JP3529146B2 - 組み換え体ネコヘルペスウイルスワクチン - Google Patents
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Description
(FHV)ゲノムの一領域に変異を有するFHV変異体
(mutant)と、FHV挿入領域を含む核酸配列
と、挿入領域由来のDNAをその側方に伴った異種核酸
配列を含む核酸配列と、そのような核酸配列を含む組み
換えDNA分子と、FHV変異体に感染させた細胞培養
物と、FHV変異体を含むワクチンとに係わる。
の一つに、気道感染に関連するものが有る。気道感染は
ほとんどの場合、ネコヘルペスウイルス1型(FHV)
またはネコカリチウイルスによって惹起される。
気管炎の原因物質である。仔猫ではFHV感染は全身化
し得、その結果死亡率が50%にも達する。この疾病は
一般的で、世界中に見いだされ、くしゃみ、鬱状態、及
び目鼻からの粘液膿分泌を特徴とする。
スウイルス亜科の一員である。ゲノムは約126kbp
の長さを有し、約99kbpのユニークな長領域
(UL)と27kbpの短領域とから成り、前記短領域
は約8kbpの倒置反復配列を側方に伴った約9kbp
のユニークな短領域(US)を含む(Grail et
al., Arch. Virol. 116, p
p.209−220, 1991)。
ので、改質生存または死滅FHVを含むネコウイルス性
鼻気管炎ワクチンが開発され、この疾病の発生率を低下
させるのに成功した。
ルス(FeLV)、ネコカリチウイルス、ネコ免疫不全
症ウイルス(FIV)、ネココロナウイルス及びネコク
ラミジアなど、他の様々な病原体にも感染し得る。現
在、猫の上記病原微生物への感染は通常、生または不活
化ワクチンや当該病原体のサブユニットに由来するワク
チンによって防御され得る。
欠点を有し得る。弱毒生ワクチンの使用には、動物に弱
毒化の不十分な病原微生物を接種する危険が常に伴う。
そのうえ、弱毒化された病原体が有毒状態に返り、その
結果ワクチン接種された動物が発症して、場合によって
は病原体が他の動物に拡散する恐れも有る。
誘導せず、免疫感作の繰り返しを必要とする。また、中
和を誘導する病原体の抗原決定基が不活性化処理によっ
て変化して、ワクチンの感染防御力を低下させかねな
い。
て含有させたワクチンに関連する問題として抗原成分同
士の相互作用が有り、この相互作用は1種以上のワクチ
ン成分の効力低下を招く。
トワクチンにも幾つか欠点が有る。第一に、複製を行な
わない構造体として免疫系に付与されるポリペプチドサ
ブユニットはしばしば長期の免疫を誘導せず、しかもア
ジュバントの存在を必要とする。第二に、複製を行なう
構造体としての付与の方がサブユニット構造体としての
付与より効率的な免疫誘導を実現し得る。
ワクチンまたは不活化ワクチンの下では、或る動物がF
HVフィールドウイルスのキャリアであるのか、それと
も以前にワクチン接種を受けたのかを判断することは不
可能である。従って、有毒なフィールドウイルスの拡散
を低減する適当手段を講じることができるように、動物
がFHVワクチンを接種されたのか、それともフィール
ドウイルスに感染したのか確認し得ることが重要とな
る。
ス性鼻気管炎に対するワクチンの製造のみでなく、ネコ
科動物の他の感染症に対するワクチンの製造にも用いら
れ得るFHV変異体を提供することを目的とし、この変
異体は弱毒化した生きた病原体をワクチンとして用いる
ことに関連して潜在するいかなる危険も回避し、必ずし
もアジュバントを必要とせずに体液免疫系と細胞免疫系
との両方を有効に刺激し、かつ異なる抗原成分が互いに
不利に干渉する危険を伴わずに多価ワクチン実現の可能
性を提示する。
は他のFHVワクチンウイルスからも区別され得るFH
Vワクチンウイルスを提供することも目的とする。
の、配列番号2に示したポリペプチドをコードする転写
解読枠のDNA配列及び該配列の側方に位置する遺伝子
間配列によって規定された領域に変異を有するFHV変
異体を提供する。
FHVのゲノムの同じ領域の遺伝情報に関して変化して
いることと理解される。変異は、例えば核酸の置換、欠
失、挿入もしくは逆位、またはこれらの組み合わせであ
り、配列番号2に示した抗原ポリペプチドもしくは機能
ポリペプチドを一切産生し得ないFHV変異体をもたら
す。
規定された領域に導入される変異は欠失または挿入によ
る。
特徴とする組み換え体FHV変異体を提供し、前記核酸
配列はFHVゲノムの、配列番号2に示したポリペプチ
ドをコードする転写解読枠(ORF)のDNA配列及び
該配列の側方に位置する遺伝子間配列によって規定され
た領域に導入されている。
株、例えば株G2620(Intervet Inte
rnational B.V., the Nethe
rlandsから市販)、C−27(ATCC VR−
636)、FVRm(ATCC VR−814)、FV
Rmワクチン(ATCC VR−815)またはF2か
ら得ることができる。
異体”という語は、異種核酸配列、即ちFHVが天然に
有する遺伝子の核酸配列と同等でない核酸配列を含むD
NAのウイルスゲノムへの組み込みによって遺伝的修飾
を施された感染性ウイルスを意味する。
細胞に侵入すると異種ポリペプチドの形態の異種遺伝子
を発現させ得る。
子鎖を意味し、この分子鎖は特定長の産生物ではなく、
また必要であれば、例えばグリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化またはホスホリル化によってin viv
oまたはin vitroに修飾され得る。即ち、特に
ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチ
ドの定義に含まれる。
ための必要条件は、異種核酸配列の挿入などによる変異
がFHVゲノム配列の許容位置もしくは領域、即ちFH
Vの感染や複製に必要な機能などの重要機能の破壊を伴
わずに変異の受容に用いられ得る位置もしくは領域にお
いて実現されることである。異種核酸配列が挿入される
場合、上記のような領域は挿入領域と呼称される。
の配置についてはさほど知られていない。Rota等
(Virology 154, pp. 168−17
9,1986)及びGrail等(Arch. Vir
ol. 116, pp.209−220, 199
1)はFHVゲノムの物理的地図を開示した。Nunb
erg等(J. Virology 63, pp.
3240−3249,1989)及びCole等(J.
Virology 64, pp. 4930−49
38, 1990)はチミジンキナーゼ(TK)遺伝子
を同定し、この遺伝子をFHVゲノムのSalI−A制
限断片(Rota等、上掲誌)にマッピングした。その
後、FHV TK遺伝子内にFeLV env及びga
g遺伝子を挿入された組み換え体FHV株が構成され
た。
まで、FHVゲノムでは同定されていなかった。驚くべ
きことに、上記領域では異種DNAの組み込みなどによ
る変異がFHVの重要機能の破壊を伴わずに可能である
ことが判明した。
された領域に変異を導入すると、生きているFHV変異
体の毒性が該変異体の感染防御特性への悪影響を伴わず
に著しく低下することが判明した。この発見によって、
弱毒FHV変異体を、例えば先に述べたように規定され
た領域への欠失または挿入の導入によって得る可能性が
提示され、そのようにして得られる変異体はワクチン接
種を受けるべき動物に生きた状態で安全に、経口/経鼻
ルートからでも投与され得る。
異種DNA配列の挿入などによって変異を導入するのに
用いられる(挿入)領域は、FHVゲノムDNAを酵素
Sau3Aで部分的に消化することによって得られる1
0.9kbpの制限断片内に位置する。
細に分析され、実質的にウイルスゲノムの、Grail
等(上掲誌)の地図上で地図単位0.08から0.17
に達するULセグメント内の1領域に対応する。
I断片内に位置し、配列番号2に示した、193個のア
ミノ酸から成るポリペプチドをコードするDNA配列
と、該配列の上流側及び下流側に位置する遺伝子間配列
とを含む。上流側及び下流側遺伝子間配列はORFまた
はタンパク質をコードするDNA配列の一部を成さず、
またはFHVウイルスの複製を調節する配列を含まな
い。これらの側方配列は、最も近い転写解読枠の始点ま
たは終点まで下流または上流方向へ伸長する。
列の長さはそれぞれ約252及び173bpである。
などによる変異を、実質的に配列番号1に示したDNA
配列によって規定された(挿入)領域に有する(組み換
え体)FHV変異体を提供する。
は特に、配列番号2に示したアミノ酸配列を有するアミ
ノ酸193個の長鎖ポリペプチドをコードするFHV
DNA配列、即ち配列番号1に示したヌクレオチド位置
253〜834に対応するDNA配列内で実現され、そ
の際異種DNAを挿入するうえで最も好ましい部位はヌ
クレオチド位置576にただ1個存在するBglII制
限部位である。
のFHVウイルス間に自然の変動(natural v
ariations)が存在し得ると理解される。その
ような変動は1個以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿
入、逆位または付加をもたらし得る。この変動の結果生
じるFHV DNA変体(variants)は、本明
細書に説明するORFとは別の対応するORFをコード
し得る。それらのORF変体をコードするDNA配列
は、配列番号1のDNA配列とのハイブリダイゼーショ
ンや、物理的地図の比較によって当該ORFをコードす
る類似領域を位置決定する方法を含めた幾つかの方法で
位置決定され得る。従って本発明は、任意のFHV株か
ら取得可能な(挿入)領域を提供する。
用いて実現し、それによって先に述べたように規定され
た(挿入)領域のDNA配列に関連するDNA配列を得
る可能性が存在する。このようにして得られる関連DN
A配列を特徴とする、FHVゲノム内の(挿入)領域へ
の異種遺伝子の挿入などによる変異を有する(組み換え
体)FHV変異体も本発明の範囲内であることは明らか
である。
域は重要な機能を有しないので、該領域の一部または全
部を欠失させ、その後所望であれば欠失部分に異種遺伝
子を導入することが可能である。
定された(挿入)領域は、FHVゲノム内の領域であっ
て所望であればこの領域からDNA配列が欠失した後に
異種核酸配列の組み込みに用いられ得るか、または別様
の変異、特にこの領域での欠失による変異の導入に用い
られ得る領域の位置を特徴付けている。
べき異種核酸配列は、例えばウイルス、原核生物、真核
生物、または合成的なものなど、任意の供給源に由来し
得る。この核酸配列は病原体、好ましくはネコ病原体に
由来し得、FHVゲノムへの挿入後疾病に対する免疫の
誘導に適用され得る。
不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイ
ルス、ネココロナウイルス及びネコクラミジアのポリペ
プチドをコードする核酸配列が、FHVゲノムの挿入領
域への組み込みに用いられる。
ド、特にリンフォカイン、インターフェロンまたはサイ
トカインといった免疫調節剤をコードする核酸配列が上
記挿入領域に組み込まれ得る。
配列が発現するための重要な必要条件は、異種核酸配列
に適当なプロモーターが機能可能に結合していることで
ある。プロモーターが、組み換え体FHVに感染した細
胞内での遺伝子転写を誘導し得る任意の真核生物、原核
生物またはウイルスプロモーター、例えばレトロウイル
スの長い末端繰り返し配列(LTR)のプロモーター
(Gorman etal., Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 79,pp.
6777−6781, 1982)、SV40プロモー
ター(Mulligan and Berg, Sci
ence 209, pp. 1422−1427,
1980)またはサイトメガロウイルス直前プロモータ
ー(Schaffner et al., Cell
41, pp. 521−530, 1985)などか
ら広く選択されることは当業者には明白である。
することが望ましい場合、先に述べたように同定された
領域のウイルスゲノムからの部分的または全体的欠失が
invivo相同組み換え技術によって実現され得る。
列の一部を含み、かつ各一方の側方部位に少なくとも1
00個のヌクレオチドを伴ったDNA断片が適当なプラ
スミド媒体中でサブクローニングされ得る。
記プラスミドにおいて、転写解読枠にかまたはその近傍
に適正に配置された部位での1種以上の酵素による制限
消化によって実現され得る。残りのプラスミド分子の再
環化によって、新たに同定された領域内に存在するコー
ド配列の少なくとも一部を欠く誘導体が得られる。ある
いは他の場合には、転写解読枠の配列内に存在する制限
部位内から1または2方向に進行する欠失が導入され得
る。この欠失導入のためには、BalIやエキソヌクレ
アーゼIIIといった酵素が用いられ得る。再環化され
たプラスミド分子でE.coli細胞が形質転換され、
個々のコロニーが上記特定領域に導入された欠失の大き
さを決定するべく制限マッピングによって分析される。
欠失の正確な位置は配列分析によって求めることができ
る。明確な欠失を有するプラスミドとFHVウイルスD
NAとで同時に、培養されたネコ細胞がトランスフェク
ションされ得る。in vivo組み換えが生起した
後、ウイルスゲノムの先に述べた領域内の適正位置に欠
失が導入される。ウイルス子孫中の組み換え体は、例え
ば本来欠失が導入された位置である接合部に生じるヌク
レオチド配列と特異的にハイブリダイズする15〜20
塩基長の合成オリゴマーによって同定され得る。
HVゲノムに異種核酸配列を導入するのに用いられ得
る。この導入を達成するために、まずFHVゲノムDN
Aとの組み換えのための組み換え体DNA分子が構成さ
れる。そのような分子は任意の適当なプラスミド、コス
ミドまたはファージ、最も好ましくはプラスミドに由来
し得、かつ、所望であればプロモーターと機能可能に結
合した異種核酸配列を含む。この核酸配列及びプロモー
ターは本明細書中に定義した挿入領域配列を含むFHV
ゲノムDNAの断片に導入され、組み換え体DNA分子
においてサブクローニングされる。異種核酸配列の側方
に位置する挿入領域配列は、FHVウイルスゲノムとの
in vivo相同組み換えを生起させ得る、例えば5
0〜3000bpの適当な長さを有するべきである。所
望であれば、同じかまたは異なる病原体に由来する2種
以上の異なる異種核酸配列を含む構成体が製造され得、
その際前記核酸配列は本明細書に定義されたFHVの挿
入領域配列を側方に伴う。このような組み換え体DNA
分子は、2種以上の異なる抗原ポリペプチドを発現させ
て多価ワンチンをもたらす組み換え体FHVの製造に用
いられ得る。
種核酸配列を含む組み換え体DNA分子の存在下にFH
V DNAで細胞、例えばネコ腎細胞(CRFK)また
はネコ胚細胞がトランスフェクションされ得、それによ
って組み換え体DNA分子の挿入領域配列とFHVゲノ
ムの挿入領域配列との間に組み換えが生起する。組み換
えは、プラスミド配列を有しない、適当な挿入領域配列
を側方に伴った異種核酸配列を含む核酸配列で感染細胞
をトランスフェクションすることによっても実現され得
る。このような組み換えの結果として細胞培養物中に生
じた組み換え体ウイルス子孫は、例えばハイブリダイゼ
ーションや、異種核酸配列に沿って同時に組み込まれた
遺伝子がコードする酵素の活性の検出や、組み換え体F
HVで発現した抗原性の異種ポリペプチドの免疫学的検
出などによって遺伝子型または表現型に基づき選択され
得る。組み換え体ウイルスの選択は、ネオマイシン、ゲ
ンタマイシンまたはミコフェノール酸といった化合物に
対する耐性に基づいて実際的に行なうことも可能であ
る。選択された組み換え体FHVは細胞培養物中で大規
模に培養され得、その後該FHVで発現した物質もしく
は異種ポリペプチドを含む組み換え体FHVが前記培養
物から回収され得る。
定病原体に由来する1種以上の異種ポリペプチドを発現
させる生きた組み換え体FHVは、動物、特に猫及びイ
ヌ科動物種の家畜であるもの及び家畜でないものへのワ
クチン接種に用いられ得る。上記のような生ベクターワ
クチンの接種後、好ましくは接種を受けた宿主内で組み
換え体FHVの複製が起こり、FHVポリペプチドに沿
って異種ポリペプチドがin vivoで発現する。接
種を受けた宿主で発現したポリペプチドは、FHVと特
定病原体との両方に対する免疫応答を誘導する。特定病
原体に由来する異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を
刺激し得る場合、本発明による組み換え体FHV変異体
を接種された動物は以後、当該病原体への感染にもFH
Vへの感染にも免疫性となる。即ち、本発明によりFH
Vゲノムの挿入領域に組み込まれた異種核酸配列はin
vivoで連続的に発現して、病原体に対する確実
で、安全で、かつ持続する免疫を実現し得る。
み、かつ発現させる本発明による組み換え体FHV変異
体は、一価または多価ワクチンとして機能し得る。
み換え体FHV変異体はネコ由来の細胞培養物上で増殖
させ得る。増殖したウイルスは組織細胞培養液及び/ま
たは細胞を集めることによって回収され得る。生ワクチ
ンは懸濁液の形態に製造され得、または凍結乾燥され得
る。
て、ワクチンは薬剤学的に許容可能なキャリヤまたは稀
釈剤も含有し得る。
キャリヤまたは稀釈剤の例には、SPGAなどの安定
剤、炭水化物(例えばソルビトール、マンニトール、澱
粉、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブ
ミンやカゼインなどのタンパン質、ウシ血清や脱脂乳な
どのタンパン質含有製剤、及び緩衝液(例えばリン酸塩
緩衝液)が含まれる。
る1種以上の化合物がワクチンに添加され得る。適当な
アジュバントは、例えば水酸化アルミニウム、リン酸ア
ルミニウムもしくは酸化アルミニウム、[例えばBay
ol F(登録商標)またはMarcol 52(登録
商標)の]油乳濁液、サポニンまたはビタミンE溶解物
などである。
に従って変化する。適当な投与量は、例えば動物1体当
たり約104・5pfuであり得る。
ンの製造にも用いられ得る。
V変異体は特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内投与さ
れ得る。
変異体で発現した異種ポリペプチドを含むサブユニット
ワクチン、医薬品用調製物及び診断用調製物も提供す
る。これらは、上記組み換え体FHV変異体に感染させ
た細胞を異種ポリペプチドの発現を促進する条件下に培
養することによって得ることができる。発現した異種ポ
リペプチドはその所期の用途に応じて或る程度慣用技術
で精製し、かつ更に処理して、免疫活性、治療活性また
は診断活性を有する調製物とされ得る。
は、健康な動物への感染防御処置として適用され得る。
既に特定病原体に感染した動物が、抗原ポリペプチドを
コードする当該病原体由来の異種遺伝子を含む本発明に
よる組み換え体FHV変異体によって誘発された抗体を
含む抗血清で治療され得ることは言うまでもない。本発
明による組み換え体FHVに対する抗血清は、動物、例
えば猫を有効量の前記組み換え体FHVで免疫感作して
適当な免疫応答を誘導することによって製造され得る。
免疫応答誘導後、動物から採血して抗血清を製造し得
る。
域の特徴付け −FHV DNAの調製及びλベクターEMBL4にお
けるゲノムライブラリーの樹立。
ミン水解物2.5g/l及びウシ胎児血清5%を補充し
たグラスゴーの変形最少必須培地中で、Crandel
l−Reesネコ腎臓(CRFK)細胞(Crande
ll, R.A.ら, InVitro 9, 176
−185, 1973)上でFHV−1のワクチン株
(ネコ鼻気管炎ウイルス、G2620株としてオラン
ダ、IntervetInternational
B.V.から市販)を生長させた。十分な細胞変性効果
が生じた後に細胞上清を回収し、ポリエチレングリコー
ル沈殿によりウイルスを濃縮した(Yamamoto,
K.R.ら, Virology 40,734−74
4, 1970)。20mM Tris−HCl(pH
7.5)、10mM EDTA及び0.5%SDSを含
有する緩衝液中で100μg/mlプロテイナーゼK
(Promega, Wisconsin, 米国)で
37℃で2時間消化することによりDNAをウイルス粒
子から遊離させた。
繰り返し抽出後、核酸を2倍容量のエタノールで沈殿さ
せ、TE(10mM Tris−HCl, pH7.
5,1mM EDTA)に溶解させた。酵素製造業者に
より推奨される条件に従ってウイルスDNAを制限酵素
Sau3A(Promega, Wisconsin,
米国)で部分的に消化し、反応生成物を分取0.8%
アガロースゲル上で分離した。
ラグメントを単離し、BamHI及びSalIで消化し
たバクテリオファージλEMBL4からのDNAと2時
間15℃で連結した(Kaiser,K.及びMurr
ay,N.“DNA Cloning”, 第1巻、第
1章、IRL Press, 1985)。反応生成物
をin vitroパッケージングし(Promeg
a, Wisconsin, 米国)、組換ファージを
大腸菌宿主株LE392にプレート培養した。SalI
で消化したFHVゲノムDNAの分取アガロースゲル電
気泳動により単離した10〜15kb制限フラグメント
から構成される32P標識DNAプローブでニトロセルロ
ースレプリカフィルターをスクリーニングすることによ
りλEMBL4中のライブラリーを集積し、ウイルスゲ
ノムの比較的大きいSalI制限フラグメント中に特異
的に存在する配列を有するインサートを含む組換体を得
た(技術的詳細についてはSambrook,J.ら,
“Molecular Cloning: A la
boratory manual”, 第2章, Co
ld Spring Harbor Laborato
ry Press,1989を参照されたい)。このス
クリーニング手順から得た個々の組換体を増幅し、λイ
ンサートDNAの制限パターンを完全FHVゲノムの公
知地図(Grail A.ら, Arch.Viro
l., 116, 209−220,1991)と比較
した。更に調査するために単離株の1つλFHV02を
選択し、このクローンの10.9kbインサート(図1
参照)を前出のGrailらの地図の単位0.08〜
0.17のウイルスゲノムのユニークな長いセグメント
の左端の近傍に配置した。
ラグメントをpGEM3Zにサブクローニングして得た
pFHV01(図2A参照)は、マーカー遺伝子の組み
込みに適切な位置にユニークなBglII制限部位を示
した。挿入に使用した遺伝子は、pCH110(Pha
rmacia, Uppsala, スウェーデン)中
に存在するようなSV40複製起源の近傍の72bp
SphIフラグメントを以下の配列(配列番号3及び
4): 5’−GGATCCGTCGACCATG−3’ 3’−GTACCCTAGGCAGCTG−5’ を有する二重鎖合成オリゴヌクレオチドで置換すること
により、pCH110から誘導した。
間にリンカーを挿入すると、どちらの部位のSphIの
認識配列も復元されず、いずれもSV40初期プロモー
ターの上流にBamHI及びSalI部位を生成する。
次いでBamHIで消化し、pFHV01のBglII
部位に挿入された4.0kbのβ−ガラクトシダーゼ発
現カセットを生成し、こうしてpFHV04を得た(図
2B参照)。リン酸カルシウム媒介DNA沈殿(Gra
ham,F.L.及びv.d.EB,A.J.,Vir
ology 52, 456−467, 1973)に
よりCRFK細胞にウイルスDNAと共にプラスミドp
FHV04の直鎖化DNAを導入した。pFHV04か
らのDNA1μgを最終容量376μlのH2O中でF
HV感染細胞からのDNA15μgと混合し、2×HB
SP(10mM KCl, 280mM NaCl,
12mMグルコース、1.5mM Na2HPO4, 5
0mM HEPES, pH7.0)500μlに加え
た。1M CaCl2溶液124μlを漸次加え、混合
物を室温で30分間インキュベートすることにより沈殿
を形成した。培養培地5ml中にCRFK細胞の半集密
的単層を各々収容する2つのφ6cmの皿に沈殿DNA
の懸濁液を静かに加えた。5時間後、培地を除去し、1
5%グリセロールを含有するHBSP5mlを細胞に重
層した。1〜2分間インキュベーション後、溶液を除去
し、細胞を培地で洗い、皿を培養培地中0.75%アガ
ロースの上層と共にインキュベートした。3〜4日後、
細胞変性効果が現れ始めたら、最終濃度0.2mg/m
lの基質Bluogal(Gibco−BRL, Ma
ryland, 米国)を含有する第2のアガロース上
層を加え、青色のプラークが検出されるまでプレートを
インキュベートした。陽性プラークを肉眼的に釣菌し、
新鮮なCRFK細胞を含むフラスコに移し、ウイルスを
増幅した。組換ウイルスの均質なストックが樹立される
までプレート培養手順及びプラーク単離を続けた。最終
調製物からのウイルス材料を使用してサザンブロッティ
ングによりウイルスゲノムを詳細に分析すると共に、動
物ワクチン接種実験を行った。
I部位に挿入したβ−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子
を含む組換FHVは、CRFK細胞上の組織培養物で連
続継代後も安定的であることが判明した。
トにおける挿入領域の構造解析。
amHIフラグメントの該当部分でヌクレオチド配列解
析を行った。pSP72(Promega, Wisc
onsin, 米国)のBglII部位に両方向に同一
フラグメントをサブクローニングし、夫々pFHV02
及びpFHV03を得た。
切な制限酵素でプラスミドDNAを二重消化後、酵素エ
キソヌクレアーゼIII(Henikoff,S.,
Gene 28, 351−359, 1984)を使
用して漸進的欠失を導入した。張り出した一重鎖3’末
端の存在により、プラスミドベクターDNAはエキソヌ
クレアーゼIIIにより消化されなかった。反応混合物
のサンプルを30秒間隔で採取し、前出のHeniko
ffの方法に従って処理し、再環状化したDNA分子を
生成し、コンピテント大腸菌細胞に形質転換させた。個
々のコロニーのミニ調製物からのプラスミドDNAを、
元の5.1kbフラグメントに導入した欠失のサイズの
制限マッピングにより分析した。T7ポリメラーゼ(P
harmacia, Uppsala, スウェーデ
ン)を使用する鎖停止反応で二重鎖DNA上のヌクレオ
チド配列決定により、漸進的欠失を含む候補群を分析し
た。
はpFHV03の挿入DNA上の鎖伸長反応を特異的に
開始させることにより、ヌクレオチド配列内の不完全又
は曖昧な読み取り値の解像度を上げた。配列データをま
とめ、Gene−Master(Bio−Rad, C
alifornia, 米国)又は同等のソフトウェア
を使用して解析した。全データをまとめた結果、マーカ
ー遺伝子の挿入に使用した実際のBglII制限部位を
含む配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドをコードする579ヌクレオチドオープンリーディン
グフレームからなるFHVゲノムのユニークな長いセグ
メント内の約1.0kb領域(配列番号1)と、非翻訳
フランキングDNA配列の約0.4kbとが判明した。
約1.0kbの領域は、感染及び複製に必要な本質的な
ウイルス機能を失わせることなくFHVのゲノムに外来
遺伝子を挿入するために使用することができる。
ク質を発現する組換えFHVの構築 配列番号1に示す配列に基づき、ヌクレオチド配列解析
に関して記載した手順と同様の手順に従い、酵素エキソ
ヌクレアーゼIIIを用いて5.1kbのBamHIイ
ンサートの両端をトリミングすることによってpFHV
02から1つのフラグメントを誘導した。その結果、p
GEM7Zf(+)(Promega、Wiscons
in、USA)中に0.9kbのインサートを含むpF
HV24が得られた。得られたこのpFHV24におい
ては、予めpFHV01中に規定されていた非反復Bg
lII制限部位が、外来DNAの取込み及びウイルスゲ
ノムとのin vivo組換えを順次行なうことができ
るように正確に位置決めされていた(図3A参照)。F
HVウイルスのゲノムに挿入された外来遺伝子の発現を
指令する強力なプロモーターをラウス肉腫ウイルス(R
SV)のLTR配列から選択した。
580bpのNdeI/HindIII制限フラグメン
トにマッピングされており(Gorman、C.M.ら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79、6
777〜6781、1982)、フラグメントの両側の
二重鎖合成リンカーによってpGEM3ZのHindI
II部位とPstI部位との間に挿入された。ベクター
pGEM3ZのHindIII部位とLTRプロモータ
ーを保有するRSVフラグメントのNdeI部位との結
合には、一方でHindIII他方でNdeIと適合性
の付着端を含む30bpのリンカーを用いた。しかしな
がら、結合後に6塩基対の認識配列の外層ヌクレオチド
を計画的に修飾したので双方の制限部位が復元しなかっ
た。これらの2つの部位が除去されたことに加えて、リ
ンカー自体の内部に存在した新しい制限部位(BamH
I)が対応する位置に生じた。20bpの第2のリンカ
ーを合成した。このリンカーはLTRフラグメントに由
来のHindIII部位をpGEM3Zに由来のPst
I部位に連結した。この場合には、両端の認識配列は破
壊されず、pGEM3Zのポリリンカーに既に存在して
いた部位例えばPstI、XbaI及びBamHI部位
に適当な非反復認識部位BglII及びXhoIが付加
された。得られたpGEM3Zの誘導体をpVEC01
と命名した。従ってこの誘導体は、LTRプロモーター
を含み且つ該プロモーターの直後に外来遺伝子の挿入に
使用できる多数の制限部位を含む650bpの制限フラ
グメントを含んでいた。650bpのフラグメントの一
端にBamHI制限部位がフランキングしており、この
部位はpFHV24中に存在する非反復BglII部位
にそのまま転移した。これらの2つの制限酵素によって
生じた付着端は適合性であるがBglIIまたはBam
HIに対する初期認識配列はいずれも復元されない。得
られた構築物の1つをpFHV28と命名し、制限マッ
ピングによってチェックした(図3B)。このFHV組
換えベクターの構造は、LTRプロモーターのすぐ下流
に外来遺伝子が挿入でき、その後のin vivo組換
えによって完全発現カセットがFHVゲノムに取込まれ
得る構造である。LTRの下流の種々の制限部位、特に
酵素BglII及びXhoIに対する制限部位の位置
は、遺伝子の多重挿入もできるように設計されている。
このベクターの第1の例をFeLV/サブグループAに
由来のエンベロープタンパク質をコードする遺伝子から
構成した。このベクターを、pFGA−5(Stewa
rt、M.A.ら、J.Virol.58、825〜83
4、1986)に由来の2.0kbのPstIフラグメ
ント上で単離し、pGEM3ZのT7配向のコーディン
グ鎖と共にサブクローニングした。pCH110に導入
された修飾と同様の合成リンカーを付加することによっ
てベクターのポリリンカー中に存在する非反復SphI
部位をBamHI部位に置換した(実施例1参照)。
単離した完全遺伝子をpFHV28のBglII部位に
挿入し、pFHV29を得た。LTRプロモーターに対
するFeLVエンベロープ遺伝子の正確な配向を制限分
析によって確認した(図4参照)。β−ガラクトシダー
ゼマーカー遺伝子の挿入に関する実施例1の記載と同様
にして、プラスミドpFHV29の直鎖化した1μgの
DNAを15μgのウイルスDNAと共にCRFK細胞
にコトランスフェクトした。トランスフェクション子孫
を3〜4日後に採取し、系列希釈してマイクロタイター
プレートのCRFK細胞に播種した。cpeの増殖後、
プレートをエタノールで定着させ、精製したFeLVの
天然型エンベロープタンパク質に対して感作させたウサ
ギ抗体と共にインキュベートした。特異的に結合した抗
体をフルオレセイン標識ヤギ抗ウサギ血清によって検出
し、VU顕微鏡で観察した。組換えFHVを保有しFe
LVのエンベロープタンパク質を発現するプラークを約
5×10-4の頻度で検出した。
タンパク質を発現する組換えFHVの構築 FIVのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子
も、FHVのU1の特異的領域に挿入できる遺伝子の有
力な候補であると考えられた。FIV−UT 113と
呼ばれるオランダのFIV単離物(Verschoo
r、E.J.ら、Virology、193、433〜4
38、1993)のプロウイルスゲノムから遺伝子を誘
導し、2.6kbのBamHIフラグメントとしてサブ
クローニングした後、FeLVのエンベロープ遺伝子に
関する上記の手順と同様の手順でpFHV28のBgl
II部位に挿入した。β−ガラクトシダーゼ発現カセッ
トに関する実施例1の記載と同様にして、得られた組換
えプラスミドpFHV37(図5参照)をFHVウイル
スDNAと共にCRFK細胞にトランスフェクトした。
ウイルスのトランスフェクション子孫をマイクロタイタ
ープレートのCRFK細胞に、ウェルあたり約50〜1
00pfuが得られるように播種した。インキュベーシ
ョン後、個々のウェルの上清を別々に保存し、プレート
の残りをエタノールで定着させた。プレートを、FIV
感染ネコの血清から成る第1試薬と共にインキュベート
した。エンベロープ特異的抗体をフルオレセイン標識ウ
サギ抗ネコ血清によって検出し、UV光下で顕微鏡観察
した。陽性フォーカスを含むウェルを採点し、対応する
保存ウイルスサンプルをウェルあたり約1〜5pfuに
限界希釈して同時に再度播種し、上記と同様にして処理
した。ウイルス原液が蛍光抗体アッセイで検出したエン
ベロープタンパク質の発現に関して50%以上均質にな
るまでプレーティング手順を繰返した。アガロースオー
バーレイ下の単一プラーク単離によって最終精製を行な
った。この手順で得られた単離物の1つを選択し、FH
V菌F2−1株と命名した。1×107pfu/mlを
上回る力価を有する増幅した原液をCRFK細胞上で調
製し、次の実験まで−80℃で凍結した。
ョンプローブとして含むDNAフラグメントを用いたサ
ザンブロット法によってF2−1株のウイルスゲノム構
造を分析した。エンベロープ遺伝子が挿入されたゲノム
の領域のBglII及びEcoRI制限部位の位置は、
予想パターンと一致した。
い非反復セグメントの1kbの領域内に存在するBgl
II部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含
む組換えウイルスの1つをFHV菌05−4−1−1株
と命名した。このウイルスの病原性及びFHVのビルレ
ント株の抗原投与によって生じた臨床徴候防御能力を動
物実験によって研究し、親株G2620と比較した。
1×105 TCID50のFHV−1突然変異体または
親株を、外鼻孔から0.3ml、口腔いん頭から0.4m
l投与することによって口鼻感染させた。動物のFHV
−1感染に特異的な臨床徴候を2週間にわたって毎日観
察し、表1に示すような基準に基づいて採点した。ワク
チン接種の6週後に1×105 TCID50のFHV−
1株SGE(National Veterinary
Service Laboratory、USA)を
口鼻投与することによってネコに抗原投与し、FHV−
1感染の臨床徴候を2週間にわたってモニターした。ワ
クチン接種及び抗原投与後の臨床観察を表2にまとめ
る。05−4−1−1株でワクチン接種したグループ1
のネコは親株G2620を接種したグループ2の動物に
比較して臨床徴候のスコアレベルが下がっていた。
ン接種したネコは、グループ3のワクチン非接種の対照
に比較して臨床スコアが平均で1/10に減少してい
た。従って突然変異体05−4−1−1株をネコに口鼻
投与すると、ビルレンスが減少し、しかも抗原投与FH
V感染の臨床徴候に対して高レベルの防御を誘発し得る
ことが判明した。
トの制限地図。ウイルスゲノム中のこのフラグメントの
位置を長い非反復セグメントの左端の近傍にマッピング
した。5.1kbのBamHIフラグメントのサブクロ
ーニングによってpFHV01が得られた。
HV02に由来の5.1kbのBamHI制限フラグメ
ントを含むプラスミドpFHV01の地図。B−pFH
V01の非反復BglII制限部位に挿入された4.0
kbのβ−ガラクトシダーゼ発現カセットを含むプラス
ミドpFHV04の地図。
配列番号1に定義された挿入領域にフランキングする余
剰配列を除去することによってpFHV02から得られ
た。配列番号1に定義された読取枠(ORF)の位置を
上部に示す、B−pFHV24の非反復BglII部位
に挿入された多重クローニング部位と共にLTRプロモ
ーターを含むプラスミドpFHB28の制限地図。この
ベクターはin vivo組換えによって外来遺伝子を
FHVのゲノムに取込ませることができる。
れたFeLVのエンベロープタンパク質をコードする遺
伝子をLTRプロモーターの下流に含むpFHV29の
制限地図。
れたFIVのエンベロープタンパク質をコードする遺伝
子をLTRプロモーターの下流に含むpFHV37の制
限地図。
Claims (15)
- 【請求項1】 配列番号2に示したポリペプチドをコー
ドする転写解読枠のDNA配列によって規定された領域
に変異を有し、該変異は天然に存在するFHVのゲノム
上の該領域に存在する遺伝情報に関する上述の領域にお
ける遺伝情報の変化であり、配列番号2に記載のポリペ
プチドと同様の抗原性若しくは機能的ポリペプチドを産
生できない、FHV変異体。 - 【請求項2】 異種核酸配列を含み、この核酸配列は配
列番号2に示したポリペプチドをコードする転写解読枠
に導入されていることを特徴とする請求項1に記載のF
HV変異体。 - 【請求項3】 異種核酸配列が転写解読枠のBglII
制限部位に導入されていることを特徴とする請求項2に
記載のFHV変異体。 - 【請求項4】 配列番号2に示すポリペプチドをコード
する転写解読枠の少なくとも一部が欠失していることを
特徴とする請求項1に記載のFHV変異体。 - 【請求項5】 異種核酸配列がポリペプチドをコード
し、かつ該核酸配列を含む組み換え体FHVに感染した
細胞内での該核酸配列の発現を調節するプロモーターの
制御下に有ることを特徴とする請求項2または3に記載
のFHV変異体。 - 【請求項6】 異種核酸配列がネコ病原体の抗原をコー
ドすることを特徴とする請求項5に記載のFHV変異
体。 - 【請求項7】 抗原がネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不
全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウイル
ス、ネココロナウイルス及びネコクラミジアの中から選
択された病原体に由来することを特徴とする請求項6に
記載のFHV変異体。 - 【請求項8】 配列番号2に示したポリペプチドをコー
ドする核酸。 - 【請求項9】 プロモーターの制御下に有るFHVにと
って異種の遺伝子が挿入された請求項8に記載の核酸。 - 【請求項10】 請求項8に記載の核酸を含む組み換え
体DNA分子。 - 【請求項11】 請求項9に記載の核酸を含む組み換え
体DNA分子。 - 【請求項12】 請求項10または11に記載の組み換
え体DNA分子でトランスフェクションした宿主細胞。 - 【請求項13】 細胞培養物をFHVゲノムDNA及び
請求項11に記載の組み換え体DNA分子でトランスフ
ェクションすることを特徴とする、請求項1から7のい
ずれか1項に記載のFHV変異体を製造する方法。 - 【請求項14】 請求項1から7のいずれか1項に記載
のFHV変異体に感染させた細胞培養物。 - 【請求項15】 請求項1から7のいずれか1項に記載
のFHV変異体を含むワクチン。
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