JP3669208B2 - ヌクレオチドブロックの製造方法、ヌクレオチドおよびヌクレオチドブロック - Google Patents
ヌクレオチドブロックの製造方法、ヌクレオチドおよびヌクレオチドブロック Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はヌクレオチドブロックの製造方法、ならびに該製造方法で作られた新規なヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックに関するものであり、該ヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックは、例えば、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業上、有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、ＤＮＡオリゴマーの中間原料であるヌクレオチドブロックとしては、前記式（５）においてＲ1'およびＲ2'のいずれも水素原子で、ｎ＝０である化合物が知られており、この化合物を合成する方法として、前記式（１）においてＲ1'およびＲ2'のいずれも水素原子、ｎ＝０、Ｘがジアルキルアミノ基であるホスホルアミダイト化合物を、前記式（２）における３'−位水酸基を適当な保護基で保護した下記式（９）で表されるヌクレオシド誘導体と反応させ、生成したヌクレオチドのヌクレオチド結合を酸化し、得られたヌクレオチド誘導体から３'−位水酸基の保護基を除去する工程からなる下記式（１０）に示される製造法が知られている（特表平０８−５０７７５２号公報参照）。
【０００３】
【化７】
【０００４】
｛式中、Ｂ3およびＡ3は前記式（２）と同じであり、Ｒ4はヌクレオチド化学における通常の保護基を示す。｝
【０００５】
【化８】
【０００６】
｛式中、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ3、Ａ1およびＡ3は前記式（５）と同じであり、Ｒ4は前記式（９）と同じであり、Ｙはジアルキルアミノ基を示す。｝
【０００７】
上記方法によれば、原料である前記式（９）で表されるヌクレオシド誘導体を、下記式（１１）に示した反応に従って製造しなければならず、さらにヌクレオチドの二量化反応後にヌクレオチドブロック誘導体から保護基Ｒ4を除去しなければならない。
このため、純度良く目的のヌクレオチドブロックを得るためには、合成工程が多段階に渡り、また、生成する副生物あるいは不純物を除去することが必要であり、それにより操作上の煩雑さが生じ、コストが嵩む等の問題がある。
【０００８】
【化９】
【０００９】
｛式中、Ｂ3、Ｒ3およびＡ3は前記式（５）と同じであり、Ｒ4は前記式（９）と同じである。｝
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡオリゴマーの調製に有用なヌクレオチドブロックを、合成工程および単離精製工程を経ることなく、簡便に該ヌクレオチドを製造する方法、および該製造方法によって調製された新規なヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、前記式（１）で表されるアゾリル基を有し、特にＲ1、Ｒ2、Ｒ1'またはＲ2'にかさ高い置換基を有するヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護で、ヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させ｛下記式（７）もしくは下記式（８）｝、前記式（３）または前記式（４）で表される構造を有する新規なヌクレオチドを経て、前記式（５）で表される構造を有する新規なヌクレオチドブロックを合成することにより、前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１発明は前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックの製造方法であり、第３発明は前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドであり、第４発明は前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックに関するものである。
【００１２】
【化１０】
【００１３】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ 3 、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ 3 、Ｚおよびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１４】
【化１１】
【００１５】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明におけるヌクレオチドブロックの製造方法は、前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させて得られた、前記式（３）または前記式（４）で表されるヌクレオチドの三価のリン原子を五価へ酸化または硫化することを特徴とし、その反応式は前記式（７）または前記式（８）で例示される製造方法である。また、ヌクレオチドブロックは前記式（５）で表される化合物であり、その前駆体であるヌクレオチドは前記式（３）または前記式（４）のいずれかにより表される化合物である。
前記式におけるＢ1、Ｂ2およびＢ3で表される塩基は、周知のものが挙げられ、プリン誘導体、例えば、アデニン、グアニンおよびヒポキサンチンの誘導体、ならびにピリミジン誘導体、例えば、シトシン、チミンおよびウラシルの誘導体などが挙げられる。具体的には、１−チミニル基、１−（Ｎ−３−ベンゾイルチミニル）基、１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基、１−（Ｎ−４−アニソイルシトシニル）基、９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、９−（Ｎ−６，Ｎ−６−ビスベンゾイルアデニニル）基、または９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基などが挙げられる。
また、前記式におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ1'およびＲ2'としては、例えば、水素原子、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基、ノルマルペンチル基、１−エチルプロピル基、シクロヘキシル基、ノルマルノニル基、２−フェニルエチル基、２−(メチルチオ)エチル基、フェニル基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基および／または１，１−ジメチル−２−フェニルエチル基などである。ただし、（Ｒ 1 とＲ 2 ）および（Ｒ 1 ’とＲ 2 ’）の組み合わせが、それぞれ（水素原子と水素原子）、（水素原子とメチル基）、（水素原子とエチル基）、（メチル基とメチル基）、（メチル基とエチル基）または（エチル基とエチル基）である場合を除く。また、Ｒ3としては、トリチル基、４−メトキシトリチル基および４，４’−ジメトキシトリチル基などが挙げられる。
また、前記式（１）におけるＸとしては、イミダゾリル基、２−メチルイミダゾリル基、４−メチルイミダゾリル基または２，４−ジメチルイミダゾリル基などが挙げられる。
また、Ａ1、Ａ2およびＡ3で表されるアルコキシ基としてはメトキシ基およびエトキシ基などが挙げられ、同様にトリアルキルシリルオキシ基としてはターシャリーブチルジメチルシリルオキシ基などが挙げられる。
【００１７】
本発明の第４発明におけるヌクレオチドブロックは、前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの三価のリン原子を五価へ酸化もしくは硫化することにより｛下記式（１２）または下記式（１３）｝、容易に製造することができる。
【００１８】
【化１２】
【００１９】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じである。｝
【００２０】
【化１３】
【００２１】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じである。｝
【００２２】
また、前記式（１）で表されるヌクレオチドは、下記式（１４）で表される反応に従って容易に製造することができる。
【００２３】
【化１４】
【００２４】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ｚおよびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００２５】
上記反応は、まず、出発原料である前記式（１４）中の式［I］で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンに、同式［II］で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物を反応させて、同式［III］で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンを得、次に、式（１４）中の式[IV]で表される５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシド誘導体または５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオチド誘導体を減圧乾燥するか、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、前記５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシドまたは５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオチド誘導体に対し０．８〜１．２当量の前記オルガノオキシビスアゾリルホスフィンを−８０℃〜室温で混合させて反応させることにより達成される。低温で反応させた方が、目的の前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体の収率は良い。有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。有機溶媒としてクロロホルムを用いると、目的のヌクレオチドの収率はより向上する。この反応溶液の31P−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。この反応は、出発原料である前記式[I]で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンから、目的のヌクレオチドに至るまで高選択的に進行するため、単離精製することなくin situで合成することができ、かつ、この反応溶液をそのままin situで前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの合成に用いることができる。
【００２６】
前記式（７）または前記式（８）のいずれの反応も、前記式（１）で表されるヌクレオチドに対して１〜２当量の前記式（２）で表される３’−Ｏ，５’−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体を、減圧乾燥するか、あるいはピリジン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、ピリジン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、前記ヌクレオチド誘導体を−８０℃〜室温で混合させて反応させることにより、３’−Ｏ，５’−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体の５’−位水酸基が選択的に反応し、達成される。有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。有機溶媒としてはピリジンを用いると、目的の前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの収率はより向上する。この反応溶液の31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。この反応において、前記式（３）および前記式（４）における置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'およびＲ2'がかさ高いほど反応性に優れ、特にＲ1およびＲ2、ならびにＲ1'およびＲ2'のファンデルワールス（van der Waals）体積の和がそれぞれ４９（オームストロング）3以上のものが反応性に優れる。
○ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の計算方法
下記式（６）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンにおいて、まず、 SPARTAN TM Version ４．１．１（ Wavefunction ， Inc. ）により三次元分子構造を決定し、ＭＭ力場を使って立体的エネルギーの最適化を行った後、半経験的分子軌道法（ AM1 ）により立体構造を確定した。次に、ＡＭ１により得られた立体構造に基づいて、 TSAR TM ３．０（ Oxford Molecular Group ）の分子体積計算プログラムにより置換基Ｒ 1 およびＲ 2 なファンデルワールス（ van der Waals ）体積を求めた。このようにして求めた置換基のファンデルワールス体積を式（２）のｎ＝０で表されるヌクレオシド誘導体または式（１）、式（２）のｎ＝１、式（３）および式（４）で表されるヌクレオチド誘導体の置換基Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 1' およびＲ 2' に外挿した。
【化２８】
（式（６）中、Ｒ 1 およびＲ 2 は前記式（１）と同じである。）
【００２７】
前記式（１２）および前記式（１３）のいずれの反応も、前述のようにして合成したヌクレオチドを単離精製することなく、その反応溶液に、前記ヌクレオチドに対して１〜３当量の、例えば、単体イオウを混合させて反応させることにより達成される。この反応溶液の31P−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。このようにして生成したヌクレオチドブロックは、分液抽出およびカラムクロマトグラフィーにより簡便かつ純度良く単離精製することができる。
【００２８】
さらに、ヌクレオチドの製造におけるもう一方の原料である前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオチド誘導体は、前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックを酸で処理して、保護基Ｒ3を除去することにより、容易に製造することができる。
上記の方法で製造されるヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックは、ＤＮＡオリゴマーを化学合成する場合の中間原料として有用である。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
前記式（５）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、Ａ1＝Ａ3＝水素原子、およびＺ'＝イオウ原子である下記式（１５）で表されるヌクレオチドダイマーブロックの製造。
【００３０】
【化１５】
【００３１】
ａ）前記式（１）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、Ａ1＝水素原子、およびＸ＝イミダゾリル基である下記式（１６）で表されるヌクレオチドの合成。
【００３２】
【化１６】
【００３３】
トルエン（３ｍｌ）溶液中、アルゴン雰囲気下、室温の条件で、２−シアノ−1−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフィン０．５７８ｇ（２．０５ｍｍｏｌ）と１−（トリメチルシリル）イミダゾール０．６３２ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間反応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトルエンを室温で２５分間減圧留去した後、残留トルエンおよび過剰の１−（トリメチルシリル）イミダゾールを５５℃の条件で2時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−1−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキビスイミダゾリルホスフィンを得た。このものを重クロロホルムおよびクロロホルムの混合溶液４．１ｍｌに溶解した溶液（０．５M）を、１，４−ジオキサン５ｍｌに溶解後、室温で１時間共沸脱水したＮ6−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシアデノシン１．４１４ｇ（２．１５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、−３．５℃で加えた。均一になった後、４℃で一晩静置して反応させ、目的のヌクレオチド誘導体を得た。31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝δ；１２９．５，１３０．３，１３１．１，１３４．３ppm. ( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
【００３４】
ｂ）前記式（３）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、およびＡ1＝Ａ3＝水素原子である下記式（１７）で表されるヌクレオチドの合成。
【００３５】
【化１７】
【００３６】
前記式（２）において、ｎ＝０、Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、およびＡ3＝水素原子である、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシン０．８４１ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）をピリジン９ｍｌに溶解後、室温で１．２時間共沸脱水した。この操作を２回繰り返した後、このＮ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンをピリジン９．６ｍｌに溶解した溶液に、前述のａ）で合成したヌクレオチド誘導体の重クロロホルムおよびクロロホルムの混合反応溶液をアルゴン雰囲気下、−４２℃で加えた。この反応溶液を４℃まで徐々に戻した後、４℃で一晩静置して反応させ、目的のヌクレオチドダイマーブロック前駆体を得た。31P−ＮＭＲ｛部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；１４０．０，１４１．１，１４１．３，１４１．７ppm. ( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
【００３７】
ｃ）前記式（１５）で表されるヌクレオチドダイマーブロックの製造。
前述のｂ）で合成したヌクレオチドダイマーブロック前駆体の反応溶液に、単体イオウ０．０９９ｇ（３．０９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温でかき混ぜて反応させた。反応系の 31P−ＮＭＲスペクトルを測定して、反応が完了したことを確認した後、クロロホルムにより分液抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ別後、溶媒を減圧留去して得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝１００：１→１００：５（容積比）の混合溶媒｝により単離精製した。単離収率８８％。31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；６５．２、６５．５，６５．８，６５．９ppm．（31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４８｛リカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝
【００３８】
ｄ）前記式（１６）で表されるヌクレオチド誘導体の、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンの５'−位水酸基との選択的反応性。
前述のｂ）に従ってヌクレオチドブロック前駆体を製造する場合、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンの３'−位水酸基が、前記ヌクレオチド誘導体（１６）と反応する、下記式（１８）で表される副反応が進行し、下記式（１９）で表される化合物が副生する。
【００３９】
【化１８】
【００４０】
【化１９】
【００４１】
そこで、前述のｂ）において、反応完了後の反応溶液の 31P−ＮＭＲスペクトルを測定し、下記式（Ｅ）のように、５'−位水酸基との選択的反応性（以下「５'選択性」という）を定義して求めた。
[５'選択性]（％）＝｛〔１７〕／（〔１７〕＋〔１９〕）｝×１００（Ｅ）
（式中、〔１７〕および〔１９〕は、31P−ＮＭＲスペクトルにより求めた化合物（１７）および（１９）の反応溶液中でのモル組成率をそれぞれ表す。）
その結果、５'選択性は９４％であった。
【００４２】
（実施例２〜１９）
実施例1と同様の操作により、下記表１および表２に示した実施例２〜１９のヌクレオチドダイマーブロックおよびその前駆体であるヌクレオチドを合成した。なお、前記式（７）におけるＸとして、イミダゾリル基を用いた。
実施例２〜１９に示したヌクレオチドダイマーブロックは、前記式（５）において、ｎ＝０、Ａ1およびＡ3が水素原子、Ｚ'がイオウ原子、Ｒ3が４，４’−ジメトキシトリチル基である下記式（２０）で表される化合物であり、同ヌクレオチドは、前記式（３）において、ｎ＝０、Ａ1およびＡ3が水素原子、Ｒ3が４，４’−ジメトキシトリチル基である下記式（２１）で表される化合物である。表１および表２中のＲ1'およびＲ2'の構造を表３に示す。表１および表２のＢ1およびＢ3欄中の（ ）内の値は、同欄中のヌクレオシドの、仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対する反応当量比を示し、二量化反応溶媒欄のＣＤＣｌ3＋Ｐｙは重クロロホルム：ピリジン＝１：２．３（容積比）の混合溶媒を、 ＣＨＣｌ3＋Ｐｙはクロロホルム：ピリジン＝１：.２．３（容積比）の混合溶媒を、Ｐｙ−ｄ5＋Ｐｙはピリジン−ｄ5とピリジンの混合溶媒を、ＣＤ3ＣＮ＋ＣＨ3ＣＮはアセトニトリル−ｄ5とアセトニトリルの混合溶媒をそれぞれ示す。また、化合物（３）の31Ｐ−ＮＭＲのδ値(ppm)欄の値は、実施例１〜６、９〜１１、および１３〜１４についてはＣＤＣｌ3溶液中で、実施例７についてはＰｙ−ｄ5溶液中で、および実施例８についてはＣＤ3ＣＮ溶液中でそれぞれ測定した値である。化合物（５）の31Ｐ−ＮＭＲのδ値(ppm)欄の値は、実施例１〜４、および実施例１１〜１４については二量化反応溶媒溶液中で、実施例１５−１９については二量化反応溶媒を減圧留去後、 得られた残さをＣＤＣｌ3に溶解してそれぞれ測定した値である。化合物（５）のＲｆ値は、いずれもシリカゲルプレート上でクロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）の混合溶媒で展開したときの値である。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【表２】
【００４５】
｛表１および表２のなかで、Ｂ1およびＢ3欄のＴは１−チミニル基を、ＴBzは１−（Ｎ−３−ベンゾイルチミニル）基を、ＣBzは１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基を、ＣAnは１−（Ｎ−４−アニソイルシトシニル）基を、ＡBzは９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基を、ＡBz2は９−（Ｎ−６，Ｎ−６−ビスベンゾイルアデニニル）基を、およびＧiBuは９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基をそれぞれ表す。｝
【００４６】
【表３】
【００４７】
【化２０】
【００４８】
｛式中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示し、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ1'およびＲ2'は前記式（５）と同じである。｝
【００４９】
【化２１】
【００５０】
｛式中、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じであり、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ1'およびＲ2'は前記式（５）と同じである。｝
【００５１】
（実施例２０）
前記式（５）において、ｎ＝１であり、Ｒ1＝Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2＝ターシャリーブチル基、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ2＝Ｂ3＝１−チミニル基、Ａ1＝Ａ2＝Ａ3＝水素原子、およびＺ＝Ｚ'＝イオウ原子である下記式（２２）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの製造
【００５２】
【化２２】
【００５３】
｛式中、Ｔは１−チミニル基を示し、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００５４】
ａ）前記式（１）で表されるヌクレオチド前駆体の合成
反応前に、仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して１．２当量の前記式（１４）の[IV]で表されるヌクレオチドダイマーブロックを、１，４−ジオキサンに溶解後共沸脱水する操作を２回繰り返し、反応溶液の濃度を０．３Mとした他は、実施例１と同様にして合成した。前記式（７）におけるＸとして、イミダゾリル基を用い、下記式（２３）で表されるヌクレオチド誘導体を合成した。
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝δ；１２６．８，１２７．４，１２８．１，１２８．９，１２９．２，１２９．５，１２９．８，１３１．６，１３２．２，１３２．６，１３２．９，１３３．７ppm.（ 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。前記δ値は、３’−末端の三価のリン原子に関するものである。）
【００５５】
【化２３】
【００５６】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００５７】
ｂ）前記式（３）で表されるヌクレオチドの合成
仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して前記式（２）で表される３'−O，５'−O−無保護のヌクレオシド誘導体（本実施例においてはチミジン）を１．２当量以上反応させ、反応濃度を０．１M以下（重クロロホルム：ピリジン＝１：２以上（容積比））とした他は、実施例１と同様にして下記式（２４）で表されるヌクレオチドトリマーブロック前駆体を合成した。
なお、この縮合反応におけるの５’選択性は＞９４％であった。
【００５８】
【化２４】
【００５９】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６０】
ｃ）前記式（２２）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの合成
実施例１と同様にして合成した。
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝；６５．７−６６．７ppmの範囲に9本のピークとして観測された。（31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４３｛シリカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝。
【００６１】
（実施例２１）
前記式（５）において、ｎ＝１であり、Ｒ1＝Ｒ1''＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ2''＝ターシャリーブチル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ2＝Ｂ3＝１−チミニル基、Ａ1＝Ａ2＝Ａ3＝水素原子、およびＺ＝Ｚ'＝イオウ原子である下記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの製造
【００６２】
【化２５】
【００６３】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６４】
仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して前記式（１４）の[IV]で表される５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシド誘導体を１．０３当量、および前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオチド誘導体を１．２当量それぞれ反応させた他は、実施例１と同様の操作により製造した。前記式（８）におけるＸとして、イミダゾリル基を用いた。
【００６５】
ａ）下記式（２６）で表されるヌクレオチドトリマーブロック前駆体の合成
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；１４０．３−１４２．２ppmの範囲に１３本のピークとして観測された。｛31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。前記δ値は、２つあるインターヌクレオチド結合のうち、３’−末端側の三価のリン原子（ホスファイト）に関するものである。｝
【００６６】
【化２６】
【００６７】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６８】
ｂ）前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの合成
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；６５．０−６６．３ppmの範囲に１３本のピークとして観測された。( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４４｛シリカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝。
ｃ）前記ｂ）に従って合成した前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックのリン酸保護基を除去して得られた下記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーのHPLC分析
【００６９】
【化２７】
【００７０】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００７１】
前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロック約１ｍｇを、数滴のピリジンに溶解後、さらに数滴の３０％アンモニア水を加えて室温で一晩静置して、リン酸保護基を除去して前記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーを得た。アンモニアおよび溶媒を減圧留去して得られた残さを、０．１Ｎ−ｐＨ７．２−トリエチルアミン−酢酸緩衝溶液に溶解して、逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣ分析には、逆相カラム（ＯＤＳカラム）としてWakopakｗｓ−ＤＮＡカラム｛和光純薬（株）製｝の4.6mmφ×150mmを用い、展開溶媒としては、０．１Ｎ−ｐＨ７．２−トリエチルアミン−酢酸緩衝溶液とアセトニトリルを用いた。分析に用いたグラディエントは、アセトニトリル／緩衝溶液＝５／９５→４５／５５（２０ｍｉｎ）とし、分析に用いたＵＶディテクタの検出波長は２６０ｎｍとし、分析温度は４０℃とした。
得られた化合物の保持時間（ｔＲ）＝２１．６（先端は２本に分裂）、２２．１ｍｉｎ（ジアステレオマーが混在するため計３本に分裂した）。このＨＰＬＣ分析結果は、通常のアミダイト法に従って合成した前記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーのそれと一致した。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−０−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させ｛前記式（７）または前記式（８）｝、前記式（３）または前記式（４）で表される構造を有するヌクレオチドを収率良く製造することができ、さらに、該ヌクレオチドから、その製造工程において合成工程および単離精製工程が省けるので、前記式（５）で表される構造を有するヌクレオチドブロックを簡便に製造することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明はヌクレオチドブロックの製造方法、ならびに該製造方法で作られた新規なヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックに関するものであり、該ヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックは、例えば、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業上、有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、ＤＮＡオリゴマーの中間原料であるヌクレオチドブロックとしては、前記式（５）においてＲ1'およびＲ2'のいずれも水素原子で、ｎ＝０である化合物が知られており、この化合物を合成する方法として、前記式（１）においてＲ1'およびＲ2'のいずれも水素原子、ｎ＝０、Ｘがジアルキルアミノ基であるホスホルアミダイト化合物を、前記式（２）における３'−位水酸基を適当な保護基で保護した下記式（９）で表されるヌクレオシド誘導体と反応させ、生成したヌクレオチドのヌクレオチド結合を酸化し、得られたヌクレオチド誘導体から３'−位水酸基の保護基を除去する工程からなる下記式（１０）に示される製造法が知られている（特表平０８−５０７７５２号公報参照）。
【０００３】
【化７】
｛式中、Ｂ3およびＡ3は前記式（２）と同じであり、Ｒ4はヌクレオチド化学における通常の保護基を示す。｝
【０００５】
【化８】
｛式中、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ3、Ａ1およびＡ3は前記式（５）と同じであり、Ｒ4は前記式（９）と同じであり、Ｙはジアルキルアミノ基を示す。｝
【０００７】
上記方法によれば、原料である前記式（９）で表されるヌクレオシド誘導体を、下記式（１１）に示した反応に従って製造しなければならず、さらにヌクレオチドの二量化反応後にヌクレオチドブロック誘導体から保護基Ｒ4を除去しなければならない。
このため、純度良く目的のヌクレオチドブロックを得るためには、合成工程が多段階に渡り、また、生成する副生物あるいは不純物を除去することが必要であり、それにより操作上の煩雑さが生じ、コストが嵩む等の問題がある。
【０００８】
【化９】
｛式中、Ｂ3、Ｒ3およびＡ3は前記式（５）と同じであり、Ｒ4は前記式（９）と同じである。｝
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡオリゴマーの調製に有用なヌクレオチドブロックを、合成工程および単離精製工程を経ることなく、簡便に該ヌクレオチドを製造する方法、および該製造方法によって調製された新規なヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックを提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、前記式（１）で表されるアゾリル基を有し、特にＲ1、Ｒ2、Ｒ1'またはＲ2'にかさ高い置換基を有するヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護で、ヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させ｛下記式（７）もしくは下記式（８）｝、前記式（３）または前記式（４）で表される構造を有する新規なヌクレオチドを経て、前記式（５）で表される構造を有する新規なヌクレオチドブロックを合成することにより、前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第１発明は前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックの製造方法であり、第３発明は前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドであり、第４発明は前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックに関するものである。
【００１２】
【化１０】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ 3 、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ 3 、Ｚおよびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１４】
【化１１】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明におけるヌクレオチドブロックの製造方法は、前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させて得られた、前記式（３）または前記式（４）で表されるヌクレオチドの三価のリン原子を五価へ酸化または硫化することを特徴とし、その反応式は前記式（７）または前記式（８）で例示される製造方法である。また、ヌクレオチドブロックは前記式（５）で表される化合物であり、その前駆体であるヌクレオチドは前記式（３）または前記式（４）のいずれかにより表される化合物である。
前記式におけるＢ1、Ｂ2およびＢ3で表される塩基は、周知のものが挙げられ、プリン誘導体、例えば、アデニン、グアニンおよびヒポキサンチンの誘導体、ならびにピリミジン誘導体、例えば、シトシン、チミンおよびウラシルの誘導体などが挙げられる。具体的には、１−チミニル基、１−（Ｎ−３−ベンゾイルチミニル）基、１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基、１−（Ｎ−４−アニソイルシトシニル）基、９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、９−（Ｎ−６，Ｎ−６−ビスベンゾイルアデニニル）基、または９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基などが挙げられる。
また、前記式におけるＲ1、Ｒ2、Ｒ1'およびＲ2'としては、例えば、水素原子、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基、ノルマルペンチル基、１−エチルプロピル基、シクロヘキシル基、ノルマルノニル基、２−フェニルエチル基、２−(メチルチオ)エチル基、フェニル基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基および／または１，１−ジメチル−２−フェニルエチル基などである。ただし、（Ｒ 1 とＲ 2 ）および（Ｒ 1 ’とＲ 2 ’）の組み合わせが、それぞれ（水素原子と水素原子）、（水素原子とメチル基）、（水素原子とエチル基）、（メチル基とメチル基）、（メチル基とエチル基）または（エチル基とエチル基）である場合を除く。また、Ｒ3としては、トリチル基、４−メトキシトリチル基および４，４’−ジメトキシトリチル基などが挙げられる。
また、前記式（１）におけるＸとしては、イミダゾリル基、２−メチルイミダゾリル基、４−メチルイミダゾリル基または２，４−ジメチルイミダゾリル基などが挙げられる。
また、Ａ1、Ａ2およびＡ3で表されるアルコキシ基としてはメトキシ基およびエトキシ基などが挙げられ、同様にトリアルキルシリルオキシ基としてはターシャリーブチルジメチルシリルオキシ基などが挙げられる。
【００１７】
本発明の第４発明におけるヌクレオチドブロックは、前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの三価のリン原子を五価へ酸化もしくは硫化することにより｛下記式（１２）または下記式（１３）｝、容易に製造することができる。
【００１８】
【化１２】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じである。｝
【００２０】
【化１３】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ａ3、Ｚ、Ｚ'およびｎは前記式（５）と同じである。｝
【００２２】
また、前記式（１）で表されるヌクレオチドは、下記式（１４）で表される反応に従って容易に製造することができる。
【００２３】
【化１４】
｛式中、Ｂ1、Ｂ2、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3、Ａ1、Ａ2、Ｚおよびｎは前記式（５）と同じであり、Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００２５】
上記反応は、まず、出発原料である前記式（１４）中の式［I］で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンに、同式［II］で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物を反応させて、同式［III］で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンを得、次に、式（１４）中の式[IV]で表される５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシド誘導体または５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオチド誘導体を減圧乾燥するか、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、前記５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシドまたは５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオチド誘導体に対し０．８〜１．２当量の前記オルガノオキシビスアゾリルホスフィンを−８０℃〜室温で混合させて反応させることにより達成される。低温で反応させた方が、目的の前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体の収率は良い。有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。有機溶媒としてクロロホルムを用いると、目的のヌクレオチドの収率はより向上する。この反応溶液の31P−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。この反応は、出発原料である前記式[I]で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンから、目的のヌクレオチドに至るまで高選択的に進行するため、単離精製することなくin situで合成することができ、かつ、この反応溶液をそのままin situで前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの合成に用いることができる。
【００２６】
前記式（７）または前記式（８）のいずれの反応も、前記式（１）で表されるヌクレオチドに対して１〜２当量の前記式（２）で表される３’−Ｏ，５’−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体を、減圧乾燥するか、あるいはピリジン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、ピリジン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、前記ヌクレオチド誘導体を−８０℃〜室温で混合させて反応させることにより、３’−Ｏ，５’−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体の５’−位水酸基が選択的に反応し、達成される。有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いた方が良い。有機溶媒としてはピリジンを用いると、目的の前記式（３）または前記式（４）のいずれかによって表されるヌクレオチドの収率はより向上する。この反応溶液の31Ｐ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。この反応において、前記式（３）および前記式（４）における置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ1'およびＲ2'がかさ高いほど反応性に優れ、特にＲ1およびＲ2、ならびにＲ1'およびＲ2'のファンデルワールス（van der Waals）体積の和がそれぞれ４９（オームストロング）3以上のものが反応性に優れる。
○ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の計算方法
下記式（６）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンにおいて、まず、 SPARTAN TM Version ４．１．１（ Wavefunction ， Inc. ）により三次元分子構造を決定し、ＭＭ力場を使って立体的エネルギーの最適化を行った後、半経験的分子軌道法（ AM1 ）により立体構造を確定した。次に、ＡＭ１により得られた立体構造に基づいて、 TSAR TM ３．０（ Oxford Molecular Group ）の分子体積計算プログラムにより置換基Ｒ 1 およびＲ 2 なファンデルワールス（ van der Waals ）体積を求めた。このようにして求めた置換基のファンデルワールス体積を式（２）のｎ＝０で表されるヌクレオシド誘導体または式（１）、式（２）のｎ＝１、式（３）および式（４）で表されるヌクレオチド誘導体の置換基Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 1' およびＲ 2' に外挿した。
【化２８】
【００２７】
前記式（１２）および前記式（１３）のいずれの反応も、前述のようにして合成したヌクレオチドを単離精製することなく、その反応溶液に、前記ヌクレオチドに対して１〜３当量の、例えば、単体イオウを混合させて反応させることにより達成される。この反応溶液の31P−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認すれば良い。このようにして生成したヌクレオチドブロックは、分液抽出およびカラムクロマトグラフィーにより簡便かつ純度良く単離精製することができる。
【００２８】
さらに、ヌクレオチドの製造におけるもう一方の原料である前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオチド誘導体は、前記式（５）で表されるヌクレオチドブロックを酸で処理して、保護基Ｒ3を除去することにより、容易に製造することができる。
上記の方法で製造されるヌクレオチドおよびヌクレオチドブロックは、ＤＮＡオリゴマーを化学合成する場合の中間原料として有用である。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
前記式（５）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、Ａ1＝Ａ3＝水素原子、およびＺ'＝イオウ原子である下記式（１５）で表されるヌクレオチドダイマーブロックの製造。
【００３０】
【化１５】
ａ）前記式（１）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、Ａ1＝水素原子、およびＸ＝イミダゾリル基である下記式（１６）で表されるヌクレオチドの合成。
【００３２】
【化１６】
トルエン（３ｍｌ）溶液中、アルゴン雰囲気下、室温の条件で、２−シアノ−1−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキシジクロロホスフィン０．５７８ｇ（２．０５ｍｍｏｌ）と１−（トリメチルシリル）イミダゾール０．６３２ｇ（４．５０ｍｍｏｌ）を加え、１０分間反応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトルエンを室温で２５分間減圧留去した後、残留トルエンおよび過剰の１−（トリメチルシリル）イミダゾールを５５℃の条件で2時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−1−（１，１−ジエチル−３−ブテニル）エトキビスイミダゾリルホスフィンを得た。このものを重クロロホルムおよびクロロホルムの混合溶液４．１ｍｌに溶解した溶液（０．５M）を、１，４−ジオキサン５ｍｌに溶解後、室温で１時間共沸脱水したＮ6−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２'−デオキシアデノシン１．４１４ｇ（２．１５ｍｍｏｌ）に、アルゴン雰囲気下、−３．５℃で加えた。均一になった後、４℃で一晩静置して反応させ、目的のヌクレオチド誘導体を得た。31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝δ；１２９．５，１３０．３，１３１．１，１３４．３ppm. ( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
【００３４】
ｂ）前記式（３）において、ｎ＝０、Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、およびＡ1＝Ａ3＝水素原子である下記式（１７）で表されるヌクレオチドの合成。
【００３５】
【化１７】
前記式（２）において、ｎ＝０、Ｂ3＝９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基、およびＡ3＝水素原子である、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシン０．８４１ｇ（２．３７ｍｍｏｌ）をピリジン９ｍｌに溶解後、室温で１．２時間共沸脱水した。この操作を２回繰り返した後、このＮ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンをピリジン９．６ｍｌに溶解した溶液に、前述のａ）で合成したヌクレオチド誘導体の重クロロホルムおよびクロロホルムの混合反応溶液をアルゴン雰囲気下、−４２℃で加えた。この反応溶液を４℃まで徐々に戻した後、４℃で一晩静置して反応させ、目的のヌクレオチドダイマーブロック前駆体を得た。31P−ＮＭＲ｛部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；１４０．０，１４１．１，１４１．３，１４１．７ppm. ( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
【００３７】
ｃ）前記式（１５）で表されるヌクレオチドダイマーブロックの製造。
前述のｂ）で合成したヌクレオチドダイマーブロック前駆体の反応溶液に、単体イオウ０．０９９ｇ（３．０９ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下、室温でかき混ぜて反応させた。反応系の 31P−ＮＭＲスペクトルを測定して、反応が完了したことを確認した後、クロロホルムにより分液抽出し、得られた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムを加えて脱水した。硫酸ナトリウムをろ別後、溶媒を減圧留去して得られた残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー｛展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝１００：１→１００：５（容積比）の混合溶媒｝により単離精製した。単離収率８８％。31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；６５．２、６５．５，６５．８，６５．９ppm．（31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４８｛リカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝
【００３８】
ｄ）前記式（１６）で表されるヌクレオチド誘導体の、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンの５'−位水酸基との選択的反応性。
前述のｂ）に従ってヌクレオチドブロック前駆体を製造する場合、Ｎ6−ベンゾイル−２'−デオキシアデノシンの３'−位水酸基が、前記ヌクレオチド誘導体（１６）と反応する、下記式（１８）で表される副反応が進行し、下記式（１９）で表される化合物が副生する。
【００３９】
【化１８】
【化１９】
そこで、前述のｂ）において、反応完了後の反応溶液の 31P−ＮＭＲスペクトルを測定し、下記式（Ｅ）のように、５'−位水酸基との選択的反応性（以下「５'選択性」という）を定義して求めた。
[５'選択性]（％）＝｛〔１７〕／（〔１７〕＋〔１９〕）｝×１００（Ｅ）
（式中、〔１７〕および〔１９〕は、31P−ＮＭＲスペクトルにより求めた化合物（１７）および（１９）の反応溶液中でのモル組成率をそれぞれ表す。）
その結果、５'選択性は９４％であった。
【００４２】
（実施例２〜１９）
実施例1と同様の操作により、下記表１および表２に示した実施例２〜１９のヌクレオチドダイマーブロックおよびその前駆体であるヌクレオチドを合成した。なお、前記式（７）におけるＸとして、イミダゾリル基を用いた。
実施例２〜１９に示したヌクレオチドダイマーブロックは、前記式（５）において、ｎ＝０、Ａ1およびＡ3が水素原子、Ｚ'がイオウ原子、Ｒ3が４，４’−ジメトキシトリチル基である下記式（２０）で表される化合物であり、同ヌクレオチドは、前記式（３）において、ｎ＝０、Ａ1およびＡ3が水素原子、Ｒ3が４，４’−ジメトキシトリチル基である下記式（２１）で表される化合物である。表１および表２中のＲ1'およびＲ2'の構造を表３に示す。表１および表２のＢ1およびＢ3欄中の（ ）内の値は、同欄中のヌクレオシドの、仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対する反応当量比を示し、二量化反応溶媒欄のＣＤＣｌ3＋Ｐｙは重クロロホルム：ピリジン＝１：２．３（容積比）の混合溶媒を、 ＣＨＣｌ3＋Ｐｙはクロロホルム：ピリジン＝１：.２．３（容積比）の混合溶媒を、Ｐｙ−ｄ5＋Ｐｙはピリジン−ｄ5とピリジンの混合溶媒を、ＣＤ3ＣＮ＋ＣＨ3ＣＮはアセトニトリル−ｄ5とアセトニトリルの混合溶媒をそれぞれ示す。また、化合物（３）の31Ｐ−ＮＭＲのδ値(ppm)欄の値は、実施例１〜６、９〜１１、および１３〜１４についてはＣＤＣｌ3溶液中で、実施例７についてはＰｙ−ｄ5溶液中で、および実施例８についてはＣＤ3ＣＮ溶液中でそれぞれ測定した値である。化合物（５）の31Ｐ−ＮＭＲのδ値(ppm)欄の値は、実施例１〜４、および実施例１１〜１４については二量化反応溶媒溶液中で、実施例１５−１９については二量化反応溶媒を減圧留去後、 得られた残さをＣＤＣｌ3に溶解してそれぞれ測定した値である。化合物（５）のＲｆ値は、いずれもシリカゲルプレート上でクロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）の混合溶媒で展開したときの値である。
【００４３】
【表１】
【表２】
｛表１および表２のなかで、Ｂ1およびＢ3欄のＴは１−チミニル基を、ＴBzは１−（Ｎ−３−ベンゾイルチミニル）基を、ＣBzは１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基を、ＣAnは１−（Ｎ−４−アニソイルシトシニル）基を、ＡBzは９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基を、ＡBz2は９−（Ｎ−６，Ｎ−６−ビスベンゾイルアデニニル）基を、およびＧiBuは９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基をそれぞれ表す。｝
【００４６】
【表３】
【化２０】
｛式中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示し、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ1'およびＲ2'は前記式（５）と同じである。｝
【００４９】
【化２１】
｛式中、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じであり、Ｂ1、Ｂ3、Ｒ1'およびＲ2'は前記式（５）と同じである。｝
【００５１】
（実施例２０）
前記式（５）において、ｎ＝１であり、Ｒ1＝Ｒ1'＝水素原子、Ｒ2＝ターシャリーブチル基、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ2＝Ｂ3＝１−チミニル基、Ａ1＝Ａ2＝Ａ3＝水素原子、およびＺ＝Ｚ'＝イオウ原子である下記式（２２）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの製造
【００５２】
【化２２】
｛式中、Ｔは１−チミニル基を示し、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００５４】
ａ）前記式（１）で表されるヌクレオチド前駆体の合成
反応前に、仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して１．２当量の前記式（１４）の[IV]で表されるヌクレオチドダイマーブロックを、１，４−ジオキサンに溶解後共沸脱水する操作を２回繰り返し、反応溶液の濃度を０．３Mとした他は、実施例１と同様にして合成した。前記式（７）におけるＸとして、イミダゾリル基を用い、下記式（２３）で表されるヌクレオチド誘導体を合成した。
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝δ；１２６．８，１２７．４，１２８．１，１２８．９，１２９．２，１２９．５，１２９．８，１３１．６，１３２．２，１３２．６，１３２．９，１３３．７ppm.（ 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。前記δ値は、３’−末端の三価のリン原子に関するものである。）
【００５５】
【化２３】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００５７】
ｂ）前記式（３）で表されるヌクレオチドの合成
仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して前記式（２）で表される３'−O，５'−O−無保護のヌクレオシド誘導体（本実施例においてはチミジン）を１．２当量以上反応させ、反応濃度を０．１M以下（重クロロホルム：ピリジン＝１：２以上（容積比））とした他は、実施例１と同様にして下記式（２４）で表されるヌクレオチドトリマーブロック前駆体を合成した。
なお、この縮合反応におけるの５’選択性は＞９４％であった。
【００５８】
【化２４】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６０】
ｃ）前記式（２２）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの合成
実施例１と同様にして合成した。
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3｝；６５．７−６６．７ppmの範囲に9本のピークとして観測された。（31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４３｛シリカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝。
【００６１】
（実施例２１）
前記式（５）において、ｎ＝１であり、Ｒ1＝Ｒ1''＝水素原子、Ｒ2'＝１，１−ジエチル−３−ブテニル基、Ｒ2''＝ターシャリーブチル基、Ｒ3＝４，４'−ジメトキシトリチル基、Ｂ1＝Ｂ2＝Ｂ3＝１−チミニル基、Ａ1＝Ａ2＝Ａ3＝水素原子、およびＺ＝Ｚ'＝イオウ原子である下記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの製造
【００６２】
【化２５】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６４】
仕込みのオルガノオキシジクロロホスフィン[I]に対して前記式（１４）の[IV]で表される５’−Ｏ,塩基保護−ヌクレオシド誘導体を１．０３当量、および前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオチド誘導体を１．２当量それぞれ反応させた他は、実施例１と同様の操作により製造した。前記式（８）におけるＸとして、イミダゾリル基を用いた。
【００６５】
ａ）下記式（２６）で表されるヌクレオチドトリマーブロック前駆体の合成
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；１４０．３−１４２．２ppmの範囲に１３本のピークとして観測された。｛31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。前記δ値は、２つあるインターヌクレオチド結合のうち、３’−末端側の三価のリン原子（ホスファイト）に関するものである。｝
【００６６】
【化２６】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００６８】
ｂ）前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックの合成
31P−ＮＭＲ｛外部標準；(CH3O)3P ＝１４０ppm, CDCl3：ｐｙ＝１：２．３（容積比）｝δ；６５．０−６６．３ppmの範囲に１３本のピークとして観測された。( 31P−ＮＭＲスペクトルは１６１．７MHzＮＭＲ測定装置で測定した。）
Ｒｆ値０．４４｛シリカゲルプレート、展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝７：１（容積比）｝。
ｃ）前記ｂ）に従って合成した前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロックのリン酸保護基を除去して得られた下記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーのHPLC分析
【００６９】
【化２７】
｛式中、Ｔは前記式（２２）と同じであり、ＤＭＴｒは前記式（２０）と同じである。｝
【００７１】
前記式（２５）で表されるヌクレオチドトリマーブロック約１ｍｇを、数滴のピリジンに溶解後、さらに数滴の３０％アンモニア水を加えて室温で一晩静置して、リン酸保護基を除去して前記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーを得た。アンモニアおよび溶媒を減圧留去して得られた残さを、０．１Ｎ−ｐＨ７．２−トリエチルアミン−酢酸緩衝溶液に溶解して、逆相ＨＰＬＣ分析を行った。
ＨＰＬＣ分析には、逆相カラム（ＯＤＳカラム）としてWakopakｗｓ−ＤＮＡカラム｛和光純薬（株）製｝の4.6mmφ×150mmを用い、展開溶媒としては、０．１Ｎ−ｐＨ７．２−トリエチルアミン−酢酸緩衝溶液とアセトニトリルを用いた。分析に用いたグラディエントは、アセトニトリル／緩衝溶液＝５／９５→４５／５５（２０ｍｉｎ）とし、分析に用いたＵＶディテクタの検出波長は２６０ｎｍとし、分析温度は４０℃とした。
得られた化合物の保持時間（ｔＲ）＝２１．６（先端は２本に分裂）、２２．１ｍｉｎ（ジアステレオマーが混在するため計３本に分裂した）。このＨＰＬＣ分析結果は、通常のアミダイト法に従って合成した前記式（２７）で表されるホスホロチオエート型ヌクレオチドトリマーのそれと一致した。
【００７２】
【発明の効果】
本発明によれば、前記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を、前記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−０−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させ｛前記式（７）または前記式（８）｝、前記式（３）または前記式（４）で表される構造を有するヌクレオチドを収率良く製造することができ、さらに、該ヌクレオチドから、その製造工程において合成工程および単離精製工程が省けるので、前記式（５）で表される構造を有するヌクレオチドブロックを簡便に製造することができる。
Claims (4)
- 下記式（１）で表されるヌクレオチド誘導体を、下記式（２）で表される３'−Ｏ，５'−Ｏ−無保護のヌクレオシド誘導体またはヌクレオチド誘導体と反応させて得られた、下記式（３）または下記式（４）で表されるヌクレオチドの三価のリン原子を五価へ酸化または硫化することを特徴とする下記式（５）で表されるヌクレオチドブロックの製造方法。
- 下記式（６）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを用いて計算した請求項１記載の式（２）のｎ＝０で表されるヌクレオシド誘導体または式（１）、式（２）のｎ＝１、式（３）および式（４）で表されるヌクレオチド誘導体のＲ1およびＲ2のファンデルワールス（van der Waals）体積の和、ならびにＲ1'およびＲ2'のファンデルワールス（van der Waals）体積の和がそれぞれ４９（オングストローム）3以上であり、かつＸがイミダゾリル基、２−メチルイミダゾリル基もしくは４−メチルイミダゾリル基である請求項１記載のヌクレオチドブロックの製造方法。
- 請求項１または請求項２記載の式（３）または式（４）によって表されるヌクレオチド（ただし、式中、Ｂ 1 、Ｂ 2 、Ｂ 3 、Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 1' 、Ｒ 2' 、Ｒ 3 、Ａ 1 、Ａ 2 、Ａ 3 、Ｚ、Ｚ’及びｎは請求項１で定義したとおりであり、Ｒ1、Ｒ2およびＲ1'、Ｒ2'の組み合わせにおいて、いずれかはヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基である）。
- 請求項１記載の式（５）で表されるヌクレオチドブロック（ただし、式中、Ｂ 1 、Ｂ 2 、Ｂ 3 、Ｒ 1 、Ｒ 2 、Ｒ 1' 、Ｒ 2' 、Ｒ 3 、Ａ 1 、Ａ 2 、Ａ 3 、Ｚ、Ｚ’及びｎは請求項１で定義したとおりであり、Ｒ1、Ｒ2およびＲ1'、Ｒ2'の組み合わせにおいて、いずれかはヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基である）。
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