JP3484459B2

JP3484459B2 - 腫瘍拒絶抗原前駆体、腫瘍拒絶抗原及びそれらの使用

Info

Publication number: JP3484459B2
Application number: JP50033093A
Authority: JP
Inventors: ティエリーブーン; デルブリュージャンピエールファン; ダンエインドベノワファン; ペルアリーヌファン; プラーンエティアンヌド; クリストフルルカン; パトリックショーメ; カティアトラヴェルサリ
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1991-05-23
Filing date: 1992-05-22
Publication date: 2004-01-06
Anticipated expiration: 2019-01-06
Also published as: EP0595838A1; NO315051B1; CA2307317C; CA2109727C; DE69233435T2; FI935174A0; ES2225818T3; NO934130D0; FI935174A; IL101963A0; FI117555B; DE69233435D1; EP0595838B1; NO934130L; PT100515B; WO1992020356A1; JPH06511144A; IL101963A; CA2307317A1; DK0595838T3

Description

【発明の詳細な説明】本出願は、1991年12月12日に出願した米国特許出願第
807,043号の一部継続出願であり、該出願は1991年９月2
3日に出願した米国特許出願第764,364号の一部継続出願
であり、該出願は1991年７月９日に出願した米国特許出
願第728,838号の一部継続出願であり、該出願は1991年
５月23日に出願し、米国特許出願第705,702号の一部継
続出願であって、これらは現在放棄されている。

発明の分野本発明は、腫瘍学の研究に応用される免疫遺伝学の分
野に一般的に関するものである。より具体的には、いわ
ゆる腫瘍拒絶抗原の提示及びここに「腫瘍拒絶抗原前駆
体」と呼ばれるものの発現を介する生体免疫系により腫
瘍が認識されるメカニズムの研究及び分析に関する。

背景及び従来技術宿主生体による癌細胞の認識又は認識不足の研究は、
多くの異なった方針において進められた。本分野を理解
することは、基礎免疫学及び腫瘍学の両方をかなり理解
することであると思われる。

マウスの腫瘍に関する初期の研究により、マウスの腫
瘍が同系の動物に移植された時に腫瘍細胞を拒絶する分
子としての特性を示すことが明らかになった。これらの
分子は、宿主動物においてＴ−細胞により「認識」さ
れ、移植された細胞の溶解を伴う細胞障害性Ｔ−細胞応
答を引き起こす。この証拠は、まず、メチルコラントレ
ンのような化学癌原性物質によりインビトロにおいて誘
発された腫瘍に得られた。腫瘍により発現され、Ｔ−細
胞応答を引き出した抗原は、各腫瘍について異なってい
ることが見出された。化学癌原性物質により腫瘍を引き
起こすことの一般的教訓及び細胞表面抗原における差異
について、プレーン（Prehn）ら著、J.Natl.Canc.Inst.
18:769〜778（1957）；クライン（Klein）ら著、Cancer
Res.20:1561〜1572（1960）；グロス（Gross）著、Can
cer Res.3:326〜333（1943）、バソンブリオ（Basombri
o）著、Cancer Res.30:2458〜2462（1970）を参照され
たい。抗原のこのクラスは、「腫瘍特異性移植抗原」又
は「TSTA」として知られるようになった。化学癌原性物
質により誘発された時のそのような抗原の提示の観察に
続いて、同様の結果は、腫瘍が紫外線照射によりインビ
トロにおいて誘発された時に得られた。クリプケ（Krip
ke）著、J.Natl.Canc.Inst.53:333〜1336（1974）を参
照されたい。

Ｔ−細胞媒介免疫応答が上記の腫瘍のタイプに関して
観察されたが、自然発生腫瘍は、一般的に非免疫原性で
あると思われていた。従って、これらは、腫瘍を保持す
る患者において、腫瘍に対する応答が誘発される抗原を
示さないと思われていた。ヘウィット（Hewitt）ら著、
Brit.J.Cancer 33:241〜259（1976）を参照されたい。

tum^-抗原提示細胞系のファミリーは、マウス腫瘍細胞
又は細胞系の突然変異誘発により得られた免疫原性変異
体であり、これらはボーン（Boon）ら著、J.Exp.Med.15
2:1184〜1193（1980）により記載された。その開示は、
参照文献としてここに含まれるものとする。詳論する
と、tum^-抗原は、同系マウスにおける免疫応答を生じず
に、かつ腫瘍を形成するであろう腫瘍細胞（即ち、「tu
m⁺」細胞）の突然変異により得られる。これらtum⁺細胞
が突然変異を起こした時、それらは同系マウスにより拒
絶され、腫瘍を形成することができない（従って「tu
m^-」）。ボーンら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:272
（1977）を参照されたい。その開示は参照文献としてこ
こに含まれるものとする。いくつかの腫瘍型は、この現
象を示すことが示された。例えば、フロスト（Frost）
ら著、Cancer Res.43:125（1983）を参照されたい。

tum^-変異体は、検疫拒絶プロセスを導くので、進行性
腫瘍を形成できないと思われる。この仮説を支持する証
拠としては、腫瘍の「tum^-」変異体、即ち腫瘍を一般的
に形成しないものが、亜致死照射（sublethal irradiat
ion）により抑制された免疫系によりマウスにおいて腫
瘍を形成する能力（ファンペル（Van Pel）ら著、Proc.
Natl,Acad.Sci.USA:5282−5285（1979））；及び腹腔内
注射した肥満細胞種P815のtum^-細胞が12〜15日間で指数
関数的に増加し、その後、リンパ球及びマクロファージ
の流入物の中にわずか２、３日で除去されることを観察
すること（ウイテンホッブ（Uyttenhove）ら著、J.Exp.
Med.152:1175−1183（1980））があげられる。さらなる
証拠として、免疫抑制量の放射線を細胞の次の攻撃を伴
って投与した時でさえ、同じtum^-変異体に対する続いて
おこる攻撃を阻止することをマウスに可能にする免疫メ
モリーをマウスが獲得するといった観察があげられる
（ブーン（Boon）ら著、Proc.Natl,Acad.Sci.USA 74;27
2−275（1977）；ファンペル（Van Pel）ら著、上記文
献；ウイテンホッフ（Uyttenhove）ら著、上記文献）。

後の研究により、自然発生腫瘍を突然変異させた時、
応答を生じる免疫原性変異体を生じた。確かに、これら
変異体は、原腫瘍に対して免疫防御応答を誘発すること
ができた。ファンペル（Van Pel）ら著、J.Exp.Med.15
7:1992−2001（1983）を参照されたい。従って、同系拒
絶応答の標的である腫瘍において、いわゆる「腫瘍拒絶
抗原」の提示を誘発することが可能なことが分かった。
同様の結果は、異種遺伝子を自然発生腫瘍にトランスフ
ェクトした時に得られる。これに関してフィルソン（Fe
arson）ら著、Cancer Res.48:2975−1980（1988）を参
照されたい。

腫瘍細胞の表面に提示され、かつ細胞障害性Ｔ−細胞
により認識され、溶解を導く抗原のクラスが確認され
た。抗原のこのクラスを、以下において「腫瘍拒絶抗
原」又は「TRA」と呼ぶ。TRAは、抗体応答を誘発しても
誘発しなくてもよい。これらの抗原が研究された範囲
は、in vitroにおける細胞障害性Ｔ−細胞の特性研究、
即ち、特定の細胞障害性Ｔ−細胞（以下、「CTL」と呼
ぶ）による抗原の同定の研究を経てきた。サブセット
は、発現した腫瘍拒絶抗原の認識に基づいて増殖し、抗
原を発現する細胞は溶解する。特性研究により、抗原を
発現する細胞を特異的に溶解するCTLクローンが同定さ
れた。この作業の例は、レビー（Levy）ら著、Adv.Canc
er Res.24:1−59（1977）；ブーン（Boon）ら著、J.Ex
p.Med.152:1184−1193（1980）；ブルーナー（Brunne
r）ら著、J.Immunol.124:1627−1634（1980）；マリヤ
ンスキ（Maryanski）ら著、Eur.J.Immunol.124:1627−1
634（1980）；マリヤンスキ（Maryanski）ら著、Eur.J.
Immunol.12:406−412（1982）；パラジーノ（Palladin
o）ら著、Canc.Res.47:5074−5079（1987）に見出され
る。このタイプの分析には、非主要組織適合抗原、雄性
特異性Ｈ−Ｙ抗原及び「tum−」抗原と呼ばるここに述
べたクラスを抗原を含む、CTLにより認識される他のタ
イプの抗原が要求される。

上記の目的物質の腫瘍の例としては、P815が知られて
いる。デプリーン（DePlean）ら著、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:2274−2278（1988）；チコラ（Szikora）ら
著、EMBOJ 9:1041−1050（1990）、及びシビレ（Sibill
e）ら著、J.Exp.Med.172:35−45（1990）を参照された
い。この開示は参照文献としてここに含まれるものとす
る。P815腫瘍は肥満細胞腫であり、メチルコラントレン
を用いてDBA/2マウスにおいて誘発され、in vitroの腫
瘍及び細胞系の両方として培養される。P815系は、突然
変異誘発の後、P91A（デプリーン著、上記参考文献）、
35B（チコラ著、上記参考文献）及びP198（シビレ、上
記参考文献）と呼ばれる変異体を含むいくつかのtum^-変
異体を生じた。腫瘍拒絶抗原と対照すると、tum^-抗原
は、腫瘍細胞が突然変異した後に存在するのみであり、
これが鍵となる特徴である。腫瘍拒絶抗原は、突然変異
なしに所定の腫瘍の細胞上に発現する。それゆえに、文
献を参照すると、細胞系は「P1」と呼ばれる系のような
tum⁺であってもよく、tum^-変異体を生じるように誘発さ
れ得る。tum^-表現型は、親細胞系のものとは異なってい
るので、それらのtum⁺親系と比較するとtum^-細胞系のDN
Aは異なっていることが予期され、tum^-細胞に重要な遺
伝子を置くためにこの差異を利用することができる。そ
の結果として、P91A、35B及びP198のようなtum^-変異体
の遺伝子は、遺伝子のコード領域における点突然変異に
よりそれの正常の対立遺伝子とは異なっていることが見
出された。チコラ（Szikora）及びシビレ（Sibille）
著、上記参考文献、及びローキン（Lurquin）ら著、Cel
l 58:293−303（1989）を参照されたい。これは、本発
明のTRAを用いたケースでないことで証明された。これ
らの論文により、tum^-抗原から誘導されたペプチドが、
CTLによる認識に関するL^d分子により提示されることが
立証された。P91AはL^dにより提示され、P35はD^dによ
り、P198はK^dにより提示される。

加工されて提示（presentation）腫瘍拒絶抗原（以
下、「腫瘍拒絶抗原前駆体」、「前駆体分子」又は「TR
AP」という）を形成する分子をコードする遺伝子は、た
いていの正常な成人組織において発現しないが、腫瘍細
胞において発現する。そこで、TRAPをコードする遺伝子
が単離され、クローン化された。そして、それはここに
開示された本発明の一部を表すものである。

該遺伝子は、単離かつ精製される腫瘍拒絶抗原前駆体
及びTRAそれ自体の源として有用であり、それらのどち
らも、抗原が「マーカー」となる癌の治療のため、及び
腫瘍学に対する様々な診断及び監視機構アプローチにお
いて、薬剤として使用できるものであり、以下に論述す
る。例えば、tum^-細胞を使用し、異なるtum^-抗原を発現
する細胞及びtum⁺細胞を溶解するCTLを生じることが知
られている。例えば、マリヤンスキ（Maryanski）ら
著、Eur.J.Immunol 12:401（1982）及びファンデンアイ
ンド（Van den Eynde）ら著、Modern Trends in Leukem
ia IX（1990年６月）を参照されたい。これらの開示は
参考文献としてここに含まれるものとする。腫瘍拒絶抗
原前駆体は、遺伝子によりトランスフェクトされた細胞
において発現されてもよく、その後使用され、対象の腫
瘍に対して免疫応答を生じる。

ヒト腫瘍における類似のケースにおいて、自己白血球
−腫瘍細胞混合培養（autologous mixed lymphocyte−t
umor cell culture）（以下「MLTC」という）は、自己
腫瘍細胞を溶解しかつナチュラルキラーターゲット、自
己EBV−形質転換Ｂ−細胞又は自己線維芽細胞を溶解し
ない応答（responder）リンパ球を頻繁に生じることが
観察された（アニチニ（Anichini）ら著、Immunol.Toda
y 8:385−389（1987）を参照されたい。）。この応答
は、メラノーマについて特によく研究されており、MLTC
は、末梢血細胞又は腫瘍浸潤リンパ球のいずれかにより
行われてきた。この分野における文献の例としては、ク
ヌス（Knuth）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2804
−2802（1984）：ムールジ（Mukherji）ら著、J.Exp.Me
d.158:240（1983）；ヘリン（Herin）ら著、Int.J.Can
c.39:390−396（1987）；トパリアン（Topalian）ら
著、J.Clin.Oncol 6:839−853（1988）があげられる。
安定（stable）細胞障害性Ｔ−細胞クローン（以下「CT
L」という）は、MLTC応答細胞から誘導されるものであ
り、これらクローンは腫瘍細胞に特異的なものである。
ムールジら著、上記参考文献、ヘリンら著、上記参考文
献、クヌスら著、上記参考文献を参照されたい。これら
自己CTLにより腫瘍細胞上に認識される抗原は、新鮮な
腫瘍細胞に見出されるので、これらは培養的アーチファ
クトを表すと思われない。トパリアン（Topalian）ら
著、上記参考文献、デギオバンニ（Degiovanni）ら著、
Eur.J.Immunol.20:1865−1868（1990）を参照された
い。特異的なネズミ腫瘍拒絶抗原前駆体に関する遺伝子
を単離するためにここに使用した技術と結び付けてこれ
らを観察すると、ヒト腫瘍に発現したTRAの腫瘍拒絶抗
原前駆体をコードする核酸配列が単離されることが導か
れた。腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸配列を単離
することが可能となり、そのことは以下に記載する結果
を伴う特定の腫瘍の大部分の特徴を含むが、それらに限
定されるものではない。また、以下に記載した。ヒト腫
瘍拒絶抗原前駆体に関するこれらの単離核酸配列及びそ
れらの適用は本発明の目的である。

本発明のこれら及び様々な他の態様は、以下の開示に
おいて詳しく述べる。

図面の簡単な説明図１は、抗原P815Aを発現するトランスフェクタント
の検出を図示するものである。

図２は、クロム放出アッセイ（chromium release ass
ay）により測定した、様々なCTLにより溶解するクロー
ンP1.HTR、PO.HTR、ゲノムトランスフェクタントP1A.T2
及びコスミドトランスフェクタントP1A.TC3.1の感受性
を示したものである。

図３は、コスミドC1A.3.1の制限地図である。

図４は、遺伝子P1Aの発現のノーザンブロット分析を
示すものである。

図５は、遺伝子P1Aの構造をその制限部位と共に示し
たものである。

図６は、細胞をP815又は正常細胞のいずれかから単離
したP1A由来の遺伝子を用いてトランスフェクトし、そ
の後CTL溶解を試験した時に得られた結果を示すもので
ある。

図７は、肥満細胞系L138.8Aを用いた溶解研究を示す
ものである。

図８は、それもまた抗原を発現する、2.4kbの抗原Ｅ
断片配列のサブフラグメントの地図である。

図９は、遺伝子mage1、２及び３のエクソン３の部位
の相同関係を示すものである。

図10は、様々な組織においてMAGE遺伝子についてノー
ザンブロットを行った結果を示すものである。

図11は、図13のデータを表にしたものである。

図12は、この適用において使用した様々なヒトメラノ
ーマ細胞系を使用したサザンブロット実験を示すもので
ある。

図13は、腫瘍及び正常組織によるMAGE1、２及び３遺
伝子の発現の一般的な構成図である。

配列の簡単な説明配列番号１は、遺伝子P1Aの一部分に関するcDNAであ
る。

配列番号２は、遺伝子P1Aに関するcDNAのコード領域を
示すものである。

配列番号３は、3'から配列番号２のコード領域までのP1
A cDNAに関する非コードDNAを示すものである。

配列番号４は、P1Aに関するcDNAの全配列である。

配列番号５は、P1Aに関するゲノムDNA配列である。

配列番号６は、P1A TRAに関する抗原性ペプチドのアミ
ノ酸配列を示したものである。該配列は、A⁺ B⁺、すな
わちＡ及びＢ抗原の両方を発現する細胞に関するもので
ある。

配列番号７は、抗原Ｅをコードする核酸配列である。

配列番号８は、MAGE−１をコードする核酸配列である。

配列番号９は、MAGE−２に関する遺伝子である。

配列番号10は、MAGE−21に関する遺伝子である。

配列番号11は、MAGE−３に関するcDNAである。

配列番号12は、MAGE−31に関する遺伝子である。

配列番号13は、MAGE−４に関する遺伝子である。

配列番号14は、MAGE−41に関する遺伝子である。

配列番号15は、MAGE−４に関するcDNAである。

配列番号16は、MAGE−５に関するcDNAである。

配列番号17は、MAGE−51に関するゲノムDNAである。

配列番号18は、MAGE−６に関するcDNAである。

配列番号19は、MAGE−７に関するゲノムDNAである。

配列番号20は、MAGE−８に関するゲノムDNAである。

配列番号21は、MAGE−９に関するゲノムDNAである。

配列番号22は、MAGE−10に関するゲノムDNAである。

配列番号23は、MAGE−11に関するゲノムDNAである。

配列番号24は、smage−Ｉに関するゲノムDNAである。

配列番号25は、smage−IIに関するゲノムDNAである。

好ましい態様の詳細な説明本出願の以下に掲げる配列から分かるように、多くの
異なる「MTGE」遺伝子を同定した。以下の実施例に記載
したプロトコールを使用し、これらの遺伝子及びcDNA配
列を単離した。

ここに使用した「MAGE」とは、ヒト細胞から単離した
核酸配列をいう。頭文字語「smage」は、ネズミ起源の
配列を記載するために使用した。

「TRAP」又は「TRA」が腫瘍型に特異的であるとここ
で論議する時、これは、研究中の分子がその型の腫瘍に
関連することを意味するが、必ずしも他の腫瘍型を除外
することを意味するものではない。

実施例１抗原P815Aをコードする遺伝子を同定及び単離するた
め、遺伝子トランスフェクションを使用した。このアプ
ローチには、遺伝子の源及び宿主細胞系の両方が必要で
ある。高率でトランスフェクト可能な細胞系P1.HTRは、
宿主の出発物質であったが、認識されたP815腫瘍抗原の
４つのうちの１つ「抗原Ａ」を示すので、それをさらに
処理せずに使用することはできなかった。ファンペル
（Van Pel）ら著、Molecular Genetics 11:467〜475（1
985）を参照されたい。従って、抗原を発現せず、な
お、P1.HTRの望ましい性質を所有する細胞系を単離する
ため、スクリーニング実験を行った。

これを行うために、腫瘍抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤについ
て特異的なCTLを用いて、P1.HTRをスクリーニングし
た。そのようなCTLはウイテンホーブ（Uyttenhove）ら
著、J.Exp.Med.157:1040−1052（1983）に記載されたも
のである。選別を行うために、10⁶個の細胞P1.HTRを、2
mlの培地の入った丸底チューブに２〜４×10⁶個のCTLク
ローンと共に混合し、３分間、150×ｇで遠心分離し
た。37℃で４時間後、細胞を洗い、10mlの培地に再び懸
濁した。（これは、マリヤンスキ（Maryanski）ら著、E
ur.J.Immunol.12:406〜412（1982）に従って行った）。
CTLアッセイ及びスクリーニングプロトコールに関する
追加の情報は、一般的に、ブーンら著、J.Exp.Med.152:
1184−1193（1980）及びマリヤンスキら著、Eur.J.Immu
nol.12:406−412（1982）に見出すことができる。この
開示は参照文献としてここに含まれるものとする。

これらの選別を行った時、抗原Ａ又はＢのどちらも発
現しない細胞系変異体を見出した。その後、抗原Ｃに特
異的なCTLを用いた追加的選別により、抗原Ｃを欠いた
変異体を生じた。これらのスクリーニングの結果の概要
に関して図２を参照されたい。変異体PO.HTRは、抗原
Ａ、Ｂ及びＣに関して陰性であり、それ故に、トランス
フェクション実験のために選択された。

細胞系PO.HTRを、ブダペスト条約に従い、Institute
Pasteur Collection Nationale De Cultures De Microo
rganismes,28,Rue de Docteur Roux,75724パリ、フラン
スに寄託した。その受託番号はＩ−1117であった。

この方法論は、認識された４つのP815腫瘍抗原、即ち
抗原Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの少なくとも一つを一般的に示す
細胞型の変異体である他の細胞系を獲得するのに適応で
きるものであり、この場合の変異体は抗原Ａ、Ｂ及びＣ
のどれも示さない。P1.HTRは、肥満細胞腫細胞系であ
り、そのため、該プロトコールにより、P815抗原Ａ、Ｂ
及びＣのいずれも発現しないが高率でトランスフェクシ
ョン可能な、生物学的に純粋な肥満細胞腫細胞系を単離
できることが分かるであろう。他の腫瘍型をこの方法で
スクリーニングし、望ましい生物学的に純粋な細胞系を
獲得してもよい。得られた細胞系は、P1.HTRのように、
外来DNAと少なくともトランスフェクション可能である
べきであり、特異的抗原を発現しないように選択される
べきである。

実施例２デプリーン（DePlaen）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85:2274−2278（1988）に示された先行の研究は、コ
スミドライブラリートランスフェクションを用いて、tu
m^-抗原をコードする遺伝子を回収することの有効性を示
したものであり、それは参照文献としてここに含まれる
ものとする。

ウォルフェル（Wolfel）ら著、Immunogenetics 26:17
8−187（1987）の記載に従い、選択的プラスミド及びP
1.HTRのゲノムDNAを製造した。トランスフェクション方
法は、何点か変更したが、コルサロ（Corsaro）ら著、S
omatic Cell Molec.Genet 7:603−616（1981）に従っ
た。簡潔に言えば、ベルナード（Bernard）ら著、Exp.C
ell.Biol.158:237−243（1985）により記載されたよう
に、細胞のDNA 60μｇ及びプラスミドpHMR272のDNA 3μ
ｇを混合した。このプラスミドは宿主細胞にヒグロマイ
シン耐性を与え、従って、トランスフェクタントをスク
リーニングする都合のよい方法を提供するものである。
混合DNAを1mMトリス−HCl（pH7.5）940μｌ、0.1mM EDT
A、及び1M CaCl₂ 310μｌと合わせた。溶液を、1.25ml
の50mMヘペス、280mM NaCl、1.5mM Na₂HPO₄に、一定に
攪拌しながらゆっくりと加え、NaOHでpH7.1に調節し
た。リン酸カルシウム−DNA沈澱物を、室温下、30〜45
分間で形成した。その後、１グループ当たり15グループ
のPO.HTR細胞（５×10⁶）を、10分間、400gで遠心分離
した。上澄みを除去し、ペレットをDNA沈澱物を含有す
る培地に直接再懸濁した。この混合物を20分間、37℃で
インキュベートした後、この混合物を10％ウシ胎児血清
を補足したDMEM 22.5mlを含有する80cm²組織培養フラス
コに加えた。24時間後、培地を元の所へ置いた。トラン
スフェクションの48時間後、細胞を回収し、計数した。
トランスフェクトした細胞を、ヒグロマイシンＢ（350
μg/ml）を補足した培養培地を用いた集団培地において
選択した。この処理により、ヒグロマイシン耐性の細胞
を選択した。

各グループに関して、40mlの培地に８×10⁶細胞をそ
れぞれ含有する２つのフラスコを準備した。トランスフ
ェクタントの数を評価するために、各グループから１×
10⁶の細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS）、0.4％バクト
アガー（bactoagar）、及び300μg/mlヒグロマイシンＢ
を含む5ml DMEMにプレートした。その後、コロニーを12
日後に計数した。２つの独立した測定を行い、平均をと
った。これに５を欠け、相当するグループにおけるトラ
ンスフェクタントの数を評価した。補正は、P815細胞の
クローニング効率に関して行うべきであり、それは約0.
3であることがわかっている。

実施例３上記実施例２に記載したトランスフェクションの８日
後、抗生物質耐性トランスフェクタントを、フィコール
パーク法による密度遠心分離を用いて、死んだ細胞から
分離した。これらの細胞を１又は２日間非選択培地に保
持した。細胞を200μｌの培養培地中の、96ウェルのマ
イクロプレート（丸底）に、30細胞／マイクロウェルの
割合でプレートした。製造したトランスフェクタントの
数により、100〜400のマイクロウェルを製造した。アガ
ーコロニー試験による推定値は、500〜3000であった。
５日後、ウェルは約６×10⁴細胞を含有しており、ウェ
ルの1/10のマイクロプレートに移すことによりレプリケ
ートプレートを製造し、その後、それを30℃でインキュ
ベートした。１日後、マスターのプレートを遠心分離
し、培地を除去し、P815抗原Ａに対する750のCTL（CTL
−P1:5）を、40U/ml組み換えヒトIL−２を含むCTL培養
培地及び刺激細胞（stimulator cell）を殺すためのHAT
培地に、照射した同系支持（feeder）脾臓細胞10⁶と共
に各ウェルに加えた。６日後、CTLが増殖したウェルを
同定するために可視的にプレートを試験した。プレート
がマイクロ培養物（microculture）の増殖を示した場合
には、ウェルの100μｌのアリコートを、⁵¹Cr標識したP
1.HTR標的細胞を含む他のプレート（１ウェル当たり２
×10³〜４×10³）に移し、４時間後にクロム放出を測定
した。高いCTL活性を示すものに相当するレプリケート
マイクロ培養物を、10％FCSを含むDMEMにおいて制限し
た希釈液により膨潤し、クローン化した。５日後、上記
のような可視的溶解アッセイにおいて、約200のクロー
ンを収集し、CTL.P1:5細胞系を用いてスクリーニングし
た。これらの結果について図1Aを参照されたい。

これらの実験において、トランスフェクタントの15の
グループのうちの３つは、２、３の陽性マイクロ培養物
を生じた。これらのマイクロカルチャーを、上記のよう
にP1.HTRに対する溶解活性について試験した。増殖が観
察されたほとんどのマイクロカルチャーは、溶解活性を
示した。図1Bに示すように、この活性は十分にバックグ
ラウンド以上であった。この図は、２つのグループの細
胞（グループ「５」及び「14」）、400及び300マイクロ
ウェルに30のヒグロマイシン耐性トランスフェクト細胞
を播種したデータをまとめたものである。マイクロ培養
物の増殖及び複製の後、抗−A CTL P1:5を添加した。６
日後、P1.HTRに対する溶解活性を試験した。図におい
て、それぞれの点は、単一のマイクロ培養物の溶解活性
を表すものである。

幾つかの陽性ウェルに相当する複製マイクロ培養物を
サブクローン化し、１％より多いサブクローンが、抗−
A CTLにより溶解されることを見出した。従って、P815A
を発現する３つの独立したトランスフェクタントは、3
3,000のヒグロマイシン耐性トランスフェクタントから
得られた。以後、P1A.T2と呼ぶ、これらの系の１つをさ
らに試験した。

P1A.T2に関連した抗原プロフィールを図２に示す。こ
れは、上記の型の抗−CTLアッセイにより得られたもの
である。

実施例４ P1A.T2について行ったCTLアッセイにより、それが抗
原Ａ（「P815A」）を示したこと及びそれ故にP1.HTRか
らの遺伝子を受けたことが示された。その結果として、
この細胞系を、以下の実験において抗原前駆体に関する
遺伝子の源として使用した。

先行の研究により、tum^-抗原をコードする遺伝子は、
コスミドライブラリーを用いて得られたトランスフェク
タントから直接回収され得ることが示された。デプリー
ン（Deplean）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2274
−2278（1988）を参照されたい。この方法は、P815遺伝
子の回収に従った。

P1A.T2のゲノムDNA全体を、制限エンドヌクレアーゼS
au 3A1を用いて部分的に消化し、NaCl密度勾配超遠心分
離により分別し、35〜50kbDNA断片に濃縮した。これら
は、グロスベルド（Grosveld）ら著、Gene10:6715−673
2（1982）に従って行った。これらの断片を、バッテス
（Bates）ら著、Gene 26:137−146（1983）に記載され
たように、C2RBのコスミドアームに結合した。この開示
は、参照文献としてここに含まれるものとする。これら
のコスミドアームは、Sma Iによる開裂及び子ウシ腸フ
ォスファターゼによる処理、続いてBamH Iによる消化に
より得られた。グロスベルドらの上記文献に従い、結合
したDNAをλファージコンポーネントにパッケージング
し、E.coli ED 8767に滴定した。挿入したDNAのμｇあ
たり約９×10⁵のアンピシリン耐性コロニーを得た。

コスミドグループは、10mM MgCl₂中のED 8767 2mlと3
0,000の独立したコスミドを混合することにより増殖さ
せ、20分間、37度でインキュベートし、20mlのルリアベ
ルタニ（「LB」）培地で希釈し、その後１時間インキュ
ベーションした。この懸濁液を滴定し、アンピシリン
（50μg/ml）の存在するLB培地１リットルを接種するた
めに使用した。細菌濃度２×10⁸細胞/ml（OD₆₀₀＝0.8）
において、10mlアリコートを凍らせ、200μg/mlのクロ
ラムフェニコールを、一晩インキュベーションするため
に培養物に加えた。全コスミドDNAを、アルカリ溶解方
法により単離し、CsCl勾配において精製した。

これらの実験において、650,000コスミドのライブラ
リーを作製した。増殖プロトコールは、約30,000コスミ
ドの21グループを使用することを含んでいた。

実施例５上に言及したコスミドの21グループ、（60μｇ）及び
４μｇの上記のpHMR272を用い、５×10⁶のPO.HTR細胞の
グループをトランスフェクタント宿主として使用した。
トランスフェクションを、前の実験において記載したの
と同じ方法において行った。記載したようなCTLアッセ
イを再び用い、１グループ当たり平均3000のトランスフ
ェクタントを抗原発現について試験した。コスミドの１
グループは、約1/5,000薬剤耐性トランスフェクタント
の頻度において、陽性トランスフェクタントを繰り返し
生成した。P1A.T2による、トランスフェクタントは、抗
原Ａ及びＢの両方の発現を示した。トランスフェクタン
トP1A.TC3.1の発現のパターンを図２に示す。

実施例６上記実施例５に示したように、P815A抗原を提示する
３つの独立したコスミドトランスフェクト細胞を単離し
た。これらのトランスフェクタントのDNAを単離し、λ
ファージ抽出液を用いて直径パッケージングした。これ
はデプリーン（DePlaen）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 85:2274−2278（1988）に従って行った。得られた生
成物を、実施例５において記載したように、E.coli ED
8767に滴定し、アンピシリンによる選択を行った。同様
に、コスミドの増殖及びトランスフェクションを、PO.H
TRを再び使用し、実施例５に従って行った。

以下の表１に記載したように、高頻度のトランスフェ
クションが観察された。

コスミドを制限酵素を用いて分析し、直接パッケージ
したトランスフェクタントP1A.TC3.1が32のコスミドを
含んでおり、そのうちの７つは異なっていたことが見出
された。これら７つのコスミドを、上記の方法におい
て、上記のプロトコールに従ってPO.HTRにトランスフェ
クトし、トランスフェクタントがP815Aを示すかどうか
について研究した。４つのコスミドトランスフェクタン
トはP815Aを示し、ここに記載したすべての実験におい
てP815Bを共に発現した。

２つの抗原の発現を示すコスミド４つのうち、コスミ
ドC1A.3.1は、長さがたったの16.7キロ塩基であり、こ
れを選び下記のさらなる分析を行った。

コスミドC1A.3.1を制限エンドヌクレアーゼ分析にか
け、図３に示す地図を作製した。

すべてのEcoR I断片を、上記プロトコールを再び用い
てトランスフェクトし、7.4キロ塩基の断片のみが、抗
−A CTLが溶解できるトランスフェクタントを生成し
た。同様の実験をPst I断片について行い、溶解可能な
トランスフェクタントを製造した7.4kb EcoR I断片内に
4.1kb断片のみが十分に含まれていた。

この断片（即ち、4.1kb Pst I断片）をSma Iで消化
し、2.3kb断片を得た。それは、トランスフェクション
の後に抗原Ａ及びＢを提示する宿主細胞を生成した。最
後に、Sma I/Xba Iで獲得されさ長さ900塩基の断片は、
これら二つの抗原の前駆体、即ち、抗原Ａ及び抗原Ｂの
両方を提示するトランスフェクトされた宿主細胞の発現
を移入した。

実施例７上記900塩基断片を、親細胞系P1.HTRにおけるP815A遺
伝子の発現を検出するプローブとして使用した。これを
完了するため、デービス（Davis）ら著、Basic Methods
In Molecular Biology（Elseview Science Publishing
Co,ニューヨーク）（1986）に記載のグアニジン−イソ
チオシアネート法を用いて、全細胞性RNAを、まず単離
した。オリゴdTセルロースカラムクロマトグラフィーを
用いてポリA⁺mRNAを単離し、生成するのに使用した方法
は、同じ文献を源としている。

その後、サンプルをノーザンブロット分析にかけた。
RNAサンプルを、0.66Mホルムアルデヒドを含有する１％
アガロースゲルにおいて分別した。ゲルを、ニトロセル
ロース膜において一晩ブロッティングする前に、30分
間、10×SSC（SSC:0.15M NaCl;0.015M クエン酸ナトリ
ウム、pH7.0）で処理した。その膜を２時間、80℃で焼
き、その後10％硫酸デキストラン、１％SDS及び1M NaCl
を含有する溶液において、60℃で15分間プレハイブリダ
イズした。その後、変性したプローブ（該900塩基断
片）を用い、サケの精液DNA 100μg/mlを一緒に用い
て、ハイブリダイゼーションを行った。

このプロトコールを、P1.HTRポリA⁺RNAを用いて行っ
た時、図４のライン１（６μｇのRNA）に示すように1.2
kbのバンド及び二つの弱いバンドが確認された。同じプ
ローブを使用し、細胞系のポリ−A⁺から製造したcDNAラ
イブラリーをスクリーニングした。これにより、1kbの
挿入物をもつクローンが生成され、これは5'末端が欠損
していることを示唆するものである。

各ケースにおけるハイブリダイゼーション実験を一
晩、60℃において行った。ブロットを、室温において２
×SSCにより２回、60℃において１％SDSを補足した２×
SSCにより２回洗った。

前述の実験は、配列決定をするのに十分なP815A抗原
前駆体を発現するDNAを、周知のサンガージデオキシチ
ェーンターミネーション法を用いて叙述したものであ
る。これを、様々な制限エンドヌクレアーゼを使用し、
合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた特定のプラ
イミングを行うことにより、生じたクローンにおいて行
った。遺伝子のエクソンに関する結果を、配列番号４に
示した。

実施例８上記ノーザン分析は、cDNAの5'末端が欠損しているこ
とを示唆した。この配列を得るため、cDNAを、位置320
−303に相当するプライマーを使用してP1.HTR RNAから
作製した。その後、位置286−266に相当する3'プライマ
ー及び5'プライマーを使用するポリメラーゼチェーンリ
アクションを用いて、配列を増幅した。これは、フロー
マン（Frohman）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:899
8−9002（1988）に記載されている。サザンブロットに
おいて上記の900bp Sma I/Xba I断片にハイブリダイズ
した、予期されたサイズ（270塩基）のバンドを見出し
た。m13tg 130λtg 131へのクローニングの後、小さな2
70bp断片の配列を決定した。その配列を配列番号１に示
した。

実施例９実施例７及び８に記載し、配列番号４に示した配列を
獲得した後、コスミドC1A.3.1の5.7kbの領域の配列を決
定した。この配列が、トランスフェクタントにおいてP8
15Aを発現する900塩基断片を含むことはわかっていた。
コスミドが開始点においてゲノムであるので、この実験
は、イントロン及びエクソンの描写を可能とした。

この遺伝子の描写した構造を図５に示す。配列番号４
と共に、これらのデータにより、以後「P1A」と呼ばれ
る抗原前駆体の遺伝子が、長さ約５キロ塩基対であり、
３つのエクソンを含むことが示された。224アミノ酸の
タンパク質についてのORFは、エクソン１において出発
し、エクソン２において終了する。抗原Ａ及びＢの前駆
体の発現を移入する900塩基対断片は、エクソン１を含
むのみである。プロモーター領域は、配列番号１に示さ
れるようなCAATボックス及びエンハンサー配列を含むも
のである。この後者の特徴は、ゲラーティ（Geraghty）
ら著、J.Exp.Med 171:1−18（1990）；キムラら著、Cel
l 44:261−272（1986）に観察されたように、たいてい
のMHCクラスＩ遺伝子のプロモーターにおいて観察し
た。

リップマン（Lipman）ら著、Science 227:1435−1441
（1985）に示されたような３及び６のＫ−トリプルパラ
メーターを用いたフラグラムFASTA、及びGenbankデータ
ベースリリース65（1990年10月）を使用し、コンピュー
タによる類似性の研究を行った。エクソン１（位置524
−618）によりコードされる酸領域の一部に相当する95
塩基の範囲以外に相同性は見出されなかった。該範囲
は、ボウアボン（Bourbon）ら著、Mol.Biol.200:627−6
38（1988）及びシュミット−ザッツマン（Schmidt−Zac
hmann）ら著、Chromosoma 96:417−426（1988）により
記載されたようなマウス核小体タンパクNO38/B23におけ
る酸性領域をコードする配列と同様のものである。95塩
基の56は同一であった。これらの相同性がクロスハイブ
リダイジングのためであるかどうかを試験するために、
900塩基断片を用いてスクリーニングしたマウス脾臓cDN
Aライブラリーを使用して実験を行った。クロスハイブ
リダイジングのバンドのサイズに正確に対応するcDNAク
ローンを得た。これらを部分的に配列決定し、2.6kb cD
NAが、マウス小核素の報告されたcDNA配列に相当し、1.
5kb cDNAがマウス核小体タンパクNO38/B23に相当するこ
とを見出した。

以下において「P1A」と呼ばれる遺伝子のヌクレオチ
ド配列の分析により、そのコード生成物が25kdの分子状
塊を有することが示された。配列番号４を分析すること
により、位置83−118において大きな酸性ドメインと同
じように、残基５−９における潜在的核酸標的シグナル
（ディングウォール（Dingwall）ら著、Ann.Rev.Cell B
iol.2:367−390（1986））が示された。上記のように、
これは、P1Aと二つの核小体タンパクの間の相同性の領
域を含むものである。推定上のリン酸化部位は、位置12
5（セリン）において見出すことができる。また、第二
の酸性ドメインは、14グルタメート残基の連続した範囲
としてＣ−末端近くに見出される。同様のＣ−末端構造
は、核酸の定位を有するネズミのホメオドメイン（home
odomain）タンパクにおいて、ケッセル（Kessel）ら
著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5306−5310（1987）に
より見出された。

遺伝子P1Aの配列をP91A、35B及びP198の配列と比較す
る研究において、P1Aは遺伝子及び抗原の異なるクラス
を表示することが分かり、類似点は見出されなかった。

実施例10 バンドにおけるP1Aプローブ及び配列を用いて、正常
組織に存在する遺伝子が、腫瘍により発現されるものと
同一であるかどうかを測定するために研究を行った。こ
れを行うために、ファージライブラリーを、λzap II 1
0及びDBA2ネズミ腎臓細胞のゲノムDNAを使用して作製し
た。P1Aをプローブとして使用した。ハイブリダイゼー
ション条件は上記のようであり、ハイブリダイズしたク
ローンを見出した。該クローンは、P1A遺伝子の１つ及
び２つのエクソンを含有し、図５の位置0.7〜3.8に相当
した。この配列の限定の後、図５の3.8〜4.5に相当する
配列を得るためにPCR増幅を行った。

配列分析を行ったが、正常腎臓由来の遺伝子とP815腫
瘍細胞から得たP1A遺伝子の間に差異は見出されなかっ
た。

さらなる実験において、DBA/2腎臓細胞に見出された
ような遺伝子を、上記のように、PO.HTRにトランスフェ
クトした。図７に描写して示したこれらの実験により、
抗原Ａ及びＢが、正常腎臓細胞から単離したP1A遺伝子
を用いたのと同じくらいに、正常腎臓細胞から単離した
腎臓遺伝子によって効率的に発現したことが示された。

これらの実験により、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードす
る遺伝子が突然変異から得られない遺伝子であるという
結論が導かれ、むしろ、遺伝子が正常細胞に存在するも
のと同じであるが、そこにおいて発現しないということ
が明らかにされた。この研究成果の細部は重要であり、
以下において論述する。

ここに詳論しない研究において、遺伝子の変異体は入
手可能であることが見出された。いくつかの細胞は、正
常「P1A」というよりも「P1A^-B⁺」であった。これらの
間の唯一の差異は、変異体における18番目のトリプレッ
トコードがValの代わりにAlaであるというエクソン１に
おける点突然変異にある。

実施例11 追加の実験を他の細胞型を用いて行った。上記のノー
ザンブロットハイブリダイゼーションについて記載した
プロトコールに従って、正常肝及び脾臓のRNAを試験
し、P1A遺伝子の転写が見出されるか否かを測定した。
ノーザンブロットデータを図４に示した。それから分か
るように、発現の形跡は見られなかった。

P1Aを単離したネズミP815細胞系は、肥満細胞腫であ
る。従って、肥満細胞系を研究し、それらが遺伝子を発
現するか否かを測定した。ナベル（Nabel）ら著、Cell
23:19−28（1981）に記載された肥満細胞系MC/9及び骨
髄誘導肥満細胞の短期間培養物を上記方法（ノーザンブ
ロッティング）において試験したが、転写は見られなか
った。一方、Balb/C誘導IL−３依存細胞系L138.8A（ヒ
ュルトナー（Hultner）ら著、J.Immunol.142:3440−344
6（1989））を試験した時、強いシグナルが見出され
た。肥満細胞の研究を図４に示した。

BALB/C及びDBA/2マウスの両方は、Ｈ−2^dハプロタイ
プを共有することが知られており、上記CTLを用いた溶
解の感受性を試験することか可能であった。図８は、こ
れらの結果を示しており、それは、抗−Ａ及び抗−B CT
Lが細胞を激しく溶解するが、抗−Ｃ及び抗−Ｄ系は溶
解しなかったことを本質的に示している。

さらに、他のネズミ腫瘍細胞系、即ち奇形癌細胞系PC
C4（ブーン（Boon）ら著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:
272−275（1977）及び白血病LEC及びWEH1−3Bにおいて
試験を行った。これらのサンプルのいずれにおいても、
発現は見られなかった。

実施例12 MHC分子によるP1A抗原の実際の提示は、興味深いもの
である。これを試験するため、コスミドC1A.3.1を線維
芽細胞系DAPにトランスフェクトし、それは表現型Ｈ−2
^kを示すものである。細胞系をK^d、D^d、L^d抗原の一つを
発現する遺伝子を用いてトランスフェクトした。コスミ
ド及びMHC遺伝子の両方を用いたトランスフェクション
の後、CTLでの溶解を、再び上記のようにして研究し
た。表２にまとめたこれらの研究により、L^dがP1A抗原
Ａ及びＢの提示に要求されることが示された。

腫瘍拒絶抗原の提示を特異的MHC分子と関連づけること
ができる観察を、以下に詳論するように、ヒト細胞及び
HLA分子を用いた実験において確認した。

実施例13 P1A遺伝子の配列及びそれらから誘導されうるアミノ
酸配列を使用し、A⁺B⁺（即ち、Ａ及びＢ抗原の両方を発
現する細胞の特性）である抗原ペプチド及びA^-B⁺である
抗原ペプチドを確認した。該ペプチドを図10に示す。該
ペプチドを、それを提示する細胞に特異的なCTL細胞系
の存在において、PO.HTR細胞のサンプルに投与した時、
このペプチドはPO.HTR細胞の溶解を導き、そのことによ
り、該遺伝子により発現される生成物に基づくペプチド
をワクチンとして使用できることが公然と支持される。

実施例14 以下にMZ2−MELといわれるヒトメラノーマ細胞系は、
クローナル細胞系ではない。それは、抗原「Ｄ、Ｅ、Ｆ
及びＡ」として公知の自己CTLにより認識される４つの
安定な抗原を発現する。さらに、２つの他の抗原「Ｂ」
及び「Ｃ」が、腫瘍のいくつかのサブライン（sublin
e）により発現する。これらの６つの抗原に特異的なCTL
クローンは、ファンデンアインド（Van den Evnde）ら
著、Int.J.Canc.44:634−640（1989）に記載されてい
る。MZ2−MELのうち、認識されたサブクローンはMEL.4
3、MEL3.0及びMEL3.1である。（ファンデンアインド（V
an dan Eynde）ら著、上記参考文献）。細胞系MEL3.1
は、P815変異体について記載されたような上記CTL研究
により測定した時、抗原Ｅを発現し、そのため、それを
抗原前駆体を発現する核酸配列の源として選択した。

腫瘍拒絶抗原前駆体に関連した核酸配列を単離するこ
とにおいて、上記の開発された技術は、宿主細胞が二つ
の基準に添うことが必要であることを示した：（ｉ）宿
主細胞は、通常の状態において重要なTRAPを発現しては
ならないこと、及び（ii）それが、関連したクラスI HL
A分子を発現しなければならないこと。また、宿主細胞
は、高頻度でトランスフェクションされなければならな
い、即ちそれは「よい」宿主でなければならない。

そのような細胞系を獲得するために、クローナルサブ
ラインME3.1を、ファンデンアインド著、上記参考文献
に記載されたように抗−E CTL 82/30を用いて反復選択
にかけた。選択の反復サイクルにより、サブクローンMZ
2−MEL−2.2 isc E^-の単離が導かれた。このサブクロー
ンは、HPRT^-（即ち、HAT培地:10^-4Mヒポキサンチン、3.
8×10^-7アミノプテリン、1.6×10^-5M 2−デオキシチミ
ジンに感受性）である。該サブクローンを、以下に簡単
に「MEL−2.2」という。

実施例15 MEL3.0のゲノムDNAをウォルフェル（Wolfel）ら著、I
mmunogenetics 26:178−187（1987）に従って製造し
た。この開示は参照文献としてここに含まれるものとす
る。ニコラス（Nicolas）ら著、Cold Spring Harb.,Con
f.Cell Prolif.10:469−485（1983）により記載された
ようなプラスミドpSVtkneoβは、ゲネチシン耐性（gene
ticin resistance）を与えるものであり、そのため、こ
の実験において、コトランスフェクションに関するマー
カーとして使用することができる。

コルサオ（Corsao）ら著、Somatic Cell Molec.Genet
7:603−616（1981）と同様であるが、同一でない方法
に従い、全ゲノムDNA及びプラスミドをコトランスフェ
クトした。該ゲノムDNA（60μｇ）及びプラスミドDNA
（６μｇ）を、940μｌの1mMトリスHCl（pH7.5）、0.1m
M EDTAにおいて混合し、その後310μｌの1M CaCl₂を加
えた。この溶液を、一定の攪拌の下で、1.25mlの２×HB
S（50mM HEPES、280mM NaCl 1.5mM Na₂HPO₄、NaOHを用
いてpH7.1に調整した）にゆっくりと加えた。リン酸カ
ルシウムDNA沈澱物を、30〜45分間、室温において形成
させ、その後、それを10％ウシ胎児血清で補ったメラノ
ーマ培養培地（ダルベッコ改質イーグル培地）22.5mlに
あらかじめ３×10⁶ MEL2.2細胞を24時間播種した80cm²
組織培養フラスコに加えた。24時間後、培地を元の位置
に戻した。トランスフェクションの48時間後、細胞を採
取し、2mg/mlのゲネチシンを補ったメラノーマ培養培地
に、80cm²のフラスコあたり４×10⁶の細胞を播種した。
ゲネチシンを選択マーカーとして提供した。

実施例16 トランスフェクションの13日後、ゲネチシン耐性コロ
ニーを計数し、採取し、２日又は３日間非選択培地にお
いて培養した。その後、トランスフェクトした細胞を、
20％ウシ胎児血清（FCS）を含む培養培地200μｌに、20
0細胞／ウェルの割合で、96ウェルのミクロプレートに
プレートし、ウェルあたり約30の成長コロニーを得た。
ミクロカルチャーの数は、過剰物が得られるようなもの
にし、すなわち、そのために各非依存性トランスフェク
タントは少なくとも４回表されるべきである。

10日後、ウェルは約６×10⁴細胞を含んでいた。これ
らの細胞を取り出し、各ミクロカルチャーの1/3をデュ
プリケートプレートに移した。６時間後、即ち、リード
ヒアレンス（readherence）の後、培地を除去し、1500
の抗−E CTL（CTL 82/30）を、35U/mlのIL−２を含むCT
L培養培地100μｌ中の各ウェルに加えた。１日後、上澄
み（50μｌ）を採取し、以下の実施例に述べる根拠につ
いて、TNF濃度を試験した。

実施例17 哺乳動物のゲノムの大きさは６×10⁶kbである。各薬
剤耐性トランスフェクタントに統合されたDNAの平均量
としては、約200kbであることが予期され、最小量の30,
000トランスフェクタントが試験に必要とされ、抗原Ｅ
がトランスフェクトされるか否かを確認した。ネズミ細
胞を用いた先行研究により、CTL刺激アッセイを使用し
た時、興味深い抗原を発現するたった３％の細胞を含有
するグループを確認できることが示された。これによ
り、30の要因によるアッセイの数が減少されるべきであ
る。上記のように、混合したE⁺/E^-細胞において、抗−E
CTLアッセイは有用であったが、一定の結果が得られな
かったことにおいては十分ではなかった。

その結果として、代わりの方法を案出した。CTLの刺
激を、ここで繰り返す必要のない周知の方法論を使用し
て腫瘍壊死因子（「TNF」）の放出により研究した。実
施例15に記載したように、トランスフェクタントのウェ
ル当たり1500のCTL 82/30細胞を加えた。これらCTLを刺
激の６日後に収集した。上記のように、各ウェルにおい
て1/3の細胞を取り出し、残りの2/3（４×10⁴）をリー
ドヒアした後、CTL及びIL−２をそれに加えた。上澄み5
0μｌを24時間後に除去し、３×10⁴ W13（WEHI−164ク
ローン13;エスペビック（Espevik）ら著、J.Immunol.Me
th.95:99−105（1986）細胞を、50μｌのW13培養培地
（Ｌ−アルギニン（116mg/l）、Ｌ−アスパラギン（36m
g/l）、Ｌ−グルタミン（216mg/l）を補ったRPMI−1640
及び２μｇのアクチノマイシンＤを補った10％FCS）に
おいて含有するミクロプレートに８％CO₂雰囲気中37％
において移した。細胞系W13は、TNFに対して感受性のあ
るマウス線維肉腫細胞系である。RPMI 1640における組
み換えTNF−βの希釈溶液を標的細胞のコントロールに
加えた。20時間のインキュベーションの後、W13培養物
を評価し、死んだ細胞の百分率を、ハンセン（Hansen）
ら著、J.Immunol.Meth.119:203−210（1989）の比色ア
ッセイ適応（an adaptation of the colorimetric assa
y）を用いて測定した。これは、PBS中2.5mg/mlにおいて
50mlの（３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）
−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミドを添加する
ことを含み、その後２時間、37℃においてインキュベー
ションした。暗青フォルマザン（formazan）結晶を、10
0μｌの溶解溶液（１容量のN,Nジメチルホルムアミドを
２容量の30％（W/V）ドデシル硫酸ナトリウムを含有す
る水と混合し、1.6％酢酸及び2.5％1N HClを用いてpH4.
7にした。）を加えることにより溶解した。プレートを3
7℃で一晩インキュベートし、ODを570mnで測定し、コン
トロールにおいては650nmを使用した。死んだ細胞の百
分率を以下の式により測定した。

これは、エスペビック（Espevik）ら著、J.Immunol.Met
h.95:99−105（1986）に従うものである。結果は、E⁺/E
^-細胞の比率が1/45であるくらいに低かった時でさえ、T
NFの有意な生成物が観察されることを示し、従って、活
性なCTLを示すものである。これは、30のグループにお
ける薬剤耐性トランスフェクタントを試験するための解
決法を導くものである。

実施例18 上記実施例17において論議したように、細胞をTNF産
生について試験した。100グループのE^-細胞（４×10⁶細
胞／グループ）の全部を、トランスフェクションの後に
試験し、１グループ当たり平均700であって、７×10⁴の
非依存性ゲネチシン耐性トランスフェクタントを得た。
トランスフェクトした細胞のたった一つのグループをミ
クロカルチャーに入れ、TNFを製造するために抗−Ｅ抗
原CTLクローン82/30を生成した。試験したクローン300
のうち、８つが陽性であった。その後、これらのクロー
ンを抗−E CTLによる溶解について、標準⁵¹Cr放出アッ
セイを用いて試験し、それらは元のE⁺細胞系と同様に効
率的に溶解することが見出された。ここに論議したトラ
ンスフェクタントE.T1は、抗原Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＦに対す
るCTLについてMEL2.2が行ったのと同じ溶解パターンを
有した。

たった一つのトランスフェクタントが70,000ゲネチシ
ン耐性トランスフェクタントから抗原を示したという現
実性は、非常に低いと最初は思われたが、それは違う。
P815に関する上記の研究は、平均的に1/13,000の頻度を
示した。ヒトDNA宿主MEL2.2は、P1.HTRよりも５倍低いD
NAを結合すると思われる。

実施例19 いったん、トランスフェクタントE.T1が見出されたな
らば、分析により、細胞集団のE⁺不純物が生じるかどう
かを含む幾つかの問題が処理されなければならなかっ
た。上記の抗原提示の分析により、E.T1が宿主細胞MEL
2.2と同様にB^-及びC^-であることが示される。また、標
準選択方法を用いて、HPRT^-であることも見出された。
しかし、ここに記載した研究に使用したすべてのE⁺細胞
はHPRT⁺であった。

MEL2.2のE⁺復帰突然変異体はE.T1の源であることも可
能であった。これを試験するために、コトランスフェク
トされた配列は宿主ゲノムの単一の位置において一緒に
通常結合されるというペルチョ（Perucho）ら著、Cell
22:309−317（1980）による観察を使用した。もし、ト
ランスフェクタントにおける抗原ＥがpSVtkneoβを用い
たコントランスフェクションから生じるならば、その
後、配列は結合されるべきであり、抗原の遺伝子欠失
は、隣接のpSVtkneoβ配列を削除するかもしれなかっ
た。ウォフェル（Wofel）ら著、上記参考文献は、この
ことを真実であると示した。もし、正常E^-細胞がpSVtkn
eoβでトランスフェクトされるならば、その後配列は結
合されるべきであり、抗原の欠失は、隣接のpSVtkneoβ
配列を削除するかもしれなかった。しかし、もし、pSVt
kneoβでトランスフェクトした正常E⁺細胞がE.T1である
ならば、「共遺伝子欠失（co−deletion）」は起こるべ
きでなかった。これを試験するために、トランスフェク
タントE.T1を上記のように、82/30を用いた免疫的選択
にあてた。このCTLによる溶解に抵抗した二つの抗原損
失変異体が得られた。これらのどれもゲネチシン耐性を
失わなかったが、サザンブロット分析は、変異体におけ
る幾つかのneo^r配列の損失を示した。これは、E.T1にお
けるＥ遺伝子とneo^r遺伝子の間の緊密な結合を示すもの
であり、E.T1がトランスフェクタントであることを結論
として導くものである。

実施例20 E⁺サブクローンMZ2−MEL 4Bを、コスミドライブラリ
ーの作製のDNAの源として使用した。上記のコスミドト
ランスフェクションプロトコールに従って、約700,000
コスミドのこのライブラリーをMZ2−MEL 2.2の細胞にト
ランスフェクトした。

λファージコンポーネントに直接コスミドトランスフ
ェクタントのDNAをパッケージングすることにより、重
要な配列を含むコスミドを回収することが時々可能であ
る。この方法はここでは成功しなかったので、我々はコ
スミドベクターpTL6の適切な制限断片にトランスフェク
タントのDNAを結合することによりトランスフェクト配
列を救済することにした。これには、二つのトランスフ
ェクタントを用いて挑戦し、これらのうちの一つが成功
した。B3と呼ばれる一つのコスミドをこの実験から回収
し、Xma I又はBamH I消化により制限エンドヌクレアー
ゼ消化を行い、大きな12kb Xma Iトランスフェクト断片
を得た。該断片をベクターpTZ 18Rにクローン化し、そ
の後MEL2.2にトランスフェクトした。再びTNF産生を測
定し、成功したトランスフェクションを決定した。実験
により、12kb Xma I断片、その後、12kbのセグメントの
BamH I消化物の2.4kb断片において、抗原Ｅをトランス
フェクトすることができる遺伝子配列を決定した。

2.4kb断片を、MZ2−MELから得た2.4kb断片及び患者MZ
−２のＴ細胞クローンとハイブリダイズし、サザンブロ
ット（BamH I/Sma I消化DNA）により測定した。このバ
ンドは、図12に見られるようにMZ2−MELのE^-抗原損失変
異体にはない。

Ｅ抗原前駆体遺伝子に関する配列を決定した。それを
以下に示す。

実施例21 2.4kbゲノム断片を同定した後、「E⁺」サブラインが
いずれかの相同DNAを発現するか否かを測定する研究を
行った。細胞系MZ2−MEL3.0を源として使用し、cDNAラ
イブラリーを、当技術分野に公知の技術を使用して、そ
のmRNAから製造した。2.4kb断片をプローブとして使用
し、約1.8kbのmRNAを、ノーザンブロット分析を使用し
て相同性と同定した。cDNAをスクリーニングした時、2.
4kb断片の一部とほとんど完全に同一であることを示す
クローンを得た。従って、二つのエクソンが同一であっ
た。2.4kb BamH I断片の前に置いたコスミドB3の断片の
配列を決定することにより、追加のエクソンをこれらの
上流側に置いた。該遺伝子は、図８に示すように約4.5k
b以上に広がっている。転写領域の出発位置は、cDNAの
5'末端に関するPCRを用いて確実にした。３つのエクソ
ンは、65、73及び1551塩基対を含むものである。ATG
は、エクソン３の位置66に位置し、枠を読む828塩基対
が続く。

実施例22 2.4kb断片のより小さな断片が、抗原Ｅの発現を移入
することができるか否かを測定するために、当技術分野
に認識された技術を用いて、より大きな遺伝子に相当す
るより小さな片を作製し、E^-細胞に移入した。図８は、
３つの断片の境界（boundary）を示している。

この方法における抗原発現の移入は、この遺伝子が、
抗原を活性化するタンパク質をコードするよりもむしろ
抗原前駆体についてコードすることを示している。

実施例23 驚くべきことに、上記cDNAのプロービングにより、二
つの異なっているが緊密に関連したcDNAが示された。試
験した時、これらのcDNAは、抗原Ｅの発現を移入しなか
ったが、それらは第一のcDNA断片に対する実質的な相同
性を示した。３つの断片は、「メラノーマ抗原」につい
て「MAGE」と呼ばれる、遺伝子の新しく認識されたファ
ミリーを示すと思われる。図９において、「mage−１」
は、MZ2細胞由来の抗原の発現を示している。各遺伝子
の第３のエクソンの位置を、図９に示す。第２及び第３
の配列は、第１のものよりも互いにより緊密に関連して
いる（第1;12％に比べて互いに18.1及び18.9％の差
異）。得られた9cDNAクローンのうち、同じ発現を示す
３つの各タイプが得られた。以下に、使用した「MAGE」
は、分子のファミリー及びそれらをコードする核酸をい
うものである。これら核酸は、一定の程度の相同性を与
え、ヒト腫瘍細胞の幾つかのタイプを含有する腫瘍細胞
及びヒト腫瘍細胞に発現する。第一のメンバーがヒトメ
ラノーマ細胞において同定されるので、そのファミリー
は「MAGE」といわれる。しかし、以下の実験が示すよう
に、MAGEファミリーのメンバーは、メラノーマ腫瘍に少
しも限定されない：むしろ、MAGEは、腫瘍拒絶抗原前駆
体のファミリー及びそれらをコードする核酸配列をい
う。それらから得られた抗原を、ここでは、「MAGE TR
A」又は「メラノーマ抗原腫瘍拒絶抗原」という。

実施例24 マウス腫瘍を用いた実験は、Ｔ−細胞により認識され
た新しい抗原が、領域において活性化遺伝子を改質する
点突然変異から生じ、それが新しい抗原ペプチドをコー
ドすることを示した。新しい抗原を、最も正常な細胞に
おいて発現されない遺伝子の活性化から生成することが
できる。抗原MZ2−Ｅに関するこの組織を解明するため
に、メラノーマ細胞に存在するmage−１遺伝子を患者MZ
2の正常細胞に存在するものと比較した。

2.4kb断片の第一の半分をカバーする1300bpの長さを
囲っているプライマーを使用して、フィトヘムアグルチ
ニン活性化血液リンパ球のDNAのポリメラーゼチェーン
リアクション（PCR）による増幅を行った。予期された
ように、PCR生成物が得られたが、E^-変異体のDNAではな
にも得られなかった。このPCR生成物の配列は、E⁺メラ
ノーマ細胞に保持される遺伝子に相当する配列と同一で
あることが証明された。さらに、抗原MZ2−３は、クロ
ーン化したPCR生成物でトランスフェクトした細胞によ
り発現したことが見出された。この結果は、通常不活動
な遺伝子の活性化が、腫瘍拒絶抗原MZ2−Ｅの出現の原
因となることを示している。

実施例25 様々な正常及び腫瘍細胞による遺伝子mage−１の発現
を評価するために、第三のエクソンのほとんどをカバー
するプロープでハイブリダイズし、ノーザンブロットを
行った。ヒト腫瘍細胞系MZ2−MEL 3.0で観察した結果と
対照的に、患者MZ2のCTLクローン及び同じ患者のフィト
ヘムアグルチニン活性化血液リンパ球から単離したRNA
ではバンドは観察されなかった。また、他の個体の幾つ
かの正常組織は陰性であった（図10及び図11）。他の患
者の14のメラノーマ細胞系を試験した。様々な強度のバ
ンドを示して、11のものが陽性であった。これらの培養
細胞系の他に、メラノーマ腫瘍組織の４つのサンプルを
分析した。遺伝子の発現が組織培養アーチファクトを示
すという可能性を除いて、患者MZ2の転移を含む二つの
サンプルが陽性を示した。肺の腫瘍を含む他の組織学的
タイプの２、３の腫瘍を試験した。これらの腫瘍のほと
んどは陽性であった（図10及び図11）。これらの結果
は、MAGE遺伝子ファミリーが幾つかのメラノーマ及びさ
らに他の腫瘍により発現することを示した。しかし、遺
伝子mage−１、２又は３に相当するDNAプローブを考え
られる範囲まで交雑ハイブリダイズしたので、３つの遺
伝子がこれらの細胞により発現されることに関しては明
らかに指摘されなかった。この分析をより明らかにする
ために、PCR増幅及び高い特異性のあるオリゴ−ヌクレ
オチドプローブを使用した。cDNAが得られ、ここで論議
した３つのMAGE遺伝子と同一のエクソン３の配列に相当
するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、PCRによ
り増幅した。その後、PCR生成物を、３つの遺伝子の一
つについて完全な特異性を示す３つの他のオリゴヌクレ
オチドにハイブリダイズするそれらの可能性について試
験した（図９）。陰性の細胞由来のRNAにおけるメラノ
ーマMZ2−MEL3.0のRNAを希釈することにより行ったコン
トロール実験は、ここに使用した条件の下、シグナルの
強さが希釈液に比例して減少したこと及び陽性のシグナ
ルが1/300の希釈液においてもまだ検出できることを示
した。PCRにより試験した正常細胞（リンパ球）は、３
つのMAGE遺伝子の発現に関して陰性であることが確証さ
れ、それ故に、MZ2メラノーマ細胞系の1/300より少ない
発現レベルを示すものである（図11）。メラノーマ細胞
系のパネルに関して、結果は、他がmage−２及び３を発
現したのみであるのに対し、幾つかのメラノーマがMAGE
遺伝子のmage1、２及び３を発現したことを明らかに示
した（図11及び10）。他の腫瘍の幾つかもまた、３つす
べての遺伝子を発現したのに対し、他のものはmage−２
及び３のみ又はmage−３のみを発現した。いくつかの陽
性PCR結果は、プライミング及びハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドの配列を共有する他の緊密に関連した
遺伝子以外の３つの特徴的なMAGE遺伝子の一つの発現を
示さないことを、形式的に除外することは不可能であ
る。MAGE遺伝子ファミリーは異なる腫瘍の大きな配列に
より発現されること及びこれらの遺伝子はこの点につい
て試験される正常細胞において不活動性であることが推
論できる。

実施例26 高率でトランスフェクトし、TRAPを効率的に発現する
配列の入手可能性は、関連した主要組織適合抗原遺伝子
（MHC）クラスＩ分子の探索を可能にした。患者MZ2のク
ラスＩ特異性は、HLA−A1、A29、B37、B44及びC6であ
る。MZ2と一緒にA1を有する患者の４つの他のメラノー
マを、2.4kb断片及びpSVtkneoβでコトランスフェクト
した。それらのうちの３つは、CD8＋である抗−E CTLク
ローン82/30によりTNF放出を刺激したneo^rトランスフェ
クタントを生じた（図10）。E^-トランスフェクタント
は、４つの他のメラノーマにより得られず、それらの幾
つかはMZ2と共にA29、B44又はC6を共有した。これは、
抗原MZ2−Ｅに関する提示分子がHLA−A1であることを示
唆するものである。確認として、HLA−A1患者の腫瘍か
ら誘導される６つのメラノーマ細胞系の中の、２つが患
者MZ2の抗−E CTLクローン82/30によりTNF放出を刺激し
たことが見出された。これら腫瘍細胞系の一つであるMI
13443−MELは、これら抗−E CTLによる溶解に高い感受
性を示した。これら２つのメラノーマは、mage−１遺伝
子を発現したものであった（図13）。A1を含まなかった
HLAハプロタイプを有する患者の８つのメラノーマを、
溶解に対するそれらの感受性及びCTLによる刺激TNF放出
に対するそれらの能力について試験した。陽性のものは
見出されなかった。原腫瘍と共に好適なHLA特異性を共
有する同種腫瘍を溶解するいくつかのヒト抗−腫瘍CTL
の能力は、前に記載された（ダロー（Darrow）ら著、J.
Immunol.142:3329（1989））。遺伝子mage2及び３によ
りコード化された抗原ペプチドを、HLA−A1又は他のク
ラスＩ分子により自己CTLに提示することができること
は、具体的には、上に詳説したようにネズミ腫瘍を用い
て見出された同様の結果からみて、ほとんど可能であ
る。

実施例27 上記のように、メラノーマMZ2は抗原Ｆ、Ｄ及びA'さ
らに抗原Ｅを発現した。抗原Ｅをコードする核酸配列の
単離の後に、同様の実験を行い、抗原Ｆをコードする核
酸配列を単離した。

これを行うために、細胞系MZ2−MEL2.2の培養物、上
記E^-細胞系を、抗−E CTLクローンを用いて処理する為
に記載した同じ方法において、抗−F CTLクローン76/6
を用いて処理した。これによりＦ抗原損失変異体が単離
され、その後、いくつかのラウンドの選別にかけた。得
られた細胞系「MZ2−MEL2.2.5」は、抗−F CTLによる溶
解に完全に耐性であったが、抗−D CTLにより溶解する
ことが確かめられた。

再び、抗原−Ｅ前駆体DNAの単離について示したプロ
トコールに従って、F^-変異体を、F⁺細胞系MZ2−MEL3.0
由来のゲノムDNAでトランスフェクトした。実験によ
り、90,000の薬剤耐性トランスフェクタントを生じた。
これらを、上記に詳述したTNF検査アッセイにおいて、3
0細胞のプールを使用することにより、MZ2−Ｆ発現につ
いて試験した。一つのプールは、抗−F CTLによりTNF放
出が刺激され、クローン化された。145クローンのうち
の５つは、抗−F CTLを刺激することが見出された。上
記プロトコールに従って行った溶解アッセイにより、
（ｉ）抗原Ｆをコードする遺伝子の発現及び（ii）抗原
Ｆ自身の提示が確認された。

実施例28 F⁺細胞系の同定の後、そこから得たDNAを、細胞をト
ランスフェクトするために使用した。これを行うため
に、再び上記プロトコールを使用し、F⁺細胞系MZ2−ME
L.43のコスミドライブラリーを作製した。ライブラリー
を約50,000コスミドの14グループに分け、各グループの
DNAをMZ2−MEL2.2.5にトランスフェクトした。その後、
トランスフェクタントを、抗−F CTLクローン76/6から
のTNF放出を刺激するその能力について試験した。コス
ミドの14グループのうち、１つは抗原Ｆを発現する２つ
の独立トランスフェクタントを生じた;17,500ゲニチシ
ン耐性トランスフェクタントのうち２つが陽性であると
いう収率であった。

実施例29 遺伝子ファミリーの存在を、サザンブロットにおいて
観察されたパターンにより示した（図12）。これを行う
ために、抗原M22−Ｅの発現を移入した2.4kb BamH I断
片を32pで標識し、Ｅ＋クローン化サブクローンM22−ME
L2.2のBamH I消化DNAのサザンブロットにおいてプロー
ブとして使用した。ハイブリダイゼーション条件として
は、50μl/cm²の3.5×SSC、１×デンハーツ（Denhaard
t's）溶液;25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、0.5
％SDS、2mM EDTAを含み、ここで2.4kbプローブを、［α
³²p］dCTP（２−3000Ci/モル）により、３×10⁶cpm/ml
で標識した。ハイブリダイゼーションを18時間、65℃に
おいて行った。この後、膜を65℃で、それぞれ１時間、
２×SSC、0.1％SDSにおいて４回洗い、最後に、30分
間、0.1×SSC、0.1％SDSにおいて洗った。ハイブリダイ
ゼーションを確認するために、膜を、コダックＸ−ARフ
ィルム及びコダックＸ−オマティックファイン増強クリ
ーンを使用してオートラジオグラフ化した。

以下の実施例において、「ハイブリダイゼーション」
という時はいつでも、使用した厳格な条件は上記のもの
と同様であった。ここに使用した「厳格な条件」とは上
記の条件をいい、決まりきった当技術分野に認識された
改良が行われると仮定した。

実施例30 mage4をコードするcDNAを、ヒトサルコーマ細胞系LB2
3−SARのサンプルから同定した。この細胞系はmage1、
２又は３を発現しないことが見出されたが、細胞系のmR
NAは、mage1に関すると2.4kb配列にハイブリダイズし
た。さらにこれを研究するために、cDNAライブラリーを
全LB23−SAR mRNAから作製し、その後2.4kb断片にハイ
ブリダイズした。cDNA配列を、このプローブにハイブリ
ダイズして同定し、以後、mage4という。

実施例31 患者「MZ2」由来のPHA−活性リンパ球を使用し、実験
を行った。「MZ2」は上記「MZ」細胞の源である。mage1
に相同性を示したが、mage2又は３には示さなかったオ
リゴヌクレオチドプローブをPHA活性化細胞から誘導し
たコスミドライブラリーを用いてハイブリダイズした。
しかし、ハイブリダイジングBamH Iコスミド断片のサイ
ズは4.5kbであり、それゆえに該物質がmage1でなかった
ことを示していた；しかし、mage1−４に対する相同性
に基づき、該断片を「mage5」と呼ぶことができる。MAG
E5の配列を配列番号16に示す。

実施例32 メラノーマ細胞系LB−33−MELを試験した。該細胞系
由来の全mRNAを使用し、cDNAを作製し、オリゴ（olig
o）CHO9:（ACTCAGCTCCTCCCAGATTT）及びCHO10:（GAAGAG
GAGGGGCCAAG）を用いて増幅した。これらのオリゴは、
前に記載したmage1、２及び３に共通するエクソン３の
領域に相当する。

これを行うために、１μｇのRNAを全量20μｌに、２
μｇの10×PCR緩衝液、２μｌの各10mM dNTP、1.2μｌ
の25mM MgCl₂、１μｌの80mMの上記CHO9溶液、20ユニッ
トのRNAsin及び200ユニットのＭ−MLV逆転写酵素を用い
て希釈した。その後、これを40分間、42℃でインキュベ
ーションした。８μｌの10×PCR緩衝液、4.8μｌの25mM
MgCl₂、１μｌのCHO10、2.5ユニットのThermus acquat
icus（「Taq」）ポリメラーゼ及び全量を100μｌにする
ための水を使用して、PCR増幅を行った。その後、増幅
を30サイクル（１分間、94℃;2分間、52℃、３分間、72
℃）行った。その後、各反応の10μｌをアガロースゲル
上でサイズにより分別し、その後、ニトロセルロースブ
ロッティングを行った。オリゴヌクレオチドプローブCH
O18（TCTTGTATCCTGGAGTCC）とハイブリダイズすること
を見出した。このプローブは、mage2又は３ではなく、m
age1と同定した。しかし、該生成物は、プローブ配列４
（TTGCCAAGATCTCAGGAA）にハイブリダイズしなかった。
このプローブは、mage2及び３でなく、mage1を結合す
る。これは、PCR生成物がmage1、２及び３とは異なった
配列を含むことを示していた。この断片の配列決定は、
mage4及び５に関して差異を示した。これらの結果は、
あらかじめ同定されたmage1、２、３、４及び５とは異
なる配列を示し、mage6と命名した。

実施例33 MZ2のPHA−活性化リンパ球由来のコスミドライブラリ
ーを使用した追加の実験において、2.4kb mage1断片を
プローブとして使用し、相補的断片を単離した。しか
し、このクローンは、mage1、２、３又は４に特異的な
オリゴヌクレオチドに結合しなかった。得られた配列
は、mage1のエクソン３に対して、ある程度の相同性を
示し、mage1−６とは異なるものである。以後、mage7と
呼ぶ。追加のスクリーニングによりmage8−11を生成し
た。

実施例34 TRAP及びそれらから誘導されたTRAの有用性を、以下
により例証する。

mage1のエクソン３は、抗原Ｅの発現を移入すること
を示した。その結果として、このエクソン３から誘導さ
れた合成ペプチドが、抗−E CTLに対する感受性を与え
るために使用できるかどうかを試験することにした。

これを行うために、標準プロトコールを使用して、抗
−E/CTLに対して一般的に感受性の細胞を、エクソン3.1
から誘導した合成ペプチドを用いてインキュベートし
た。P815Aにおける上記のCTL溶解アッセイ及び3mMのペ
プチド濃度を使用し、ペプチドGlu−Ala−Asp−Pro−Th
r−Gly−His−Ser−Tyrがベストであることを示した。
該アッセイは、抗−E CTLに対して感受性を与えること
を示す30％の溶解を示した。

実施例35 「smage」のいわれる核酸配列を、ネズミ細胞から単
離した。上記プロトコールを使用して、コスミドベクタ
ーC2RBを使用して、コスミドライブラリーを正常DBA/2
腎臓細胞のDNAから製造した。プローブとして、MAGE−
１の2.4kb BamH I断片を使用した。DNAをナイロンフィ
ルターにブロットし、これらを２×SSCにおいて、65℃
で洗い、smage物質を同定した。

実施例36 さらに、組織サンプルを、上記プロトコールを使用し
て、MAGE遺伝子の存在について試験した。これらの結果
のいくつかを以下に示す。

MAGE遺伝子の発現は、脳又は腎臓の腫瘍組織には見ら
れなかった。結腸腫瘍組織はMAGE1、２、３及び４の発
現を示したが、試験したすべての腫瘍がすべてのMAGE遺
伝子の発現を示したのではない。これは、膵臓の腫瘍
（MAGE1）；非小細胞肺（non−small cell lung）（MAG
E1、２、３及び４）、前立腺（MAGE1）、サルコーマ（M
AGE1、２、３及び４）、胸部（MAGE1、２及び３）及び
喉頭（MAGE1及び４）に関してもまた真実である。

実施例を含む上記開示は、当業者の支配下において極
めて価値のあるいくつかの手段を提起するものである。
まず、実施例は、腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸
分子及びそれらに相補的な核酸分子を単離するための方
法論を確認し、提供する。DNAは二重鎖の形態において
存在すること及び二つの鎖のそれぞれが互いに相補的で
あることが知られている。核酸ハイブリダイゼーション
テクノロジーにより、当業者がその補体（complement）
を単離することができるか又はそれを合成することがで
きるDNAの鎖を与えるという点が開発された。

ここに使用した「核酸分子」とは、上記の特性を有す
るDNA及びRNAのすべての種類をいう。ゲノム及び相補的
DNAすなわち「cDNA」は両方とも特定のタンパク質をコ
ードし、MAGEコード配列の単離に関する実施例が示すよ
うに、この開示は、これらの両方をどのように獲得する
かを当業者に教示するものである。

同様に、RNA分子、例えばmRNAを獲得することができ
る。

さらに、当業者に対する参考として述べると、自由に
できるコード配列をいったん持てば、mRNAを単離するか
合成することができる。

TPAPをコードしない相補的配列、例えば「アンチセン
スDNA」又はmRNAは、例えば、そのコード配列のプロー
ビング及びその発現を遮断する方法論において有用であ
る。

該実施例が、TRAP分子をコードするか発現する核酸配
列でトランスフェクトされた細胞系の生物学的純粋培養
物の製造を示すことが明らかとされるであろう。そのよ
うな培養物は、例えば腫瘍拒絶抗原の源、すなわち治療
法として使用することができる。本発明のこの態様は以
下に論じる。

TRAPコード配列でトランスフェクトした細胞を、他の
コード配列によりトランスフェクトしてもよい。他のコ
ード配列の例としては、サイトカイン遺伝子、例えば、
インターロイキン（例えばIL−２又はIL−４）又は主要
組織適合抗原複合体（MHC）又はヒト白血球抗原（HLA）
分子があげられる。サイトカイン遺伝子のトランスフェ
クションは、これらの発現により、in vivoにおける細
胞の生物学的純粋培養物の治療効率が高められることが
期待されるので、価値がある。この技術は、インターロ
イキントランスフェクタントを癌状態の治療に患者に投
与する治療についてよく知られている。特に好ましい態
様において、細胞は、（ｉ）TRAP分子、（ii）HLA/MHC
分子及び（iii）サイトカインのそれぞれをコードする
配列でトランスフェクトされる。

一定のTRAが特定のMHC/HLA分子によってのみ優先的に
又は特異的に発現してもよいので、MHC/HLAコード配列
を用いたトランスフェクションは望ましい。従って、宿
主細胞が、TRAの提示に関連するMHC/HLA分子をすでに発
現している場合、追加のトランスフェクションは必要と
されなくてもよいが、さらなる軽質転換を使用して抗原
の過剰発現（over−expression）を引き起こすことがで
きる。一方、宿主細胞が関連したMHC/HLA分子を一般的
に発現しない時、第二の配列でトランスフェクトするこ
とが望ましいかもしれない。当然のことだが、一つの追
加の配列によるトランスフェクションは、他の配列によ
るさらなるトランスフェクションを妨げないことは理解
されるべきである。

ここに記載した細胞系に関して使用した「生物学的純
粋」とは、他の細胞から本質的にフリーなものを単に意
味している。厳密に言えば、定義による「細胞系」は
「生物学的純粋」であるが、詳説はこれを充分に証明す
るであろう。

細胞のトランスフェクションは、好適なベクターを使
用することを要求とする。従って、本発明は、重要なTR
APのコード配列をプロモーターに操作可能に結合する発
現ベクターを包含する。プロモーターは強力なプロモー
ター、例えば、当技術分野に周知のもの、あるいは特異
的プロモーター、即ち、特異的細胞型にのみ作用するも
のであってもよい。発現ベクターは、ウイルス性又は細
菌性ゲノム、例えば牛痘ウイルス又はBCGの全て又は一
部を含んでもよい。そのようなベクターはワクチンの製
造に特に有用である。

TRAP配列が含まれるならば、発現ベクターは、幾つか
のコード配列を含んでもよい。上記のサイトカイン及び
／又はMHC/HLA遺伝子は、TRAP配列と一緒に単一のベク
ターに含まれてもよい。これが望ましくない場合、その
後発現システムを提供してもよく、それは二つ以上の分
離ベクターを使用し、各コード配列をプロモーターに操
作可能に結合する。さらに、該プロモーターは強力な又
は特異的なプロモーターであってもよい。コトランスフ
ェクションは周知の技術であり、当業者は、利用のため
の入手可能なこの技術を持つことが期待される。ベクタ
ーを、TRAP分子よりもむしろTRA分子を直接コードする
ように構築してもよい。これは、翻訳後プロセッシング
の必要性を排除する。

上記の論議から明らかなように、「腫瘍拒絶抗原前駆
体」（「TRAP」）をコードする配列は、その後、腫瘍拒
絶抗原（「TRA」）にプロセッシングされる。これらの
カテゴリーの両方の単離された形態を、それぞれの特異
的な例を含めてここに記載した。恐らく、それらの最も
顕著な態様は、様々な癌状態を処理するためのワクチン
である。その証拠としては、腫瘍細胞上のTRAの提示、
その後の免疫応答の進展及び細胞の抹消が示される。様
々なTRAを細胞に投与する時、CTL応答が高まり、提示細
胞は消去される。これは、ワクチンの作用特性であり、
それゆえにTRAに加工されるTRAP及びTRAを、それ自体又
は医薬として好適な組成物において、ワクチンとして使
用してもよい。同様に、提示細胞を、単独で又は医薬組
成物を生成する成分と合わせたものとして、同じ方法に
おいて使用してもよい。ワクチンとして使用してもよい
追加の物質としては、表面にTRA分子を提示する単離細
胞（isolated cell）、及びTRAP断片、突然変異ウイル
ス、具体的には活力のない形態のもの、及びトランスフ
ェクトした細菌があげられる。ここに使用した「断片」
とは、TRAより小さいペプチドをいうが、上記のような
ワクチンに要求される性質を有するものをいう。他のワ
クチンは、TRAとHLA分子の複合体を含むか又はそれらか
らなる。ここに記載したタイプのワクチンを予防、即
ち、癌状態の発症を予防するのに十分な量を患者に投与
することによって使用してもよい。

Ｔ−細胞又はＢ−細胞に関連した免疫応答の発生は、
提示された腫瘍拒絶抗原の効果に特徴的なものである。
Ｂ−細胞応答に関していえば、これは、なかでもTRAに
対する抗体の発生、即ち、それらに特異的に結合するも
のを含む。さらに、TRAP分子はそれらを免疫原性にする
のに十分な大きさのものであり、それらに特異的に結合
する抗体は、本発明の一部である。これらの抗体はポリ
クローナル又はモノクローナルであってもよく、後者は
ここで繰り返される必要のないそれらの製造に関して十
分に認識された方法論のいずれかにより製造される。例
えば、mABを動物モデル、例えばBalb/Cマウスを使用す
るか、あるいは試験管内において、EBV形質転換株を使
用して、製造してもよい。さらに、抗血清を、一定の細
胞がTRAを提示する癌疾患患者から単離してもよい。そ
のような抗体は、TRA及びHLA/MHC分子の相互作用により
定義されるエピトープに対しては生成されてもよい。

上記の論述は、「腫瘍拒絶抗原の提示及び認識」と呼
ぶことができるシステムに多くの面があることを示すで
あろう。これらの事象の認識は、診断に役立つという重
要性を有する。例えば、特異的CTLクローン又はTRAに対
する抗体の存在により癌状態の診断又はモニター（以下
に説明する）が可能となり、それは患者のサンプル中の
CTL、TRAへの抗体の結合又は患者のサンプルに関連した
抗−TRA CTL活性をモニタリングすることによる。同様
に、TRAPに関する核酸分子の発現は、増幅（例えば、
「ポリメラーゼチェーンリアクション」）、アンチ−セ
ンスハイブリダイゼーション、プローブテクノロジー等
によりモニターすることができる。体液（例えば血液、
血清、他の滲出液）、組織及び腫瘍を含む様々な患者の
サンプルをそのように分析してもよい。

診断の具体的な方法は、結核の診断に一般的に使用さ
れる標準「ツベルクリン試験」の適合を用いるものであ
る。この標準皮膚試験では、診断の補助として「精製ツ
ベルクリン」即ち「PPD」の安定した形態を投与する。
同一方向の方法においては、本発明によるTRAを、診断
補助又はモニタリング方法としてそのような皮膚試験に
使用してもよい。

「癌状態（camcerous condition）」という語は、癌
の初発で開始し、最終的に臨床的な症状発現を生じると
いうすべての生理学的事象を含むものとしてここに使用
する。腫瘍は、目にみえる腫瘍として「最初から」生じ
るのではなく、むしろそれには正常細胞の悪性への形質
転換、それに続くバイオマス、例えば腫瘍、転移腫瘍細
胞等の成長に関連した様々な事象がみられる。さらに、
緩解は、腫瘍がめったに自然に消滅しないような「癌状
態」の一部の状態と思われてもよい。本発明の診断とし
ての態様は、腫瘍の進行及び転移及び緩解を介して、単
一の細胞が悪性へ第一に形質転換することから生じる発
癌に含まれるすべての事象を含む。

「患者」を使用した場合、この語は、癌状態に苦しむ
いずれの種も含む。これには、ヒト及び非ヒト、例え
ば、家畜化された動物、種鶏等が含まれる。

さらに、本発明には治療における態様がある。ワクチ
ンとしてのTRAP及びTRAの有効量の投与効率は、すでに
上述した。同様に、in vitroにおける特異的CTLを開発
し、その後、患者へそれらを投与してもよい。重要なTR
Aを提示する細胞に特異的に結合するポリクローナル又
はモノクローナルのいずれかの抗体を投与してもよい。
これらの抗体を、メトトレキセート放射性ヨウ素化合
物、トキシン、例えばリシン、他の細胞増殖抑制性又は
細胞溶解性の薬剤等を含む特異的抗腫瘍剤に結合しても
よいが、これらに制限されるものではない。従って、
「標的」抗体療法は、それがCTLを使用して癌細胞を除
去するために適用されるものとして、ここに含まれる。

使用した語及び表現は、記載上の語句として使用した
ものであり、これらに限定されるものではなく、かつ、
そのような語及び表現の使用において、示しかつ記載し
た性質又はその一部の相当価値のいずれをも除外するこ
とを意図するものではなく、様々な改良が本発明の範囲
内において可能であることが認識される。

（１）一般的情報：（ｉ）出願人：ブーンシィアリー，ファン
デンアインド，ベノワ（ii）発明の名称：腫瘍拒絶抗原前駆体、腫瘍拒絶
抗原及びそれらの使用（iii）配列の数:26 （iv）通信先：（Ａ）フェルフェアンドリンチ（Ｂ）サードアベニュー 805 （Ｃ）ニューヨーク市（Ｄ）ニューヨーク州（Ｆ）郵便番号:10022 （ｖ）コンピュータ読取りフォーム：（Ａ）メディウムタイプ：ディスケット,5.25イ
ンチ,360kb蓄積（Ｂ）コンピュータ:IBM （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（vi）本件出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（vii）先願データ：（Ａ）出願番号:07/807,043 （Ｂ）出願日:1991年12月12日（vii）先願データ：（Ａ）出願番号:07/764,364 （Ｂ）出願日:1991年９月23日（vii）先願データ：（Ａ）出願番号07/728,838 （Ｂ）出願日:1991年７月９日（vii）先願データ：（Ａ）出願番号:07/705,702 （Ｂ）出願日:1991年５月23日（viii）代理人情報：（Ａ）名前：ハンソン，ノーマンＤ（Ｂ）登録番号:30,946 （Ｃ）参照／ドケット番号:LUD 253.4 （ix）遠距離通信情報：（Ａ）電話：（212）688−9200 （Ｂ）テレファックス：（212）838−3884 （２）配列番号１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:462塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:675塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:228塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1365塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:4698塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:9アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2418塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:5724塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−1 gene （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:4157塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−2 gene （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:662塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−21 gene （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1640塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA to mRNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:cDNA MAGE−３（xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:943塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−31 gene （xi）配列：配列番号12: （２）配列番号13の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2531塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−4 gene （xi）配列：配列番号13: （２）配列番号14の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2531塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:MAGE−41 gene （xi）配列：配列番号14: （２）配列番号15の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1068塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA to mRNA （ix）特徴：（Ａ）名前／キー:cDNA MAGE−４（xi）配列：配列番号15: （２）配列番号16の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2226塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−5 gene （xi）配列：配列番号16: （２）配列番号17の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2305塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−51 gene （xi）配列：配列番号17: （２）配列番号18の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:225塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:cDNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−6 gene （xi）配列：配列番号18: （２）配列番号19の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1947塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−7 gene （xi）配列：配列番号19: （２）配列番号20の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1810塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−8 gene （xi）配列：配列番号20: （２）配列番号21の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1412塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−9 gene （xi）配列：配列番号21: （２）配列番号22の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:920塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−10 gene （xi）配列：配列番号22: （２）配列番号23の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:1107塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:MAGE−11 gene （xi）配列：配列番号23: （２）配列番号24の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2150塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:smage−Ｉ（xi）配列：配列番号24: （２）配列番号25の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:2099塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:genomic DNA （ix）特徴（Ａ）名前／キー:smage−II （xi）配列：配列番号25: （２）配列番号26の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ:9アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号26:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/30 Ｃ０７Ｋ 16/30 16/42 16/42 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ 7/00 21/08 15/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｑ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ｂ 33/68 15/00 Ｃ (31)優先権主張番号７６４，３６４ (32)優先日平成３年９月23日(1991．9．23) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号８０７，０４３ (32)優先日平成３年12月12日(1991．12．12) (33)優先権主張国米国（ＵＳ）早期審査対象出願 (72)発明者ファンデルブリュージャンピエールベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者ファンダンエインドベノワベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者ファンペルアリーヌベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者ドプラーンエティアンヌベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者ルルカンクリストフベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者ショーメパトリックベルギーベー1200 ブリュッセルユーシーエル 7459 アベニューヒッポクラート 74 (72)発明者トラヴェルサリカティアイタリーイ−20099 ミラノセストエッセジョヴァンニ（番地なし) (56)参考文献Ｊ．ＥＸｐ．Ｍｅｄ，1990年，172, 35−45頁Ｃｅｌｌ，1989年，58，293−303頁 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 A61K 31/70 A61K 35/12 A61K 39/00 A61K 39/395 A61K 48/00 C07K 16/30 C07K 16/42 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 7/00 C12N 15/02 C12P 21/02 C12P 21/08 C12Q 1/68

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号８の塩基配列からなる腫瘍拒絶抗
原前駆体をコードする単離核酸分子、又は、配列番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腫瘍拒絶抗原
前駆体をコードする単離核酸分子。
【請求項２】ヒト腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする請求
項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】請求項１に記載の腫瘍拒絶抗原前駆体をコ
ードする核酸分子に相補的な単離核酸分子。
【請求項４】ゲノムDNA、cDNAまたはmRNAである、請求
項１〜３のいずれか１項に記載の単離核酸分子。
【請求項５】配列番号８の塩基配列からなるMAGE腫瘍拒
絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子、又は、配列番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、MAGE腫瘍拒絶
抗原前駆体をコードする単離核酸分子。
【請求項６】前記MAGE腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする
核酸分子が、配列番号８の塩基配列からなるmage1、配列番号９の塩基配列からなるmage2、配列番号11の塩基配列からなるmage3、配列番号13または配列番号15の塩基配列からなるmage
4、配列番号18の塩基配列からなるmage6、配列番号20の塩基配列からなるmage8、および、配列番号22の塩基配列からなるmage10、からなる群より選ばれる、請求項５に記載の単離核酸分
子。
【請求項７】ゲノムDNA、cDNAまたはmRNAである請求項
５に記載の単離核酸分子。
【請求項８】以下のヌクレオチド配列のいずれかを含
む、請求項５に記載の単離核酸分子。
【請求項９】配列番号８のヌクレオチド配列を有する、
請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】配列番号８の塩基配列からなるMAGE腫瘍
拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子、又は、配列
番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、MAGE腫瘍拒絶抗原
前駆体をコードする単離核酸分子でトランスフォーメー
ションまたはトランスフェクションされた細胞系の生物
学的に純粋な培養物。
【請求項１１】単離核酸分子が以下のヌクレオチド配列
を有する、請求項10に記載の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１２】細胞系がサイトカインまたはHLA分子を
コードする少なくとも１種の核酸分子によってトランス
フォーメーションまたはトランスフェクションされてい
る、請求項10に記載の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１３】サイトカインがインターロイキンであ
る、請求項12に記載の生物学的に純粋な培養物。
【請求項１４】細胞系が、前記細胞系をトランスフォー
メーションまたはトランスフェクションした配列番号８
の塩基配列からなる核酸分子によって発現されるMAGE−
１腫瘍拒絶抗原前駆体由来の、配列番号26のアミノ酸配
列からなる腫瘍拒絶抗原を提示するMHC分子またはHLA分
子を発現している、請求項10に記載の生物学的に純粋な
培養物。
【請求項１５】細胞系が非増殖性にされているか、又は
線維芽細胞系である、請求項10に記載の生物学的に純粋
な培養物。
【請求項１６】配列番号８の塩基配列からなるMAGE腫瘍
拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子、又は、配列
番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、MAGE腫瘍拒絶抗原
前駆体をコードする単離核酸分子を含む形質転換された
細菌。
【請求項１７】配列番号８の塩基配列からなるMAGE腫瘍
拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子、又は、配列
番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリンジェント
な条件下でハイブリダイズし、かつ、MAGE腫瘍拒絶抗原
前駆体をコードする単離核酸分子を含む変異ウイルス。
【請求項１８】プロモーターに操作可能に結合した、配
列番号８の塩基配列からなるMAGE腫瘍拒絶抗原前駆体を
コードする単離核酸分子、又は、配列番号８の塩基配列
からなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつ、MAGE腫瘍拒絶抗原前駆体をコードす
る単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１９】プロモーターに操作可能に結合した配列
番号26のアミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原をコードす
る単離核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２０】プロモーターが強力なプロモーターであ
るか、または特異的なプロモーターである、請求項18ま
たは19に記載の発現ベクター。
【請求項２１】さらにMHC、HLAまたはサイトカイン分子
をコードする単離核酸分子を含む、請求項18または19に
記載の発現ベクター。
【請求項２２】サイトカインがインターロイキンであ
る、請求項21に記載の発現ベクター。
【請求項２３】細菌ゲノム若しくはその一部分またはウ
イルスゲノム若しくはその一部分を含む、請求項18また
は19に記載の発現ベクター。
【請求項２４】（ｉ）配列番号８の塩基配列からなるMA
GE腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子、又
は、配列番号８の塩基配列からなる核酸分子にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、MAGE腫瘍
拒絶抗原前駆体をコードする単離核酸分子を含む第１の
発現ベクター、および（ii）MHC分子またはHLA分子またはサイトカイン分子を
コードする第２のベクターを少なくとも更に含む、細胞をトランスフェクションまたはトランスフォーメー
ションするために有用な発現系。
【請求項２５】配列番号８の塩基配列からなる核酸分
子、又は、配列番号８の塩基配列からなる核酸分子にス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子
によってコードされるMAGE単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
【請求項２６】前記MAGE単離腫瘍拒絶抗原前駆体が、配列番号８の塩基配列からなるmage1、配列番号９の塩基配列からなるmage2、配列番号11の塩基配列からなるmage3、配列番号13または配列番号15の塩基配列からなるmage
4、配列番号18の塩基配列からなるmage6、配列番号20の塩基配列からなるmage8、および配列番号22の塩基配列からなるmage10、からなる群より選ばれる単離核酸分子によってコードさ
れるヒトの分子である、請求項25に記載のMAGE単離腫瘍
拒絶抗原前駆体。
【請求項２７】配列番号８の塩基配列からなるmage−１
核酸分子、または、配列番号11の塩基配列からなるmage
−３核酸分子によってコードされる請求項25に記載のMA
GE単離腫瘍拒絶抗原前駆体。
【請求項２８】配列番号26のアミノ酸配列からなる単離
腫瘍拒絶抗原。
【請求項２９】配列番号26に記載の配列を有する単離ペ
プチド。
【請求項３０】配列番号８の塩基配列からなる核酸分
子、又は、配列番号８の塩基配列からなる核酸分子にス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子
によってコードされる腫瘍拒絶抗原前駆体に特異的に結
合する抗体。
【請求項３１】腫瘍拒絶抗原前駆体が配列番号８の塩基
配列からなる核酸分子、又は、配列番号８の塩基配列か
らなる核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズする核酸分子によってコードされるMAGE分子であ
る、請求項30に記載の抗体。
【請求項３２】MAGE分子が、配列番号８の塩基配列からなるmage1、配列番号９の塩基配列からなるmage2、配列番号11の塩基配列からなるmage3、配列番号13または配列番号15の塩基配列からなるmage
4、配列番号18の塩基配列からなるmage6、配列番号20の塩基配列からなるmage8、および配列番号22の塩基配列からなるmage10、からなる群より選ばれる単離核酸分子によってコードさ
れる腫瘍拒絶抗原前駆体である、請求項31に記載の抗
体。
【請求項３３】モノクローナル抗体である、請求項30〜
32のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３４】配列番号26のアミノ酸配列からなる腫瘍
拒絶抗原または配列番号26のアミノ酸配列からなる腫瘍
拒絶抗原とHLA若しくはMHC分子との複合体に特異的に結
合する抗体。
【請求項３５】モノクローナル抗体である、請求項34に
記載の抗体。
【請求項３６】MHCまたはHLA分子と配列番号26のアミノ
酸配列からなる腫瘍拒絶抗原との複合体をその表面上に
提示する非増殖性細胞を含む抗腫瘍医薬組成物。
【請求項３７】抗癌剤に結合した請求項30または34に記
載の抗体を含む抗腫瘍医薬組成物。
【請求項３８】サンプル中の配列番号26のアミノ酸配列
からなる腫瘍拒絶抗原とMHCまたはHLA分子の複合体をそ
の表面上に提示している細胞を障害するのに有用な細胞
障害性Ｔ細胞を同定する方法であって、配列番号26のア
ミノ酸配列からなる腫瘍拒絶抗原とMHCまたはHLA分子の
複合体をその表面上に提示している細胞とＴ細胞とを接
触させ、少なくとも（ｉ）細胞障害性Ｔ細胞の増殖、（ii）細胞障害性Ｔ細胞によって生産される因子の放
出、の１つを前記細胞障害性Ｔ細胞の指標として測定するこ
とを含む、サンプル中の配列番号26のアミノ酸配列から
なる腫瘍拒絶抗原とMHCまたはHLA分子の複合体をその表
面上に提示している細胞を障害するのに有用な細胞障害
性Ｔ細胞を同定する方法。
【請求項３９】請求項13に記載のインターロイキンがIL
−２またはIL−４である、請求項13に記載の生物学的に
純粋な培養物。
【請求項４０】請求項22に記載のインターロイキンがIL
−２またはIL−４である、請求項22に記載の発現ベクタ
ー。
【請求項４１】請求項23に記載の細菌ゲノム若しくはそ
の一部分がBCG DNAである、請求項23に記載の発現ベク
ター。
【請求項４２】請求項23に記載のウイルスゲノム若しく
はその一部分がワクシニアウイルスDNAである、請求項2
3に記載の発現ベクター。
【請求項４３】請求項38に記載の細胞障害性Ｔ細胞によ
って生産される因子が腫瘍壊死因子である、請求項38に
記載の方法。
【請求項４４】プロモーターに操作可能に結合した、請
求項６の単離核酸分子を含む請求項18に記載の発現ベク
ター。