JP3600753B2 - 新規リンカーおよびそれを用いる糖ペプチドの固相合成法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、新規なリンカーとこれを用いる糖ペプチドの固相合成法に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、立体障害の大きい、かさ高い置換基を有する新規なリンカーを形成するｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物と、その製造法およびそれを糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして用いる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現在一般的なペプチドの固相合成法では、ペプチドＣ末端となるアミノ酸のカルボキシル基を、予め固相に固定したリンカーとエステル結合で結び、引き続きＮ末端方向へ必要数のアミノ酸ユニットを順次結合させてペプチド鎖を伸長し、最後にアミノ酸側鎖の保護基の除去とともに固相よりオリゴペプチドを切り出すという手法が用いられている。この切り出しの操作は一般的には、トリフルオロ酢酸やフッ化水素というような強い酸性条件でおこなわれる。
【０００３】
だが、この従来一般的な方法における酸性における切り出し操作には強酸を使用することからその取扱いに注意が必要であって、あまり実際的ではないという問題がある。そこで、より弱い酸性条件で切断できるリンカーも開発されている。この場合には、側鎖の保護基を保持したままでオリゴペプチドを取りだすことが可能となる。ただしこの弱酸条件の設定は慎重に検討することが肝要となる。すでにこれらの技術のために各種アミノ酸について残基リンカーを介して固相に結合させた樹脂も市販されているが、その操作は必ずしも容易でないという問題が解消されないでいた。
【０００４】
このような状況において、固相と合成ペプチドとを切断する際に酸条件を必要としないリンカー類も開発されており、その一つとしてフッ素アニオンとケイ素との親和性を利用して切断反応を導く含ケイ素型のリンカーが数種知られている（Ｄ．Ｇ．Ｍｕｌｌｅｎ， Ｇ．Ｂａｒａｎｙ， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． １９８８， ５３， ５２４０）。しかしながら、ペプチド合成用に開発されたのはアミノ酸のカルボキシル基をエステル型で結ぶリンカー内の置換基の一部としてケイ素脱離基が採用されているものばかりである。
【０００５】
さらにまた、近年では、糖鎖の合成にも固相合成法を用いて効率化、あるいはコンビナトリアルケミストリーを展開しようとする試みが盛んに行われるようになって、シリル基を導入した樹脂上に糖残基の水酸基との間でケイ素−酸素結合によって糖残基を固定し、糖鎖伸長の後にフッ素アニオンで切り出しを行うという例が知られている（Ｊ．Ｔ．Ｒａｎｄｏｌｐｈ， Ｋ．Ｆ．ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ， １９９５， １１７， ５７１２）。ただ、この場合には、樹脂上へ固定された糖残基のモル数を直接的に検出し推定することは困難である。複合糖質研究が盛んとなって蛋白質と糖鎖からなる糖蛋白質の構造と機能の解明そして糖蛋白質分子の医薬、農薬などへの応用が期待される今日、高分子の糖蛋白質を有機化学的に精密合成する技術の確立も必要とされている。このためには糖蛋白質分子構築の部品となるべき小断片である糖ペプチドを、糖鎖水酸基をはじめとするその側鎖上の官能基を保護したものとして効率良く合成し、後にブロック縮合などの技術によって大分子に組み立てる方法が実際的であると考えられている。
【０００６】
しかしながら、以上のような従来のペプチド合成用に開発されたシリルリンカーは酸性条件に依存することなく切り出し操作ができるという長所を有するものの、その調製が煩雑であり、また切り出しに際してリンカーの一部が副生成物として目的物に混入してくる欠点をもつものもある。しかも、これらリンカーの利用に当たっては通常前もって固相合成担体に必要中間体を結合した後に固定する必要があるが、この固定化を検証する決定的な方法がなかった。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、固相合成反応においてこれら従来の問題点を克服することのできる優れたリンカーを提供し、糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして用いることを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、一般式（Ｉ）
【０００９】
【化５】
【００１０】
（式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、同一または相異なり、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基またはアリール基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物を提供する。
また、この出願の発明は、上記化合物について、第２には、Ｒ１ およびＲ２ の少くとも一方がメチル基である化合物を、第３には、Ｒ３ およびＲ４ の少くとも一方がフェニル基である化合物を、第４には、Ｘが塩素原子である化合物を、第５には、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ がメチル基を、Ｘが塩素原子である化合物を提供する。
【００１１】
この出願の発明は、第６には、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化６】
【００１３】
（式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、同一または相異なり、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基またはアリール基を示し、Ｘはハロゲ原子を示す）
で表わされるフェニルカルビニルシリルハライド化合物を加水分解後、ニトロ化し、次いでハロゲン化することを特徴とする前記第１の発明のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物の製造方法を提供する。
【００１４】
そして、この出願の発明は、第７には、固相合成担体にシリルリンカーを介して糖鎖またはアミノ酸を固定させ、糖ペプチドまたはペプチド合成した後に、ケイ素−酸素結合を切断して糖またはアミノ酸を取り出す方法において、糖またはアミノ酸のアルコール性水酸基を前記第１の発明のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物で反応保護し、ニトロ基を還元した後にジカルボン酸無水物と縮合させてジカルボン酸モノアミド体としたものをシリルリンカーとして使用することを特徴とする糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法を提供する。
【００１５】
さらにまた、この出願の発明は、上記合成方法について、第８には、ジカルボン酸無水物として無水コハク酸または無水グルタル酸を用いる方法を、第９には、ケイ素−酸素結合をフッ素アニオンによって切断する方法を、第１０には、フッ化セシウムとともに、１８−クラウン−６または酢酸とを用いてケイ素−酸素結合を切断する方法をも提供する。
【００１６】
すなわち、以上のとおりのこの出願の発明は、発明者らによる糖鎖を介して固相合成担体に固定できるような合成素子についての検討から導かれたものであって、シリルエーテルを含む糖ペプチドユニットを合成し、そのシリル化合物の置換基を介して固相と連結させるべくリンカーとなる構造部分の検討と、糖ペプチド等の固相合成方法の検討の結果、立体障害の大きい、かさ高い置換基を有する新規なｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物が、上記問題点を解決し、糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして有用であることを見いだしたことに基づいて完成されたものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は以上のとおりの特徴を有するものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
まず、この発明において提供される前記の一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物については、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、炭化水素基としてのアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、またはアリール基、もしくは置換されたこれらの炭化水素の各種のものであってよいが、一般的には、炭素数が１〜８程度のものが適当であり、なかでも、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基等の低級アルキル基、またはフェニル基、トリル基等のアリール基から選択されたものが適当なものとして例示される。
【００１８】
またＸはハロゲン原子であるが、反応性、合成および取扱い性等の面からは塩素原子とすることが適当である。
たとえば、具体的に、一般式（Ｉ）の化合物を例示すると、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルフェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【００１９】
なかでも、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジエチルシリルクロリドが適当なものとして例示される。
たとえば以上のとおりのこの発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物は、シリルエーテル型リンカーを形成するものとして有用な新規な化合物である。
【００２０】
このｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物は、この発明においては、前記の一般式（ＩＩ）のフェニルカルビルシリルハライド化合物を原料とし、このものを加水分解し、ニトロ化およびハロゲン化反応させることによって製造する。この方法を反応式として示すと次の一般式（ＩＩＩ） のとおりとなる。
【００２１】
【化７】
【００２２】
原料となるフェニルカルビニルシリルハライド化合物としては、（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、（フェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ジフェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリドが例示される。好ましくは（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジエチルシリルクロリドが使用される。
【００２３】
原料としてのフェニルカルビニルシリルハライド化合物の加水分解、ニトロ化、ハロゲン化には化学反応の常法が適宜に採用されるが、たとえば加水分解ではアルカリ水溶液による加水分解方法が、ニトロ化では硝酸アンモニウムとトリフルオロ酢酸無水物を用いたニトロ化方法が、ハロゲン化ではハロゲン化オキザリルを用いたハロゲン化方法が例示される。
【００２４】
また、この発明においては、前記一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物によって糖ペプチドあるいはオリゴペプチドの固相合成のためのシリルリンカーが提供されるが、このシリルリンカーは、たとえば次式
【００２５】
【化８】
【００２６】
（Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、前記と同一のものを示し、Ａは、糖またはアミノ酸のアルコール性水酸基部位の残基を、Ｂはジカルボン酸の残基を示す）
で表わすことができる。
たとえば上記のとおりのこの発明のシリルリンカーは、前記の一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物を糖もしくはアミノ酸のアルコール性水酸基と反応させてシリル−エーテル結合による保護構造を形成し、次いでニトロ基を還元してアミノ基とし、ジカルボン酸無水物と縮合反応させてジカルボン酸モノアミド体とすることにより形成される。
【００２７】
より具体的には、たとえば、固相合成に用いる出発物質ないし中間体として、有機化合水酸基を有する糖鎖またはアミノ酸を出発物質または中間体として用い、前記一般式（Ｉ）のｐ−ニトロフェニルカルビニルハライドを溶液中で脱酸剤の存在下に反応させると対応するシリルエーテルを容易に得ることができる。この反応は通常のシリル化反応の条件で実施できるが、ヨウ化ナトリウム等の反応促進剤の存在下で反応を実施することが望ましい。得られたシリルエーテルは化学的に安定で、クロマトグラフィー等の方法で容易に精製が可能であり、ＮＭＲ等で生成物の構造確認も容易にできる。
【００２８】
次いで得られたシリルエーテルのニトロ基は極めて穏和な条件、たとえば、亜鉛末の存在下で還元でき、対応するアニリン誘導体を得ることができる。この還元反応は基質の構造に影響されずに進行し、目的とするアニリン誘導体を得ることができる。
そして、得られたアニリン誘導体を環状の酸無水物、たとえば、コハク酸無水物やグルタル酸無水物と反応させると容易にアミド結合を有するモノカルボン酸（ジカルボン酸モノアミド）を得ることができる。もちろん、酸無水物は各種のものであってよい。このようにして前記のシリルエーテルは製造することができる。
【００２９】
このシリルエーテルは、適当な固相合成担体に固定されたアミノ酸のアミノ基と縮合剤を用いて反応させることによってアミド結合を形成し結合できる。
この発明で得られるシリルエーテル型縮合をもつリンカーは、従来のペプチド固相合成では行われなかったセリンやスレオニンの水酸基を利用して固相に結合し、縮合を繰り返してペプチド鎖の伸長を行った後に、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基および側鎖の官能基に配した保護基を損なうことなく特異的に合成ペプチドを取りだすことを可能とする。さらにセリンやスレオニンばかりでなく糖鎖に多数存在する水酸基の一個所を固相への結合点とすることができる。この発明のシリルリンカーを用いる固相合成法によれば、ペプチド主鎖の両端がそれぞれの保護基を選択的に除去することによってペプチド合成の反応点として使用可能となることから、従来ほとんど試みられなかった固相上でのペプチドＣ末端側伸長も行うことができる。
【００３０】
この発明によるシリルリンカーはその調製が容易であること、切断時には全て樹脂上に残るという特性を持ち、目的生成物との分離は濾過操作のみという利点がある。また、力価が既知の市販のアミノ型樹脂（またはアミノ酸結合型樹脂）と結合することにより、ニンヒドリン法やＦｍｏｃ定量法などによってその結合効率の数値を容易に知ることができる。
【００３１】
この発明において、固定化反応の定量については特に特別な方法は必要なく、例えば、ニンヒドリンを用いた残存アミノ基の検出試験によって極めて容易に感度よく検出できる。
そして、この発明においては、特別な反応条件は必要なく固相合成反応を行うことができ、前記のとおり、Ｎ−末端、Ｃ−側酸末端の一方または双方にペプチド鎖を伸長させることができる。
【００３２】
固相合成を完成した後で特異的にケイ素−酸素結合を切断することで保護された糖ペプチドやオリゴペプチドが取り出せるが、通常のシリル系保護基の脱保護条件で固相上から遊離させることができる。フッ素イオンを発生する化合物、たとえば、フッ化セシウムにより、たとえば酢酸やクラウンエーテルの存在下または非存在下に反応を実施すると、極めて容易に定量的に切断することができる。
【００３３】
【実施例】
次にこの発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、この発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリドの製造＞
（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド２６．５７ｇをジエチルエーテル７５ｍｌに溶解し、水酸化カリウム８．４ｇを溶解した水−メタノールの１：４（ｖ／ｖ）混合溶媒１００ｍｌを徐々に添加、攪拌した。混合溶液を室温で２０時間攪拌し、分液したのちジエチルエーテルで２度抽出し、エーテル溶液を洗浄、乾燥後、溶媒を減圧留去し無色油状物質として、２２．８９ｇの（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノールを得た。
【００３４】
このシラノール５．００ｇをアセトニトリル３５ｍｌに溶解し、硝酸アンモニウム２．６０ｇを加え、懸濁液を調整し、攪拌しながらそれにトリフルオロ酢酸無水物５．８ｍｌを少量ずつ加えた。添加終了後、さらに５０分後と６０分後にトリフルオロ酢酸無水物各２．０ｍｌずつ添加し、室温で一晩攪拌した。
得られた反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出した後、有機相を洗浄、乾燥し、溶媒を減圧で留去し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して無色結晶性化合物として３．９９ｇの（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノールを得た。
【００３５】
次いで、この（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノール３．５８ｇを塩化メチレン５０ｍｌに溶解し、塩化オキサリル１．５０ｍｌを加えた後、ジメチルフォルムアミド１滴加え、室温で１日攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた結晶性残渣をヘキサンより再結晶し、無色結晶として、３．５６ｇの（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド（ｍｐ．１１４．５−１１７℃（ヘキサン））を得た。
（実施例２）
実施例１の（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリドを（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリドに変えて同様の反応を行うことにより、同等の収率で（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリドが得られた。
【００３６】
また、同様の方法を実施することにより、以下の化合物が得られた。
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニル−フェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリド
（実施例３）
＜シリルリンカーの合成＞
次の反応式に従ってシリルリンカーの合成を行った。
【００３７】
【化９】
【００３８】
第１工程：シリルエーテルの製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル＞
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−セリン アリルエステル（５００ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）と（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド（４２０ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（６１０ｍｇ，４．０６ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）を加え、室温で１５分反応させた。さらにＮ−メチルモルホリン（１７９μｌ，１．６２ｍｍｏｌ）を加えた後、２０分間反応させた。反応液をエーテル−飽和重曹水で分配し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ ６０ｇ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ２：１）で精製し標記化合物を無色油状物として７７５ｍｇ（９７％）得た。
【００３９】
第２工程：アニリン誘導体の製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−アミノフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル＞
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル（７８０ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解し、亜鉛末（５．００ｇ，ｅｘｃｅｓｓ）および酢酸（１ｍｌ）を加えて４５分間反応させた。反応液を酢酸エチルで希釈し、セライトの層を通して濾過した後、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ ６０ｇ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ１：１）で精製し標記化合物を無色油状物として６５０ｍｇ（８８％）得た。
【００４０】
第３工程：アミドカルボン酸の製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）｛Ｏ−〔（４−スクシン酸モノアミドフェニル）ジメチルカルビニル〕ジメチルシリル｝−Ｌ−セリン アリルエステル＞
９−フルオレニルメトキシカルボニル〔Ｏ−（４−アミノフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル（６５０ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）にコハク酸無水物（１２０ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（１１１μｌ，０．８９ｍｍｏｌ）を加え、４時間反応させた。反応液を濃縮しＢｉｏｂｅａｄｓ ＳＸ−３（１００ｇ）のカラムに展着し、トルエン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で溶出して精製し、標記化合物を７６０ｍｇ（９９％）得た。
（実施例４）
＜樹脂への導入＞
実施例３により得られたシリルリンカーを樹脂に導入して次式のとおり固定化した。
【００４１】
【化１０】
【００４２】
すなわち、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）｛Ｏ−〔（４−スクシン酸モノアミドフェニル）ジメチルカルビニル〕ジメチルシリル｝−Ｌ−セリン アリルエステル（２５０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（３．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ：２８８ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）と０．５Ｍ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ：ジメチルホルムアミド溶液，０．７６ｍｌ，０．３８ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．１９ｍｌ，０．３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間２０分反応させた。ついでグリシンＨＭＰ樹脂（ＡＢＩ製，０．９５ｍｍｏｌ／ｇ，２７１ｍｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、４３９ｍｇ（１０２％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
（実施例５）
＜ペプチド固相合成＞
次の反応式に従って、実施例４に続いてペプチドの固相合成を行った。
【００４３】
【化１１】
【００４４】
９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去（１）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ，１５１ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルモルホリン−ピペリジン（１：１ｖ／ｖ，３．０ｍｌ）に懸濁し、１時間４０分攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、１３４ｍｇの樹脂を得た。
【００４５】
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕トレオニンの導入（２）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニン（３３ｍｇ，０．０４９２ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（１．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３７．３ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６６ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．４９μｌ，０．０９８ｍｍｏｌ）を加え３５分間反応させた。ついでセリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．６８ｍｍｏｌ／ｇ，６６ｍｇ，０．０４４７ｍｍｏｌ）を加え一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、８８．５ｍｇ（９６％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
【００４６】
９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去（３）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ，８４．３ｍｇ，０．０４２５ｍｍｏｌ）をＮ−メチルモルホリン−ピペリジン（１：１ｖ／ｖ，２．０ｍｌ）に懸濁、１時間２０分攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、８０．４ｍｇの樹脂を得た。
【００４７】
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕トレオニンの導入（４）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニン（３３ｍｇ，０．０４９２ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（１．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３７．３ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６６ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．４９μｌ，０．０９８ｍｍｏｌ）を加え３５分間反応させた。ついで〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．５３ｍｍｏｌ／ｇ，８０．４ｍｇ，０．０４２５ｍｍｏｌ）を加え一晩攪拌した。上記（２）と同様の処理により１１２ｍｇ（１０２％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
【００４８】
糖ペプチドの樹脂からの切り出し（５）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．３９ｍｍｏｌ／ｇ，７７．４ｍｇ，０．０３０２ｍｍｏｌ）を０．２ｍｏｌ／ｌフッ化セシウム−１．０ｍｏｌ／ｌ酢酸ＤＭＦ溶液に懸濁し、一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリンで洗浄した後、２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄した。２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルの洗液を濃縮しＮ−メチルモルホリンの洗液とあわせて酢酸エチルで希釈し、水と分配した。水層をさらに酢酸エチルで３回抽出したのち、有機層をあわせて飽和食塩水で洗浄、ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥してから濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（１ｍｍ ｌａｙｅｒ，ＣＨＣｌ３ ／ＭｅＯＨ９：１）で精製し、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン アリルエステルを２７．２ｍｇ（７３％）得た。
【００４９】
【発明の効果】
この発明の（ｐ−ニトロフェニルカルビニル）シリルハライド化合物は固相合成のリンカーの形成に有用な化合物であり、糖またはアミノ酸のアルコール性水溶液と定量的に結合してシリルエーテル結合を形成し、さらに数段階を経て固相上に必要な化合物を固定することができる。このリンカーを使用した固相有機合成は機械的に進められ、コンビナトリアルケミストリーとして反応を展開後に穏和な条件で固相から離脱させることによって、酵素阻害剤となるオリゴペプチドやリセプターとなるペプチドホルモン等の生理活性糖ペプチドあるいはペプチドを得ることができる。
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、新規なリンカーとこれを用いる糖ペプチドの固相合成法に関するものである。
さらに詳しくは、この出願の発明は、立体障害の大きい、かさ高い置換基を有する新規なリンカーを形成するｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物と、その製造法およびそれを糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして用いる方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
現在一般的なペプチドの固相合成法では、ペプチドＣ末端となるアミノ酸のカルボキシル基を、予め固相に固定したリンカーとエステル結合で結び、引き続きＮ末端方向へ必要数のアミノ酸ユニットを順次結合させてペプチド鎖を伸長し、最後にアミノ酸側鎖の保護基の除去とともに固相よりオリゴペプチドを切り出すという手法が用いられている。この切り出しの操作は一般的には、トリフルオロ酢酸やフッ化水素というような強い酸性条件でおこなわれる。
【０００３】
だが、この従来一般的な方法における酸性における切り出し操作には強酸を使用することからその取扱いに注意が必要であって、あまり実際的ではないという問題がある。そこで、より弱い酸性条件で切断できるリンカーも開発されている。この場合には、側鎖の保護基を保持したままでオリゴペプチドを取りだすことが可能となる。ただしこの弱酸条件の設定は慎重に検討することが肝要となる。すでにこれらの技術のために各種アミノ酸について残基リンカーを介して固相に結合させた樹脂も市販されているが、その操作は必ずしも容易でないという問題が解消されないでいた。
【０００４】
このような状況において、固相と合成ペプチドとを切断する際に酸条件を必要としないリンカー類も開発されており、その一つとしてフッ素アニオンとケイ素との親和性を利用して切断反応を導く含ケイ素型のリンカーが数種知られている（Ｄ．Ｇ．Ｍｕｌｌｅｎ， Ｇ．Ｂａｒａｎｙ， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． １９８８， ５３， ５２４０）。しかしながら、ペプチド合成用に開発されたのはアミノ酸のカルボキシル基をエステル型で結ぶリンカー内の置換基の一部としてケイ素脱離基が採用されているものばかりである。
【０００５】
さらにまた、近年では、糖鎖の合成にも固相合成法を用いて効率化、あるいはコンビナトリアルケミストリーを展開しようとする試みが盛んに行われるようになって、シリル基を導入した樹脂上に糖残基の水酸基との間でケイ素−酸素結合によって糖残基を固定し、糖鎖伸長の後にフッ素アニオンで切り出しを行うという例が知られている（Ｊ．Ｔ．Ｒａｎｄｏｌｐｈ， Ｋ．Ｆ．ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ， １９９５， １１７， ５７１２）。ただ、この場合には、樹脂上へ固定された糖残基のモル数を直接的に検出し推定することは困難である。複合糖質研究が盛んとなって蛋白質と糖鎖からなる糖蛋白質の構造と機能の解明そして糖蛋白質分子の医薬、農薬などへの応用が期待される今日、高分子の糖蛋白質を有機化学的に精密合成する技術の確立も必要とされている。このためには糖蛋白質分子構築の部品となるべき小断片である糖ペプチドを、糖鎖水酸基をはじめとするその側鎖上の官能基を保護したものとして効率良く合成し、後にブロック縮合などの技術によって大分子に組み立てる方法が実際的であると考えられている。
【０００６】
しかしながら、以上のような従来のペプチド合成用に開発されたシリルリンカーは酸性条件に依存することなく切り出し操作ができるという長所を有するものの、その調製が煩雑であり、また切り出しに際してリンカーの一部が副生成物として目的物に混入してくる欠点をもつものもある。しかも、これらリンカーの利用に当たっては通常前もって固相合成担体に必要中間体を結合した後に固定する必要があるが、この固定化を検証する決定的な方法がなかった。
【０００７】
そこで、この出願の発明は、固相合成反応においてこれら従来の問題点を克服することのできる優れたリンカーを提供し、糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして用いることを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、一般式（Ｉ）
【０００９】
【化５】
（式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、同一または相異なり、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基またはアリール基を示し、Ｘはハロゲン原子を示す）
で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物を提供する。
また、この出願の発明は、上記化合物について、第２には、Ｒ１ およびＲ２ の少くとも一方がメチル基である化合物を、第３には、Ｒ３ およびＲ４ の少くとも一方がフェニル基である化合物を、第４には、Ｘが塩素原子である化合物を、第５には、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ がメチル基を、Ｘが塩素原子である化合物を提供する。
【００１１】
この出願の発明は、第６には、一般式（ＩＩ）
【００１２】
【化６】
（式中Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、同一または相異なり、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基またはアリール基を示し、Ｘはハロゲ原子を示す）
で表わされるフェニルカルビニルシリルハライド化合物を加水分解後、ニトロ化し、次いでハロゲン化することを特徴とする前記第１の発明のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物の製造方法を提供する。
【００１４】
そして、この出願の発明は、第７には、固相合成担体にシリルリンカーを介して糖鎖またはアミノ酸を固定させ、糖ペプチドまたはペプチド合成した後に、ケイ素−酸素結合を切断して糖またはアミノ酸を取り出す方法において、糖またはアミノ酸のアルコール性水酸基を前記第１の発明のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物で反応保護し、ニトロ基を還元した後にジカルボン酸無水物と縮合させてジカルボン酸モノアミド体としたものをシリルリンカーとして使用することを特徴とする糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法を提供する。
【００１５】
さらにまた、この出願の発明は、上記合成方法について、第８には、ジカルボン酸無水物として無水コハク酸または無水グルタル酸を用いる方法を、第９には、ケイ素−酸素結合をフッ素アニオンによって切断する方法を、第１０には、フッ化セシウムとともに、１８−クラウン−６または酢酸とを用いてケイ素−酸素結合を切断する方法をも提供する。
【００１６】
すなわち、以上のとおりのこの出願の発明は、発明者らによる糖鎖を介して固相合成担体に固定できるような合成素子についての検討から導かれたものであって、シリルエーテルを含む糖ペプチドユニットを合成し、そのシリル化合物の置換基を介して固相と連結させるべくリンカーとなる構造部分の検討と、糖ペプチド等の固相合成方法の検討の結果、立体障害の大きい、かさ高い置換基を有する新規なｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物が、上記問題点を解決し、糖ペプチドあるいはペプチドの固相合成のリンカーとして有用であることを見いだしたことに基づいて完成されたものである。
【００１７】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は以上のとおりの特徴を有するものであるが、以下に、その実施の形態について説明する。
まず、この発明において提供される前記の一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物については、Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、炭化水素基としてのアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、またはアリール基、もしくは置換されたこれらの炭化水素の各種のものであってよいが、一般的には、炭素数が１〜８程度のものが適当であり、なかでも、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基等の低級アルキル基、またはフェニル基、トリル基等のアリール基から選択されたものが適当なものとして例示される。
【００１８】
またＸはハロゲン原子であるが、反応性、合成および取扱い性等の面からは塩素原子とすることが適当である。
たとえば、具体的に、一般式（Ｉ）の化合物を例示すると、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルフェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリド等が挙げられる。
【００１９】
なかでも、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジエチルシリルクロリドが適当なものとして例示される。
たとえば以上のとおりのこの発明の前記一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物は、シリルエーテル型リンカーを形成するものとして有用な新規な化合物である。
【００２０】
このｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物は、この発明においては、前記の一般式（ＩＩ）のフェニルカルビルシリルハライド化合物を原料とし、このものを加水分解し、ニトロ化およびハロゲン化反応させることによって製造する。この方法を反応式として示すと次の一般式（ＩＩＩ） のとおりとなる。
【００２１】
【化７】
原料となるフェニルカルビニルシリルハライド化合物としては、（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、（フェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（ジフェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリドが例示される。好ましくは（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリド、（フェニルジメチルカルビニル）ジエチルシリルクロリドが使用される。
【００２３】
原料としてのフェニルカルビニルシリルハライド化合物の加水分解、ニトロ化、ハロゲン化には化学反応の常法が適宜に採用されるが、たとえば加水分解ではアルカリ水溶液による加水分解方法が、ニトロ化では硝酸アンモニウムとトリフルオロ酢酸無水物を用いたニトロ化方法が、ハロゲン化ではハロゲン化オキザリルを用いたハロゲン化方法が例示される。
【００２４】
また、この発明においては、前記一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物によって糖ペプチドあるいはオリゴペプチドの固相合成のためのシリルリンカーが提供されるが、このシリルリンカーは、たとえば次式
【００２５】
【化８】
（Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ は、前記と同一のものを示し、Ａは、糖またはアミノ酸のアルコール性水酸基部位の残基を、Ｂはジカルボン酸の残基を示す）
で表わすことができる。
たとえば上記のとおりのこの発明のシリルリンカーは、前記の一般式（Ｉ）で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビルシリルハライド化合物を糖もしくはアミノ酸のアルコール性水酸基と反応させてシリル−エーテル結合による保護構造を形成し、次いでニトロ基を還元してアミノ基とし、ジカルボン酸無水物と縮合反応させてジカルボン酸モノアミド体とすることにより形成される。
【００２７】
より具体的には、たとえば、固相合成に用いる出発物質ないし中間体として、有機化合水酸基を有する糖鎖またはアミノ酸を出発物質または中間体として用い、前記一般式（Ｉ）のｐ−ニトロフェニルカルビニルハライドを溶液中で脱酸剤の存在下に反応させると対応するシリルエーテルを容易に得ることができる。この反応は通常のシリル化反応の条件で実施できるが、ヨウ化ナトリウム等の反応促進剤の存在下で反応を実施することが望ましい。得られたシリルエーテルは化学的に安定で、クロマトグラフィー等の方法で容易に精製が可能であり、ＮＭＲ等で生成物の構造確認も容易にできる。
【００２８】
次いで得られたシリルエーテルのニトロ基は極めて穏和な条件、たとえば、亜鉛末の存在下で還元でき、対応するアニリン誘導体を得ることができる。この還元反応は基質の構造に影響されずに進行し、目的とするアニリン誘導体を得ることができる。
そして、得られたアニリン誘導体を環状の酸無水物、たとえば、コハク酸無水物やグルタル酸無水物と反応させると容易にアミド結合を有するモノカルボン酸（ジカルボン酸モノアミド）を得ることができる。もちろん、酸無水物は各種のものであってよい。このようにして前記のシリルエーテルは製造することができる。
【００２９】
このシリルエーテルは、適当な固相合成担体に固定されたアミノ酸のアミノ基と縮合剤を用いて反応させることによってアミド結合を形成し結合できる。
この発明で得られるシリルエーテル型縮合をもつリンカーは、従来のペプチド固相合成では行われなかったセリンやスレオニンの水酸基を利用して固相に結合し、縮合を繰り返してペプチド鎖の伸長を行った後に、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基および側鎖の官能基に配した保護基を損なうことなく特異的に合成ペプチドを取りだすことを可能とする。さらにセリンやスレオニンばかりでなく糖鎖に多数存在する水酸基の一個所を固相への結合点とすることができる。この発明のシリルリンカーを用いる固相合成法によれば、ペプチド主鎖の両端がそれぞれの保護基を選択的に除去することによってペプチド合成の反応点として使用可能となることから、従来ほとんど試みられなかった固相上でのペプチドＣ末端側伸長も行うことができる。
【００３０】
この発明によるシリルリンカーはその調製が容易であること、切断時には全て樹脂上に残るという特性を持ち、目的生成物との分離は濾過操作のみという利点がある。また、力価が既知の市販のアミノ型樹脂（またはアミノ酸結合型樹脂）と結合することにより、ニンヒドリン法やＦｍｏｃ定量法などによってその結合効率の数値を容易に知ることができる。
【００３１】
この発明において、固定化反応の定量については特に特別な方法は必要なく、例えば、ニンヒドリンを用いた残存アミノ基の検出試験によって極めて容易に感度よく検出できる。
そして、この発明においては、特別な反応条件は必要なく固相合成反応を行うことができ、前記のとおり、Ｎ−末端、Ｃ−側酸末端の一方または双方にペプチド鎖を伸長させることができる。
【００３２】
固相合成を完成した後で特異的にケイ素−酸素結合を切断することで保護された糖ペプチドやオリゴペプチドが取り出せるが、通常のシリル系保護基の脱保護条件で固相上から遊離させることができる。フッ素イオンを発生する化合物、たとえば、フッ化セシウムにより、たとえば酢酸やクラウンエーテルの存在下または非存在下に反応を実施すると、極めて容易に定量的に切断することができる。
【００３３】
【実施例】
次にこの発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、この発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
＜（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリドの製造＞
（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド２６．５７ｇをジエチルエーテル７５ｍｌに溶解し、水酸化カリウム８．４ｇを溶解した水−メタノールの１：４（ｖ／ｖ）混合溶媒１００ｍｌを徐々に添加、攪拌した。混合溶液を室温で２０時間攪拌し、分液したのちジエチルエーテルで２度抽出し、エーテル溶液を洗浄、乾燥後、溶媒を減圧留去し無色油状物質として、２２．８９ｇの（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノールを得た。
【００３４】
このシラノール５．００ｇをアセトニトリル３５ｍｌに溶解し、硝酸アンモニウム２．６０ｇを加え、懸濁液を調整し、攪拌しながらそれにトリフルオロ酢酸無水物５．８ｍｌを少量ずつ加えた。添加終了後、さらに５０分後と６０分後にトリフルオロ酢酸無水物各２．０ｍｌずつ添加し、室温で一晩攪拌した。
得られた反応液に水を加え酢酸エチルで２回抽出した後、有機相を洗浄、乾燥し、溶媒を減圧で留去し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製して無色結晶性化合物として３．９９ｇの（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノールを得た。
【００３５】
次いで、この（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシラノール３．５８ｇを塩化メチレン５０ｍｌに溶解し、塩化オキサリル１．５０ｍｌを加えた後、ジメチルフォルムアミド１滴加え、室温で１日攪拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた結晶性残渣をヘキサンより再結晶し、無色結晶として、３．５６ｇの（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド（ｍｐ．１１４．５−１１７℃（ヘキサン））を得た。
（実施例２）
実施例１の（フェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリドを（フェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリドに変えて同様の反応を行うことにより、同等の収率で（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルエチルシリルクロリドが得られた。
【００３６】
また、同様の方法を実施することにより、以下の化合物が得られた。
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジビニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジフェニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルフェニルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）メチルトリルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルジエチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニル−フェニルメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド、
（ｐ−ニトロフェニルメチルプロピルカルビニル）ジメチルシリルクロリド
（実施例３）
＜シリルリンカーの合成＞
次の反応式に従ってシリルリンカーの合成を行った。
【００３７】
【化９】
第１工程：シリルエーテルの製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル＞
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−セリン アリルエステル（５００ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）と（ｐ−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリルクロリド（４２０ｍｇ，１．６３ｍｍｏｌ）およびヨウ化ナトリウム（６１０ｍｇ，４．０６ｍｍｏｌ）にジメチルホルムアミド（２０ｍｌ）を加え、室温で１５分反応させた。さらにＮ−メチルモルホリン（１７９μｌ，１．６２ｍｍｏｌ）を加えた後、２０分間反応させた。反応液をエーテル−飽和重曹水で分配し、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ ６０ｇ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ２：１）で精製し標記化合物を無色油状物として７７５ｍｇ（９７％）得た。
【００３９】
第２工程：アニリン誘導体の製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−アミノフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル＞
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（４−ニトロフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル（７８０ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解し、亜鉛末（５．００ｇ，ｅｘｃｅｓｓ）および酢酸（１ｍｌ）を加えて４５分間反応させた。反応液を酢酸エチルで希釈し、セライトの層を通して濾過した後、飽和重曹水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２ ６０ｇ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ１：１）で精製し標記化合物を無色油状物として６５０ｍｇ（８８％）得た。
【００４０】
第３工程：アミドカルボン酸の製造
＜Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）｛Ｏ−〔（４−スクシン酸モノアミドフェニル）ジメチルカルビニル〕ジメチルシリル｝−Ｌ−セリン アリルエステル＞
９−フルオレニルメトキシカルボニル〔Ｏ−（４−アミノフェニルジメチルカルビニル）ジメチルシリル〕−Ｌ−セリン アリルエステル（６５０ｍｇ，１．１６ｍｍｏｌ）にコハク酸無水物（１２０ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ）とＮ−メチルモルホリン（１１１μｌ，０．８９ｍｍｏｌ）を加え、４時間反応させた。反応液を濃縮しＢｉｏｂｅａｄｓ ＳＸ−３（１００ｇ）のカラムに展着し、トルエン−酢酸エチル（１：１）の混合溶媒で溶出して精製し、標記化合物を７６０ｍｇ（９９％）得た。
（実施例４）
＜樹脂への導入＞
実施例３により得られたシリルリンカーを樹脂に導入して次式のとおり固定化した。
【００４１】
【化１０】
すなわち、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）｛Ｏ−〔（４−スクシン酸モノアミドフェニル）ジメチルカルビニル〕ジメチルシリル｝−Ｌ−セリン アリルエステル（２５０ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（３．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ：２８８ｍｇ，０．７６ｍｍｏｌ）と０．５Ｍ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ：ジメチルホルムアミド溶液，０．７６ｍｌ，０．３８ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．１９ｍｌ，０．３８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間２０分反応させた。ついでグリシンＨＭＰ樹脂（ＡＢＩ製，０．９５ｍｍｏｌ／ｇ，２７１ｍｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、４３９ｍｇ（１０２％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
（実施例５）
＜ペプチド固相合成＞
次の反応式に従って、実施例４に続いてペプチドの固相合成を行った。
【００４３】
【化１１】
９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去（１）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ，１５１ｍｇ，０．０８９ｍｍｏｌ）をＮ−メチルモルホリン−ピペリジン（１：１ｖ／ｖ，３．０ｍｌ）に懸濁し、１時間４０分攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、１３４ｍｇの樹脂を得た。
【００４５】
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕トレオニンの導入（２）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニン（３３ｍｇ，０．０４９２ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（１．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３７．３ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６６ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．４９μｌ，０．０９８ｍｍｏｌ）を加え３５分間反応させた。ついでセリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．６８ｍｍｏｌ／ｇ，６６ｍｇ，０．０４４７ｍｍｏｌ）を加え一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、８８．５ｍｇ（９６％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
【００４６】
９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）の除去（３）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ，８４．３ｍｇ，０．０４２５ｍｍｏｌ）をＮ−メチルモルホリン−ピペリジン（１：１ｖ／ｖ，２．０ｍｌ）に懸濁、１時間２０分攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリン，２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄し、８０．４ｍｇの樹脂を得た。
【００４７】
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕トレオニンの導入（４）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニン（３３ｍｇ，０．０４９２ｍｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリン（１．０ｍｌ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾ−１−リル−１−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３７．３ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ），１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（６６ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）および２Ｍジイソプロピルエチルアミン（ジメチルホルムアミド溶液，０．４９μｌ，０．０９８ｍｍｏｌ）を加え３５分間反応させた。ついで〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．５３ｍｍｏｌ／ｇ，８０．４ｍｇ，０．０４２５ｍｍｏｌ）を加え一晩攪拌した。上記（２）と同様の処理により１１２ｍｇ（１０２％：重量よりの計算）の樹脂を得た。
【００４８】
糖ペプチドの樹脂からの切り出し（５）
Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン（Ｏ−リンカー−グリシンＨＭＰ樹脂）アリルエステル（０．３９ｍｍｏｌ／ｇ，７７．４ｍｇ，０．０３０２ｍｍｏｌ）を０．２ｍｏｌ／ｌフッ化セシウム−１．０ｍｏｌ／ｌ酢酸ＤＭＦ溶液に懸濁し、一晩攪拌混和した。得られた樹脂を濾別し、Ｎ−メチルモルホリンで洗浄した後、２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルで順次洗浄した。２−プロパノール、塩化メチレン、ジエチルエーテルの洗液を濃縮しＮ−メチルモルホリンの洗液とあわせて酢酸エチルで希釈し、水と分配した。水層をさらに酢酸エチルで３回抽出したのち、有機層をあわせて飽和食塩水で洗浄、ついで無水硫酸ナトリウムで乾燥してから濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（１ｍｍ ｌａｙｅｒ，ＣＨＣｌ３ ／ＭｅＯＨ９：１）で精製し、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）〔Ｏ−（２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル〕−Ｌ−トレオニル−Ｌ−セリン アリルエステルを２７．２ｍｇ（７３％）得た。
【００４９】
【発明の効果】
この発明の（ｐ−ニトロフェニルカルビニル）シリルハライド化合物は固相合成のリンカーの形成に有用な化合物であり、糖またはアミノ酸のアルコール性水溶液と定量的に結合してシリルエーテル結合を形成し、さらに数段階を経て固相上に必要な化合物を固定することができる。このリンカーを使用した固相有機合成は機械的に進められ、コンビナトリアルケミストリーとして反応を展開後に穏和な条件で固相から離脱させることによって、酵素阻害剤となるオリゴペプチドやリセプターとなるペプチドホルモン等の生理活性糖ペプチドあるいはペプチドを得ることができる。
Claims (10)
- 一般式（Ｉ）
で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物。 - Ｒ１ およびＲ２ の少くとも一方がメチル基である請求項１のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物。
- Ｒ３ およびＲ４ の少くとも一方がフェニル基である請求項１または２のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物。
- Ｘが塩素原子である請求項１ないし３のいずれかのｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物。
- Ｒ１ ，Ｒ２ ，Ｒ３ およびＲ４ がメチル基、Ｘが塩素原子である請求項１のｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物。
- 一般式（ＩＩ）
で表わされるフェニルカルビニルシリルハライド化合物を加水分解後、ニトロ化し、次いでハロゲン化することを特徴とする一般式（Ｉ）
で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物の製造方法。 - 固相合成担体にシリルリンカーを介して糖鎖またはアミノ酸を固定させ、糖ペプチドまたはペプチド合成した後に、ケイ素−酸素結合を切断して糖またはアミノ酸を取り出す方法において、糖またはアミノ酸のアルコール性水酸基を一般式（Ｉ）
で表わされるｐ−ニトロフェニルカルビニルシリルハライド化合物で反応保護し、ニトロ基を還元した後にジカルボン酸無水物と縮合させてジカルボン酸モノアミド体としたものをシリルリンカーとして使用することを特徴とする糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法。 - ジカルボン酸無水物として無水コハク酸または無水グルタル酸を用いる請求項７の糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法。
- ケイ素−酸素結合をフッ素アニオンによって切断する請求項７または８の糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法。
- フッ化セシウムとともに、１８−クラウン−６または酢酸とを用いてケイ素−酸素結合を切断する請求項９の糖ペプチドまたはオリゴペプチドの合成方法。
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