JP3538998B2 - 長鎖プレニル二燐酸合成酵素 - Google Patents
長鎖プレニル二燐酸合成酵素Info
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Description
リン酸合成酵素が合成するプレニル二リン酸よりも長鎖
のプレニル二リン酸を合成することができる変異型プレ
ニル二リン酸合成酵素に関する。
て、ステロイドの前駆体であり、カロテノイドの前駆体
であり、rasガン遺伝子がコードするプレニル化タン
パク質の転移基質となり、ビタミンE・Kやユビキノン
(CoQ)合成の基質となるなど、応用価値が高い。プ
レニル二燐酸はジメチルアリル二燐酸(dimethylallyl
diphosphate ;DMAPP ;C5) をはじめ、ゲラニル二燐酸
(geranyl diphosphate ;GPP ;C10 )、ファルネシル
二燐酸 (farnesyl diphosphate;FPP ;C15 )、ゲラニ
ルゲラニル二燐酸 (geranylgeranyl diphosphate;GGP
P;C20 )、ゲラニルファルネシル二燐酸(geranylfarn
esyl diphosphate ;GFPP;C25 )、ヘキサプレニル二
燐酸(hexaprenyl diphosphate;HPP ;C30 )、ヘプタ
プレニル二燐酸(heptaprenyl diphosphate ;HepPP ;
C35 )、オクタプレニル二燐酸(octaprenyl diphospha
te;OPP ;C40 )等が存在する。
るプレニルトランスフェラーゼ(prenyltransferase ;
PTase )はイソペンテニル二燐酸 (isopentenyl diphos
phate ;IPP, C5 )をアリル性二燐酸に連続的に縮合さ
せてプレニル二燐酸を生成せしめる酵素であって、合成
し得る最大のプレニル二燐酸の長さ(炭素数)により、
ファルネシル二燐酸合成酵素(farnesyldiphosphate sy
nthase;FPS )、ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素(ge
ranylgeranyl diphosphate synthase ;GGPS)、ゲラニ
ルファルネシル二燐酸合成酵素 (geranylfarnesyldipho
sphate synthase ;GFPS) 、ヘキサプレニル二燐酸合成
酵素 (hexaprenyldiphosphate synthase;HPS ) 、ヘプ
タプレニル二燐酸合成酵素 (heptaprenyldiphosphate s
ynthase;HepPS )、オクタプレニル二燐酸合成酵素(o
ctaprenyldiphosphate synthase;OPS ) 等が存在す
る。
炭素数5個のジメチルアリル二燐酸〜炭素数20個のゲ
ラニルゲラニル二燐酸が少量試薬として市販されている
だけであり、より長鎖のプレニル二燐酸を工業的に大量
に合成・採取する方法は知られていない。合成されるプ
レニル二燐酸の炭素鎖長及び立体異性は、個々の酵素に
よって特異的に決定される事が知られている。現在ま
で、どういったメカニズムがこの炭素鎖長の決定要因に
なっているかは明らかになっていない。プレニルトラン
スフェラーゼおよびその遺伝子は、バクテリア・かび・
植物・動物の由来のものが知られているが、一般的にこ
の酵素は不安定で、取り扱いが困難であり工業的な利用
価値は望めない。
菌由来のプレニルトランスフェラーゼとその遺伝子は、
中等度好熱菌バシラス・ステアロサーモフィルス(Baci
llus stearothermophilus) からのファルネシル二燐酸合
成酵素(farnesyldiphosphate synthase;FPS )(Koyam
a, T. et al.(1993) J.Biochem. 113, 355-363)及びヘ
プタプレニル二燐酸合成酵素(heptaprenyl diphosphat
e synthase;HepPS)(Koike-Takeshita, A. et al.(199
5) J.Biol.Chem. 270, 18396-18400);高度好熱古細菌
スルホロバス・アシドカルダリス(Sulfolobus acidoc
aldarius) からのゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素(ge
ranylgeranyl diphosphate synthase;GGPS) (Ohnuma,
S.-i. et al.(1994) J.Biol.Chem. 268, 14792-1479
7);
ム・サーモオートトロピカム(Methanobacterium ther
moautotrophicum) からの、酵素のキャラクタリゼーシ
ョンとしてのファルネシル二燐酸/ゲラニルゲラニル二
燐酸合成酵素(farnesyl diphosphate/geranylgeranyl
diphosphate synthase : FPS/GGPS) (Chen, A. and
Poulter, C.D.(1993) J.Biol.Chem. 268, 11002-11007
)が知られているにすぎない。このうちHepPSの
みが、炭素数35のプレニル二燐酸を合成できるだけ
で、炭素数25以上のプレニル二燐酸を合成する熱安定
性のある酵素は報告されていない。また、前記HepP
Sは十分な耐熱性を有せず、2種のサブユニットから成
る酵素であり取扱いは必ずしも容易でない。
プレニル二燐酸を合成することができる耐熱性のプレニ
ル二燐酸合成酵素及びその製造方法、並びに該酵素の使
用方法を提供しようとするものである。
鎖長を有するプレニル二燐酸を合成することができる酵
素を作出すべく、ゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素をコ
ードするDNAを変異剤により処理し、ヘキサプレニル
二燐酸合成酵素を欠損した酵母サッカロミセス・セレビ
シエー(Saccharomyces cerevisiae)に前記変異処理
したDNAを導入し、前記の欠損を相補できる変異DN
Aを選択することにより、生来のゲラニルゲラニル二燐
酸合成酵素より長鎖のプレニル二燐酸を合成することが
できる変異型酵素を作出することに成功し、さらに酵素
中の変異部位と生成するプレニル二燐酸の鎖長との関係
を解明し、本発明を完成した。
ルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius) 由来のゲラ
ニルゲラニル二燐酸合成酵素において、77位のPh
e、85位のMet、99位のVal、101位のTy
r、118位のPhe、199位のArg及び312位
のAspの内少なくとも1個が他のアミノ酸により置換
されており、且つ炭素数25個以上のプレニル二燐酸を
生成せしめることができる変異型酵素を提供する。本発
明はさらに、上記の酵素をコードする遺伝子系、及びそ
れを用いた上記酵素の製造方法を提供する。
成酵素の製造方法であって、もとの酵素をコードする遺
伝子中での、アスパラギン酸−richドメインIのN
末端のアミノ酸から5個N−末端側に位置するPheを
コードするコドンを非芳香族性のアミノ酸をコードする
コドンに転換した遺伝子により形質転換した宿主を培養
し、もとのプレニル二燐酸合成酵素が生成し得る最長の
プレニル二燐酸よりも長鎖のプレニル二燐酸を生成せし
めることができる変異型酵素を発現せしめることを特徴
とする方法を提供する。本発明はまた、上記の酵素を用
いての長鎖プレニル二燐酸の製造方法を提供する。
て、高度好熱古細菌スルホロバス・アシドカルダリウス
(Sulfolobus acidocaldarius) のゲラニルゲラニル二
燐酸合成酵素(GGPS)遺伝子を出発材料として用い
る。この遺伝子のクローニング方法は特願平6−315
572の明細書に詳細に記載されている。また、他のク
ローニング方法の一例を本明細書に実施例1として記載
すると共に、その塩基配列及びそれがコードするアミノ
酸配列を配列番号:1として示す。
Aを試験管内で変異処理する。変異手段としては変異剤
を用いる化学的処理、紫外線、X線等を用いる物理的処
理等を用いることができるが、化学的処理を行うのが便
利である。化学的処理のための変異剤としては、任意の
常用の変異剤を用いることができ、例えば亜硝酸塩を用
いることができる。
に、変異処理されたDNAを酵母発現ベクターに挿入し
てDNAライブラリーを作製する。このための発現ベク
ターとしては、挿入された外来遺伝子を酵母中で発現す
ることができる任意のベクター、例えば酵母プラスミ
ド、例えばpYEUra3(Clonetech社から入手可
能)、pYES2(Invitrogen社から入手可能)等を使
用することができる。
ラリーを、ヘキサプレニル二燐酸合成能を欠く酵母変異
株に導入する。この変異株は、非発酵性糖代謝に必要な
補酵素Q6を合成することができないため、唯一の炭素
原としてグリセロールを含有する培地には生育できな
い。従って、前記ライブラリーにより形質転換された酵
母を、グリセロール培地で培養し、そこで成育した株を
選択すれば、炭素数の多いプレニル二燐酸合成能を獲得
した株を選択することができる。こうして、約1400
の形質転換体から5個のポジティブクローンを得た。こ
れらのクローンからプラスミドを精製し、挿入部の塩基
配列を決定し、コードされているアミノ酸配列を推定し
たところ、各変異体は下記のごとくアミノ酸配列の変化
を起こしていた。
99位のArg→Lys、及び312位のAsp→As
nの変化 Mutation2:118位のPhe→Leuの変化 Mutation3:77位のPhe→Serの変化 Mutation4:77位のPhe→Leu、及び99位のV
al→Metの変化 Mutation5:77位のPhe→Ser、及び101位の
Tyr→Hisの変化 そして、変異していない酵素が炭素数25個以上のプレ
ニル二燐酸を合成できなかったのに対して、これらの変
化を有するアミノ酸配列からなる酵素は炭素原子数25
個以上のプレニル二燐酸を合成することができた。上記
のアミノ酸置換を有する酵素のアミノ酸配列をそれぞれ
配列番号:2〜6に示す。
ミノ酸が他のアミノ酸により置換されておれば、もとの
酵素より炭素数の多いプレニル二燐酸を合成することが
できると合理的に推定される。従って、本発明は、77
位のPhe、85位のMet、99位のVal、101
位のTyr、118位のPhe、199位のArg及び
312位のAspの内の少なくとも1個のアミノ酸が他
のアミノ酸により置換されており、且つ炭素数25個以
上のプレニル二燐酸を生成せしめることができる変異型
酵素を提供する。
ましくは非芳香族性のアミノ酸、例えばSer又はLe
uにより置換された場合、その酵素は炭素原子数25個
以上のプレニル二燐酸を合成することができる。従っ
て、本発明は1つの態様において、少なくとも77位の
Pheが他のアミノ酸、例えばSer,Leuその他の
非芳香族性アミノ酸により置換されている酵素を提供す
る。この様な酵素は、前記の他の部位の1又は複数にお
いてアミノ酸置換が存在する酵素を含む。他のアミノ酸
位置としては例えば99位のVal及び/又は101位
のTyrを挙げることができる。
置換されている酵素、77位のPheと99位のVal
が置換されている酵素、77位のPheと101位のT
yrが置換されている酵素、及び77位のPheと99
位のValと101位のTyrが置換されている酵素、
並びに77位のPheと他の1個又は複数の前記部位の
アミノ酸が置換されている酵素を包含する。
t、199位のArg及び312位のAspの置換を有
する酵素も炭素原子数25個以上のプレニル二燐酸を合
成する。従って本発明は、1つの態様において、少なく
とも85位のMet、199位のArg及び312位の
Aspが他のアミノ酸により置換されている酵素を包含
する。この態様には、85位のMetと199位のAr
gと312位のAspとが置換されている酵素、及びこ
れらの部位に加えて、前記の変異部位の内他の1又は複
数の部位にアミノ酸置換が存在する酵素が含まれる。
位のPheが他のアミノ酸により置換されている酵素
も、炭素原子数25個以上のプレニル二燐酸を合成する
ことができる。従って本発明は1つの態様において、少
なくとも118位のアミノ酸が他のアミノ酸に置換され
ている酵素を包含する。この態様には、118位のアミ
ノ酸が他のアミノ酸により置換されている酵素、及びさ
らにそれに加えて前記アミノ酸置換位置の内他の1又は
複数の位置にアミノ酸置換を有する酵素が含まれる。
又は少数個のアミノ酸の付加、除去、及び/又は置換に
よって修飾されている場合でもその本来の酵素活性を有
する場合があることが知られている。従って、本発明
は、配列番号:2〜6に示されるアミノ酸配列を有する
ペプチド数の他に、配列番号2〜6に示されるアミノ酸
配列に対して1又は少数個、例えば5個まで、又は10
個までのアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加により変
化しているアミノ酸配列を有し、なお生来の機能を果す
ことができる酵素をも包含する。
通に2個のアスパラギン酸−richドメイン(図1
中、矢印で示す部位)が存在し、ここに基質の二燐酸部
位が結合すると考えられている。そして前記77位のP
heはこの2個のアスパラギン酸−richドメインの
内、N−末端側に存在するアスパラギン酸−richド
メインIのN−末端アミノ酸からN末端に向かって5番
目に存在する。本発明の5個のMutantの内3個に
おいてこのPheが非芳香族性のアミノ酸に置換されて
いる。
個以上のプレニル二燐酸の合成のためには、アスパラギ
ン酸−richドメインIのN−末端のアミノ酸から約
5残基N−末端側にあるPheを他のアミノ酸、例えば
非芳香族性のアミノ酸に変化させれば、配列番号:1に
示すアミノ酸配列を有するスルホロバス・アシドカルダ
リウス由来のプレニルトランスフェラーゼ以外のプレニ
ルトランスフェラーゼであっても、もとの酵素に比べて
炭素数の多いプレニル二燐酸を合成できる酵素が得られ
る。
ラーゼのアスパラギン酸−richドメインIのN−末
端側のアミノ酸から約5残基N−末端側にあるPheを
非芳香族性アミノ酸に置き換えることを特徴とする変異
型プレニルトランスフェラーゼの製造方法を提供する。
このアミノ酸置換は、そのアミノ酸をコードするコドン
の変更により行うことができる。本発明はまた、上記の
種々の変異型酵素をコードする遺伝子及びそれを含むベ
クター、特に発現ベクター、及び該ベクターにより形質
転換された宿主を提供する。本発明の遺伝子(DNA)
は、例えば配列番号:1に示す生来のアミノ酸配列をコ
ードするDNAに部位特定変異誘発やPCR法等の常法
に従って変異を導入することにより容易に得ることがで
きる。
列が定まれば、それをコードする適当な塩基配列を決定
することができ、常用のDNA合成法によりDNAを化
学合成することもできる。本発明はまた、前記のごとき
DNAを含んで成る発現ベクター、該発現ベクターによ
り形質転換された宿主、及びこれらの宿主を用いての本
発明の酵素又はペプチドの製造方法を提供する。
配列等を含有するが、これらは宿主により異る。宿主と
しては、原核性生物、例えば細菌、例えば大腸菌、バチ
ラス属細菌、例えばバシラス・ズブチリス(Bacillus
Subtilis)、真核性微生物、例えば真菌、例えば酵母、
例えばサッカロミセス(Saccharomyces )属に属すサッ
カロミセス・セレビシエー(S.cerevisiae)やピキア
(Pichia)属に属するピキア・パストリス(Pichia pa
storis)、糸状菌、例えばアスペルギルス(Aspergillu
s )属のアスペルギルス・オリゼー(A.oryzae)、ア
スペルギルス・ニガー(A.niger )、動物細胞、例え
ばカイコの培養細胞、高等動物の培養細胞、例えばCH
O細胞、等が挙げられる。また植物を宿主とすることも
可能である。
発明のDNAにより形質転換した宿主を培養することに
より、培養物中にゲラニルファルネシル二リン酸を蓄積
することができ、これを採取することによりゲラニルフ
ァルネシル二リン酸を製造することができる。本発明に
よればまた、本発明の方法により製造した変異型GGP
P合成酵素を基質イソペンテニル二リン酸及び各アリル
性基質、例えばファルネシル二リン酸に作用させること
によってもゲラニルファルネシル二リン酸を製造するこ
とができる。
DNAからmRNAを転写する過程とmRNAからタン
パク質を翻訳する過程など遺伝子の発現調節機能がある
ことが知られている。mRNAの合成を調節するプロモ
ーター配列として、天然に存在する配列(たとえばla
c,trp,bla,lpp,PL ,PR ,ter,T
3,T7など)以外にも、それらの変異体(例えばla
cUV5)や天然にあるプロモーター配列を人工的に融
合した(例えばtac,trcなど)配列が知られてお
り、本発明にも使用できる。
調節する配列として、リボソームバインディングサイト
(GAGGおよびその類似配列)配列と開始コドンであ
るATGまでの距離が重要であることは既知である。ま
た、3′側に転写終了を指令するターミネーター(例え
ば、rrnPT1 T2 を含むベクターがファルマシア社
から市販されている)が組換え体でのタンパク質合成効
率に影響する事はよく知られている。
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種のベクターを挙
げることができる。例えば、pMB1由来のrepliconを
持つpBR322,pBR327,pKK223−3,
pKK233−2,pTrc99等や、コピー数が向上
するように改変したpUC18,pUC19,pUC1
18,pUC119,pBluescript ,pHSG298,
pHSG396等、またp15A由来のrepliconを持つ
pACYC177やpACYC184等、さらにはpS
C101やColE1やR1やF因子などに由来するプ
ラスミドが挙げられる。さらに、より精製の容易な融合
蛋白質発現ベクター例えばpGEX−2T,pGEX−
3XやpMal−c2のようなベクターも利用でき、本
発明の出発材料として用いた遺伝子の例が特願平6−3
15572に記載されている。
M13ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。大腸菌以外の
微生物への遺伝子導入では、pUB110( Sigma社か
ら販売)やpHY300PLK(宝酒造より販売)など
によるBacillus属への遺伝子導入が知られている。これ
らベクターについてはMolecular Cloning (J.Sambrook,
E.F.Fritsch, T.Maniatis著 Cold Spring Harbor Labo
ratory Press発行) やCloning Vector (P.H.Pouwels,
B.E.Enger.Valk, W.J.Brammar著Elsevier発行) や各社
カタログに記載されている。
販売)は、選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子以外
に、プロモーター及び制御遺伝子としてPtrc及びl
acIq 、リボソームバインディングサイトとしてAG
GAという配列、ターミネーターとしてrrnPT1 T
2 を持ち、HDP合成酵素遺伝子の発現調節機能を持
つ、好ましいベクターとして挙げられる。
をコードするDNA断片および必要により前記酵素の遺
伝子を発現調節する機能を有するDNA断片の組み込み
は、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知方法で行う
ことができる。こうして作製される発明のプラスミドの
具体的なものとしてはpBS−GGPSmut1,pB
S−GGPSmut2,pBS−GGPSmut3,p
BS−GGPSmut4,pBS−GGPSmut5が
挙げられる。
きる微生物としてはエシェリヒアコリー(Escherichia
coli)、バシラス(Bacillus)属などに属する微生物も
利用することができる。この形質転換も常法、たとえば
Molecular Cloning (J.Sambrook, E.F.Fritsch, T.Mani
atis著 Cold Spring Harbor Laboratory Press発行)やD
NA Cloning Vol.I〜111 (D.M.Glover編 IRL PRESS発
行) などに記載された、CaCl2 法やプロトプラスト
法により行うことができる。本発明の変異型酵素を製造
するには、上記の形質転換された宿主を培養し、その培
養物から常法に従って、例えば塩析、有機溶剤沈澱、ゲ
ル濾過、アフィニティクロマトグラフィー、疎水クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により
回収精製することができる。
ニル二燐酸を製造する方法を提供する。この方法におい
ては、媒体、特に水性媒体中で、本発明の酵素とを反応
せしめ、所望により反応媒体から目的とするプレニル二
燐酸を採取すればよい。酵素としては、精製酵素のみな
らず、種々の段階まで半精製して得られる粗酵素、又は
培養菌体もしくは培養物等の酵素含有物でもよい。ま
た、前記の酵素、粗酵素又は酵素含有物を常法に従って
固定した固定化酵素であってもよい。基質としては、目
的とするプレニル二燐酸の炭素数に炭素原子数が少ない
例えば、5〜20位、好ましくは5個少ないプレニル二
燐酸とイソペンテニル二燐酸とが用いられる。反応媒体
としては水又は水性緩衝液、例えばリン酸緩衝液等が用
いられる。
説明する。なお、以下の実施例において使用する材料
は、いずれも下記のごとく当業者にとって容易に入手可
能である。スクリーニング用宿主として出芽酵母サッカ
ロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)
C296−LH3株(Tzagoloff, A. and Dieckmann,
C.L.(1990) Microbiological Reviews 54, 211-255, Tz
agoloff, A. et al.(1075)J.Bacteriol. 122, 826-831
)を用いた。
ル用プラスミドとしてはpG3/T1(Tzagoloff, A.
and Dieckmann, C.L.(1990) Microbiological Reviews
54,211-255, Tzagoloff, A. et al.(1975) J.Bacterio
l. 122, 826-831, Ashby, M.N. and Edwards, P.A.(199
0) J.Biol.Chem. 265, 13157-13164)またはpG3/T
1からHPSコード領域以外の部分を取り除いたプラス
ミドYEpG3ΔSpH(Ashby, M.N. and Edwards,
P.A.(1990) J.Biol.Chem. 265, 13157-13164 )を用い
た。
tEよりcrtE遺伝子部分(Misawa, N. et al.(199
0) J.Bacteriology 172, 6704-6712 )を取り除いたY
−PGKを用いた。ポジティブコントロールコロニー用
に使用する野生型株は、サッカロミセス・セレビシエー
A451株を用いた。ただし、本発明に必要な実験材料
は上記のみに限定されるものではなく、全く同様な代替
品として以下のものも使用できる。
H3株は、HPS遺伝子欠損株を作出すれば充分であ
る。つまり、広く用いられている出芽酵母野生株を、既
に知られている出芽酵母HPS遺伝子配列( GenBankTM
/EMBL Data Bank accession number(s) JO5547 )を利
用しPCR法により容易に出芽酵母HPS遺伝子断片が
得られる。この遺伝子断片を例えばpRS403、pR
S404、pRS405、pRS406(Strategene社
から入手可能)の様な酵母組込み型プラスミド(Yl
p)と結合して用いれば、広く行われている相同性組換
えを利用した遺伝子破壊法によって、容易にHPS遺伝
子欠損株を作出できる。
ドもこの遺伝子断片を良く知られる出芽酵母発現ベクタ
ー、pYEUra3(Clonetech社から入手可能)、pY
ES2(Invitrogen社から入手可能)等を用い挿入すれ
ば十分である。ポジティブコントロールコロニー用に使
用する株は特にA451株に限定されず、HPS野生型
遺伝子を保持している他の株で十分である。また、ライ
ブラリ作製用発現ベクターは、市販の例えばClonetech
社製のpYEYra3やInvitrogen社製のpYES2等
を用いれば十分である。LKC−18逆相薄層クロマト
グラフィープレートは Wattman Chemical Separation,
Inc.から購入した。〔1−14C〕IPPは、Amersham社
から購入した。
TTTGAC−3′(配列番号:7)と5′−GATACAAGCTTTAT
TTTCTCC −3′(配列番号:8)を用いて、PCR法に
より新しいHindIII 制限酵素部位をスルホロバス・
アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius) の
GGPS遺伝子( GenBankTM/EMBL Data Bank accessi
on number(s) D28748 )上流及び下流に導入した。PC
R法の鋳型DNAとしては、アメリカンタイプカルチャ
ーコレクション(ATCC)より、ATCC33909
として入手可能なスルホロバス・アシドカルダリウス
(Sulfolobus acidocaldarius) より常法に従ってDN
Aを精製し、クローニングしたものを用いた。
III で切断しプラスミド pBluescript(KS+ )のHi
ndIII 部位にライゲーションし、これをpBS−GG
PSとした。プラスミドY−crtEをHindIII で
切断してcrtE遺伝子部分を取り除き、残りのPGK
プロモーターとPGKターミネーターを含む部分をセル
フライゲーションした。これを、Y−PGKとする。p
BS−GGPSをHindIII で切断しGGPS遺伝子
を含むインサート部分を、Y−PGKのHindIII 部
位に挿入した。これをY−GGPSとする。
処理 Myersら (Myers, R.M. et al.(1985) Science 229, 242
-247 )の方法に従って亜硝酸を用いてGGPS遺伝子
コード領域にランダム変異を導入した。ヘルパーファー
ジM13KO7感染によってpBS−GGPSを含む大
腸菌から一本鎖DNAを単離し、これを1Mの亜硝酸ナ
トリウムで60分処理した。その後、T7プロモーター
部分の配列に相当する化学合成DNA5′−CCCCCCTCGA
GGTCGACGGTATCGATAA−3′(配列番号:9)を用いてプ
ライマーとして相補鎖を合成した。GGPS遺伝子部分
を制限酵素HindIII で切り出し、Y−PGKのHi
ndIII 部位に導入し、大腸菌XL1−Blue株に形
質転換しライブラリーとした。
グ Ashbyら (Ashby, M.N. and Edwards, P.A.(1990) J.Bio
l.Chem. 265, 13157-13164 )の方法に従って、スフェ
ロプラスト法で出芽酵母サッカロミセス・セレビシエー
(Saccharomyces cerevisiae)を形質転換した。すな
わち、HPS欠損株C296−LH3を先述のプラスミ
ドライブラリーで形質転換し、トップアガー(3%バク
ト−アガー、0.67%イースト・ナイトロジェン・ベ
ース、0.05%酵母エクストラクト、0.05%バク
ト・ペプトン、1.0Mソルビトール、2%グルコー
ス)法を用いてロイシン欠失寒天培地(leu- plate )に
重層し、培養した。
EPG(1%酵母エクストラクト、2%エタノール、2
%バクト・ペプトン、3%グリセロール)とD(1%酵
母エクストラクト、2%エタノール、2%バクト・ペプ
トン、3%グリセロール、0.1%グルコース)とYP
D(1%酵母エクストラクト、2%バクト・ペプトン、
2%グルコース)の各寒天培地に接種し30℃で3日間
培養した。変異型GGPSを含むプラスミドで形質転換
したC296−LH3のうち、YEPG寒天板上で成育
し、D寒天板上で、形質転換していないC296−LH
3より大きなコロニーを形成するクローンを選択した。
子伝達鎖が機能しているということ、つまり、機能しう
る補酵素QがC296−LH3細胞中で合成されたこと
を示していると考えられる。1400の形質転換体か
ら、このような相補された表現型を持つクローンが5つ
得られた。得られた5つのクローンを再試験した結果、
それらはYEPG寒天板上で成育できるだけでなく、D
寒天板上で、酵母由来のHPS遺伝子を含むプラスミド
を有するYEpG3ΔSpH/C296−LH3より明
らかに大きなコロニーを形成できる能力を持っていた。
上記5つのクローンについて常法に従ってプラスミドD
NAを精製した。
t1,Y−GGPSmut2,Y−GGPSmut3,
Y−GGPSmut4及びY−GGPSmut5とし
た。なお、酵母C296−LH3株は、HPS活性を欠
損しているためにヘキサプレノール(hexaprenol)基を
側鎖に持つ補酵素Q6(coenzyme Q6 )を生合成できな
い。補酵素Q6は、非発酵性糖代謝に必要なので、C2
96−LH3は少量のグルコースを含む培地上では野生
株より小さなコロニーを形成し、炭素源としてグリセロ
ールの様な非発酵性基質しか含まない培地上では成育で
きない。変異活性をスクリーニングする前に、スルホロ
バス・アシドカルダリウス(S. acidocaldarius)由来
の野生型GGPSのC296−LH5での発現の効果を
調べた。
含むプラスミドを有するC296−LH5株であるY−
GGPS/C296−LH3株は、酵母由来のHPS遺
伝子を含むプラスミドを有するYEpG3ΔSpH/C
296−LH3とプラスミドを持たないC296−LH
3との中間であるが明らかにYEpG3ΔSpH/C2
96−LH3より小さいコロニーを形成することがわか
った。しかし、Y−GGPS/C296−LH3はYE
PG寒天板上では成育できなかった。そこで、このスク
リーニング方法は有用であることが確認された。
析 精製した5種のプラスミドに含まれる5つの変異型GG
PSをコードするDNA断片の塩基配列を、ダイデオキ
シ・チェイン・ターミネーション法でパーキンエルマー
社製373A蛍光DNAシークエンサーを用いて決定し
た。塩基配列の解析は、遺伝情報解析ソフトウェア Mac
MollyTetraを用いて行なった。
るアミノ酸置換部位を図1に示す。選抜された全ての変
異体に塩基配列レベルで置換部位が見いだされた。Y−
GGPSmut1挿入断片であるMutant1では8
5位の変異Met→Ileと199位の変異Arg→L
ysと312位の変異Asp→Asn、Y−GGPSm
ut2挿入断片であるMutant2では118位の変
異Phe→Leu、Y−GGPSmut3挿入断片であ
るMutant3では77位の変異Phe→Ser、Y
−GGPSmut4挿入断片であるMutant4では
77位の変異Phe→Leuと99位の変異Val→M
et、そしてY−GGPSmut5挿入断片であるMu
tant5では77位の変異Phe→Serと101位
の変異Tyr→His、の各アミノ残基置換が見いださ
れた。
芳香族アミノ酸残基に置換されている割合が高い。特に
77番目のPheが伸長反応に最も顕著な影響がある。
77番目のPheは、アスパラギン酸−richドメイ
ンI(aspartate-rich domain I )の5残基N末端側上
流に位置している。プレニルトランスフェラーゼには共
通に見られる2つのアスパラギン酸−richドメイン
モチーフ(DDXX(XX)D)がある。ここに、基質の二燐酸
部分が結合すると考えられている。本発明で初めて注目
されたこのアスパラギン酸−richドメインIの5残
基N末端側上流のアミノ酸残基が反応産物の鎖長の決定
に非常に重要であると考えられる。
−GGPSmut1/C296−LH3,Y−GGPS
mut2/C296−LH3,Y−GGPSmut3/
C296−LH3,Y−GGPSmut4/C296−
LH3、及びY−GGPSmut5/C296−LH
3)から、Itohら(Itoh, N. et al.(1984) J.Biol.Che
m. 259, 13923-13929 )の方法にしたがって粗抽出液を
調製した。
養した。約400μgの菌体を遠心により集菌し800
μlの buffer A(50mM Tris・HCl pH7.
5、5mM MgCl2 、50mMジチオスレイトール、1
Mソルビトール)で1回洗った。菌体を1.2mMの buf
fer B(50mM Tris・HCl pH7.5、5mM
MgCl2 、3mMジチオスレイトール、1Mソルビトー
ル)に懸濁し、0.8mgの zymolyase 20T(生化学工業
製)を加え、30℃で1時間インキュベーションした。
buffer Bで3回洗い1mlの buffer C(50mM Tr
is・HCl pH7.0、10mM 2−メルカプトエタ
ノール、1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド、1
mM EDTA)で懸濁した。懸濁液をBranson Sonifier
を用い出力最大で10秒処理を2分の間隔をおいて氷中
で10回超音波処理した。溶菌液を55℃で1時間イン
キュベーションして宿主由来のプレニルトランスフェラ
ーゼ活性を失活させた後、10,000×gで10分遠
心した。得られた上清を変異型GGPS粗酵素液としプ
レニルトランスフェラーゼ活性のアッセイに使用した。
この、酵母から調製した変異型GGPS粗酵素液を用い
て、PTase活性のアッセイをLKC−18薄層クロ
マトグラフィーにより行なった結果を図2及び図3に示
す。
ニル二燐酸を1−ブタノールで抽出し、窒素ガス流で1
−ブタノールを蒸発させた。得られたポリプレニル二燐
酸をFujiiら(Fujii et al.(1982) Biochim.Biophys.Ac
ta 712, 716-718)方法にしたがって酸性フォスファタ
ーゼ(acid phosphatase) 処理した。加水分解産物をペ
ンタンで抽出しアセトン/H2 O(9:1)を展開液と
したLKC−18薄層クロマトグラフィーを行なった
後、富士写真フィルム製BAS2000 Bio-image analyzerで
放射活性の分布を解析した。オーセンティックスタンダ
ードとして同時に薄層クロマトグラフィーを行なったア
ルコール(ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲ
ラニオール)は、ヨウ素蒸気で展開位置を検出した。
E)−FPPを基質として反応した結果であり、図3
は、〔1−14C〕IPPと(all−E)−GGPPを
基質として反応した結果である。スポットa〜cはオー
センティックスタンダードサンプルで、aはゲラニオー
ル、bは(all−E)−ファルネソール、cは(al
l−E)−ゲラニルゲラニオールを示す。Oriは展開
開始点、S.F.は展開液先端を示す。
Pを使用した場合、各変異型GGPSは野生型酵素の反
応産物より1イソプレン単位長いゲラニルファルネシル
二燐酸(geranylfarnesyl diphosphate :GFPP) を合成
できることが示された。一方野生型GGPSは検出可能
なレベルの、GGPPより長鎖長の反応産物は合成する
ことができない。アリル性基質としてFPPを使用した
場合、変異型GGPSが示すGGPP/GFPP反応産
物比は各変異型GGPSにより異なっていた。
調製 さらに、正確に解析するため、大腸菌XL1−Blue
株で得られた各変異型GGPSを過剰発現させた。すな
わち、スクリーニングで得られた5つのプラスミドY−
GGPSmut1,Y−GGPSmut2,Y−GGP
Smut3,Y−GGPSmut4,Y−GGPSmu
t5のそれぞれをHindIII で消化し変異型GGPS
をコードするHindIII DNA断片を得た。これら
の、HindIII DNA断片をプラスミドベクター pBl
uescript(KS+ )のHindIII部位に挿入し、それ
ぞれpBS−GGPSmut1,pBS−GGPSmu
t2,pBS−GGPSmut3,pBS−GGPSm
ut4,pBS−GGPSmut5とした。
Smut1,pBS−GGPSmut2,pBS−GG
PSmut3,pBS−GGPSmut4,pBS−G
GPSmut5で形質転換しMolecular Cloning (Sambr
ook, J. et al.(1989) Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York) に記載の方法に従って
培養した。集菌後、10mM 2−メルカプトエタノール
と1mM EDTAを含む50mM Tris・HCl緩衝
液中で超音波破砕した。ホモジェネートを55℃で1時
間熱処理した後、100,000×gで10分間遠心し
た。上清を粗酵素液としPTase活性のアッセイに使
用した。
ラフィーによる生成物の分析と、酵素活性の測定により
行った。薄層クロマトグラフィーにおいては、アリル性
基質として、DMAPP,GPP,(all−E)−F
PP、及び(all−E)−GGPPを用い、実施例5
と同様に反応させた後、実施例5と同様にしてLKC−
18薄層クロマトグラフィーを行った。結果を図4及び
図5に示す。
MAPPを基質として反応した結果であり、(B)は、
〔1−14C〕IPPとGPPを基質として反応した結果
である。図5の(C)は、〔1−14C〕IPPと(al
l−E)−FPPを基質として反応した結果であり、
(D)は〔1−14C〕IPPと(all−E)−GGP
Pを基質として反応した結果である。スポットa〜cは
オーセンティックスタンダードサンプルで、aはゲラニ
オール、bは(all−E)−ファルネソール、cは
(all−E)−ゲラニルゲラニオールを示す。Ori
は展開開始点、S.F.は展開液先端を示す。
sferase ;PTase )活性のアッセイは次のようにして行
った。25nmol〔1−14C〕IPP(37 GBq/mol
)、25nmolアリル性基質(DMAPPまたはGPP
または(all−E)−FPPまたは(all−E)G
GPP)、5μmol MgCl2 、10μmol 燐酸緩衝液
(pH5.8)とアッセイ用酵素液を含む1mlのアッセイ
混合液を55℃で60分インキュベーションした。
た。混合液に水飽和した3.5ml 1−butanol を加
え、攪拌後、1−butanol 層をNaCl飽和水で洗い14
C放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定し
た。酵素活性1unitは1nmolの〔1−14C〕IPPを1
−butanol 層で抽出可能な伸長したプレニル二燐酸(ポ
リプレニル二燐酸)に取り込む量と定義した。結果を表
1及び表2に示す。
長のポリプレニル二リン酸合成活性を示した。野生型G
GPS、各変異型GGPSともに、4つのアリル性基質
のうちDMAPPと良く反応し、また、FPPより短鎖
長の各アリル性基質を用いたときの相対活性は同様の値
を示した。しかし、アリル性基質としてGGPPを用い
たときの相対活性や、反応産物の分布はそれぞれ大きく
異なっていた。
ンサートDNAがコードするMutant1は、DMA
PP,GPP,FPPをアリル性基質としたとき、GF
PPとGGPPが主反応産物となる。なかでもDMAP
Pをアリル性基質としたときは、わずかにヘキサプレニ
ル二燐酸(hexaprenyl diphosphate;HPP )が反応産物
として検出された。反応産物の分布は各アリル性基質に
より異なっていたが、1回の縮合反応でできる産物の割
合が高かった。pBS−GGPSmut2プラスミドの
インサートDNAがコードするMutant2は、GG
PPが主反応産物で、GFPPの割合は10%程度だっ
た。HPPは、検出されなかった。
ンサートDNAがコードするMutant3とpBS−
GGPSmut5プラスミドのインサートDNAがコー
ドするMutant5は、同様の特徴を示した。GFP
P合成活性が強く、HPPも少し合成する。pBS−G
GPSmut4プラスミドのインサートDNAがコード
するMutant4は、GGPPが主反応産物で、GF
PPの割合は15%程度だった。GPPをアリル性基質
としたときは、FPPが効果的に合成された。
obus acidocaldarius) 配列: ATG AGT TAC TTT GAC AAC TAT TTT AAT GAG ATT GTT AAT TCT GTA AAC 48 Met Ser Tyr Phe Asp Asn Tyr Phe Asn Glu Ile Val Asn Ser Val Asn 5 10 15 GAC ATT ATT AAG AGC TAT ATA TCT GGA GAT GTT CCT AAA CTA TAT GAA 96 Asp Ile Ile Lys Ser Tyr Ile Ser Gly Asp Val Pro Lys Leu Tyr Glu 20 25 30 GCC TCA TAT CAT TTG TTT ACA TCT GGA GGT AAG AGG TTA AGA CCA TTA 144 Ala Ser Tyr His Leu Phe Thr Ser Gly Gly Lys Arg Leu Arg Pro Leu 35 40 45 ATC TTA ACT ATA TCA TCA GAT TTA TTC GGA GGA CAG AGA GAA AGA GCT 192 Ile Leu Thr Ile Ser Ser Asp Leu Phe Gly Gly Gln Arg Glu Arg Ala 50 55 60 TAT TAT GCA GGT GCA GCT ATT GAA GTT CTT CAT ACT TTT ACG CTT GTG 240 Tyr Tyr Ala Gly Ala Ala Ile Glu Val Leu His Thr Phe Thr Leu Val 65 70 75 80 CAT GAT GAT ATT ATG GAT CAA GAT AAT ATC AGA AGA GGG TTA CCC ACA 288 His Asp Asp Ile Met Asp Gln Asp Asn Ile Arg Arg Gly Leu Pro Thr 85 90 95 GTC CAC GTG AAA TAC GGC TTA CCC TTA GCA ATA TTA GCT GGG GAT TTA 336 Val His Val Lys Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Ile Leu Ala Gly Asp Leu 100 105 110 CTA CAT GCA AAG GCT TTT CAG CTC TTA ACC CAG GCT CTT AGA GGT TTG 384 Leu His Ala Lys Ala Phe Gln Leu Leu Thr Gln Ala Leu Arg Gly Leu 115 120 125 CCA AGT GAA ACC ATA ATT AAG GCT TTC GAT ATT TTC ACT CGT TCA ATA 432 Pro Ser Glu Thr Ile Ile Lys Ala Phe Asp Ile Phe Thr Arg Ser Ile 130 135 140 ATA ATT ATA TCC GAA GGA CAG GCA GTA GAT ATG GAA TTT GAG GAC AGA 480 Ile Ile Ile Ser Glu Gly Gln Ala Val Asp Met Glu Phe Glu Asp Arg 145 150 155 160 ATT GAT ATA AAG GAG CAG GAA TAC CTT GAC ATG ATC TCA CGT AAG ACA 528 Ile Asp Ile Lys Glu Gln Glu Tyr Leu Asp Met Ile Ser Arg Lys Thr 165 170 175 GCT GCA TTA TTC TCG GCA TCC TCA AGT ATA GGC GCA CTT ATT GCT GGT 576 Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ser Ser Ser Ile Gly Ala Leu Ile Ala Gly 180 185 190 GCT AAT GAT AAT GAT GTA AGA CTG ATG TCT GAT TTC GGT ACG AAT CTA 624 Ala Asn Asp Asn Asp Val Arg Leu Met Ser Asp Phe Gly Thr Asn Leu 195 200 205 GGT ATT GCA TTT CAG ATT GTT GAC GAT ATC TTA GGT CTA ACA GCA GAC 672 Gly Ile Ala Phe Gln Ile Val Asp Asp Ile Leu Gly Leu Thr Ala Asp 210 215 220 GAA AAG GAA CTT GGA AAG CCT GTT TTT AGT GAT ATT AGG GAG GGT AAA 720 Glu Lys Glu Leu Gly Lys Pro Val Phe Ser Asp Ile Arg Glu Gly Lys 225 230 235 240 AAG ACT ATA CTT GTA ATA AAA ACA CTG GAG CTT TGT AAA GAG GAC GAG 768 Lys Thr Ile Leu Val Ile Lys Thr Leu Glu Leu Cys Lys Glu Asp Glu 245 250 255 AAG AAG ATT GTC CTA AAG GCG TTA GGT AAT AAG TCA GCC TCA AAA GAA 816 Lys Lys Ile Val Leu Lys Ala Leu Gly Asn Lys Ser Ala Ser Lys Glu 260 265 270 GAA TTA ATG AGC TCA GCA GAT ATA ATT AAG AAA TAC TCT TTA GAT TAT 864 Glu Leu Met Ser Ser Ala Asp Ile Ile Lys Lys Tyr Ser Leu Asp Tyr 275 280 285 GCA TAC AAT TTA GCA GAG AAA TAT TAT AAA AAT GCT ATA GAC TCT TTA 912 Ala Tyr Asn Leu Ala Glu Lys Tyr Tyr Lys Asn Ala Ile Asp Ser Leu 290 295 300 AAT CAA GTC TCC TCT AAG AGT GAT ATA CCT GGA AAG GCT TTA AAA TAT 960 Asn Gln Val Ser Ser Lys Ser Asp Ile Pro Gly Lys Ala Leu Lys Tyr 305 310 315 320 CTA GCT GAA TTT ACG ATA AGA AGG AGA AAA TAA 993 Leu Ala Glu Phe Thr Ile Arg Arg Arg Lys TER 325 330
来のゲラニルゲラニル二燐酸合成酵素の遺伝子中の本発
明の変異部位を示す。図中矢印は2つのアスパラギン酸
−richドメインを示す。
型酵素系を基質IPP及び(all−E)−FPPに作
用させた場合の生成物を示す薄層クロマトグラフィー図
であり、図面代用写真である。
型酵素を基質IPP及び(all−E)−GGPPに作
用させた場合の生成物を示す薄層クロマトグラフィー図
であり、図面代用写真である。
れた本発明の変異型酵素を基質IPPとDMAPPに作
用させた場合、(B)は基質IPPとGPPに作用させ
た場合の生成物を示す薄層クロマトグラフィー図であ
り、図面代用写真である。
れた本発明の変異型酵素を基質IPPと(all−E)
−FPPに作用させた場合、(D)は基質IPPと(a
ll−E)−GGPPに作用させた場合の生成物を示す
薄層クロマトグラフィー図であり、図面代用写真であ
る。
Claims (6)
- 【請求項1】 スルホロバス・アシドカルダリウス(Su
lfolobus acidocaldarius) 由来のゲラニルゲラニル二
燐酸合成酵素において、下記(1)〜(5)のいずれか
一組の変化: (1) 85 位の Met → Ile 、 199 位の Arg → Lys 、及び 312 位の
Asp → Asn の変化; (2) 118 位の Phe → Leu の変化; (3) 77 位の Phe → Ser の変化; (4) 77 位の Phe → Leu 、及び 99 位の Val → Met の変化;又
は (5) 77 位の Phe → Ser 、及び 101 位の Tyr → His の変化; を有し 、且つ炭素数25個以上のプレニル二燐酸を生成せ
しめることができる変異型酵素。 - 【請求項2】 請求項1に記載の酵素をコードする遺伝
子。 - 【請求項3】 請求項2に記載の遺伝子を含んで成る発
現ベクター。 - 【請求項4】 請求項3に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。 - 【請求項5】 請求項1に記載の酵素の製造方法におい
て、請求項4に記載の宿主を培養することを特徴とする
方法。 - 【請求項6】 請求項1に記載の酵素又は請求項5に記
載の方法により製造される酵素を、イソペンテニル二燐
酸、ジメチルアリル二燐酸、ゲラニル二燐酸、ファルネ
シル二燐酸、ゲラニルゲラニル二燐酸から成る群から選
択される基質に作用せしめることを特徴とする炭素数25
以上のプレニル二燐酸の製造方法。
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