JP3651878B2 - 畜肉タンパク質由来の血圧降下ペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食肉（畜肉）タンパク質をプロテアーゼで分解することにより生成する、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害するペプチド、及びそれらペプチド又はその塩を有効成分として含有する、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する高血圧等の疾患の予防及び／又は症状改善用などの医薬用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症に深く関わっている生体内の系としてレニン−アンジオテンシン系が知られており、この系の重要な構成要素であるアンジオテンシンＩ変換酵素はアンジオテンシンＩに作用し、血圧上昇作用をもつアンジオテンシンIIを生成し、また、アンジオテンシンＩ変換酵素は降圧作用を有するペプチドであるブラジキニンを分解する作用をも有する。すなわち、アンジオテンシンＩ変換酵素は昇圧性ペプチドの生成と、降圧性ペプチドの分解という二つの作用により血圧上昇をもたらす。したがって、アンジオテンシンＩ変換酵素のこのような作用により高血圧症が発症している場合、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害することにより、血圧上昇を抑制することができる。さらに、近年、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質は、心不全の治療薬など、血圧降下剤以外の用途でも注目されている。
【０００３】
アンジオテンシンＩ変換酵素の阻害物質として、天然物では毒蛇由来のペプチド、化学合成物質ではカプトプリルなどが見い出されている。また近年、医薬品に対する安全性や食品に対する機能性への関心の高まりなどを背景として、食品や食品原料由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質が注目されている。特に食品タンパク質の分解により生成するペプチド性のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質の検索が数多く行われている。このようなものの例として、牛乳カゼイン、大豆タンパク質、トウモロコシタンパク質などのプロテアーゼ分解により生成するペプチドを挙げることができる（特開平８−２８３１７３号公報、特開平８−２６９０８７号公報、特開平８−９９９９４号公報、特開平６−８７８８６号公報）。また、魚肉を原料とした例として、かつお節やイワシのプロテアーゼ分解物などから、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性や血圧降下作用を示すペプチドを得ることが知られている（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 56, 1541-1545, 1992、特開平７−１８８２８２号公報）。その他、豚血液から調製したプラズマのプロテアーゼ分解物から血圧降下ペプチドを調製した例も知られている（特開平５−２３８９４６号公報）。しかし、豚肉や牛肉といった畜肉あるいは畜肉に含まれるタンパク質から、このようなペプチドを得た例は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、食品の中で重要な位置づけをされている食肉から血圧降下作用あるいはアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する新規なペプチド類及びこれらペプチド類を有効成分として含む医薬用組成物を提供することにある。
【０００５】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、食肉タンパク質であるミオシンから、プロテアーゼの作用により生成するペンタペプチドである配列番号１で示される（Met-Asn-Pro-Pro-Lys）や配列番号２で示される（Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）が、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性や血圧降下作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、Met-Asn-Pro-Pro-Lys 、 Met-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Pro 、 Ile-Thr-Thr-Asn-Pro 、 Thr-Asn-Pro のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩（請求項１）に関する。
【０００７】
また本発明は、Met-Asn-Pro-Pro-Lys 、 Met-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Pro 、 Ile-Thr-Thr-Asn-Pro 、 Thr-Asn-Pro のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分とする医薬用組成物（請求項２）や、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドが、ミオシン又はミオシンを含む原料をプロテアーゼ処理することにより得られることを特徴とする請求項２記載の医薬用組成物（請求項３）や、ミオシンを含む原料が、畜肉の筋原繊維構成タンパク質であることを特徴とする請求項３記載の医薬用組成物（請求項４）や、プロテアーゼが、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ及びパパインから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼであることを特徴とする請求項３又は４記載の医薬用組成物（請求項５）や、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善剤であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の医薬用組成物（請求項６）や、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用の食品であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか記載の医薬用組成物（請求項７）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドとしては、配列表の配列番号１（Met-Asn-Pro-Pro-Lys）又は配列番号２（Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）に示されるアミノ酸配列の全部を含み、かつアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドや、配列表の配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部を含み、かつアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドであればどのようなものでもよく、例えば、以下の（１）〜（１４）のいずれかで表されるペプチドを具体的に例示することができる。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys
（２）Met-Asn-Pro
（３）Asn-Pro-Pro
（４）Pro-Pro-Lys
（５）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（６）Ile-Thr-Thr
（７）Thr-Thr-Asn
（８）Thr-Asn-Pro
（９）Met-Asn-Pro-Pro
（１０）Asn-Pro-Pro-Lys
（１１）Ile-Thr-Thr-Asn
（１２）Thr-Thr-Asn-Pro
（１３）Leu-Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（１４）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro-Tyr
【０００９】
上記（１）〜（１４）に示される新規ペプチドは、Ｌ体のアミノ酸配列を有し、常温において白色等の粉末である。また、本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではなく、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの塩類を例示することができる。また、かかる本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法としては、食肉あるいは食肉タンパク質のプロテアーゼ分解物から分離・精製する方法と、アミノ酸の配列情報に基づき、化学的に合成する方法を挙げることができる。
【００１０】
プロテアーゼを用いるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法における原料としては、本発明の配列番号１及び配列番号２で示されるペンタペプチドが筋原線維を構成するタンパク質であるミオシンのアミノ酸配列の一部であることからして、ミオシン又はミオシンを含む原料が用いられる。かかるミオシンとしては、精製品の他、未精製のミオシンやアクトミオシンを例示することができ、また、かかるミオシンを含む原料としては、肉塊、挽肉、残肉、屑肉、筋肉等のミオシンを４〜５％含む食肉（畜肉）や、かかる食肉から得られる筋肉由来の水不溶性タンパク質等のミオシンを４０〜５０％含む筋原繊維構成タンパク質などを例示することができ、これらミオシンや食肉の種類・由来等は特に制限されるものではない。また、プロテアーゼとしては、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の強いペプチド溶液を得ることができるものであれば特に制限されるものではないが、サーモリシン（SIGMA社製）やプロテイナーゼＫ（MERCK社製）の他、プロナーゼＥ（MERCK社製）、パパイン（東京化成工業社製）等のプロテアーゼを好ましいプロテアーゼとして例示することができる。
【００１１】
プロテアーゼによるミオシンを含むタンパク質の分解は、例えば、ミオシン又はミオシンを含む原料を水あるいは適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）に、ミオシン濃度が０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜３．０％程度の濃度になるよう懸濁し、この溶液にプロテアーゼを０．０１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｇ／Ｌ程度の濃度で添加することにより行われ、酵素反応条件としてはプロテアーゼが作用しうる条件であれば特に制限されないが、例えば用いるプロテアーゼの至適ｐＨ付近で、３７℃で１２〜１８時間程度の酵素処理条件を例示することができる。また、プロテアーゼによる分解反応は、加熱、無機酸や有機酸の添加、限外濾過によるプロテアーゼ除去など、一般によく知られている方法のいずれかにより停止することができる。反応停止後の分解液は、濾過あるいは遠心分離により不溶物を除去し、得られた濾液（タンパク質分解溶液）は、ミオシンの分解により生成したペプチドを含み、この溶液から目的とするペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製することができる。また、濾液は必要に応じて、凍結乾燥や減圧乾燥により濃縮することができる。
【００１２】
他方、化学的合成法によるペプチドの製法は液相法と固相法に大別され、最近のペプチドシンセサイザーの普及により固相法による合成が一般化しつつあるものの、いずれの方法においても常法により本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドを調製することができる。固相法によるペプチドの製造は、例えばアプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａ装置を用い、ポリマー性の固相支持体へ合成しようとするペプチドのカルボキシル末端側からＬ体アミノ酸を順次ペプチド結合により延長させて目的とするペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切り出し、次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーなどの方法で精製し、目的とするペプチドを得ることにより行うことができる。
【００１３】
本発明の医薬用組成物としては、上記本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、本発明のペプチド又はその塩の有する薬理作用の対象となる疾病、例えば高血圧症、心不全等のアンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾病に対する予防及び／又は症状改善剤、並びに予防及び／又は症状改善用の食品などを例示することができる。かかる本発明のペプチド及び／又はその塩と他の成分又は素材との混合物からなる医薬用組成物として、より具体的には、本発明のペプチド又はその塩に賦形剤を配合した高血圧症治療薬や、本発明のペプチド又はその塩を添加した食品や、本発明のペプチド又はその塩を含有する食品素材や、該食品素材を添加した食品等を挙げることができる。食品としては、コーヒー、紅茶、煎茶、ヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、スポーツ飲料等の各種飲料や、パン、ケーキ、ゼリー、饅頭、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他の各種総菜を例示することができる。
【００１４】
上記本発明のペプチド又はその塩を含有する食品素材は、肉塊や残肉・屑肉を原料として安価かつ大量に調製することができる。例えば、肉塊を原料とする場合、肉塊より脂肪組織及び結合組織を除去したものをグラインドし、得られた挽肉にほぼ４倍量の水と適量のプロテアーゼを添加し、サイレントカッター等で攪拌し、３７℃で１２〜１８時間反応させて本発明のペプチドを生成せしめた後、９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させ、次いで必要に応じて濾過・精製することにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。また、残肉・屑肉を原料とする場合、まずこれら残肉・屑肉をグラインドし、得られた挽肉に塩溶液（例えば０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液）を加え、サイレントカッター等で攪拌して、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を抽出した後、遠心分離あるいは濾過により不溶物を除去し、抽出溶液に４〜５倍量の水を加えて塩濃度を低下せしめることにより、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を析出させ、遠心分離あるいは濾過により不溶物として回収した不溶性のタンパク質に対して、以下上記肉塊の場合と同様に、プロテアーゼ処理等を行うことにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、特に断らない限り、実施例中に示された“％”は重量％を表す。
実施例１［アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの単離］
（豚骨格筋から不溶性タンパク質の調製）
豚骨格筋（大腿二頭筋）を細切し、脂肪や結合組織をできるだけ取り除いたもの１００ｇに蒸留水２００ｍｌを加え、ほぼ均一になるまでホモジナイズした。これを目の細かい金網に通して細切されなかった塊を除去した後、濾紙を用いて濾過した。濾過後、さらに蒸留水で濾液が無色になるまで濾紙上の不溶物を洗浄した。洗浄後、濾紙上の不溶物を集め、凍結乾燥により粉末状の豚骨格筋不溶性タンパク質を得た。また、かかるタンパク質に含まれる主要なタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ミオシンとアクチンであることを確認した。
【００１６】
（豚骨格筋不溶性タンパク質画分からのペプチドの生成）
上記豚骨格筋不溶性タンパク質１０ｇに蒸留水９０ｍｌを加え、均一になるまで攪拌した。プロテアーゼとしては８種類、すなわちサーモリシン（SIGMA社製）、プロテイナーゼＫ（MERCK社製）、プロナーゼＥ（MERCK社製）、フィチン（東京化成工業社製）、パパイン（東京化成工業社製）、トリプシン（和光純薬社製；2000units/g）、α−キモトリプシン（和光純薬社製；牛膵臓製）及びペプシン（和光純薬社製；1:10,000）をそれぞれ単独に用いた。上記不溶性タンパク質懸濁液に上記プロテアーゼの１種を１０ｍｇ添加して溶解させた後、３７℃で１８時間反応させ、ペプチドを生成させた。反応終了後、溶液を９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させた。遠心分離により大部分の不溶物を取り除き、さらにメンブランフィルターを通し、微細な粒子を除去し、８種類のペプチド溶液を得た。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定には、かかるペプチド溶液を蒸留水で１０倍希釈した８種類の試料溶液を用いた。
【００１７】
（ミオシンからのペプチドの生成）
豚ミオシン（SIGMA社製）１０ｍｇに蒸留水１０ｍｌを添加して懸濁させ、この懸濁液に前記８種のプロテアーゼ（サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、フィシン、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン）１ｍｇを用いて、前記豚骨格筋不溶性タンパク質の場合と同様にして、８種類のペプチド溶液を得た。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定には、これらペプチド溶液を蒸留水で１０倍希釈した８種類の試料溶液を用いた。
【００１８】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定方法）
アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定は、合成基質である馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシン（SIGMA社製）を用いてアンジオテンシンＩ変換酵素が基質の末端ジペプチドのＬ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンを選択的に切断することを利用して、遊離する馬尿酸を抽出し、比色する方法で実施した。試験管に測定しようとする試料溶液（ペプチド溶液）を０．０１５ｍｌ入れ、これに０．１２５ｍｌの基質溶液（６０８ｍＭ食塩を含む０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．３を用いて７．６ｍＭになるように馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシンを溶解させたもの）を添加し、３７℃で５分間保温した。その後、０．０５ｍｌの酵素溶液（SIGMA社製アンジオテンシンI変換酵素を蒸留水に５０単位／ｍｌになるように溶解させたもの）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ塩酸０．１２５ｍｌを添加して反応を停止させた後、酢酸エチル０．７５ｍｌを加え、酢酸エチル中に抽出された馬尿酸を２２８ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。かかる試料溶液の吸光度を“Ｓ”、試料溶液に代えて同量の蒸留水を用いた対照の吸光度を“Ｂ”、反応開始前の吸光度を“Ｃ”とし、アンジオテンシンI変換酵素阻害率を次式により算出した。
阻害率（％）＝（Ｂ−Ｓ）÷（Ｂ−Ｃ）×１００
【００１９】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定結果）
豚骨格筋不溶性タンパク質を各種プロテアーゼで分解して調製した前記８種類の試料溶液、及びミオシンを各種プロテアーゼで分解して調製した前記８種類の試料溶液のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を表１に示す。豚骨格筋不溶性タンパク質にサーモリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼＥを作用させた試料溶液が７０％以上の阻害活性を有し、またミオシンにサーモリシン、キモトリプシンを作用させた試料溶液が７０％以上の阻害活性を有していた。
【００２０】
【表１】
【００２１】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの精製）
豚ミオシン（SIGMA社製）１００ｍｇに蒸留水１００ｍｌを加え、懸濁させた。これに１０ｍｇのサーモリシンを添加して溶解させた後、３７℃で１８時間反応させ、ミオシンからペプチドを生成させた。反応終了後、９８℃で１０分間加熱して、サーモリシンを失活させた。遠心分離により大部分の不溶物を除去し、さらにメンブランフィルターを通し、微細な粒子を取り除いてペプチド溶液を得た。得られたペプチド溶液からのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの精製は逆相高速液体クロマトグラフィーにより行った。すなわち、カラムに資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０４．６×１５０ｍｍを用い、溶出液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水）から溶出液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系で溶出を行った。
【００２２】
（ペプチドの構造決定）
精製したペプチドのアミノ酸配列は、自動エドマン分解法（気相法）によるＮ末端アミノ酸分析により決定した。自動分析装置としてアブライドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサーモデル４７０Ａを利用した。操作は製品マニュアルの記載に従って行い、試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを用いた。ミオシンのサーモリシン分解物を試料とする逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを図１に示す。溶出液を５分間隔で採取し、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定した結果、２５〜３０分の画分に最も高い活性が認められた。この画分を再度、同条件で高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを図２に示す。溶出時間２６．３分付近と２７．７分付近の矢印を付けた２本のピークの部分(１)及び(２)に高いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性が検出された。
【００２３】
次に、これらの部分を採取し、構造解析を試みたところ、数種のペプチドが混在することがわかったため、さらに溶出液Ｃ（０．０１５％アンモニアを含む蒸留水）から溶出液Ｄ（０．０１５％アンモニアを含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系によるアルカリ性溶出液を用いた逆相高速クロマトグラフィーを実施した。図２のピーク(１)の画分に含まれるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示すペプチドは、アルカリ性溶出液を用いた場合、溶出時間２６．５分付近に検出された。一方、図２のピーク(２)の画分に含まれる阻害活性ペプチドは、アルカリ性溶出液を用いた条件では、７．１分付近に溶出された。上記アルカリ性溶出液を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、それぞれのペプチドは単一成分に精製された。
【００２４】
精製した２種のペプチドの構造解析を行ったところ、いずれも５つのアミノ酸残基からなるペンタペプチドであった。これらの構造は以下のとおりである。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys（図２のピーク(１)由来）
（２）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro（図２のピーク(２)由来）
これらのアミノ酸配列をデータベース（Swiss-Prot）を利用して検索したところ、いずれも筋肉のミオシン重鎖内に存在する配列に一致するものであった。Met-Asn-Pro-Pro-Lysはラットミオシン重鎖（８０〜８４残基目）、ニワトリミオシン重鎖（８０〜８４残基目）、ヒトミオシン重鎖（８２〜８６残基目）に一致した。一方、Ile-Thr-Thr-Asn-Proはラットミオシン重鎖（３０４〜３０８残基目）、ニワトリミオシン重鎖（３０５〜３０９残基目）、ヒトミオシン重鎖（３０６〜３１０残基目）に一致した。なお、アミノ酸残基の数字はいずれもＮ末端側からのものである。
【００２５】
本発明で利用したミオシンは豚骨格筋由来のものであるが、豚ミオシン重鎖の配列は未だ確定していない。データベース（Swiss-Prot）には豚ミオシンのアミノ酸配列が一応登録されてはいるものの、本発明のペンタペプチドと完全に一致する配列は見出せなかった。しかし、登録されている豚ミオシン重鎖配列にも、Gln-Asn-Pro-Pro-Lys（７９〜８３残基目）とIle-Thr-Asn-Asn-Pro（３０３〜３０７残基目）という本研究のペンタペプチドとそれぞれ１残基だけ異なる配列が、ほぼ多種の動物由来のミオシンにおける場合と同一位置に存在しており、ラット、ニワトリ、ヒトでの結果からすると、１残基異なる部分はデータベースに登録されている豚ミオシン重鎖の配列を決定する際に、誤って読みとられたものと考えられる。したがって、本発明のペンタペプチドに一致する配列は豚ミオシン重鎖の７９〜８３残基目と３０３〜３０７残基目に存在するものと考えられる。
【００２６】
実施例２［ペンタペプチド等の化学合成］
（化学合成法）
２種のペンタペプチド（Met-Asn-Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）及びこれらの配列の中に含まれる６種のトリペプチド（Met-Asn-Pro、Asn-Pro-Pro、Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr、Thr-Thr-Asn、Thr-Asn-Pro）の化学合成はアブライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａを用い、製品マニュアルの記載に従って行った。試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを使用した。ペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸により、固相支持体から切り出した。次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーにより、目的とするペンタペプチドを精製した。なお、高速液体クロマトグラフィーは、前記実施例１の酸性溶出液を利用した条件で行った。
【００２７】
（化学合成ペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定）
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定は、前記実施例１記載の方法と同様にして行った。また、阻害率５０％のときのペプチド濃度をＩＣ５０値とした。化学合成により調製した２種のペンタペプチドと６種のトリペプチドの分子量とアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を表２に示す。合成したペプチドの質量分析計（ＦＡＢ−ＭＡＳ）により測定した分子量の値は、化学構造から算出した値にほぼ一致しており、目的ペプチドの合成が問題なく行われたものと判断した。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は、トリペプチドMet-Asn-Proで最も高かった。
【００２８】
【表２】
【００２９】
（化学合成ペプチド等の血圧降下作用）
上記２種のペンタペプチド及びこれらの配列の中に含まれる６種のトリペプチドの血圧降下作用について、自然発症高血圧ラットを用いて調べた。これら合成ペプチドをそれぞれ自然発症高血圧ラット（日本チャールズリバー社、１群５匹、１８〜２７週齢、雄）に胃ゾンデを用いて強制投与した。ペプチド投与量はラット体重１ｋｇあたり１ｍｇとし、投与容量は１匹あたり１ｍｌとした。また、実施例１において調製されたミオシンのサーモリシン分解物の投与も行った。サーモリシン分解物としては、実施例１における蒸留水での希釈前のペプチド溶液を凍結乾燥させたものを用い、投与量はラット体重１ｋｇあたり３０ｍｇとした。なお、生理食塩水を経口投与したものを対照とした。胃ゾンデによる投与を行ってから６時間後の尾動脈における最高血圧値を測定し、投与直前の最高血圧値を減じた値を算出し、変動値（血圧降下値）とした。血圧測定は非観血式血圧測定装置（ソフトロン社製、ＢＰ−９８Ａ）を用い、テイル・カフ（tail cuff）法により行った。結果を表３に示す。いずれの試料においても、投与６時間後に血圧降下が測定されたが、これらのうち、２種のペンタペプチド（Met-Asn-Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）と２種のトリペプチド（Met-Asn-Pro、Pro-Pro-Lys）、及びミオシンのサーモリシン分解物の投与では、有意（Ｐ＜０．０１）な血圧降下が認められた。
【００３０】
【表３】
【００３１】
【発明の効果】
本発明によると、食肉を原料とすることにより、血圧降下作用等の機能性を有するペプチドを低コストで得ることができる。また本発明のペプチドは、食肉由来のペプチドであることから、安全性が高く、医薬用組成物として利用しうるばかりでなく、血圧降下作用等を有する付加価値の高い機能性食品を作る素材としても有用である。
【００３５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ミオシンのサーモリシン分解物を試料とする逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】 図１に示される活性画分を再度逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、食肉（畜肉）タンパク質をプロテアーゼで分解することにより生成する、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害するペプチド、及びそれらペプチド又はその塩を有効成分として含有する、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する高血圧等の疾患の予防及び／又は症状改善用などの医薬用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高血圧症の発症に深く関わっている生体内の系としてレニン−アンジオテンシン系が知られており、この系の重要な構成要素であるアンジオテンシンＩ変換酵素はアンジオテンシンＩに作用し、血圧上昇作用をもつアンジオテンシンIIを生成し、また、アンジオテンシンＩ変換酵素は降圧作用を有するペプチドであるブラジキニンを分解する作用をも有する。すなわち、アンジオテンシンＩ変換酵素は昇圧性ペプチドの生成と、降圧性ペプチドの分解という二つの作用により血圧上昇をもたらす。したがって、アンジオテンシンＩ変換酵素のこのような作用により高血圧症が発症している場合、アンジオテンシンＩ変換酵素の活性を阻害することにより、血圧上昇を抑制することができる。さらに、近年、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質は、心不全の治療薬など、血圧降下剤以外の用途でも注目されている。
【０００３】
アンジオテンシンＩ変換酵素の阻害物質として、天然物では毒蛇由来のペプチド、化学合成物質ではカプトプリルなどが見い出されている。また近年、医薬品に対する安全性や食品に対する機能性への関心の高まりなどを背景として、食品や食品原料由来のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質が注目されている。特に食品タンパク質の分解により生成するペプチド性のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質の検索が数多く行われている。このようなものの例として、牛乳カゼイン、大豆タンパク質、トウモロコシタンパク質などのプロテアーゼ分解により生成するペプチドを挙げることができる（特開平８−２８３１７３号公報、特開平８−２６９０８７号公報、特開平８−９９９９４号公報、特開平６−８７８８６号公報）。また、魚肉を原料とした例として、かつお節やイワシのプロテアーゼ分解物などから、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性や血圧降下作用を示すペプチドを得ることが知られている（Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 56, 1541-1545, 1992、特開平７−１８８２８２号公報）。その他、豚血液から調製したプラズマのプロテアーゼ分解物から血圧降下ペプチドを調製した例も知られている（特開平５−２３８９４６号公報）。しかし、豚肉や牛肉といった畜肉あるいは畜肉に含まれるタンパク質から、このようなペプチドを得た例は知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、食品の中で重要な位置づけをされている食肉から血圧降下作用あるいはアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有する新規なペプチド類及びこれらペプチド類を有効成分として含む医薬用組成物を提供することにある。
【０００５】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、食肉タンパク質であるミオシンから、プロテアーゼの作用により生成するペンタペプチドである配列番号１で示される（Met-Asn-Pro-Pro-Lys）や配列番号２で示される（Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）が、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性や血圧降下作用を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、Met-Asn-Pro-Pro-Lys 、 Met-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Pro 、 Ile-Thr-Thr-Asn-Pro 、 Thr-Asn-Pro のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩（請求項１）に関する。
【０００７】
また本発明は、Met-Asn-Pro-Pro-Lys 、 Met-Asn-Pro 、 Asn-Pro-Pro 、 Ile-Thr-Thr-Asn-Pro 、 Thr-Asn-Pro のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分とする医薬用組成物（請求項２）や、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドが、ミオシン又はミオシンを含む原料をプロテアーゼ処理することにより得られることを特徴とする請求項２記載の医薬用組成物（請求項３）や、ミオシンを含む原料が、畜肉の筋原繊維構成タンパク質であることを特徴とする請求項３記載の医薬用組成物（請求項４）や、プロテアーゼが、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ及びパパインから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼであることを特徴とする請求項３又は４記載の医薬用組成物（請求項５）や、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善剤であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の医薬用組成物（請求項６）や、アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用の食品であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか記載の医薬用組成物（請求項７）に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドとしては、配列表の配列番号１（Met-Asn-Pro-Pro-Lys）又は配列番号２（Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）に示されるアミノ酸配列の全部を含み、かつアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドや、配列表の配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の一部を含み、かつアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドであればどのようなものでもよく、例えば、以下の（１）〜（１４）のいずれかで表されるペプチドを具体的に例示することができる。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys
（２）Met-Asn-Pro
（３）Asn-Pro-Pro
（４）Pro-Pro-Lys
（５）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（６）Ile-Thr-Thr
（７）Thr-Thr-Asn
（８）Thr-Asn-Pro
（９）Met-Asn-Pro-Pro
（１０）Asn-Pro-Pro-Lys
（１１）Ile-Thr-Thr-Asn
（１２）Thr-Thr-Asn-Pro
（１３）Leu-Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（１４）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro-Tyr
【０００９】
上記（１）〜（１４）に示される新規ペプチドは、Ｌ体のアミノ酸配列を有し、常温において白色等の粉末である。また、本発明においてペプチドの塩としては、薬理学上許容される塩であれば特に制限されるものではなく、本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩などの塩類を例示することができる。また、かかる本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法としては、食肉あるいは食肉タンパク質のプロテアーゼ分解物から分離・精製する方法と、アミノ酸の配列情報に基づき、化学的に合成する方法を挙げることができる。
【００１０】
プロテアーゼを用いるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの製法における原料としては、本発明の配列番号１及び配列番号２で示されるペンタペプチドが筋原線維を構成するタンパク質であるミオシンのアミノ酸配列の一部であることからして、ミオシン又はミオシンを含む原料が用いられる。かかるミオシンとしては、精製品の他、未精製のミオシンやアクトミオシンを例示することができ、また、かかるミオシンを含む原料としては、肉塊、挽肉、残肉、屑肉、筋肉等のミオシンを４〜５％含む食肉（畜肉）や、かかる食肉から得られる筋肉由来の水不溶性タンパク質等のミオシンを４０〜５０％含む筋原繊維構成タンパク質などを例示することができ、これらミオシンや食肉の種類・由来等は特に制限されるものではない。また、プロテアーゼとしては、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の強いペプチド溶液を得ることができるものであれば特に制限されるものではないが、サーモリシン（SIGMA社製）やプロテイナーゼＫ（MERCK社製）の他、プロナーゼＥ（MERCK社製）、パパイン（東京化成工業社製）等のプロテアーゼを好ましいプロテアーゼとして例示することができる。
【００１１】
プロテアーゼによるミオシンを含むタンパク質の分解は、例えば、ミオシン又はミオシンを含む原料を水あるいは適当な緩衝液（例えばリン酸緩衝液）に、ミオシン濃度が０．０１〜１０％、好ましくは０．１〜３．０％程度の濃度になるよう懸濁し、この溶液にプロテアーゼを０．０１〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜２ｇ／Ｌ程度の濃度で添加することにより行われ、酵素反応条件としてはプロテアーゼが作用しうる条件であれば特に制限されないが、例えば用いるプロテアーゼの至適ｐＨ付近で、３７℃で１２〜１８時間程度の酵素処理条件を例示することができる。また、プロテアーゼによる分解反応は、加熱、無機酸や有機酸の添加、限外濾過によるプロテアーゼ除去など、一般によく知られている方法のいずれかにより停止することができる。反応停止後の分解液は、濾過あるいは遠心分離により不溶物を除去し、得られた濾液（タンパク質分解溶液）は、ミオシンの分解により生成したペプチドを含み、この溶液から目的とするペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー等により精製することができる。また、濾液は必要に応じて、凍結乾燥や減圧乾燥により濃縮することができる。
【００１２】
他方、化学的合成法によるペプチドの製法は液相法と固相法に大別され、最近のペプチドシンセサイザーの普及により固相法による合成が一般化しつつあるものの、いずれの方法においても常法により本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドを調製することができる。固相法によるペプチドの製造は、例えばアプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａ装置を用い、ポリマー性の固相支持体へ合成しようとするペプチドのカルボキシル末端側からＬ体アミノ酸を順次ペプチド結合により延長させて目的とするペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸などを用いて固相支持体から切り出し、次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーなどの方法で精製し、目的とするペプチドを得ることにより行うことができる。
【００１３】
本発明の医薬用組成物としては、上記本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、本発明のペプチド又はその塩の有する薬理作用の対象となる疾病、例えば高血圧症、心不全等のアンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾病に対する予防及び／又は症状改善剤、並びに予防及び／又は症状改善用の食品などを例示することができる。かかる本発明のペプチド及び／又はその塩と他の成分又は素材との混合物からなる医薬用組成物として、より具体的には、本発明のペプチド又はその塩に賦形剤を配合した高血圧症治療薬や、本発明のペプチド又はその塩を添加した食品や、本発明のペプチド又はその塩を含有する食品素材や、該食品素材を添加した食品等を挙げることができる。食品としては、コーヒー、紅茶、煎茶、ヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、スポーツ飲料等の各種飲料や、パン、ケーキ、ゼリー、饅頭、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他の各種総菜を例示することができる。
【００１４】
上記本発明のペプチド又はその塩を含有する食品素材は、肉塊や残肉・屑肉を原料として安価かつ大量に調製することができる。例えば、肉塊を原料とする場合、肉塊より脂肪組織及び結合組織を除去したものをグラインドし、得られた挽肉にほぼ４倍量の水と適量のプロテアーゼを添加し、サイレントカッター等で攪拌し、３７℃で１２〜１８時間反応させて本発明のペプチドを生成せしめた後、９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させ、次いで必要に応じて濾過・精製することにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。また、残肉・屑肉を原料とする場合、まずこれら残肉・屑肉をグラインドし、得られた挽肉に塩溶液（例えば０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液）を加え、サイレントカッター等で攪拌して、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を抽出した後、遠心分離あるいは濾過により不溶物を除去し、抽出溶液に４〜５倍量の水を加えて塩濃度を低下せしめることにより、ミオシン、アクチン等の塩溶性タンパク質を析出させ、遠心分離あるいは濾過により不溶物として回収した不溶性のタンパク質に対して、以下上記肉塊の場合と同様に、プロテアーゼ処理等を行うことにより、本発明のペプチドを含有する食品素材を調製することができる。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。なお、特に断らない限り、実施例中に示された“％”は重量％を表す。
実施例１［アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドの単離］
（豚骨格筋から不溶性タンパク質の調製）
豚骨格筋（大腿二頭筋）を細切し、脂肪や結合組織をできるだけ取り除いたもの１００ｇに蒸留水２００ｍｌを加え、ほぼ均一になるまでホモジナイズした。これを目の細かい金網に通して細切されなかった塊を除去した後、濾紙を用いて濾過した。濾過後、さらに蒸留水で濾液が無色になるまで濾紙上の不溶物を洗浄した。洗浄後、濾紙上の不溶物を集め、凍結乾燥により粉末状の豚骨格筋不溶性タンパク質を得た。また、かかるタンパク質に含まれる主要なタンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ミオシンとアクチンであることを確認した。
【００１６】
（豚骨格筋不溶性タンパク質画分からのペプチドの生成）
上記豚骨格筋不溶性タンパク質１０ｇに蒸留水９０ｍｌを加え、均一になるまで攪拌した。プロテアーゼとしては８種類、すなわちサーモリシン（SIGMA社製）、プロテイナーゼＫ（MERCK社製）、プロナーゼＥ（MERCK社製）、フィチン（東京化成工業社製）、パパイン（東京化成工業社製）、トリプシン（和光純薬社製；2000units/g）、α−キモトリプシン（和光純薬社製；牛膵臓製）及びペプシン（和光純薬社製；1:10,000）をそれぞれ単独に用いた。上記不溶性タンパク質懸濁液に上記プロテアーゼの１種を１０ｍｇ添加して溶解させた後、３７℃で１８時間反応させ、ペプチドを生成させた。反応終了後、溶液を９８℃で１０分間加熱して、プロテアーゼを失活させた。遠心分離により大部分の不溶物を取り除き、さらにメンブランフィルターを通し、微細な粒子を除去し、８種類のペプチド溶液を得た。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定には、かかるペプチド溶液を蒸留水で１０倍希釈した８種類の試料溶液を用いた。
【００１７】
（ミオシンからのペプチドの生成）
豚ミオシン（SIGMA社製）１０ｍｇに蒸留水１０ｍｌを添加して懸濁させ、この懸濁液に前記８種のプロテアーゼ（サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ、フィシン、パパイン、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン）１ｍｇを用いて、前記豚骨格筋不溶性タンパク質の場合と同様にして、８種類のペプチド溶液を得た。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定には、これらペプチド溶液を蒸留水で１０倍希釈した８種類の試料溶液を用いた。
【００１８】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定方法）
アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定は、合成基質である馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシン（SIGMA社製）を用いてアンジオテンシンＩ変換酵素が基質の末端ジペプチドのＬ−ヒスチジル−Ｌ−ロイシンを選択的に切断することを利用して、遊離する馬尿酸を抽出し、比色する方法で実施した。試験管に測定しようとする試料溶液（ペプチド溶液）を０．０１５ｍｌ入れ、これに０．１２５ｍｌの基質溶液（６０８ｍＭ食塩を含む０．１Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．３を用いて７．６ｍＭになるように馬尿酸−Ｌ−ヒスチジル−ロイシンを溶解させたもの）を添加し、３７℃で５分間保温した。その後、０．０５ｍｌの酵素溶液（SIGMA社製アンジオテンシンI変換酵素を蒸留水に５０単位／ｍｌになるように溶解させたもの）を添加し、３７℃で３０分間反応させた。１Ｎ塩酸０．１２５ｍｌを添加して反応を停止させた後、酢酸エチル０．７５ｍｌを加え、酢酸エチル中に抽出された馬尿酸を２２８ｎｍの吸光度を測定することにより定量した。かかる試料溶液の吸光度を“Ｓ”、試料溶液に代えて同量の蒸留水を用いた対照の吸光度を“Ｂ”、反応開始前の吸光度を“Ｃ”とし、アンジオテンシンI変換酵素阻害率を次式により算出した。
阻害率（％）＝（Ｂ−Ｓ）÷（Ｂ−Ｃ）×１００
【００１９】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害活性の測定結果）
豚骨格筋不溶性タンパク質を各種プロテアーゼで分解して調製した前記８種類の試料溶液、及びミオシンを各種プロテアーゼで分解して調製した前記８種類の試料溶液のアンジオテンシンI変換酵素阻害活性を表１に示す。豚骨格筋不溶性タンパク質にサーモリシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、プロナーゼＥを作用させた試料溶液が７０％以上の阻害活性を有し、またミオシンにサーモリシン、キモトリプシンを作用させた試料溶液が７０％以上の阻害活性を有していた。
【００２０】
【表１】
【００２１】
（アンジオテンシンI変換酵素阻害ペプチドの精製）
豚ミオシン（SIGMA社製）１００ｍｇに蒸留水１００ｍｌを加え、懸濁させた。これに１０ｍｇのサーモリシンを添加して溶解させた後、３７℃で１８時間反応させ、ミオシンからペプチドを生成させた。反応終了後、９８℃で１０分間加熱して、サーモリシンを失活させた。遠心分離により大部分の不溶物を除去し、さらにメンブランフィルターを通し、微細な粒子を取り除いてペプチド溶液を得た。得られたペプチド溶液からのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害ペプチドの精製は逆相高速液体クロマトグラフィーにより行った。すなわち、カラムに資生堂製ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃ１８ ＵＧ１２０４．６×１５０ｍｍを用い、溶出液Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水）から溶出液Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系で溶出を行った。
【００２２】
（ペプチドの構造決定）
精製したペプチドのアミノ酸配列は、自動エドマン分解法（気相法）によるＮ末端アミノ酸分析により決定した。自動分析装置としてアブライドバイオシステムズ社製プロテインシークエンサーモデル４７０Ａを利用した。操作は製品マニュアルの記載に従って行い、試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを用いた。ミオシンのサーモリシン分解物を試料とする逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを図１に示す。溶出液を５分間隔で採取し、アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を測定した結果、２５〜３０分の画分に最も高い活性が認められた。この画分を再度、同条件で高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを図２に示す。溶出時間２６．３分付近と２７．７分付近の矢印を付けた２本のピークの部分(１)及び(２)に高いアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性が検出された。
【００２３】
次に、これらの部分を採取し、構造解析を試みたところ、数種のペプチドが混在することがわかったため、さらに溶出液Ｃ（０．０１５％アンモニアを含む蒸留水）から溶出液Ｄ（０．０１５％アンモニアを含むアセトニトリル）への直線濃度勾配系によるアルカリ性溶出液を用いた逆相高速クロマトグラフィーを実施した。図２のピーク(１)の画分に含まれるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を示すペプチドは、アルカリ性溶出液を用いた場合、溶出時間２６．５分付近に検出された。一方、図２のピーク(２)の画分に含まれる阻害活性ペプチドは、アルカリ性溶出液を用いた条件では、７．１分付近に溶出された。上記アルカリ性溶出液を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより、それぞれのペプチドは単一成分に精製された。
【００２４】
精製した２種のペプチドの構造解析を行ったところ、いずれも５つのアミノ酸残基からなるペンタペプチドであった。これらの構造は以下のとおりである。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys（図２のピーク(１)由来）
（２）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro（図２のピーク(２)由来）
これらのアミノ酸配列をデータベース（Swiss-Prot）を利用して検索したところ、いずれも筋肉のミオシン重鎖内に存在する配列に一致するものであった。Met-Asn-Pro-Pro-Lysはラットミオシン重鎖（８０〜８４残基目）、ニワトリミオシン重鎖（８０〜８４残基目）、ヒトミオシン重鎖（８２〜８６残基目）に一致した。一方、Ile-Thr-Thr-Asn-Proはラットミオシン重鎖（３０４〜３０８残基目）、ニワトリミオシン重鎖（３０５〜３０９残基目）、ヒトミオシン重鎖（３０６〜３１０残基目）に一致した。なお、アミノ酸残基の数字はいずれもＮ末端側からのものである。
【００２５】
本発明で利用したミオシンは豚骨格筋由来のものであるが、豚ミオシン重鎖の配列は未だ確定していない。データベース（Swiss-Prot）には豚ミオシンのアミノ酸配列が一応登録されてはいるものの、本発明のペンタペプチドと完全に一致する配列は見出せなかった。しかし、登録されている豚ミオシン重鎖配列にも、Gln-Asn-Pro-Pro-Lys（７９〜８３残基目）とIle-Thr-Asn-Asn-Pro（３０３〜３０７残基目）という本研究のペンタペプチドとそれぞれ１残基だけ異なる配列が、ほぼ多種の動物由来のミオシンにおける場合と同一位置に存在しており、ラット、ニワトリ、ヒトでの結果からすると、１残基異なる部分はデータベースに登録されている豚ミオシン重鎖の配列を決定する際に、誤って読みとられたものと考えられる。したがって、本発明のペンタペプチドに一致する配列は豚ミオシン重鎖の７９〜８３残基目と３０３〜３０７残基目に存在するものと考えられる。
【００２６】
実施例２［ペンタペプチド等の化学合成］
（化学合成法）
２種のペンタペプチド（Met-Asn-Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）及びこれらの配列の中に含まれる６種のトリペプチド（Met-Asn-Pro、Asn-Pro-Pro、Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr、Thr-Thr-Asn、Thr-Asn-Pro）の化学合成はアブライドバイオシステムズ社製ペプチド合成装置モデル４３０Ａを用い、製品マニュアルの記載に従って行った。試薬類はすべてアブライドバイオシステムズ社指定のものを使用した。ペプチド鎖を合成した後、トリフルオロメタンスルホン酸により、固相支持体から切り出した。次いで、アミノ酸側鎖の保護基を取り除き、逆相高速クロマトグラフィーにより、目的とするペンタペプチドを精製した。なお、高速液体クロマトグラフィーは、前記実施例１の酸性溶出液を利用した条件で行った。
【００２７】
（化学合成ペプチドのアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定）
アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性の測定は、前記実施例１記載の方法と同様にして行った。また、阻害率５０％のときのペプチド濃度をＩＣ５０値とした。化学合成により調製した２種のペンタペプチドと６種のトリペプチドの分子量とアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を表２に示す。合成したペプチドの質量分析計（ＦＡＢ−ＭＡＳ）により測定した分子量の値は、化学構造から算出した値にほぼ一致しており、目的ペプチドの合成が問題なく行われたものと判断した。アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性は、トリペプチドMet-Asn-Proで最も高かった。
【００２８】
【表２】
【００２９】
（化学合成ペプチド等の血圧降下作用）
上記２種のペンタペプチド及びこれらの配列の中に含まれる６種のトリペプチドの血圧降下作用について、自然発症高血圧ラットを用いて調べた。これら合成ペプチドをそれぞれ自然発症高血圧ラット（日本チャールズリバー社、１群５匹、１８〜２７週齢、雄）に胃ゾンデを用いて強制投与した。ペプチド投与量はラット体重１ｋｇあたり１ｍｇとし、投与容量は１匹あたり１ｍｌとした。また、実施例１において調製されたミオシンのサーモリシン分解物の投与も行った。サーモリシン分解物としては、実施例１における蒸留水での希釈前のペプチド溶液を凍結乾燥させたものを用い、投与量はラット体重１ｋｇあたり３０ｍｇとした。なお、生理食塩水を経口投与したものを対照とした。胃ゾンデによる投与を行ってから６時間後の尾動脈における最高血圧値を測定し、投与直前の最高血圧値を減じた値を算出し、変動値（血圧降下値）とした。血圧測定は非観血式血圧測定装置（ソフトロン社製、ＢＰ−９８Ａ）を用い、テイル・カフ（tail cuff）法により行った。結果を表３に示す。いずれの試料においても、投与６時間後に血圧降下が測定されたが、これらのうち、２種のペンタペプチド（Met-Asn-Pro-Pro-Lys、Ile-Thr-Thr-Asn-Pro）と２種のトリペプチド（Met-Asn-Pro、Pro-Pro-Lys）、及びミオシンのサーモリシン分解物の投与では、有意（Ｐ＜０．０１）な血圧降下が認められた。
【００３０】
【表３】
【００３１】
【発明の効果】
本発明によると、食肉を原料とすることにより、血圧降下作用等の機能性を有するペプチドを低コストで得ることができる。また本発明のペプチドは、食肉由来のペプチドであることから、安全性が高く、医薬用組成物として利用しうるばかりでなく、血圧降下作用等を有する付加価値の高い機能性食品を作る素材としても有用である。
【００３５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ミオシンのサーモリシン分解物を試料とする逆相高速液体クロマトグラフィーを行った際に得られたクロマトグラムを示す図である。
【図２】 図１に示される活性画分を再度逆相高速液体クロマトグラフィーに供した際のクロマトグラムを示す図である。
Claims (7)
- 下記（１）〜（５）のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys
（２）Met-Asn-Pro
（３）Asn-Pro-Pro
（４）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（５）Thr-Asn-Pro - 下記（１）〜（５）のいずれかで表されるアンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチド又はその塩を有効成分とする医薬用組成物。
（１）Met-Asn-Pro-Pro-Lys
（２）Met-Asn-Pro
（３）Asn-Pro-Pro
（４）Ile-Thr-Thr-Asn-Pro
（５）Thr-Asn-Pro - アンジオテンシンＩ変換酵素阻害活性を有するペプチドが、ミオシン又はミオシンを含む原料をプロテアーゼ処理することにより得られることを特徴とする請求項２記載の医薬用組成物。
- ミオシンを含む原料が、畜肉の筋原繊維構成タンパク質であることを特徴とする請求項３記載の医薬用組成物。
- プロテアーゼが、サーモリシン、プロテイナーゼＫ、プロナーゼＥ及びパパインから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼであることを特徴とする請求項３又は４記載の医薬用組成物。
- アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善剤であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか記載の医薬用組成物。
- アンジオテンシンＩ変換酵素に起因する疾患の予防及び／又は症状改善用の食品であることを特徴とする請求項２〜６のいずれか記載の医薬用組成物。
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