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JP3530186B2 - 共有架橋オリゴヌクレオチド - Google Patents

共有架橋オリゴヌクレオチド

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JP3530186B2
JP3530186B2 JP51594893A JP51594893A JP3530186B2 JP 3530186 B2 JP3530186 B2 JP 3530186B2 JP 51594893 A JP51594893 A JP 51594893A JP 51594893 A JP51594893 A JP 51594893A JP 3530186 B2 JP3530186 B2 JP 3530186B2
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野 本発明は、オリゴヌクレオチドのための共有結合に関
する。該共有結合は、２つのオリゴヌクレオチドを接続
するか、またはひとつのオリゴヌクレオチド鎖の異なる
領域を接続するが、該接続は、第１鎖または第１鎖領域
上の糖部分を他方の鎖または鎖領域上のヌクレオチドに
伸ばす空間スパニング基による。 発明の背景 相補的オリゴヌクレオチドの間の架橋に関するいくつ
かの報告例がある。このような架橋の目的は、しばしば
核酸の機能を破壊することであり、最初に標的を分断す
る。紫外線暴露を用いて位置的に制御できない様式によ
り核酸を架橋することは知られている。しかしながら、
GrinevaとKarpova、FEBS.,1973,32,351−355は、制御さ
れた化学的手法により特定の部位でオリゴヌクレオチド
の相補鎖を共有架橋した最初の例である。ナイトロジェ
ンマスタードを、アセタール結合によりオリゴヌクレオ
チドの3'末端リボースユニットに付着させるか、または
ホスホルアミド結合によりオリゴヌクレオチドの5'末端
に付着させた。ハイブリダイゼーションの際に、グアニ
ンまたはアデニンの７位の第三ヘテロ芳香性窒素原子の
アルキル化を通して、反応性マスタードが相補鎖に共有
結合される。しかしながら、そうして形成されたアルキ
ル化塩基は第四荷電種であり、該種はイミダゾール環の
開裂、および続く標的鎖の分断による迅速な化学的分解
に供される。 酵素は、核酸からアルキル化塩基を除去することが知
られている。事実、そのような酵素による除去は、DNA
修復機構において包含される。標的であるアルキル化核
酸の破壊は、理論的には抗微生物または抗腫瘍治療に利
用されうる。しかしながら、架橋アルキル化反応および
続く分解は、宿主細胞の生存を必要とする場合に望まし
くない。 SummertonとBartlettは、別の種類のアルキル化オリ
ゴヌクレオチドを提案しており、シチジンヌクレオチド
の４位に付着したα−ブロモメチルケトが主要グループ
を広げて標的鎖中の相補的グアニン残基の７位をアルキ
ル化する［J.Mol.Biol.,1978,122,145−162;J.Theor.Bi
ology,1979,78,61−75,および米国特許第４、123、610
号を参照されたい］。上記のナイトロジェンマスタード
のように、このアルキル化は標的核酸鎖の分断に作用す
る電荷種を生じる。 グアニンの７位への共有架橋のさらなる例は、Meyer
ら、J.Am.Chem.Soc.,1989,111,8517に記載されている。
この著者らは、ヨードアセトアミドプロピル部分をDNA
のチミジンヌクレオチドの５位に付着させた。次に、ヨ
ードアセトアミドプロピル部分は、相補鎖の２塩基下流
の位置のグアニンヌクレオチドの７位をアルキル化し
た。標的鎖の分断は、さまざまな時間および温度におい
て観察された。 MatteucciとWebbは、ハイブリダイゼーションが引き
金となる架橋方法を記載しており、N6、N6−エタノ−ア
デニンまたはN4、N4−エタノシトシンが適当な位置で相
補鎖中の電子供与体をアルキル化する［Nucleic Acids
Res.,1986,14,7661;Tetrahedron Letters,1987,28,2
469−2472を参照されたい］。この方法は、安定な付加
物を形成するか、または加水分解あるいは酵素分解の何
れかにより、標的DNAの正常な機能を不活性化するよう
にデザインされた。 上記N6、N6−エタノ結合と同様な架橋は、Ferentz
ら、J.Am.Chem.Soc.,1991,113,4000に記載されており、
著者らは、エチルジスルフィドまたはプロピルジスルフ
ィドの何れかを利用して自己相補的オリゴヌクレオチド
上にアデニン残基のN6位を接続させた。 Leeら、Biochemistry,1988,27,3197−3203は、一本鎖
DNAを用いたプソラレン−誘導化メチルホスホネートオ
リゴヌクレオチドの相互作用を記載している。この方法
によれば、照射は架橋に作用して、架橋はひるがえって
DNAを不活性化する。プソラレン架橋はピリミジン塩基
間のみで生じ、一本鎖を連結するかまたはより一般には
二本鎖構造を連結する。 核酸上に脱塩基部位を生成させることは、上述のアル
キル化塩基を核酸から酵素的に除去することに含まれて
きた。Monoharan,et.al.,J.Am.hem.Soc.,1987,109,7217
および、Monoharan,et.al.,J.Am.hem.Soc.,1988,110,26
90は、13CNMRスペクトルを用いて、オリゴヌクレオチド
中の脱塩基部位の特徴づけを行った。また、脱塩基部位
を核酸上に形成して、インターカレーターである９−ア
ミノエリプチシンを核酸に結合させた。Vasseur,et.a
l.,Nucleosides ＆ Nucleotides,1989,8,863−866
は、トリマーTp（Ap）Pt（ここで（Ap）は脱プリン部位
である）をインターカレーターである９−アミノエリプ
チシンと反応させたときに、生成物の混合物が得られる
ことを報告している。この反応は、脱プリン部位と９−
アミノエリプチシンとの間に望ましいシッフ塩基付加物
を生成したが、また、ホスフェート主鎖の開裂も生じ
た。この仕事は、Bertrand,et.al.,Nucleic Acids Re
search,1989,17,10307により、９−アミノエリプチシン
と13merオリゴヌクレオチドとの相互作用に拡張され
た。この13merオリゴヌクレオチドは、１つのプリンヌ
クレオチドのみを有していた。酸処理により、プリン塩
基が失われ、不安定な脱塩基部位が得られた。反応の間
のシッフ塩基付加物を減少させることにより、９−アミ
ノエリプチシンはオリゴヌクレオチド中の脱塩基部位に
うまく結合した。単一のプリン部位を有するオリゴヌク
レオチドを用いることにより、この著者は、インターカ
レーターである９−アミノエリプチシンをオリゴヌクレ
オチドに結合させる研究を行うことができた。しかし、
生物学的意義を有する配列に結合するオリゴヌクレオチ
ドが単一のプリン部位のみを含むことはありそうにもな
い。 脱塩基ヌクレオシド前駆体を合成的にオリゴヌクレオ
チドに取り込ませることにより、他の脱塩基部位含有オ
リゴヌクレオチドが組み立てられている。例えば、Phil
ippe,et.al.,Tetrahedron Letters,1990,31,6347−635
0は、ペンタメチレン鎖を介してその1'位に結合した一
級アミン官能基を有する２−デオキシ−Ｄ−リボースを
取り込ませている。1,2−デオキシ−Ｄ−リボフラノー
スおよびブタン1,3−ジオールもまた同様にオリゴヌク
レオチドに取り込まれている（P.lyer,et.al.,Nucleic
Acids Research,1990,18,2855を参照のこと）。 Groehke,et.al.,Helvetica Chimica Acta,1990,73,
608は、（tert−ブチル）ジメチルシリル保護されたデ
オキシ−Ｄ−リボースの製造および固相技術を用いたオ
リゴヌクレオチドへの取り込みを報告している。Reoc'
h,et.al.,Tetrahedron Letters,1991,32,207は、他の
オリゴヌクレオチドの合成において１−（ｏ−ニトロベ
ンジル）−２−デオキシ−Ｄ−リボフラノースを用い
た。これらの化学的に生成された脱塩基部位は、架橋を
形成するためには用いられていない。 RNA模倣を用いた遺伝子発現の調節のための試薬およ
び方法と題した、出願PCT/US91/01822（1991年３月19日
出願）は、RNA構造を模倣するオリゴヌクレオチドの効
果的な使用を開示している。出願PCT/US91/01822（本出
願の出願人に譲渡されている）の全開示を、本明細書中
の一部としてここに引用する。PCT/US91/01822に開示さ
れるオリゴヌクレオチドは、遺伝子によりコードされる
RNAの一部分を模倣すべく選択される。RNA模倣オリゴヌ
クレオチドは、蛋白質−RNA相互作用を妨害することに
より、遺伝子発現を妨害または調節する。 RNAを模倣するためには、オリゴヌクレオチドはRNAの
二次構造および三次構造を仮定しかつ保持していなけれ
ばならない。通常はRNAをその二次構造および三次構造
に保持する物理学的および化学的な力は、実際には共有
結合性ではないが、RNA模倣体を必要な二次構造および
三次構造に固定する１つの方法は、その模倣体を共有結
合により架橋することである。しかし、現在のところ知
られている核酸鎖を架橋するための技術は、鎖の開裂や
構造またはワトソン・クリック水素結合の破壊をもたら
すか、または限定された特定の配列または配列中の特定
の位置においてのみ有用である。 ２つのオリゴヌクレオチド鎖の間、または単一の鎖の
領域中の架橋は、架橋が鎖を破壊しうるかまたはオリゴ
ヌクレオチドのコンホメーション構造を不当に変性させ
る場合には望ましくないだろう。また、架橋により架橋
された生成物が天然の核酸のコンホメーションを近似す
ることができない場合にもまた、架橋は望ましくないだ
ろう。従来技術においては、鎖を破壊せず、適当なコン
ホメーションを可能にし、種々の配列および配列中の種
々の位置において有用であり、天然に存在する核酸二重
鎖に見いだされる”チルト”および”プロペラツイス
ト”等の性質を正常な範囲に保ち得る架橋または架橋方
法についての示唆はない。したがって、核酸の架橋およ
び核酸の架橋方法についての長い間のニーズがあった。 本発明の目的 本発明の主要な目的は、改良された共有結合により架
橋された核酸およびその形成方法を提供することであ
る。 本発明の別の目的は、鎖上の１またはそれ以上の部位
において共有結合により互いに結合した個々のオリゴヌ
クレオチド鎖を提供することである。 本発明のまた別の目的は、鎖上の１またはそれ以上の
部位において共有結合によりそれ自身に結合した単一の
オリゴヌクレオチド鎖を提供することである。 本発明のまた別の目的は、架橋共有結合を介して特定
の空間コンホメーションに固定されたRNA模倣体を提供
することである。 本発明のまた別の目的は、核酸結合蛋白質用のレセプ
ターに結合する既知のヌクレアーゼ耐性模倣体と同一の
配列を有する、共有結合により架橋したオリゴヌクレオ
チドを提供することである。 本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書および
付随する請求の範囲から当業者には明らかになるであろ
う。 発明の簡単な説明 本発明に従うと、相補的オリゴヌクレオチド鎖の第一
の鎖かまたは単一オリゴヌクレオチド鎖上に位置する第
一のヌクレオチドを含む配列特異的で共有結合で架橋さ
れた核酸が提供される。架橋された核酸はさらに別の相
補的鎖の鎖上または、単一の鎖上の第一のヌクレオチド
に対し離れた部位に位置する第二のヌクレオチドをさら
に含んでいる。第一の結合手段は、第一のヌクレオチド
の糖部分に位置し、第二の結合手段は第二のヌクレオチ
ドの糖部分に位置している。共有結合による架橋は第一
と第二の結合手段を連結し、そうすることにより一本の
鎖または複数の鎖を架橋する。 本発明の一つの実施態様においては、第一および第二
のヌクレオチドは、各々単一のオリゴヌクレオチド鎖上
の第一および第二のヌクレオチド配列内に位置してい
る。最初の好適な実施態様においては、第一および第二
のヌクレオチド配列がお互いに特異的にハイブリダイズ
可能なコンホメーションをとることをオリゴヌクレオチ
ド鎖に可能にする距離だけ第二のヌクレオチド配列は第
一のヌクレオチド配列から離されている。さらなる好適
な実施態様においては、第一および第二のヌクレオチド
はハイブリダイズ不可能な部位に位置しているが第一お
よび第二のヌクレオチド間の架橋を可能にするには十分
な距離である。 本発明の好適な実施態様において、第一の結合手段は脱
塩基部位を含み、第二の結合手段は空間スパニング基を
含んでおり、それは順に脱塩基部位と共有結合で結合で
きる活性官能基を含んでいる。 本発明にさらに従うと、第一の相補的オリゴヌクレオ
チド鎖上に位置する第一のヌクレオチド、第二の相補鎖
上に位置する第二のヌクレオチド、第一のヌクレオチド
の糖部分に位置する第一の結合前駆体、第二のヌクレオ
チドの糖部分に位置する第二の結合前駆体および第一お
よび第二の鎖を架橋する第一および第二の結合前駆体を
連結する共有結合架橋を含む配列特異的架橋オリゴヌク
レオチドが提供される。本発明の好適な実施態様におい
て、第一のヌクレオチドは第一のヌクレオチド配列中に
位置しており、第二のヌクレオチドは第二のヌクレオチ
ド配列中に位置し、および第二のヌクレオチド配列は第
一のヌクレオチド配列に相補的であり特異的にハイブリ
ダイズ可能である。 さらに本発明に従うと、オリゴヌクレオチド鎖上に位
置する第一のヌクレオチドおよび同一のオリゴヌクレオ
チド鎖上に位置する第二のヌクレオチドを含む配列特異
的架橋オリゴヌクレオチドが提供される。第一および第
二のヌクレオチドはお互いのヌクレオチドが特異的にハ
イブリダイズするのに可能な距離だけ離れている。第一
の結合前駆体は第一のヌクレオチドの糖部分に位置して
おり、第二の結合前駆体は第二のヌクレオチドの糖部分
に位置している。共有結合による架橋は第一および第二
の結合前駆体を連結し第一および第二のヌクレオチドを
架橋している。好適な実施態様において第一のヌクレオ
チドは第一のヌクレオチド配列中に位置しており、第二
の特異的ヌクレオチドは第二のヌクレオチド配列に位置
し、第二のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列
に相補的でありハイブリダイズ可能である。さらなる好
適な実施態様においては、第一および第二のヌクレオチ
ドはハイブリダイズ不可能な部位に位置しているが、そ
れらの間で架橋結合が形成されるには十分な距離であ
る。 本発明に従うと、脱塩基部位を含む第一の配列領域お
よび空間スパニング基を含む第二の配列領域を含む架橋
オリゴヌクレオチドが提供される。活性官能基は、空間
スパニング基上に位置しており、脱塩基部位で共有結合
により結合されている。第一の好適な実施態様において
は、第一の配列領域および第二の配列領域は同じオリゴ
ヌクレオチド鎖上に存在する。さらに好適な実施態様に
おいては第一の配列領域および第二の配列領域は異なっ
たオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。これらの好適な
実施態様において第一の配列領域および第二の配列領域
は相補的であり、お互いに特異的にハイブリダイズ可能
である。好適な活性官能基はアミン、ヒドラジン、ヒド
ロキシルアミン、セミカルバジド、チオセミカルバジ
ド、ヒドラジド、チオールまたは、アルコールであり脱
塩基部位にはアルデヒド官能性が含まれる。 本発明に従った空間スパニング基には約１から約50原
子の長さの伸長された鎖が含まれている。空間スパニン
グ基は好適には約４から約20原子の長さの伸長された鎖
を含んでおり、より好適には約８から約13原子の長さの
鎖を含んでいる。 更に本発明に従うと第一の配列領域、第二の配列領域
及び構造： X1−L1−Ｙ−L2−X2 （式中X1は第一の配列領域に共有結合で連結されており
X2は第二の配列領域に共有結合で連結されており： （ｉ） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2またはC
Oであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキル、C1−C
20の直鎖置換アルキル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2
−C50の分岐鎖置換アルキル、C2−C20の直鎖アルケニ
ル、C2−C20の直鎖置換アルケニル、C3−C50の分岐鎖ア
ルケニル、C3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C2−C20の
直鎖アルキン、C2−C20の直鎖置換アルキン、C3−C50の
分岐鎖アルキン、C3−C50の分岐鎖置換アルキン、ポリ
アミン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレングリ
コール、ポリエーテル、アリール、アラルキルまたはヘ
テロ環式であり；および Ｙはイミン、アミン、オキシム、ヒドロキシルアミ
ン、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジド−ヒ
ドラゾン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジド、セミ
カルバゾン、チオセミカルバジド、チオカルバゾン、ジ
スルフィド、ヘミアセタール、チオヘミアセタール、α
−ケト−アルキルチオアルキルおよびα−ケト−アルキ
ルアミノアルキルであり；または （ii） X1およびX2は独立してＯまたはNHであり；およ
び L1−Ｙ−L2は一緒になってNH−L3−NHまたはNH−NH−
L3−NH−NHであり；および L3はC1−C20の直鎖アルキル、C1−C20の直鎖置換アル
キル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖置換
アルキル、C2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖置
換アルケニル、C3−C50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の
分岐鎖置換アルケニル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C
20の直鎖置換アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3
−C50の分岐鎖置換アルキン、ポリアミン、ポリアミ
ド、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリエー
テル、アリール、アラルキルまたはヘテロ環式であり；
または （iii） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2または
COであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキルアミ
ノ、C1−C20の直鎖置換アルキルアミノ、C2−C50の分岐
鎖アルキルアミノ、C2−C50の分岐置換アルキルアミ
ノ、C2−C20の直鎖アルケニルアミノ、C2−C20の直鎖置
換アルケニルアミノ、C3−C50の分岐鎖アルケニルアミ
ノ、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルアミノ、C2−C20の
直鎖アルキニルアミノ、C2−C20の直鎖置換アルキニル
アミノ、C3−C50の分岐鎖アルキニルアミノ、C3−C50の
分岐鎖置換アルキニルアミノ、C1−C20の直鎖アルキル
チオ、C1−C20の直鎖置換アルキルチオ、C2−C50の分岐
鎖アルキルチオ、C2−C50の分岐鎖置換アルキルチオ、C
2−C20の直鎖アルケニルチオ、C2−C20の直鎖置換アル
ケニルチオ、C3−C50の分岐鎖アルケニルチオ、C3−C50
の分岐鎖置換アルケニルチオ、C2−C20の直鎖アルキニ
ルチオ、C2−C20の直鎖置換アルキニルチオ、C3−C50の
分岐鎖アルキニルチオ、C3−C50の分岐鎖置換アルキニ
ルチオであり；および Ｙはヘテロ二官能性またはホモ二官能性架橋試薬であ
る； ここで前記置換アルキル、置換アルケニルおよび置換ア
ルキン部分の前記置換基はインターカレーター、コンジ
ュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリ
コール、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を促進する
基またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学的性質を促進
する基である）の共有結合で結合された連結基を含む架
橋オリゴヌクレオチドが提供される。 さらに本発明に従うと、第一の配列領域、第二の配列
領域、第一の配列領域中のヌクレオチドの2'位に連結さ
れた第一の空間スパニング基、第二の配列領域中のヌク
レオチドの2'位に連結された第一の空間スパニング基お
よび第一および第二の空間スパニング基を共有結合で連
結する結合部分を独立して含む架橋オリゴヌクレオチド
が提供される。好適な実施態様において結合部分は： −Ｎ＝CH、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−CH2−Ｎ（Ｒ）
−、−Ｏ−Ｎ＝CH−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−
Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−HC＝Ｎ−Ｎ＝CH
−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ
（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ
（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）
−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）＝CH−、−Ｎ（Ｒ）−
Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ
（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）＝CH−、−CH（OH）−Ｏ−
CH2−、−CH（OH）−Ｓ−CH2−、−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ
（Ｏ）−CH2−、−CH2−NH−Ｃ（Ｏ）−CH2−、または
−Ｓ−Ｓ−； （式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、アラルキル、
インターカレーター、コンジュゲート、ポリアミン、ポ
リアミド、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチ
ドの薬力学的性質を促進する基またはオリゴヌクレオチ
ドの薬物動力学的性質を促進する基である）である。 さらに本発明に従うと、固定したコンフィギュレーシ
ョン中に配列特異的オリゴヌクレオチドを固定する方法
が提供される。その方法にはオリゴヌクレオチドの第一
の部位（前記第一の部位は第一のヌクレオチド配列を持
っている）を選択することが含まれている。本方法はさ
らに、オリゴヌクレオチド中の第二の部位を選択するこ
とを含んでいる（前記第二の部位は第二のヌクレオチド
配列を持っている）。第一の結合前駆体が第一の部位の
第一のヌクレオチドの糖部分に結合されており、一方、
第二の結合前駆体が第二の部位の第二のヌクレオチドの
糖部分に結合されている。第一および第二の結合前駆体
間には共有結合による架橋結合が形成されている。好適
な実施例においては、第一のヌクレオチド前駆体の糖部
分上に第一の結合前駆体を導入するため、第一のヌクレ
オチド前駆体と試薬を反応させることにより第一の部位
に第一の結合前駆体が結合される。第一のヌクレオチド
前駆体は保護および活性化形に誘導され、第一の特異的
ヌクレオチド配列内に合成的に取り込まれる。第二のヌ
クレオチド配列は第一のヌクレオチド配列とは相補的で
ありハイブリダイズ可能でなければならない。 本方法の一つの実施例において、第一の結合前駆体は
脱塩基ヌクレオチドであり、第二の結合前駆体は第二の
ヌクレオチドの2'位に結合されている。この実施例にお
いては、第二の結合前駆体は脱塩基部位と反応して第一
のヌクレオチド配列と第二のヌクレオチド配列間にイミ
ン、オキシム、ヒドラゾン、ヒドラジド−ヒドラゾン、
セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ヘミアセタール
またはチオヘミアセタール結合を形成する。これらの結
合のあるものはアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジ
ン、ヒドラジド、セミカルバジド、またはチオセミカル
バジド結合に還元できる。 本方法の別の実施態様においては、第一の結合前駆体
は第一の結合前駆体は第一のヌクレオチドの2'位に結合
され、第二の結合前駆体は第二のヌクレオチドの2'位に
結合される。本実施例のために好適な結合には： −Ｎ＝CH、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−CH2−Ｎ（Ｒ）
−，−Ｏ−Ｎ＝CH−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−
Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−HC＝Ｎ−Ｎ＝CH
−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ
（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ
（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）
−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）＝CH−、−Ｎ（Ｒ）−
Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ
（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）＝CH−、−CH（OH）−Ｏ−
CH2−、−CH（OH）−Ｓ−CH2−、−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ
（Ｏ）−CH2−、−CH2−NH−Ｃ（Ｏ）−CH2−、または
−Ｓ−Ｓ−； （式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、アラルキル、
インターカレーター、コンジュゲート、ポリアミン、ポ
リアミド、ポリエチレングリコール、オリゴヌクレオチ
ドの薬力学的性質を促進する基またはオリゴヌクレオチ
ドの薬物動力学的性質を促進する基である）が含まれ
る。 本発明にさらに従うと、一本の配列特異的オリゴヌク
レオチド鎖を架橋するための方法が提供される。これら
の方法はオリゴヌクレオチド中の第一および第二のヌク
レオチド配列を選択し、第一のヌクレオチド内に脱塩基
ヌクレオチドを取り込ませ、第二の配列のヌクレオチド
の一つに結合前駆体を結合させ、脱塩基部位および結合
前駆体間に共有結合の架橋結合を形成させることを含ん
でいる。本方法の一つの実施態様においては、結合前駆
体が第二の配列のヌクレオチドの糖部分（好適には2'位
で）に結合される。好適な実施態様においては、脱塩基
部位はアルデヒド様官能基を含んでおり、結合前駆体は
アルデヒド様官能基とオキシム、イミン、ヒドラゾン、
ヒドラジド−ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカ
ルバゾン、ヘミアセタールまたはチオヘミアセタール結
合を形成できる官能基を含んでいる。第二のヌクレオチ
ド配列は好適には第一のヌクレオチド配列と相補的であ
り特異的にハイブリダイズ可能であるように選択され
る。 一本の配列特異的オリゴヌクレオチド鎖を架橋するた
めの別の方法には、オリゴヌクレオチド中の第一のヌク
レオチド配列および第二のヌクレオチド配列を選択する
ことが含まれている。第一のヌクレオチド配列のヌクレ
オチドの糖部分に第一の結合前駆体が結合され、第二の
ヌクレオチド配列のヌクレオチドの糖部分に第二の結合
前駆体が結合される。第一および第二の結合前駆体間に
共有結合による架橋結合が形成される。好適な実施態様
において、架橋結合はイミン、アミン、アミノアルキル
アミン、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、
ヒドラゾン、アジン、ヒドラジド−ヒドラゾン、アミ
ド、ヒドラジド、セミカルバジド、セミカルバゾン、チ
オセミカルバジド、チオカルバゾン、ジスルフィド、ヘ
ミアセタール、チオヘミアセタール、α−ケト−アルキ
ルチオアルキル、およびα−ケト−アルキルアミノアル
キル架橋結合である。別の好適な実施態様において、第
二のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と相補
的でありハイブリダイズ可能である。 本発明にさらに従うと、第一のオリゴヌクレオチド中
の第一のヌクレオチド配列および第二のオリゴヌクレオ
チド中の第二のヌクレオチド配列を選択する工程を含む
オリゴヌクレオチドの第一および第二鎖の架橋法が提供
される。本方法はさらに第一のヌクレオチド配列内に脱
塩基ヌクレオチドを取り込ませ、第二の配列のヌクレオ
チドに結合前駆体を結合させ、および脱塩基部位と結合
前駆体間に共有結合による架橋結合を形成させることを
含んでいる。好適な実施態様においては、第二のヌクレ
オチド配列は第一のヌクレオチド配列と相補的でありハ
イブリダイズ可能である。 さらに本発明に従うと、第一のオリゴヌクレオチド鎖
中の第一のヌクレオチド配列を選択し、第二のオリゴヌ
クレオチド鎖中の第二のヌクレオチド配列を選択し、第
一の配列のヌクレオチドの糖部分に第一の結合前駆体を
結合させ、第二の配列のヌクレオチドの糖部分に第二の
共有結合前駆体を結合させ、および第一と第二の結合前
駆体間で共有結合による架橋結合を形成させる工程を含
む第一と第二のオリゴヌクレオチドを架橋する方法が提
供される。好適な実施態様においては、第二のヌクレオ
チド配列は第一のヌクレオチド配列と相補的でありハイ
ブリダイズ可能である。 発明の詳細な説明 本発明の目的に従うと、新規の共有結合で架橋された
オリゴヌクレオチド鎖が開示される。好適にはそのよう
な鎖はそれらの全長の少なくとも一部が”二重鎖（dupl
ex）にされている”かまたは”相補的”である。本発明
の文脈において、術語”二重鎖”または”相補的鎖”ま
たは類似の術語は第一に、一つの鎖上の少なくとも一つ
のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列が他の鎖上に向
かい合ったヌクレオチドまたはヌクレオチド配列と相補
的であり、特異的にハイブリダイズ可能であるような二
つの別々の差を意味している。第二に、この術語はそれ
自身折りたたまれ、各々の配列領域中の相補的ヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な
距離にお互いに離れている一本鎖の二つの部分または配
列領域を意味している。折りたたまれ、自己ハイブリダ
イズした一本鎖は、そのようなハイブリダイゼーション
の結果としてヘアピンループ、ステムループ、内部ルー
プ、またはバルジ型構造を形成する。 さらに本発明の文脈において、術語”オリゴヌクレオ
チド”とは複数の連結されたヌクレオチド単位から形成
されるポリヌクレオチドを意味している。ある場合に
は、ヌクレオチドは天然に存在する塩基およびペントフ
ラノシル糖基から形成され、天然のヌクレオシド間ホス
ホジエステル結合により連結されている。術語”オリゴ
ヌクレオチド”はそれ故実際上天然に存在するサブユニ
ットから形成される天然または合成種を含んでいる。術
語”オリゴヌクレオチド”はまた、修飾されたまたは天
然に存在しないヌクレオチドサブユニットから形成され
た構造も含んでいる。修飾はヌクレオチドの塩基部分
上、ヌクレオチドの糖部分上またはひとつのヌクレオチ
ドから次への結合上になされうる。さらに、ヌクレオシ
ド間リン酸結合を置き換える連結基と共にヌクレオシド
単位が連結されているような修飾も可能である。本発明
の架橋とは区別されるべきヌクレオシド間連結基には、
−Ｏ−CH2−CH2−Ｏ−結合および新規ヌクレオチド類似
体と題され、1990年８月３日に出願された米国特許出願
第566,836号、およびバックボーン修飾オリゴヌクレオ
チド類似体と題され、1991年５月21日に出願された米国
特許第703,619号（両方とも本発明の譲受人に譲渡され
ている）に開示されているようなその他の新規結合が含
まれている。その他の修飾はヌクレオチドの糖、塩基ま
たはリン酸基になされうる。修飾の例は以下の米国特許
出願:RNA活性を検出および調節するための組成物および
方法と題され、1990年１月11日に出願された第463,356
号；遺伝子発現を検出および調節する糖修飾オリゴヌク
レオチドと第され、1990年８月13日に出願された第566,
977号；新規ポリアミン複合オリゴヌクレオチドと題さ
れ、1990年７月27日に出願された第558,663号；遺伝子
発現を検出および調節するヌクレアーゼ耐性ピリミジン
修飾オリゴヌクレオチドと題され、1991年７月27日に出
願された第558,806号およびRNA活性を検出および調節す
るための組成物および方法と題され、1991年１月11日に
出願されたPCT/US91/00243号に開示されている（全て本
発明の譲受人に譲渡されている）。全ての上に示した特
許出願の開示内容は引例としてここに含まれている。 本発明に関連して使用される場合、術語オリゴヌクレ
オチドは修飾糖部分、修飾塩基部分または修飾糖連結部
分のような修飾部分を含む構造を意味する。これらの修
飾部分は天然の塩基、天然の糖および天然の結合と同様
の様式で機能する。従って、本発明の文脈において、オ
リゴヌクレオチドは改変された塩基部分、改変された糖
部分、または改変された糖間結合を持っていてもよい。
これらの例としては以下のものがある：ホスホジエステ
ルヌクレオチド間結合の代わりに使用されたホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、またはホスホロアミデートヌ
クレオシド間結合；天然のプリンまたはピリミジン塩基
の代わりに使用されたデアザまたはアザプリンおよびピ
リミジン;5−または６−位に置換基を持つピリミジン塩
基;2−、６−または８−位に改変または代用置換基を持
つプリン塩基；または、その2'位に置換基を持つ糖、糖
の一つまたはそれ以上の水素原子の代わりの置換基、ま
たは炭素環式または非環式糖。オリゴヌクレオチドはま
た本発明の精神に矛盾しないその他の修飾を含んでいて
も良い。そのようなオリゴヌクレオチドは天然のオリゴ
ヌクレオチドと構造的に異なってはいるが機能的には交
換可能なものとして表わされる。全てのそのようなオリ
ゴヌクレオチドは所望のRNAまたはDNA鎖の機能を有効に
模倣する限り本発明に包含される。 さらに本発明の文脈において術語”架橋結合”、”架
橋”または”架橋する”からは、個々のヌクレオチドサ
ブユニットまたはヌクレオシド様修飾サブユニットを直
線的に連結するオリゴヌクレオチド構造のそれらの部
分、即ち、オリゴヌクレオチドの一次構造を決定する配
列中のヌクレオシド単位を連結する部分は特別に除かれ
ることが認識されるであろう。従って、”架橋結
合”、”架橋”または”架橋する”からはヌクレオシド
（並びに類似体）を連結する天然のホスホジエステル結
合、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の代わりに使
用されたホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、
メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロア
ミデートおよび−Ｏ−CH2−CH2−Ｏ−結合のような非天
然ヌクレオシド間結合が除かれる。本発明の文脈におい
て術語”架橋結合”、”架橋”または”架橋する”は単
一のオリゴヌクレオチド鎖またはいくつかのオリゴヌク
レオチド鎖にわたって、一つの鎖または複数の鎖を二次
およびより高次のきれいにならんだ構造に保つために創
られた”追加の”結合を意味している。一次、二次およ
びより高次の構造は、化学および生物学における核酸、
G.Michael BlackburnおよびMichael J.Gait編、Oxfor
d University Press、New York、1991、のような標
準的な参照テキストに定義されている。 本発明に従うと架橋は二重鎖構造中の別々のオリゴヌ
クレオチド鎖の固定、またはヘアピンループ、ステムル
ープ、内部ループ、バルジまたはその他のより高次のき
れいにならんだ構造の固定に用いられた。そのような固
定はオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与え、構
造依存性機能を最適化すると信じられている。二重鎖構
造においての一つまたは複数の鎖の固定はまた、タンパ
ク質の結合レセプターのヌクレアーゼ耐性模倣物を形成
することにより一本鎖核酸結合タンパク質の正常な機能
を破壊できる。決められた二次構造への一つまたは複数
の鎖の固定はまた、病気の細胞特にウイルスおよびレト
ロウイルスに感染した細胞に観察されるRNA二次構造を
模倣することを可能にする。そのようなRNAの模倣の詳
細な描写は、RNA模倣を通した遺伝子発現調節のための
試薬および方法と題され、1991年３月19日に出願された
PCT/US91/01822出願（本出願の譲受人に譲渡されてい
る）に開示されている。出願PCT/US91/01822の全内容は
ここに引例として含まれている。 決められた二次または他の高次の構造への多数のオリ
ゴヌクレオチド鎖または一本のオリゴヌクレオチド鎖
の”固定”は、本発明に従ってオリゴヌクレオチド鎖ま
たはオリゴヌクレオチドの架橋により達成される。一つ
の好適な実施例において、新規架橋結合は一つの鎖上の
ヌクレオチドまたはヌクレオシドペントフラノシル部分
と別の鎖上のヌクレオチドまたはヌクレオシドペントフ
ラノシル部分を連結する。別の好適な実施例において、
新規架橋結合は一本の鎖の第一の領域上のヌクレオチド
またはヌクレオシドペントフラノシル部分と同一の鎖の
さらに別の領域上のヌクレオチドまたはヌクレオシドペ
ントフラノシル部分を連結する。そのような”糖と糖”
の架橋結合はこれまで知られていない。本発明のさらに
別の実施態様において、新規架橋結合は一つのオリゴヌ
クレオチド鎖上の脱塩基部位と別の鎖上のさらに別の部
位を連結する。また、新規架橋結合は一本鎖の第一の領
域の脱塩基部位と一本鎖の別の領域の別の部位を連結す
る。オリゴヌクレオチド架橋結合のための結合部位とし
て脱塩基部位の使用もまたこれまで知られていない。 本発明のさらに別の実施態様において、本発明の新規
架橋結合は一つのオリゴヌクレオチド鎖上の末端糖また
は一本鎖の第一の領域とさらに別の鎖上のさらに別の部
位または一本鎖上のさらに別の領域を連結する。 本発明の一つの好適な架橋結合は一つのオリゴヌクレ
オチド鎖（または一本鎖の第一の領域）上のリボース糖
の2'−位と別の鎖（または一本鎖のさらに別の領域）上
のリボース糖の2'−位を連結する。この架橋結合は2'−
リボースと2'−リボースの架橋結合と考えられる。第二
の好適な架橋結合は一つのオリゴヌクレオチド鎖（また
は一本鎖の第一の領域）上の2'−リボース位と別の鎖
（または一本鎖のさらに別の領域）上のC1'−リボース
位（脱塩基部位）を連結する。この架橋結合は2'−リボ
ースとC1'−リボースの架橋結合と考えられる。第三の
好適な架橋結合は一つのオリゴヌクレオチド鎖上（また
は一本鎖の第一の領域上）の2'−リボース位と別の鎖
（または一本鎖のさらに別の領域）の3'−末端上のセコ
−リボース位を連結する。この架橋結合は2'−リボース
とセコ−リボースの架橋結合と考えられる。第四の好適
な架橋結合は一つのオリゴヌクレオチド鎖（または一本
鎖の第一の領域）上の2'−リボース位と別の鎖（または
一本鎖のさらに別の領域）の3'−末端上のヌクレオシド
糖の2'および3'ヒドロキシル位を連結する。この架橋結
合は2'−リボースと2',3'−OH−リボースの架橋結合と
考えられる。 2'−リボースと2'−リボースの架橋結合に対して現在
好適であるのは：ワトソン／クリックヌクレオチド塩基
対のヌクレオチド糖部分の2'−ヒドロキシル基（または
他の2'置換基）間の架橋結合；ヌクレオチド糖部分の2'
−ヒドロキシル基（または他の2'置換基）と反対側の鎖
の（5'−方向に）一つの塩基だけ移動したヌクレオチド
糖部分の2'−ヒドロキシル基（または他の2'置換基）間
の架橋結合；一つのらせんだけ移動したヌクレオチド間
の架橋結合；または、鎖に沿ってはお互いに離れている
が、しかし、高次構造においてはお互いに近くにまたは
隣接して位置しているヌクレオチド間の架橋結合であ
る。分子モデルおよびコンピューターモデルはRNA−RNA
二重鎖の2'−ヒドロキシルはマイナーグルーブまたはマ
イナーサイトに露出されていることを示している。従っ
て、適当な長さの連結基での2'−ヒドロキシルの直接的
共有結合による架橋結合は二重鎖の天然のコンホメーシ
ョンを妨げないにちがいない。 本発明の教示によると、RNA−RNA,DNA−DNAまたはDNA
−RNA型二重鎖は所望の結合部位でヌクレオチドユニッ
トに結合された空間スパニング基を経て共有結合により
架橋できる。各々の鎖または一本鎖の領域上の空間スパ
ニング基の長さは１から約25原子であろう。従って、二
つの空間スパニング基が一緒になって架橋される場合、
空間スパニング基の全長（架橋物）およびその他の連結
原子は約50原子未満の長さでなければならない。 空間スパニング基は炭素原子または炭素原子に一つま
たはそれ以上の窒素、硫黄または酸素のようなヘテロ原
子が加わったものである。個々の鎖または一本鎖の配列
領域上の空間スパニング基は約20原子またはそれ未満の
長さであるものが好適である。架橋基が８から13原子で
あるのがより好適である。 2'−リボースとC1'−リボースの架橋結合に対して
は、一つの鎖上（または一本鎖の第一の領域上）のヌク
レオチド糖部分の2'−位と別の鎖上（または一本鎖のさ
らに別の領域上）の脱塩基1'−位間で架橋結合が形成さ
れる。架橋基で好適であるのは８から13原子の長さであ
る。 2'−リボースとセコ−リボースの架橋結合に対して
は、第一の鎖3'−末端リボフラノシルヌクレオシドと別
の鎖上（または第一鎖のさらに別の領域上）のヌクレオ
チドの糖部分に結合された空間スパニング基上の反応性
官能性間に架橋結合が形成される。好適には、そのよう
な架橋結合は3'−末端ヌクレオシドの2'および3'ヒドロ
キシル基を通して形成される。2'および3'ヒドロキシル
基は最初に過ヨウ素酸塩により2',3'−ジアルデヒド構
造に変換される。アルデヒド様官能性と反応できる官能
基を含む連結または空間スパニング基を持つ相補鎖との
ハブリダイゼーションにより架橋結合が形成される。2'
−アミノアルコキシ連結または空間スパニング基が2'−
リボース鎖に提供されたならば、セコ−リボース鎖のア
ルデヒド官能性との反応でシッフ塩基が生成するであろ
う。このシッフ塩基をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで
還元すると安定な架橋結合を与える。 2'−リボースと2',3'−OH−リボースの架橋結合にお
いては、第一の鎖の3'−末端リボフラノシルヌクレオシ
ドの2'および3'ヒドロキシルと別の鎖上（または第一の
鎖のさらに別の領域上）のヌクレオチド糖部分に結合さ
れた空間スパニング基上のアルデヒド官能性間に架橋結
合が形成される。鎖のハイブリダイゼーションに際し、
空間スパニング基上のアルデヒド官能基は2',3'−ヒド
ロキシルと反応させてアセタール結合を形成させる。 本発明に従ったオリゴヌクレオチドは好適には約３か
ら約100のサブユニットから成っている。約６サブユニ
ット以上から成るそのようなオリゴヌクレオチドが好適
である（より好適であるのは約８から約60のサブユニッ
ト）。約10から約30のサブユニットを持つオリゴヌクレ
オチドはさらにより好適である。サブユニットが糖部分
に連結された塩基部分を含むことが認められるであろ
う。サブユニットは典型的にはヌクレオシド間結合を通
して隣接するサブユニットに結合されている。前に参照
した米国特許出願に示したごとく、オリゴヌクレオチド
は診療的、治療的および予防的応用ができ、また研究用
試薬としても使用できる。治療的使用のためには、処置
することが望まれている疾患状態の動物（ヒトを含む）
に架橋オリゴヌクレオチド類似体が投与できる。 本発明の治療薬は医薬として受容可能な担体と一緒に
または単独で経口、静脈内または筋肉内のように内用で
応用するのが一般的に好適である。経皮、局所または病
変内投与のような他の投与形もまた有用であろう。架橋
オリゴヌクレオチドはまた座薬に含ませることもでき
る。 ある実施態様において、活性官能基を持つ空間スパニ
ング基は二重鎖にされたオリゴヌクレオチド鎖の対の一
つの鎖上に位置している。好適には、空間スパニング基
は鎖上のヌクレオチドの2'−位に結合されている。官能
基は空間スパニング基上、空間スパニング基がヌクレオ
チドに連結されている点から離れた点に位置している。
空間スパニング基は一つまたはそれ以上の連結原子を通
して2'−位に連結されている。好適には、連結原子とし
てＯ、NH、CH2またはCOが含まれる。 空間スパニング基は好適には直線状または直鎖基であ
る。本発明の一つの実施態様において、空間スパニング
基は１から約20原子の長さのメチレン鎖を含んでいる。
連結原子がメチレン基の場合、連結基および空間スパニ
ング基は一緒になってアルキル鎖を形成する。別の実施
態様においては、空間スパニング基に一つまたはそれ以
上の不飽和部位が存在し、アルケニルまたはアルキニル
鎖を生じている。これらの実施態様において、アルケニ
ルまたはアルキニル空間スパニング基は２から約20の炭
素原子を持っている。 別の実施態様において、空間スパニング基はさらにバ
ックボーンまたは一次直鎖から伸びた分岐鎖または置換
基を含んでいる。分岐鎖は分岐アルキル、分岐アルケニ
ルまたは分岐アルキニル空間スパニング基から選択でき
る。主鎖の炭素原子加えて、分岐鎖は１から約30の炭素
原子を含んでいる。従って、空間スパニング基はC1−C
20の直鎖アルキル、C1−C20の直鎖置換アルキル、C2−C
50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖置換アルキル、C
2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖置換アルケニ
ル、C3−C50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換
アルケニル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C20の直鎖置
換アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3−C50の分岐
鎖置換アルキンを含むことができる。別の空間スパニン
グ基はアリール、アラルキルおよびヘテロ環式基を含ん
でいる。 空間スパニング基の代表的例としてメチル、エチル、
プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オ
クチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリ
デシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、
ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、およびエイ
コシル直鎖アルキル基;2−メチルプロピル、２−メチル
−４−エチルブチル、2,4−ジエチルプロピル、３−プ
ロピルブチル、2,8−ジブチルデシル、6,6−ジメチルオ
クチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチ
ルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、
２−エチルヘキシル、３−ペンテン−２−オン、３−メ
チル−２−ブタノール、２−シアノオクチル、３−メト
キシ−４−ヘプタナール、３−ニトロブチル、４−イソ
プロポキシドデシル、４−アジド−２−ニトロデシル、
５−メルカプトノニル、４−アミノ−１−ペンテニル分
岐または置換基；アリル、クロチル、プロパルギル、２
−ペンテニル不飽和基;4−メチレンベンジル、1,4−ナ
フチル、2,7−アントラシルおよび2,6−フェナントリル
アリールまたはアラルキル基が挙げられるがこれらに制
限されるけではない。別の空間スパニング基はポリアミ
ン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレングリコー
ルおよびポリエーテル、（ポリアルコキシアルキル）基
を含んでいる。ポリアミンには構造［アミン官能性−
（連結基）ｍ］ｎの化合物が含まれる。通常、連結基は
メチレン鎖である。アミン官能性は一級アミン、ヒドラ
ジン、セミカルバジド、チオセミカルバジドまたは類似
の窒素性化学種であろう。ポリアミンの個々の単位の数
（ｎ）は原子の総数が好適には20またはそれ未満になる
ように連結器原子の数（ｍ）と連係して選択される。従
って、もし［−NH（CH2）ｍ−］ｎがポリアミンバック
ボーンとして選択されたら、ｎはｍに依存して１から10
でありうる。例えば、もしｍが１であるならば、ｎは10
まで大きくすることができ、もしｍが２であれば、ｎは
５まで大きくすることができる。ヒドラジンまたはセミ
カルバジドのようなより大きな窒素性化学種が利用され
たならば、ｎおよびｍは窒素性化学種により増加した原
子数を反映し、対応してより小さくなるであろう。 本発明に従ったポリアミド、ポリエステルおよびポリ
エチレングリコールは上記のポリアミンと類似の構造
（但し、ポリアミンの窒素性化学種がアミド、エステル
またはアルコール官能性に置換されている）を持ってい
る。ポリエーテル基もまた類似の構造を持っているが、
但し、炭素鎖中に一つまたはそれ以上のエーテル酸素原
子が散在している。 アリール、アラルキルおよびヘテロ環式空間スパニン
グ基は上記のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基
と類似しているが、但し、適当な芳香族、混合アルキル
−芳香族またはヘテロ環式基が選択される。そのような
空間スパニング基は好適には約20原子未満であり、空間
スパニング基鎖に直接的ではないが芳香族またはヘテロ
環式環の構造内の原子は除かれる。アリール、アラルキ
ルおよびヘテロ環式空間スパニング基は約50原子まで含
むことができる。 上記アルキル、アルケニル、アルキン、ポリアミン、
ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレングリコール、
ポリエーテル、アリール、アラルキルおよびヘテロ環式
空間スパニング基上に置換基が存在できる。置換基に
は、ハロゲン、ヒドロキシル、ケト、カルボキシ、硝酸
エステル、亜硝酸エステル、ニトロ、ニトロソ、ニトリ
ル、トリフルオロメチル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキ
ル、NH−アルキル、アミノ、アジド、スルホキシド、ス
ルホン、スルフィド、シリル、インターカレーター、コ
ンジュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレン
グリコール、ポリエーテル、オリゴヌクレオチドの薬力
学的性質を促進する基およびオリゴヌクレオチドの薬動
力学的性質を促進する基などが挙げられるがそれらに制
限されるけわではない。典型的なインターカレーターお
よびコンジュゲートにはコレステロール、リン脂質、ビ
オチン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリ
ジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、
ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。ハロゲ
ンにはフッ素、塩素、臭素、およびヨウ素が含まれる。
本発明の文脈において薬力学性質を促進する基にはオリ
ゴヌクレオチドの取り込みを改良し、分解に対しオリゴ
ヌクレオチドの耐性を促進しおよび／またはRNAとの配
列特異的ハイブリダイゼーションを強くする基が含まれ
る。本発明の文脈において薬動力学的性質を促進する基
にはオリゴヌクレオチドの取り込み、分布、代謝または
排泄を促進する基が含まれる。 連結原子、空間スパニング基および空間スパニング基
の末端上の官能基を取り込んだヌクレオチドは米国特許
出願第463,358、566,977号およびPCT/US91/00243号に記
載されている方法および合成法に従って一般的に合成さ
れる。所望のオリゴヌクレオチド配列内のヌクレオチド
上にアミン官能性化空間スパニング基を導入するため
に、5'−ジメトキシトリチル−2'−O,2'−Ｓまたは2'−
NH−（空間スパニング基−Ｎ−フタルイミド）ヌクレオ
シドホスホロアミダイトが合成された。Ｎ−フタルイミ
ドアミン保護基は濃NH4OHにより除去される。この様に
してＮ−フタルイミド化合物はオリゴヌクレオチドのヌ
クレオチド成分の2'−位に結合されたアミン官能性化空
間スパニング基を提供する。 アミン官能性化空間スパニング基を持つ化合物の生成
のため以下の化合物がAldrich Chemical Co.,Inc.,Mi
lwaukee,WIから市販品として入手可能である:N−（２−
ブロモエチル）フタルイミド、Ｎ−（２−ブロモプロピ
ル）フタルイミドおよびＮ−（２−ブロモブチル）フタ
ルイミド。その他のフタルイミド−保護アミン化合物は
適当なアルキル、アラルキルまたはアリールハライドお
よびフタルイミドから都合良く合成できる。代表的な化
合物としてＮ−（７−ブロモヘプチル）フタルイミド;N
−（８−ブロモオクチル）フタルイミド;N−（９−ブロ
モノニル）フタルイミド;N−（10−ブロモドデシル）フ
タルイミド;N−（11−ブロモウンデシル）フタルイミ
ド;N−（12−ブロモドデシル）フタルイミド;N−（13−
ブロモトリデシル）フタルイミド;N−（14−ブロモテト
ラデシル）フタルイミド;N−（15−ブロモペンタデシ
ル）フタルイミド;N−（16−ブロモヘキサデシル）フタ
ルイミド;N−（17−ブロモヘプタデシル）フタルイミ
ド;N−（18−ブロモオクタデシル）フタルイミド;N−
（19−ブロモノナデシル）フタルイミド;N−（３−ブロ
モ−２−メチルプロピル）フタルイミド;N−（４−ブロ
モ−２−メチル−３−エチルブチル）フタルイミド;N−
（３−ブロモ−2,2−ジエチルプロピル）フタルイミド;
N−（４−ブロモ−３−プロピルブチル）フタルイミド;
N−（10−ブロモ−2,8−ジブチルデシル）フタルイミ
ド;N−（８−ブロモ−6,6−ジメチルオクチル）フタル
イミド;N−（８−ブロモ−６−プロピル−６−ブチルオ
クチル）フタルイミド;N−（４−ブロモ−２−メチルブ
チル）フタルイミド;N−（５−ブロモ−２−メチルペン
チル）フタルイミド;N−（５−ブロモ−３−メチルペン
チル）フタルイミド;N−（６−ブロモ−２−エチルヘキ
シル）フタルイミド;N−（５−ブロモ−３−ペンテン−
２−オン）フタルイミド;N−（４−ブロモ−３−メチル
−２−ブタノール）フタルイミド;N−（８−ブロモ−３
−アミノ−４−クロロ−２−シアノオクチル）フタルイ
ミド;N−（７−ブロモ−３−メトキシ−４−ヘプタナー
ル）フタルイミド;N−（４−ブロモ−２−ヨード−３−
ニトロブチル）フタルイミド;N−（12−ブロモ−４−イ
ソプロポキシドデシル）フタルイミド;N−（10−ブロモ
−４−アジド−２−ニトロデシル）フタルイミド;N−
（９−ブロモ−５−メルカプトノニル）フタルイミド;N
−（５−ブロモ−４−アミノペンテニル）フタルイミ
ド;N−（５−ブロモペンテン−２−イル）フタルイミ
ド;N−（３−ブロモアリル）フタルイミド;N−（４−ブ
ロモクロチル）フタルイミド;N−（３−ブロモプロピル
ギル）フタルイミド;N−（１−ブロモナフト−４−イ
ル）フタルイミド;N−（２−ブロモアントラセ−７−イ
ル）フタルイミド；およびＮ−（２−ブロモフェナント
ロ−６−イル）フタルイミドが含まれる。そのようなハ
ライド化合物は次に適当な2'−酸素、2'−硫黄または2'
−アミンヌクレオシドと反応させる。 アミン（−NH2−）に加えて本発明の官能基としてさ
らに好適な反応性部分として、ヒドラジン（−NH−NH
−）、ヒドロキシルアミン（−NH−OH）、セミカルバジ
ン（−NH−Ｃ（Ｏ）−NH−NH2）、チオセミカルバジン
（−NH−Ｃ（Ｓ）−NH−NH2）、ヒドラゾン（−Ｎ＝NH
−）、ヒドラジド（−Ｃ（Ｏ）−NH−NH2）、アルコー
ル（−OH）、チオール（−SH）およびアルデヒド（−CH
＝Ｏ）が含まれる。所望のオリゴヌクレオチド配列内へ
その2'−位にヒドラジン官能性化空間スパニング基を持
つヌクレオチドを導入するために、5'−ジメトキシトリ
チル−2'−Ｏ−、−2'−Ｓ−または−2'−NH−（空間ス
パニング基−Ｎ−ベンジルカルバジド）ヌクレオシドホ
スホロアミダイトが合成された。これらのヌクレオチド
を取り込んだオリゴヌクレオチドが合成されたら、パラ
ジウム活性炭による還元によりヒドラジン官能性が発生
させられる。 所望のオリゴヌクレオチド配列内へその2'−位にヒド
ロキシル官能性化空間スパニング基を持つヌクレオチド
を導入するために、5'−ジメトキシトリチル−2'−Ｏ
−、−2'−Ｓ−または−2'−NH−（空間スパニング基−
Ｎ−フタルイミド）ヌクレオシドホスホロアミダイトが
合成された。これらのヌクレオチドを取り込んだオリゴ
ヌクレオチドが合成された後、オリゴヌクレオチドをメ
チルヒドラジンによる処理によりヒドロキシルアミン官
能性が発生させる。空間スパニング基上のセミカルバジ
ドおよびチオセミカルバジド官能性は保護基なしで直接
導入できる。5'−ジメトキシトリチル−2'−Ｏ−、−2'
−Ｓ−または−2'−NH−（アルキセミルカルバジド）ヌ
クレオシドホスホロアミダイトが合成され、所望のオリ
ゴヌクレオチド内へ取り込ませて、オリゴヌクレオチド
の成分ヌクレオチドの2'−位に結合されたセミカルバジ
ド官能性化空間スパニング基が提供される。 ヒドラジド官能性はヒドラジンと2'−Ｏ−アルキルエ
ステルを持つヌクレオチドと反応させて空間スパニング
基上に形成される。アルコール官能性はΩ−ブロモアル
コールを経て空間スパニング基上に形成できる。アルコ
ールヒドロキシル基はテトラヒドロピラン（THP）保護
基で保護される。THP−保護化合物は次に活性化された
ヌクレオチドと反応させて、ヌクレオチドの2'−位にTH
P−保護化合物が結合される。オリゴヌクレオチド合成
後、THP保護基が除去されてアルコール性官能性が露出
される。チオール官能性はα，Ω−ジチオール化合物を
使用した2,2'−アンヒドロピリミジンヌクレオシドの環
開裂により直接的に形成できる。もしくは、空間スパニ
ング基のチオール官能性はＳ−トリチル保護基で保護で
きる。オリゴヌクレオチド合成後、Ｓ−トリチル保護基
は硝酸銀で除去される。 架橋結合の形成に活性官能基として使用されたアルデ
ヒドは最初のオリゴヌクレオチド合成の間保護アルデヒ
ドまたはアルデヒド前駆体として”マスク”できる。ア
ルデヒドは架橋に先だって保護アルデヒドまたはアルデ
ヒド前駆体から発生され、共有結合による架橋結合形成
のための反応体として利用される。代表的な保護アルデ
ヒドはＣ−ホルミル、ｏ−メチルアミノベンゼンチオ、
ジ−フェニルイミダゾリジノのようなアリール置換イミ
ダゾリジノ、ジチアン、ビス（ｐ−ニトロフェノキシ）
およびアセタールである。特に好適なアセタールはビス
（ｏ−ニトロベンジル）アセタールのようなジ−アラル
キルアセタールであり、触媒的水素化分解により除去さ
れる。ヒドラジン水和物／シアノ水素化ホウ素ナトリウ
ム処理により除去されるジフェニルイミダゾリジノ基も
また特に好適である。アルデヒド前駆体にはニトリル、
アルコールおよびエステルが含まれる。ニトリルおよび
エステルはそれらの対応するアルデヒドへ還元され、一
方アルコールはそれらの対応するアルデヒドへ酸化され
る。ニトリルはヒドラジンで処理でき、続いてシアノ水
素化ホウ素ナトリウムで還元される。エステルは水素化
アルミニウムリチウムで還元できる。アルコールはフィ
ッツナー−モファット条件のような穏やかな酸化条件下
で酸化できる。J.Ame.Chem.Soc.,1965,87,5661参照。そ
のような条件はHansske,et.al.,Tetrahedro,1984,40,12
5、によりクロム酸酸化試薬ならびにDMSO/Ac2Oの両方を
用いた種々のヌクレオシドの2'または3'ヒドロキシル基
の酸化に使用されている。 アルデヒド前駆体および保護アルデヒドはヌクレオシ
ド／ヌクレオチドレベルおよびオリゴヌクレオチドレベ
ルの両方で使用できる。アルデヒド前駆体または保護ア
ルデヒドを取り込んだ個々のヌクレオチド（または、そ
れらのヌクレオシド前駆体）は直接的にオリゴヌクレオ
チド内へ取り込まれる。もしくは、アルデヒド前駆体は
保護アルデヒドへ変換でき（Ｃ−ホルミル保護アルデヒ
ドとして）、続いてオリゴヌクレオチド内へ直接取り込
まれる。オリゴヌクレオチド合成後、アルデヒドは保護
アルデヒドから再生され、または、アルデヒド前駆体か
ら発生され、オリゴヌクレオチド鎖がさらに別のオリゴ
ヌクレオチド鎖または同一のオリゴヌクレオチド鎖のさ
らに別の領域と架橋される。ある種のオリゴヌクレオチ
ドに対してアルデヒド前駆体の使用が示唆されている
（遺伝子スプライス部位から上流のピリミジン域配列の
模倣のような）。そのようなピリミジン域配列の一つは
配列CCC CTC CCCを含んでいる。そのような区域はピ
リミジンヌクレオチドのみを含んでいるので、アルコー
ルからアルデヒドへの変換のために使用される酸性酸化
条件は酸性脱プリン化またはオリゴヌクレオチドの酸性
鎖切断を起こさないであろう。 例えば、2'−リボースと2'−リボースの結合が形成さ
れる前記の実施態様のごとく、空間スパニング基上のヒ
ドラジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、チオ
セミカルバジド、ヒドラゾン、ヒドラジド、アルコール
またはチオール官能基はさらに別の空間スパニング基上
のアルデヒド基（−CH＝Ｏ基）と反応できることが認識
されるであろう。これらの官能基はまた脱塩基部位のC
1'−位のアルデヒド基とも反応でき、2'−リボースとC
1'−リボースの結合を形成する。もしくは、これらの官
能基は2',3'−ジアルデヒド3'−末端ヌクレオシドのア
ルデヒド基と反応でき2'−リボースとセコ−リボースの
結合を形成し、または、イミン（−Ｃ＝Ｎ−）、ヒドラ
ゾン（−Ｃ＝Ｎ−NH−）、オキシム（−Ｏ−Ｎ＝CH
−）、セミカルバゾン（NH−Ｃ（Ｏ）−NH−Ｎ＝Ｃ
−）、チオセミカルバゾン（NH−Ｃ（Ｓ）−NH−Ｎ＝Ｃ
−）、アジン（−HC＝Ｎ−Ｎ＝CH−）、ヒドラジド−ヒ
ドラゾン（−Ｃ（Ｏ）−NH−Ｎ＝Ｃ−）、ヘミアセター
ル（−CH（OH）−Ｏ−CH2−）、またはチオヘミアセタ
ール（−CH（OH）−Ｓ−CH2−）架橋結合を形成する。 第一の鎖上のアルデヒドと別の鎖上または第一の鎖の
さらに別の領域上のアルコールまたはチオアセタールが
反応した場合、生じるヘミアセタールまたはチオヘミア
セタールは理論的にはさらにアルコールまたはチオール
基と反応できる。しかしながら、水溶液中、またはさら
なるアルコールまたはチオール基の濃度が低い条件下で
通常みられるようにそのような反応は一般的に動力学的
に（エントロピー的に）好ましくない。 第一の鎖（または一本鎖の第一の領域）上の2'−リボ
ースおよび別の鎖（または一本鎖のさらに別の領域）上
の2'−リボース間で架橋結合が形成される本発明のこれ
らの実施態様において、空間スパニング基および反応性
官能基は鎖（または一本鎖の領域）の各々に結合されて
いる。空間スパニング基および反応性官能基は上記のよ
うに連結原子を利用して各々の鎖（または一本鎖の領
域）の各々の2'−位に結合されている。鎖または複数の
鎖は次に反応性官能基との反応により架橋される。従っ
て、反応性官能基は一緒になって共有結合を形成するの
で、それらは各々”結合前駆体”または”結合手段”と
考えることができる。 鎖（または一本鎖の領域）の各々の反応性官能基に依
存して、架橋結合の絶対に必要な部分として共有結合が
形成されるであろう。鎖の各々の活性反応基がチオール
基である場合、酸化によりジスルフィド架橋結合が生じ
る。アルデヒドが一つの鎖（または一本鎖上の第一の領
域）上の官能基であり、アミンがさらに別の鎖（または
一本鎖上のさらに別の領域）上の官能基である場合、イ
ミン（−Ｎ＝CH−、シッフ塩基）架橋結合が生じる。イ
ミン架橋結合はシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような
還元剤を用いてアミン（−NH−CH2−）に還元できる。 ヒドラジン（−HN−NH−）とアルデヒドとの反応では
ヒドラゾン（−HC＝Ｎ−NH−）架橋結合を得、一方、ヒ
ドロキシルアミン（HO−Ｎ−）とアルデヒドとの反応で
はオキシム（−Ｏ−Ｎ＝CH−）を得る。アルデヒドとヒ
ドラジド（−Ｃ（Ｏ）−NH−NH2）の反応ではヒドラジ
ド−ヒドラゾン（−Ｃ（Ｏ）−NH−Ｎ＝CH−）架橋結合
を得、アルデヒドとセミカルバジド（−NH−Ｃ（Ｏ）−
NH−NH2）の反応はセミカルバゾン（NH−Ｃ（Ｏ）−NH
−Ｎ＝Ｃ−）架橋結合を得、およびアルデヒドとチオセ
ミカルバジド（−NH−Ｃ（Ｓ）−NH−NH2）との反応で
はチオセミカルバゾン（−NH−Ｃ（Ｓ）−NH−Ｎ＝Ｃ
−）架橋結合を得る。ビドラゾン、オキシム、ヒドラジ
ド−ヒドラゾン、セミカルバゾンおよびチオセミカルバ
ゾンは必要に応じ、各々対応するヒドラジン、ヒドロキ
シルアミン、ヒドラジド−ヒドラジン、セミカルバジド
およびチオセミカルバジドへ還元できる。 空間スパニング基上の活性官能基はヘテロ二官能性お
よびホモ二官能性基の両方と反応できる。後で認識され
るように、ホルムアルデヒドは二つのアミンと反応させ
られる場合、ホモ二官能性基である。ホルムアルデヒド
と二つの鎖（または、一本鎖の二つの領域）の各々に結
合されているアミン官能基との反応によりアミノアルキ
ルアミン（−NH−CH2−NH−）結合を得る。 ヒドラジンもまた各々アルデヒドが末端に存在する空
間スパニング基を持つ鎖を結合させるための二官能性基
として使用できる。ヒドラジンは第一のアルデヒド基に
付加してアルデヒド−ヒドラゾンを形成し、順に、第二
のアルデヒドと反応してアジン（−CH＝Ｎ−Ｎ＝CH−）
架橋結合を得る。 ヘテロ二官能性基は一つの鎖（または、一本鎖の一つ
の領域）上に一つの活性官能性を使用し、別の鎖（また
は、一本鎖の別の領域）上での異なった活性官能性の使
用を可能にする。従って、一つの鎖はその空間スパニン
グ基の末端にアミン官能性を持ち、別の鎖はその空間ス
パニング基の末端にチオール官能性を持つことが可能で
あった。ヘテロ二官能性基またはある種の前述の活性官
能性が用いられた場合、一つの鎖（または一本鎖の領
域）の空間スパニング基は必要とされないであろう。結
合基、例えば、2'−置換−2'−デオキシ−エリスロ−ペ
ントフラノシル部分の2'−アミノまたは2'−チオは活性
官能性として直接的に使用できた。他の鎖からの空間ス
パニング基およびその活性な官能性はこの2'−位に位置
している活性な官能性と直接的に反応できた。たとえ
ば、2'−デオキシ−2'−チオ−エリスロ−ペントフラノ
シル糖は一つの鎖上に選択されたヌクレオチドの糖部分
として利用できた。相補的二重鎖の空間スパニング基上
のオメガチオール基が次にジスルフィド結合を通して第
一の2'−チオ基に結合された。この型の架橋結合に対し
て適したその他の2'の基には2'−アミノ基が含まれる。
2'−ケト基もまた適したヒドラジンまたは他の反応性の
官能性と反応できる。 Pierce（Rockford,Il）を含む販売元から種々のヘテ
ロ二官能性結合剤が入手可能である。これらの試薬に
は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド（水溶性DCC型結合剤）、ジメチルアジ
ピミデート二塩酸塩、ジメチルピメリミデート二塩酸塩
およびジメチル3,3'−ジチオビスプロピオンイミデート
二塩酸塩等のような二官能性イミドエステル（アミノ基
の結合に対して）、および２−イミノ−チオラン（アミ
ンチオール結合に対して）。結合剤には、アミンと反応
するＮ−ヒドロキシスクシンイミド部を持つ化合物、さ
らにチオール官能性とジスルフィド結合を通してさらに
結合できる活性チオールを遊離して露出できる内部ジス
ルフィド結合を持つ化合物およびアミンに対してＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドと異なった反応性を持つスルホ
スクシンイミジル基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスルホス
クシンイミド）を持つ化合物もまた含まれる。結合剤に
は遊離チオール部分を交換するピリジル−ジスルフィド
β−カルボニルアルキルハライドの様な活性ハロゲン種
（例えばヨードアセトアミド）、マレイミド部分および
フェニルアジドの様な光反応性アリールアジドが含まれ
る。また、チオイソシアネートもまた空間スパニング基
上の活性官能性との結合に使用できる。 二官能性架橋結合の種々の官能基は適した連結原子と
一緒に結合される。市販品として入手可能な二官能性化
合物の代表的なものには、スルホスクシンイミジル４−
（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボ
キシレート,N−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート、Ｎ−スルホスクシンイミジル
（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート、ｍ−マレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミ
ドエステル、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ビスマ
レイミドヘキサン、ジスルホスクシンイミジルタートレ
ート、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスク
シネート）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネ
ート）、ジスクシンイミジルスベレート、Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミジル−４−アジドサリチル酸、Ｎ−５−
アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド、
および、スルホスクシンイミジル２−（ｍ−アジド−ｏ
−ニトロベンズアミド）−エチル−1,3'−ジチオプロピ
オネートが含まれる。これらの二官能性基の各々は空間
スパニング基上の適当な活性を官能性と反応する。従っ
て、空間スパニング基を持つオリゴヌクレオチド鎖（ま
たは、一本鎖の領域）は二官能性基を通して架橋され
る。 Summerton,et al.およびMeyer,et al.により（前記
文献）各々記載されている６−ブロモ−5,5−ジメトキ
シヘキサノヒドラジドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミジルヨードアセテートもまたヘテロ二官能性架橋剤と
して使用できる。Summerton試薬のヒドラジン部分およ
びMeyer試薬のスクシンイミジル部分は二重鎖の一つの
鎖に結合でき、他の鎖はバックボーンまたはこれらの試
薬のヨードアセトアミド部分に結合できる。例えば、Su
mmerton試薬のヒドラジン官能性は最初に一つの鎖上の
アルデヒド官能性と反応し、この試薬のα−ハロケター
ル官能性はpH調整により活性化されてα−ハロケトンと
なり、α−ハロケトンは次に他の鎖のアミンまたはチオ
ール官能性とさらに反応するであろう。Meyer試薬の活
性スクシンイミド官能性は最初に第一の鎖上のアミン官
能性と結合され、生じるヨードアセトアミドアルキル官
能性がさらに他の鎖上のアミンまたはチオール官能性と
結合されるであろう。 SummertonおよびMeyer試薬の両方とも二つのアミン官
能性の連結に使用できるので（Summerton試薬の場合二
つのヒドラジン官能性）、これらはまた、ホモ二官能性
結合剤とも考えられる。SummertonおよびMeyer試薬の両
方とも本発明に従ったプリン環の７−位を通しての二重
鎖の結合には使用されない。従って、荷電を持つ（すな
わち、化学的に不安定な）化学種は生成せずむしろ荷電
を持たない構造−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ（Ｏ）−CH2−およ
び−CH2−NH−CH2−Ｃ（Ｏ）−CH2−の化学的に安定な
架橋結合が生成する。 第一のオリゴヌクレオチドをその3'末端で終末リボフ
ラノシルヌクレオシドで終止させることにより、さらに
別のオリゴヌクレオチド鎖（または、一本鎖のさらに別
の領域）への架橋は二つの機構の内の一つにより実現で
きる。最初の機構には例えば、3'−末端リボースの2',
3'ヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化によるセコリボース
の発生が含まれている。「例えば、Lemaitre,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,1986,84,648;Chang,Biochem,1981,199,
281;およびEasterbrook−Smith,Eur.J.Biochem,1976,6
2,125.参照」そのような酸化により2'3'ジ−アルデヒド
（セコリボース）が得られ、それは活性アミン官能性を
持つ空間スパニング基を含む第二の鎖（または、一本鎖
のさらに別の領域）と反応させられる。そのような反応
によりシッフ塩基が生じ、それは例えばシアノ水素化ホ
ウ素ナトリウムにより還元され、第一のオリゴヌクレオ
チド鎖の3'−末端ヌクレオシドのセコリボースに直接結
合されたアミノ基を持つアミン架橋連結物を形成する。 第二の機構は末端リボースの2',3'ヒドロキシル基か
らのアセタール架橋結合の形成を含んでいる。アセター
ル結合を形成するには、末端リボースの2',3'−ヒドロ
キシル基を第二の鎖（または、一本鎖のさらに別の領
域）の空間スパニング基上のアルデヒド基と反応させ
る。この型のアセタールはKnorre,et al,による、酵素
および核酸を標的とする不可逆的阻害剤としてのヌクレ
オチドおよびオリゴヌクレオチド誘導体、化学的側面、
G.Weber（編）、Advances Press,Oxford,1986,pp.277
−299.に記載されているように末端リボースへのナイト
ロジェンマスタードの結合に利用されている。ナイトロ
ジェンマスタードは次に短いオリゴヌクレオチドの相補
的配列とさらに反応させる。明らかに、架橋結合はアセ
タールではなくナイトロジェンマスタードを通して形成
された。先に示したように、ナイトロジェンマスタード
を通して形成された架橋結合は化学的に不安定な荷電種
を生成する。本発明は架橋の実現に荷電種を発生しない
アセタールを使用している。 まとめると、空間スパニング基、官能基および連結原
子には以下の群から選択される部分を含んでいる:C1−C
20の直鎖アルキルアミン、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキル
アミン、C1−C20の直鎖Ｓ−アルキルアミン、C1−C20の
直鎖NH−アルキルアミン、C1−C20の直鎖置換アルキル
アミン、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキルアミン、C1−C
20の直鎖置換Ｓ−アルキルアミン、C1−C20の直鎖置換N
H−アルキルアミン、C2−C50の分岐鎖アルキルアミン、
C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルアミン、C2−C50の分岐鎖
Ｓ−アルキルアミン、C2−C50の分岐鎖NH−アルキルア
ミン、C2−C50の分岐鎖置換アルキルアミン、C2−C50の
分岐鎖置換Ｏ−アルキルアミン、C2−C50の分岐鎖置換
Ｓ−アルキルアミン、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
ルアミン、C2−C50の直鎖アルケニルアミン、C2−C20の
直鎖Ｏ−アルケニルアミン、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケ
ニルアミン、C2−C20の直鎖NH−アルケニルアミン、C2
−C20の直鎖置換アルケニルアミン、C2−C20の直鎖置換
Ｏ−アルケニルアミン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケ
ニルアミン、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニルアミ
ン、C3−C50の分岐鎖アルケニルアミン、C3−C50の分岐
鎖Ｏ−アルケニルアミン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケ
ニルアミン、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニルアミン、C
3−C50の分岐鎖置換アルケニルアミン、C3−C50の分岐
鎖置換Ｏ−アルケニルアミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ
−アルケニルアミン、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケ
ニルアミン、C2−C20の直鎖アルキニルアミン、C2−C20
の直鎖Ｏ−アルキニルアミン、C2−C20の直鎖Ｓ−アル
キニルアミン、C2−C20の直鎖NH−アルキニルアミン、C
2−C20の直鎖置換アルキニルアミン、C2−C20の直鎖置
換Ｏ−アルキニルアミン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アル
キニルアミン、C2−C20の直鎖置換NH−アルキニルアミ
ン、C3−C50の分岐鎖アルキニルアミン、C3−C50の分岐
鎖Ｏ−アルキニルアミン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキ
ニルアミン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキニルアミン、C
3−C50の分岐鎖置換アルキニルアミン、C3−C50の分岐
鎖置換Ｏ−アルキニルアミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ
−アルキニルアミン、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
ニルアミン、C1−C20の直鎖アルキルヒドラジン、C1−C
20の直鎖Ｏ−アルキニルヒドラジン、C1−C20の直鎖Ｓ
−アルキルヒドラジン、C1−C20の直鎖NH−アルキルヒ
ドラジン、C1−C20の直鎖置換アルキルヒドラジン、C1
−C20の直鎖置換Ｏ−アルキルヒドラジン、C1−C20の直
鎖置換Ｓ−アルキルヒドラジン、C1−C20の直鎖置換NH
−アルキルヒドラジン、C2−C50の分岐鎖アルキルヒド
ラジン、C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルヒドラジン、C2
−C50の分岐鎖Ｓ−アルキルヒドラジン、C2−C50の分岐
鎖NH−アルキルヒドラジン、C2−C50の分岐鎖置換アル
キルヒドラジン、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキルヒ
ドラジン、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキルヒドラジ
ン、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキルヒドラジン、C2
−C20の直鎖アルケニルヒドラジン、C2−C20の直鎖Ｏ−
アルケニルヒドラジン、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニル
ヒドラジン、C2−C20の直鎖NH−アルケニルヒドラジ
ン、C2−C20の直鎖置換アルケニルヒドラジン、C2−C20
の直鎖置換Ｏ−アルケニルヒドラジン、C2−C20の直鎖
置換Ｓ−アルケニルヒドラジン、C2−C20の直鎖置換NH
−アルケニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖アルケニル
ヒドラジン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニルヒドラジ
ン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニルヒドラジン、C3−C
50の分岐鎖NH−アルケニルヒドラジン、C3−C50の分岐
鎖置換アルケニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ
−アルケニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−ア
ルケニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケ
ニルヒドラジン、C2−C20の直鎖アルキニルヒドラジ
ン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキニルヒドラジン、C2−C20
の直鎖Ｓ−アルキニルヒドラジン、C2−C20の直鎖NH−
アルキニルヒドラジン、C2−C20の直鎖置換アルキニル
ヒドラジン、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキニルヒドラ
ジン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキニルヒドラジン、C
2−C20の直鎖置換NH−アルキニルヒドラジン、C3−C50
の分岐鎖アルキニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−
アルキニルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキニ
ルヒドラジン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキニルヒドラ
ジン、C3−C50の分岐鎖置換アルキニルヒドラジン、C3
−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキニルヒドラジン、C3−C50
の分岐鎖置換Ｓ−アルキニルヒドラジン、C3−C50の分
岐鎖置換NH−アルキニルヒドラジン、C1−C20の直鎖ア
ルキルヒドロキシルアミン、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキ
ルヒドロキシルアミン、C1−C20の直鎖Ｓ−アルキルヒ
ドロキシルアミン、C1−C20の直鎖NH−アルキルヒドロ
キシルアミン、C1−C20の直鎖置換アルキルヒドロキシ
ルアミン、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキルヒドロキシ
ルアミン、C1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキルヒドロキシ
ルアミン、C1−C20の直鎖置換NH−アルキルヒドロキシ
ルアミン、C2−C50の分岐鎖アルキルヒドロキシルアミ
ン、C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルヒドロキシルアミ
ン、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキルヒドロキシルアミ
ン、C2−C50の分岐鎖NH−アルキルヒドロキシルアミ
ン、C2−C50の分岐鎖置換アルキルヒドロキシルアミ
ン、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキルヒドロキシルア
ミン、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキルヒドロキシル
アミン、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキルヒドロキシ
ルアミン、C2−C20の直鎖アルケニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖NH−アルケニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖置換アルケニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルケニルヒドロキシルア
ミン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケニルヒドロキシル
アミン、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニルヒドロキシ
ルアミン、C3−C50の分岐鎖アルケニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニルヒドロキシ
ルアミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルケニルヒドロ
キシルアミン、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニルヒ
ドロキシルアミン、C2−C20の直鎖アルキニルヒドロキ
シルアミン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキニルヒドロキシ
ルアミン、C2−C20の直鎖Ｓ−アルキニルヒドロキシル
アミン、C2−C20の直鎖NH−アルキニルヒドロキシルア
ミン、C2−C20の直鎖置換アルキニルヒドロキシルアミ
ン、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキニルヒドロキシルア
ミン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキニルヒドロキシル
アミン、C2−C20の直鎖置換NH−アルキニルヒドロキシ
ルアミン、C3−C50の分岐鎖アルキニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖置換アルキニルヒドロキシルア
ミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキニルヒドロキシ
ルアミン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキニルヒドロ
キシルアミン、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルキニルヒ
ドロキシルアミン、C1−C20の直鎖アルキルセミカルバ
ジド、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキルセミカルバジド、C1
−C20の直鎖Ｓ−アルキルセミカルバジド、C1−C20の直
鎖NH−アルキルセミカルバジド、C1−C20の直鎖置換ア
ルキルセミカルバジド、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキ
ルセミカルバジド、C1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキルセ
ミカルバジド、C1−C20の直鎖置換NH−アルキルセミカ
ルバジド、C2−C50の分岐鎖アルキルセミカルバジド、C
2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルセミカルバジド、C2−C50
の分岐鎖Ｓ−アルキルセミカルバジド、C2−C50の分岐
鎖NH−アルキルセミカルバジド、C2−C50の分岐鎖置換
アルキルセミカルバジド、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−ア
ルキルセミカルバジド、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アル
キルセミカルバジド、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
ルセミカルバジド、C2−C50の直鎖アルケニルセミカル
バジド、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケニルセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニルセミカルバジド、C2
−C20の直鎖NH−アルケニルセミカルバジド、C2−C20の
直鎖置換アルケニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖置
換Ｏ−アルケニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖置換
Ｓ−アルケニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖置換NH
−アルケニルセミカルバジド、C3−C50の分岐鎖アルケ
ニルセミカルバジド、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニル
セミカルバジド、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニルセミ
カルバジド、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニルセミカル
バジド、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルセミカルバジ
ド、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニルセミカルバジ
ド、C3−C50−分岐鎖置換Ｓ−アルケニルセミカルバジ
ド、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニルセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖アルキニルセミカルバジド、C2−C20
の直鎖Ｏ−アルキニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖
Ｓ−アルキニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖NH−ア
ルキニルセミカルバジド、C2−C20の直鎖置換アルキニ
ルセミカルバジド、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキニル
セミカルバジド、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキニルセ
ミカルバジド、C2−C20の直鎖置換NH−アルキニルセミ
カルバジド、C3−C50の分岐鎖アルキニルセミカルバジ
ド、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキニルセミカルバジド、C
3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキニルセミカルバジド、C3−C
50の分岐鎖NH−アルキニルセミカルバジド、C3−C50の
分岐鎖置換アルキニルセミカルバジド、C3−C50の分岐
鎖置換Ｏ−アルキニルセミカルバジド、C3−C50の分岐
鎖置換Ｓ−アルキニルセミカルバジド、C3−C50の分岐
鎖置換NH−アルキニルセミカルバジド、C1−C20の直鎖
アルキルチオセミカルバジド、C1−C20の直鎖Ｏ−アル
キルチオセミカルバジド、C1−C20の直鎖Ｓ−アルキル
チオセミカルバジド、C1−C20の直鎖NH−アルキルチオ
セミカルバジド、C1−C20の直鎖置換アルキルチオセミ
カルバジド、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキルチオセミ
カルバジド、C1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキルチオセミ
カルバジド、C1−C20の直鎖置換NH−アルキルチオセミ
カルバジド、C2−C50の分岐鎖アルキルチオセミカルバ
ジド、C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルチオセミカルバジ
ド、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキルチオセミカルバジ
ド、C2−C50の分岐鎖NH−アルキルチオセミカルバジ
ド、C2−C50の分岐鎖置換アルキルチオセミカルバジ
ド、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキルチオセミカルバ
ジド、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキルチオセミカル
バジド、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキルチオセミカ
ルバジド、C2−C20の直鎖アルケニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖NH−アルケニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖置換アルケニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルケニルチオセミカルバ
ジド、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケニルチオセミカル
バジド、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニルチオセミカ
ルバジド、C3−C50の分岐鎖アルケニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニルチオセミカ
ルバジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルケニルチオセ
ミカルバジド、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニルチ
オセミカルバジド、C2−C20の直鎖アルキニルチオセミ
カルバジド、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキニルチオセミカ
ルバジド、C2−C20の直鎖Ｓ−アルキニルチオセミカル
バジド、C2−C20の直鎖NH−アルキニルチオセミカルバ
ジド、C2−C20の直鎖置換アルキニルチオセミカルバジ
ド、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキニルチオセミカルバ
ジド、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキニルチオセミカル
バジド、C2−C20の直鎖置換NH−アルキニルチオセミカ
ルバジド、C3−C50の分岐鎖アルキニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖NH−アルキニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖置換アルキニルチオセミカルバ
ジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキニルチオセミカ
ルバジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキニルチオセ
ミカルバジド、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルキニルチ
オセミカルバジド、C1−C20の直鎖アルキルヒドラゾ
ン、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキルヒドラゾン、C1−C20の
直鎖Ｓ−アルキルヒドラゾン、C1−C20の直鎖NH−アル
キルヒドラゾン、C1−C20の直鎖置換アルキルヒドラゾ
ン、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキルヒドラゾン、C1−C
20の直鎖置換Ｓ−アルキルヒドラゾン、C1−C20の直鎖
置換NH−アルキルヒドラゾン、C2−C50の分岐鎖アルキ
ルヒドラゾン、C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキルヒドラゾ
ン、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキルヒドラゾン、C2−C50
の分岐鎖NH−アルキルヒドラゾン、C2−C50の分岐鎖置
換アルキルヒドラゾン、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アル
キルヒドラゾン、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキルヒ
ドラゾン、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキルヒドラゾ
ン、C2−C20の直鎖アルケニルヒドラゾン、C2−C20の直
鎖Ｏ−アルケニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖Ｓ−アル
ケニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖NH−アルケニルヒド
ラゾン、C2−C20の直鎖置換アルケニルヒドラゾン、C2
−C20の直鎖置換Ｏ−アルケニルヒドラゾン、C2−C20の
直鎖置換Ｓ−アルケニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖置
換NH−アルケニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖アルケ
ニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニルヒド
ラゾン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニルヒドラゾン、C
3−C50の分岐鎖NH−アルケニルヒドラゾン、C3−C50の
分岐鎖置換アルケニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖置
換Ｏ−アルケニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ
−アルケニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖置換NH−ア
ルケニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖アルキニルヒドラ
ゾン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキニルヒドラゾン、C2−C
20の直鎖Ｓ−アルキニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖NH
−アルキニルヒドラゾン、C2−C20の直鎖置換アルキニ
ルヒドラゾン、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキニルヒド
ラゾン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキニルヒドラゾ
ン、C2−C20の直鎖置換NH−アルキニルヒドラゾン、C3
−C50の分岐鎖アルキニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖
Ｏ−アルキニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アル
キニルヒドラゾン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキニルヒ
ドラゾン、C3−C50の分岐鎖置換アルキニルヒドラゾ
ン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキニルヒドラゾン、C
3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキニルヒドラゾン、C3−C
50の分岐鎖置換NH−アルキニルヒドラゾン、C1−C20の
直鎖アルキルヒドラジド、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキル
ヒドラジド、C1−C20の直鎖Ｓ−アルキルヒドラジド、C
1−C20の直鎖NH−アルキルヒドラジド、C1−C20の直鎖
置換アルキルヒドラジド、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アル
キルヒドラジド、C1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキルヒド
ラジド、C1−C20の直鎖置換NH−アルキルヒドラジド、C
2−C50の分岐鎖アルキルヒドラジド、C2−C50の分岐鎖
Ｏ−アルキルヒドラジド、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキ
ルヒドラジド、C2−C50の分岐鎖NH−アルキルヒドラジ
ド、C2−C50の分岐鎖置換アルキルヒドラジド、C2−C50
の分岐鎖置換Ｏ−アルキルヒドラジド、C2−C50の分岐
鎖置換Ｓ−アルキルヒドラジド、C2−C50の分岐鎖置換N
H−アルキルヒドラジド、C2−C20の直鎖アルケニルヒド
ラジド、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケニルヒドラジド、C2
−C20の直鎖Ｓ−アルケニルヒドラジド、C2−C20の直鎖
NH−アルケニルヒドラジド、C2−C20の直鎖置換アルケ
ニルヒドラジド、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルケニルヒ
ドラジド、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケニルヒドラジ
ド、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニルヒドラジド、C3
−C50の分岐鎖アルケニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖
Ｏ−アルケニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アル
ケニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニルヒ
ドラジド、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルヒドラジ
ド、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニルヒドラジド、C
3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルケニルヒドラジド、C3−C
50の分岐鎖置換NH−アルケニルヒドラジド、C2−C20の
直鎖アルキニルヒドラジド、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキ
ニルヒドラジド、C2−C20の直鎖Ｓ−アルキニルヒドラ
ジド、C2−C20の直鎖NH−アルキニルヒドラジド、C2−C
20の直鎖置換アルキニルヒドラジド、C2−C20の直鎖置
換Ｏ−アルキニルヒドラジド、C2−C20の直鎖置換Ｓ−
アルキニルヒドラジド、C2−C20の直鎖置換NH−アルキ
ニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖アルキニルヒドラジ
ド、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキニルヒドラジド、C3−C
50の分岐鎖Ｓ−アルキニルヒドラジド、C3−C50の分岐
鎖NH−アルキニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖置換ア
ルキニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキ
ニルヒドラジド、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキニル
ヒドラジド、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルキニルヒド
ラジド、C1−C20の直鎖アルカノール、C1−C20の直鎖Ｏ
−アルカノール、C1−C20の直鎖Ｓ−アルカノール、C1
−C20の直鎖NH−アルカノール、C1−C20の直鎖置換アル
カノール、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルカノール、C1−C
20の直鎖置換Ｓ−アルカノール、C1−C20の直鎖置換NH
−アルカノール、C2−C50の分岐鎖アルカノール、C2−C
50の分岐鎖Ｏ−アルカノール、C2−C50の分岐鎖Ｓ−ア
ルカノール、C2−C50の分岐鎖NH−アルカノール、C2−C
50の分岐鎖置換アルカノール、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ
−アルカノール、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルカノー
ル、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルカノール、C2−C20の
直鎖アルケノール、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケノール、C
2−C20の直鎖Ｓ−アルケノール、C2−C20の直鎖NH−ア
ルケノール、C2−C20の直鎖置換アルケノール、C2−C20
の直鎖置換Ｏ−アルケノール、C2−C20の直鎖置換Ｓ−
アルケノール、C2−C20の直鎖置換NH−アルケノール、C
3−C50の分岐鎖アルケノール、C3−C50の分岐鎖Ｏ−ア
ルケノール、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケノール、C3−C
50の分岐鎖NH−アルケノール、C3−C50の分岐鎖置換ア
ルケノール、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケノール、C
3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルケノール、C3−C50の分岐
鎖置換NH−アルケノール、C2−C20の直鎖アルキノー
ル、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキノール、C2−C20の直鎖Ｓ
−アルキノール、C2−C20の直鎖NH−アルキノール、C2
−C20の直鎖置換アルキノール、C2−C20の直鎖置換Ｏ−
アルキノール、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキノール、C
2−C20の直鎖置換NH−アルキノール、C3−C50の分岐鎖
アルキノール、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキノール、C3
−C50の分岐鎖Ｓ−アルキノール、C3−C50の分岐鎖NH−
アルキノール、C3−C50の分岐鎖置換アルキノール、C3
−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキノール、C3−C50の分岐鎖
置換Ｓ−アルキノール、C3−C50の分岐鎖置換NH−アル
キノール、C1−C20の直鎖アルカンチオール、C1−C20の
直鎖Ｏ−アルカンチオール、C1−C20の直鎖Ｓ−アルカ
ンチオール、C1−C20の直鎖NH−アルカンチオール、C1
−C20の直鎖置換アルカンチオール、C1−C20の直鎖置換
Ｏ−アルカンチオール、C1−C20の直鎖置換Ｓ−アルカ
ンチオール、C1−C20の直鎖置換NH−アルカンチオー
ル、C2−C50の分岐鎖アルカチオール、C2−C50の分岐鎖
Ｏ−アルカンチオール、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルカン
チオール、C2−C50の分岐鎖NH−アルカンチオール、C2
−C50の分岐鎖置換アルカンチオール、C2−C50の分岐鎖
置換Ｏ−アルカンチオール、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−
アルカンチオール、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルカン
チオール、C2−C20の直鎖アルケンチオール、C2−C20の
直鎖Ｏ−アルケンチオール、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケ
ンチオール、C2−C20の直鎖NH−アルケンチオール、C2
−C20の直鎖置換アルケンチオール、C2−C20の直鎖置換
Ｏ−アルケンチオール、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケ
ンチオール、C2−C20の直鎖置換NH−アルケンチオー
ル、C3−C50の分岐鎖アルケンチオール、C3−C50の分岐
鎖Ｏ−アルケンチオール、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケ
ンチオール、C3−C50の分岐鎖NH−アルケンチオール、C
3−C50の分岐鎖置換アルケンチオール、C3−C50の分岐
鎖置換Ｏ−アルケンチオール、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ
−アルケンチオール、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケ
ンチオール、C2−C20の直鎖アルキンチオール、C2−C20
の直鎖Ｏ−アルキンチオール、C2−C20の直鎖Ｓ−アル
キンチオール、C2−C20の直鎖NH−アルキンチオール、C
2−C20の直鎖置換アルキンチオール、C2−C20の直鎖置
換Ｏ−アルキンチオール、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アル
キンチオール、C2−C20の直鎖置換NH−アルキンチオー
ル、C3−C50の分岐鎖アルキンチオール、C3−C50の分岐
鎖Ｏ−アルキンチオール、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキ
ンチオール、C3−C50の分岐鎖NH−アルキンチオール、C
3−C50の分岐鎖置換アルキンチオール、C3−C50の分岐
鎖置換Ｏ−アルキンチオール、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ
−アルキンチオール、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
ンチオール。 本発明はまた、二つのオリゴヌクレオチド鎖を結び付
けるための、または、一本鎖の二つの離れた領域を結び
付けるためのオリゴヌクレオチドの架橋連結物も提供す
る。ある実施態様において、架橋連結物は構造： X1−L1−Ｙ−L2−X2 （式中X1は第一の鎖に共有結合で連結されており、X2は
第二の鎖または一本鎖のさらに別の領域に共有結合で連
結されており、およびここで： （ｉ） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2またはC
Oであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキル、C1−C
20の直鎖置換アルキル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2
−C50の分岐鎖置換アルキル、C2−C20の直鎖アルケニ
ル、C2−C20の直鎖置換アルケニル、C3−C50の分岐鎖ア
ルケニル、C3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C2−C20の
直鎖アルキン、C2−C20の直鎖置換アルキン、C3−C50の
分岐鎖アルキン、C3−C50の分岐鎖置換アルキン、ポリ
アミン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレングリ
コール、ポリエーテル、アリール、アラルキルまたはヘ
テロ環式であり；および Ｙはイミン、アミン、オキシム、ヒドロキシルアミ
ン、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジド−ヒ
ドラゾン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジド、セミ
カルバゾン、チオセミカルバジド、チオカルバゾン、ジ
スルフィド、ヘミアセタール、チオヘミアセタール、α
−ケト−アルキルチオアルキルまたはα−ケト−アルキ
ルアミノアルキルである；または （ii） X1およびX2は独立してＯまたはNHであり；およ
び L1−Ｙ−L2は一緒になってNH−L3−NHまたはNH−NH−
L3−NH−NHであり；および L3はC1−C20の直鎖アルキル、C1−C20の直鎖置換アル
キル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖置換
アルキル、C2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖置
換アルケニル、C3−C50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の
分岐鎖置換アルケニル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C
20の直鎖置換アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3
−C50の分岐鎖置換アルキン、ポリアミン、ポリアミ
ド、ポリエステル、ポリエチレングリコール、ポリエー
テル、アリール、アラルキルまたはヘテロ環式である；
または （iii） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2または
COであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキルアミ
ノ、C1−C20の直鎖置換アルキルアミノ、C2−C50の分岐
鎖アルキルアミノ、C2−C50の分岐鎖置換アルキルアミ
ノ、C2−C20の直鎖アルケニルアミノ、C2−C20の直鎖置
換アルケニルアミノ、C3−C50の分岐鎖アルケニルアミ
ノ、C3−C50の分岐鎖置換アルケニルアミノ、C2−C20の
直鎖アルキニルアミノ、C2−C20の直鎖置換アルキニル
アミノ、C3−C50の分岐鎖アルキニルアミノ、C3−C50の
分岐鎖置換アルキニルアミノ、C1−C20の直鎖アルキル
チオ、C1−C20の直鎖置換アルキルチオ、C2−C50の分岐
鎖アルキルチオ、C2−C50の分岐鎖置換アルキルチオ、C
2−C20直鎖アルケニルチオ、C2−C20の直鎖置換アルケ
ニルチオ、C3−C50の分岐鎖アルケニルチオ、C3−C50の
分岐鎖置換アルケニルチオ、C2−C20の直鎖アルキニル
チオ、C2−C20の直鎖置換アルキニルチオ、C3−C50の分
岐鎖アルキニルチオ、C3−C50の分岐鎖置換アルキニル
チオであり；および Ｙはヘテロ二官能性またはホモ二官能性架橋試薬であ
る； ここで前記置換アルキル、置換アルケニルおよび置換ア
ルキン部分の前記置換基はインターカレーター、コンジ
ュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリ
コール、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を促進する
基またはオリゴヌクレオチドの薬物動力学的性質を促進
する基である）を持っている。 以下の実施例に示すごとく、本発明はさらに配列特異
的オリゴヌクレオチドを設定したコンフィギュレーショ
ンに固定する方法も含んでいる。これらの方法にはオリ
ゴヌクレオチド中の第一の部位を選択することが含まれ
ている。第一の部位はヌクレオチドの第一の特異的配列
を持つように選択される。第一の結合前駆体は第一の部
位のヌクレオチドの一つの糖部分へ結合される。第一の
結合前駆体は共有結合を形成するためのものである。こ
の方法はオリゴヌクレオチド中の第二の部位を選択する
ことを含んでいる。第二の部位はヌクレオチドの第二の
特異的配列を持つように選択される。第二の結合前駆体
は第二の部位のヌクレオチドの糖部分へ結合される。第
二の結合前駆体もまた共有結合を形成するためのもので
ある。本方法はさらに第一および第二の結合前駆体間に
共有結合による架橋結合を形成させることを含んでい
る。共有結合による架橋結合はオリゴヌクレオチドの一
次構造を決定するリン酸ヌクレオシド間結合とは独立し
ている。ある実施態様においては、この方法はさらにヌ
クレオチドの前駆体と適当な試薬を反応させることによ
り、第一の部位のヌクレオチドの糖部分に第一の結合前
駆体を結合させ、保護および活性化形にするために誘導
体化し、続いて誘導体化されたヌクレオチド前駆体を第
一のヌクレオチド配列内へ合成的に取り込ませることを
含んでいる。さらに別の実施態様において、本方法はさ
らにヌクレオチドの前駆体と適当な試薬を反応させるこ
とにより、第二の部位のヌクレオチドの糖部分に第二の
結合前駆体を結合させ、保護および活性化形にするため
に誘導体化し、続いて誘導体化されたヌクレオチド前駆
体を第二のヌクレオチド配列内へ合成的に取り込ませる
ことを含んでいる。 本発明はさらにオリゴヌクレオチドの鎖内架橋結合の
ための方法を含んでいる。ある実施態様においては、こ
の方法はオリゴヌクレオチド中の第一のヌクレオチド配
列および第二のヌクレオチド配列を選択し、第一の配列
内へ脱塩基ヌクレオチドを取り込ませ、第二の配列のヌ
クレオチドに結合前駆体を結合させ、および脱塩基部位
と結合前駆体の間に共有結合による架橋結合を形成させ
る工程を含んでいる。 別の実施態様において、この方法はオリゴヌクレオチ
ド中の第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチ
ド配列を選択し、第一の特異的配列のヌクレオチドの糖
部分に第一の結合前駆体を結合させ、第二の特異的配列
のヌクレオチドの糖部分に第二の結合前駆体を結合さ
せ、第一の結合前駆体と第二の結合前駆体の間に共有結
合による架橋結合を形成させることを含んでいる。この
共有結合による架橋結合はオリゴヌクレオチドの一次構
造を決定するリン酸ヌクレオシド間結合とは独立してい
る。好適には、第一のヌクレオチド配列は第二のヌクレ
オチド配列と相補的でハイブリダイズ可能であるように
選択される。 本発明はさらに第一のオリゴヌクレオチド鎖中の第一
のヌクレオチド配列を選択し、第二のオリゴヌクレオチ
ド鎖中の第二のヌクレオチド配列を選択し、第一のヌク
レオチド配列内へ脱塩基ヌクレオチドを取り込ませ、第
二の配列のヌクレオチドに結合前駆体を結合し、および
脱塩基部位および結合前駆体の間に共有結合による架橋
結合を形成させる工程を含んでいる。これらの方法はさ
らに、第二のヌクレオチド配列と相補的でありハイブリ
ダイズ可能である第一のヌクレオチド配列を選択し、第
二の配列のヌクレオチドの2'−位に結合前駆体を結合さ
せ、脱塩基部位にアルデヒド官能基を形成させることを
含むことができる。結合前駆体は脱塩基部位アルデヒド
官能基とオキシム、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾ
ン、チオセミカルバゾン、ヒドラジド−ヒドラゾン、ヘ
ミアセタールまたはチオヘミアセタール連結基を形成で
きなければならない。 本発明はさらに、第一のオリゴヌクレオチド鎖中の第
一のヌクレオチド配列を選択し、第二のオリゴヌクレオ
チド鎖中の第二のヌクレオチド配列を選択し、第一の配
列のヌクレオチドの糖部分に第一の結合前駆体を結合さ
せ、第二の配列のヌクレオチドの糖部分に結合前駆体を
結合させ、および第一および第二の結合前駆体の間に共
有結合による架橋結合を形成させる工程を含む、第一お
よび第二のオリゴヌクレオチド鎖の架橋法を含んでい
る。この共有結合による架橋結合はオリゴヌクレオチド
の一次構造を決定するリン酸ヌクレオシド間結合とは独
立している。 以下の実施例は本発明の例示である。本発明はこれら
の例示的実施例には制限されず、単にここに付随する請
求の範囲によることを理解されたい。 実施例１ 標準オリゴヌクレオチド合成 オリゴヌクレオチド合成は、製造業者によって提供さ
れる試薬を使用して、標準ホスホアミダイト法およびサ
イクルに従うApplied Biosystems380Bまたは394DNA合
成器で行った。変性ホスホアミダイトを使用するとき、
より長いカップリング時間（10−15分）を用いた。オリ
ゴヌクレオチドは”トリチル−オン”方法で10μmol規
模または３×１μmol規模のいずれかで通常は合成し
た。標準的な脱保護条件（30％NH4OH、55℃、16時間）
を用いた。HPLCはモデル991検出器を備えたWaters600E
装置で行った。分析クロマトグラフィーには、次の逆相
HPLC条件を用いた：ハミルトンPRP−１カラム（15×2.5
cm）；溶剤A:50mmTEAA、pH7.0;溶媒B:80％CH3CNを含む4
5mmTEAA;流速:1.5ml/分；勾配：初めの５分は５％Ｂ、
その後、Ｂは毎分直線（１％）的増加。調整のために、
次の逆相HPLC条件を用いた:Waters Delta PakWaters
Delta−Pak C415μｍ、300A、同じ材料のグアードカ
ラムを備えた25×100mmカラム；カラム流速:5ml/分；勾
配：はじめの10分は５％Ｂ、その後、毎分直線（１％）
的増加。HPLC精製に続いて、オリゴヌクレオチドを脱ト
リチル化し、そしてさらにセファデックスＧ−25カラム
を使用してサイズをより分けることにより精製する。全
てのオリゴヌクレオチド配列は左から右へ順に標準５′
−３′となる。 実施例２ 空間スパニング基および活性官能基を有する活性化およ
び保護化ヌクレオチドの製造 A. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（官能化空
間スパニング基）ヌクレオシドホスホアミダイト i. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペンチル
−Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシンホスホ
アミダイト ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペンチル−
Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシンホスホア
ミダイトは、アデノシンから出発する米国特許出願US91
/00243および463,358（引例としてここに挙げる）の手
順に従って合成した。簡単に述べると、この手順はアデ
ノシンをDMF中のNaHで処理し、その後、Ｎ−（５−ブロ
モペンチル）フタルイミド（メリーランド州ロックビル
のトランスワールド・ケミカル社）で処理するものであ
る。さらに（CH3）3SiCl、Ph−Ｃ（Ｏ）−ClおよびNH4O
Hで処理するとN6−ベンジル保護化２′−ペンチル−Ｎ
−フタルイミド官能化アデノシンが生じた。DIPAおよび
CH2Cl2で処理すると、５′−位置にDMTブロッキング基
が加わった。最後にホスフィチル化すると希望のホスホ
アミダイト化合物が得られた。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（２−メ
チルオクチル−Ｎ−フタルイミド）−N4−ベンジルシチ
ジンホスホアミダイト a. Ｎ−（８−ブロモ−２−メチルオクチル）フタルイ
ミド ８−ブロモ−２−メチルアミノオクタンを還流下、ト
リエチルアミンの存在下、トルエン中の無水フタル酸で
処理する。溶剤を真空中で除去する。残留物を水中で粉
砕し、塩酸で酸性化し、そしてアルコールから結晶化す
ると、Ｎ−（８−ブロモ−２−メチルオクチル）フタル
イミドが生じる。 b. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（２−メチ
ルオクチル−Ｎ−フタルイミド）−N4−ベンジルシチジ
ンホスホアミダイトの製造 シチジンを、実施例２−Ａ−ｉの手順を用いて、NaH
およびＮ−（８−ブロモ−２−メチルオクチル）フタル
イミドで処理し、次にDIPAおよびCH2Cl2で処理し、そし
てホスフィチル化すると、５′−ジメトキシトリチル−
２′−Ｏ−（２−メチルオクチル−Ｎ−フタルイミド）
−Ｎ−ベンジルシチジンホスホアミダイトが得られる。 c. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（２−エイ
コシル−Ｎ−フタルイミド）アデノシンホスホアミダイ
ト Ｎ−（20−ブロモエイコシル）フタルイミドを、実施
例２−Ａ−ii−ａの手順に従って、１−アミノ−20−ブ
ロモエイコサンから製造する。アデノシンを、実施例２
−Ａ−iiの手順に従って、DMF中のNaHおよび１−アミノ
−20−ブロモエイコサンで処理し、ベンジル化し、DIPA
およびCH2Cl2で処理し、そしてホスフィチル化すると、
表題化合物が生じる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（２−エ
イコシル−Ｎ−フタルイミド）ウリジンホスホアミダイ
ト Ｎ−（20−ブロモエイコシル）フタルイミドを、実施
例２−Ａ−ii−ａの手順に従って、１−アミノ−20−ブ
ロモエイコサンから製造する。ウリジンはアキヤマ等、
NOTES Bull.Chem.Soc.Jpn.、1990、63、3356の手順に
従って処理すると、３−（４−メトキシフェニルメチ
ル）−３′.5′−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサ
ン−1,3−ジイル）ウリジンが得られる。簡単に述べる
と、この処理はまずウリジンの３′および５′糖ヒドロ
キシルをブロックし、その後、ピリミジン複素環のN3イ
ミド基をｐ−メトキシベンジル基でブロックするもので
ある。Ag2OおよびＮ−（20−ブロモエイコシル）フタル
イミドでブロック化ウリジンを処理すると、２′−アル
キル化ブロック化中間体化合物が生じる。テトライソプ
ロピルジシロキサンブロッキング基は、ウリジン中間体
をCH2CN中に取り、そして60％HFで処理することによっ
て除去される。ｐ−メトキシフェニルメチルブロッキン
グ基は、N2雰囲気下、アニソール中のAlCl3で、次にHCl
で処理することによって除去される。これらの手順は共
にアキヤマ等の上記手順に従って行う。さらに実施例２
−Ａ−iiの手順に従って、DIPAおよびCH2Cl2で処理し
て、５′−位置にDMTブロッキング基を加え、次にホス
フィチル化すると、表題化合物が生じる。 iv ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（２−アミ
レニル−Ｎ−フタルイミド）−N2−イソブチリルグアノ
シンホスホアミダイト Ｎ−（５−ブロモ−２−アミレニル）フタルイミドを
実施例２−Ａ−ii−ａの手順に従って１−アミノ−５−
ブロモアミル−２−エンから製造する。３′,5′−Ｏ−
（テトライソプロピルジシロキサン−1,3−ジイル）−
２−クロロ−６−（2,6−ジクロロフェノキシ）プリン
リボシドをSproat.Nuceic Acid Res.、1990、18、41
に従って製造する。この化合物をまず最初の化合物で処
理し、次に脱ブロックし、Sproat、Nucleic Acid Res
earch、1991、19、733の手順を用いてアデノシンデアミ
ナーゼで酵素による脱アミノ化すると、希望の２′−ア
ルキル化グアノシン中間体が生じる。さらにこのアルキ
ル化グアノシン中間体を実施例２−Ａ−ｉの手順に従っ
て、（CH3）3SiCl、塩化イソブチリルおよびNH4OHで処
理するとN2−イソブチリル保護化２′−アミルエニル−
Ｎ−フタルイミド官能化グアノシンが生じる。DIPAおよ
びCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキング基
を加え、次にホスフィチル化すると、希望のホスホアミ
ダイト化合物が得られる。 ｖ ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（エチル−
Ｎ−フタルイミド）チミジンホスホアミダイト チミジンをブロックし、Ag2OおよびＮ−（２−ブロモ
エチル）フタルイミド（ウイスコンシン州ミルウォーキ
ーのアルドリッチ・ケミカル社）で実施例２−Ａ−iii
の手順に従って処理し、さらに実施例２−Ａ−ｉの手順
に従ってDIPAおよびCH2Cl2で処理して５′−位置にDMT
ブロッキング基を加え、最後にホスフィチル化すると、
表題化合物が生じる。 vi 他の５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（フタ
ルイミドブロック化アミン官能化空間スパニング基）−
ヌクレオシドホスホアミダイト a. Ｎ−（Ω−ブロモアルキル、Ω−ブロモアルケニル
およびΩ−ブロモアルキニル）フタルイミドの製造 実施例２−Ａ−ii−ａの方法において、アミン官能化
空間スパニング基として用いる次のΩ−ブロモフタルイ
ミドブロック化アミン化合物を製造することができる： Ｎ−（７−ブロモヘプチル）フタルイミド;N−（８−
ブロモオクチル）フタルイミド;N−（９−ブロモノニ
ル）フタルイミド;N−（10−ブロモドデシル）フタルイ
ミド;N−（11−ブロモウンデシル）フタルイミド;N−
（12−ブロモドデシル）フタルイミド;N−（12−ブロモ
ドデシル）フタルイミド;N−（13−ブロモトリデシル）
フタルイミド;N−（14−ブロモテトラデシル）フタルイ
ミド;N−（15−ブロモペンタデシル）フタルイミド;N−
（ブロモヘキサデシル）フタルイミド;N−（17−ブロモ
ヘプタデシル）フタルイミド;N−（18−ブロモオクタデ
シル）フタルイミド;N−（19−ブロモノナデシル）フタ
ルイミド;N−（３−ブロモ−２−メチルプロピル）フタ
ルイミド;N−（４−ブロモ−２−メチル−３−エチルブ
チル）フタルイミド;N−（３−ブロモ−2,2−ジエチル
プロピル）フタルイミド;N−（４−ブロモ−３−プロピ
ルブチル）フタルイミド;N−（10−ブロモ−2,8−ジブ
チルデシル）フタルイミド;N−（８−ブロモ−6,6−ジ
メチルオクチル）フタルイミド;N−（８−ブロモ−６−
プロピル−６−ブチルオクチル）フタルイミド;N−（４
−ブロモ−２−メチルブチル）フタルイミド;N−（５−
ブロモ−２−メチルペンチル）フタルイミド;N−（５−
ブロモ−３−メチルペンチル）フタルイミド;N−（６−
ブロモ−２−エイルヘキシル）フタルイミド;N−（５−
ブロモ−３−ペンテン−２−オン）フタルイミド;N−
（４−ブロモ−３−メチル−２−ブタノール）フタルイ
ミド;N−（８−ブロモ−３−アミノ−２−シアノオクチ
ル）フタルイミド;N−（７−ブロモ−３−メトキシ−４
−ヘプタナール）フタルイミド;N−（４−ブロモ−２−
ヨード−３−ニトロブチル）フタルイミド;N−（12−ブ
ロモ−４−イソプロポキシドデシル）フタルイミド;N−
（10−ブロモ−４−アジド−２−ニトロデシル）フタル
イミド;N−（９−ブロモ−５−メルカプトノニル）フタ
ルイミド;N−（５−ブロモ−４−アミノペンテニル）フ
タルイミド;N−（５−ブロモペンテン−２−イル）フタ
ルイミド;N−（３−ブロモアリル）フタルイミド;N−
（４−ブロモクロチル）フタルイミド;N−（３−ブロモ
プロパルギル）フタルイミド;N−（１−ブロモナフト−
４−イル）フタルイミド;N−（２−ブロモアントラク−
７−イル）フタルイミド；およびＮ−（２−ブロモフェ
ナントル−６−イル）フタルイミド。 b. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（Ｎ−フタ
ルイミド官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホ
アミダイトの製造 実施例２−Ａ−ｉ、２−Ａ−ii−ｂ、２−Ａ−iii、
２−Ａ−ivおよび２−Ａ−ｖの方法において、次の５′
−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（空間スパニング基
−Ｎ−フタルイミド）ヌクレオシドホスホアミダイトを
製造することができる。 ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ドデシル−
Ｎ−フタルイミド）−N4−ベンジルシチジンホスホアミ
ダイト;5′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（テトラ
ドデシル−Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシ
ンホスホアミダイト;5′−ジメトキシトリチル−２′−
Ｏ−（２−メチルプロピル−Ｎ−フタルイミド）ウリジ
ンホスホアミダイト;5′−ジメトキシトリチル−２′−
Ｏ−（2,8−ジブチルデシル−Ｎ−フタルイミド）−N2
−イソブチリルグアノシンホスホアミダイト;5′−ジメ
トキシトリチル−２′−Ｏ−（３−メチルペンチル−Ｎ
−フタルイミド）チミジンホスホアミダイト;5′−ジメ
トキシトリチル−２′−Ｏ−（２−シアノオクチル−Ｎ
−フタルイミド）−N4−ベンジルシチジンホスホアミダ
イト;5′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（３−メト
キシ−４−ヘプタナール−Ｎ−フタルイミド）ウリジン
ホスホアミダイト;5′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ
−（３−ニトロブチル−Ｎ−フタルイミド）−N6−アデ
ノシンホスホアミダイト;5′−ジメトキシトリチル−
２′−Ｏ−（プロパルギル−Ｎ−フタルイミド）−N2−
イソブチリルグアノシンホスホアミダイト；および５′
−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（３−アントラク−
７−イル−Ｎ−フタルイミド）チミジンホスホアミダイ
ト。 B. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｓ−（アミン官
能化空間スパニング基）−２′−デオキシ−ヌクレオシ
ドホスホアミダイトの製造 i. Ｎ−（１−ブロモ−８−ドデシル）フタルイミドの
製造 McArthur等のSynth.Commun.、1983、13、311の反応条
件を用いて、１−アミノドデシル−12−オールをＮ−エ
トキシカルボニルフタルイミドで処理して、Ｎ−（ドデ
シル−12−オール）フタルイミドを得、そしてこれをHa
ll等のSynthetic Procedures in Nucleic Acid Ch
emistry、編集者ZorbachおよびTipson、Vol.1、ジョン
・ウイレー アンド サンズ、1968の反応条件を用いて
三臭化リンおよびピリジンで処理すると、Ｎ−（12−ブ
ロモドデシル）フタルイミドが生じる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｓ−（ドデク
−12−Ｎ−フタルイミド）−２′−デオキシウリジンホ
スホアミダイト ２′−デオキシ−２−チオウリジンはDivakar、JChe
m.Soc.Perkin Trans.、1990、１、969の手順に従って
製造する。２′−デオキシ−２−チオウリジンをDMF中
のNaHで処理し、次にＮ−（12−ブロモドデシル）フタ
ルイミドで処理すると、２′−Ｓ−（ドデシル−Ｎ−フ
タルイミド）官能化ウリジンが生じる。DIPAおよびCH2C
l2で処理して５′−位置にDMTブロッキング基を加え、
次に、ホスフィチル化すると、希望のホスホアミダイト
化合物が得られる。 C. ５′−ジメトキシトリチル−２′−NH−（アルキル
−Ｎ−フタルイミド）−２′−デオキシ−ヌクレオシド
ホスホアミダイトの製造 i. Ｎ−（ブチル−４−アル）フタルイミド（Ω−アル
デヒド性末端α−Ｎ−フタルイミド官能化空間スパニン
グ基） 実施例２−Ａ−ii−ａの手順に従って、４−アミノブ
チルアルデヒドエチルアセタール（ウイスコンシン州ミ
ルウィーキーのアルドリッチ・ケミカル社）をトリエチ
ルアミンの存在下、トルエン中の無水フタル酸で処理す
ると、ブチル基の１−位置にＮ−フタルイミドブロック
化アミン基および４−位置にジエチルアセタールブロッ
ク化アルデヒド基が得られる。ジエチルアセタールブロ
ッキング基を酸触媒加水分解によって除くと、Ｎ−（ブ
チル−４−アール）フタルイミドが得られる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−NH−（ブチル
−Ｎ−フタルイミド）−２′−デオキシ−N6−ベンジル
アデノシンホスホアミダイト ２′−アミノ−N6−ベンジル−２′−デオキシアデノ
シンをG.Burker等、J.Carbohydrates,Nucleosides,Nucl
eotides、1988、７、63の手順に従って製造し、そして
Ｎ−（ブチル−４−アール）フタルイミドを乾燥CH2Cl2
中で撹拌する。溶剤を除去し、残留物をNaOAcバッファ
ー（pH5.02）に取り、NaCNBHで処理して、中間体イミン
を希望のアミン結合官能基に還元する。さらに、実施例
２−Ａ−ｉの手順に従ってDIPAおよびCH2Cl2で処理し
て、５′−位置にDMTブロッキング基を加え、次にホス
フィチル化すると、表題化合物が生じる。 D. ５′−ジメトキシトリチル−２′−（アルキル−Ｎ
−フタルイミド）−２′−デオキシ−ヌクレオシドホス
ホアミダイトの製造 ２′が直接アルキル化されたヌクレオチド（すなわ
ち、メチレン結合基が空間スパニング基をヌクレオチド
糖部分の２′−位置に結合している）のオリゴヌクレオ
チドへの導入は、相当するヌクレオシドを遊離基アルキ
ル化し、次に、適当な５′−ジメトキシトリチルホスホ
アミダイトヌクレオチドに変換することによって行う。 i. ５′−ジメトキシトリチル−２′−（アリル−Ｎ−
フタルイミド）−２′−デオキシ−N6−ベンジルアデノ
シンホスホアミダイト Flandor等、Tetrahedron Letters、1990、31、597に
記載の条件と同様な条件を用いて、２′−Ｏ−（フェノ
キシチオキソメチル）−２′−デオキシアデノシンをＮ
−（５−ブロモペンテン−２−イル）フタルイミド（実
施例２−Ａ−viから）および水素化トリブチルスズで処
理して、ヌクレオシドの２′−位置での遊離基アルキル
化を行う。得られたアルキル化化合物をさらに（CH3）3
SiCl、Ph−Ｃ（Ｏ）−ClおよびNH4OHで処理すると、N6
−ベンジル保護化２′−（Ｎ−（ペンテン−２−イル）
フタルイミド）官能化アデノシンが得られる。これをそ
の後DIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブ
ロッキング基を加え、次にホスフィチル化すると（全
て、実施例２−Ａ−ｉの手順に従って）、希望のホスホ
アミダイト化合物が生じる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−（アリル−Ｎ
−フタルイミド）−２′−デオキシウリジンホスホアミ
ダイト Flandor等、Tetrahedron Letters、1990、31、597に
記載の条件と同様な条件を用いて、２′−Ｏ−（フェノ
キシチオキソメチル）−２′−デオキシウリジンをＮ−
（５−ブロモペンテン−２−イル）フタルイミド（実施
例２−Ａ−viから）および水素化トリブチルスズで処理
して、ヌクレオシドの２′−位置での遊離基アルキル化
を行う。得られたアルキル化化合物をさらにDIPAおよび
CH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキング基を
加え、次にホスフィチル化すると（全て、実施例２−Ａ
−iiiの手順に従って）、希望のホスホアミダイト化合
物が生じる。 E. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ヒドラジ
ン官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホアミダ
イトの製造 i. ８−ブロモオクチルベンジルカルバジド（Ω−ブロ
モカルバジド保護化Ω−ヒドラジン官能化空間スパニン
グ基） ８−ブロモオクタールをピリジン中で塩化トシルでト
シレート化する。溶剤を除去し、８−ブロモオクタノー
ルＯ−トシレートを無水ジメチルアセトアミド中でベン
ジルカルバジドおよび活性化分子ふるいで一晩、110℃
にて処理する。溶剤を除去し、残留物をシリカゲルクロ
マトグラフィーで精製すると、ブロモオクタ−８−イル
ベンジルカルバジドが生じる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクト
−８−イルベンジルカルバジド）ウリジンホスホアミダ
イト 実施例２−Ａ−iiiの方法を用いて、ウリジンを８−
ブロモオクチルベンジルカルバジドで処理すると、表題
化合物が得られる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクト
−８−イルベンジルカルバジド）−N4−ベンジルシチジ
ンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ii−ｂの方法を用いて、シチジンを８
−ブロモオクチルベンジルカルバジドで処理すると、表
題化合物が得られる。 iv. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクト
−８−イルベンジルカルバジド）−N2−イソブチリルグ
アノシンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ivの方法を用いて、グアノシンを８−
ブロモオクチルベンジルカルバジドで処理すると、表題
化合物が得られる。 v. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクト−
８−イルベンジルカルバジド）−N6−ベンジルアデノシ
ンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ｉの方法を用いて、アデノシンを８−
ブロモオクチルベンジルカルバジドで処理すると、表題
化合物が得られる。 F. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ヒドロキ
シルアミン官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホス
ホアミダイトの製造 i. Ｏ−（８−ブロモオクタノール）フタルイミド（α
−ブロモＯ−フタルイミド保護化Ω−ヒドロキシルアミ
ン官能化空間スパニング基） 1,8−オクタンジオールを酸の存在下、１当量のジヒ
ドロピランで処理して６−（テトラヒドロピラン−２−
イル）オクタノールを得る。ミツノブ反応条件を用い
て、DMF中の８−（テトラヒドロピラン−２−イル）オ
クタノール、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドおよびトリフ
ェニルホスフィンを０℃で、ジイソプロピルアゾジカル
ボキシレートで処理して、Ｏ−［８−（テトラヒドロピ
ラン−２−イル）オクタノール］フタルイミドを得る。
Ｏ−［８−（テトラヒドロピラン−２−イル）オクタノ
ール］フタルイミドを酸で処理すると、Ｏ−（オクタノ
ール）フタルイミドが生じ、これをHall等、Synthetic
Procedures in Nucleic Acid Chemistry、編集者
Zorbach and Tipson、Vol.1、ジョン・ウイレー ア
ンドサンズ、1968の反応条件を用いて、三臭化リンで処
理すると、Ｏ−（８−ブロモオクタノール）フタルイミ
ドが生じる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクタ
ン−８−オール−Ｏ−フタルイミド）−N4−ベンジルシ
チジンホスホアミダイト シチジンをDMF中のNaHで処理し、次に、実施例２−Ｆ
−ｉからのＯ−（８−ブロモオクタノール）フタルイミ
ドで処理する。さらに、（CH3）3SiCl、Ph−Ｃ（Ｏ）−
ClおよびNH4OHで処理すると、N4−ベンジル保護化２′
−オクチル−Ｏ−フタルイミド官能化シチジンが生じ
る。DIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブ
ロッキング基を加える。実施例２−Ａ−iiの手順に従っ
て、最後にホスフィチル化すると、希望のホスホアミダ
イト化合物が得られる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（オクタ
ン−８−オール−Ｏ−フタルイミド）ウリジンホスホア
ミダイト ウリジンをブロックし、そしてAg2Oおよび実施例２−
Ｆ−ｉからのＯ−（８−ブロモオクタノール）フタルイ
ミドで処理する。DIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−
位置にDMTブロッキング基を加える。実施例２−Ａ−iii
の手順に従って、最後にホスフィチル化すると、希望の
ホスホアミダイト化合物が得られる。 G. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（セミカル
バジド官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホア
ミダイトの製造 i. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペント−
５−イルセミカルバジド）ウリジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiiの方法を用いて、ウリジンをブロ
ックし、そしてAg2OおよびＮ−（８−ブロモペニル）セ
ミカルボジドで処理すると、表題化合物が得られる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ペント
−５−イルセミカルバジド）−N6−ベンジルアデノシン
ホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ｉの方法を用いて、アデノシンをＮ−
（８−ブロモペニル）セミカルボジドで処理すると、表
題化合物が得られる。 H. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（ヒドラジ
ド官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホアミダ
イトの製造 i. α−クロロエトキシカルボニルエタン 塩化クロロアセチル（ペンシルバニア州エマウスのエ
アー・プロダクツ社）を撹拌エタノールに滴加して酸塩
化物をエステル化する。次に、エステルを蒸留によって
回収する。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（エトキ
シカルボニルエチル）ウリジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiiの手順に従って、ウリジンをブロ
ックし、そしてAg2Oおよびα−クロロエトキシカルボニ
ルエタンで処理すると、表題化合物が得られる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（エト−
２−イルヒドラジド）ウリジンホスホアミダイト ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（エトキシカ
ルボニルエチル）ウリジンホスホアミダイトをヒドラジ
ンで処理すると、相当する２′−Ｏ−（エチルヒドラジ
ン）ウリジン表題化合物が得られる。 I. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（アルコー
ル官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホアミダ
イトの製造 i. １−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−７−
ブロモヘプタノール ７−ブロモヘプタノールを酸の存在下でジヒドロピラ
ンで処理すると、１−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−
イル）−７−ブロモヘタノールが得られる。 ii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［Ｏ−
（テトラヒドロピラン−２−イル）ヘプタン−７−オー
ル）］−N4−ベンジルシチジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiの手順に従って、シチジンを１−Ｏ
−（テトラヒドロピラン−２−イル）−７−ブロモヘプ
タノールで処理すると、表題化合物が得られる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［Ｏ−
（テトラヒドロピラン−２−イル）ヘプタン−７−オー
ル）］ウリジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiiの手順に従って、ウリジンをAg2O
および１−Ｏ−（テトラヒドロピラン−２−イル）−８
−ブロモヘタノールで処理すると、表題化合物が得られ
る。 J. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏまたは２′−
Ｓ−（チオール官能化空間スパニング基）ヌクレオシド
ホスホアミダイトの製造 i. 2,2′−無水ピリミジンの開環による a. ２′−Ｓ−（オクタン−８−チオール）チミジン 2,2′−無水チミジンをオクタン−1,8−ジチオールで
開環すると、２′−Ｓ−（オクタン−８−チオール）チ
ミジンが得られる。 b. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｓ−［Ｓ−トリ
チル−（オクタン−８−チオール）］−２′−デオキシ
−チミジンホスホアミダイト ２′−Ｓ−（オクタン−８−チオール）チミジンを塩
化トリチルで処理すると２′−Ｓ−［Ｓ−トリチル−
（オクタン−８−チオール）］チミジンが得られ、次
に、これをさらにDIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−
位置にDMTブロッキング基を加え、そして実施例２−Ａ
−ｖの手順に従って最後にホスフィチル化すると、表題
化合物が得られる。 ii. Ｏ−アルキル化による a. １−Ｓ−トリチル−８−ブロモヘキサンチオール ８−ブロモヘキサンチオールを塩化トリチルでトリチ
ル化すると１−Ｓ−トリチル−８−ブロモヘキサンチオ
ールが得られる。 b. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［Ｓ−トリ
チル−（ヘキサン−８−チオール）］−N6−ベンジルア
デノシンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ｉに従ってアデノシンをDMF中のNaHで
処理する。次に、反応生成物を１−Ｓ−トリチル−８−
ブロモヘキサンチオールで、続いて（CH3）3SiCl、Ph−
Ｃ（Ｏ）−ClおよびNH4OHで処理するとN6−ベンジル保
護化２′−Ｏ−［Ｓ−トリチル−（ヘキシル−８−チオ
ール）］官能化アデノシンが生じる。さらに実施例２−
Ａ−ｉの手順に従って、DIPAおよびCH2Cl2で処理して、
５′−位置にDMTブロッキング基を加え、ホスフィチル
化すると、表題化合物が得られる。 c. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［Ｓ−トリ
チル−（ヘキサン−８−チオール）］ウリジンホスホア
ミダイト 実施例２−Ａ−iiiに従って、ウリジンをブロック
し、次にAg2Oおよび１−Ｓ−トリチル−８−ブロモヘキ
サンチオールで処理する。そしてさらに実施例２−Ａ−
iiiの手順に従って、反応生成物をDIPAおよびCH2Cl2で
処理して、５′−位置にDMTブロッキング基を加え、最
後にホスフィチル化すると、表題化合物が得られる。 d. １−Ｓ−トリチル−８−ブロモペンタンチオール ８−ブロモペンタンチオールを塩化トリチルでトリチ
ル化すると１−Ｓ−トリチル−８−ブロモペンタンチオ
ールが得られる。 e. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［Ｓ−トリ
チル−（ペンタン−８−チオール）］ウリジンホスホア
ミダイト 実施例２−Ａ−iiiに従って、ウリジンをブロック
し、次に、実施例２−Ａ−iiiの手順に従って、Ag2Oお
よび１−Ｓ−トリチル−８−ブロモペンタンチオールで
処理し、その後、DIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−
位置にDMTブロッキング基を加え、最後にホスフィチル
化すると、表題化合物が得られる。 K. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−（保護化ア
ルデヒド官能化空間スパニング基）ヌクレオシドホスホ
アミダイトの製造 i. アセタール官能化での製造 a. N6−ベンジル−５′−ジメトキシトリチル−２′−
Ｏ−［プロピオン−３−アールビス（ｏ−ニトロベンジ
ルアセタール）アデノシンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ｉの手順に従ってアデノシンをNaHお
よび３−ブロモプロピオンアルデヒドで処理する。さら
に実施例２−Ａ−ｉの手順に従って（CH3）3SiCl、Ph−
Ｃ（Ｏ）−ClおよびNH4OHで処理してベンジルブロッキ
ング基を加え、その後、DIPAおよびCH2Cl2で処理して、
５′−位置にDMTブロッキング基を加え、ホスフィチル
化すると、希望の化合物が得られる。 b. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［プロピオ
ン−３−アールビス（ｏ−ニトロベンジルアセタール）
ウリジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiiの手順に従って、ウリジンをブロ
ックし、次にAg2Oおよび３−ブロモプロピオンアルデヒ
ドビス（ｏ−ニトロベンジル）アセタールで処理する。
実施例２−Ａ−ｉの手順に従って、さらにDIPAおよびCH
2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキング基を加
え、ホスフィチル化すると希望の化合物が得られる。 ii. 臭化６−（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル ６−ブロモヘキシオニル酸塩化物をエチルメルカプタ
ンで処理する。得られたエチルチオール−６−ブロモヘ
キシオネートを次にラニーニッケルで脱硫すると６−ブ
ロモヘキセナールが得られる。そして６−ブロモヘキセ
ナールをベンゼン/DMSO中で1,2−ジアニリノエチレンで
処理すると表題の臭化６−（ジフェニルイミダゾリジ
ノ）ヘキシルガ得られる。 iii. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［６−
（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル］−N2−イソブ
チリルグアノシンホスホアミダイト ３′,5′−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−
1,3−ジイル）−２−クロロ−６−（2,6−ジクロロフェ
ノキシ）プリンリボシドを実施例２−Ａ−ivに従って臭
化６−（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシルと反応さ
せる。さらに（CH3）3SiCl、塩化イソブチリルおよびNH
4OHで処理するとN2−イソブチリル保護化２′−（ジフ
ェニルイミダゾリジノ）ヘキシル官能化グアノシンが生
じる。さらに実施例２−Ａ−ivの手順に従って、DIPAお
よびCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキング
基を加え、ホスフィチル化すると、表題化合物が得られ
る。 iv. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［６−
（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル］−N6−ベンジ
ルアデノシンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−ｉに従って、アデノシンをNaH/DMFで
処理し、次に臭化６−（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘ
キシルで処理する。さらに（CH3）3SiCl、塩化ベンジル
およびNH4OHで処理するとN6−ベンジル保護化２′−
（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル官能化グアノシ
ンが生じる。さらに実施例２−Ａ−ｉに従って、DIPAお
よびCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキング
基を加え、ホスフィチル化すると、表題化合物が得られ
る。 v. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［６−（ジ
フェニルイミダゾリジノ）ヘキシル］−N4−ベンジルシ
チジンホスホアミダイト 実施例２−Ａ−iiに従って、シチジンをNaH/DMFで処
理し、次に、臭化６−（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘ
キシルで処理する。さらに（CH3）3SiCl、塩化ベンジル
およびNH4OHで処理するとN4−ベンジル保護化２′−
（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル官能化シチジン
が生じる。さらに実施例２−Ａ−iiの手順に従って、DI
PAおよびCH2Cl2で処理して、５′−位置にDMTブロッキ
ング基を加え、ホスフィチル化すると、表題化合物が得
られる。 vi. ５′−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−［６−
（ジフェニルイミダゾリジノ）ヘキシル］ウリジンホス
ホアミダイト 実施例２−Ａ−iiiに従って、ウリジンをブロック
し、次に、Ag2Oおよび臭化（ジフェニルイミダゾリジ
ノ）ヘキシルで処理する。さらに実施例２−Ａ−iiの手
順に従って、DIPAおよびCH2Cl2で処理して、５′−位置
にDMTブロッキング基を加え、ホスフィチル化すると、
表題化合物が得られる。 実施例３ 脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチドの製造 A. 酵素反応による脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチ
ドの製造 i. 単一ウリジン部位を含むオリゴヌクレオチド 配列： （式中、Ｕ＊は２′−デオキシウリジンヌクレオチドを
表す） のオリゴヌクレオチドを実施例１の手順を用いて製造し
た。配列の中央のデオキシウリジンヌクレオチドは合成
中にデオキシウリジンホスホアミダイト（バージニア州
スターリングのグレン・リサーチ社）を用いて加えた。
オリゴヌクレオチドは標準合成サイクルを用いて製造し
た。これを水酸化アンモニウム、30％、を用いて16時
間、通常の脱保護によって脱保護した。溶剤を蒸発さ
せ、残留物をHPLCで精製し、そして脱トリチル化した。
最終的な精製はセファデックスＧ−25で行った。 ii. 酵素ストック溶液の製造 Uracil−DNAグリコシラーゼは、ung遺伝子を含む発現
プラスミドpBD396でトランスフォームしたE.coli M521
9細胞から単離した。Lindahl等、J.Biol.Chem.、1977、
252、3286に記載のように、酵素は電気泳動的な均質性
に精製し、そして５％グリセロール、2mM DTTおよび1m
M EDTAを含有する30Mm HEPES−NaOH、pH7.4中で貯蔵
した。 iii. 単一脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチド 配列： （式中、Ｄ＊は脱塩基部位を表す） の脱塩基オリゴヌクレオチドは、水0.5ml中の実施例３
−Ａ−ｉのオリゴマー 237O.D.単位を、200μｌの実施
例３−Ａ−iiのストック溶液（200μｇのウラシルDNA−
グリコシラーゼ）で処理し、そして室温で一晩インキュ
ベートすることによって製造した。HPLC分析から、ウラ
シルおよび脱塩基12量体オリゴヌクレオチドの比率が1:
10で、ウラシルが定量的に除去されたことが分かった。
ウラシル維持時間は2.43分であり、脱塩基オリゴヌクレ
オチドは21.68分であった。溶液は凍結乾燥し、使用す
るまでフリーザーに貯蔵した。 iv. 多数のウリジン部位を含むオリゴヌクレオチド 実施例３−Ａ−ｉの方法で、次のオリゴヌクレオチド
を製造像した： （式中、Ｕ＊は２′−デオキシウリジンヌクレオチドを
表す） このオリゴヌクレオチドを実施例３−Ａ−iiiの手順に
従って処理すると、次の配列のオリゴヌクレオチドが得
られる： （式中、Ｄ＊はオリゴヌクレオチド内の脱塩基部位を表
す）。 B. 脱塩基糖先駆体による脱塩基部位を含むオリゴヌク
レオチドの製造 i. ５−Ｏ−4,4′−ジメトキシトリチル−1,2−ジデオ
キシ−Ｄ−リボフラノース−３−Ｏ−（２−シアノエチ
ル−N,N′−ジイソプロピル）ホスホアミダイト ５−Ｏ−4,4′−ジメトキシトリチル−1,2−ジデオキ
シ−Ｄ−リボフラノース−３−Ｏ−（２−シアノエチル
−N,N′−ジイソプロピル）ホスホアミダイトは、Lyer
等、Nucleic Acid Research、1990、18、2855に従っ
て、またはDidier Peoch等、Tetrahedron Letters、1
991、32、207に従って製造する。 ii. 脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチド 実施例３−Ａ−iiiのオリゴマー２、すなわち、以下
の配列のオリゴヌクレオチド： （式中、Ｄ＊は脱塩基部位を表す） はまた、実施例３−Ｂ−ｉに示した論文の合成手順を用
いて製造することもできる。これらの手順を用いると、
これらの論文のオリゴヌクレオチド合成方法を使用し
て、ｏ−ニトロベンジルデオキシフラノースを含むオリ
ゴヌクレオチドが製造される。協力Hgランプを使用する
光分解で相当する脱塩基部位を含むオリゴヌクレオチド
が生じる。そのような脱塩基オリゴヌクレオチドはまた
Horn等、Nucleosides ＆ Nucleotides、1991、10、29
9にも記載されている。 実施例４ 2'−Ｏ−（アミン官能化空間スパニング基）を組み込む
オリゴヌクレオチドの調製 A.単一部位 配列： （式中、Ａ＊は2'−Ｏ−（ペンチルアミノ）アデノシン
ヌクレオチドを示す。）のオリゴヌクレオチドを、実施
例１の操作に従って、修飾ヌクレオチド単位のカップリ
ング工程の間10分の延長カップリング時間を用いて調製
した。5'−ジメトキシトリチル−2'−Ｏ−（ペンチル−
Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシンホスホル
アミダイト（実施例２−Ａ−ｉより）をDNA合成装置内
で無水CH3CN中の0.09M溶液として用いた。オリゴヌクレ
オチド合成は、5'−ジメトキシトリチル−2'−Ｏ−（ペ
ンチル−Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシン
ホスホルアミダイトのオリゴヌクレオチド配列内へのカ
ップリングの間10分の延長カップリング時間で標準的合
成サイクルを用いて、ABI390B又は394合成装置のいずれ
かで行った。5'−ジメトキシトリチル−2'−Ｏ−（ペン
チル−Ｎ−フタルイミド）−N6−ベンジルアデノシンホ
スホルアミダイトカップリングについて、＞98％のカッ
プリング効率が認められた。Ｎ−フタルイミド・アミン
保護基の除去は、ベンジル及びイソブチリルヌクレオチ
ド塩基保護基のNH4OH脱保護と同時に行われる。 B.複数部位 （式中、Ａ＊は、ペンチルアミノ官能基を組み込むよう
に修飾されたヌクレオチドを表す。）のオリゴヌクレオ
チドを、実施例４−Ａの操作に従って調製した。このオ
リゴヌクレオチドは、ウシ乳頭腫ウィルス−１（BPV−
１）のE2領域に対するアンチセンス化合物である。 実施例５ A.脱塩基部位を有するオリゴヌクレオチド鎖のアミン官
能化空間スパニング基を有するオリゴヌクレオチドへの
カップリング 構造： 架橋ストランドＩ （式中、“|"は、該オリゴヌクレオチド鎖間のＯ−（CH
2）５−Ｎ−CH2−架橋を表す。）の二本鎖の二重鎖架橋
オリゴヌクレオチドを、100μｌの0.2M NaOAc緩衝液（p
H5.02）中の2.8O.D.単位の実施例４−Ａのオリゴマー
５、即ち、GGC TGA＊ CTG CGオリゴヌクレオチド
を、10μｌの水に溶かした2.37O.D.単位の実施例３−Ａ
−iiiのオリゴマー２、即ち、脱塩基オリゴヌクレオチ
ドGGC AGD＊ CAG CCと反応させることによって調製
する。この混合溶液を２時間放置した。10mgのNaCNBH3
を400μｌの250mM NaOAc（pH5.02）に溶かし、その溶液
25μｌを反応溶液に添加した。添加した後、該溶液中の
水素化シアノホウ素の最終濃度は、ほぼ80mMであった。
反応を１時間間隔でHPLCにより追跡した。アミン連結オ
リゴヌクレオチドは21.65分の保持時間を有し、脱塩基
オリゴヌクレオチドは22.46分であった。生成物ピーク
は、24.07分に認められた。該生成物ピークがゆっくり
と増加してゆくのが認められた。12時間後に生成物をHP
LCにより反応混合物から分離したところ、1.05O.D.単位
（収率20.3％）が得られた。この生成物の少量をHPLCに
再注入したところ、単一ピークとして認められた。 B.ゲル分析 上の架橋11量体オリゴヌクレオチド、即ち、架橋スト
ランドＩに関し、ゲル分析を行った。架橋物質は、その
成分11量体オリゴヌクレオチド、即ち、オリゴマー２又
は５のいずれよりもおそく移動する。事実、それは、21
量体オリゴヌクレオチド（11＋11−失った塩基の１）の
ものと同じ電気泳動移動度を有した。 C.イオン交換クロマトグラフィー イオン交換クロマトグラフィーを用いて、架橋ストラ
ンドＩの架橋を更に確認した。21量体架橋鎖は、最大の
電荷量を有しているので0.25M塩濃度で溶出するのに対
して、11量体成分オリゴヌクレオチドは0.15M塩濃度で
溶出した。 D.架橋確認 ハイブリダイゼーション二重鎖形成ではなく架橋が形
成されたことは、ゲル分析及びHPLCへの該架橋鎖の再注
入によって独立に確認された。架橋せずに一緒に混合さ
れた２成分オリゴヌクレオチドの混合物のゲル分析は、
21量体移動度生成物をもたらさなかった。架橋生成物を
HPLC内に再注入しても、２つのオリゴヌクレオチド一本
鎖の当量混合物をもたらさずに、単一ピークとして出現
した。 実施例６ アミン官能化空間スパニング基が付いている硫黄連結原
子を有するオリゴヌクレオチドの調製 配列： （式中、Ｔ＊は、硫黄連結原子を介してチミジンヌクレ
オチドに結合したドデシルアミノ官能基を組み込むよう
に修飾されたヌクレオチドを表す。）のオリゴヌクレオ
チドは、実施例４−Ａの操作に従って、実施例２−Ｂ−
iiのオリゴヌクレオチドを用いて調製される。 実施例７ アミン官能化空間スパニング基が付いている窒素連結原
子を有するオリゴヌクレオチドの調製 配列： （式中、Ａ＊は、窒素連結原子を介してアデノシンヌク
レオチドに結合したブチルアミノ官能基を組み込むよう
に修飾されたヌクレオチドを表す。）のオリゴヌクレオ
チドは、実施例４−Ａの操作に従って、実施例２−Ｃ−
iiのオリゴヌクレオチドを用いて調製される。 実施例８ アミン官能化空間スパニング基が付いている炭素連結原
子を有するオリゴヌクレオチドの調製 配列： （式中、Ａ＊は、メチレン連結原子を介してアデノシン
ヌクレオチドに結合したアリルアミン官能基を組み込む
ように修飾されたヌクレオチドを表す。）のオリゴヌク
レオチドは、実施例４−Ａの操作に従って、実施例２−
Ｄ−ｉのオリゴヌクレオチドを用いて調製される。 実施例９ A.脱塩基部位と、硫黄連結基を介して繋がっているアミ
ン官能化空間スパニング基とによるオリゴヌクレオチド
鎖のカップリング 構造： 架橋ストランドII （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
のＳ−（CH2）12−Ｎ−CH2−架橋を表す。）の二本鎖の
二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの操作
を用いて、実施例６のオリゴマー７を実施例３−Ａ−ii
iの脱塩基オリゴマー２と反応させることによって調製
される。 B.脱塩基部位と、窒素連結基を介して繋がっているアミ
ン官能化空間スパニング基とによるオリゴヌクレオチド
鎖のカップリング 構造： 架橋ストランドIII （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
の−NH（CH2）12−Ｎ−CH2−架橋を表す。）の二本鎖の
二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの操作
を用いて、実施例７のオリゴマー８を実施例３−Ａ−ii
iの脱塩基オリゴマー２と反応させることによって調製
される。 C.脱塩基部位と、メチレン連結基を介して繋がっている
アミン官能化空間スパニング基とによるオリゴヌクレオ
チド鎖のカップリング 構造： 架橋ストランドIV （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
の−CH2−CH＝CH−Ｎ−CH2−架橋を表す。）の二本鎖の
二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの操作
を用いて、実施例８のオリゴマー９を実施例４−Ａ−ii
iの脱塩基オリゴマー２と反応させることによって調製
される。 実施例10 A.ヒドラジン官能化空間スパニング基を有するオリゴヌ
クレオチドの調製 i.単一官能基 配列： （式中、Ｕ＊は、ウリジンに結合した2'−Ｏ−（オクチ
ルヒドラジノ）官能基を組み込むように修飾されたヌク
レオチドを表す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例４
−Ａの操作に従って、実施例２−Ｅ−iiのオリゴヌクレ
オチドを用い、その後にパラジウム炭存在下の水素化分
解によりベンジルカルバジドを脱保護して調製される。 ii.複数官能基 構造： （式中、Ｕ＊は、2'−Ｏ−（オクチルヒドラジン）基を
有するウリジンヌクレオチドを表し、Ｇ＊＊は、2'−Ｏ
−（オクチルヒドラジン）基を有するグアノシンヌクレ
オチドを表す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例４−
Ａの操作に従って、それぞれ実施例２−Ｅ−ii及び２−
Ｅ−ivのヌクレオチドを用いて調製され、ヒドラジン官
能化空間スパニング基含有ヌクレオチドが適切な配列内
に導入される。ベンジルカルバジドの脱保護は、パラジ
ウム炭存在下の水素化分解により行われる。 B.ヒドロキシルアミン官能化空間スパニング基を有する
オリゴヌクレオチドの調製 配列： （式中、Ｕ＊は、酸素連結原子を介してウリジンヌクレ
オチドに結合したオクチルヒドロキシルアミン官能基を
組み込むように修飾されたヌクレオチドを表す。）のオ
リゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に従って、実
施例２−Ｆ−iiiのオリゴヌクレオチドを用い、その後
にDCM中でＯ−フタルイミド基をメチルヒドラジンで処
理してオクチル空間スパニング基上にヒドロキシルアミ
ン官能基を生成させることで調製される。 C.セミカルバジド官能化空間スパニング基を有するオリ
ゴヌクレオチドの調製 配列： （式中、Ｕ＊は、酸素連結原子を介してウリジンヌクレ
オチドに結合したフェニル−Ｎ−セミカルバジド官能基
を組み込むように修飾されたヌクレオチドを表す。）の
オリゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に従って、
実施例２−Ｇ−ｉのオリゴヌクレオチドを用いて調製さ
れる。 D.ヒドラジド官能化空間スパニング基を有するオリゴヌ
クレオチドの調製 配列： （式中、Ｕ＊は、酸素連結原子を介してウリジンヌクレ
オチドに結合したエチルヒドラジド官能基を組み込むよ
うに修飾されたヌクレオチドを表す。）のオリゴヌクレ
オチドは、実施例４−Ａの操作に従って、実施例２−Ｈ
−iiiのオリゴヌクレオチドを用いて調製される。 E.アルコール官能化空間スパニング基を有するオリゴヌ
クレオチドの調製 配列： （式中、Ｕ＊は、ウリジンヌクレオチドに結合したヘプ
タン−７−オール官能基を組み込むように修飾されたヌ
クレオチドを表す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例
４−Ａの操作に従って、実施例２−Ｉ−iiiのオリゴヌ
クレオチドを用いて調製される。 実施例11 A.脱塩基部位と、ヒドラジン又はヒドラゾン官能化空間
スパニング基とによるオリゴヌクレオチド鎖のカップリ
ング i.ヒドラジン連結鎖 構造： 架橋ストランドＶ （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
のＯ−（CH2）８−NH−NH−CH2−架橋を表す。）の二本
鎖の二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの
操作に従って、実施例10−Ａ−ｉのオリゴマー10を実施
例３−Ａ−iiiの脱塩基オリゴマー２と反応させた後、
生成したヒドラゾン結合をNaOAc緩衝液中でNaCNBH3で還
元してヒドラジン結合を生成させることによって調製さ
れる。 ii.ヒドラゾン連結鎖 ヒドラゾン架橋を有する実施例13−Ａ−ｉの架橋鎖
は、実施例13−Ａ−ｉのNaCNBH3還元工程を省略するこ
とによって生成させることができる。 B.脱塩基部位と、ヒドロキシルアミン又はオキシム官能
化空間スパニング基とによるオリゴヌクレオチド鎖のカ
ップリング i.ヒドロキシルアミン連結鎖 構造： 架橋ストランドVI （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
のＯ−（CH2）８−NH−Ｏ−CH2−架橋を表す。）の二本
鎖の二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの
操作に従って、実施例10−Ｂのオリゴマー12を実施例３
−Ａ−iiiの脱塩基オリゴマー２と反応させた後、生成
したオキシム結合をNaOAc緩衝液中でNaCNBH3で還元して
ヒドロキシルアミンを生成させることによって調製され
る。 ii.オキシム連結鎖 オキシム架橋を有する実施例13−Ｂ−ｉの架橋鎖は、
実施例13−Ａ−ｉのNaCNBH3還元工程を省略することに
よって生成させることができる。 C.脱塩基部位と、セミカルバジド又はセミカルバゾン官
能化空間スパニング基とによるオリゴヌクレオチド鎖の
カップリング i.セミカルバジド連結鎖 構造： 架橋ストランドVII （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
のＯ−（CH2）８−NH−NH−Ｏ−CH2−架橋を表す。）の
二本鎖の二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−
Ａの操作に従って、実施例10−Ｃのオリゴマー13を実施
例３−Ａ−iiiの脱塩基オリゴマー２と反応させた後、
生成したセミカルバゾン結合をNaOAc緩衝液中でNaCNBH3
で還元してセミカルバジド結合を生成させることによっ
て調製される。 ii.セミカルバゾン連結鎖 セミカルバゾン架橋を有する実施例13−Ａ−ｉの架橋
鎖は、実施例13−Ａ−ｉのNaCNBH3還元工程を省略する
ことによって生成させることができる。 D.脱塩基部位と、アルコール官能化空間スパニング基と
を橋渡しするヘミアセタールによるオリゴヌクレオチド
鎖のカップリング 構造： 架橋ストランドVIII （式中、“|"は、該構造の個々のオリゴヌクレオチド間
のＯ−（CH2）７−Ｏ−CH（OH）−架橋を表す。）の二
本鎖の二重鎖架橋オリゴヌクレオチドは、クノーレ（Kn
orre）ら，“Nucleotide and Oligonucleotide Derivat
ives As Enzyme and Nucleic Acid Targeted Irreversi
ble inhibitors",Chemical Aspects,G.Weber（Ed.）,Ad
vance Press,Oxford,1986,pp.277−320の操作を変形し
て、トリフルオロ酢酸の存在下で実施例10−Ｅのオリゴ
マー15を実施例３−Ａ−iiiの脱塩基オリゴマー２と反
応させることによって調製される。 実施例12 同一又は相違する官能基を含む複数の空間スパニング基
を有するオリゴヌクレオチドの調製 A.アルデヒド及びアミン官能基含有オリゴヌクレオチド 構造： （式中、Ａ＊は、2'−Ｏ−（ペンチルアミノ）基を有す
るアデノシンヌクレオチドを表し、Ｕ＊＊は、2'−Ｏ−
〔プロピオン−４−アールビス（ｏ−ニトロベンジル）
アセタール〕基を有するウリジンヌクレオチドを表
す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に
従って、官能化空間スパニング基含有ヌクレオチド用の
実施例２−Ａ−ｉ及び２−Ｋ−ｉ−ｂのそれぞれのヌク
レオチドを用いて調製される。 B.複数チオール官能基含有オリゴヌクレオチド 構造： （式中、Ａ＊は、2'−Ｏ−〔Ｓ−トリチル（ヘキシル−
８−チオール）〕基を有するアデノシンヌクレオチドを
表し、Ｕ＊＊は、2'−Ｏ−〔Ｓ−トリチル（ヘキシル−
８−チオール）〕基を有するウリジンヌクレオチドを表
す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に
従って、官能化空間スパニング基含有ヌクレオチド用の
実施例２−Ｊ−ii−ｂ及び２−Ｊ−ii−ｃのそれぞれの
ヌクレオチドを用いて調製される。 C.複数アルデヒド官能基含有オリゴヌクレオチド 構造： （式中、Ｕ＊は、2'−Ｏ−〔プロピオン−３−アールビ
ス（ｏ−ニトロベンジル）アセタール〕基である。）の
オリゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に従って、
アルデヒド官能化空間スパニング基含有ヌクレオチド用
の実施例２−Ｋ−ｉ−ｂのヌクレオチドを用いて調製さ
れる。 D.チオール及びアミン官能基含有オリゴヌクレオチド 構造： （式中、Ｇ＊は、2'−Ｏ−〔（２−アミルエニル）−Ｎ
−フタルイミド〕基を有するグアノシンヌクレオチドを
表し、Ｕ＊＊は、2'−Ｏ−〔Ｓ−トリチル（ペンタン−
８−チオール）〕基を有するウリジンヌクレオチドを表
す。）のオリゴヌクレオチドは、実施例４−Ａの操作に
従って、官能化空間スパニング基含有ヌクレオチド用の
実施例２−Ａ−iv及び２−Ｊ−ii−ｅのそれぞれのヌク
レオチドを用いて調製される。 実施例13 オリゴヌクレオチドの二重鎖の多部位架橋 A.2つの脱塩基部位による架橋 構造： 架橋ストランドIX （式中、“|"は、鎖間の架橋を表す。）の二本鎖の二重
鎖多部位架橋オリゴヌクレオチドは、実施例５−Ａの架
橋操作を用いて、実施例３−Ａ−ivからのオリゴマー４
及び実施例４−Ｂからのオリゴマー６から調製される。
得られる架橋鎖は、二重構造体のハイブリダイゼーショ
ンによるのみならず、個々のオリゴヌクレオチド鎖間に
伸びる２本の架橋によっても一緒に維持される。 B.2つの空間スパニング基による架橋 構造： 架橋ストランドＸ （式中、“|"は、鎖間のオキシム結合により形成された
共有結合を有する架橋を表す。）の二本鎖の二重鎖多部
位架橋オリゴヌクレオチドは、実施例12−Ｃからのオリ
ゴマー18及び実施例４−Ｂからのオリゴマー６から調製
される。オリゴマー18の水溶液を抱水ヒドラジン／水素
化シアノホウ素ナトリウムで処理すると、アルデヒド保
護基が除去される。 次いで、オリゴマー６を0.1M NaCl中で添加して、こ
れら鎖をハイブリダイズさせる。次いで、酢酸ナトリウ
ム緩衝液を添加してアミンとアルデヒド基間でシッフ塩
基を形成させてこれら鎖を架橋する。NaCNBH3を添加し
てオキシム結合をアミン結合に還元し、このことによ
り、得られる架橋鎖は二重構造体のハイブリダイゼーシ
ョンによるのみならず、個々のオリゴヌクレオチド鎖間
に伸びる複数の架橋によっても一緒に維持される。 実施例14 一本鎖上の２つの部位のカップリング 構造： 架橋ストランドXI （式中、“|"は、該鎖の領域間のオキシム結合により形
成された共有結合を有する架橋を表す。）の一本鎖の二
重鎖架橋ヘアピンループオリゴヌクレオチドは、実施例
12−Ａからのオリゴマー16から調製される。オリゴマー
16を0.1M NaCl溶液中に取り、ハイブリダイゼーション
を行わせ、次いで、パラジウム炭の存在下で、アルデヒ
ド保護基の除去を示す２当量の水素が吸収されるまで大
気圧の水素で処理する。次いで、酢酸ナトリウム緩衝液
を添加してアミンとアルデヒド基間でシッフ塩基結合を
形成させる。NaCNBH3を添加してオキシム結合をアミン
結合に還元し、このことにより、得られる架橋鎖はヘア
ピンループ構造体の二重鎖ステム部分のハイブリダイゼ
ーションによるのみならず、該ステムヌクレオチドを橋
渡しして伸びる共有結合の架橋によっても一緒に維持さ
れる。 実施例15 ジスルフィド結合によるカップリング 構造： 架橋ストランドXII （式中、“|"は、該鎖の領域間のジスルフィド結合によ
り形成された共有結合を有する架橋を表す。）の一本鎖
の二重鎖架橋バルジヘアピンループオリゴヌクレオチド
は、実施例12−Ｂからのオリゴマー17から調製される。 オリゴマー17を窒素気流下0.1M NaCl溶液中に溶かし
てハイブリダイゼーションを行わせ、次いで、硝酸銀で
処理して、Ｓ−トリチル保護基を除去する。該溶液に空
気をバブリングすることによる温和な酸化により２つの
遊離のチオール基間にジスルフィド結合を形成して、オ
リゴヌクレオチドのＡ−Ｕ部位を架橋する。該オリゴヌ
クレオチドは、ヘアピンループ構造体の二重鎖ステム部
分のハイブリダイゼーションによるのみならず、該ステ
ム領域を結ぶ共有結合のジスルフィド結合によってもヘ
アピンループ構造に維持される。 実施例16 ジアルデヒドによるカップリング 実施例４−Ａの操作を用いて、配列： （式中、Ａ＊は、実施例２−Ａ−ii−ｃの2'−Ｏ−（エ
イコシルアミノ）アデノシンヌクレオチドである。）の
オリゴヌクレオチドを調製する。該オリゴヌクレオチド
をCPG合成カラムから取り出し、セファデックスＧ−25
で脱塩する。次いで、ルメルテ（Lemairte）ら,Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.,84:648（1986）の過酸化操作に従
ってオリゴマー20を処理して、3'末端ウリジンヌクレオ
チドの糖部分の過ヨウ素酸酸化を行う。 構造： 架橋ストランドXIII （式中、“|"は、該鎖の3'末端ヌクレオチドの酸化開環
した糖と二重鎖ステム部分のその反対側のヌクレオチド
上のアミン基により形成された共有結合の架橋を表
す。）の一本鎖の二重鎖架橋ヘアピンループオリゴヌク
レオチドを調製する。かかる架橋は、過ヨウ素酸酸化し
たオリゴヌクレオチドから形成され、該酸化オリゴヌク
レオチドを0.1M NaClに溶かしてハイブリダイゼーショ
ンさせた後に、酢酸ナトリウム緩衝液とNaCNBH3を添加
することによって形成される。中間体のシッフ塩基架橋
が形成されるので、実施例５−Ａの操作に従い、NaCNBH
3の添加によってアミン結合に還元される。 実施例17 アセタール結合によるカップリング 配列： （式中、Ａ＊は、2'−Ｏ−〔プロピオン−３−アールビ
ス（ｏ−ニトロベンジル）アセタール〕官能化アデノシ
ンヌクレオチドである。）のオリゴヌクレオチドは、実
施例４−Ａの操作に従って、実施例２−Ｋ−ｉ−ａのヌ
クレオチドを用いて調製され、アルデヒド官能化空間ス
パニング基含有ヌクレオチドがオリゴヌクレオチド配列
に導入される。該オリゴヌクレオチドをCPG合成カラム
から取り出し、セファデックスＧ−25で脱塩する。 構造： 架橋ストランドXIV （式中、“|"は、該鎖の3'末端Ｕヌクレオチド上の糖の
2',3'−ヒドロキシル部分と該鎖の二重鎖ステム部分の
その反対側のＡヌクレオチド上のアルデヒド官能基の間
に形成されたアセタール架橋を表す。）の一本鎖の二重
鎖架橋ヘアピンループオリゴヌクレオチドを、トリフル
オロ酢酸の存在下で0.1M NaCl中で架橋することによっ
て調製する。この操作は、クノーレら，“Nucleotide a
nd Oligonucleotide Derivatives As Enzyme and Nucle
ic Acid Targeted Irreversible Inhibitors",Chemical
Aspects,G.Weber（Ed.）,Advance Press,Oxford,1986,
pp.277−320の操作を変形したものである。Ａヌクレオ
チド上の遊離のアルデヒド基の反応により、反対側の3'
末端Ｕヌクレオチドの2',3'−ヒドロキシルへ架橋さ
れ、ヘアピンループバルジ一本鎖オリゴヌクレオチドの
ステム部分のヌクレオチド間に共有結合の架橋が形成さ
れる。 実施例18 一本鎖上のヘテロ二官能性リンカーによるカップリング 構造： 架橋ストランドXV （式中、“＼”は、ワトソン／クリック型塩基対から１
塩基除去された２つの別々の領域のＧ及びＵヌクレオチ
ドを橋渡しする、該鎖の二重領域のＧ及びＵヌクレオチ
ド間のホモ二官能性リンカーにより形成された架橋を表
す。）の一本鎖の二重鎖架橋ヘアピンループオリゴヌク
レオチドを、実施例12−Ｄからのオリゴマー19から調製
する。まず、オリゴマー19を0.1M NaCl溶液に取り、オ
リゴヌクレオチドをヘアピンループ一本鎖二重構造体に
ハイブリダイズさせる。次いで、この反応溶液を緩衝液
中で硝酸銀で処理してＳ−トリチル保護基を除去する。
弱アルカリ中のＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジ
ルジチオ）プロピオネート（SPDP）（ピアス，ロックフ
ォード,Il）を少量添加してアミン官能基をリンカーに
カップリングさせる。次いで、pHを4.5に調節して２−
ピリジルジスルフィドとヌクレオチド上のチオール官能
基とを交換すると該鎖の架橋ができる。かくして、該鎖
は、ヘアピンループバルジ構造の二重鎖ステム部分のハ
イブリダイゼーションによるのみならず、ステムヌクレ
オチドを橋渡しして伸びるヘテロ二官能性架橋によって
も一緒に維持される。 実施例19 ホモ二官能性リンカーによるカップリング 構造： 架橋ストランドXVI （式中、架橋は、該鎖のUCUバルジ部分上のUXヌクレオ
チドとAGGGUCループ領域のGXヌクレオチド間にまたがる
ホモ二官能性リンカーにより形成される。）の一本鎖の
二重鎖架橋バルジヘアピンループオリゴヌクレオチド
を、実施例10−Ａ−iiからのオリゴマー11から調製す
る。ストランドXVIの提案された三次構造の分子モデル
は、UX及びGXヌクレオチドが互いに物理的にきわめて近
接していることを示している。ストランドXVIを調製す
るには、まず、オリゴマー11を0.1M NaCl溶液に取り、
該オリゴヌクレオチドをヘアピンループバルジ一本鎖二
重構造体にハイブリダイズさせる。次いで、この反応溶
液を0.2Mホウ酸ナトリウム緩衝液になるように調節す
る。ジスクシンイミジルスベレート（DSS,ピアス，ロッ
クフォード,Il）を添加して、ウリジン−グアノシンヌ
クレオチドのヒドラジン反応性官能基の架橋を行う。バ
ルジ部分のＵヌクレオチドとループのＧヌクレオチド
は、空間スパニング基上の官能基とホモ二官能性架橋リ
ンカーの間のヒドラジン結合により連結する。この構造
では、内部ループのUXヌクレオチドとヘアピンループの
GXヌクレオチドは、互いに相補的でもハイブリダイズ可
能でもないが、該オリゴヌクレオチドのより高次の構造
のために、それらは３次元空間で互いに近接して位置し
ている。この架橋は、この３次元空間をまたいで、該オ
リゴヌクレオチドをこのより高次の構造に固定する。 実施例20 ウリジン−2'−ヘキシルアミノリンカーの合成 5'−ジメトキシトリチル−2'−（Ｏ−ヘキシル−Ｎ−フ
タルイミド）ウリジンホスホルアミダイトの調製 2',3'−Ｏ−ジブチルスタンニレン−ウリジンを、ワ
グナー（Wagner）ら,J.Org.Chem.,1974,39,24の操作に
従って合成した。この化合物をP2O5で12時間減圧乾燥し
た。200mlの無水DMF中のこの化合物（29g,42.1mmol）の
溶液に、16.8g（50mmol）の６−ブロモヘキシルフタル
イミドと4.5gのヨウ化ナトリウムを添加して、この混合
液をアルゴン雰囲気下130℃で16時間加熱した。この反
応混合液の溶媒を留去し、トルエンと共に１回同時留去
して、その粘着性タール状残渣をシリカカラム（500g）
に適用した。カラムを2LのEtOAcで洗浄した後に10％MeO
H:90％EtOAcで溶出した。生成物、すなわちＯ−ヘキシ
ル−Ω−Ｎ−フタルイミドウリジンの2'−及び3'−異性
体が、分離不能混合物（EtOAc中10％MeOHでRf＝0.64）
として溶出した。13C NMRによれば、異性体比は2'異性
体が約55％、3'−異性体が約45％であった。併せた収量
は9.2g（46.2％）であった。この混合物を減圧乾燥して
ピリジンで２回再留去した。それを150mlの無水ピリジ
ンに溶解して7.5gの塩化ジメチルオキシトリチル（22.1
3mmol）と500mgのDMAPとで処理した。２時間後、TLC（E
tOAc:ヘキサン＝6:4）により、出発原料が完全に消失し
て2'−及び3'−異性体が良好に分離することがわかった
（2'−異性体についてはRf＝0.29、3'−異性体について
は0.12）。この反応混合物の反応を5mlのCH3OHを添加す
ることによって停止させ、溶媒を減圧留去した。残渣を
300mlCH2Cl2に溶解し、飽和NaHCO3で洗浄し、続いて飽
和NaCl溶液で洗浄した。それを乾燥（MgSO4）して溶媒
を留去すると15gの褐色泡状物が得られた。これをシリ
カゲル（500g）で精製して、6.5gの2'−異性体と3.5gの
3'−異性体が得られた。 2'−Ｏ−ヘキシル−Ω−Ｎ−フタルイミド−5'−DMT
−ウリジン（4g,5.2mmol）を40mlの無水CH2Cl2に溶解し
た。この溶液にジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.
5g,2.9mmol）とビス（イソプロピルアミノ）−β−シア
ノエトキシホスフィン（2.5g,7.0mmol）を添加して一晩
攪拌した。TLC（EtOAc:ヘキサン＝1:1）で出発原料が完
全に消失したとが分かった。この反応混合物をCH2Cl2で
移して飽和NaHCO3（100ml）で洗浄した後に飽和NaClで
洗浄した。有機層を無水NaSO4で乾燥して溶媒を留去す
ると、6.4gの粗生成物が得られ、これをシリカカラム
（200g）でヘキサン:EtOAc＝1:1を用いて精製したとこ
ろ4.6g（4.7mmol,90％）の目的のホスホルアミダイトが
得られた。 実施例21 Ｕ−2'−Ｏ−ヘキシルアミンリンカーを含有するオリゴ
ヌクレオチドのオリゴマー合成及びNMRによる特徴付け 配列： （式中、Ｕ＊は、ヘキシルアミン修飾ウリジン部分を表
す。）のオリゴヌクレオチドを、DNA合成装置で10mmol
合成条件で合成した。実施例20からのホスホルアミダイ
トをCH3CN中0.12M溶液として用いた。オリゴヌクレオチ
ドの脱保護を行った後、逆相HPLCカラムで精製して純粋
なトリマーを得た（未脱保護フタルイミド基を含有する
オリゴヌクレオチドはトリマーから分離した）。このオ
リゴヌクレオチドを乾燥し、脱塩して600uLD2Oに溶解し
た（約50O.D.,A260）。プロトンNMRと31P NMRの両方を
測定した。1H NMR:1.0−1.8（m,ヘキシル鎖のCH2プロト
ン）;5.75（ｄ）;5.9（ｄ）;6.1（ｔ）;6.15（ｔ）;7.5
（ｓ）。31P NMR:−0.2;−0.4ppm（２本線）。 実施例22 対置する鎖内の脱塩基部位に向かい合って配置されたヌ
クレオチド（A,U,C又はＧ）の調製の例示的合成 A.オリゴヌクレオチド合成 配列： （式中、Ｕ＊は、2'−Ｏ−（ヘキシルアミノ）ウリジン
ヌクレオチドを示す。）のオリゴヌクレオチドを10分間
の延長カップリング時間を用いて調製した。5'−ジメト
キシトリチル−2'−（Ｏ−ヘキシル−Ｎ−フタルイミ
ド）ウリジンホスホルアミダイトを無水CH3CN中0.12M溶
液として用いた。オリゴヌクレオチドを脱保護し、逆相
HPLCで精製し（トリチル・オン）、5'−位を脱保護して
再度精製し、未脱保護フタルイミドオリゴヌクレオチド
を除去した。 B.架橋反応 オリゴマー23オリゴヌクレオチドを脱塩基オリゴヌク
レオチドCGC AGD＊CAG CC（オリゴマー２）と＞90％
の架橋効率で反応させた。結合の形成は逆相HPLC、イオ
ン交換HPLC及び最終的に塩基対になった架橋二重鎖イミ
ノプロトンのNMRスペクトルでの観察により確認した。 実施例23 キメラオリゴヌクレオチドと脱塩基部位含有オリゴヌク
レオチド間の架橋の形成 配列： （式中、ｓはホスホロチオエート主鎖を表し、ｏはホス
ホジエステル主鎖を表し、そしてＵ＊は2'−Ｏ−（ヘキ
シルアミノ）ウリジンを表す。）のオリゴヌクレオチド
を、それぞれの酸化工程において慣用的なヨウ素酸化法
（Ｐ＝Ｏ）又はボウケージ（Baeucage）試薬酸化法（Ｐ
＝Ｓ）のいずれかを用いて混合（ホスホジエステル／ホ
スホロチオエート）主鎖で合成した。このオリゴヌクレ
オチドを合成し、精製しそしてCGCAGD＊CAGCCと架橋さ
せた。架橋した二重鎖を、1 NMR、ゲル分析、HPLC（逆
相及びイオン交換）によって特徴を明らかにした。 実施例24 ２つの脱塩基部位間の結合を含む架橋核酸二重鎖 次の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した： オリゴマー26は、前駆体オリゴマー： （式中、Ｕは、2'−デオキシウリジンを表す。）から、
ウラシル−DNAグリコシラーゼの作用により得た。オリ
ゴマー２をNaOAc/NaCNBH3媒質中で1,6−ヘキサンジアミ
ンと反応させると、リンカー上に位置する遊離のアミノ
基を有する生成物が単離される。この修飾オリゴヌクレ
オチドをNaOAc緩衝液中でオリゴマー26と混合した後
に、NaOAc緩衝液中のNaCNBH3を添加する。得られる架橋
は、２つの脱塩基部位間で−NH−（CH2）６−NH−リン
カーにより離れた結合を有する。 （式中、“|"は、−CH2−NH−（CH2）６−NH−CH2−リ
ンカーを表す。） 実施例25 架橋ストランドＩのTm測定 架橋した二重鎖の架橋ストランドＩの溶融挙動を、10
0mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、0.1mM EDTAでpH7.0
で、4mMの各ストランド濃度で測定した。 Tm オリゴマー５−オリゴマー１ 二重鎖（野生型） 48℃ オリゴマー５−オリゴマー２ 二重鎖（脱塩基部位） ＜30℃ オリゴマー５−オリゴマー２ 架橋ストランドＩ 74℃ 架橋二重鎖のTmが高いことから、２本鎖（オリゴマー
５とオリゴマー２）間の共有結合の存在は確実である。 評価 操作１−ヌクレアーゼ耐性 A.血清及び細胞質ヌクレアーゼに対する架橋オリゴヌク
レオチドの耐性の評価 本発明の架橋オリゴヌクレオチドは、種々の濃度のウ
シ胎児血清又は成人ヒト血清を含有する培地中で架橋オ
リゴヌクレオチドをインキュベーションすることによっ
て、血清ヌクレアーゼに対するそれらの耐性について評
価することができる。標識した架橋オリゴヌクレオチド
を種々の時間インキュベートし、プロテアーゼＫで処理
してから20％ポリアクリルアミド−尿素変性ゲルでのゲ
ル電気泳動及びそれに続いてオートラジオグラフィーに
よって分析する。オートラジオグラムは、レーザーデン
シトメトリで定量する。修飾した結合の位置及び架橋オ
リゴヌクレオチドの既知長に基づいて、特定の修飾によ
るヌクレアーゼ分解への影響を確認することが可能であ
る。細胞質ヌクレアーゼについては、HL−60細胞系を用
いることができる。ポストミトコンドリア上澄み液を分
画遠心分離により調製して、標識した架橋オリゴヌクレ
オチドをこの上澄み液中で種々の時間インキュベートす
る。インキュベーション後、血清ヌクレオチド分解につ
いて上に概説した分解について、この架橋オリゴヌクレ
オチドを評価する。未修飾オリゴヌクレオチド及び本発
明の架橋オリゴヌクレオチドの比較のために、オートラ
ジオグラフィー結果を定量する。架橋オリゴヌクレオチ
ドは、血清及び細胞質ヌクレアーゼに対して完全に耐性
があると思われる。 B.特異的エンド及びエキソヌクレアーゼに対する架橋オ
リゴヌクレオチドの耐性の評価 特異的ヌクレアーゼ（即ち、エンドヌクレアーゼ、
3',5'−エキソ、及び5',3'−エキソヌクレアーゼ）に対
する天然オリゴヌクレオチドと本発明の架橋オリゴヌク
レオチドの耐性に対する評価を行って、分解に関する修
飾結合の正確な影響を確認することができる。種々の選
択したヌクレアーゼに対して特異的な定義された反応緩
衝液中で架橋オリゴヌクレオチドをインキュベートす
る。生成物をプロテアーゼＫで処理した後、尿素を添加
し、そして尿素を含有する20％ポリアクリルアミドゲル
で分析する。ゲル生成物をステインズ・オール試薬（シ
グマケミカル社）で染色することによって可視化する。
レーザーデンシトメトリを用いて分解の程度を定量す
る。修飾結合の影響を特異的ヌクレオチドについて測定
して、血清及び細胞質系から得られた結果と比較する。
血清及び細胞質ヌクレアーゼでの場合のように、本発明
の架橋オリゴヌクレオチドは、エンド及びエキソヌクレ
アーゼに対して完全に耐性があると思われる。 操作２−５−リポキシゲナーゼ分析及び検定法 A. 治療剤 治療用途については、５−リポキシゲナーゼの過剰又
は異常な供給によって特徴付けられる疾患を有する動物
に本発明による架橋オリゴヌクレオチドを投与すること
によって治療する。当業者は、最適な投与量、投与方法
及び反復率を容易に決定することができる。かかる治療
は、一般に、治癒するか又は疾患状態の縮小が達成され
るかのいずれかまで継続される。幾つかの疾患では長期
治療もありそうである。 B. 研究試薬 本発明の架橋オリゴヌクレオチドは、粗細胞溶解産物
中又は部分的に若しくは完全に精製したRNA試料中で５
−リポキシゲナーゼmRNAを開裂するか又は調節するのに
用いる場合、研究試薬としても有用であろう。本発明の
この適用は、例えば、標準的方法により細胞を溶解する
ことにより、最適にはRNAを抽出してから、それを例え
ば10μｇの全RNA当たり約100〜約500ngの濃度の組成
で、例えば50mMリン酸塩からなる緩衝液（pH約４〜10）
中で約30〜50℃で処理することにより行われる。開裂し
た５−リポキシゲナーゼRNAは、アガロースゲル電気泳
動及び放射性標識DNAプローブでのハイブリダイゼーシ
ョンにより又は他の標準的な方法により分析することが
できる。 C. 診断薬 本発明の架橋オリゴヌクレオチドは、特に種々の組織
内での特定のmRNA種の発現又は異常な若しくは突然変異
型RNA種の発現を測定するための診断的適用にも有用で
あろう。この例においては、架橋オリゴヌクレオチド
は、仮想上の異常配列に相補的だが正常mRNAとはハイブ
リダイズしないようにデザインされることによって異常
mRNAを標的とする。 組織サンプルをホモジェナイズして標準的方法により
RNAを抽出することができる。粗ホモジェネート又は抽
出物を処理して、例えば、標的RNAの開裂を行わせても
よい。次いで、開裂部位の5'側の領域に相補的なオリゴ
ヌクレオチドが結合した固体支持体にハイブリダイズさ
せることができる。mRNAの正常及び異常5'領域のいずれ
も固体支持体に結合するだろう。異常RNAの開裂した3'
領域は支持体に結合しないであろうから、正常mRNAから
分離することができる。 調節の標的にされるmRNA種は５−リポキシゲナーゼに
関連するが；しかしながら、当業者は、本発明がそのよ
うには限定されず、広く適用可能であることを理解する
であろう。酵素５−リポキシゲナーゼの産生の阻害又は
調節は、疾患の治療において有意な治療的恩恵を有する
と考えられる。組成物の有効性を評価するためには、１
検定法又は一続きの検定法が要求される。 D. in vitro検定法 ５−リポキシゲナーゼのための細胞検定は、好ましく
は、ヒト前骨髄球白血病細胞系HL−60を用いる。この細
胞は、種々の既知物質によって単球様細胞又は好中球様
細胞のいずれかに分化するように誘導され得る。1.3％
ジメチルスルホキシド（DMSO）でこの細胞を処理する
と、好中球への分化が促進されることが知られている。
基底HL−60細胞は、検出可能なレベルの５−リポキシゲ
ナーゼタンパク質を合成しないか又はロイコトリエン
（５−リポキシゲナーゼの下流産物）を分泌しないこと
が見出されている。DMSOで該細胞を分化させると、DMSO
の添加後48時間で、５−リポキシゲナーゼタンパク質及
びロイコトリエン生合成体が現れる。かくして、５−リ
ポキシゲナーゼタンパク質合成の誘導は、この細胞内で
５−リポキシゲナーゼ合成を妨害する架橋ヌクレオチド
の分析のための試験システムとして利用できる。 架橋ヌクレオチドのための第２の試験システムは、５
−リポキシゲナーゼは、基質と反応するとそれ自身を不
活性化するという点で“自己不活性”酵素であるという
事実を用いる。５−リポキシゲナーゼを発現する分化し
たHL−60又は他の細胞を10μＭのカルシウムイオノフォ
アA23187で処理すると、５−リポキシゲナーゼの細胞質
ゾルから細胞膜への移動とそれに続く該酵素の活性化を
促進する。活性化及び数ラウンドの触媒作用後に、該酵
素は触媒的に不活性となる。かくして、カルシウムイオ
ノファでの該細胞の処理は、内因性５−リポキシゲナー
ゼを不活性化する。該細胞がA23187処理から回復するに
は、ロイコトリエンB4を合成するそれらの能力により測
定して約24時間かかる。５−リポキシゲナーゼに向けら
れた架橋オリゴヌクレオチドは、次の定量的検定法を用
いて２つのHL−60モデル系における活性について試験す
ることができる。これら検定法を、無傷細胞内での５−
リポキシゲナーゼタンパク質合成の阻害の最も直接的な
測定法から無傷細胞内での５−リポキシゲナーゼ活性測
定の如きより下流的事項へと説明する。 架橋オリゴヌクレオチドが無傷細胞に対して発揮でき
かつ容易に定量できる最も直接的な作用は、５−リポキ
シゲナーゼタンパク質合成の特異的阻害である。この方
法を行うためには、新たに合成されたタンパク質を標識
するために、細胞を35S−メチオニン（50μCi/ml）で37
℃で２時間標識することができる。細胞を抽出して全細
胞タンパク質を可溶化し、５−リポキシゲナーゼを５−
リポキシゲナーゼ抗体で免疫沈殿させた後、プロテイン
Ａ−セファロースビーズから溶出させる。免疫沈殿した
タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より展開し、オートラジオグラフィーに曝す。免疫沈殿
した５−リポキシゲナーゼの量を走査型デンシトメトリ
により定量する。 これら実験から予測される結果は次のようである。コ
ントロール細胞から免疫沈殿した５−リポキシゲナーゼ
タンパク質の量を100％とする。１μＭ、10μＭ及び30
μＭの有効架橋オリゴヌクレオチドで48時間細胞を処理
すると、それぞれ免疫沈殿５−リポキシゲナーゼがコン
トロールの５％、25％及び75％だけ減少するであろう。 細胞ホモジェネート中の５−リポキシゲナーゼ酵素活
性の測定を用いて、ロイコトリエンを合成することがで
きる酵素の存在量を定量することもできるだろう。逆相
HPLCを用いて細胞ホモジェネート中の５−リポキシゲナ
ーゼ酵素活性を定量するための放射計検定法が開発され
ている。プロテアーゼ阻害物質及びEDTAを含有する緩衝
液中で細胞を音波により破壊する。この細胞ホモジェネ
ートを10,000×ｇで30分間遠心分離して、上澄み液を５
−リポキシゲナーゼ活性について分析する。細胞質ゾル
タンパク質を10μM14C−アラキドン酸、2mM ATP、50μ
Ｍ遊離カルシウム、100μg/mlホスファチジルコリン、
及び50mMビス−トリス緩衝液（pH7.0）と共に37℃で５
分間インキュベートする。等量のアセトンを添加するこ
とによって反応を停止して、酢酸エチルで脂肪酸を抽出
する。基質と反応生成物をノバパック（Novapak）C18カ
ラム（ウォーターズ社，ミルフォード,MA）での逆相HPL
Cによって分離する。放射性ピークをベックマン・モデ
ル171ラジオクロマトグラフィー検出器により検出す
る。ジ−HETE及びモノ−HETEに転化したアラキドン酸の
量を５−リポキシゲナーゼ活性の指標として用いる。 １μＭ、10μＭ及び30μＭの有効架橋オリゴヌクレオ
チドで72時間処理したDMSO分化HL−60細胞について予測
される結果は次のようである。コントロール細胞は、ア
ラキドン酸を200pmol/5分/106細胞で酸化する。１μ
Ｍ、10μＭ及び30μＭの有効架橋オリゴヌクレオチドで
処理した細胞は、アラキドン酸をそれぞれ195pmol、140
pmol、及び60pmol/5分/106細胞で酸化するであろう。 細胞中の全５−リポキシゲナーゼタンパク質を測定す
るための定量的競合的酵素結合免疫吸着検定法（ELIS
A）が開発されている。大腸菌内で発現され、抽出、Ｑ
−セファロース、ヒドロキシアパタイト、及び逆相HPLC
により精製されたヒト５−リポキシゲナーゼを標準及び
一次抗原として用いて、マイクロタイタープレートをコ
ーティングする。25ngの精製５−リポキシゲナーゼをマ
イクロタイタープレートに４℃で一晩結合させる。150m
M NaClの存在下で20mMトリスHCl緩衝液（pH7.4）（TB
S）で希釈した５％ヤギ血清でウェルを90分間ブロック
する。細胞抽出物（0.2％トリトンＸ−100,12,000×ｇ
で30分間）又は精製した５−リポキシゲナーゼを、総容
量100μｌのマイクロタイターウェル内で、５−リポキ
シゲナーゼポリクローナル抗体の1:4000希釈液と共に90
分間インキュベートした。この抗体は、ウサギを精製ヒ
ト組換え５−リポキシゲナーゼで免疫感作することによ
って調製する。ウェルを0.05％Tween20を含有するTBS
（TBST）で洗浄してから、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗
ウサギIgG（カペル（Cappel）・ラボラトリーズ，モー
バン,PA）の1:1000希釈液100μｌと共に25℃で60分間イ
ンキュベートする。ウェルをTBSTで洗浄してペルオキシ
ダーゼ標識第二抗体の量をテトラメチルベンジジンで発
色することによって測定する。 30量体架橋オリゴヌクレオチドを１μＭ、10μＭ及び
30μＭで用いるかかる検定法から予測される結果は、10
6細胞当たりの５−リポキシゲナーゼがそれぞれ30ng、1
8ng及び5ngであり、未処理細胞は５−リポキシゲナーゼ
が約34ngであろう。 ５−リポキシゲナーゼ生合成の阻害な最終的な効果
は、刺激された細胞から放出されるロイコトリエンの量
が減少することである。DMSO分化HL−60細胞は、カルシ
ウムイオノフォアA23187での刺激でロイコトリエンB
4（LTB4）を放出する。細胞培地中に放出されたロイコ
トリエンB4は、市販の診断用キット（ニューイングラン
ド・ヌクレアー，ボストン,MA）を用いる放射性免疫検
定法により定量することができる。ロイコトリエンB4産
生は、HL−60細胞を好中球様細胞に分化するDMSOの添加
48時間後に該細胞内で検出することができる。細胞（２
×105細胞/ml）を、1.3％DMSOの存在下で種々の濃度の
架橋オリゴヌクレオチドで48〜72時間処理する。該細胞
を洗浄して、１％脱脂ウシ血清アルブミンを含有するダ
ルベッコ食塩加リン酸緩衝液中で２×106細胞/mlの濃度
で懸濁する。細胞を10μＭカルシウムイオノフォアA231
87で15分間刺激して、メーカーにより記載された放射性
免疫検定法により、５×105細胞から産生したLTB4の量
を測定する。 この検定法を用いると、５−リポキシゲナーゼmRNAに
向けられた架橋オリゴヌクレオチドで次の結果が得られ
るようである。細胞は、1.3％DMSOの存在下で１μＭ、1
0μＭ又は30μＭの架橋オリゴヌクレオチドで処理され
るだろう。５×105細胞から産生するLTB4の量は、それ
ぞれ約75pg、50pg及び35pgで、未処理の分化細胞は75pg
LTB4を産生すると考えられる。 E. in vivo検定法 マウスにおける５−リポキシゲナーゼの産生の阻害
は、次の手順に従って証明することができる。アラキド
ン酸を局所適用すると、皮膚内にロイコトリエンB4、ロ
イコトリエンC4及びプロスタグランジンE2が急速に産生
して、浮腫及び細胞浸潤をもたらす。一定の５−リポキ
シゲナーゼ阻害物質がこの検定法において活性を示すこ
とが知られている。この検定には、2mgのアラキドン酸
をマウスの耳に適用し、反対側の耳をコントロールとし
て用いる。アラキドン酸の投与後１時間の生検材料から
取ったホモジェネート中のミエロペルオキシダーゼ活性
により、多形核細胞浸潤巣を検定する。浮腫反応を耳の
厚みと細切生検材料の湿量の測定によって定量する。生
検材料検体内で産生したロイコトリエンB4の測定を、該
組織中の５−リポキシゲナーゼ活性の直接測定として行
う。架橋オリゴヌクレオチドは、該化合物の活性が最大
になるように、アラキドン酸の投与前12〜24時間に両方
の耳に局所適用されるだろう。両方の耳をアラキドン酸
の攻撃前に該オリゴヌクレオチド0.1μmol、0.3μmol、
又は1.0μmolのいずれかで24時間前処理する。数値は、
各濃度当たり３匹の動物の平均として表す。0.1μmol、
0.3μmol、及び１μmolについての多形核細胞浸潤の阻
害は、それぞれコントロール活性の約10％、75％及び92
％と考えられる。浮腫の抑制は、それぞれ約３％、58％
及び90％と考えられ、ロイコトリエンB4産生の阻害は、
それぞれ約15％、79％及び99％と考えられる。
【配列表】
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フロントページの続き (72)発明者 マノハラン，ムシアン アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，レポサド・ドライブ 7634 (72)発明者 ブルース，トーマス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，シェアウォータ・ドラ イブ 6880 (56)参考文献 特開 平３−190895（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−240864（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−509945（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／12020（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，111, （1989），Ｐ8517〜8519 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，30［３ ］，（1991），Ｐ788〜796

Claims (64)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】第一のオリゴヌクレオチド鎖上に位置する
    第一のヌクレオチド； 前記第一のヌクレオチドは第一の糖部分を有しており； さらに別のオリゴヌクレオチド鎖上に位置する第二のヌ
    クレオチド； 前記第二のヌクレオチドは第二の糖部分を有しており；
    および 前記第一および前記第二の糖部分間の共有結合による架
    橋結合； を含み、ただし、前記架橋結合は3'ヌクレオチド位置と
    5'ヌクレオチド位置の間ではなく、1'ヌクレオチド位置
    と1'ヌクレオチド位置の間ではないことを特徴とする架
    橋核酸。
  2. 【請求項２】オリゴヌクレオチド鎖上に位置する第一の
    ヌクレオチド； 前記第一のヌクレオチドは第一の糖部分を有しており； 前記オリゴヌクレオチド鎖上に位置する第二のヌクレオ
    チド； 前記第二のヌクレオチドは第二の糖部分を有しており；
    および 前記第一および前記第二の糖部分間の共有結合による架
    橋結合； を含み、ただし、前記架橋結合は3'ヌクレオチド位置と
    5'ヌクレオチド位置の間ではないことを特徴とする架橋
    核酸。
  3. 【請求項３】第一のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端上に
    位置し、2',3'−ジアルデヒド構造を含む第一のヌクレ
    オチド； さらに別のオリゴヌクレオチド鎖上または前記第一のオ
    リゴヌクレオチド鎖上に位置する第二のヌクレオチド； 前記第二のヌクレオチドの糖部分上に位置する空間スパ
    ニング基；および 前記ジアルデヒド構造および前記空間スパニング基間の
    共有結合による架橋結合； を含む架橋核酸。
  4. 【請求項４】第一のオリゴヌクレオチド鎖の3'末端上に
    位置し、2'および3'ヒドロキシル基を含む第一のヌクレ
    オチド； さらに別のオリゴヌクレオチド鎖上または前記第一のオ
    リゴヌクレオチド鎖上に位置する第二のヌクレオチド； 前記第二のヌクレオチドの糖部分上に位置する空間スパ
    ニング基；および 前記2'および3'ヒドロキシル基および前記空間スパニン
    グ基間の共有結合によるアセタール架橋結合； を含む架橋核酸。
  5. 【請求項５】第一のオリゴヌクレオチド鎖上に位置する
    第一のヌクレオチド； 前記第一のヌクレオチドは第一の糖部分を有しており； さらに別のオリゴヌクレオチド鎖または前記第一のオリ
    ゴヌクレオチド鎖上に位置する第二のヌクレオチド； 前記第二のヌクレオチドは第二の糖部分を有しており；
    および 前記第一および前記第二の糖部分間の共有結合による架
    橋結合； を含み、ただし、前記架橋結合は3'ヌクレオチド位置と
    5'ヌクレオチド位置の間ではなく、前記第二のヌクレオ
    チドが前記別のオリゴヌクレオチド鎖上に位置する場合
    には前記架橋結合は1'ヌクレオチド位置と1'ヌクレオチ
    ド位置の間ではないことを特徴とする架橋核酸。
  6. 【請求項６】前記第一のヌクレオチドが第一のヌクレオ
    チド配列に位置し、かつ前記第二のヌクレオチドが第二
    のヌクレオチド配列に位置し； 前記第二のヌクレオチド配列が前記第一のヌクレオチド
    配列と相補的でありかつハイブリダイズ可能であり；お
    よび 前記第一および前記第二のヌクレオチド配列が前記第一
    のオリゴヌクレオチドの単一の鎖上に位置しており、前
    記第二のヌクレオチド配列は、前記第一のオリゴヌクレ
    オチドが前記第一および第二のヌクレオチド配列が互い
    に特異的にハイブリダイズ可能なようにお互いに並べら
    れるコンホメーションをとることが十分可能なほど前記
    第一のヌクレオチド配列から離れた距離に位置してい
    る、請求項第５項に記載の架橋核酸。
  7. 【請求項７】前記第一のヌクレオチドが第一のヌクレオ
    チド配列に位置し、かつ前記第二のヌクレオチドが第二
    のヌクレオチド配列に位置し； 前記第二のヌクレオチド配列が前記第一のヌクレオチド
    配列と相補的でありかつハイブリダイズ可能であり；お
    よび 前記第一および前記第二のヌクレオチド配列が異なった
    オリゴヌクレオチド鎖上に位置している、請求項第５項
    に記載の架橋核酸。
  8. 【請求項８】前記第一の糖部分が脱塩基部位を含み； 前記第二の糖部分が空間スパニング基を含み；および 前記空間スパニング基が前記脱塩基部位に共有結合で結
    合されている、請求項第５項に記載の架橋核酸。
  9. 【請求項９】前記脱塩基部位がアルデヒドを含む請求項
    第８項に記載の架橋核酸。
  10. 【請求項１０】前記空間スパニング基がアミン、ヒドラ
    ジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、チオセミ
    カルバジド、ヒドラゾン、ヒドラジド、アルコール、ま
    たはチオールである請求項第８項に記載の架橋核酸。
  11. 【請求項１１】前記空間スパニング基が前記第二のヌク
    レオチドの2'位に結合されている請求項第８項に記載の
    架橋核酸。
  12. 【請求項１２】前記空間スパニング基がC1−C20の直鎖
    アルキル、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキル、C1−C20の直鎖
    Ｓ−アルキル、C1−C20の直鎖NH−アルキル、C1−C20の
    直鎖置換アルキル、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキル、C
    1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキル、C1−C20の直鎖置換NH
    −アルキル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐
    鎖Ｏ−アルキル、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキル、C2−C
    50の分岐鎖NH−アルキル、C2−C50の分岐鎖置換アルキ
    ル、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキル、C2−C50の分岐
    鎖置換Ｓ−アルキル、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
    ル、C2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖Ｏ−アル
    ケニル、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニル、C2−C20の直鎖
    NH−アルケニル、C2−C20の直鎖置換アルケニル、C2−C
    20の直鎖置換Ｏ−アルケニル、C2−C20の直鎖置換Ｓ−
    アルケニル、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニル、C3−C
    50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニ
    ル、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖
    NH−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C3
    −C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置
    換Ｓ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニ
    ル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキ
    ン、C2−C20の直鎖Ｓ−アルキン、C2−C20の直鎖NH−ア
    ルキン、C2−C20の直鎖置換アルキン、C2−C20の直鎖置
    換Ｏ−アルキン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキン、C2
    −C20の直鎖置換NH−アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキ
    ン、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルキン、C3−C50の分岐鎖Ｓ
    −アルキン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキン、C3−C50の
    分岐鎖置換アルキン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキ
    ン、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキン、C3−C50の分岐
    鎖置換NH−アルキン、ポリアミン、ポリアミド、ポリエ
    ステル、ポリエチレングリコール、アリール、アラルキ
    ル、またはヘテロ環式である、請求項第８項に記載の架
    橋核酸。
  13. 【請求項１３】前記空間スパニング基が約８から約13原
    子の長さである請求項第12項に記載の架橋核酸。
  14. 【請求項１４】前記第一の糖部分が第一の空間スパニン
    グ基を含み； 前記第二の糖部分が第二の空間スパニング基を含み；お
    よび 前記共有結合による架橋結合が前記第一および前記第二
    の空間スパニング基の間にある、請求項第５項に記載の
    架橋核酸。
  15. 【請求項１５】前記第一の空間スパニング基がアルデヒ
    ド、保護アルデヒドまたはアルデヒド前駆体である請求
    項第14項に記載の架橋核酸。
  16. 【請求項１６】前記第二の空間スパニング基がアミン、
    ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、チ
    オセミカルバジド、ヒドラジド、アルコール、またはチ
    オールである、請求項第14項に記載の架橋核酸。
  17. 【請求項１７】前記第一の空間スパニング基が前記第一
    のヌクレオチドの2'位に結合し；および 前記第二の空間スパニング基が前記第二のヌクレオチド
    の2'位に結合している、請求項第14項に記載の架橋核
    酸。
  18. 【請求項１８】前記第一および第二の空間スパニング基
    の各々が独立して、C1−C20の直鎖アルキル、C1−C20の
    直鎖Ｏ−アルキル、C1−C20の直鎖Ｓ−アルキル、C1−C
    20の直鎖NH−アルキル、C1−C20の直鎖置換アルキル、C
    1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキル、C1−C20の直鎖置換Ｓ
    −アルキル、C1−C20の直鎖置換NH−アルキル、C2−C50
    の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖Ｏ−アルキル、C2
    −C50の分岐鎖Ｓ−アルキル、C2−C50の分岐鎖NH−アル
    キル、C2−C50の分岐鎖置換アルキル、C2−C50の分岐鎖
    置換Ｏ−アルキル、C2−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルキ
    ル、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキル、C2−C20の直鎖
    アルケニル、C2−C20の直鎖Ｏ−アルケニル、C2−C20の
    直鎖Ｓ−アルケニル、C2−C20の直鎖NH−アルケニル、C
    2−C20の直鎖置換アルケニル、C2−C20の直鎖置換Ｏ−
    アルケニル、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルケニル、C2−C
    20の直鎖置換NH−アルケニル、C3−C50の分岐鎖アルケ
    ニル、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニル、C3−C50の分岐
    鎖Ｓ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖NH−アルケニル、C
    3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換
    Ｏ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換Ｓ−アルケニ
    ル、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニル、C2−C20の直
    鎖アルキン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキン、C2−C20の直
    鎖Ｓ−アルキン、C2−C20の直鎖NH−アルキン、C2−C20
    の直鎖置換アルキン、C2−C20の直鎖置換Ｏ−アルキ
    ン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキン、C2−C20の直鎖置
    換NH−アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3−C50の
    分岐鎖Ｏ−アルキン、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルキン、C
    3−C50の分岐鎖NH−アルキン、C3−C50の分岐鎖置換ア
    ルキン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキン、C3−C50の
    分岐鎖置換Ｓ−アルキン、C3−C50の分岐鎖置換NH−ア
    ルキン、ポリアミン、ポリアミド、ポリエステル、ポリ
    エチレングリコール、アリール、アラルキル、またはヘ
    テロ環式である、請求項第14項に記載の架橋核酸。
  19. 【請求項１９】前記第一および第二の空間スパニング基
    がチオール基であり、前記共有結合による架橋結合がジ
    スルフィド結合である請求項第14項に記載の架橋核酸。
  20. 【請求項２０】前記第一のヌクレオチドが第一のヌクレ
    オチド配列に位置し、かつ前記第二のヌクレオチドが第
    二のヌクレオチド配列に位置し； 前記第一および前記第二のヌクレオチド配列が前記第一
    のオリゴヌクレオチドの単一の鎖上に位置し、前記第二
    のヌクレオチド配列は前記第一のオリゴヌクレオチド
    上、前記第一のヌクレオチド配列に関してハイブリダイ
    ズ不可能な位置に、かつ前記オリゴヌクレオチドが前記
    第一および第二のヌクレオチド配列が互いに空間的に近
    接して位置するようなコンホメーションをとることが十
    分可能なほど前記第一のヌクレオチドから離れて位置し
    ている請求項第５項に記載の架橋核酸。
  21. 【請求項２１】前記第一の糖部分が2',3'−ジアルデヒ
    ド構造を有する3'−末端ヌクレオチドを含み； 前記第二の糖部分が空間スパニング基を含み；および 前記空間スパニング基がジアルデヒドと反応しうる請求
    項第５項に記載の架橋核酸。
  22. 【請求項２２】前記第一の糖部分が2'および3'−糖ヒド
    ロキシ基を有する3'−末端ヌクレオチドを含み； 前記第二の糖部分が空間スパニング基を含み；および アセタール架橋結合が前記2'および3'ヒドロキシ基およ
    び前記空間スパニング基を連結する、請求項第５項に記
    載の架橋核酸。
  23. 【請求項２３】オリゴヌクレオチド中の第一の配列領
    域； オリゴヌクレオチド中の第二の配列領域； 前記第一の配列領域中に位置する脱塩基部位；および 前記第二の配列領域の糖部分上に位置し、前記脱塩基部
    位と共有結合で結合されている空間スパニング基； を含み、ただし、前記第一の配列領域および前記第二の
    配列領域が異なるオリゴヌクレオチド鎖上にある場合に
    は前記架橋結合は1'ヌクレオチド位置と1'ヌクレオチド
    位置の間ではないことを特徴とする架橋オリゴヌクレオ
    チド。
  24. 【請求項２４】前記第一の配列領域および前記第二の配
    列領域が単一のオリゴヌクレオチド鎖上にある請求項第
    23項に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  25. 【請求項２５】前記第一の配列領域および前記第二の配
    列領域が異なるオリゴヌクレオチド鎖上にある請求項第
    23項に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】前記第一の配列領域および前記第二の配
    列領域が互いに相補的でありかつ特異的にハイブリダイ
    ズ可能である請求項第23項に記載の架橋オリゴヌクレオ
    チド。
  27. 【請求項２７】前記空間スパニング基がC1−C20の直鎖
    アルキル、C1−C20の直鎖Ｏ−アルキル、C1−C20の直鎖
    Ｓ−アルキル、C1−C20の直鎖NH−アルキル、C1−C20の
    直鎖置換アルキル、C1−C20の直鎖置換Ｏ−アルキル、C
    1−C20の直鎖置換Ｓ−アルキル、C1−C20の直鎖置換NH
    −アルキル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐
    鎖Ｏ−アルキル、C2−C50の分岐鎖Ｓ−アルキル、C2−C
    50の分岐鎖NH−アルキル、C2−C50の分岐鎖置換アルキ
    ル、C2−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキル、C2−C50の分岐
    鎖置換Ｓ−アルキル、C2−C50の分岐鎖置換NH−アルキ
    ル、C2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖Ｏ−アル
    ケニル、C2−C20の直鎖Ｓ−アルケニル、C2−C20の直鎖
    NH−アルケニル、C2−C20の直鎖置換アルケニル、C2−C
    20の直鎖置換Ｏ−アルケニル、C2−C20の直鎖置換Ｓ−
    アルケニル、C2−C20の直鎖置換NH−アルケニル、C3−C
    50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の分岐鎖Ｏ−アルケニ
    ル、C3−C50の分岐鎖Ｓ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖
    NH−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C3
    −C50の分岐鎖置換Ｏ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置
    換Ｓ−アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換NH−アルケニ
    ル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C20の直鎖Ｏ−アルキ
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    換Ｏ−アルキン、C2−C20の直鎖置換Ｓ−アルキン、C2
    −C20の直鎖置換NH−アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキ
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    −アルキン、C3−C50の分岐鎖NH−アルキン、C3−C50の
    分岐鎖置換アルキン、C3−C50の分岐鎖置換Ｏ−アルキ
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    鎖置換NH−アルキン、ポリアミン、ポリアミド、ポリエ
    ステル、ポリエチレングリコール、アリール、アラルキ
    ル、またはヘテロ環式である、請求項第23項に記載の架
    橋オリゴヌクレオチド。
  28. 【請求項２８】前記空間スパニング基がアミン、ヒドラ
    ジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジド、ヒドラジ
    ド、アルコールまたは、チオールを含む、請求項第23項
    に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  29. 【請求項２９】前記空間スパニング基がCH2−L3、Ｏ−L
    3、Ｓ−L3、NH−L3、またはCO−L3（式中、L3はC1−C20
    の直鎖アルキル、C1−C20の直鎖置換アルキル、C2−C50
    の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖置換アルキル、C2
    −C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖置換アルケニ
    ル、C3−C50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の分岐鎖置換
    アルケニル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C20の直鎖置
    換アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3−C50の分岐
    鎖置換アルキン、ポリアミン、ポリアミド、ポリエステ
    ル、ポリエチレングリコール、アリール、アラルキルま
    たはヘテロ環式である）である請求項第23項に記載の架
    橋オリゴヌクレオチド。
  30. 【請求項３０】前記空間スパニング基が前記第二の配列
    領域内のヌクレオチドの2'−位に位置している請求項第
    23項に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  31. 【請求項３１】オリゴヌクレオチド中の第一の配列領
    域； オリゴヌクレオチド中の第二の配列領域；および 構造： X1−L1−Ｙ−L2−X2 （式中X1は前記第一の配列領域に共有結合で連結されて
    おり、X2は前記第二の配列領域に共有結合で連結されて
    おり、およびここで： （ｉ） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2またはC
    Oであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキル、C1−C20
    の直鎖置換アルキル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C
    50の分岐鎖置換アルキル、C2−C20の直鎖アルケニル、C
    2−C20の直鎖置換アルケニル、C3−C50の分岐鎖アルケ
    ニル、C3−C50の分岐鎖置換アルケニル、C2−C20の直鎖
    アルキン、C2−C20の直鎖置換アルキン、C3−C50の分岐
    鎖アルキン、C3−C50の分岐鎖置換アルキン、ポリアミ
    ン、ポリアミド、ポリエステル、ポリエチレングリコー
    ル、ポリエーテル、アリール、アラルキルまたはヘテロ
    環式であり；および Ｙはイミン、アミン、オキシム、ヒドロキシルアミン、
    ヒドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジド−ヒドラ
    ゾン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジド、セミカル
    バゾン、チオセミカルバジド、チオカルバゾン、ジスル
    フィド、ヘミアセタール、チオヘミアセタール、α−ケ
    ト−アルキルチオアルキルまたはα−ケト−アルキルア
    ミノアルキルである；または （ii） X1およびX2は独立してＯまたはNHであり；およ
    び L1−Ｙ−L2は一緒になってNH−L3−NHまたはNH−NH−L3
    −NH−NHであり；および L3はC1−C20の直鎖アルキル、C1−C20の直鎖置換アルキ
    ル、C2−C50の分岐鎖アルキル、C2−C50の分岐鎖置換ア
    ルキル、C2−C20の直鎖アルケニル、C2−C20の直鎖置換
    アルケニル、C3−C50の分岐鎖アルケニル、C3−C50の分
    岐鎖置換アルケニル、C2−C20の直鎖アルキン、C2−C20
    の直鎖置換アルキン、C3−C50の分岐鎖アルキン、C3−C
    50の分岐鎖置換アルキン、ポリアミン、ポリアミド、ポ
    リエステル、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、
    アリール、アラルキルまたはヘテロ環式である；または （iii） X1およびX2は独立してＯ、Ｓ、NH、CH2または
    COであり； L1およびL2は独立してC1−C20の直鎖アルキルアミノ、C
    1−C20の直鎖置換アルキルアミノ、C2−C50の分岐鎖ア
    ルキルアミノ、C2−C50の分岐鎖置換アルキルアミノ、C
    2−C20の直鎖アルケニルアミノ、C2−C20の直鎖置換ア
    ルケニルアミノ、C3−C50の分岐鎖アルケニルアミノ、C
    3−C50の分岐鎖置換アルケニルアミノ、C2−C20の直鎖
    アルキニルアミノ、C2−C20の直鎖置換アルキニルアミ
    ノ、C3C50の分岐鎖アルキニルアミノ、C3−C50の分岐鎖
    置換アルキニルアミノ、C1−C20の直鎖アルキルチオ、C
    1−C20の直鎖置換アルキルチオ、C2−C50の分岐鎖アル
    キルチオ、C2−C50の分岐鎖置換アルキルチオ、C2−C20
    直鎖アルケニルチオ、C2−C20の直鎖置換アルケニルチ
    オ、C3−C50の分岐鎖アルケニルチオ、C3−C50の分岐鎖
    置換アルケニルチオ、C2−C20の直鎖アルキニルチオ、C
    2−C20の直鎖置換アルキニルチオ、C3−C50の分岐鎖ア
    ルキニルチオ、C3−C50の分岐鎖置換アルキニルチオで
    あり；および Ｙはヘテロ二官能性またはホモ二官能性架橋剤である； ここで前記置換アルキル、置換アルケニルおよび置換ア
    ルキン部分の前記置換基はインターカレーター、コンジ
    ュゲート、ポリアミン、ポリアミドまたはポリエチレン
    グリコールである）の共有結合で結合された連結基を含
    み、 ただし、前記架橋結合は3'ヌクレオチド位置と5'ヌクレ
    オチド位置の間ではなく、前記第一の配列領域および前
    記第二の配列領域が異なるオリゴヌクレオチド鎖上にあ
    る場合には前記架橋結合は1'ヌクレオチド位置と1'ヌク
    レオチド位置の間ではないことを特徴とする架橋オリゴ
    ヌクレオチド。
  32. 【請求項３２】前記第一の配列領域および前記第二の配
    列領域が単一のオリゴヌクレオチド鎖上にある請求項第
    31項に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  33. 【請求項３３】前記第一の配列領域および前記第二の配
    列領域が異なるオリゴヌクレオチド鎖上にある請求項第
    31項に記載の架橋オリゴヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】オリゴヌクレオチド中の第一の配列領
    域； オリゴヌクレオチド中の第二の配列領域； 前記第一の配列領域中に位置するヌクレオチドの2'位に
    結合した第一の空間スパニング基； 前記第二の配列領域内に位置するヌクレオチドの2'位に
    結合した第二の空間スパニング基；および 前記第一および第二の空間スパニング基を共有結合で結
    合する連結部分を含む、架橋オリゴヌクレオチド。
  35. 【請求項３５】前記連結部分が−Ｎ＝CH−、−Ｎ（Ｒ）
    −CH2−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｏ−Ｎ＝CH−、
    −Ｏ−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−HC＝Ｎ
    −Ｎ（Ｒ）−、−HC＝Ｎ−Ｎ＝CH−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ
    （Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）
    −Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ
    （Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）
    −Ｎ＝CH−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ
    （Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH
    −、−Ｓ−Ｓ−、−CH（OH）−Ｏ−CH2−、−CH（OH）
    −Ｓ−CH2−、−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ（Ｏ）−CH2−、また
    は−CH2−NH−CH2−Ｃ（Ｏ）−CH2−であり；および ＲがＨ、アルキル、アルケニル、アラルキル、インター
    カレーター、コンジュゲート、ポリアミン、ポリアミド
    またはポリエチレングリコールである請求項第34項に記
    載の架橋オリゴヌクレオチド。
  36. 【請求項３６】オリゴヌクレオチドを規定のコンフィギ
    ュレーションに固定する方法であって、 前記オリゴヌクレオチド中の第一の部位を選択し、ここ
    で前記第一の部位は第一のヌクレオチド配列を有してお
    り； 前記第一の部位の第一のヌクレオチドの糖部分に第一の
    結合前駆体を結合させ； 前記オリゴヌクレオチド中の第二の部位を選択し、ここ
    で前記第二の部位は第二のヌクレオチド配列を有してお
    り； 前記第二の部位の第二のヌクレオチドの糖部分に第二の
    結合前駆体を結合させ；および 前記第一および前記第二の結合前駆体間に共有結合によ
    る架橋結合を形成する； ことからなり、ただし、前記架橋結合は3'オリゴヌクレ
    オチド位置および5'オリゴヌクレオチド位置の間ではな
    いことを特徴とする方法。
  37. 【請求項３７】前記第一のヌクレオチドの前駆体を前記
    第一のヌクレオチド前駆体の糖部分上に前記第一の結合
    前駆体を導入するための試薬と反応させることにより、
    前記第一のヌクレオチドへ前記第一の結合前駆体を結合
    し； 前記第一のヌクレオチド前駆体を保護および活性化形に
    誘導化し； 前記第一のヌクレオチド配列内へ前記誘導化された第一
    のヌクレオチド前駆体を合成的に取り込ませ； 前記第二のヌクレオチドの前駆体を前記第二のヌクレオ
    チド前駆体の糖部分上に前記第二の結合前駆体を導入す
    るための試薬と反応させることにより、前記第二のヌク
    レオチドへ前記第二の結合前駆体を結合し； 前記第二のヌクレオチド前駆体を保護および活性化形に
    誘導化し；および 前記第二のヌクレオチド配列内へ前記誘導化された第二
    のヌクレオチド前駆体を合成的に取り込ませることを含
    む、請求項第36項に記載の方法。
  38. 【請求項３８】前記第一の結合前駆体として脱塩基ヌク
    レオチドを選択し；および 前記第二のヌクレオチドの2'位に前記第二の結合前駆体
    を結合させることを含む、請求項第36項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記第一の結合前駆体を前記第一のヌク
    レオチドの2'位に結合させ；および 前記第二のヌクレオチドの2'位に前記第二の結合前駆体
    を結合させることを含む、請求項第36項に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記架橋結合を： −Ｎ＝CH、−Ｎ（Ｒ）−、−Ｎ（Ｒ）−CH2−NH−、−N
    H−CH2−NH−、−Ｏ−Ｎ＝CH−、−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−、−
    Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−HC＝Ｎ−Ｎ（Ｒ）−、−HC＝
    Ｎ−Ｎ＝CH−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｃ
    （Ｏ）Ｎ（Ｒ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）
    −、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）−、−
    Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｎ（Ｒ）
    −Ｃ（Ｓ）−Ｎ（Ｒ）−NH−、−Ｎ（Ｒ）−Ｃ（Ｓ）−
    Ｎ（Ｒ）−Ｎ＝CH−、−Ｓ−Ｓ−、−CH（OH）−Ｏ−CH
    2−、−CH（OH）−Ｓ−CH2−、−CH2−Ｓ−CH2−Ｃ
    （Ｏ）−CH2−または−CH2−NH−CH2−Ｃ（Ｏ）−CH
    2−； （式中、ＲはＨ、アルキル、アルケニル、アラルキル、
    インターカレーター、コンジュゲート、ポリアミン、ポ
    リアミドまたはポリエチレングリコールである）から選
    択することを含む請求項第39項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記架橋結合を、イミン、アミン、アミ
    ノアルキルアミン、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒ
    ドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジド−ヒドラゾ
    ン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジド、セミカルバ
    ゾン、チオセミカルバジド、チオカルバゾン、ジスルフ
    ィド、ヘミアセタール、チオヘミアセタール、α−ケト
    −アルキルチオアルキルまたはα−ケト−アルキルアミ
    ノアルキル結合から選択することを含む、請求項第39項
    に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記第二の部位のヌクレオチドの前記配
    列と相補的であり、かつ特異的にハイブリダイズ可能で
    あるような前記第一の部位のヌクレオチドの前記配列を
    選択することを含む請求項第36項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】単一オリゴヌクレオチドを架橋する方法
    であって、 オリゴヌクレオチド中の第一のヌクレオチド配列を選択
    し； 前記オリゴヌクレオチド中の第二のヌクレオチド配列を
    選択し； 前記第一のヌクレオチド配列内へ脱塩基ヌクレオチドを
    取り込ませ； 前記第二の配列のヌクレオチド上に結合前駆体を結合さ
    せ；および 前記脱塩基部位および前記結合前駆体間に共有結合によ
    る架橋結合を形成する； ことを含む方法。
  44. 【請求項４４】前記第二の配列の糖部分上に前記結合前
    駆体を結合させることを含む請求項第43項に記載の方
    法。
  45. 【請求項４５】前記第二のヌクレオチドの2'位に前記結
    合前駆体を結合させることを含む請求項第43項に記載の
    方法。
  46. 【請求項４６】前記脱塩基部位にアルデヒド官能基を形
    成させ；および 前記脱塩基部位アルデヒド官能基とオキシム、イミン、
    ヒドラゾン、ヒドラジド−ヒドラゾン、セミカルバゾ
    ン、チオセミカルバゾン、ヘミアセタールまたはチオ−
    ヘミアセタール共有結合の内の一つを形成しうる官能基
    を含むように前記結合前駆体を選択することを含む請求
    項第43項に記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記第二のヌクレオチド配列と相補的で
    あり、かつ特異的にハイブリダイズ可能であるような前
    記第一のヌクレオチド配列を選択することを含む請求項
    第43項に記載の方法。
  48. 【請求項４８】単一オリゴヌクレオチド鎖を架橋する方
    法であって、 オリゴヌクレオチド中の第一のヌクレオチド配列を選択
    し； 前記オリゴヌクレオチド中の第二のヌクレオチド配列を
    選択し； 前記第一のヌクレオチド配列の第一のヌクレオチドの糖
    部分に第一の結合前駆体を結合させ； 前記第二のヌクレオチド配列の第二のヌクレオチドの糖
    部分に第二の結合前駆体を結合させ；および 前記第一および前記第二の結合前駆体間に共有結合によ
    る架橋結合を形成させる； ことを含み、ただし、前記架橋結合は3'オリゴヌクレオ
    チド位置および5'オリゴヌクレオチド位置の間ではない
    ことを特徴とする方法。
  49. 【請求項４９】前記第二のヌクレオチド配列と相補的で
    あり、かつ特異的にハイブリダイズ可能であるような前
    記第一のヌクレオチド配列を選択することを含む請求項
    第48項に記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記共有結合による架橋結合をイミン、
    アミン、アミノアルキルアミン、オキシム、ヒドロキシ
    ルアミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジ
    ド−ヒドラゾン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジ
    ド、セミカルバゾン、チオセミカルバジド、チオカルバ
    ゾン、ジスルフィド、ヘミアセタールまたはチオヘミア
    セタール結合から選択することを含む請求項第48項に記
    載の方法。
  51. 【請求項５１】オリゴヌクレオチドの第一鎖および第二
    鎖を架橋する方法であって、 第一のオリゴヌクレオチド鎖中の第一のヌクレオチド配
    列を選択し； 第二のオリゴヌクレオチド鎖中の第二のヌクレオチド配
    列を選択し； 前記第一のヌクレオチド配列内に脱塩基ヌクレオチドを
    取り込ませ； 前記第二のヌクレオチド配列のヌクレオチドに結合前駆
    体を結合させ；および 前記脱塩基部位および前記結合前駆体間に共有結合によ
    る架橋結合を形成させる； ことを含み、ただし、前記架橋結合は1'ヌクレオチド置
    と1'ヌクレオチド位置の間ではないことを特徴とする方
    法。
  52. 【請求項５２】前記第二のヌクレオチド配列と相補的で
    あり特異的にハイブリダイズ可能であるような前記第一
    のヌクレオチド配列を選択することを含む請求項第51項
    に記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記第二のヌクレオチド配列の糖部分に
    前記結合前駆体を結合させることを含む請求項第51項に
    記載の方法。
  54. 【請求項５４】前記第二のヌクレオチドの2'位に前記結
    合前駆体を結合させることを含む請求項第53項に記載の
    方法。
  55. 【請求項５５】前記脱塩基部位にアルデヒド官能基を形
    成し；および 前記脱塩基部位アルデヒド官能基とオキシム、イミン、
    ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ヒ
    ドラジド−ヒドラゾン、ヘミアセタールまたはチオヘミ
    アセタール結合の内の一つを形成しうる官能基を含むよ
    うに前記結合前駆体を選択することを含む請求項第51項
    に記載の方法。
  56. 【請求項５６】オリゴヌクレオチドの第一および第二の
    鎖を架橋する方法であって、 第一のオリゴヌクレオチド鎖中の第一のヌクレオチド配
    列を選択し； 第二のオリゴヌクレオチド鎖中の第二のヌクレオチド配
    列を選択し； 前記第一のヌクレオチド配列の選択されたヌクレオチド
    の糖部分に第一の結合前駆体を結合させ； 前記第二のヌクレオチド配列のヌクレオチドの糖部分に
    第二の結合前駆体を結合させ；および 前記第一および前記第二の結合前駆体間に共有結合によ
    る架橋結合を形成させる； ことを含み、ただし、前記架橋結合は3'オリゴヌクレオ
    チド位置および5'オリゴヌクレオチド位置の間ではな
    く、1'ヌクレオチド位置と1'ヌクレオチド位置の間では
    ないことを特徴とする方法。
  57. 【請求項５７】前記第二のヌクレオチド配列と相補的で
    あり、かつ特異的にハイブリダイズ可能であるような前
    記第一のヌクレオチド配列を選択することを含む請求項
    第56項に記載の方法。
  58. 【請求項５８】前記共有結合による架橋結合をイミン、
    アミン、アミノアルキルアミン、オキシム、ヒドロキシ
    ルアミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、アジン、ヒドラジ
    ド−ヒドラゾン、アミド、ヒドラジド、セミカルバジ
    ド、セミカルバゾン、チオセミカルバジド、チオカルバ
    ゾン、ジスルフィド、ヘミアセタールまたはチオヘミア
    セタール結合から選択することを含む請求項第56項に記
    載の方法。
  59. 【請求項５９】前記第１のヌクレオチドが前記第１のオ
    リゴヌクレオチド鎖上の少なくとも２つのヌクレオチド
    に共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記さらなるオリゴヌクレオ
    チド鎖上の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合し
    ている、請求項１記載の架橋核酸。
  60. 【請求項６０】前記第１のヌクレオチドが前記オリゴヌ
    クレオチド鎖上の少なくとも２つのさらなるヌクレオチ
    ドに共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド鎖上
    の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合しており、
    前記さらなるオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌ
    クレオチドとは異なる、請求項２記載の架橋核酸。
  61. 【請求項６１】前記第１のヌクレオチドが前記オリゴヌ
    クレオチド鎖上の少なくとも２つのさらなるヌクレオチ
    ドに共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド鎖上
    の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合しており、
    前記さらなるオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌ
    クレオチドとは異なる、請求項５記載の架橋核酸。
  62. 【請求項６２】前記第１のヌクレオチドが前記オリゴヌ
    クレオチド鎖上の少なくとも２つのさらなるヌクレオチ
    ドに共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド鎖上
    の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合しており、
    前記さらなるオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌ
    クレオチドとは異なる、請求項36記載の方法。
  63. 【請求項６３】前記第１のヌクレオチドが前記オリゴヌ
    クレオチド鎖上の少なくとも２つのさらなるヌクレオチ
    ドに共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチド鎖上
    の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合しており、
    前記さらなるオリゴヌクレオチドは前記第１のオリゴヌ
    クレオチドとは異なる、請求項48記載の方法。
  64. 【請求項６４】前記第１のヌクレオチドが前記第１のオ
    リゴヌクレオチド鎖上の少なくとも２つのヌクレオチド
    に共有結合しており、かつ、 前記第２のヌクレオチドが前記第２のオリゴヌクレオチ
    ド鎖上の少なくとも２つのヌクレオチドに共有結合して
    いる、請求項56記載の方法。
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