen-antibody reaction between an antigen and an antibody.
[0020]
Examples of such immunoassay methods include latex turbidimetry; indirect agglutination measurement methods such as latex agglutination measurement methods; enzyme immunoassay methods, fluorescence immunoassay methods, radioimmunoassay methods, and luminescent immunoassay methods. Labeled immunoassay using labeled substances; Western blotting; ELSA method (enzyme-linked ligand assay) [Dahlback et al., Thromb. Haemost. 79, 767-772, 1998; WO 98/23963]; immunochromatography method; or specific to a test substance described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132819 Using a carrier having a surface on which a target binding substance is immobilized and coated, and particles on which a specific binding substance for a test substance is immobilized, and measuring depending on whether or not the particles are collected on the surface of the carrier, etc. Can be mentioned. When using a labeled immunoassay, the present invention can be applied to any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method). In the present invention, a carrier having a surface on which a specific binding substance for a test substance is immobilized and coated, as described in a latex turbidimetric method, or in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919 In addition, it is preferable to use a method in which particles on which a specific binding substance for a test substance is immobilized are used and measurement is performed depending on whether the particles gather on the surface of the carrier.
[0021]
The measurement may be performed by a method, or may be performed using an apparatus such as an analyzer. The measurement may be performed by a one-step method (one-reagent method) or by a method including a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
[0022]
In the present invention, the TP antigen used in the above-described immunoassay method for anti-TP antibody is not particularly limited as long as it contains at least TP47K Dalton antigen protein. In addition to the TP47K dalton antigen protein, other antigen proteins may be included. Preferably, it comprises a Treponema pallidum surface antigen protein, such as TP15K Dalton antigen protein or TP17K Dalton antigen protein. The antigen protein used as the antigen may be one kind of TP47K Dalton antigen protein or a mixture of several kinds of antigen proteins, but it is preferable to use a mixture of several kinds of antigen proteins. Those in which a plurality of these antigen proteins are bound may be used. These antigen proteins may be purified from Treponema pallidum cells or may be obtained using genetic recombination techniques. As the TP47K dalton antigen protein, a homogenous protein can be prepared continuously and inexpensively, so that it is preferable to use a protein obtained using a gene recombination technique.
[0023]
In the case of producing an antigen protein using a gene recombination technique, a method usually used in this technical field can be used. For example, by cloning a gene encoding an antigen protein, incorporating the obtained gene into an expression vector such as a plasmid, introducing the expression vector into a host cell such as Escherichia coli, and culturing the resulting transformant. Can be expressed. Examples of the gene cloning method include a PCR method, a recombinant PCR method, a ligation method, and a linker ligation method.
[0024]
The TP47K dalton antigen protein artificially prepared by this gene recombination technique may be one that is fused with another protein. Examples of other proteins to be fused include glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin, β-galactosidase, lactase, biotinylated protein, protein A, and gene 10.
[0025]
When purifying an antigen protein from Treponema pallidum cells, it can be obtained by extraction from the cells with a surfactant or ultrasonic disruption. Furthermore, it can also obtain by refine | purifying the antigen protein extracted from the microbial cell by gel filtration, ion exchange, or a hydroxyapatite.
[0026]
The present invention is an anti-treponema using a TP47K dalton antigen protein, which is a peptide having 3 or more amino acids, preferably 3 to 200, more preferably 50 to 200, including all or part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. -It relates to a peptide that has an activity of suppressing a non-specific reaction in an immunoassay method for a paridum antibody and does not have the antigenicity of a TP antigen protein. Here, the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence corresponding to positions 126 to 295 in the amino acid sequence of the 47 K Dalton antigen protein of Treponema paridum. As such a peptide, the peptide containing the amino acid sequence of the following sequence numbers 4-36 can be mentioned.
(1) EGAVALADRA (SEQ ID NO: 4)
(2) LADRASS FMV (SEQ ID NO: 5)
(3) SSFMVDSEEY (SEQ ID NO: 6)
(4) DSEYYKITNV (SEQ ID NO: 7)
(5) KITNVKVHGM (SEQ ID NO: 8)
(6) KVHGMKFVPV (SEQ ID NO: 9)
(7) KFVPVAVPHE (SEQ ID NO: 10)
(8) AVPHELKGIA (SEQ ID NO: 11)
(9) LKGIAKEKFH (SEQ ID NO: 12)
(10) KEKFHFVEDS (SEQ ID NO: 13)
(11) FVEDSRVTEN (SEQ ID NO: 14)
(12) RVTENNGLK (SEQ ID NO: 15)
(13) TNGLKTMLTE (SEQ ID NO: 16)
(14) TMLTEDFSA (SEQ ID NO: 17)
(15) DSFSARKVSS (SEQ ID NO: 18)
(16) RKVSSSMESPH (SEQ ID NO: 19)
(17) MESPHDLVVD (SEQ ID NO: 20)
(18) DLVVDTVGTG (SEQ ID NO: 21)
(19) TVGTTGYHSRF (SEQ ID NO: 22)
(20) YHSRFGSDAE (SEQ ID NO: 23)
(21) GSDAEASVML (SEQ ID NO: 24)
(22) ASVMLKRADG (SEQ ID NO: 25)
(23) KRADGSELSH (SEQ ID NO: 26)
(24) SELSHREFID (SEQ ID NO: 27)
(25) REFIDYVMNF (SEQ ID NO: 28)
(26) YVMFNNTVRY (SEQ ID NO: 29)
(27) NTVRYDYYGD (SEQ ID NO: 30)
(28) DYYGDDASYT (SEQ ID NO: 31)
(29) DASYTNLMAS (SEQ ID NO: 32)
(30) NLMASYGTKH (SEQ ID NO: 33)
(31) YGTKHSADSW (SEQ ID NO: 34)
(32) SADSWWKTGR (SEQ ID NO: 35)
(33) WKTGRVPRIS (SEQ ID NO: 36)
[0027]
Of the above peptides, a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 corresponding to positions 165 to 244 in the amino acid sequence of the 47 K Dalton antigen protein of Treponema pallidum is preferred. More preferred is a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The peptide of the present invention comprises an amino acid sequence having a deletion, addition, substitution or modification of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 or a part thereof. A peptide that has an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method of an anti-Treponema pallidum antibody using an antigen containing Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein, and has no antigenicity of TP47K Dalton antigen protein Is included. Here, several means 1 to 10, preferably 1 to 5. The length of these peptides is not particularly limited, but is 3 or more amino acids, preferably 3 to 200 amino acids, more preferably 50 to 200 amino acids.
In the present invention, the peptide means a peptide in which two or more amino acids are bonded by peptide bonds, and includes oligopeptides, polypeptides, and proteins.
[0028]
Furthermore, the peptide used in the present invention is not limited to other proteins, peptides, carbohydrates, lipid residues, amino acids, etc., as long as the nonspecific reaction inhibitory effect is maintained and the fusion itself does not cause a nonspecific reaction. May be bonded. Here, as other proteins, proteins for efficiently expressing or purifying the peptide of the present invention, such as glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), thioredoxin, β-galactosidase, lactase , Biotinylated protein, protein A or gene 10 and the like.
[0029]
The peptide of the present invention as described above can be prepared by a method usually used in the art, and such a method is not particularly limited. For example, a method such as a chemical synthesis method or a gene recombination technique is used. be able to.
When using a gene recombination technique, for example, a gene encoding a target peptide is first cloned, and the obtained gene is incorporated into an expression vector such as a plasmid. The target peptide can be expressed by introducing this expression vector into a host cell such as E. coli and culturing the resulting transformant.
[0030]
Examples of the gene cloning method include a PCR method, a recombinant PCR method, a ligation method, and a linker ligation method. For example, when the PCR method is used, the target base sequence can be amplified using a primer.
[0031]
For example, in order to express a peptide consisting of the entire amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, first, the base of the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the amino acid sequence of TP47K Dalton antigen protein is used by PCR. The sequence is obtained by amplification using primers. The nucleotide sequence of the gene thus obtained is incorporated into an expression vector by a ligation method or the like, this expression vector is introduced into Escherichia coli, and the resulting transformant is cultured to obtain the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. It is possible to express a peptide consisting of an amino acid sequence consistent with the whole.
[0032]
The method of using the peptide when suppressing the nonspecific reaction in antibody measurement using the peptide of the present invention is not particularly limited as long as the sample to be measured can be brought into contact with the nonspecific reaction suppressing peptide of the present invention. For example, a method of bringing a peptide of the present invention contained in a buffer solution or the like into contact with a sample before an antibody measurement reaction and suppressing a nonspecific reaction in advance can be mentioned. Alternatively, the peptide of the present invention is contained in a reagent in which an antigen containing TP47K Dalton antigen protein is present, and this reagent is brought into contact with the sample to carry out an antibody measurement reaction. Upon reaction between the anti-TP antibody in the sample and the antigen Alternatively, the method of coexisting the peptide of the present invention may be used. Alternatively, a method combining these two methods may be used.
[0033]
In the present invention, the sample means an object for which anti-TP antibody may be present and the presence or absence or content (concentration) of the anti-TP antibody is measured. For example, human or animal blood, serum And body fluids such as plasma, urine and saliva.
The amount of the peptide to be used can be changed according to the strength of the nonspecific reaction occurring at the time of measuring the anti-TP antibody, and a concentration sufficient to absorb the nonspecific reaction may be appropriately set. For example, the concentration of the peptide of the present invention present at the time of antibody measurement is preferably 0.0001% (w / v) or more, more preferably 0.0001 to 1% (w / v), still more preferably 0.01 to It is preferably used in such an amount that the concentration is 1% (w / v).
[0034]
The buffer solution containing the peptide of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various buffer solutions such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution, phosphate buffer solution or phosphate buffered saline. it can. You may further contain additives, such as a reaction accelerator and a stabilizer, in a buffer solution. It can also be used together with another nonspecific reaction suppressing substance used in the prior art.
[0035]
For example, when measuring by a two-step method using latex turbidimetry as an anti-TP antibody measurement method, the peptide of the present invention is contained in a first reagent consisting of a buffer solution, and this is brought into contact with a sample in advance. Thus, the non-specific reaction can be suppressed before measuring the anti-TP antibody, and then this can be brought into contact with the second reagent in which latex particles on which the TP antigen is immobilized are present. Further, the peptide of the present invention is contained in a second reagent in which latex particles having immobilized TP antigens are present, and this second reagent is brought into contact with a mixture of the sample and the first reagent to perform an antibody measurement reaction. The peptide of the present invention may coexist in the measurement reaction of the anti-TP antibody. Alternatively, these two methods may be used in combination.
When a measurement method using a carrier is used as the antibody measurement method, the type and shape of the carrier to be used are not particularly limited, and those commonly used in the art can be used.
[0036]
Carriers usable in the latex turbidimetric method are not particularly limited. For example, polystyrene / latex particles, styrene / styrene sulfonate copolymer / latex particles, acrylonitrile / butadiene / styrene copolymer / latex particles, chloride Vinyl-acrylic acid ester copolymer / latex particles, vinyl acetate-acrylic acid copolymer / latex particles, polyacrolein / latex particles, styrene-methacrylic acid copolymer / latex particles, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer Examples thereof include latex particles in which synthetic polymer particles such as polymer / latex particles, methacrylic acid polymer / latex particles, and acrylic acid polymer / latex particles are uniformly suspended.
[0037]
The carrier that can be used in the indirect agglutination reaction measurement method such as the particle agglutination reaction measurement method or the latex agglutination reaction measurement method is not particularly limited, and examples thereof include polystyrene, liposome, latex, gelatin, polyacrylamide, microcapsule, and emulsion. Examples thereof include particles made of an organic polymer material, particles made of an inorganic polymer material such as glass, silica gel, carbon or bentonite, or other artificial carriers.
[0038]
The carrier particles may be colored by coating a pigment or dispersing or encapsulating the pigment in the particles. The particle diameter of the carrier particles is not particularly limited, but the average particle diameter is preferably in the range of 0.01 to 100 μm, and more preferably in the range of 0.1 to 10 μm. Moreover, it is preferable that the specific gravity of these particle | grains exists in the range of 1-10, and it is more preferable that it exists in the range of 1-2.
[0039]
In the indirect agglutination measurement method, for example, a test tube, a microplate (microtiter plate), a tray, or the like made of glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, or the like can be used as a carrier. The shape of the bottom of the solution storage portion of such a container, that is, the well of the microplate is not particularly limited, but is a shape having an inclination from the bottom center to the periphery, such as U type, V type, or UV type. Is preferred.
[0040]
The carrier that can be used in a labeled immunoassay using a labeling substance such as an enzyme immunoassay, a fluorescent immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay is not particularly limited. For example, polystyrene, polycarbonate, polyvinyl Particles made of materials such as toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose or glass, microcapsules, beads, microplate (microtiter plate) , Test tubes, sticks or test pieces.
[0041]
Further, a carrier having a surface on which a specific binding substance to a test substance (test substance) is fixed and coated, as described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919, and the test The carrier that can be used in the measurement method using particles in which a specific binding substance for a substance (test substance) is immobilized is not particularly limited. For example, polystyrene, glass, polyvinyl chloride, polyacrylate, polypropylene, nylon, Examples thereof include a carrier made of a non-water-absorbing material such as polyethylene, polycarbonate, and polymethacrylate.
In the present invention, a magnetic carrier prepared by coating the above carrier with a ferromagnetic material or containing a ferromagnetic material at the time of carrier molding can be used.
[0042]
The label used in the labeled immunoassay is not particularly limited as long as it is usually used in the art, but an enzyme label is preferably used. Examples of the enzyme label include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, β-galactosidase, luciferase, urease, lysozyme, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and ribonuclease.
[0043]
In the present invention, the anti-TP antibody measurement reagent means a reagent for use in the aforementioned immunoassay method for anti-TP antibody. Examples of the anti-TP antibody measurement reagent include a reagent containing the peptide of the present invention and a reagent containing TP47K Dalton antigen protein. The antigen protein may be immobilized on a carrier. The anti-TP antibody measurement reagent may contain additional components such as other antigenic proteins. The amount of the peptide of the present invention contained in the anti-TP antibody measurement reagent is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction in the measurement of anti-TP antibody and has a nonspecific reaction suppressing effect, but preferably 0.0001 to 1 % (W / v), more preferably 0.01 to 1% (w / v).
[0044]
The anti-TP antibody measurement reagent of the present invention is not particularly limited to these, but includes, for example, proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or salts thereof; various salts; various sugars; Non-fat dry milk; various animal sera such as normal rabbit serum; various preservatives such as sodium azide or antibiotics; activator; reaction accelerator; sensitivity-increasing substance such as polyethylene glycol; nonspecific reaction inhibitor Or you may contain 2 or more types suitably. The concentration of these components in the anti-TP antibody measurement reagent is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% (w / v), and particularly preferably 0.01 to 5% (w / v).
[0045]
In the production of the anti-TP antibody measurement reagent of the present invention, various aqueous solvents can be used as the solvent. Examples of the aqueous solvent include, but are not limited to, purified water, physiological saline, or various buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, or phosphate buffered saline. Can do.
[0046]
The pH of the anti-TP antibody measurement reagent may be appropriately selected and used, and although there is no particular limitation, a pH within the range of pH 3 to 12 is usually selected. In the present invention, it is preferable to use a pH in the alkaline region. More preferably, the pH is 7.3 or higher, for example, pH 8-10.
[0047]
The anti-TP antibody measurement reagent of the present invention may be used alone or in combination with other reagents. Other reagents include, for example, a buffer, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or a reagent containing a substance for performing calibration. Etc.
In order to measure an anti-TP antibody in a sample using the anti-TP antibody measurement reagent in the present invention, the operation may be performed according to an operation method based on the measurement principle of the immunoassay method to be used.
[0048]
The present invention also includes an immunoassay kit in which an anti-TP antibody measurement reagent, the above-mentioned other reagents, a carrier and the like are appropriately combined based on the principle of the measurement method used. As such a kit, for example, when used in a labeled immunoassay, a kit containing an anti-TP antibody measurement reagent, a labeled antigen, an antibody diluent and the like is preferable. Those containing a TP antibody measurement reagent and a particle dispersion are preferred.
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not limited to these.
[0049]
【Example】
[Example 1]
Preparation of peptides with activity to suppress non-specific reactions
From the crushed rabbit testicles subcultured with Treponema pallidum, Treponema pallidum cells were extracted to extract genes. The base sequence of TP47K Dalton antigen protein is already known as described above, and the entire amino acid sequence is as shown in SEQ ID NO: 3. This amino acid sequence was divided into the following five regions, and each TP47K dalton antigen protein fragment was prepared by the following method.
Example 1: Peptide consisting of sequences 126 to 295 of SEQ ID NO: 3
Comparative Example 1: Peptide consisting of sequences 1 to 164 of SEQ ID NO: 3
Comparative Example 2: Peptide consisting of sequences 244 to 415 of SEQ ID NO: 3
Comparative Example 3: Peptide consisting of sequences 1 to 295 of SEQ ID NO: 3
Comparative Example 4: Peptide consisting of sequences 126 to 415 of SEQ ID NO: 3
[0050]
First, oligonucleotides of about 20 bases at both ends of the base sequence encoding the TP47K Dalton antigen protein fragment were synthesized as primers. Here, the base sequences encoding the five types of TP47K Dalton antigen protein fragments were amplified by PCR using the above-mentioned base sequences divided into five regions as templates and the above primers. Next, the obtained 5 types of base sequences were each inserted into a vector (Pharmacia, pGEX4T3) containing a base sequence encoding glutathione-S-transferase (GST). This vector was introduced into Escherichia coli, and the cells were cultured. Thereafter, Escherichia coli in which the TP47K dalton antigen protein fragment was sufficiently expressed was disrupted by sonication, centrifuged, and the precipitate was solubilized with 8 M urea, and then dialyzed to remove urea. This was further centrifuged, and the supernatant was recovered to obtain 5 types of TP47K Dalton antigen protein fragments having a purity of 50% or more.
[0051]
[Example 2]
The nonspecific reaction inhibitory effect of the peptide fragment in the measurement of an antibody (anti-TP antibody) against Treponema pallidum was confirmed using an ELISA method.
(1) Preparation of TP47K Dalton antigen protein-immobilized plate
(1) Preparation of cleaning solution
A phosphate buffered saline containing 0.02% (w / v) Tween 20 was prepared and used as a washing solution.
(2) Preparation of blocking solution
Phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared and used as a blocking solution.
(3) Preparation of TP47K Dalton antigen protein immobilized plate
[0052]
The 47K Dalton antigen protein of Treponema pallidum Weigel, M .; It was prepared by a gene recombination technique according to the method of Norgard et al. (Infection and Immunity, 60, 1568 to 1576, 1992). This TP47K Dalton antigen protein was added to phosphate buffered saline so as to be 2 μg / mL. 50 μL of this was dispensed into each well of a 96-well microtiter plate (manufactured by Nunk), and then allowed to stand overnight at 4 ° C. to immobilize TP47K Dalton antigen protein on the inner wall of each well.
[0053]
Next, the solution in each well of the 96-well plate was removed, and the plate was washed twice with the washing solution (1). Thereafter, 200 μL of the blocking solution (2) was dispensed into each well, and each well was blocked. Then, the liquid in each well of the plate was removed, and the plate was washed twice with the washing liquid. What was prepared by the above operation was used as the TP47K Dalton antigen protein fixed plate.
[0054]
(2) Preparation of peroxidase (POD) labeled antibody
A POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution (manufactured by Dako; P0406) was diluted 1000-fold with phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate.
[0055]
(3) Preparation of sample diluent
A phosphate buffered saline containing 0.5% (w / v) sodium caseinate was prepared, and the peptide fragments of Example 1 and Comparative Examples 1 to 4 prepared in Example 1 were added to the final concentration of 0.02 % (W / v) was added. Moreover, the thing which does not add any peptide was made into the control example.
[0056]
(4) Nonspecific reaction suppression effect in anti-TP antibody measurement
50 μL each of false positive serum (1 sample) or anti-TP antibody positive serum (14 samples) diluted 200-fold with the sample diluent prepared in (3) was added to the TP47K Dalton antigen protein-immobilized plate prepared in (1) above. It was added to each well and reacted at 37 ° C. for 4 hours. Thereafter, the serum solution in the wells of the plate was removed and the plate was washed with the washing solution.
Further, 50 μL of the POD-labeled rabbit anti-human IgG antibody solution prepared in (2) above was added to each well and allowed to react at room temperature for 4 hours. Next, each well was washed with the washing solution.
[0057]
Thereafter, 100 μL of a coloring solution (33 μL of 0.3% hydrogen peroxide added to 1 mL of a buffer solution containing 4 mM o-phenylenediamine, 103 mM disodium hydrogen phosphate, 49 mM citric acid immediately before use) After adding to wells and reacting for 20 minutes at room temperature, 50 μL of 4N sulfuric acid aqueous solution was added to each well to stop the reaction.
Thereafter, the absorbance at 490 nm of each well was measured using a microplate reader (Biorad, Model 3550). The obtained absorbance is shown in Table 1.
[0058]
[Table 1]

[0059]
(5) Consideration
From Table 1, when the peptides of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 were used, the reactivity with the sample when the false positive sample was measured was as follows: In 86.4% and Comparative Example 2, it is 85.9%, indicating that the non-specific reaction was not suppressed. Further, when a positive sample is measured, depending on the sample, since the anti-TP antibody contained in the positive sample has been absorbed, the absorbance has decreased as compared with the control example. That is, the peptides of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 have no activity to suppress non-specific reaction, and the antigenicity as TP47K Dalton antigen protein remains, resulting in a decrease in sensitivity and accurate measurement. I understand that there is no.
[0060]
In addition, when the peptides of Comparative Example 3 and Comparative Example 4 were used, the reactivity with the sample when the false positive sample was measured was 35. In 6% and Comparative Example 4, it was 14.5%, and the non-specific reaction could be suppressed. However, when a positive sample was measured, depending on the sample, the anti-TP antibody contained in the positive sample As a result, the absorbance has decreased as compared to the control example. That is, it can be seen that the peptides of Comparative Example 3 and Comparative Example 4 still have antigenicity as TP47K Dalton antigen protein, which causes a decrease in sensitivity and does not allow accurate measurement.
[0061]
On the other hand, when the peptide of Example 1 was used, the reactivity with the sample when measuring the false positive sample was 20.4% when the control example was 100%. It can be seen that the non-specific reaction can be suppressed. Furthermore, even when a positive sample is measured, although there is variation depending on the sample, the reactivity with the positive sample is maintained, and the peptide of the present invention has almost no antigenicity as a TP47K Dalton antigen protein. I understand.
[0062]
Therefore, by using the peptide of the present invention, the nonspecific reaction can be suppressed, and the sensitivity can be kept high without absorbing the anti-TP antibody contained in the sample. It was confirmed that the anti-TP antibody contained therein could be accurately measured.
[0063]
Further, from the results of the present invention, Comparative Example 1 and Comparative Example 2, among the amino acid sequences of the peptides of the present invention, the 165th to 244th positions not included in the amino acid sequence of the TP47K Dalton antigen protein fragment of Comparative Example 1 and Comparative Example 2 The sequence corresponding to is considered to be involved in the suppression of non-specific reactions.
[0064]
Example 3
Using the measurement methods described in JP-A-9-229936 and JP-A-10-132919, etc., the nonspecific reaction inhibitory effect of the peptide of the present invention in measuring antibody (anti-TP antibody) against Treponema pallidum was confirmed. .
[0065]
(1) Preparation of peptide
In the same manner as in Example 1, the peptide of the present invention (Example 1) was prepared.
(2) Preparation of anti-TP antibody measuring instrument
Example 1 (1) in Example 2 on the acrylic resin extruded plate 1 (width 10 mm, depth 38 mm, thickness 1 mm) from the front end of the acrylic resin (made by Acrysanday) to a portion 18 mm to 15 mm (position 3 in FIG. 1) The antigen was immobilized by placing 2 μg / mL of TP47K Dalton antigen protein prepared by genetic recombination by the same method as in 3 ▼ using a pipette and allowing to stand at 37 ° C. for 3 hours.
[0066]
Then, after removing the solution with a pipette, 0.3 mL of phosphate buffer (pH 7.5, 50 mM) containing 0.5% (w / v) casein (hereinafter referred to as Diluent A) is added thereto. Then, the sample was left at 4 ° C. overnight, and this was removed by suction with a pipette to perform masking, and the determination unit 3 was obtained.
[0067]
Next, as shown in FIG. 1A, a cover 2 (width 12 mm, depth 40 mm) made of a transparent plate in which two frames 4 (depth 16 mm, height 0.5 mm, distance 5 mm between the frames) are formed at the center. , Thickness 2.5 mm) and sample absorbing portion 8 (Berclin E2, manufactured by Kanebo Co., Ltd., 2 mm thick material cut to 4 mm width and 5 mm depth) on the acrylic resin extruded plate 1 By combining as shown in A of 2, a passage 6 having a space of 0.5 mm in height, 16 mm in depth and 5 mm in width surrounded by the acrylic resin extruded plate 1 and the cover 2 shown in A of FIG. 2 was provided. The opening 5 (width 5 mm, depth 2 mm, thickness 2.5 mm) provided in the cover 2 becomes the sample supply unit 5. 1B is a cross-sectional view of the cover 2, and FIG. 1C is a view of the cover 2 as viewed from the back side.
[0068]
Further, as shown in FIG. 1A, a transparent obstacle 7 (width) having a hole of the same size as that of the sample supply unit at the center and formed so that one side surface of the hole extends toward the upper part. 7 mm, depth 8 mm, height 1 mm) was pasted on the sample supply unit 5 with an acrylic adhesive. This was used as an anti-TP antibody measuring instrument. FIG. 2B is a longitudinal sectional view of an anti-TP antibody measuring instrument.
[0069]
(3) Preparation of TP47K Dalton antigen protein-immobilized particles
Particles (magnetic particles) [Dynabeads M-450 uncoated, manufactured by Dynal, particle size: 4.5 μm, particle size C.I. V. 5% or less, specific gravity 1.5, concentration 6% (w / v)] and TP47K Dalton antigen protein (pH 7.0, 10 mM phosphate buffer solution) prepared in the same manner as (3) in (2) of Example 2 1 mL) dissolved at a concentration of 100 μg / mL was mixed and reacted at 37 ° C. for 1 hour. To this, a phosphate buffer solution (pH 7.5, 50 mM) containing 0.5% (w / v) casein was added in an amount of about 20 times to perform masking, and the resulting particles were washed with diluent A. The particles were redispersed in glycine buffer (pH 9.5, 50 mM) to a concentration of about 0.2% (w / v). In this way, a TP47K dalton antigen protein-immobilized particle dispersion was prepared.
[0070]
(4) Non-specific reaction inhibitory effect of peptides in anti-TP antibody measurement
The peptide prepared in (1) above was added to the TP47K Dalton antigen protein-immobilized particle dispersion prepared in (3) so that the final concentration was 0.2% (w / v). Moreover, the thing which does not add a peptide was made into the control example.
A determination unit is prepared by placing 50 μL each of false positive serum (3 samples) or anti-TP antibody positive serum (1 sample) on each sample supply unit 5 of the anti-TP antibody measuring instrument prepared in (2) above using a pipette. 3 was contacted.
[0071]
As a result, the sample moves through the passage 6 of the measuring instrument and contacts the determination unit 3, and is then absorbed by the sample absorption unit 8.
After the false positive sample or the positive sample brought into contact with the determination unit 3 is absorbed and removed by the sample absorption unit 8, the TP47K dalton antigen protein-immobilized particle dispersion prepared in (3) is used as the anti-TP antibody measurement instrument. The determination unit 3 was brought into contact with each sample supply unit 5 by placing it on each sample supply unit 5 using a pipette.
[0072]
Then, by arranging a magnet in the direction of the side where the determination unit 3 of the anti-TP antibody measuring instrument is formed, the TP47K Dalton antigen protein-immobilized particles move in the direction from the sample supply unit 5 to the sample absorption unit 8. A magnetic field having a magnetic flux density of 40 to 60 gauss was generated.
[0073]
Table 2 shows the determination result one minute after the magnetic field was generated. In addition, + indicates a case where a particle image is recognized in the determination unit 3, + W indicates a case where a weak particle image is recognized in the determination unit 3, and-indicates a case where a particle image is not recognized in the determination unit 3. ing.
[0074]
[Table 2]

[0075]
(5) Consideration
As shown in Table 2, in the control example, the determination result of the false positive sample 1 indicates + (a particle image is recognized in the determination unit 3), and the determination result of the false

positive samples

2 and 3 is + W (determination unit) 3 showed a weak image of the particles), confirming that the nonspecific reaction could not be suppressed.
[0076]
On the other hand, when the peptide of the present invention is used, all the determination results of the false positive samples 1 to 3 indicate − (no particle image was recognized in the determination unit 3), and the nonspecific reaction It was confirmed that this was able to be suppressed. Furthermore, the determination result when a positive sample is measured also shows +, indicating that the nonspecific reaction-suppressing peptide of the present invention does not retain the antigenicity as a TP47K dalton antigen protein.
[0077]
Therefore, by using the peptide of the present invention, the non-specific reaction can be suppressed and the sensitivity can be kept high without absorbing the anti-TP antibody contained in the sample. It was confirmed that the anti-TP antibody contained therein could be accurately measured.
[0078]
Example 4
The inhibitory effect on the nonspecific reaction of the peptide of the present invention in the antibody (anti-TP antibody) measurement against Treponema pallidum was confirmed using a latex agglutination method.
(1) Preparation of first reagent
The following first reagent was prepared as a sample diluent.
Example 1 in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 8.5) containing 4% (w / v) BSA, 0.2% (w / v) polyethylene glycol and 15 mM sodium azide The prepared peptide of the present invention was added so that the final concentration was 0.008% (w / v) or 0.08% (w / v). Moreover, the thing which does not add a peptide was made into the control example.
[0079]
(2) Preparation of second reagent
(1) A 47K Dalton antigen protein of Treponema pallidum Weigel, M .; It was prepared by a gene recombination technique according to the method of Norgard et al. (Infection and Immunity 60, 1568 to 1576, 1992).
(2) The 47 K Dalton antigen protein of Treponema pallidum prepared in (1) above was added to a 50 mM glycine buffer (pH 9.0) and dissolved so that the final concentration was 50 μg / mL.
[0080]
(3) Latex particles (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd., average particle size 0.4 μm, polystyrene) are added to 50 mM glycine buffer (pH 9.0) so as to be 0.5% (w / v). Made cloudy.
(4) 0.2 mL of the 47 K Dalton antigen protein solution of Treponema Paridam in (2) above and 0.2 mL of the latex particle suspension in (3) above were mixed.
Then, it was allowed to stand at 37 ° C. for 3 hours to immobilize the Treponema pallidum 47K dalton antigen protein on the latex particles.
[0081]
(5) 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane-hydrochloric acid buffer containing 1% (w / v) BSA in a suspension of latex particles on which 47 K Dalton antigen protein of Treponema pallidum of (4) is immobilized 1 mL of the liquid (pH 7.2) was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours to perform blocking treatment (masking treatment) on the surface of the latex particles as the carrier.
[0082]
(6) After the blocking treatment (masking treatment) in (5) above, centrifugation was carried out at 10 ° C. for 20 minutes at 14,000 rpm.
After centrifugation, the supernatant was removed by decantation to obtain latex particles (latex particles immobilizing 47K Dalton antigen protein of Treponema Paridam) as precipitates.
(7) 50 mM Tris (hydroxymethyl) containing 300 mM sodium chloride, 1% (w / v) BSA and 15 mM sodium azide containing 0.25% (w / v) of the latex particles prepared in (6) above ) Aminomethane-hydrochloric acid buffer (pH 7.2) was prepared and used as the second reagent.
[0083]
(3) Effect of inhibiting nonspecific reaction of peptide in anti-TP antibody measurement
(1) Add 87.5 μL of the first reagent to the wells of a 96-well microtiter plate (manufactured by NUNK), and then add false-positive serum (2 samples) or anti-TP antibody-positive serum (1 sample). 10 μL each was added and mixed.
(2) After adding 12.5 μL of the second reagent to the well and mixing it, the absorbance (main wavelength: 490 nm, subwavelength: 655 nm) of the mixed solution in the well was immediately measured. (3350 type, manufactured by Bio-Rad).
[0084]
(3) Immediately after the measurement of the absorbance, the microtiter plate was allowed to stand at 37 ° C.
(4) Ten minutes after the measurement of the absorbance in (2) above, the absorbance of the reaction mixture in the well was measured in the same manner as in (2) above.
(5) The difference in absorbance was obtained by subtracting the absorbance measured in (2) from the absorbance measured in (4). This difference in absorbance is proportional to the amount (concentration) of anti-TP antibody contained in the sample.
[0085]
(4) Measurement results
Table 3 shows the difference in absorbance obtained by measuring the anti-TP antibody in the sample in (3).
[0086]
[Table 3]

[0087]
(5) Consideration
As shown in Table 3, in the control example, the absorbance difference was 0.0021 in the false positive sample 1 and 0.0069 in the false positive sample 2, and it was confirmed that the nonspecific reaction could not be suppressed.
[0088]
On the other hand, in the case of using the peptide of the present invention, in the false positive sample 1, when the concentration of the peptide of the present invention is 0.008%, the absorbance difference is 0.0001 and the concentration is 0.08%. In some cases, the absorbance difference was -0.0001, confirming that the nonspecific reaction could be suppressed. Moreover, in the false positive sample 2, when the concentration of the peptide of the present invention is 0.008%, the absorbance difference is 0.0044, but when the concentration is increased to 0.08%, the absorbance difference is 0.00. 0006 was shown, confirming that the nonspecific reaction could be suppressed. Furthermore, when a positive sample is measured, the absorbance difference is 0.0032 when the concentration of the peptide of the present invention is 0.008%, and 0.0034 when the concentration is 0.08%. . This is almost the same value as the difference in absorbance (0.0030) in the control example not containing the peptide of the present invention, and the nonspecific reaction inhibitor of the present invention does not retain the antigenicity as a TP47K dalton antigen protein. I understand that.
[0089]
Therefore, by using the non-specific reaction inhibitor of the present invention, the non-specific reaction can be suppressed and the sensitivity can be kept high without absorbing the anti-TP antibody contained in the sample. As a result, it was confirmed that the anti-TP antibody in the sample can be accurately measured.
[0090]
【The invention's effect】
According to the present invention, a non-specific reaction can be suppressed in the measurement of anti-TP antibody, and further, the anti-TP antibody is not absorbed in the measurement and does not inhibit the immune reaction. Measurements can be made.
[0091]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1A is an exploded perspective view of an anti-TP antibody measuring instrument of the present invention. B is a cross-sectional view of the cover 2, and C is a view of the cover 2 as viewed from the back side.
FIG. 2 shows a perspective view and a longitudinal sectional view of an anti-TP antibody measuring instrument of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the results of Table 1 as% reactivity relative to the reactivity of the control example.

Claims

The following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1,
(B) A peptide consisting of an amino acid sequence having a deletion, addition, substitution or modification of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and comprising Treponema paridum 47K Dalton antigen protein A peptide that has an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method of an anti-treponema paridum antibody using an antigen and does not show the antigenicity of the treponema paridum 47K dalton antigen protein.

The following peptide (a) or (b):
(A) a peptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
(B) a peptide consisting of an amino acid sequence having a deletion, addition, substitution or modification of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and comprising the Treponema paridum 47K Dalton antigen protein A peptide that has an activity of suppressing non-specific reaction in an immunoassay method of an anti-treponema paridum antibody using an antigen and does not show the antigenicity of the treponema paridum 47K dalton antigen protein.

The nonspecific reaction inhibitor containing the peptide of Claim 1 or 2 for using it in the immunoassay method of the anti- Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein.

A reagent for measuring anti-Treponema pallidum antibody comprising the peptide according to claim 1 or 2 for use in an immunoassay method for anti-Treponema pallidum antibody using Treponema paridum 47K Dalton antigen protein.

The reagent according to claim 4, further comprising Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein.

The reagent according to claim 5, wherein the Treponema pallidum 47K dalton antigen protein is produced using a gene recombination technique.

In the immunoassay method of the anti-Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K dalton antigen protein, the method of contacting a peptide of Claim 1 or 2 with a sample, and suppressing a nonspecific reaction.

A method for immunoassay of an anti-Treponema pallidum antibody using Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein, the method comprising contacting the peptide according to claim 1 or 2 with a sample.

The immunoassay method according to claim 8, wherein the Treponema pallidum 47K Dalton antigen protein is produced using a gene recombination technique.

An immunoassay kit for measuring an anti-Treponema pallidum antibody, comprising a carrier on which the peptide according to claim 1 or 2 and Treponema pallidum 47K dalton antigen protein are immobilized.