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JP3479531B2 - ハイブリッドｒｎａウイルス - Google Patents

ハイブリッドｒｎａウイルス

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JP3479531B2
JP3479531B2 JP02863088A JP2863088A JP3479531B2 JP 3479531 B2 JP3479531 B2 JP 3479531B2 JP 02863088 A JP02863088 A JP 02863088A JP 2863088 A JP2863088 A JP 2863088A JP 3479531 B2 JP3479531 B2 JP 3479531B2
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virus
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virion
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ディー．フレンチ ロイ
エフ．サッチャー ロバート
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マイコジェン プラント サイエンス，インコーポレイテッド
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，植物細胞を形質転換させたり，系統的に植
物に感染させたりするための遺伝子工学に,RNA植物ウイ
ルスを使用することに関する。特に本発明は，異種のコ
ートタンパクにウイルス配列をパッケージングすること
に関する。
（従来の技術） RNAウイルス，特に（＋）鎖メッセンジャーセンスRNA
ウイルスが植物の遺伝子操作に有用であることは認識さ
れている。例えば，欧州特許出願第85300979.3号および
第86301586.3号を参照されたい（これらは参照文献とし
てここに採用する）。
しかしながら，植物の遺伝子工学に対してRNAウイル
スを使用することを包含する従来の方法における問題点
は，外来遺伝子のRNAコピーを挿入するのに適当な部位
を提供する多くの植物ウイルスが，自然な感染状態で
は，球状または二十面体のキャプシドにキャプシド化さ
れるという事実であった。該キャプシドは，これらのウ
イルスによって保持され得る遺伝子物質の量に対して幾
何学的な制約を課している。
このように有用なウイルスの例は，ブロムモザイクウ
イルス（BMV）やササゲクロロテックモットルウイルス
（CCMV）のようなトリコルナビリダエ（Tricornavirida
e）の三分節ウイルスである。これらのウイルスは二十
面体キャプシドにパッケージングされる。BMV RNA3部分
は異種RNAの担体として広く研究されている。しかしな
がら，このRNA部分の機能的要素の構造を観察すると，
天然のBMV RNAの3.2〜3.3kbというサイズは，二十面体
のBMVコートによって保持され得る最大サイズにほぼ近
い。
BMV RNA3のサイズは約2.1kbであるので，パッケージ
ングし得るRNA3誘導体に，天然のBMV RNA3配列の一部を
欠失させることなく付加し得る外来配列の大きさは，せ
いぜい約1kb程度である。広く研究されているBMV RNA3
の場合には，複製および遺伝子発現に対してシスである
必要のない配列を同定することにより，このような欠失
を有する変異体を構築し得る可能性が開かれるが，同量
の元のウイルスRNAを欠失させる必要がなく異種RNA配列
を付加し得ることは，より複雑なウイルス誘導体を作製
する際に自由度と柔軟性とを増大させるのに非常に望ま
しい。BMVおよび等しい大きさの他のいくつかのウイル
スに対しても，ウイルスのRNAをパッケージングするの
にRNAサイズの上限と下限とが存在する可能性がある（A
hlquistら（1984）,J.Mol.Biol.172:369−383）。
このように，サイズに上限または下限の制約がなく，
いくつかのRNAを自由にパッケージングし得るコートタ
ンパク中に組換えRNAウイルス配列をキャプシド化する
ことは望ましい。
二十面体ウイルスとは対照的に，広範囲な植物ウイル
スの部類は，硬質の桿状または可撓性のある桿状の形で
あるビリオンにまで拡張された。タバコモザイクウイル
スは広く研究されている一例である。例えば，以下の文
献を参照されたい:M.H.V.Van Regenmortel（1981），
“トバモウイルス,"「植物ウイルスの感染および比較診
断に関するハンドブック」,E.Kurstak（編）,pp.541−5
64;P.J.G.Butler（1984），「タバコモザイクウイルス
の構造と構築に関する最近の描像」,J.Gen.Virol.65:25
3−279;D.L.Beckら（1985），「TMVの全長cDNAクローン
の合成」,Phytopathology,75:1334（要約）；およびW.
O.Dowsonら（1986），「タバコモザイクウイルスの完全
ゲノムのcDNAクローニングおよび感染性の転写物の生
産」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1832−1836。
このような桿状ビリオンのコートタンパクは,RNA遺伝
子によってコードされている。構築起点配列もパッケー
ジングを開始するのに必要である。
TMVササゲ株（Cc）の構築起点とコートタンパク遺伝
子とを含むcDNAクローンは,T.Meshiら（1981），「TMV
（ササゲ株）RNAのクローン化されたcDNAコピーの，構
築起点，コートタンパクシストロン，および3'非コード
領域を含むヌクレオチド配列」,Mol.Gen.Genet.184:20
−25によって単離されている。この特定のTMV株では，
構築起点配列はコートタンパク遺伝子内にある；しか
し，他の株では，構築起点とコートタンパク遺伝子とは
別個である。
桿状ビリオンのコートタンパクは，らせん状に構築さ
れており，伸長可能な粒子の内部にRNAをらせん状に巻
くようにしてRNA桿状ウイルス粒子をキャプシド化す
る。このように，遺伝子操作を行ったRNAウイルス配列
のサイズ範囲を拡張するために，桿状のコートにキャプ
シド化された組換えRNA配列を提供することが本発明の
目的である。
一般的に，例えば所望の宿主が，感染させるのが望ま
しいウイルスの配列の天然のコートタンパクに対して免
疫性を確立する場合には，異種のコートタンパクキャプ
シドにウイルス配列をパッケージングすることが望まし
い。しかし，本発明の以前には,1つより多くのRNAウイ
ルスに由来する機能（例えば，宿主特異性，感染性な
ど）を組み合わせたハイブリッドウイルスは構築されて
いなかった。
生育可能な組換え体は,RNA配列に70％の相同性のある
ポリオウイルス１型と３型との間のcDNAレベルで構築さ
れた（G.Stanwayら（1986），「cDNAを用いたポリオウ
イルスのタイプ間の組換え体の構築」,J.Virol.57:118
7）。この組換え体は,0.74kbの5'非翻訳配列と,3型由来
の最初の11個のポリタンパクコドンとを,1型由来の配列
の残部とともに保存していた。報告されている第２の組
換え体は,3型由来のVP1キャプシドタンパク遺伝子の一
部を１型の構造物に挿入したものを含んでいたが，この
組換え体は生育可能ではなかった。このことは相同性を
有さない機能領域を組み合わせることに問題があること
を示している。
広範囲のピコルナウイルスゲノム間における組換えの
別の例は，ポリオウイルス１型とコクサッキーB3ウイル
スとの間の組換えによる構築である（B.L.Semlerら（19
86），「ポリオウイルスおよび温度感受性のコクサッキ
ーウイルスのcDNAクローンに由来のキメラプラスミ
ド」,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1777）。この場合に
は，コクサッキーB3の5'非コード領域の0.4kb部分が,70
％の相同性を有する部分と置き換えることによって，ポ
リオウイルスの構造物に挿入された。得られた組換えウ
イルスは生育可能ではあったが，温度感受性の複製表現
型を示した。
組換えウイルスを生産するためのこれらの報告されて
いる試みのいずれおいても，置き換えた部分に対して70
％より少なく相同性を有する置換部分を持つ生育可能な
ハイブリッドウイルスは生産されなかった。そして，い
ずれの場合も,2またはそれ以上の異なるウイルスに由来
する別個の機能を再び成功裏に組み合わせたものはなか
った。２つの異なるウイルス型由来のハイブリッドRNA
植物ウイルスに関する人為的な構築も報告されていな
い。
桿状ウイルスのキャプシド化されていない誘導体は，
組換えRNA中に外来遺伝子を運ぶためのベクターとして
最近使用されており（Takamatsn,N.ら「TMV−RNAに媒介
された外来遺伝子のタバコ植物における発現」（印刷
中）），そして組換えRNA配列は桿状コートにインビト
ロでキャプシド化されている（Sleat,D.E.ら，「タバコ
モザイクウイルスRNAの構築起点の配列によって導かれ
る組換えRNA分子の偽ウイルス粒子へのパッケージング
（印刷中））。しかし。感染性ウイルス配列にとって外
来であるキャプシドに組換えウイルスRNAをインビボで
パッケージングすることは，これまで報告されていな
い。
（発明の要旨） RNAウイルスは，植物およびその他の高等生物の遺伝
子工学において，除草剤，病害および害虫に対する抵抗
性のような有益な性質を与えるための有用なベクターと
なる。しかし，現存する系は望まれるような適応性がな
い。RNAウイルス配列のキャプシド化は，該ウイルスの
宿主系によるかなりの，そして確実な分布拡大に必要で
あると思われる。例えば，コートのないRNAウイルス
は，単細胞およびプロトプラストに感染し得る。そし
て，ある単一成分のRNAウイルスの場合，最初に接種さ
れた部位から離れた部位に不規則に広がり得る。しか
し，特に多くの多成分植物RNAウイルスについては，単
一の感染部位またはトランスフェクション部位からの植
物を介する効率的な伝達に，ウイルスコート内へのキャ
プシド化を必要とする。本発明は，感染性ウイルス配列
を異種コートタンパクキャプシド内にパッケージングさ
れたハイブリッドウイルス作製法を提供する。インビト
ロまたはインビボでキャプシド化し得るハイブリッドウ
イルスRNA配列と同様に，キャプシド化ハイブリッドビ
リオンも提供される。
本発明のハイブリッドRNAウイルス配列は，感染性ウ
イルス配列と，異種の構築起点およびコートタンパク遺
伝子とを含む。
本発明のプラスミドは上記のRNA配列に相補的なcDNA
を含む。
機能性異種RNAで植物をトランスフェクトさせる本発
明の方法は、以下の工程を包含する： （ａ）該植物を感染させ得る，第１のビリオンに由来す
るRNAウイルス配列を，該機能性異種RNAと，第２のビリ
オンに由来する構築起点およびコートタンパクとを含む
ように修飾することであり，ここで該第１および第２の
ビリオンは形状が異なる； （ｂ）１またはそれ以上の複製遺伝子をシスまたはトラ
ンスに与えて，該修飾されたRNAウイルス配列の複製を
確実にすること； （ｃ）該植物を，（ａ）および（ｂ）の要素と接触させ
て，感染を起こさせること；および （ｄ）該植物によって該感染を系統的に広げること。
ここで用いる“ハイブリッドRNAウイルス”という用
語は，生存可能な生体を形づくるために,2つまたはそれ
以上の異なるウイルス由来の機能性配列を組み合わせた
組換え体ウイルスを意味する。詳細には，本発明のハイ
ブリッドRNAウイルスは，あるRNAウイルス由来の感染性
ウイルス配列，および別のウイルス（またはその他のウ
イルス）由来の構築起点およびコートタンパク遺伝子を
有するRNA配列である。“ハイブリッドRNAビリオン”と
いう用語は，キャプシド化された形のこのようなウイル
スを意味する。
多くの有用なRNAウイルスは，付加し得る遺伝子の大
きさを制限する正二十面体のコート内にキャプシド化さ
れる。それによって，桿状コートタンパクキャプシド内
にRNAウイルス配列をキャプシド化する方法が提供され
る。これらのコートタンパクキャプシドは，少なくとも
タバコモザイクウイルスの6.4kbの大きさまでの，大き
なサイズのRNA断片を収容するように拡張し得る。所望
の大きさのRNA断片は，粒子が通常の物理的操作によっ
て実質的に破砕されるほど大きくない限りは，桿状粒子
内にキャプシド化され得る。
組換え体ウイルスRNA配列は、通常はある型のコート
タンパクにキャプシド化されているウイルス由来の本来
のウイルス配列を，更なる型にキャプシド化したものと
して提供される。好ましくは，正二十面体キャプシドに
通常キャプシド化されるか，そうでなければ桿状キャプ
シドに通常キャプシド化されない感染性ウイルスを，桿
状キャプシド生成のために遺伝子および構築起点と組み
合わせる。このようにして，桿状キャプシド内に本来の
ウイルス配列をキャプシド化し得る。好ましくは，本来
のウイルス配列を修飾して所望の外来遺伝子を含有させ
る。
異種コートタンパク遺伝子および構築起点を結合させ
るのに適した本来のウイルスRNA配列は,RNAウイルス配
列由来か，またはRNAウイルス配列に相当する配列であ
る。このようなウイルスの例は，当該技術分野で公知で
あるBMV,一般にトリコルナビリダエ（Tricornavirida
e），およびその他の多くのような正鎖ウイルスであ
る。さらに有用なウイルス配列は，逆転写されたウイル
スまたはトランスポゾンRNA,ウイロイドおよびサテライ
トウイルス由来の，または相当する配列である。
このようなウイルス配列は最小限として，宿主内に於
ける複製能力および宿主への感染能力を有しているべき
である。このような機能の決定因子は，シスで必要とさ
れ得るか，またはその他の場合ではトランスで供給され
得る。トランスにおける複製に充分である条件の一例
は、BMV RNA3を宿主内で複製させるための,BMV RNA1お
よび２によりコードされるタンパクの存在の必要性であ
る。これに対して，ある複製シグナルは、RNA1および２
で感染させた細胞において誘導される機構によってRNA3
誘導体を複製させるように，シスで（すなわちRNA3誘導
体に直接に結合して）存在させるべきである。
このような本来のウイルス配列は，外来または異種遺
伝子を付加するための適当な部位を有することも望まし
い。遺伝子および配列に関する“外来”および“異種”
という用語は，天然に存在する本来のウイルスにコード
されない遺伝子または配列を意味する。このような外来
遺伝子または配列は，本来のウイルス配列に必要な機
能，すなわち，複製能力および宿主への感染能力を妨害
しないいずれの部位にも挿入し得る。宿主内での発現に
関して，“異種”遺伝子は，該遺伝子が配置される宿主
内の位置に天然には存在しない遺伝子である。
同様に，異種コートタンパク遺伝子および構築起点の
配置される位置は，本来のウイルス配列のこのような必
要な機能を妨害しない位置が望ましい。
可撓性のある，または硬質の桿状RNAウイルス由来の
コートタンパク配列は本発明において特に有用であり，
該配列と構築起点とを組み合わせると，コートタンパク
配列を制御し得る。一般に，当該技術分野で認められて
いるように，構築起点はそれらのコートタンパク遺伝子
に特異的である。それゆえ，コートタンパク遺伝子およ
び構築起点は同じ生体由来であることが好ましい。遺伝
子内に構築起点を有するコートタンパク遺伝子，例え
ば,TMVササゲ（Cc）株遺伝子が特に好ましい。
本来のウイルスRNAに付加される外来RNA配列は，機能
性RNAであり得るか，または機能性RNAをコードし得る。
そして，宿主生物の遺伝子型および表現型をトランスフ
ェクションまたは形質転換し得る。機能性RNAは，特定
の，そしてRNA断片によってもたらされることが知られ
ているいずれの機能をも提供する。このような機能は，
宿主細胞によって翻訳されると，有用あるいは所望の特
性を有するペプチドまたはタンパクを合成する配列をコ
ードするメッセンジャーRNAとして作用するようなコー
ド機能を包含するが，これに限定されない。このような
タンパクをここでは“機能性タンパク”と呼ぶ。RNA断
片は，例えば，リボゾームRNAのように構造的でもあり
得る；例えば，核内低分子RNAまたはアンチセンスRNAの
ように制御的であるか，または触媒的であり得る。アン
チセンスRNAは，標的細胞内における相補的RNAの機能を
阻害するのに有用である。
当業者によって認められるように，もし挿入されたRN
A配列が形質転換細胞によって直接翻訳される遺伝子か
らなるメッセンジャー−センスRNA型であるならば，遺
伝子はイントロンのような非翻訳配列に妨害されない。
一方，挿入遺伝子は自然に存在する遺伝子である必要は
ないが，修飾された１つ以上のコード断片合成物であり
得るか，または１つ以上のタンパクをコードする。RNA
はまた，修飾されたRNA分子の全長またはその他の特徴
を調節するために，挿入および欠失を組み合わせること
により修飾され得る。
挿入された外来RNA配列は，非ウイルスまたはウイル
ス起源であり得る。そして，本来はRNAまたはDNAのいず
れかに相当し得る。これらの配列は，受容細胞の翻訳機
構によって直接翻訳され得るか，またはそれらの機能
性，構造性，あるいは制御的機能について認識され，利
用される型であるのならば，その起源は原核生物または
真核生物であり得る。
上述のように，外来RNA配列の“発現”は，機能性RNA
または機能性タンパクの生産を包含し得る。この発明
は，いずれの有用なレベルでもあり得る。そして，当業
者により認められるように，所望の生産物および用いる
宿主に依存する適当な制御因子が必要であり得る。この
ような制御因子を提供することは，当業者にとり通常の
問題である。
天然のTMV RNAは，長さが約6.4kbである。しかし，本
発明の桿状キャプシドは，必要に応じて長く，または短
くし得る。BMVの正二十面体キャプシドがキャプシド化
し得る最大の大きさは約3.2kbであると考えられている
ので，桿状コートを使用すると，前もって正二十面体に
キャプシド化されたウイルスのみが接近しうる宿主にお
いて，系統的拡散のためのキャプシド化によってコンピ
テントに作製され得る，遺伝子操作されたウイルス配列
の大きさの範囲をかなり拡張することが確認され得る。
後に述べるように，外来RNA配列の挿入は，対応するc
DNAに含有されるすべての配列の逆転写により行うこと
が好ましい。または，本来はDNA由来の外来配列の場
合，本来のDNA配列が用いられ得る。適当なベクターの
いずれもが，このような遺伝子工学を実施するための基
礎を提供するために用いられ得る。これらはすべて当業
者に明らかである。好適なプラスミドは実施例で検討す
る。所望のDNA配列またはDNA断片の組み合わせを構築す
るための方法は，当該技術分野でよく知られている。こ
れらの方法は，適当な制限酵素，結合方法およびオリゴ
ヌクレオチドの変換を用いており，所望の機能を有する
断片を組み合わせて構築するために役立つ。これらの操
作性を確認するためのこのような構築物を調べる技術も
よく知られているが，ここでは詳細を議論しない。
同様に，遺伝子工学を実施および／またはインビトロ
でDNA配列が転写されたRNAを得るにあたり，本発明のDN
A配列を有するベクターのために，当該分野で公知の細
菌宿主のいずれもが用いられ得る。例えば，欧州特許出
願番号第85300979.3号に記載の方法により，インビトロ
における転写されたRNAの生産を行い得る。
当業者に明らかなように，適当な宿主特異性および複
製機能を与えることによって本発明のRNA配列でいずれ
の植物も感染され得る。その他の真核生物もまた，単細
胞および組織培養物のように適当な構築物で感染させ得
る。本発明は，与えられた宿主の種類，またはRNAウイ
ルスの型のいずれにも制限されない。異種の保護コー
ト，またはキャプシド化を提供する一般的効用，特にウ
イルス配列の大きさを拡張させるという効用は，付加さ
れたRNA配列によって改良され得るようなウイルスの使
用を包含するいずれの過程においても，改良として当業
者に認められる。
“系統的感染”という用語は，本来の接種部位の細胞
以上を包含するように宿主生物系を通して広がる感染を
意味する。宿主生物全体が感染する必要はない；感染の
目的により，単一の器官または器官の一部で十分であ
る。
宿主生物に適用される“トランスフェクションされ
た”という用語は，該生物内部で複製されるような方法
で生物細胞内へ本発明のウイルス配列を導入することを
意味する。トランスフェクションさせるために，生物を
系統的に感染させる必要はないが，系統的に感染させる
ことが好ましい。
宿主生物の感染を開始する方法は，当該技術分野で公
知であり，適当な方法のいずれも使用し得る。植物への
感染の好適な方法は，ウイルスが複製するか，または植
物に感染するように，ウイルスまたはウイルスRNAを含
有する溶液を傷つけた植物に接触させることである。
（発明の好適な実施態様） 本発明の好ましい実施態様においては，正二十面体ウ
イルス，好ましくは三分節系ウイルス，そしてより好ま
しくはBMV,のRNA断片は，円筒状キャプシド中にパッケ
ージングされる。好ましくはTMVの，そしてより好まし
くはTMVササゲ株（Cc）のコートタンパクの円筒状キャ
プシド中にパッケージングされる。好ましくは，そのパ
ッケージングされた配列はまた，異種遺伝子を含むよう
に修飾される。
BMVのゲノムは，それぞれ3.2,2.9および2.1kbのメッ
センジャーセンスRNA1,2,および３に分けられる。これ
らのRNAのcDNAコピーは，一般的な転写ベクターであるp
PM1中にクローン化された。このpPM1は、1984年３月７
日に，アメリカンタイプカルチャーコレクション，ロッ
クビル，メリーランド，にNo.4017として寄託された。R
NAの1,2および３をそれぞれ含むクローンは,pB1PM18,pB
2PM25およびpB3PM1と命名され，そして，それぞれNo.40
171,40170および40169として上記と同日にATCCに寄託さ
れた。細菌が,BMV RNA3に感染するためには,BMV RNA1お
よび２によってコードされたタンパクが存在しなければ
ならない。好ましい実施態様においては，これら３つの
BMV RNAは，桿状ウイルスのコートタンパク内に，別々
にキャプシド化されている。
好ましい実施態様においては,BMV RNA1,2および３
は，それぞれ，適切な構築の起点を含むが,BMV RNA3配
列だけが加えられたコートタンパクを含む。上記いずれ
の配列も機能性タンパクまたは機能性RNAをコードする
配列のような付加的なRNA配列を含むように修飾され得
るにもかかわらず,BMV RNA3配列だけが該タンパクを含
む。異種または外来の配列を挿入するためのDNA配列の
修飾方法は，当該分野で既知である。一般に，ウイルス
のRNA配列は，完全長のcDNA転写物に転換され，そして
ベクターにクローン化され，次いで外来DNA断片を挿入
する（該挿入物のRNA複製が中断したり感染性が妨害さ
れないような領域中に挿入する）ことによって修飾され
る。
パッケージングされているウイルスRNAは，加えられ
たコートタンパク遺伝子により妨害されるのを回避する
ように欠失または不活性化した，それ自身のコートタン
パクの遺伝子を有することが必要である。ウイルスコー
トタンパク遺伝子を不活性化する方法は，当該分野で既
知である。例えば,Ahlquistら，（1981），「ブロムモ
ザイクウイルスRNA3のヌクレオチド完全配列」,J.Mol.B
iol.153:23−38を参照されたい。遺伝子を不活性化する
好適な方法は，その遺伝子またはその本質的な部分にお
ける単なる欠失である。他の方法としては，点突然変異
または挿入による不活性化が包含される。
異種コートタンパク遺伝子の翻訳の正確さを確実にす
るためには，本来のコートタンパクの翻訳の開始ATGコ
ドンを（これが欠失していないならば），修飾する必要
もあり得る。そしてこれは，オリゴヌクレオチド置換の
ような，当該分野で既知の方法により達成され得る。も
し，付加されたコートタンパクの配列が，それ自身の翻
訳開始コドンを有するならば，本来のタンパクの開始コ
ドンの欠失または不活性化が必要である。しかし，また
は，それは保持され，付加されたコートタンパク配列の
翻訳を開始するのに使用され得る。但しこれは，それに
よって導入されるどのようなアミノ酸配列の変化も,RNA
のパッケージングおよびキャプシドの形成に妨害を与え
ない場合においてである。
桿状ビリオン粒子を生産する多くのRNAウイルスが，
当該分野で知られている（例えば，「植物のウイルス
学」（第２版）R.E.F.Matthews（1981）Academic Pres
s,New York,および“4th Report of the International
Committee on Taxowony of Viruses",（1982）Intervi
rology 17:1−199を参照されたい。有用なコートタン
パクおよび構築の起点となる配列は，単離され，そして
余分な実験を行うことなく当該分野で既知の方法によ
り，そのようなウイルスから逆転写され得る。好適は配
列は,TMV配列であり，最も好ましい配列は,TMVササゲ
（Cc）株のコートタンパク遺伝子のような，それ自身の
構築起点が組み込まれているコートタンパクの遺伝子で
ある。Meshiら，（前出）のpCc8C5プラスミドは，その
ような配列に相当するcDNAを含んでいる。これをMeshi
らの方法により調製し，ここで論じている実験のために
用いた。この株の広範な有用性，そしてコートタンパク
遺伝子の配列および構築の起点がMeshiら，（前出）に
より発表されているという事実から，このプラスミドお
よび／または該配列の再構築を行うことは，当業者に容
易である。
標準的なクローン化技術によって，コートタンパク遺
伝子および桿状ビリオンの構築起点の配列が，パッケー
ジングされるべきウイルス配列中に連結される。好まし
くは，そのウイルスの本来のコートタンパク遺伝子が除
去される部位に連結される。しかし，ウイルスが複製
し，そしてその宿主に感染する能力が妨害されなけれ
ば，どの部位に連結されてもよい。
挿入された新しいコートタンパク遺伝子の翻訳の発現
は，既知の方法によって行われ得る。以下の実施例にお
いては,TMVコートタンパク遺伝子は，サブゲノムBMV RN
A4の開始部位のすぐ下流に挿入され，このことにより,T
MVコートタンパクのサブゲノムmRNAのBMV由来の合成が
行われる。このTMV遺伝子は，従って“サブゲノムプロ
モーター”の下流に位置すると言われる。
宿主植物中での発現が望まれる外来遺伝子は，ウイル
スが複製する能力および該ウイルスが宿主に感染する能
力を妨害しなければ，本来のウイルスのゲノム中の好都
合な位置のどこにでも挿入され得る。好ましくは，外来
遺伝子は，コートタンパクおよびそのサブゲノムのプロ
モーターのすぐ上流に挿入される。本来のウイルスのコ
ートタンパクを通常制御するサブゲノムプロモーターの
コピーはまた，そのような外来遺伝子の上流に配置さ
れ，その翻訳の発現を可能にする。
RNA転写物が，インビボ（例えば，細菌宿主中）で，
またはインビトロ（当該分野で既知である）で調製さ
れ，そして，適当な植物宿主または植物組織に移植され
る。キャプシド化が，宿主生物中でおこるので，そのRN
Aは，キャプシド化された形で，または溶液で使用され
得る。
当業者に理解されるように，あるウイルスは，感染お
よび複製が最も好適に行われるための特別の条件を必要
とし得る。そしてそれには，シスもしくはトランスで作
用する遺伝子（その全ては植物もしくは植物組織に感染
するときに存在するべきである）の存在が包含される。
例えば,BMV RNA3の感染には,BMV RNA1および２の存在が
必要である。さらに，ある宿主に対して必要な宿主特異
性遺伝子を有するウイルスによる感染は，ある環境下で
は，通常はその宿主に影響しない第２のウイルスによる
宿主の感染を可能にする。例えば、BMVウイルス単独で
はタバコに感染せず，そしてTMVウイルス単独では大麦
に感染しないが,TMVおよびBMVウイルスの混合物は，大
麦およびタバコの両者に感染する（HamiltonおよびNich
ols（1977）Phytopathology,67:484−489）。もし必要
な遺伝子を供給する完全な本来のウイルスが使用される
ならば，必要とされる遺伝子の全てを同定しマッピング
する必要はない。
宿主植物中で発現するように本来のウイルス遺伝子の
一部分に挿入され得る適当な遺伝子としては,CAT（クロ
ラムフェニコールトランスフェラーゼ）遺伝子；害虫抵
抗性遺伝子（例えば，バシラス チューリンジェンシス
（Bacillus thuringiensis）の殺虫タンパク遺伝子）；
病原菌抵抗性，除草剤耐性または抵抗性，改変された成
長特性を有する，または新しい代謝経路の遺伝子；そし
て，植物または他の宿主生物中での商業的に有用なペプ
チドまたは薬剤の生産のための遺伝子；を包含する。一
般に，その発現生成物が植物細胞内で機能的であるどの
ような異種遺伝子も，ここで述べるウイルスの発現系内
に挿入され得る。
植物は，野外および温室内の条件下のいずれにおいて
もトランスフェクトされ得る。修飾は，その特性に対す
る必要性に応じて，成長サイクル中のどのようなときに
も行われ得る。例えば、害虫に対する抵抗性は，その収
穫物が害虫により被害を受ける危険があるときにのみ，
そして収穫物が害虫により最も影響を受けそうであると
きに，付与され得る。他の特性は，二次的な性質（例え
ば，収穫後の飼料のタンパク含量の増加）を増強するの
に用いられ得る。RNAウイルスの感染を受けるどのよう
な植物の種類も，表現型の形質転換が可能である。ウイ
ルスの選択および修飾の詳細は，当業者に知られかつ理
解されている事柄から自由に選択される事項である。
RNAウイルス由来の修飾RNAにより，表現型もしくは遺
伝型を改変された細胞および生物体の他の用途は，修飾
すべき広範囲のRNAウイルス，および感染する広範囲の
宿主細胞型が与えられれば，当業者にとって自明であ
る。トランスフェクトした動物細胞，細菌細胞などの他
の用途は，容易に想像され得る。例えば，αウイルスに
感染する動物細胞（BMVと同種の非構造タンパクを共用
し，そしてウイルス複製の多くの性質をBMVと共用す
る）は，所望の遺伝子を有する修飾αウイルスにより細
胞培養物中において感染し，そしてそれにより短時間の
うちに所望のタンパクの大量の発現が起こる。本発明の
キャプシド化されたRNAウイルスは，環境条件または宿
主防御による厳しい条件（コートを有していないウイル
スを不活性化するような条件）に，そのウイルスをさら
す必要のある場合に，特に有効である。
遺伝子学的に設計されたウイルスを調製し，使用する
方法が，ここにBMVのRNAを例にあげて述べられている
が，当業者は，他のウイルスRNAについても，既知の技
術を用いてここに述べた原理を適応し得る。
（実施例） 以下に,TMVコートタンパク遺伝子および構築起点のBM
V RNA3への挿入，挿入遺伝子の発現，そして，ハイブリ
ッドRNAの桿状粒子へのインビボでのパッケージングを
記載する。
第１図に示されるように，プラスミドpB3TP7は，バク
テリオファージT7のRNAポリメラーゼのプロモーターに
融合したプラスミドpB3PM1からのBMV RNA3の全長のcDNA
コピーを含み，生物学的に活性のあるRNA3転写物を，イ
ンビトロで生成させ得る。このプラスミドのBMVコート
タンパクの開始ATGコドンは，オリゴヌクレオチド特異
的置換法（ZollerおよびSmith（1982）,Nucl.Acids Re
s.10:6487−6500;Kunkel（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.8
2:488−492）により修飾し,AAGコドンとし，プラスミド
pB3RS2とされた。
プラスミドpCc8C5は，タバコモザイクウイルスのササ
ゲ（Cc）株のRNAのcDNAコピー（Meshiら，前出）を部分
的に含む。標準的な方法（Maniatisら，（1982）Molecu
lar Cloning.CSH Labolatory）により,BMVコート遺伝子
の内部のpB3RS2の約0.5kbのSal I−Xba I断片（TMV Cc
の全コートタンパクを含む）が,pCc8C5遺伝子の約0.6kb
Mbo II−Xba I断片に置き換えられた。上記断片はその
RNAのキャプシド化の起点を表わすと考えられる配列（M
eshiら，前出）を含む。そのSal IおよびMbo II制限断
片の末端は，両者とも連結の前にT4 DNAポリメラーゼに
より平滑末端に修復された。得られたプラスミドは,PB3
/TMVと命名される。
そのプラスミドに含まれる完全なBMV RNA3およびTMV
配列を含み,EcoR Iで線状とされたPB3/TMVからの転写物
は,BMV RNA1およびRNA2のcDNAクローンの転写物（感染
し得る能力を有する）（Fernchら，（1986）Science 23
1:1294−1297）と共に，大麦のプロトプラストに接種さ
れた。このpB3/TMV RNAは，そのような感染により複製
され，正常なBMV RNA3サブゲノムの開始部位で開始され
るmRNA（その点とBMV RNA配列の3'末端間のすべての配
列を含み,TMV Cc配列の挿入物をも含む）に期待される
大きさのサブゲノムRNAを生じた。
RNAのサンプルは,BMV RNA 1および２の野生型cDNAコ
ピーの転写物と，付加していない転写物（−）とを接種
したプロトプラストから得られた。または上記野生型cD
NAコピーの転写物と，野生型BMV RNA3 cDNAまたはpB3/T
MVの転写物とを接種し，プロトプラストから得られた。
種々に接種を行い，そして光照射下24℃で20時間インキ
ュベートしたプロトプラストのサンプルから抽出した
後,1％（w/v）のアガロースゲルで分離した,3H−ウリジ
ン標識RNAのフルオログラフにより，すべてのこれらのR
NAの存在が示された。
BMV RNA1,RNA2およびpB3/TMVの転写物に感染した大麦
プロトプラストの凍結／融解細胞破砕物を，抗TMVビリ
オン抗体を用いて血清学特異的な電子顕微鏡（K.S.Derr
ickおよびR.H.Brlansky（1976）Phytopathology66:815
−820）で調べると，繰り返し実験を行った場合にも，
桿状粒子が常に観察された。これらの粒子は，正常なTM
Vビリオン粒子に極めて特徴的ないくつかの特徴を有し
ており，直径が約20nmであり，中央にウラニルアセテー
トで染色される溝がある。その粒子は，主として，長さ
が約110nmであり，他方TMV CcビリオンRNAに感染したプ
ロトプラストを同じ方法で観察したときの最も長い粒子
は，長さ約310nmであった。TMV RNAが6.4kbの長さであ
り（Goeletら（1982）Proc.Natl.Acad.Sci.82:488−49
2），粒子の長さに対するRNAの比が一定である（Butle
r,前出）と仮定すると，これらの結果から,pB3/TMVで感
染したプロトプラストからの主な粒子は約2.3kbのRNAを
含み，そしてpB3/TMV RNAの長さは約2.2kbであることが
わかる。より短い粒子を含む小さい画分もまた,pB3/TMV
由来の調製物中に認められ，そして，より大きい画分と
長さが310nmより短い粒子を含む幅広い分布が認められ
る画分もまた,TMV Cc感染調製物中に認められた。その
ような小さい粒子は，大きな粒子の破損またはサブゲノ
ムRNAのキャプシド化から起こり得る。
前述の実施例は，例示のために示され，本発明を限定
するものではない。
（発明の要約） 本発明の組換えRNAウイルスは，異種の，高ましくは
桿状コートタンパクのキャプシド内に，遺伝子操作され
たウイルス配列をキャプシド化させることによって与え
られる。二十面体ウイルスは，それが保持するRNAの量
に制約があるが，桿状ウイルスは拡大が可能なので，本
発明によれば組換えウイルスRNA成分のサイズを増加
（または減少）させ得る。このような組換えウイルスの
作製および使用の方法はまた，特に植物におけるトラン
スフェクションに関して，遺伝型および表現型の変化を
もたらすことを提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は,pB3/TMVの構築を示すウイルスcDNA領域概略図
を示しており，該cDNA領域はBMV RNA3を有するプラスミ
ドpB3TP7,ATGからAGGまでを修飾されたコートタンパク
の開始コドンを有するpB3RS2,BMV RNA3コートタンパク
の代わりにTMVコートタンパクおよび構築起点を有するp
B3/TMV,およびTMVコートタンパクおよび構築起点を有す
るpCc8C5を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 ロイ ディー．フレンチ アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53713 マジソン，グリーンウェイ ク ロス ナンバー１ 2009 (72)発明者 ロバート エフ．サッチャー アメリカ合衆国 ウィスコンシン 53558 マックファーランド，ブルマ ロード 4606 (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，1986年，ｖｏｌ. 155，ｎｏ．２，ｐ．299−308 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，Ｇｅｎｅｔ．，1981 年，ｖｏｌ．184，ｎｏ．１，ｐ．20− 25 Ｒ．Ｅ．Ｆ．Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｐｌ ａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３ｒｄ Ｅ ｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ，Ｉｎｃ．，1991年，ｐ．６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1984年，ｖｏｌ．81，ｐ. 7066−7070 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (26)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】宿主細胞に感染しそして該宿主細胞におい
    て複製し得るハイブリッドRNAであって、第１のウイル
    ス由来のRNAセグメント、および該第１のウイルスとは
    異種の構築起点およびコートタンパク遺伝子をコードす
    る異なるウイルス由来のRNA配列を、該ハイブリッドRNA
    のRNA複製または感染性を妨害せずにこのような配列を
    容認し得る該ハイブリッドRNAの領域に含む、ハイブリ
    ッドRNAであって、ここで、該異なるウイルスのビリオ
    ンは、該第１のウイルスのビリオンよりも大きい、ハイ
    ブリッドRNA。
  2. 【請求項２】機能性RNAの異種配列を含む特許請求の範
    囲第１項に記載のハイブリッドRNA。
  3. 【請求項３】特許請求の範囲第１項に記載のハイブリッ
    ドRNAに相補的なcDNAを含むプラスミド。
  4. 【請求項４】特許請求の範囲第１項に記載のハイブリッ
    ドRNAにより感染された真核細胞であって、該ハイブリ
    ッドRNAをその中に含み、そして複製する、細胞。
  5. 【請求項５】特許請求の範囲第１項に記載のハイブリッ
    ドRNAにより感染された細菌細胞であって、該ハイブリ
    ッドRNAをその中に含み、そして複製する、細胞。
  6. 【請求項６】特許請求の範囲第１項に記載のハイブリッ
    ドRNAにより全身感染された植物。
  7. 【請求項７】特許請求の範囲第２項に記載のハイブリッ
    ドRNAにより全身感染された植物であって、それらの機
    能的産物を発現する、植物。
  8. 【請求項８】特許請求の範囲第１項に記載のハイブリッ
    ドRNAを含む、ハイブリッド桿状RNAビリオン。
  9. 【請求項９】機能性異種RNAで植物をトランスフェクト
    させる方法であって、該方法は以下の工程を包含する： （ａ）該植物を感染させ得る、第１のビリオンに由来す
    るRNAウイルス配列を、該機能性異種RNAと、第２のビリ
    オンに由来する構築起点およびコードタンパク遺伝子と
    を含むように修飾することであり、ここで該第１および
    第２のビリオンは形状が異なり、該第２のビリオンは該
    第１のビリオンよりも大きい： （ｂ）１またはそれ以上の複製遺伝子をシスまたはトラ
    ンスに与えて、該修飾されたRNAウイルス配列の複製を
    確実にすること； （ｃ）該植物を、（ａ）および（ｂ）の要素と接触させ
    て、感染を起こさせること；および （ｄ）該植物によって該感染を系統的に広げること。
  10. 【請求項１０】前記第２のビリオンが桿状ビリオンであ
    る、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記第２のビリオンがTMVビリオンであ
    る、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記第１のビリオンが二十面体ビリオン
    である、特許請求の範囲第９項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記第１のビリオンがBMVビリオンであ
    る、特許請求の範囲第12項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記第１のビリオンが植物ウイルスのビ
    リオンである、特許請求の範囲９項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記第１のRNAセグメントが植物ウイル
    スに由来する、特許請求の範囲第１項に記載のハイブリ
    ッドRNA。
  16. 【請求項１６】宿主細胞に感染しそして該宿主細胞にお
    いて複製し得るハイブリッドRNAであって、該ハイブリ
    ッドRNAは、第１のウイルス由来の第１のRNAセグメント
    および第２の形態学的に異なるより大きなウイルス由来
    の第２のRNA配列を含み、該第２のRNA配列は、構築起点
    を含み、そして該第１のウイルスとは異種のコートタン
    パクをコードし、ここで該第１のウイルスのコートタン
    パク遺伝子は、該第１のRNAセグメントから欠失される
    か、または該配列において不活性化され、そして該第２
    のRNA配列は、該第２のウイルスのコートタンパク遺伝
    子を発現し得るハイブリッドRNAを生成するために置換
    され、そしてここで該ハイブリッドRNAは、該第１のウ
    イルスRNAセグメントおよび該第２のRNA配列からインビ
    トロで構築されるか、またはここで該ハイブリッドRNA
    は、組換えDNA技術を用いてインビトロで構築された核
    酸分子から受け継がれ、ここで、該第２のウイルスのビ
    リオンが該第１のウイルスのビリオンよりも大きい、ハ
    イブリッドRNA。
  17. 【請求項１７】インビボでキャプシド化され得る、特許
    請求の範囲第16項に記載のハイブリッドRNA。
  18. 【請求項１８】機能性タンパクをコードする前記第１の
    ウイルスとは異種の配列をさらに含む、特許請求の範囲
    第16項に記載のハイブリッドRNA。
  19. 【請求項１９】前記第１のウイルスが二十面体ウイルス
    である、特許請求の範囲第16項に記載のハイブリッドRN
    A。
  20. 【請求項２０】前記第１のウイルスが桿状ウイルスであ
    る、特許請求の範囲第16項に記載のハイブリッドRNA。
  21. 【請求項２１】約3.2kbより大きい長さを有する、特許
    請求の範囲第16項に記載のハイブリッドRNA。
  22. 【請求項２２】前記構築起点およびコートタンパク遺伝
    子がTMVに由来する、特許請求の範囲第16項に記載のハ
    イブリッドRNA。
  23. 【請求項２３】前記第１のウイルス由来の前記RNAセグ
    メントがBMV RNA3である、特許請求の範囲第１項に記載
    のハイブリッドRNA。
  24. 【請求項２４】前記第１のウイルスが植物ウイルスであ
    る、特許請求の範囲第16項に記載のハイブリッドRNA。
  25. 【請求項２５】宿主細胞に感染しそして該宿主細胞にお
    いて複製し得るハイブリッドRNAであって、該ハイブリ
    ッドRNAは、第１の非桿状ウイルス由来のRNAセグメント
    および第２の桿状ウイルス由来のRNA配列を含み、該第
    ２のウイルスRNA配列は該第１のウイルスとは異種の構
    築起点およびコートタンパクをコードし、ここで該第２
    のウイルスRNA配列はハイブリッドRNAを生成するために
    該第１のウイルスのRNAセグメントの領域中に配置さ
    れ、ここで該領域は、該ハイブリッドRNAによるRNA複製
    または感染を妨害しないようにこのような配列を容認し
    得、そしてここで該ハイブリッドRNAは、該第１のウイ
    ルスRNAセグメントおよび該第２のRNA配列からインビト
    ロで構築されるか、またはここで該ハイブリッドRNAは
    組換えDNA技術を用いてインビトロで構築された核酸分
    子から受け継がれる、ハイブリッドRNA。
  26. 【請求項２６】宿主細胞に感染しそして該宿主細胞にお
    いて複製し得るハイブリッドRNAであって、該ハイブリ
    ッドRNAは、BMV RNA3配列、およびTMV由来の構築起点を
    含みコートタンパクをコードするRNA配列を含み、ここ
    で、該BMVコートタンパク遺伝子は、該BMV RNA3配列か
    ら欠失されるか、または該配列において不活性化され、
    そして該TMV RNA配列は、該TMV RNA配列によりコードさ
    れるコートタンパクを発現し得るハイブリッドRNAを生
    成するために置換され、そしてここで該ハイブリッドRN
    Aは、該BMV RNA3セグメントおよび該TMV RNA配列からイ
    ンビトロで構築されるか、またはここで該ハイブリッド
    RNAは組換えDNA技術を用いてインビトロで構築された核
    酸分子から受け継がれる、ハイブリッドRNA。
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