JP3580836B2 - 好中球減少症治療剤 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト神経成長因子２（ＮＧＦ−２）を含有する好中球減少症治療剤 に関する。
【０００２】
【従来の技術】
神経栄養因子群は、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＮＧＦ）がレヴィ ーモンタルチーニ（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｎｔａｌｃｉｎｉ），アニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイエンス（Ａｎｕ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ）５５，３３０（１９５２）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら，プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ ４０，１０１４（１９５４）によって見出されて以来、多数の因子が見い出されている。これらの因子は、神経細胞の分化、成熟、生存、機能維持、増殖などの多様な機能を担っているものと考えられている。これらの因子は具体的には、先に上げたＮＧＦ以外に、脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ ｄｅｖｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ＢＤＮＦ，Ｂａｒｄｅ Ｙ−Ａ，ｅｔ ａｌ，エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）１，５４９−５５３（１９８２）），毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ；ＣＮＴＦ，Ｗａｔｔｅｒｓ． Ｄ． ｅｔ ａｌ，ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．） ４９，７０５−７１３，（１９８７）などが報告されている。
ヒト神経成長因子２（ＮＧＦ−２）は、ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７ ５２号公報にポリペプチド（Ｉ）として示され、また、フェブス・レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ），２６６，１８７−１９１（１９９０）に発表されている。これと同じ因子が、Ｈｏｈｎ ら，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３４４，３９９（１９９０）などの文献にＮＴ−３として発表されており、またＰＣＴ公開ＷＯ９１／０３５６９号公報に示されている。
該ヒト神経成長因子２を、本明細書においては、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３と略称することもある。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３については、（１）ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子は腎臓および脳中の海馬，小脳に強く発現している。（２）成熟動物よりも新生仔の方が発現が強い。（３）ＮＧＦ，ＢＤＮＦが作用を示さないか弱い作用を示すような神経細胞（例えば ｎｏｄｏｓｅ ｇａｎｇｌｉｏｎ 由来神 経細胞）に作用を示す。これらのことから、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は神経系の発達時に重要な働きをしていると考えられる。
血球の分化においては、まず多能性幹細胞がリンパ系幹細胞と骨髄系幹細胞に分化する。次にリンパ系幹細胞はいくつかの過程を経て、Ｔリンパ球および形質細胞へと分化する。また骨髄系幹細胞は、いくつかの分化過程を経て好塩基球，好酸球，単球およびマクロファージ，好中球，巨核球および赤血球へと分化する。これらの各分化過程には多数の造血因子（コロニー刺激因子およびインターロイキンなど）が関与していることが分っており、そのうちいくつかの因子は臨床的に有用であることが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
各種コロニー刺激因子やインターロイキンなどの造血因子は血球の分化過程に働く因子であり、末梢血中の最終分化過程にある血球、例えば好塩基球，好酸球，単球，好中球などに作用し、これらを増殖せしめるものは非常に少ない。例えばＮＧＦに末梢血リンパ球のコロニー形成を促進することが知られている〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．） ＵＳＡ ８５，６５０８（１９８８）〕だけである。
ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は中枢神経系諸疾患の治療への応用が試みられているが、本発明はこの因子が末梢血中の血球を増殖せしめる作用を有することを応用し、この因子を好中球減少症さらには感染症および腫瘍に対する治療剤として用いることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に挙げたＮＧＦとは構造的に異なるＮＧＦ−２／ＮＴ−３が末梢血中の分化した血球の増殖を刺激する活性をもつことを見い出し、これを動物に投与すると顕著な血球の増加が引き起こされ、好中球減少症の治療に著効を示すことを見い出し、さらに感染症および腫瘍の治療にも有効であろうと考えられ、これらの知見に基づいて鋭意研究した結果、本発明を完成した。
【０００５】
本発明は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する好中球減少症治療剤である。
上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質としては、神経栄養因子活性、すなわち神経細胞の分化，生存，機能維持などの作用を有する物質であればいずれでもよい。 例えば動物体内や動物細胞で産生される天然のＮＧＦ−２／ＮＴ−３、遺伝子組換え技術で生産されるＮＧＦ−２／ＮＴ−３、あるいはこれらの関連物質が挙げられる。上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３やこれらの関連物質は、そのペプチド鎖に糖鎖を有していてもよくまた無くてもよい。
具体的には、例えば〔図２２〕（配列番号１２。図２２においてＸはＡｒｇまたはＡｒｇ Ｔｈｒである。）で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）（ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３）（ＥＰ−３８６，７５２，特開平３−２０４８９７）や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。上記フラグメントとしては、例えばポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端から５個のアミノ酸残基を欠くフラグメント（ヨーロッパ特許公開４９９，９９３号）やカルボキシル末端部の数個のアミノ酸残基を欠くフラグメントなどが挙げられる。さらに〔図２２〕で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｉ）のムテインも本発明において用いることができる。
【０００６】
このようなＮＧＦ−２／ＮＴ−３のムテインは主に本来のペプチドもしくは蛋白質のアミノ酸配列の改変によって得られる。このような改変としては単数もしくは複数のアミノ酸の付加、単数もしくは複数の構成アミノ酸の欠失、および単数もしくは複数の構成アミノ酸の他のアミノ酸での置換などが挙げられる。更に、グリコシル化位置で導入されるＮＧＦ−２／ＮＴ−３のムテインもこの改変の中に含まれるものである。
上記のアミノ酸の付加としては、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲内で、ペプチド発現のためもしくはシグナルペプチドとして使用される開始コドンに由来するメチオニンもその対象として、少なくとも１個のアミノ酸の付加をいう。ＮＧＦ−２／ＮＴ−３と同様の活性を示すＮＧＦやＢＤＮＦとの類似性を有す蛋白質のアミノ酸配列のいくつかもしくは全てが、付加のための好ましいアミノ酸として挙げられる。
上記の欠失されるアミノ酸は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲内でかつシステインを除く、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３構成アミノ酸の少なくとも１個のアミノ酸の欠失が挙げられる。ポリペプチド（Ｉ）のアミノ末端から１〜７個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失したムテインや、ポリペプチド（Ｉ）の４１〜４８番目、５７〜６１番目および９１〜９４番目のアミノ酸領域から１もしくはそれ以上のアミノ酸が欠失したムテインがその例として挙げられる。
【０００７】
上記の他のアミノ酸で構成アミノ酸を置換するものとしては、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の活性が失なわれない範囲で、システインを除く少なくともの１個のＮＧＦ−２／ＮＴ−３構成アミノ酸を少なくとも１個の異なったアミノ酸で置換するものが挙げられる。これらの被置換構成アミノ酸としては、イソロイシン、リジン、スレオニン、アラニン、セリン、プロリン、バリン、グルタミン酸、アルギニン、グリシンおよびアスパラギンが挙げられ、その置換位置としては、図２２のアミノ酸配列の内、アミノ酸残基番号４１〜４８番、５７〜６１番および９１〜９４番の領域での置換が好ましいものとして挙げられる。
例えば、構成アミノ酸がイソロイシンであるとき、置換アミノ酸としてはアスパラギン、スレオニン、バリン、リジン、グリシン、セリンおよびプロリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアルギニンであるとき、置換アミノ酸としてはグルタミン酸、リジンおよびアラニンが挙げられる。
構成アミノ酸がグリシンであるとき、置換アミノ酸としてはスレオニン、イソロイシン、リジン、グリシン、セリン、アスパラギン、プロリンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がセリンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、グルタミン酸、スレオニン、グリシン、アスパラギン、プロリン、バリンおよびリジンが挙げられる。
【０００８】
構成アミノ酸がバリンであるとき、置換アミノ酸としてはセリン、イソロイシン、プロリン、グリシン、スレオニン、リジンおよびアスパラギンが挙げられる。
構成アミノ酸がリジンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、セリン、プロリン、グルタミン酸、アラニン、アルギニンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がスレオニンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、リジン、グリシン、アスパラギン、セリン、プロリンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアスパラギンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、スレオニン、グリシン、リジン、セリン、プロリン、グルタミン酸およびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がプロリンであるとき、置換アミノ酸としてはイソロイシン、リジン、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニンおよびバリンが挙げられる。
構成アミノ酸がアラニンであるとき、置換アミノ酸としてはグルタミン酸、リジンおよびアルギニンが挙げられる。
構成アミノ酸がグルタミン酸であるとき、置換アミノ酸としてはアラニン、リジン、セリン、アスパラギンおよびアルギニンが挙げられる。
【０００９】
上記置換においては、少なくとも２つの構成アミノ酸の置換を同時に行なうことができ、特に２もしくは３の構成アミノ酸の置換が好ましい。
上記の付加、欠失および置換の２もしくは３個の組合せによってムテインを得ることもできる。
これらのムテインを得るために、部位指向突然変異を用いることができる。この技術はＲ．Ｆ．ＬａｔｈｅｒおよびＪ．Ｐ．Ｌｅｃｏｑのジェネティク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），３１−５０頁、アカデミック・プレス（１９８３）に記載されて、よく知られているものである。オリゴヌクレオチドに対する突然変異は、Ｍ．ＳｍｉｔｈおよびＳ．Ｇｉｌｌａｍのジェネティク・エンジニアリング：プリンシプルズ・アンド・メソッズ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ），３巻，１〜３２頁、プレナム・プレス（１９８１）に記載されている。
【００１０】
また上記ＮＧＦ−２／ＮＴ−３は、ポリエチレングリコール誘導体など、化学修飾されたものでもよい。
とりわけ、本発明においては〔図２２〕で示されるアミノ酸配列を有するヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を用いるのが好ましく、この場合そのアミノ末端にさらにメチオニン残基（Ｍｅｔ）を有するものと有さないものとの混合物であってもよく、またアミノ末端にＭｅｔを有さずチロシン（Ｔｙｒ）で始まるもの（ヨーロッパ特許公開４９９，９９３号）でもよい。
【００１１】
本発明におけるＮＧＦ−２／ＮＴ−３は低毒性であるので安全に使用することができる。
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３は末梢血中の血球、たとえば好塩基球，好酸球，単球，好中球などを増加せしめ、その機能を亢進させる。従って、本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３は動物の好中球減少症に対する治療剤として用いることができ、さらに感染症や腫瘍に対する治療剤として用いることができる。
該動物としては温血哺乳動物があげられ、その例としては、たとえばマウス、ネコ、牛、羊、ヤギ、ブタ、ウサギ、ヒトなどがあげられる。
【００１２】
本発明の治療剤は動物に投与することにより、その好中球減少症、さらに感染症に伴なう症状を改善し、治癒を促進する。本発明の治療剤は動物に投与することにより、さらに、抗腫瘍作用をも示す。
該投与は、一般に非経口的におこなわれ、たとえば本発明の治療剤を該動物に注射投与することにより好ましく実施できる。
本発明の治療剤の使用量は、その使用方法，使用目的などにより異なるが、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３のタンパク質量として、注射投与して用いる場合には、たとえば１日量約０．０２μｇ／ｋｇ〜０．０２ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましい。
【００１３】
本発明の治療剤を水溶液として調製する場合は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を水性溶剤（例、蒸留水），水溶性溶剤（例、生理的食塩水，リンゲル液），油性溶剤（例、ゴマ油，オリーブ油）等の溶剤，または所望により溶解補助剤（例、サリチル酸ナトリウム，酢酸ナトリウム），緩衝液（例、クエン酸ナトリウム，グリセリン），等張化剤（例、ブドウ糖，転化糖），安定剤（例、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコール），保存剤（例、ベンジルアルコール，フェノール），無痛化剤（例、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカイン）等の添加剤と共に用いて、常套手段により製造される。
また、該水溶液におけるｐＨは、約３〜８に、さらに好ましくは約５〜７に調 整される。上記ｐＨ範囲に調整するためには、たとえば希酸（例、希塩酸）や希 アルカリ（例、希水酸化ナトリウム，希炭酸水素ナトリウム）などを添加することにより行なわれる。
また、本発明の治療剤を固型状のものとして調製する場合は、たとえばＮＧＦ−２／ＮＴ−３を凍結乾燥するか、あるいは固型状（例、粉末状）のＮＧＦ−２／ＮＴ−３に希釈剤（例、蒸留水，生理的食塩水，ブドウ糖），賦形剤（例、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ），アルギン酸ナトリウム），保存剤（例、ベンジルアルコール，塩化ベンザルコニウム，フェノール），無痛化剤（ブドウ糖，グルコン酸カルシウム，塩酸プロカイン）等を混合し、常套手段により、固型状筋肉内注射用製剤に製造することができる。
【００１４】
本発明の治療剤の製剤化にあたって、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する水溶剤にさらにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を配合し、溶液状態でｐＨ３〜８を示す ように調整すると、保存中および凍結や凍結乾燥操作におけるＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性の低下が少なく、また凍結乾燥品においてはその再溶解時の溶状が澄明であるので好都合である。
ＨＳＡとしては、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用するためには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好ましい。
例えば、健康人血漿を原料として Ｃｏｈｎ のエタノール分画第６法によって、分画精製したものが用いられる。
また安定剤としてアセチルトリプトファンナトリウムや、カプリル酸ナトリウムを含有するものであってもよい。
ＨＳＡは、各成分を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当り約０．１ｍｇ〜５０ｍｇ、とりわけ約０．５ｍｇ〜２０ｍｇ含有させることが好ましい。
【００１５】
本発明の治療剤の製剤化にあたっては、上記ＨＳＡに加えさらにグリシン，グルタミン酸，アスパラギン酸，アラニン，プロリンなどのアミノ酸、とりわけモノアミノ脂肪族アミノ酸、もしくは環状アミノ酸，ブドウ糖，マンノースなどの単糖類，ソルビット，マンニット等の糖アルコール類，およびこれらの生理学的に許容できる塩もしくは誘導体の１種または２種以上を配合してもよい。
上記配合剤は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３を水溶液とした場合に、水溶液１ｍｌ当り、単糖類または糖アルコール類に関しては約１０〜１００ｍｇ，アミノ酸に関しては約５〜５０ｍｇ配合することが好ましい。
上記の製剤化にあたっては、水溶液を溶液状態でｐＨ約３〜８，好ましくはｐＨ約５〜７に示すように調整するために、グルタミン酸などの酸性アミノ酸を配合する場合は該物質を上記所定量加えることにより所定のｐＨに調整でき、また所 望により、または上記酸性アミノ酸を配合しない場合は塩酸，リン酸等の鉱酸、もしくはコハク酸，酒石酸，クエン酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調整する。
【００１６】
本発明の治療剤は、水溶液，凍結品または凍結乾燥品の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥品が好ましい。
本発明の治療剤は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質の減弱を防止するために、たとえば以下の方法によってより好ましくは製造することができる。
ＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性物質を含有する水溶液に、所望によりＨＳＡを前記所定の濃度になるように加え、前記した方法でｐＨ調整を行なう。
また、所望により、単糖類，糖アルコール類，アミノ酸などもそこに記載した濃度として加えることもできる。また所望により等張化剤，界面活性剤なども加えることができる。なお、ＨＳＡ以外の物質を添加する場合には、最終水溶液のｐＨが前記ｐＨを示すように、前記した方法でｐＨ調整を行う。かくして得られる 水溶液としての本発明の治療剤は、下記の凍結および凍結乾燥品の原料としても用いることができる。
【００１７】
凍結品としての本発明の治療剤は、とえば上記水溶液を通常約−８０〜−２０℃で凍結することにより製造できる。該凍結組成物は約−８０〜−１０℃で保管することが好ましい。
凍結乾燥品としての本発明の治療剤は、例えば上記凍結組成物を常法により減圧乾燥するか上記水溶液または上記凍結組成物の融解により得られる水溶液を、所望により小分けし、上記同様凍結した後、常法により減圧乾燥することにより製造することができる。
また前記の方法により製造した凍結乾燥品を、例えば前記した単糖類，等アルコール類，アミノ酸等を含有し、所望により塩酸等でｐＨ調整された溶解液によ つて再溶解することによって溶液状態の本発明の治療剤を製造することができる。
【００１８】
注射用製剤としての本発明の凍結乾燥した治療剤を製造する場合は、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の水溶液および配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌ろ過して混合するか、これらの混合液を小分けする前に除菌ろ過等により精製し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした後上記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。この場合、容器の空間部を真空にするか、窒素ガス置換することにより、該組成物の安定性を高めることができる。
また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール類を含有する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水溶液は除菌ろ過し、無菌操作によりアンプル等に分注小分後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ましい。
【００１９】
本発明の治療剤を投与するには、該組成物が水溶液のものである場合には、そのまま注射用溶解液として用いる。
該組成物が凍結乾燥により固型状のものである場合には、蒸留水もしくは生理的食塩水などを用いて溶解し注射用溶解液として用いる。なお、所望により前記したと同様の単糖類，糖アルコール類，アミノ酸等を含有し、前記と同様にｐＨ 調整された溶解液で溶解後使用することも出来る。
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３からなる治療剤は、末梢血中の血球を著しく増加せしめ、機能を亢進する。
したがつて、本発明の治療剤は、好中球減少症の治療に有効であり、さらに感染症および腫瘍の治療に使用することが可能である。
【００２０】
本願発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ による略 号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
Ａ アデニン
Ｃ シトニン
Ｇ グアニン
Ｔ チミン
Ａｌａ ：アラニン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｃｙｓ ：システイン
Ｇｌｎ ：グルタミン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ｇｌｙ ：グリシン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｌｙｓ ：リジン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｐｈｅ ：フェニールアラニン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｖａｌ ：バリン
後述の参考例９で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｎ２−１は、平成３年１月２２日から財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ ５０３０７として寄託されており、また該形質転換体は平成３年１月２９日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５として寄託されている。
【００２１】
参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（１）
ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムライブラリー〔クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社〕を大腸菌ＮＭ５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１０^４クローンずつ撒いた。プラークをナイロンメンブラン（アマシャム社、ハイボンド−Ｎ）上に移した後、０．５Ｎ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液に６分 間浸し、ファージＤＮＡを変性させた後、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液に６分間浸した。本メンブランを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理することによりＤＮＡをメンブランに固定した。
一方、既知〔アルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ， Ａ．）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） ３０３，８２１（１９８３）〕のヒトＮＧＦ遺伝子を参考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ（０．３８ｋｂ）を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット（ニッポンジーン社）を用いて^３２Ｐで標識したものをプローブとした。
ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含む、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム），５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ，０．５％ＳＤＳ，２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ溶液１０ｍｌ中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィルターを２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で ５分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ溶液中で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応するクローンを検索した。この方法により得られたクローンλβＬＮ２１１３よりデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）らの方法（Ｄａｖｉｓら、〔アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）〕，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８０）によりファージＤＮＡを抽出した。
次にλβＬＮ２１１３をＳｍａＩとＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ（約１ｋｂ）を切り出し、プラスミドｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（＋は上付き）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社，ＵＳＡ）のＳｍａＩ，ＡｐａＩ部位に挿入し、プラスミドｐＮＧＦ１０７Ｇを得た。
また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ￣（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ 社）のＳｍａＩ，ＡｐａＩ部位に同ＤＮＡ断片を挿入することによりｐＮＧＦＰ１０８Ｇを得た。ｐＮＧＦＰ１０７ＧおよびｐＮＧＦＰ１０８Ｇに挿入された部分の塩基配列をシークナーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｒｉｏｎ）を用いて決定した。決定された塩基配列はネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３０３，８２１（１９８３）に記載されている配列と、蛋白コード領域では完全に一致した。
上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）を単離した。一方、動物細胞用の発現ベクターｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）を制限酵素Ｂｇｌ ＩＩで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（１．８ｋｂ）とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＭＮＧＦ１０１〕から単離したプラスミドをｐＭＮＧＦ１０１と命名した。
【００２２】
参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（２）
参考例１で得られたプラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを制限酵素ＢｃｌＩおよびＡｐａＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（０．８ｋｂ）を単離した。この０．８ｋｂ ＢｃｌＩ−ＡｐａＩ断片と化学合成アダプターＳＮ１，ＳＮ２およびＳＮ３とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結したのち、Ｂｇｌ ＩＩで切断することによっ て０．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂｇｌ ＩＩ ＤＮＡ断片が得られた。
【００２３】

プラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２０９，１４２２（１９８０）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２． ６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片を単離した。次にプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒ〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２９４，２２８（１９８１）〕よりｐｏｌｙＡ付加領域を含 む１．６ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。
上記のＳＶ４０プロモーターを含む２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡ断片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含む０．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｂｇｌ ＩＩ ＤＮＡ断片およびｐｏｌｙＡ 付加領域を含む１．６ｋｂ Ｂｇｌ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し た。この反応液を用いてエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体〔エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ｐＭＮＧＦ２０１〕から単離したプラスミドをｐＭＮＧＦ２０１と命名した。
【００２４】
参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築（３）
参考例２で得られたプラスミドｐＭＮＧＦ２０１をＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ フラグメント反応により平滑化したのち、Ｂｇｌ ＩＩで切断して約０．８ｋｂ ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドｐＴＢ３９９（特開昭６１−６３２８２に記載）をＥｃｏＲＩで切断後、Ｋｌｅｎｏｗ フラグメント反応により平滑化したのち、Ｂｇｌ ＩＩで切断して約３．９ｋｂ ＤＮＡ断片を得た。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環状化し、プラスミドｐＴＢ１０５４を得た。
【００２５】
参考例４ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現ベクターの構築
（１）ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＨＮＴ２（ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報参照）を制限酵素ＳｔｕＩで切断し、Ｂｇｌ ＩＩ リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼにより結合させた。このＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断することにより、ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ ｃＤＮＡを含 む１．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。一方、動物細胞用発現プラスミドｐＴＢ３９９（セル・ストラクチャー・アンド・ファンクション（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｆｕｎｃｔ．） １２，２０５（１９８７））を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断し、約３．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。両ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させプラスミドｐＴＢ１０５５を得た。
次に、ハムスタージヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡを有するプラスミ ドｐＴＢ３４８（特開昭６１−６３２８２に記載）を制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断し、これにプラスミドｐＴＢ１０５５を制限酵素ＳａｌＩ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断することによって得られた約２．６ｋｂ ＤＮＡ断片を連結することにより、プラスミドｐＴＢ１０５９を得た（〔図１〕参照）。
【００２６】
（２）上記（１）項記載のプラスミドｐＨＮＴ２に含まれるヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ 遺伝子は５′上流にｉｎ ｆｒａｍｅ のＡＴＧ配列が存在する（ヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報の第２図参照）。このＡＴＧ配列を除くために以下の２つのＤＮＡオリゴマーを合成した。
【００２７】
Ｐｒｉｍｅｒ１：５′ＴＡＣ ＡＧＧ ＴＧＡ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＴＧ ３′（配列番号：４）
Ｐｒｉｍｅｒ２：５′ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＣＧ ＡＡＴ ＴＣＡ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣ ３′（配列番号：５）
Ｐｒｉｍｅｒ１および２を用いて、以下の手順でポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を行った。プラスミドｐＨＮＴ２を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し直鎖状に し、フェノール抽出後、エタノールで抽出、蒸発乾固し、蒸留水に溶解した。ＰＣＲは、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＤＮＡ増幅試薬マキット（パーキン・エルマー・シータスＵＳＡ）を用い、鋳型ＤＮＡとして前述の直鎖状ｐＨＮＴ２を０．３ｎｇ，プライマーとしてＰｒｉｍｅｒ１，２を各１．０μＭ加えて行った。反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン・エルマー・シータス）を用い、９４℃，１分，５５℃，２分，７２℃，３分を３０回くり返すことによって行った。その結果、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得ることができた。Ｐｒｉｍｅｒ１，２には、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位が存在するので、得られた断片をＥｃｏＲＩで切断し、ｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。この組換えプライマーｐＴＢ１３３７を大腸菌ＭＶ１１８４株に導入して得られる一本鎖ＤＮＡから塩基配列を確認したところ、一塩基の誤りもなく遺伝子が増幅されていたことがわかった。このｐＴＢ１３３７を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで切り出し０．２３ｋｂのＤＮＡ断片を得た。上記（１）項記載のプラスミドｐＴＢ１０５５を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｐａＩで切断して得られる約４．６ｋｂのＤＮＡに、この０．２３ｋｂのＤＮＡを連結し、プラスミドｐＴＢ１３３８を得た。
ｐＴＢ１３３８を制限酵素ＳａｌＩとＨｉｎｄ ＩＩＩで切断し、上記（１）項と同様の方法でハムスターＤＨＦＲ遺伝子を導入し、発現プラスミドｐＴＢ１３３９を得 た（〔図２〕〜〔図３〕参照）。
このプラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域を コードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図７−１〕〜〔図７−２〕に示す（配列番号：６）。
【００２８】
参考例５ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３の生物活性の測定
ニワトリ有精卵を３７．５℃でふ卵器で８日〜１０日揺卵して胚発生を行った 胎児から後根神経節（Ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉｏｎ，以下ＤＲＧ）を摘出した。ＤＲＧを０．１２５％トリプシン−ＰＢＳ溶液で３７℃、２０分処理し、ピペッティングを行うことで、細胞を分散させた。これを、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシンに懸濁し、３７℃，５％ＣＯ_２存在下２〜４時間培養することにより線維芽細胞等を培養シャーレに付着させ、非付着細胞のみを分取した。非付着細胞を遠心（８００ｒｐｍ，５分）により集め、１０％牛胎児血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（混合比１：１）−１μＭサイトシンアラビノシド（ＡｒａＣ，シグマ社，ＵＳＡ）−５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む培地に１００００細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、０．５ｍｌ／ウェルずつ、ポリＬーオルニチンコート済み４８穴プレートに播種した。この培地にサンプルとなる溶液を０．５〜２０μｌ加え、３７℃，５％ＣＯ_２存在下で３日間培養し、生存細胞数を計測した。
【００２９】
参考例６ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現ベクターの構築
プラスミドｐＨＮＴ５（ｐＨＮＴ２のＥｃｏＲＩ挿入断片の方向が逆向き）を大腸菌ＭＶ１１８３に導入することにより（−）鎖一本鎖ＤＮＡを常法により調製した。一方プラスミドｐＮＧＦＰ１０８Ｇ（参考例１参照）を用いヒトＮＧＦ（−）鎖一本 鎖ＤＮＡを調製した。これらに対し、
ｏｌｉｇｏ１；５′ＡＧＧＡＧＣＡＡＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡ ３′（配列番号：７）
ｏｌｉｇｏ２；５′ＴＣＡＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＡＣＧＣＧＧＡＧＣＡＴ ３′（配列番号：８）
を合成し、これを用いて部位特異的な塩基変異を導入し、ＮＧＦおよびＮＧＦ−２／ＮＴ−３のそれぞれに制限酵素Ｅｃｏ４７ＩＩＩの認識部位（ＡＧＣＧＣＴ）を導入した。この反応は、ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒ． ２．０（アマシャム，ＵＫ）を使用した。この結果、ヒトＮＧＦ遺伝子中にＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を有するプラスミドｐＴＢ１３４０，ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子中にＥｃｏ４７ＩＩＩ部位を有するプラスミドｐＴＢ１３４１を得た。ｐＴＢ１３４０を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで切断することにより約３．０ｋｂのＤＮＡ断片を得た。ｐＴＢ１３４１を制限酵素ＫｐｎＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩで切断することにより、０．６７ｋｂのＤＮＡの断片を得た。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結させることにより、プレプロ領域がＮＧＦ，ｍａｔｕｒｅ 領域がＮＧＦ−２／ＮＴ−３となるハイブリッドタ ンパクをコードする遺伝子を持つプラスミドｐＴＢ１３４２を得た。ｐＴＢ１３４２を制限酵素ＳｔｕＩで切断後、合成Ｂａｌ ＩＩリンカーを連結し、これを制限酵素 ＭｌｕＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断することにより０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これを制限酵素ＭｌｕＩおよびＢｇｌ ＩＩでｐＴＢ１０５４（参考例３参照）を切断して得られる約４．１ｋｂのＤＮＡ断片に挿入し、発現プラスミドｐＴＢ１３４３を得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。さらにこれをＳａｌＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ で切断して得た約２．６ｋｂのＤＮＡ断片をｐＴＢ３４８のＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位に挿入することによりｐＴＢ１３４４を得た（〔図４〕〜〔図６〕参照）。
該プラスミドｐＴＢ１３４４上に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡを〔図８−１〕〜〔図８−２〕に示す（配列番号：９）。
【００３０】
参考例７ ＣＨＯ細胞の形質転換およびクローニング
ハムスターＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲ−）を５％牛胎児血清を含むＨａｍＦ−１２培地 でファルコンシャーレ（径６ｃｍ）に４×１０^５個まいた。５％ＣＯ_２存在下３７℃で一晩培養後、培地を交換し、さらに４時間培養を行い、参考例１で得られたヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３発現プラスミドｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，ｐＴＢ１３ ４４をそれぞれ、シャーレ一枚あたり１０μｇ リン酸カルシウム法（グラハムら ウィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５２，４５６−４６７（１９７３））によりＣＨＯ細胞 に導入した。培養４時間後、培地を交換し一晩培養後、選択培地（５％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地−５０μｇ／ｍｌカナマイシン−３５μｇ／ｍｌプロリン） に培地を置き換え培養を続けた。１０〜１５日後ＤＨＦＲ＋（＋は上つき）となった細胞がコロニーを形成したので、シングルコロニーアイソレーションを行いクローニングした。
【００３１】
参考例８ 形質転換体によるヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子の発現
参考例２によって得られたＣＨＯ形質転換体の培養上清を採取し、参考例５に示した方法で培養上清中のヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３活性を測定した。この結果、ｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，ｐＴＢ１３４４のいずれによって形質転換した 場合にも生物活性が認められた。
【００３２】
参考例９ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３高産生ＣＨＯ細胞株の確立
参考例７，８で示した形質転換株をそれぞれ、１００ｎＭメトトレキセートを 含む選択培地（参考例７に記載）で培養した。この培地で生存してきたクローンについては、更に選択培地中のメトトレキセート濃度を１μＭ，１０μＭへと段階的に上げながら培養を続けた。その結果、プラスミドｐＴＢ１０５９によって形 質転換した株Ａ１００２，プラスミドｐＴＢ１３３９によって形質転換した株Ｃ ＨＯ−ｄＮ２−１７およびＣＨＯ−ｄＮ２−１９，プラスミドｐＴＢ１３４４によ って形質転換した株ＣＨＯ−Ｎ２−１（ＩＦＯ ５０３０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−３２５５）およびＣＨＯ−Ｎ２−３７を得た。これらのＮＧＦ−２／ＮＴ−３の産生量）は以下のとおりであった。

この表において産生量は参考例５に示した生物活性測定方法によって、マウスβＮＧＦ当量として算出した。この例では、限界希釈点を０．０２ｎｇ／ｍｌ βＮＧＦ当量点とした。
【００３３】
参考例１０ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３の単離
参考例９で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｎ２−１を５％牛胎児血清、３５μｇ／ｍｌ プロリン，５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２μＭメトトレキセートを含むダル ベッコ改変培地で２×１０^４細胞／ｃｍ^２の濃度で播種し、５％ＣＯ_２存在下、３７℃，７日間培養した。ニワトリ胚ＤＲＧに対する活性測定から、この培地中には、１０μｇ ＮＧＦ−１当量以上の組換え型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３が産生されていることがわかった。この培養液は、使用時まで−２０℃で凍結保存した。
凍結保存培養上清１リットルを遠心８０００ｒｐｍ，１５分，４℃または濾過（東洋濾紙 Ｎｏ．２）することで細胞残渣を除き、これを終濃度が１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ＣＨＡＰＳとなるように調整し、２Ｎ酢酸でｐＨ６．０に補正した。これを再び遠心又は濾過し、不溶性画分を除き陽イオン交換樹脂に通した。陽イオン交換樹脂としては、Ｓ−セファロース ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ， スウェーデン）を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化し、これを径２．６ｃｍ高さ１０ｃｍのカラムに詰めたものを用いた。調製済み培養上清を４℃で６０ｍｌ／ｈｒの流速でこのカラムを通すことにより、吸着を行った。吸着後、カラムを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳを流速６０ｍｌ／ｈｒで４時間洗浄し、０．５Ｍ ＮａＣｌ−０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳを流速５０ｍｌ／ｈｒで流すことにより溶出を行った。ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含む画分をヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報の参考例１に記載の抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティングにより決定し、これを集めウルトラフリー２０（ミリポア，ＵＳＡ）により約２０倍濃縮した。得られた濃縮液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳで平衡化させたセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシアＬＫＢ，スウェーデン）カラム（径１．６ｃｍ×８５ｃｍ）によりゲル濾過した。先に示したのと同様に、ウェスタンブロッティングによりヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３画分を同定し、この画分をウルトラフリー２０で約２０倍に濃縮した。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ−２を精製した。即ち、この濃縮液をＡｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０（旭化成，日本，径８ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを通し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む０−９０％アセトニトリルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３を約６０μｇ 得た。
こうして得られた組換え型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５ ％（３５．１：１））により分析したところ、分子量１４０００付近にほぼ単一なバンドとして検出された〔図９〕。また、これはＥＰ−３８６，７５２の参考例１ に示す抗体と反応した〔図１０〕。
〔図９〕では、この精製過程をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、銀染色を行った図を示し、〔図１０〕ではＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ウェスタンブロッティングを行ったものを示した。〔図９〕，〔図１０〕ともレーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）を、レーン２は上記の逆相クロマトグラフィーにかけたサンプルを、レーン３は逆相クロマトグラフィーで素通しした画分を、レーン４は逆相クロマトグラフィーでアセトニトリルの濃度勾配をかけることによって溶出されてきた画分（ＮＧＦ−２／ＮＴ−３画分）をそれぞれ示す。
【００３４】
参考例１１ ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３遺伝子の動物細胞での発現（ＩＩ）
参考例４で得られたプラスミドｐＴＢ１０５９，ｐＴＢ１３３９，および参考例１で得られたｐＴＢ１３４４についてサルＣＯＳ−７細胞での発現を検討した。 遺伝子導入は参考例７で示したリン酸カルシウム法により行った。ただし、培地としては１０％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用い、遺伝子導入後は、０．５％牛胎仔血清−ダルベッコ改変ＭＥＭ培地を用いた。遺伝子導入４８時間後に培地を採集した。１００μｌの培養上清に１０μｌの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加え冷却（０℃，１０分）することによりタンパクを沈殿させ、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ウエスタン・ブロッティングを常法により行い、ＥＰ−３８６，７５２の参考例１に示した抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ末ペプチド抗体を用いて組換え体を検出した〔図１１〕。この系ではｐＴＢ１３３９が最もよく組換え体を産生した。〔図１１〕において、レーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）の、レーン２はプラスミドｐＴＢ１０５９によるＣＯＳ上清の、レーン３はプラスミドｐＴＢ１３４４によるＣＯＳ上清の、レーン４はプラスミドｐＴＢ１３３９によるＣＯＳ上清の結果をそれぞれ示す。
【００３５】
参考例１２
参考例９で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株をそれぞれ用い大量培養による調製を行った。調製法を参考例１０を基にし、一部以下のように改変した。
培養は５％牛胎仔血清，３５μｇ／ｍｌプロリン，５０μｇ／ｍｌカナマイシン，２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地で２×１０^４／ｃｍ^２の濃度で播種し、５％ＣＯ_２存在下，３７℃，７日間培養した。培養上清を採集後、１％牛胎児血清−３５μｇ／ｍｌプロリン−５０μｇ／ｍｌカナマイシン−２μＭメトトレキセートを含むダルベッコ改変ＭＥＭ培地／ハムＦ−１２培地（１：１混合培地）（以下、調製培地と略す）に置き換え３〜４日間培養した。この培養上清を採集後、さらに調製培地で３〜４日培養し培養上清を採集した。１２０枚の１０ｃｍシャーレからこの一連の培養で５リットルの培養上清を得ることができた。これを２回くり返し１０リットルの培養上清を得た。培養上清は−２０℃で保管した。 参考例１０記載の方法で培養上清を処理し、Ｓ−セファロースカラム（径５ ×２０ｃｍ）にかけた。参考例１０に記載した方法により活性画分を溶出し、１２ｍｌ／フラクションずつ分画した〔図１２〕。この画分に対し、５０％飽和になるように硫安を加え、０℃で２時間放置し、遠心（１００００ｒｐｍ，１５分，４℃，サーバルＳＳ３４ローター（ＵＳＡ））により沈殿を回収した。沈殿を４０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１ｍＭ ＥＤＴＡ−０．０５％ＣＨＡＰＳに溶解した。ゲル濾過を行う前に遠心（１５０００ｒｐｍ，１５分，４℃，サーバルＳＳ ３４ローター）し、不溶性物質を除いた。ゲル濾過は参考例１０に記載の方法で行った。ただし、カラムは径２．６ｃｍ×９０ｃｍのものを用い、流速は１００ｍｌ／ｈ，サンプル量１０ｍｌにした〔図１３〕。溶出画分はウルトラフリー２０（ミリポア，ＵＳＡ）で濃縮した。これを参考例１０記載の方法で逆相クロマトグラフィーを行い精製した（１ｍｌ ／フラクション）〔図１４〕。これらの各ステップでの精製過程を表１に示す。
これらについてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した図を〔図１５〕および〔図１６〕に示した。最終標品は、ほぼ単一のバンドを示した。以上のことから、約１０リットルの培養上清から組換え標品が２１０μｇ得られたことがわかった。
なお、〔図１５〕は銀染色の結果を、〔図１６〕は、ウエスタンブロッティングの結果をそれぞれ示す。〔図１５〕および〔図１６〕において、レーン１はヨーロッパ特許出願公開第３８６，７５２号公報に記載の方法で得られたポリペプチド（Ｉ）０．０１μｇについての、レーン２はＣＨＯ−Ｎ２−１細胞培養上清１０μｇについての、レーン３はＳ−セファロース素通し画分１０μｇについての、レーン４はＳ−セファロース溶出画分１μｇについての、レーン５は硫安沈殿画分１μｇについての、レーン６はゲル濾過溶出画分０．１μｇについての、レーン７は逆相ＨＰＬＣ溶出画分０．１μｇについての結果をそれぞれ示す。
なお、精製開始時は、総タンパクの０．００１〜０．０１％程度のものが、最終的には純度９５％以上にまで精製（効率１０^４倍）されていることを示すためにウエスタンブロッティング〔図１６〕と銀染色〔図１５〕を並置した。
【００３６】
【表１】

【００３７】
参考例１３ 精製組換え体の生物活性（Ｉ）
参考例１２で得られた最終精製標品について、参考例５で示した方法により生物活性を測定した。コントロールとしてマウスβＮＧＦ（和光純薬）を用いた。結果を〔図１７〕に示す。〔図１７〕において■はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ−２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。〔図１７〕に示すようにＮＧＦ−２／ＮＴ−３は、この系においてβＮＧＦよりも活性が弱いことがわかった。
【００３８】
参考例１４ 精製組換え体の生物活性（ＩＩ）
ラットＰＣ１２細胞に対する生物活性を測定した。活性測定法はバイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ １７１巻 １１６〜１２２頁（１９９０年）に記載の方法により行った。この結果を〔図１８〕に示した。〔図１８〕において、■はマウスβＮＧＦの結果を、●はＮＧＦ−２／ＮＴ−３の結果をそれぞれ示す。組換え型ＮＧＦ−２はＰＣ１２細胞に対し神経突起の伸長を惹き起こす活性は非常に低く、マウスβＮＧＦ（和光純薬）に対して１／１０^３かそれ以下の活性であることがわかった。
【００３９】
参考例１５
参考例９で得られたＣＨＯ−Ｎ２−１株を、参考例１０と同様に播種，培養した。培地を無血清培地（Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ；コスモバイオ社）に交換し、さらに２日間培養した。１リッターの培養上清を１００個の１０−ｃｍ皿から集めた。０．５ｍＭＰＭＳＦと１ｍＭのベンズアミジンを集められた培養上清とカラムの緩衝液に加えて、参考例１０と同様の方法でＮＧＦ−２／ＮＴ−３を精製した。逆相ＨＰＬＣによって、保持時間が２４分（Ｐ１），２６分（Ｐ２）および２８分（Ｐ３）の３つのピークを与えた〔図１９〕。
Ｐ２とＰ３は、ニワトリ胎仔ＤＲＧ神経に対する生物的活性を有していたが、Ｐ１は有していなかった。Ｐ２蛋白質は、ＰＡＧＥにおいて大腸菌により生産された組換えＮＧＦ−２と同時に移動したが、Ｐ３蛋白質はそれらより少しさらに速く移動した〔図２１〕。Ｐ２蛋白質のみが、ウエスタン・ブロッティングにより、抗ポリペプチド（Ｉ）Ｎ−末端ペプチド抗体（ＥＰ−Ａ−３８６，７５２の参考例２で得られたもの）を認識した〔図２０〕。〔図２０〕において、レーン（ａ） は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦ−２を、レーン（ｂ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２４（Ｐ１）を、レーン（ｃ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２６（Ｐ２）を、レーン（ｄ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２８（Ｐ３）をそれぞれ示す。
〔図２１〕において、レーン（ｅ）は大腸菌形質転換体により生産されたＮＧＦを、レーン（ｆ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２５を、レーン（ｇ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２６（Ｐ２）を、レーン（ｈ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２７を、レーン（ｉ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２８（Ｐ３）を、レーン（ｊ）は逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー〔図１９〕で得られたフラクション２９をそれぞれ示す。
Ｎ末端アミノ酸を分析したところ、Ｐ２は成熟型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３のＮ末端配列と一致したが、Ｐ３はＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３に相当することが分かった〔表２〕。
【００４０】
【表２】

【００４１】
実施例１ （ヒト末梢血リンパ球に対するＮＧＦ−２／ＮＴ−３の効果）
ヒト静脈より採取したヒト末梢血を、ＬＳＭ（リンホサイトセパレーティングメディウム，Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）上に重層し、２０００ｒｐｍで３０分間室温にて遠心分離に付した。界面の、リンパ球からなる白濁層を集め、ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、１５００ｒｐｍ ，５分間の遠心操作を２回繰り返して洗浄した。このリンパ球画分をＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁し、あらかじめ牛胎児血清（ＦＣＳ）でコーティングしておいてプラスチックディッシュ上に播種した。５％炭酸ガスふ卵器内で、３７℃，１時間インキュベートしたのち、シャーレ器壁に接着しなかった細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）を集めＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。このようにして調製したヒト末梢血由来リンパ球細胞を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（組換え型，Ｇｅｎｚｙｍｅ 社）５，５０および５００Ｕ／ｍｌまたはヒトＮＧＦ（組換え型，Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １７１，１１６（１９９０））５，５０および５００ｎｇ／ｍｌまたは上述の参考例１２で得られたＮ末端５残基欠失型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ ５，５０および５００ｎｇ／ｍｌをそれぞれ含む寒天培地（０．３％バクトアガー，２０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地）に懸濁し（１×１０^６細胞／ｍｌ）、径３５ｍｍディッシュあたり１ｍｌを播種した。
寒天が固化したのち、炭酸ガスふ卵器（５％ＣＯ_２）内で、３７℃にて２週間培養し、細胞数が５０ケ以上となったコロニー数を計数した結果を〔図２３〕に示した。
〔図２３〕から明らかな如く、Ｎ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の添加により、ヒト末梢血リンパ球のコロニー形成は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＮＧＦを添加した場合と同様に明らかに促進された。
【００４２】
実施例２ 注射剤の製造
１ｍｌあたり参考例１２で得られたＮ末端５残基欠失型ヒトＮＧＦ−２／ＮＴ−３ ０．５ｍｇ，シュークロース１０ｍｇおよびクエン酸ナトリウム１５ｍｇを含む水溶液（ｐＨ７．４）を調製して、安定な注射液を得る。
【００４３】
【発明の効果】
本発明のＮＧＦ−２／ＮＴ−３を含有する治療剤は、動物の末梢血中の血球に作用し増殖促進作用を示す。したがって、本発明の治療剤は、様々の原因による好中球減少症に対して有効な治療剤として用いることができ、さらに、感染症や腫瘍の治療にも有効である。
【００４４】
【００４５】
【配列表】

【００４６】

【００４７】

【００４８】

【００４９】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【００５３】

【００５４】

【００５５】

【図面の簡単な説明】
【図１】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１０５９の構築図を示す。
【図２】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９の 構築図を示す。
【図３】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９の 構築図を示す。
【図４】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ １３４４の構築図を示す。
【図５】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ １３４４の構築図を示す。
【図６】参考例６で得られた、プラスミドｐＴＢ １３４４の構築図を示す。
【図７−１】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図７−２】参考例４で得られた、プラスミドｐＴＢ１３３９上に存在するＮＧＦ−２／ＮＴ−３のプロ領域をコードするＤＮＡ、ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図８−１】参考例６で得られたプラスミドｐＴＢ１３４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図８−２】参考例６で得られたプラスミドｐＴＢ１３４４上 に存在するＮＧＦのプロ領域をコードするＤＮＡ，ＮＧＦ−２／ＮＴ−３をコードするＤＮＡおよびその付近のＤＮＡ配列を示す。
【図９】参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１０】参考例１０で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】参考例１１で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１２】参考例１２で得られた、ＣＨＯ−Ｎ２−１株の培養上清のＳ−セファロースカラムの溶出画分を示す。
【図１３】参考例１２で得られた、ゲル濾過の溶出画分を示す。
【図１４】参考例１２で得られた、逆相クロマトグラフィーの結果を示す。
【図１５】参考例１２で得られた、各精製過程における生成物についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１６】参考例１２で得られた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１７】参考例１３で得られた、生物活性の測定結果を示す。
【図１８】参考例１４で得られた、生物活性の測定結果を示す。
【図１９】参考例１５で得られた、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーの結果を示す。
【図２０】参考例１５で得られた、ウエスタン・ブロッティングの結果を示す。
【図２１】参考例１５で得られた、ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２２】ヒトＮＧＦ−２のアミノ酸配列を示す。
【図２３】実施例１で得られた、ヒト末梢血リンパ球に対するＮ末端５残基欠失型ＮＧＦ−２／ＮＴ−３の効果を示す。

Claims (8)

1. ヒト神経成長因子２および／または
   （１）少なくとも１個のアミノ酸の付加；
   （２）システインを除く少なくとも１個の構成アミノ酸の欠失；
   （３）システインを除く少なくとも１個の構成アミノ酸の置換；
   （４）上記の付加、欠失および置換の２もしくは３個の組合せ；
   （５）ポリエチレングリコール誘導体による化学修飾；および
   （６）グリコシル化位置の導入
   からなる群から選ばれる改変を含み末梢血の血球の増殖を促進する活性を有するヒト神経成長因子２のムテイン
   を含有する好中球減少症治療剤。
2. ヒト神経成長因子２が、天然抽出物もしくはリコンビナントポリペプチドのものである請求項１記載の好中球減少症治療剤。
3. ヒト神経成長因子２が、配列番号：１２のアミノ酸配列で表わされるポリペプチドである請求項１または２記載の好中球減少症治療剤。
4. ムテインが、配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列で表わされるポリペプチドである、請求項１記載の好中球減少症治療剤。
5. ムテインが、配列番号：１２または配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列のＮ−末端にメチオニンを有する配列で表わされるポリペプチドである請求項１記載の好中球減少症治療剤。
6. 配列番号：１２または配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列で表わされるポリペプチドと、配列番号：１２または配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列のＮ−末端にメチオニンを有する配列で表わされるポリペプチドとを含有する請求項１記載の好中球減少症治療剤。
7. ムテインが、配列番号：１２または配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列で表わされるポリペプチドのアミノ末端から１〜７個のアミノ酸を欠失したものである請求項１記載の好中球減少症治療剤。
8. ムテインが、配列番号：１２または配列番号：１２のアミノ酸残基番号１〜１１８番のアミノ酸配列で表わされるポリペプチドのアミノ末端から５個のアミノ酸を欠失したものである、請求項７記載の好中球減少症治療剤。

Images