JP3416147B2

JP3416147B2 - 活性化ｔリンパ球におけるリバビリン及びリバビリン類似体によるｔｈ１型／ｔｈ２型サイトカインの発現の調節

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Publication number: JP3416147B2
Application number: JP52690797A
Authority: JP
Inventors: タム，ロバート; ラマサミー，カンダサミー; アベレツト，デブロン
Original assignee: アイ・シー・エヌ・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2003-06-16
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: HK1049958A1; JP2004035537A; EP1240899A2; EP1240899A3; JP2008133293A

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明の分野は免疫学である。

発明の背景リンホカインは、サイトカインファミリーに属する一
群のポリペプチド、即ち、種々の細胞機能に影響を与え
得且つ異なる細胞間の情報伝達を可能にするホルモン様
分子である。近年の研究により、免疫応答におけるリン
ホカインの役割の解明が進められた。ヘルパーCD4⁺（及
びCD8⁺）Ｔ細胞により産生されるリンホカインは、マウ
ス系の場合もヒト系の場合も、２種の表現型、Th1及びT
h2のどちらかに属する場合が多い〔Romagnani,1991,Imm
unol Today 12:256−257,Mosmann,1989,Annu Rev I
mmunol、7:145−173〕。Th1型細胞は、インターロイキ
ン２（IL−２）、腫瘍壊死因子（TNFα）及びインター
フェロンγ（IFNγ）を産生し、主として遅延型過敏症
などの細胞性免疫に関与する。Th2型細胞は、インター
ロイキン類、IL−４、IL−５、IL−６、IL−９、IL−10
及びIL−13を産生し、主としてIgE及びIgG4抗体アイソ
タイプスイッチングなどの体液性免疫応答の促進に関与
する（Mosmann,1989,Annu Rev Immunol,7:145−17
3）。

強度に分極したTh1型及びTh2型応答は、保護において
異なる役割を果たすだけでなく、異なる免疫病理学的反
応を促進し得る。Th1型応答は、実験的自己免疫型ぶど
う膜網膜炎（Dubeyら,1991,Eur Cytokine Network
2:147−152）、実験的自己免疫型脳炎（EAE）（Beraud
ら,1991,Cell Immunol 133:379−386）及びインスリ
ン依存性糖尿病（Hahnら,1987,Eur Ｊ Immunol 18:2
037−2042）などの器官特異的自己免疫状態や、接触性
皮膚炎（Kapsenbergら,Immunol Today 12:392−395）
及びある種の慢性炎症性疾患に関与する。それに対し、
Th2型応答は、（一般的な環境性アレルゲンに対する）
アレルギー性アトピー性疾患、例えば、アレルギー性喘
息（Walkerら,1992,Am Rev Resp Dis 148:109−11
5）及びアトピー性皮膚炎（van der Heijdenら,1991,
J Invest Derm 97:389−394）の誘発に関与し、ぜん
虫（Finkelmanら,1991,Immunoparasitol Today 12:A6
2−66）やLeishmania mejor（Caceres−Dittmarら,199
3,Clin Exp Immunol 91:500−505）などの組織寄生
原虫類感染症を悪化させると考えられ、高IgE症候群（D
el Preteら,1989,J Clin Invest 84:1830−1835）
及びOmennOs症候群（Schandeneら,1993,Eur Ｊ Immun
ol 23:56−60）などの特定の原発性免疫不全において
選択的に誘発され、高いIgE症候群（Del Preteら,198
9,J Clin Invest 84:1830−1835）及びOmennOs症候
群（Schandeneら,1993,Eur Ｊ Immunol 23:56−60）
の低下に関連し、HIV複製抑制能（Barkerら,1995,Proc
Soc Nat Acad Sci USA 92:11135−11139）の低
下に関連する。

従って、上記疾患状態のリンホカインプロフィールを
調節することが治療上有用なことは明らかである。恐ら
く、Th1型応答を促進するとTh2表現型が抑制され、Th2
型応答を促進するとTh1表現型が抑制されるであろう。
リンホカインに対するモノクローナル抗体（mAb）、リ
ンホカイン自体及び他の作用物質例えばチオール酸化防
止剤（Jeanninら,1995,J Exp Med 182 1785−179
2）は、疾患促進サイトカインパターン、Th1又はTh2の
いずれかを阻害することにより特定の疾患の病因を逆転
させることが証明されている。例えば、細胞内原虫感染
症は、IFNγにより抑制され、IL−４により悪化する
が、線虫感染症は、IL−４により抑制され、IFNγによ
り悪化する（Heinzelら,1989,J Exp Med 162:59−7
2,Elseら,1994,J Exp Med 179:347−351）。NODマウ
スのインスリン依存性糖尿病や、マウス及びラットのEA
Eは、該疾患が発症する前にIL−４又は抗IFNγ mAbで
治療すると改善され得る（Rapoportら,1993,J Exp Me
d 178:87−99,Rackeら,1994,J Exp Med 180:1961−
1966,Campbellら,1991,J Clin Invest 87:739−74
2）。また、全身性エリテマトーデス様症候群を特徴と
する自己免疫移植片対宿主症（GVHD）は、Th2型リンホ
カインの産生に関連し、抗IL−４抗体によって阻害され
る（Umlandら,1992,Clin Immunol Immunopathol 63:
66−73）。一方、Th1型サイトカインは、ドナーCD8⁺T細
胞がCTLになり、宿主の免疫系を破壊する急性GVHDにお
いて産出される。抗IFNγ又は抗TNFα mAbで治療する
と疾患が改善され、抗IL−2mAbで治療すると急性GVHDが
自己免疫型GVHDに変化する（Via及びFinkelman,1993,In
t Immunol 5:565−572）。

1983年以来、HIV感染患者の治療において天然及び組
換えIL−２の臨床実験が進められている（Volberding
ら,1987,AIDS Res Hum Retroviruses,3:115−12
4）。この場合、両者の関係は、AIDSの発症が産出され
るリンホカインのパターン変化に関連すると報告された
ことに由来する（Clerici及びShearer,1994,Immunol T
oday 15:575−581）。発症に向かって進行している感
染患者では、IL−２などのTh1型リンホカインの発現が
経時的に低下する（Maggiら,1987,Eur Ｊ Immunol 1
7:1685−1690,Grutersら,1990,Eur Ｊ Immunol 20:1
039−1044,Clericiら,1993,J Clin Invest 91:759−
765）と同時に、IL−４及びIL−10などのTh2型リンホカ
インの産出が増大する（Clericiら,1994,J Clin Inve
st 93:768−775,Hoffmanら,1985,Virology 147:326−
335）。IL−２で治療した非症候性又は長期生存患者由
来のＴ細胞は、その抗HIV活性が増強されていたが、IL
−４又はIL−10に暴露すると、そのHIV複製抑制能及びI
L−２産出能が低下した（Barkerら,1995,Proc Soc Na
t Acad Sci USA 92:11135−11139）。

しかし、現在使用されているこれらの免疫調節治療薬
（mAb及び組換えサイトカイン）には限界がある。例え
ば、長期間モノクローナル抗体を用いて治療を行うと、
宿主動物にモノクローナル抗体に対する抗体ができ、そ
のためにモノクローナル抗体の有用性が制限される。mA
bに対する免疫応答の誘発というリスクを明らかに低減
させる「人化」（humanized）モノクローナル抗体が開
発された。しかし、該抗体はまだ開発途上であり、その
上、これら新規なmAbは依然、巨大タンパク質であり、
従って、標的部位への到達が難しい可能性がある。サイ
トカインをベースとする治療薬にも限界がある。例え
ば、マウスでは、自己免疫型GVHDをIL−12で治療すると
急性GVHDが発症する。

リバビリン（１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−1,2,4−
トリアゾール−３−カルボキサミド）は、RNA及びDNAウ
イルスの複製を阻害し得る合成ヌクレオシドである（Hu
ffmanら,1973,Antimicrob Agents Chemother 3:235,
Sidwellら,1972,Science 177:705）。本発明者は、リ
バビリンが、その抗ウイルス活性に加えて、特定の免疫
応答に作用することを示唆した他の人々の所見を確認し
た（Jolley及びSuchil,1984,Clinical Applications
of Ribavirin:93−96ページを再検討した）。本発明者
はさらに、リバビリンがマイトジェン及び抗原活性化Ｔ
及びＢリンパ球の増殖に影響を与え〔Tamら、1995（デ
ータ示さず）,Peavyら,1980,Infection and Immunity
29:583−589〕、さらに、リバビリンは、シクロスポ
リンと組み合わせると、長期の同種移植生存に効力を示
す（Jelleyら,1988,Transplantation Proc 20:703−7
06）という他の人々の所見を確認した。

また、本発明は、リバビリンが、Th1型応答を促進し
且つTh2型応答を抑制することにより、少なくとも部分
的に免疫応答のサイトカインパターンを調節することを
証明することにより従来の研究を著しく進展させた。こ
の発見は従来の研究と矛盾しないと洞察される。先ず第
１に、リバビリンが機能性体液性免疫応答（Peavyら,19
81,J Immunol 126:861−864,Powersら,1982,Antimicr
ob Agents Chemother 22:108−114）及び肥満細胞分
泌のIgE媒介性調節（Marquardtら,1987,J Pharmacol
Exp Therapeutics 240:145−149）（いずれもTh2型リ
ンホカイン媒介性事象である）のどちらをも阻害するこ
とは公知である。第２に、リバビリンは、HIV患者由来
の末梢血リンパ球においてアジドチミジン（AZT）の抗
ウイルス作用を拮抗する（Vogtら,1987,Science 235:1
376−1379）。この知見は重要である。というのは、AZT
はIL−２受容体（IL−2R）の発現を低下させるがIL−２
の発現は低下させないからである（Viora及びCamponesc
hi,1995,Cell Immunol 163:289−295）。従って、リ
バビリンが、IL−２の発現を調節し且つ低下したIL−2R
レベルを上昇させることによりAZTを拮抗することは可
能である。第３に、慢性GVHD（Th2媒介性疾患）を有す
る免疫減弱患者をリバビリンで治療すると該疾患が驚異
的に消散するが、これは、シクロスポリンやグルココル
チコイドなどの従来の免疫抑制療法では起こらなかった
ことである（Cassano,1991,Bone Marrow Transplanta
tion 7:247−248）。最後に、Ｃ型肝炎（HCV）患者を
リバビリンで（１年間）治療すると、プラシーボ対照群
に比べ、リンパ球の凝集率が低下し且つ肝損傷率がはる
かに低下することが判明した（Dusheikoら,1994,Hepato
logy 19（１）:13−８）。この所見は、Ｃ型肝炎に対
する主要免疫応答はTh1型リンホカインにより媒介され
るが、Th0/Th2表現型のＴ細胞はHCVを介して感染し得る
（Zignegoら,1994,未公開データ）ことを表し得、この
感染は肝細胞のさらなる抗体媒介性破壊を誘発し得る。

図面の簡単な説明表１は、ヒトＴ細胞の刺激48及び72時間後の上清中で
測定したリンホカイン、IL−２、IL−４、TNFα及びIFN
γの休止レベルとPMA/イオノマイシン（ionomycin）活
性化レベル（pg/ml）、並びにIL−２受容体（IL−2R）
及びIL−４受容体（IL−4R）の細胞表面発現（平均チャ
ンネル蛍光強度）を表す。

図１は、PMA/イオノマイシンで活性化したＴリンパ球
におけるIL−２、IL−４、TNFα及びIFNγの細胞外発現
に及ぼすリバビリン及びインターフェロンαの作用を表
すグラフである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみ
を行った後のリンホカイン発現に対する増大率（％）と
して表す。

図２は、PMA/イオノマイシンで活性化したＴリンパ球
におけるIL−２（Ａ及びＣ）及びIL−４（Ｂ及びＤ）の
細胞外発現に及ぼす、2,000U/mlのインターフェロンα
の存在下の２、10又は50mMのリバビリンの作用（左側パ
ネル）と、10mMのリバビリンの存在下の500、1,000又は
2,000U/mlのインターフェロンαの作用（右側パネル）
を表すグラフである。

図３は、PMA/イオノマイシンで活性化したＴリンパ球
におけるIL−２、IL−４及びIFNγのmRNAの発現に及ぼ
すリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラ
フである。

図４は、PMA/イオノマイシンで活性化したＴリンパ球
におけるIL−２及びIL−４受容体の細胞表面発現に及ぼ
すリバビリン及びインターフェロンαの作用を表すグラ
フである。結果を、PMA/イオノマイシン処理のみを行っ
た後のリンホカイン受容体発現に対する増大率（％）と
して表す。

図５は、休止Ｔ細胞（Ａ及びＥ）、あるいはPMA/イオ
ノマイシンのみで処理する（Ｂ及びＦ）か又はPMA/イオ
ノマイシン処理を10mMのリバビリンの存在下（Ｃ及び
Ｇ）若しくは5,000U/mlのインターフェロンαの存在下
（Ｄ及びＨ）に行った活性化CD4⁺T細胞（上部パネル）
若しくはCD8⁺細胞（下部パネル）における細胞内IL−２
の発現を表すグラフである。１回の実験から得られたデ
ータを示し、IL−２とCD4又はCD8の二重ポジティブ染色
を示す細胞の百分率として表わす。

図６は、企図されるリバビリン類似体を表すグラフで
ある。

図７は、IL−２、TNFα、IFNγ、IL−４及びIL−５に
対する種々の濃度のリバビリン類似体の結果を示すグラ
フを集めたものである。

発明の要旨本発明の１つの態様によれば、リバビリン（ヌクレオ
シド）を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調
節に有効な投薬量範囲で患者に投与する。特に、リバビ
リンは、Th2媒介性Ｔ細胞応答の抑制及びTh1媒介性Ｔ細
胞応答の促進に用いる。

従って、本発明では、リバビリンをその抗ウイルス剤
としての十分に認識された役割で投与する代わりに、リ
ンホカイン発現の平衡異常の治療に用いる。そのような
平衡異常は、アレルギー性喘息やアトピー性皮膚炎など
のアレルギー性アトピー性疾患、ぜん虫感染症及びリー
シュマニア症、並びにウイルス感染に関連し得るものも
関連しないと考えられるものも含めた種々の原発性及び
続発性免疫不全に付随するものとして見出され得る。

本発明の他の態様によれば、１種以上のリバビリン類
似体を、活性化Ｔ細胞におけるリンホカイン発現の調節
に有効な投薬量範囲で患者に投与する。リバビリン類似
体は、Th1又はTh2媒介性Ｔ細胞応答の抑制又は促進に用
い得る。

発明の詳細な説明好ましい実施態様において、リバビリンは、平均して
0.25〜12.5μＭ、最も好ましくは約2.5μＭの血清レベ
ルが得られる投薬量で患者に経口投与する。典型的な個
体では、最適な血清レベルは、１日につき体重1kg当た
り約4.5mgであり、都合200〜1,200mgの投薬量で投与し
得る。１日当たりの投薬量を何回分かに分割して投与す
るのが好ましい。

リバビリンは数年前から市販されているので、多くの
剤形や投与経路が公知となっており、そのうちの適切な
ものを利用することができる。例えば、リバビリンは、
経口投与以外にも、公知のように、静脈内、筋肉内、腹
腔内、局所投与したりすることができる。リバビリンを
含む医薬組成物は、１種以上の医薬上許容し得る担体を
さらに含み得、該担体は、（長期貯蔵用の）安定剤、乳
化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶剤、分散媒、コ
ーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅
延剤などを含み得る。医薬活性物質としてのそのような
媒質及び作用物質の使用は当業界では周知である。従来
の媒質又は作用物質は、リバビリンに不適合である場合
を除いて、治療用組成物及び製剤に用いられる。組成物
や製剤に補助有効成分を混和してもよい。

リバビリンは、本発明において企図されている治療用
としての用途に加えて、吸収、分配、細胞取込み及び効
力に関する研究の実験用ツールとしても用い得る。

さらに、今まで活性が極めて低いとして用いられてい
なかった（既知又は未知の）数種のヴァイラゾール類似
体も有意なサイトカイン活性を有することが見出され
た。本発明者が調べたところ、そのような活性を有する
ヴァイラゾール類似体は数種存在し、以下の「リバビリ
ン類似体」というタイトルの下にその実施例が示されて
いる。これらの実施例は、活性組成物を得るためにヴァ
イラゾールを修飾し得る位置を特定することを目的と
し、従ってこの開示は、示されている特定の修飾に限定
されるものではない。さらに、これらの修飾は、標準的
なＤ型ヴァイラゾールにも、Ｌ型ヴァイラゾールにも適
用し得るように企図されている。

実施例細胞系及びＴ細胞の精製健康なドナー由来の血液60mlをフィコール−ハイパッ
ク密度勾配遠心分離にかけた後、バフィーコートから末
梢血単核細胞（PBMC）を単離した。次いで、Ｔ細胞に特
異的なLymphokwikリンパ球単離試薬（LK−25T,One Lam
bda,Canoga Park,CA）を用い、PBMCからＴ細胞を精製
した。次いで、平均収量40〜60×10⁶個のＴ細胞を、20
〜30mlのRPMI−AP5〔20mMのHEPES緩衝液、pH7.4、５％
の自己由来血漿、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシ
リン／ストレプトマイシン及び0.05％の２−メルカプト
エタノールを含むPRMI−1640培地（ICN,Costa Mesa,C
A）〕中37℃で一晩インキュベートして、不純混合付着
細胞を除去した。全ての実験において、Ｔ細胞をRPMI−
AP5で洗浄し、次いで、96ウエルマイクロタイタープレ
ート上に１×10⁶細胞/mlの細胞密度で平板培養した。

Ｔ細胞活性化及びリバビリン処理 500ngのイオノマイシン及び10ngのホルボール12−ミ
リステート13−アセテート（PMA）（Calbiochem,La Jo
lla,CA）を添加してＴ細胞を活性化し、37℃で48〜72時
間インキュベートした。PMA/イオノマイシンで活性化さ
れたＴ細胞を、活性化直後に0.5〜50mMのリバビリン又
は250〜10,000U/mlの対照抗ウイルス剤、インターフェ
ロンα（Accurate,Westbury,NY）で処理し、24時間後に
再処理した。各プレートからのＴ細胞を免疫蛍光法分析
に用い、上清を細胞外サイトカインの測定に用いた。活
性化後、細胞由来サイトカインの産生を分析するため
に、各マイクロプレートから細胞上清900mlを取り出
し、別のマイクロプレートに移した。次いで、細胞を、
免疫蛍光法による細胞内サイトカインレベル及びサイト
カイン受容体の発現の分析に用いた。

細胞外サイトカインの分析各マイクロプレートからの細胞上清中で細胞由来ヒト
サイトカインの濃度を定量した。市販のELISAキット
（Ｒ＆Dsystems Quantikine kit,Minneapolis,MN）を
用いるか、又はIL−２依存性細胞系、CTLL−２（ATCC,R
ockville,MD）を用いたバイオアッセイにかけて、活性
化により誘発されたインターロイキン−２（IL−２）の
レベルの変化を定量した。ELISAキットを用い、活性化
により誘発された、インターロイキン−４（IL−４）、
腫瘍壊死因子（TNFα）、インターロイキン−８（IL−
８）（Ｒ＆Ｄ Systems（Quantikine kit,Minneapoli
s、MN）及びインターフェロンγ（IFNγ）（Endogen（C
ambridge,MA）のレベルの変化を定量した。全てのELISA
の結果はpg/mlとして表し、CTLL−２バイオアッセイ
は、CTLL−２細胞による³H−チミジン（ICN,Costa Mes
a,CA）のIL−２依存性細胞取込みを表す１分当たりのカ
ウント数として表した。

直接免疫蛍光法実験（サイトカイン受容体）蛍光標識した細胞表面抗原に対する抗体で直接染色す
るために、細胞を生理食塩液、pH7.4（Becton Dickins
on,Mansfield,MA）で２回洗浄し、50mlの生理食塩液に
再懸濁し、２つの試料に分割した。一方の試料アリコー
トをPE抗CD25/FITC−抗CD4又はPE−ラット抗マウスIgG
＋抗CDw124/FITC−抗CD4 mAbで同時染色し、第２のア
リコートをPE/FITCで標識したアイソタイプマッチド対
照モノクロナール抗体で染色して、非特異的蛍光を評価
した。蛍光標識したモノクローナル抗体は全てBecton
Dickinson（SanJose,CA）から入手したが、抗CDw124はP
harmingen,San Diego,CAから入手した。インキュベー
ションは、飽和mAb濃度を用いて暗所で45分間４℃で行
った。取り込まれなかった標識をPBSで洗浄して除去し
た後、CACScanフロー・サイトメトリー（Becton Dicki
nson）を用いて分析した。

ゲートをかけた生きているCD4⁺T細胞中で抗原密度を
間接定量し、平均蛍光チャンネル（MCF）として表し
た。特異的抗原（CDw124,CD25）の表面発現を、FITC又
はPE標識した抗原特異的mAb染色細胞のMCFからFITC又は
PE標識したアイソタイプマッチド（IgG1）対照mAb染色
細胞のMCFを減算して得られた平均チャンネル変化（MC
S）として表した。あるいは、CD28mAbで染色された細胞
のCD4⁺サブセットの表面発現を、CD28^-CD4^-細胞のMCFか
らCD28⁺CD4⁺のMCFを減算して測定した。

未処理対照とリバビリン処理細胞及びインターフェロ
ンα処理細胞の生存能力を、生体染料、ヨウ化プロプジ
ウム（propidium iodide）（最終濃度:5mg/ml）で染色
することにより、多重ドナーの全てのオリゴヌクレオチ
ドを有する各バッチ中で定量した。ヨウ化プロピジウム
を除去した生存細胞の百分率をフロー・サイトメトリー
で測定すると、用いた全ての濃度において、処理した
後、＞90％（90〜99％の範囲）であった。

細胞内サイトカイン発現の免疫蛍光法分析 CD4⁺及びCD8⁺T細胞サブセットにおけるIL−２の細胞
内発現を分析するために、先ず、48〜72時間の活性化の
最後の４時間に、Ｔ細胞を10mgのBrefeldinA（Gibco B
RL,Gaithersburg,MD）で処理して、新たに合成されるIL
−２の細胞外への分泌を最小限にした。活性化後、細胞
由来サイトカインの産生を分析するために、各マイクロ
プレートから細胞上清900mlを取り出し、別のマイクロ
プレートに移した。FITC標識した細胞表面抗原、CD4及
びCD8に対する抗体で直接染色（30分間、４℃、暗所）
する前に、細胞を生理的食塩液、pH7.4で２回洗浄し、1
00〜150mlの染色緩衝液〔１％ウシ胎児血清（FCS）（Hy
clone,Logan,UT）及び0.1％アジ化ナトリウムを含むリ
ン酸緩衝生食液、pH7.4〕に再懸濁し、２つの試料に分
割した。染色された細胞を1mlの染色緩衝液で洗浄し、
上清を吸引した後、細胞ペレットを100mlの固定緩衝液
（PBS中４％パラホルムアルデヒド）に再懸濁した。固
定された細胞を20分間４℃に維持し、次いで、1mlの染
色緩衝液で洗浄し、細胞ペレットを50mlの透過性化緩衝
液〔PBS中0.1％サポニン（ICN,Costa Mesa,CA）〕に攪
拌下に再懸濁した。透過性となった細胞を、暗所で30分
間４℃で、PE標識したIL−２抗体で染色し、次いで、1m
lの透過性化緩衝液中で洗浄し、FACS分析にかける前に2
50mlの染色緩衝液に再懸濁した。

サイトカインmRNAの分析商業用のグラニジウムチオシアネート／フェノール抽
出剤〔Trizol剤（GIBCO/BRL）〕を用い、休止Ｔ細胞、
リバビリン処理Ｔ細胞及びインターフェロンα処理Ｔ細
胞、並びに非処理活性化Ｔ細胞から全RNAを抽出した。R
NAを70％エタノールで洗浄し、最後に、DEPC処理した水
10μｌに再懸濁した。

製造業者（Promega,Madion,WI）の指示に従ってcDNA
合成反応を行った。簡略的に言えば、全RNA（１μｇ）
を65℃で10分間加熱し、氷上で冷却してから、10×逆転
写緩衝液〔100mMのTris HCl（pH8.8）、500mMのKCl、
１％のTriton Ｘ−100、5mMのMgCl〕（２μｌ）、10mM
のdNTP（各dNTP:1mM）（２μｌ）、RNアーゼ阻害剤（0.
5μｌ）、オリゴ（dT）₁₅プライマー（0.5μg/μgRNA）
（１μｌ）及びAMV逆転写酵素（H.C.）（0.65μ１）と
合わせた。反応混合物を42℃で１時間次いで95℃で10分
間次いで氷上で５分間インキュベートした。

GeneAmp PCRキット（Perkin−ElmerCetus,Foster C
ity,CA）を用い、PCR反応を行った。新しい試験管中
で、RT反応混合物（３μｌ）を、10×PCR緩衝液〔500mM
のKCl、100mMのTris−HCl、pH8.3、15mMのMgCl₂及び0.0
1％（w/v）のゼラチン〕（５μｌ）、10mMのdNTP（１μ
ｌ）並びにTaq DNAポリメラーゼ（1U）と合わせた。用
いたプライマーは以下の通りであった：インターロイキ
ン−２、インターロイキン−４、インターフェロンγ
（ヒト）プライマー（Strategene,La Jolla,CA）及びp
HE7リボソーム遺伝子。増幅条件は、94℃で45秒間、57
℃で１分間、72℃で２分間のサイクルを35回、次いで、
72℃で８分間であった。臭化エチジウムを含む２％アガ
ロースゲル上でPCR産物を分析した。電気泳動させた
後、PCR産物を20×SSC中で一晩かけてHybondN＋メンブ
ラン（Amersham,Arlington Heights,IL）に移し、0.4M
NaOHを用いて固定化した。ブロットをRapid−hyb緩衝
液（Amersham）中42℃で１時間、³²P−γATP標識オリゴ
ヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。（指示
に従って）各サイトカインプライマーミックスを放射線
標識プローブとして用いた。pHE7センスプライマーから
作製したプローブとハイブリダイズさせた後、処理量が
等しいことを確認した。次いで、洗浄したブロットをPh
osphorImagerで分析した。

活性化Ｔ細胞における細胞外サイトカインレベルに及ぼ
すリバビリンの作用図１に示されている代表的な実験において、リバビリ
ンを0.5〜50mMの用量範囲で添加すると、Th1サイトカイ
ン、IL−２及びTNFαの活性化レベルが、それぞれ5mM
（30％）及び20mM（36％）で極大増大を示した。それに
対し、インターフェロンαを添加すると、非処理活性化
Ｔ細胞におけるレベルに比べ、IL−２及びTNFαの発現
が用量依存的に阻害された（250〜10,000U/ml、極大阻
害率はそれぞれ33％及び38％）。さらに、リバビリンは
Th2型サイトカイン、IL−４の活性化レベルの同時低下
を媒介した（2mMで74％のピーク阻害率）が、インター
フェロンαは細胞外IL−４を最大で26％増大させた（1
0,000U/ml）。図２は、リバビリンとインターフェロン
αを組み合わせて用いると、2,000U/mlの定濃度のイン
ターフェロンαは活性化IL−２レベルのリバビリン用量
依存性増大を抑制し（Ａ）、活性化IL−４レベルの阻害
を逆転させた（Ｃ）ことを示している。同様に、10mMの
定濃度のリバビリンは、活性化IL−２レベルのインター
フェロンα媒介性用量依存性阻害を逆転させ（Ｂ）、活
性化IL−４レベルの増大を抑制した（Ｄ）。

活性化Ｔ細胞におけるサイトカインmRNAレベルに及ぼす
リバビリンの作用活性化細胞外サイトカインレベルに及ぼすリバビリン
とインターフェロンαの上記対立作用は転写レベルにお
いても認められた。図３は、ヒトＴ細胞をPMA/イオノマ
イシンで処理すると、IL−２、IL−４及びIFNγのmRNA
レベルが実質的に増大することを示している。Ｔ細胞を
活性化した後でリバビリン（２、５及び10mM）で処理す
ると、IL−２のmRNAレベルは増大し、IL−４のmRNAレベ
ルは低下するが、IFNγのmRNAレベルには影響がない。
それに対し、1,000、2,000及び5,000U/mlのインターフ
ェロンαで処理すると、IL−２のmRNAレベルは低下し、
IL−４のmRNAレベルは増大し、IFNγのmRNAレベルは低
下する。従って、IL−２、TNFα及びIL−４のmRNAの発
現に及ぼすリバビリンとインターフェロンαそれぞれの
用量依存性作用はELISA分析と一致した。これらのデー
タは、リバビリンが、活性化ヒトＴ細胞において、Th1
型サイトカイン、IL−２及びTNFαの合成を促進し、Th2
型サイトカイン、IL−４の発現を阻害することを示唆し
ている。

活性化Ｔ細胞におけるIL−２及びIL−４受容体レベルに
及ぼすリバビリンの作用 FACS分析を用い、活性化Ｔ細胞におけるIL−２受容体
（CD25）及びIL−４受容体（CDw124）の発現に及ぼすリ
バビリンとインターフェロンαの作用を比較した。PMA/
イオノマイシンで処理すると、CD25とCDw124の発現が、
それぞれ50.16±0.45及び62.31±1.46の休止レベルから
162.48±2.89及び87.53±3.98の活性化レベルに増大す
る（ｎ＝４）。図４は、３回の実験のうち代表的なもの
では、リバビリン（１〜5mM）はIL−２及びIL−４受容
体の活性化レベルには殆ど作用しないが、インターフェ
ロンαは、250〜10,000U/mlの用量範囲で、対照活性化
Ｔ細胞における受容体レベルに比べ、用量依存的にIL−
２受容体の発現を低下させ且つIL−４受容体の発現を増
大させたことを示している。従って、これらのデータ
は、サイトカイン合成に及ぼすリバビリンの作用は、サ
イトカイン受容体の発現とは独立に作用することを示し
ている。それに対し、IL−２及びIL−４受容体に及ぼす
インターフェロンα処理の作用は、活性化IL−２及びIL
−４発現に及ぼすインターフェロンαの作用と相関関係
にある。

活性化Ｔ細胞のCD4⁺及びCD8⁺サブセットにおける細胞内
IL−２レベルに及ぼすリバビリンの作用 IL−２発現に及ぼすリバビリンの作用がCD4⁺T細胞とC
D8⁺R細胞のどちらかに特異的であるかを調べた。固定さ
れ且つ透過性化された活性化Ｔ細胞における細胞内IL−
２の発現を、蛍光標識したCD4又はCD8抗体及びIL−２抗
体を用い、２色フロー・サイトメトリーにより定量し
た。図５は、10mMのリバビリンで処理した後では、IL−
２を発現しているCD4⁺T細胞は82％から91％に増大し、I
L−２を発現しているCD8⁺T細胞は81％から91％に増大し
たことを示している。対照的に、インターフェロンα
（5,000U/ml）で処理した後では、IL−２を発現してい
るCD4⁺及びCD8⁺T細胞は、それぞれ81％と71％であっ
た。これらのデータは、リバンビリンが、CD4⁺T細胞サ
ブセットとCD8⁺T細胞サブセットとを区別せずに細胞内I
L−２発現に作用を及ぼすことを示している。それに対
し、インターフェロンαによる処理は、CD4⁺T細胞には
殆どを作用を及ぼさず、しかも、CD8⁺T細胞サブセット
ではIL−２の発現を低下させさえする。

リバビリン類似体臨床的にTh1又はTh2媒介性Ｔ細胞応答の調節に有効で
あると考えられるリバビリン類似体は数種存在する。該
類似体には、図６の一般式〔式中、Ｘは、Ｏ、Ｓ、C
H₂、CHOH又はＮ−CO−R₁₁であり;A、Ｂ及びＣは独立
に、Ｎ、Ｐ、CH、Ｃ−OH、Ｃ−CH₃、Ｃ−アルキル、Ｃ
−アルケニル、Ｃ−CH₂、−CN、Ｃ−ハロゲン、Ｃ−C
N、Ｃ−COOCH₃、Ｃ−NH₂、Ｃ−SNH₂、Ｃ−SO₂−NH₂、Ｃ
−CONH₂、Ｃ−CS−NH₂、Ｃ−Ｃ（NH）NH₂、CPO₂−NH₂又
はＣ−複素環式であり;Dは、Ｓ、Se、Te、PH、NH又はNR
₁₂であり;R₁は、Ｈ、（CH₂）ｐ（OH）、ハロゲン、CN、
（CH₂）pONH₂、（CH₂）pNH₂、CH₃、CH₂SPH又は（CH₂）
−複素環であり;R₂はＨ、OH、OCH₃、SH、SCH₃、ハロゲ
ン、CN、NH₂、ONH₂、NHCH₃、（CH₂）OH、（CH₂）pNH₂、
CH₃又はCOOMeであり;R₃、R₄、R₅、R₆、R₇及びR₈は独立
に、Ｈ、OH、OCH₃、SH、SCH₃、ハロゲン、CN、NH₂、ONH
₂、NHCH₃、（CH₂）OH、（CH₂）pNH₂、CH₃、COOMe又はフ
ェニルであり;R₉は、Ｈ、ハロゲン、NH₂、CH₃、CONH、C
SNH₂、COOMe、SNH₂、SO₂NH₂、PO₂NH₂、（CH₂p、（CH₂）
ｐ−複素環系又は（CH₂）ｐ−グルコースであり;R
₁₀は、Ｈ、ハロゲン、NH₂、CH₃、CONH、CSNH₂COOMe、SN
H₂、SO₂NH₂、PO₂NH₂、（CH₂）ｐ、（CH₂）ｐ−複素環
系、（CH₂）ｐ−グルコース、Ｏ−CH₃、Ｏ−CH₂CH₃又は
アミノ酸であり;Yは、Ｏ、Ｓ、NH・HCl、NOH、NOCH₃又
はNOCH₂PHであり;R₁₀とＹは一緒になると、チアゾー
ル、イミダゾールなどのような複素環系を形成し;R
₁₁は、CH₃（CH₂）pNH₂、（CH₂）Ｐ−複素環、（CH₂）ｐ
−アミノ酸又は（CH₂）ｐ−糖（グルコースなど）であ
り;pは０〜８の整数である〕を有する分子が含まれ、該
分子には、ＬヌクレオシドもＤヌクレオシドも包含され
る。

そのような分子は、以下に例示する図式の１つ以上に
従って製造し得る。

1. ICN1369（ピラゾマイシン）の合成：該化合物の合
成法は、以下の参考文献に記載されている：（ａ）J.Fa
rkas,Z.Flegelova及びF.Sorm,Tetrahedron Letts.,22,
2279（1972）；（ｂ）S.De Bernardo及びM.Weigele,J.
Org.Chem.,41,287（1976）；（ｃ）J.G.Buchanan,A.Sto
bie及びR.H.Wightrnan,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,916
（1980）;N.Karagiri,K.Takashima,T.Haneda及びT.kat
o,J.Chem.Soc.Perkin Transd.,553（1984）。

2. ICN3438（１−β−Ｄ−キシロフラノシル−1,2,4−
トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合物
の合成は、J.T.Witkowski,M.Fuertes,P.D.Cook及びR.K.
Robins,J.Carbohydr.Nicleosides,Nucleotides ２
（１）、１（1975）に記載の手順に従って行った。

3. ICN3844（１（５−Ｏ−スルファモイル−β−Ｄ−
リボフラノシル）−1,2,4−トリアゾール−３−カルボ
キサミド）の合成：該化合物は、G.D.Kini、B.M.Henr
y、R.K.Robins、S.B.Larson、J.J.Marr,R.L.Berens,C.
J.Bacchi,H.C.Nathan及びB.S.Keithly,J.Med.Chem.,3
3、44（1990）に開示されている手順に従って製造し
た。

4. ICN4625（１（３−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペ
ントフラノシル）−1,2,4−トリアゾール−３−カルボ
キサミド）の合成：該化合物は、以下の合成法を用いて
製造した。

5. ICN5531（５−アミノ−１−β−Ｄ−リボフラノシ
ルピラゾール−４−カルボキサミド）の合成：標記化合
物は、B.K.Bhattacharya,R.K.Robins及びG.R.Revankar,
J.Heterocyclin Chem.,21,795（1990）に記載の合成法
に従って製造した。

6. ICN5676（１−β−Ｄ−アラビノフラノシル−1,2,4
−トリアゾール−３−カルボキサミド）の合成：該化合
物の合成は、J.T.Witkowski,M.Fuefles,P.D.Cook及びR.
K.Robins,J.Carbohydr.Nucleosides,Nucleotides,2
（１）、１（1975）に記載の手順に従って行った。

7. ICN5839（１−β−Ｄ−エリスロフラノシル−1,2,
4,3−カルボキサミド）の合成：該化合物は、以下に記
載の合成順序を用いて製造した： 8. ICN6242（２−ブロモ−１−β−Ｄ−リボフラノシ
ルイミダゾール−４−カルボキサミド）の合成:ICN6242
は、以下に示されている方法に従って製造した。

9. ICN11808（１−β−Ｄ−リボフラノシル−ピラゾー
ル−3,4−ジカルボキサミド）の合成：該化合物の合成
は、Y.S.Sanghvi,B.K.Bhattacharya,G.D.Kini,S.S.Mats
umoto,S.B.Larson,W.J.Jolley,R.K.Robins及びG.R.Reva
nkar,J.Med.Chem.,33,336（1990）に記載されている方
法に従って行った。

10. ICN12204（２−（β−Ｄ−リボフラノシル）イミ
ダゾール−５−カルボキサミド）の合成：該化合物の合
成は、J.Igoleo,T.H.Dinh,A.Keib及びC.Perreur,Chimie
Therapeutique,207（1972）に記載の手順に従って行
った。

リバビリン類似体の炭素環式４′−チオ糖及び４′−
アザ糖誘導体を得るには、以下の糖を適切な複素環式化
合物と縮合し、上記図式及び参考文献に記載の方法で誘
導体化し得る。

1. 炭素環式糖は、以下の文献に記載の手順に従って製
造し得る:M.Yoshikawa,Y.Yoshikawa,Y.Inoue,S.Yamaguc
hi及びN.Murakami,Tetrahedron,50,9961（1994）;L.Agr
ofoglio,E.Suhas,A.Parese,R.Condom,S.R.Challand,R.
A.Earl及びR.Guedj,Tetrahedron,59,10611（1994）。

2. ４−アザ糖は、E.J.Reist,D.E.Gueffroy及びL.Good
man,J.Am.Chem.Soc.87,677（1965）に記載の手順に従っ
て製造した。

3. ４−チオ−Ｄ−リボフラノースは、M.Hobek及びR.
L.Whistler,“Methods in Carbohydrate Chemistr
y",第１巻,292（1962）に記載の手順に従って製造し
た。

Th1型及びTh2型サイトカインの調節にリバビリンが有
効であるという証拠が図７及び以下の表に示されてい
る。該図及び表に示されているアッセイは、テストした
35種のリバビリン類似体のうち注目すべきもののリスト
を含み、アッセイは全て３回実施した。一般に、テスト
した化合物は主要な３種：（１）IFNγ、IL−２、IL−
４、IL−Ｓ及びTNFαを抑制したICN1369及びICN3844な
どの化合物；（２）IL−２及びTNFαを促進し、ILA及び
IL−５を抑制したリバビリンなどの化合物；及び（３）
IL−２及びIFNγを促進し、IL−４及びIL−５を抑制し
たICN6242,ICN3839及びICN3531などの化合物に分類され
ることがわかるであろう。上記にリストしたような活性
は、サイトカインの調節が適切な免疫応答に強い影響を
与えるであろうという見通しのために潜在的に有用であ
ると考えられる。

このように、リバビリン及びリバビリン類似体は、活
性化Ｔ細胞においてリンホカインの発現の調節に有効で
あることが証明された。特定の実施態様及び用途を記載
したが、当業者には、本発明の概念を逸脱せずにさらに
多くの変更を実施し得ることが明らかであろう。従っ
て、本発明は、以下の請求の範囲の精神においてのみ制
限されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ラマサミー，カンダサミーアメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92653、ラグナ・ヒルズ、ロツキー・クリーク・レイン・５ (72)発明者アベレツト，デブロンアメリカ合衆国、カリフオルニア・ 92612、アービン、トリニテイ・26 (56)参考文献特表平２−500916（ＪＰ，Ａ) ＡｕｔｉｖｉｒａｌＣｈｅｗｉｓｔｒｙ＆Ｃｈｅｗｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．５，ｐｐ．257−263 （1991) Ｓｃｉｅｍｃｌ，Ｖｏｌ95，Ｎｏ. 4280，ｐｐ．787−789（1977) Ｊ．Ｅｚｐ．Ｍｅｄ，1989 Ｊａｎｌ；169（１）：59−72 Ｃｌｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．, 1995 Ｎｏｖ；102（２）：281−５Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕａｏｌ．，1995 Ａａｇ；７（４）：505− 11 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61P 33/02 A61K 31/70 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】リバビリンを含有する薬剤であって、蠕虫
感染およびリーシュマニア症から成る群から選択される
疾患の治療用薬剤。
【請求項２】前記疾患が蠕虫病である請求項１に記載の
薬剤。