JP3473700B2 - Ｓｉｒｓワクチンおよびｓｉｒｓ診断方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 背景技術 1987年以降、養豚産業は未知の病気で、しばしば「ブ
タミステリー病」（MSD、最近は「ブタ不育呼吸器不全
症候群」（SIRS）と呼ばれている）と呼ばれる壊滅的伝
染病の被害にあっている。これは、研究者らが病原を同
定できなかったためである。MSDは、北アメリカおよび
欧州の全域にわたって何十万ものブタに被害を与えてき
た。ブタ１頭がMSDに感染すると、３乃至７日以内に群
れ全体にMSDが感染する場合もある。1987年から1991年
にかけて、養豚産業はMSDが原因で何百万ドルもの利益
を損失してしまった。最近の調査から、MSDによって棚
卸した雌ブタあたり250ドルから500ドルの財務上の損失
が生じたと推定されている。

MSDは、ブタに複数の症状をもたらす。ブタの飼育群
におけるMSDの最初の徴候は、一般に、食欲不振および
軽度の発熱である。さらに、この群のブタの特に、耳、
乳頭、鼻ならびに頸および肩の前頭部の皮膚に青みがか
った変色が見られることがある。感染した皮膚の損傷
は、非回復性になることがある。ただし、MSDの関最も
壊滅的な症状は、ブタの飼育群に生じる生殖不全であ
る。MSDによって、雌ブタは仔ブタを死産したり、呼吸
困難の標準より小さい虚弱な仔ブタを産んだり、離乳前
に死亡する仔ブタを産んだりする。MSD起因のその他の
生殖性の徴候には、早産、受胎率の低下、複数の雌ブタ
における周期不全および同腹の仔ブタ総数の減少などが
ある。生殖不全によるブタの損失数は、年間のブタ生産
量の約10乃至15％であると推定されている。

このため、研究は、MSDの病原を単離する方向に向け
られてきた。この結果、多くの潜在的細菌病原体が単離
されている。ただし、潜在的細菌病原体の型は、養豚場
によってさまざまであった。ウイルス調査には、蛍光抗
体試験、電子顕微鏡検査、血清学的方法などがある。こ
れらの方法によって、MSDの病原を追求することはでき
なかった。

研究者らは、ブタミステリー病の臨床的徴候を示すオ
ランダのブタから得たウイルスを単離し、Lelystadウイ
ルスと名付けた。これについては、Wensvoortら、Vet.Q
uarterly 13:121−129（1991）およびTerpstraら、Vet.
Quarterly 13:131−136（1991）に述べられている。こ
のLelystadウイルスは、エアゾールとして投与され、雌
ブタにMSDを再生させ、その雌ブタから生まれた仔ブタ
から再単離された。しかし、ブタの集団治療に使用する
ことができるワクチンの開発に成功した者はいない。

したがって、本発明の目的は、ブタの飼育群に投与し
た場合に、飼育集団中のMSDの発現を低減することがで
きる血清含有ワクチンを提供することにある。本発明の
別の目的は、ブタ母集団をそのワクチンで治療し、その
ブタ母集団からMSDを根絶する方法を提供することにあ
る。また、本発明の別の目的は、MSD診断方法を提供す
ることにある。

発明の大要 上記のおよび別の目的は、ブタにおけるMSDの予防お
よび治療するための血清含有ワクチンならびにその診断
方法に向けられた本発明によって達成することができ
る。

本発明のワクチンは、ブタにMSDを感染させる病原菌
由来である。病原菌は、MSDに感染したブタの調整組織
接種材料から得られ、肺組織から得られることが好まし
い。病原菌は、ブタ感染組織の接種材料に感染したサル
細胞系などのin vitroは乳類細胞培養生成物であること
が好ましい。この接種材料は、大きさが約1.0ミクロン
以下の生物学的粒子であることが好ましく、0.5ミクロ
ン以下であることが好ましく0.2ミクロン以下であるこ
とが最も好ましい。接種材料は、一般的な抗体で中和す
ることも好ましい。

本発明に従って、ノトバイオートの仔ブタおよび妊娠
ブタに鼻腔内接種した場合、SIRS影響下群の仔ブタから
得られた組織ホモジネートは、SIRSの呼吸性生殖性形態
を複製した。ノトバイオートの仔ブタに、未濾過接種材
料または濾過接種材料（0.45、0.22または0.1μｍ）で
同様に接種したところ食欲不振に陥り、SIRS影響下の群
れに見られる病変に類似した顕微鏡的肺病変を発現し
た。同様の接種材料は、SIRS影響下群に見られる生殖的
効果と同一の効果も引き起こした。ウイルス因子を組織
ホモジネートから検出した。このウイルス因子によっ
て、仔ブタおよび妊娠豚のSIRS類似の疾患が生じる。ウ
イルス因子は、現在まで分類されていない。ただし、ウ
イルス因子は、選好性非血球凝集外被RNAウイルスであ
る。SIRSを引き起こすウイルス因子は、1991年07月18
日、メリーランド州ロックビル所在のアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）、登録番号ATCC
VR−2332で寄託されている。

感染したブタの治療に用いる血清は、ほ乳類抗体をMS
D病変まで輸送する。これは、上述の病原菌で前処理し
た（ブタであるか否かを問わず）ほ乳類血漿から得られ
る。

選択的に、血清をハイブリドーマ法によって生成した
MSDに対するモノクロナール抗体から調合する。

MSD診断方法は、MSDに対する免疫特異抗体の使用に基
づく。本方法は、肺生検試料の濾過ホモジネートまたは
生検試料もしくは他の組織から得た同様の（生検または
ホモジネート）試料と免疫特異抗体とを結合させる必要
があり、この結合で形成された接合体には既知の検出技
術を利用する。接合体の定着または沈殿と、ELISA、RI
A、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウエスタ
ンブロット法などの検出技術を用いることによって、MS
Dを診断できる。

本発明によれば、MSDに対して抗体を使用する治療方
法および診断方法には、上述の選好性非血球凝集外被RN
Aウイルスに対するモノクロナール抗体（IgGやIgM）が
必要である。模範的な抗体には、SDOW12とSDOW17があ
り、各々登録番号HB 10996とHB 10997で1992年３月27日
付けでアメリカン・タイプ・カルチャーに寄託されてい
る。

図面の簡単な説明 図１は、SIRSウイルスVR−2332によって観察される細
胞変性効果を示す。図1Aは、非感染未染色細胞単層であ
る。図1Bは、小型顆粒状成熟変性細胞に感染した単層で
あり、該SIRSウイルスの６回目の継代を伴う接種３日後
に観察された。

図２は、SIRSウイルス感染MA−104細胞の直接免疫蛍
光染色を示す。図2Aは、非感染細胞単層である。図2B
は、強度で、しばしば接種後３日後観察される顆粒状細
胞質蛍光を有する感染細胞である。

図３は、CsC1密度勾配にかけて精製したSIRSウイルス
の密度勾配プロフィルである。ウイルスの感染力は1.18
−1.19g/mlで最大になる。

図４は、密度1.18−1.19g/mlのCsC1勾配画分に観察さ
れるウイルス粒子の電子顕微鏡写真を示す。図4Aは、こ
れら４粒子が直径60−65nmの球形であることを示す。２
粒子は、「中空」であり、高電子密度核であることを示
し（矢印）、残り２粒子は完全である。棒線の長さは10
0nmである。図4Bは、ウサギ高度免疫血清および金粒子
で標識化した抗ウサギIgGを用いたSIRSウイルスの免疫
−金電子顕微鏡検査の結果を示す。このビリオン内に直
径約25−30nmの核粒子が存在することに注目されたい。
棒線の長さは、50nmである。

図５は、SIRSウイルスの４℃（黒三角）、37℃（黒
丸）、56℃（白丸）における温度安定性を示す。

発明の詳細な説明 ブタミステリー病（MSD）の決定は困難であった。し
かし、本発明によって、MSDを引き起こす病原菌を単離
し成長させることができた。本文中に使用するように
「病原菌」は、ブタに対して不育症候群および呼吸器症
候群を生じさせることができるウイルスを言う。さらに
詳述すると、病原菌は、ブタに対して不育と呼吸器疾患
とを生じさせる能力がある選好性非血球凝集外被RNAウ
イルスおよびその動物病理学的突然変異体である。病原
菌の単離は大発見である。この発見によって、ワクチン
の生産、感染したブタを治療するための抗体血清の生産
および診断方法の確立が可能になる。

ワクチンは、不活性のまたは弱毒化したMSD病原菌か
ら成り、MSDの特性的損傷を示すブタ感染肺組織または
その他のブタ組織調整の接種材料由来である。病原菌の
機能的誘導体として、サブユニットワクチン、ベクター
ワクチン、組換体ワクチン、合成ペプチドワクチンなど
も、考えられる。MSDワクチンの開発には、複数のステ
ップを踏む方法を利用する。初めに、MSD病原菌を感染
ブタ組織、好ましくは肺組織から分離および単離するこ
とによって接種材料として得る。次に、MSD病原菌を既
知のワクチン学的技法を使用して処理し、抗MSDワクチ
ンを生成する。

MSD病原菌は、MSDによって呼吸が急速なブタの肺組織
から接種材料として単離することが好ましい（胎児組織
などのその他の組織を使用してウイルスを回収すること
もできる）。このようなブタを殺処分し、肺組織を摘出
する。次に、摘出その肺組織を、肺胞腔中にマクロファ
ージ、変性細胞およびデブリの存在によって生じる肥大
した肺胞間について調べる。これらの特性は、MSD病原
菌の存在を示すものである。この種の損傷を示す別のブ
タ組織を使用して、MSD病原菌を単離することもでき
る。

続いて、（生理的塩類溶液、リンガー溶液、ハンクス
均衡塩類溶液、最小必須培地などの）薬学的に耐用し得
る水溶液で、肺組織またはその他のブタ組織を均質化し
て、組織がホモジネートの容量に対して10％の重量から
成るようにする。ホモジネートを、細孔直径が0.05乃至
10ミクロンまでの、好ましくは0.45、0.2および0.1ミク
ロンの一連の濾過器にかけて、MSD病原菌を含む濾過ホ
モジネートを生成する。結果的に、濾過ホモジネート
は、約1.0ミクロン以下の、好ましくす0.2−0.1ミクロ
ンの大きさの生物学的粒子を含む。ホモジネートをさら
にフロインド不完全アジュバンドに混合して、抗体産生
をほ乳類への注射時に刺激することができる。この混合
物をブタのMSD発現用接種材料またはMSD病原菌のさらに
進んだ研究用の接種材料として使用することもできる。

病原菌を含む濾過ホモジネートを得た後に、ホルマリ
ンやアセトアルデヒドなどを含むアルデヒド試薬、クレ
ゾールやフェノールなどを含む反応性酸性アルコール、
安息香酸やベンゼンスルホン酸などの酸、ベータ−プロ
ピオンラクトンやカプロラクトンなどのラクトン、カル
ボニルジイミダゾールなどの活性ラクタム、カルボジイ
ミド、カルボニルジヘテロ芳香族化合物などの標準的化
学的不活性化剤を含む濾過ホモジネートを処理すること
によって、病原菌を不活性化または死滅させることがで
きる。紫外線照射やγ線などによる照射を使用して病原
菌を不活性化または死滅させることもできる。選択的に
は、この病原菌をブタ以外のほ乳動物または鳥の起点由
来の細胞培養で反復成長させることによって弱毒化し、
病原菌が毒性を有して繁殖する能力を失わせることがて
きる。細胞培養による弱毒化技術に関する詳細は、以下
に述べる。

死滅または弱毒化した病原菌を、免疫応答刺激用稀釈
アジュバント溶液を添加することによって、適切な力価
まで稀釈する。力価測定は、ELISA、RIA、IFAなどの免
疫学的試験または以下に述べる酵素基質検出試験におい
て、MSD抗体を測定することによって、達成することが
できる。

病原菌の精製形態を生成するには、上述の濾過ホモジ
ネートを一連のin vitro細胞試料に接種することもでき
る。腎臓、肝臓、心臓などのほ乳類の器官細胞と、脳細
胞細胞、肺細胞、脾細胞、精巣細胞、鼻甲介、白血球細
胞および赤血球細胞ならびにリンパ節とによる細胞試料
のほか、昆虫胚試料および鳥胚試料を使用することがで
きる。これらの細胞試料に適切な培地には、ウシ胎児血
清およびウシ胎児寒天、浸出物物寒天、脳−心臓浸出物
の肉汁および寒天などほ乳類支持細胞成長因子などを含
む。ほ乳類細胞は、サル腎細胞であることが好ましく、
アフリカ産ミドリザル腎胚細胞−−サル腎細胞系（MA−
104）−−であることが最も好ましい。

濾過ホモジネートを細胞試料に接種し、培養を増殖さ
せた後、培養細胞から成る個体凝集を細胞含有の無菌培
地に収集し再導入する。この系列の最終培養由来の培養
液は、毒性病原菌の精製形態を提供する。また、一連の
反復収集物を形成した後、培養を育成し、培養液を収集
しその液を異なる細胞種を培養するための接種材料とし
て使用することができる。この方法では、病原菌を弱毒
化して、異種培養由来の培養液によって弱毒化病原菌の
精製形態を提供する。

ポリクローナル抗体血清を、ほ乳類の免疫応答を引き
起こす抗原物質として病原菌を使用することによって生
成することができる。培養液または上述の方法で調整し
た接種材料を、ウマ、ヤギ、マウス、ウサギなどのブタ
以外のほ乳動物に対して刺激アジュバントを投与するこ
とができる。抗原刺激を反復した後、血液採取した動物
の血清に一般に認められる上述の疾患に特異的な抗体に
対して固着した抗体を使用して、血清の一部を取り出し
て抗原精製をすることができる。さらに、生理的塩類溶
液と分子量約10,000のタンパク様化合物の収集物とを含
む糖ゲルカラムなどによるクロマトグラフィーによって
半精製した血清を処理し、治療に用いる精製ポリクロー
ナル血清を生成する。

モノクロナール抗体血清をハイブリドーマ技術によっ
て生成することができる。MSD含有細胞培養ライゼート
または上述の勾配−精製MSDでマウス、ブタ、ラット、
ウサギまたはその他の適切な種を免疫化した後、動物の
脾臓を摘出し完全な細胞試料に変換することができる。
KohlerおよびMilsteinの方法（Kohlerら、Nature,256,4
59−97（1975））に従って、脾臓細胞試料由来の免疫細
胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成す
ることができる。このハイブリドーマを培養し、病原菌
を輸送する培養液または接種材料に対して培養液を試験
することによって、MSD病原菌に対するモノクロナール
抗体を産生するハイブリドーマ培養を単離することがで
きる。このハイブリドーマをホスト種の腹膜に導入する
ことによって、ハイブリドーマを腹膜で増殖させること
ができる。腹水を収集することによって、病原菌に対す
るモノクロナール抗体を含む体液を生成することができ
る。ハイブリドーマ細胞培養由来の細胞培養上澄みを使
用することもできる。モノクロナール抗体をマウス誘導
ハイブリッド細胞系によって生成することが好ましく、
この場合の抗体は、IgG型またはIgM型の免疫グロブリン
である。SIRSの病原菌に対する模範的モノクロナール抗
体は、SDOW12とSDOW17である。本明細書の別の箇所で述
べる使用方法の他に、本発明によるモノクロナール抗体
を、診断用組成物および治療用組成物ならびに、受動免
疫方法や抗イディオタイプワクチン調整方法などの診断
方法および治療方法を利用することができる。

本発明のワクチンは、ブタ母集団に見られるMSD感染
を予防し治癒することができる。in vivoにおいて、効
果的に予防および抗感染用に使用するために、ワクチン
には死滅病原菌または弱毒化病原菌を含んでおり、単独
でまたはブタと適合する薬学的担体と組み合わせて投与
することができる。このワクチンは、経口、非経口、経
鼻腔または経静脈的に誘導することができる。ワクチン
容量決定に関連する因子には、年齢、体重および感染し
たブタの母体抗体レベルなどが含まれる。投与量は、1m
lあたりの50％組織培養感染価で10³−10⁷であり、容量
で1ml乃至5mlで投与することが好ましい。ワクチン投与
は、約14−28日間で投与して、ブタがMSD感染に対して
確実に免疫を発現させることが望ましい。

MSDワクチンは、様々な異なる投与形態で投与するこ
とができる。死滅または弱毒化させたMSD病原菌を含む
水性培地は、錠剤やカプセルなどの形態をしたラクトー
ス、デンプン、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウムな
どの薬学的に耐用し得る不活性賦形剤および緩衝剤で乾
燥させて組み合わせることができる。これらの組み合わ
せは、粉末状にしたり、水溶液に懸濁したりして、この
粉末および水溶液またはそのいずれかを動物用飼料や動
物用飲料水に添加しても良い。これらのMSDワクチン粉
末または溶液をさまざまな既知の薬剤によって、適当な
甘味や風味を与えて、ブタが経口でワクチンを摂取する
ように促進しても良い。

非経口投与を行なうには、死滅または弱毒化させたMS
D病原菌を食塩水、水、プロピレングリコール、などの
当業者らには良く知られている薬学的に耐用し得る担体
と組み合わせることができる。この形態では、ワクチン
を非経口的、経鼻腔的および経口的手段で、獣医学関係
の当業者には良く知られる方法によって投与することが
できる。MSDワクチンは注射器によって静脈投与するこ
ともできる。この場合、食塩水などの薬学的に耐用し得
る水性担体と組み合わせる。MSDワクチンの非経口的お
よび静脈的製剤形態は、乳化剤および懸濁剤またはその
いずれか一方であるが、薬学的に耐用し得る稀釈剤を併
用し、MSDワクチンの誘導および投与量を制御すること
もできる。

MSD診断方法は、上述のポリクローナル抗体血清また
はモノクローナル抗体血清を用いて実行することができ
る。抗体血清または生検組織ホモジネートをポリスチレ
ン表面またはタンパク質を固定する別のポリマー表面に
接触させることによって固定することができる。さら
に、抗体血清および抗体ホモジネートの残りを添加し、
培養し、非固定材料を洗浄などによって除去する。抗体
血清用の標識種−特異抗体を加えて、標識の存在および
量を測定する。標識測定は、検定する組織にMSDが存在
することを示す。この方法の一般的な態様には、酵素結
合免疫吸着検定方法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ
（RIA）、免疫蛍光検定（IFA）、ノーザンブロット免疫
検定、サザンブロット免疫検定、ウエスタンブロット免
疫検定などがある。

以下の例は、本発明の特異的態様をさらに説明するも
のである。ただし、以下の例は、上述の開示において十
分に特徴づけられた本発明の範囲を限定するものではな
い。

例 １ MSD病原菌は、接種材料の処理後、ノトバイオートブ
タに接種して、MSD病原菌に病原性が残存するかどうか
を測定し、物理化学的特性（大きさ、脂質溶剤に対する
感受性およびプロテアーゼ感受性）を測定することによ
って特徴付けることができる。

A.材料 ノトバイオートブタ。 ノトバイオートブタに対する誘
導方法および維持方法はBenifieldら、Am.J.Vet.Res.,4
9,330−36（1988）およびCollinsら、Am.J.Vet.Res.,5
0,824−35（1989）に記載されている。雌ブタをMSDを含
む生殖上の問題がない群れから得ることができる。死産
およびミイラ化した胎児またはそのいずれか一方を伴う
同腹子は使用してはならない。

MSD接種材料（MN90−SD76−GP2、本文ではMNSD90 76L
またはMSND90 76−Ｐ）を言う）。 気管、肺、鼻甲
介、扁桃、肝臓、脳、脾臓をMSDに自然感染したミネソ
タ州の１群中養育中のブタから得ることができる（Coll
ins et at.,Minnesota Swine Conference for Veterina
rians,Abstract,254−55（1990））。これらの組織ホモ
ジネート（MN 89−35477）を、抗体を用いずにハンクの
塩類溶液で調整し、0.5mlを経鼻腔によりNebulizerガラ
ス（Ted Pella Co.,Redding,CA）を使用して、日齢３日
のノトバイオートブタに接種することができる。接種し
た仔ブタは、自然感染のブタに観察されるのと同様の臨
床的徴候および電子顕微鏡的損傷を発現する場合があ
る。これらのノトバイオートブタから得た肺、肝臓、腎
臓、脾臓および脳を、初回接種後８日後収集し、プール
して別のホモジネートを調整することができる。その
後、第２回目に得られたホモジネートを、ノトバイオー
ト豚にもう一度接種することができる。また、MSDは肺
組織から理想的に増殖させることができるので、肺組織
を分離ホモジネートとして調整できる場合以外は、同様
組織を収集し均質化しても良い。肺ホモジネートは、ノ
トバイオートブタの初回接種材料（MN 89−35477）の第
２の連続継代に相当する（Collinsら、71st Meeting of
the Conference of Research Workers in Animal Dise
ase,Abastract No.2（1990））。２種の濾液を0.20μｍ
フィルター（Gelman Sciences,Ann Arbor,MI）および0.
10μｍフィルター（Millipore Corp.,Bedford,MA）を用
いて調整することができる。これらの濾液を区分して、
−70℃で保管することができる。すべての濾液は、細菌
を有さず、ウイルスは、逆染色調整法を使用しても直接
電子顕微鏡検査では観察されないことが望ましい。

対照接種材料。 擬似感染ノトバイオートブタ２例から
調整した肺組織ホモジネートを対照ブタの接種材料とし
て使用することができる。この対照接種材料をMSD接種
材料に関して述べたように、0.20および0.10μｍの濾液
として調整することができる。

剖検方法および組織病理学。 Collinsら、71st Meetin
g of the Conference of Research Workers in Animal
Disease,Abstract No.2（1990）で先述したように、初
回接種７日後、ブタを安楽死させる。組織を収集し、中
性緩衝ホルマリンで固定し、Collinsら、Am.J.Vet.Re
s.,50,827−35（1989）で述べたように光学的顕微鏡試
験で処理することができる。標本を、鼻甲介、扁桃、気
管、脳、胸腺、肺（根尖葉、噴門側葉、隔膜側葉）、心
臓、腎臓、脾臓、肝臓、胃、十二指腸、空腸、回腸、上
行結腸、下行結腸、血液、隔膜リンパ結節から収集する
ことができる。これらの組織を処理し、光学顕微鏡を使
用して、リンパ単核脳炎、間質性肺炎、リンパプラスマ
細胞性鼻炎、タンパ単核心筋炎または門脈性肝炎が存在
するか否かを測定する。病変は、MSD接種群から得た自
然感染ブタに常時認められる（Collinsら、Minnesota S
wine Conference for Veterinarians,Abstract,254−55
（1990））。糞含有物を収集し、先述のRitchieらによ
る、Arch.Gesante.Virus−forcshe,23,292−98（1968）
のように、ウイルス粒子を試験しても良い。血液を免疫
検定および免疫組織用に収集し、例３に述べるように細
菌用に培養することができる。

B.病原菌の単離 SIRS感染群中の感染仔ブタから得た肺組織および脳−
脾−肝−腎結合組織を個々に均質化した。10％の組織ホ
モジネートを用いた。個々のホモジネートを1ml当たり
約100μｇでゲンタマイシンを含む最小必須培養液（ME
M）と混合した。両試料を約25分間約4000×ｇで遠心分
離にかけた。上澄みを抽出して、0.45ミクロンのフィル
ターに通した。組織ホモジネートおよび肺ホモジネート
を混合させ、この混合材料を使用してさまざまな組織培
養細胞系を感染させた。

1.in vitro試験。 75cm²プラスチックボトルを使用し
て２つの実験を行なった。試験番号１では、混合材料を
以下に記載した細胞系各々の完全細胞シーツを含むボト
ル２本に接種した。さらに、各細胞系を含む１ボトルに
約2.5mgのトリプシンを添加した。残りの条件はすべ
て、細胞系を含む各ボトルに関して同一であった。血清
は、培地に添加しなかった。接種材料は1mlだった。す
べてのボトルを約34℃で７日間保管した。結果は、７日
目の最後に記録した。凍結し解凍した後、試料を同細胞
系における第２の継代用に取り出す。残りの材料は、凍
結し約−60℃で保管した。

試験番号２おいては、混合材料を、試験番号１で使用
したものと同様の細胞を含む１ボトルに接種した。ただ
し、細胞シーツは、接種時には20−40％しか融合してい
なかった。培地は約10％のウシ胎児血清を含んでいた。
さらに、接種材料は1mlであり、培養を約７日間約34℃
で培養した。試験番号１および試験番号２の結果を以下
にまとめた。

使用細胞系 試験番号１ 試験番号２ ウシ鼻甲介（BT） − − ネコ腎臓（CRFK） − − サル（Vero）腎臓 − − サル（Vero）肺 − − イヌ腎臓（MDCK） − − ブタ（PK2a）腎臓 − − ミンク肺 − − ケナガイタチ肺 − − ウシ肺 − − 水牛肺 − − ウシ腎臓（MDBK） − − ブタ精巣（ST） − − サル腎臓（MA−104） − ＋ ヒト直腸腫瘍（HRT−18） − NT ヒト肺 NT − ＋＝CPE効果 −＝CPE効果なし NT＝未試験 細胞変性効果は、評価した細胞系を問わず試験番号１
においては認められなかった。ただし、試験番号２にお
いては、MA−104細胞の小凝集が肥大し、ボトルの縁周
辺の単層で「ウィーク・ホール」を形成し始めた。液体
をボトルから分離し、MA−104細胞（これも20−40％の
細胞シーツである）を含む新たなボトルに継代した後、
もう一度継代した。細胞変性効果は、継代を重ねる度に
大きくなった。上述の方法を、完全細胞シーツを使用し
て、MA−104細胞系に対して繰り返した。その後の試験
は、ウイルス剤は、37℃でも繁殖することを示した。血
清の存在は、ウイルス剤の初回単離に役立てられる。MA
−104細胞系におけるウイルス剤のその後の継代によっ
て、血清を含まないCPEを生じさせることができる。さ
らに、より際立ったPE効果をMA−104細胞系用の増殖培
地に血清を用いることで認めることができる。

ウイルス剤をMA−104細胞系で８回継代したところ、
３日間後の５回目以降の継代では、CPEは良好だった。
得られた力価は対数で約５−1/2であった（10^5.5）。ウ
イスル剤は、さらにサル細胞系でも増殖することができ
る。

2.in vivo試験。 別の継代収集物を使用して日齢３日
のノトバイオート仔ブタに接種した。両仔ブタとも経鼻
腔で、一方は1mlであり、もう一方は2mlで暴露した。仔
ブタを７日間観察し、安楽死させた。

組織材料を病理組織学的試験用とウイルス剤の回収用
に収集した。病理組織学的報告からは、感染仔ブタの肺
病変は、SIRSにかかったことが判明している仔ブタ由来
の肺組織病変と一致することが確認された。組織試料は
前述のように処理され、ウシ胎児血清を含むMA−104細
胞系を20−40％含む単層と100％含む単層上で培養し
た。ウイルス剤を再び回収した。

別の継代収集物を雌ブタに接種し、疾患の繁殖効果を
複製し確認することができることが証明するために使用
した。経産雌ブタ２例に、妊娠93日目に経鼻腔で接種を
行なった。この雌ブタは、それぞれ妊娠112日目および1
14日に50％死産で同腹子の仔ブタを出産した（死産／生
産比は、8/13と6/14）。死産仔ブタ７例は、一部ミイラ
化しており、生産仔ブタは弱く、強健に育成することは
できなかった。このウイルス剤を死産仔ブタの組織から
回収した。

ウイルス剤をSIRSとわかっている３群から回収した。
ATCC VR−2332剤に対する抗体力価は、これらの同じ群
で確認された。

臨床的徴候に違い、すなわち、ヨーロッパ産のブタに
おける耳、尾、乳房のの皮膚チアノーゼが若干あるが、
北アメリカにおける疾患およびヨーロッパにおける疾患
は、同一のウイルスすなわちATCC寄託のVR−2332によっ
て例証されるように選好性非血球凝集外皮RNAウイスル
によって引き起こされるというのが、一般の意見であ
る。

例1A−その他の病原菌特性 A.材料および方法 1.細胞。 ネコ科Crandellの腎臓（CRFK）およびサル腎
臓（MA−104）の細胞を適切な細胞培養フラスコ内で37
℃で育成した。CRFK細胞およびMA−104細胞は、（JRH B
iosciences,Lenexa,KSより入手可能な）10％のγ線照射
ウシ胎児血清（FBS）と１％のペニシリン−ストレプト
マイシンと2.5μg/mlのアムホテリシンＢとを補足した
（Gibco Laboratories,Grand Island,NYより入手可能
な）イーグル最小必須培地（MEM）で増殖させた。MA−1
04細胞を10％のFBSと50μg/mlのゲンタマイシンで補足
同様の培地で増殖させた。FBSおよび細胞は、先述のMay
erら、Vet.Microbiol.,16,303−314（1988）、Smithies
ら、Proc.Annu.Meet.U.S.Amimal Health Assoc.,73,539
−550（1969）およびVickersら、J.Vet.Diagm Invest.,
2,300−302（1990）による方法で、ウシウイルス性下痢
性ウイルスがないことが確認された。

2.VR−2332単離体ソース（SIRSウイルス）。 本例のSI
RSウイルスのソースおよび単離体は、以下記載の通りで
ある。この試験に使用したウイルスは、105乃至10⁶TCID
50/mlの力価のMA−104細胞を５乃至７回継代したものに
乗せた。

ノトバイオートブタ。閉鎖子宮切開で得たノトバイオー
トブタを、先述のMiniatas O.P.ら、Can.J.Comp.Med.,4
2,428−437（1978）のようにフレキシブルフィルムアイ
ソレータで覆わせたステンレス鋼タブに保管した。この
アイソレータは、周囲温度30℃で保管され、ブタに１日
３回商用ミルク代用品を推奨量摂取させた。実験接種前
および剖検時に、糞スワブを収集し、好気雰囲気および
嫌気雰囲気中で、ヒツジ血液寒天、tergital−seven寒
天、ブリリアントグリーン寒天上に接種した。剖検時に
収集した糞も、上述のRichieら、Arch.Gesante.Virus−
Forscheに述べられたように、陰性造影電子顕微鏡検査
によって、ウイルスに対する試験を行なった。

接種材料ソース。 West Central Mnndesotaの分娩から
仕上げまでの160頭の雌ブタの１群が典型的なMSD症候を
有するMSDを発症した。生存雌ブタ、生存新生仔ブタお
よび死産ブタ胎児をMinnesota Veterinary Diagnostic
LAboratoryに提供し、全身剖検、組織病理学的調査およ
び規定の微生物調査を含む試験を行なった。接種材料を
臨床的疾患新生仔ブタ由来の複数の組織を用いて実験す
るために調整した。さらに詳しく述べると、感染した群
れから動物間で流行中に日齢７乃至10日の生存仔ブタお
よび死亡仔ブタを各２例ずつ剖検し、試料を診断試験用
に収集した。生存仔ブタは、剖検前に安楽死用液を静注
し安楽死させた。各ブタからプールした脳、肺および扁
桃から成る10％ホモジネート（MN89−35477）を、100IU
ペニシリンと100μg/mlストレプトマイシンと５μg/ml
アムホテリシンＢとを含むハンクスの平衡塩類溶液（HB
SS）を使用して調整した。

実験的媒介。 一連のノトバイオートブタ14例に、日齢
３日目にプールした組織ホモジネートで抗原刺激を行な
った。各仔ブタは、経鼻腔で、ブタの外鼻孔前に置いた
Nebulizerガラスに取り付けたゴムバルブを使用して、
抗原刺激を受けた。最初、ノトバイオート仔ブタ２例に
濾過していない接種材料をそれぞれ0.5ml接種し、疾患
の臨床的徴候を監視し、暴露後７日後に感電（PE）させ
て安楽死させた。

前述のノトバイオート仔ブタからプールした肺の10％
ホモジネート（MNSD−１）を、１例に0.5mlの未濾過ホ
モジネートを投与し、別の１例に0.45μｍ濾液を投与
し、残り１例には0.22μｍの濾液を投与したノトバイオ
ート仔ブタ３例各々を0.5mlのホモジネートで暴露し
て、盲目的継代を行なった。仔ブタは、PEによって８日
後安楽死させ、組織を組織学的試験用、その後のノトバ
イオートブタ継代用およびウイルス単離用に収集した。

MNSD−１濾液0.45μｍを接種した仔ブタの肺（MSND90
76−Ｌ）と脳、肝臓および腎臓（MNSD90 76−Ｐ）の複
合材料とから成る25％の懸濁液を、カナマイシン、スト
レプトマイシン、バンコマイシンをそれぞれ0.5mg/ml含
むリン酸緩衝塩類溶液を使用して調整した。ノトバイオ
ート仔ブタ６例に肺ホモジネートMNSD90 76−Ｌを、４
例に0.45μmlの濾液を、２例に0.1μmlの濾液を投与し
た。未感染対照ノトバイオート仔ブタ３例については、
１例にHBSSに含有の未感染コブタ組織ホモジネート0.45
μｍを接種し、残り２例にはHBSSのみを接種した。

ウイルス単離。 組織ホモジネート（MNSD90 76−Ｌお
よびMNSD90 76−Ｐ）を20分間４℃で1500gで遠心分離し
た。上澄みを10μg/mlのゲンタマイシンを含む最小必須
培地（MEM）で稀釈し、Vortexミキサーを使用して完全
に混合し、30分間４℃で4500gで再び遠心分離にかけ
た。上澄みを収集し0.45μｍフィルターで濾過した。肺
ホモジネートおよび組織プールホモジネートから得た濾
液を混合し、連続的継代細胞系MA−104に接種した。ウ
イルス単離を10％ウシ胎児血清（FBS）含有の50mlMEM
（pH7.5）を含むMA−104細胞の20−40％密集単層を伴う
75cm²フラスコで行なった。細胞培養は、７日間34℃で
保持した。細胞変性効果（CPE）が７日以内に観察され
ない場合は、培養を凍結し、融解し、MA−104細胞に接
種し、上述のように培養した。

ウイルス滴定。 ウイルス滴定を96ウェル型平底マイク
ロタイタ板で行なった。ウイルスの10回連続稀釈液を２
％FBSを含むMEMで調整した。３日後、細胞育成培地をマ
イクロタイタ板から排除し、200μｌのウイルス稀釈液
を５つのウェル各々に入れて、プレートを５％CO₂雰囲
気中37℃で培養した。３日後、CPEがないウェル中の培
地を２％FBS（pH7.5）で補足したMEMと取換えて、最終
判定を培養５日目に行なった。力価は、ReedらのAm.J.H
yg.,27,493−497（1938）の方法によって算出された。

3.その他のウイルス。 Department of Microbiology,U
niversity of South Dakota School of Medicine,Vermi
llion,SDのRoger Koment博士から得た弱毒化ポリオウイ
ルスをMA−104細胞上で108TCID50/mlの力価まで増殖
し、National Veteronary Servises Laboratory,Ames,I
Aより得られた仮性狂犬病ウイルスのショープ菌株をCRF
K細胞上で成長させて、力価10^5-7TCID₅₀mlになるまで育
成した。これらのウイルスを、試験においてRNAおよびD
NAのウイルス対照として使用し、SIRSウイルスのVR2332
分離体の核酸型を決定した。

4.VR−2332単離体に対する抗血清の調整。

５回目の継代のSIRSウイルスのVR 2332単離体（力価1
0⁶TCID₅₀/ml）を0.25％ホルマリンで不活性化し、フロ
インドの不完全アジュバントで１対１に混合し、ウサギ
にこの懸濁液2mlを２週間間隔て６週間皮下注射した。
最後の注入２週間後に調整した抗血清は、１対512の中
和力価を有した。

5.ウイルス中和化試験（VNT）。 MA−104細胞をVNT用
の平底の96ウェル型マイクロタイタ板に接種した。血清
（100μｌ）それぞれの２回連続稀釈液をMEM稀釈液で調
整し、100−300TCID₅₀/100μｌを含む同容量（100μ
ｌ）単離体VR−2332と混合した。各混合液を37℃で１時
間培養し、200μｌの血清ウイルス混合物それぞれを３
重ウェルに添加する。マイクロタイタ板をさらに３日間
37℃で培養し、細胞変性効果（CPE）について光学的顕
微鏡で調査し、終点力価は、CPEを中和化した最高の血
清稀釈液の逆数として表わされた。

以下のポリクローナル抗血清は、別段の記載がない場
合、VR−2332単離体に関して記載されたように調整し、
VNTに使用した。換言すれば、伝染性胃腸炎のミラー
株、ブタロタウイルスセロタイプ４（Gottfried）、ブ
タロタウイルスセロタイプ５（OUT）、ブタレオウイル
スセロタイプ１、National Veterinary Services Labor
atory,Ames.IAより入手可能なブタエンテロウイルスセ
ロタイプ１乃至８、アメリカン・タイプ・カルチャーRo
ckville,MDより入手可能なブタパルボウイルスに対する
モノクロナール抗体、Department of Clinical and Pop
ulation Sciences,University of Minnesota St.Paul M
NのW.Christtanson博士より入手可能な脳心筋炎ウイル
ス、NAtional Veterinary Services Laboratory,Ames I
Aより入手可能な仮性狂犬病ウイルス、東部脳炎ウイル
ス、西部脳炎ウイルスおよびベネズエラ脳炎ウイルス、
NayerらのVet.Microbiol.,16,303−314（1988）に記載
のBVDVに対するD89モノクロナール抗体、National Vete
rinary Services Laboratory,Ames.,IAより入手可能な
ウマ動脈炎ウイルス、風疹ならびにDepartment of Micr
obiology,University of South Dakota School of Medi
cine Vermillion,SDのW.Cafruny博士より入手可能な乳
酸脱水酵素である。

6.直接電子顕微鏡法（DEM）。 セシウムクロライド勾
配画分を、BenfieldらのJ.Clin.Microbiol.,16,186−19
0（1982）、Horzinek,Non−arthropod−borne Togaviru
ses"（Acad.Press,London,1981）、RichieらのArch.Ges
ante.Virus−forshe.に先述したように、ウイルス粒子
に対してDEMによって試験し、75kV電圧で電子顕微鏡（H
itachi HU12A,日立、東京、日本）で検査した。

7.免疫電子顕微鏡（IEM）。 免疫−金標識化を、ヤギ
の抗ウサギIgG金コロイド粒子（5nm）を使用して行なっ
た。簡潔に述べれば、ウイルスを４℃で30分間、40,000
×ｇで濃縮した。ペレットを50μｌの再懸濁で、25μｌ
をパラフィルム１枚の上に置いた。コロジオン炭素被覆
グリッドをウイルス滴に15分間浮かべて、25μｌのウサ
ギ抗SIRS血清に２分間置いた。グリツドを0.1％のウシ
血清アルブミン（BSA）−トリス緩衝液を２回交換して
各５分間洗浄し、金標識化抗ウサギ−IgG1滴に15分間浮
かべた。各２分間ずつBSA−トリス緩衝液で６回洗浄
し、２回上流水で洗浄した後、ネガティブ染色し、上述
のようにDEMに対して試験した。

8.血液凝集反応（HAT）。 ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウ
シ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒト「Ｏ」
型、カモおよびニワトリの赤血球を血液凝集させるVR−
2332単離体能力を標準的方法を使用して測定した。VR−
2332単離体の第５乃至第７継代の２回稀釈液をＵ底マイ
クロタイタ板のリン酸緩衝塩類溶液（pH7.2−7.4）で調
整した。上述の標本それぞれから洗浄赤血球の１％懸濁
液を等容量、ウイルス稀釈液に添加して、４℃、22℃ま
たは37℃で培養し、（ウイルス非含有の）赤血球対照を
ウェルの底のボタンに沈殿した１−２時間後に判定し
た。

9.免疫蛍光検査（ImF）。 単離体VR−2332感染および
非感染のMA−104細胞の間接または直接ImF染色を、VNT
で試験したポリクロナール抗体またはモノクロナール抗
体を使用して行なった。National Veterinary Services
Laboratory,Ames,IA（Ａ型、H1N1）から入手可能なブ
タインフルエンザおよびNational Veterinary Services
Laboratory,Ames,IAも使用した。先述のBenfieldらの
J.Clin.Microbiol.に記載されているように、細胞単層
のスクラップを無菌接種ループImF染色を用いた72時間P
Iで除去する。陽性対照スライドを雌ブタ由来の回復期
抗血清またはSIRSウイルスのVR−2332単離体に対するモ
ノクロナール抗体（本文では、SDOW12またはSDOW17）の
何れかで染色する。

10.VR−2332の大きさ評価のための濾過試験。

浄化−感染細胞培養上澄みを0.45μｍ（Shleicher and
Scne11,Keene,NH）、0.20μｍ（Millipore Products Di
v.,Bedford MA）および0.05μｍ（Millipore Products
Div.,Bedford,MA）の各フィルターで濾過した。濾過の
前後の感染力価をマイクロタイター検定およびCottral,
Manual of Standardized Methodes for Veterinary Mic
robiology,pp.81−82（Cornell Univ.Press,Ithaca,NY,
1978）で先述した方法を使用して測定した。感染力価に
おいて、100倍の減少は有意と見なされた。

11.VR−2332単離体の勾配精製。

浄化培養上澄みから得たSIRSウイルスのVR−2332単離
体をTNC緩衝液（10mMトリス、100mMNaclおよび2mMCaC
l、pH7.8）中の2mlの20、30、40、50おにび65％ショ糖
（wt/vol）を含む非連続ショ糖勾配を介して、200,000
×ｇ、４℃16時間で遠心分離（Beckman SW 41 Ti roto
r）によって濃縮した。培養上澄みも1,1,2−トリクロロ
トリフルオロエタン（Sigma Chemical Co.,St Louis,M
O）で抽出し、１時間４℃、100,00×ｇで超遠心分離に
かけて、ショ糖勾配に関して述べたように、セシウムク
ロライド密度勾配（1.20g/ml）で精製した。何れかの勾
配から得た画分を上部から収集し、屈折計を使用して屈
折率を測定し、選択画分を上述のウイルス滴定用ハンク
の均衡塩類溶液で稀釈した。

12.クロロホルムおよびフルオロカーボン培養。

等量のSIRSウイルス（VR−2332）およびクロロホルム
を周囲室温で30分間定期的に混合し、500×ｇ、４℃で1
5分間遠心分離した。同様に、等量の1,1,2−トリクロロ
トリフルオロエタンおよびSIRSウイルスを５分間渦状撹
拌し、クロロホルム処理ウイルスに関して述べたように
遠心分離した。遠心分離後、各処理試料の水性相を収集
し、稀釈し、マイクロタイター検定を使用して、残りの
ウイルス感染力を測定した。非処理ウイルスと比較し、
処理ウイルスの力価が100倍減少していることは有意で
あると見なされた。

13.VR−2332単離体に対するDNAウイルス阻害剤の効果。
５−ブロモ−２−デオキシウリジン（BUDR）およびマ
イトマイシンの配合物は、DNAウイルス複製阻害座とし
て知られているが、レトロウイルス科を除き、RNAウイ
ルスを阻害することはない（Easternbrook,Virology,1
9,509−520）およびReichら、Proc.Natl.Acad.Sci.,47,
1212−1217（1961））。仮性狂犬病およびポリオウイル
スを本実験では既知のDNAウイルス対照およびポリオウ
イルス対照として使用した。細胞（CRFKまたはMA−10
4）を96ウェル型ミクロタイター板に接種し、複製のウ
ェルを仮性狂犬病ウイルス、ポリオウイルスまたはSIRS
ウイルス各々の100μｌの10倍稀釈液で接種した。37℃
の１時間吸収期後、未吸収ウイルスを含む培地を取り出
し、MEM（未処理ウイルス対照）、40もしくは150μg/ml
のBUDRで補足したMEMまたは２、10もしくは20μg/mlの
マイトマイシンＣを含むMEMと取換えた。マイクロタイ
ター板をさらに４日間37℃で培養し、CPEに対して光学
的顕微鏡法で調査をして、ウイルス力価を上述のCottra
lの文献（1978）による方法で計測した。非処理対照と
比較したウイルス感染力価の1000倍の減少は、有意であ
ると見なされた。

14.SIRSウイルスの温度安定性。 MEM中の2mlのアリコ
ートを４度または水槽中で37度および56℃で少なくとも
５日間培養した。３つの異なる温度で各管から得たアリ
コートを15、30、60および120分目に収集し、12乃至120
時間までは12時間間隔で収集した。ウイルス試料をMEM
で10倍稀釈し、ウイルス力価は上述のようになった。

B.結果。

1.MA−104細胞に対するVR−2332単離体の細胞変性効
果。 CPEは小型の細胞球状凝集として発現し、この凝
集は未感染単層残物上方に上昇すると考えられた（図1
B）。球状凝集数は増加し、細胞の多くは核凝縮を起こ
し、２乃至４日PI以内に単層から剥離した。５乃至６日
PIまでに、CPEは100％の単層において明らかとなった。
感染力価は、ウイルスの連続継代５度目および７度目に
は、各々10⁵乃至10⁷TCID₅₀/1mlと同様であった。未接種
のMA−104細胞では、CPEは観察されなかった（図1A）。

蛍光は非接種MA−104細胞では観察されなかった。図2
Bは強烈な拡散蛍光が（SIRSのVR−2332単離体に対して
調整した）ブタ回復期血清、ウサギ抗血清またはモノク
ローナル抗体のいずれかで染色した接種MA−104細胞の
細胞質に認められることを示す。

2.SIRSウイルス（VR−2332単離体）の感染力に対する脂
質溶剤の効果。

クロロホルムによるウイルスの前処理は、感染力を相
殺した（10⁵から10¹TCID₅₀/1mlまで減少）。従って、フ
ルオロカーボン処理には有意な効果はなかった。

3.血球凝集。 ウイルスは、培養温度とは無関係に異な
る11種から得られた赤血球を凝集させなかった。

4.濾過によるSIRSウイルスの大きさ評価。

ウイルス力価は、0.45、0.20および0.10μｍフィルター
による濾過後も変化しなかった。ただし、感染力価葉、
0.05μｍ（50nm）による継代後には、（10⁵−10²TCID₅₀
/1mlまで）1000倍減少した。

5.SIRSウイルス複製に対するDNA阻害剤の効果。 仮性
狂犬病DNAウイルスだけは、BUDRまたはマイトマイシン
Ｃによって感染力が減少した。ポリオウイルス（RNA）
対照およびVR−2332単離体の複製は、影響を受けず、SI
RSウイルスのゲノムが恐らくRNAであることが示された
（表１および２）。

6.ウイルス精製。 ウイルス帯はショ糖勾配では検出さ
れなかった。ウイルス力価のピーク（10⁴TCID₅₀/ml）
は、1.18−1.23g/mlの浮遊密度を有する画分から発見さ
れた。このピークウイルス懸濁液の感染力価（10⁷TCID
₅₀/ml）の1000分の１以下であった。セシウムクロライ
ド勾配によって、単一の僅かなタンパク光帯が1.18−1.
19g/mlの浮遊密度で生じた。ピークウイルス感染力は、
1.3×10⁶TCID₅₀/1mlであるが、これはショ糖勾配から得
られるピーク感染力寄りも130倍高く、この可視帯に一
致した（図３）。

7.精製SIRSウイルス粒子のDEM。

相似形態であるが主に球状ビリオンがCsCl画分中のDE
Mによって認められた（1.18−1.19g/ml）。ビリオン
は、直径48−80nm（平均25粒子＝62nm）であり、薄膜ま
たは外皮に囲まれた完全な電子半透明または中空（電子
密集中心）粒子から成っていた（図4A）。［長さ約5nm
の短い突起を有する直径40−45nmのイソサヘドラルヌク
レオチドカピドが観察された。］これらの粒子は、直径
25−35nmの核を含んでいた（図4B）。ウサギ高度免疫抗
血清と金標識化抗−ウサギIgGとを１次および２次抗体
として使用した場合には、ビリオンを免疫−金標識化し
た（図4B）。VR−2332単離体に対するウサギ高度免疫血
清の非存在下では、ビリオンを金標識化しなかった。

8.他のウイルスから得た抗血清に対するSIRSウイルスの
抗原関係。 既知のブタウイルスとさまざまなトガウイ
ルスは、感染MA−104細胞中のSIRSウイルス抗原と中和
化したり、反応したりしなかった。回復期のブタ抗血清
および高度免疫ウサギ血清は、各々1:256と1:512の中和
化抗体力価を有していた。

9.SIRSウイルスの感染力に対する温度効果。

MA−104細胞に対するウイルス感染力は、12時間37℃
の培養後50％減少し、37℃の48時間培養および56℃の45
分間培養後完全に不活性化した（図５）。感染力は（デ
ータを示さないが）４℃の１か月培養または４か月の−
70℃培養後は変化しなかった。SIRSウイルスに感染しハ
ンクスの均衡塩類溶液で均質化したノトバイオートブタ
から回収した肺組織は、少なくとも18か月間ブタに対す
る感染力を維持する。結果は、VR−2332単離体は選好性
非血球凝集外皮RNAウイルスであり、未知の属の非節足
動物偏狭性トガウイルスに仮説的に分類することができ
る。

SIRSウイルスのRNAゲノムの存在葉、DNAおよびあるRN
Aウイルス系統群の複製を阻害しその他のRNAウイルスの
複製を阻害しないことが知られる５−ブロモ−２−デオ
キシウリジンおよびマイトマイシンＣの存在下で継続的
に複製するこのウイルスの能力によって確認された（Ea
sterbrook,上述（1962）、Reichら、上述（1961）。RNA
ウイルスとしてのSIRウイルスの暫定的な著者らの分類
は、このウイルスがImFによって検出されるウイルスの
存在によって示される細胞の細胞質で複製する観察結果
に一致する。

SIRSウイルスのVR−2332単離体は熱に不安定である
が、４℃および−70℃では比較的長期間安定である。37
℃でのこのウイルスの熱不安定性は、ウイルスの増殖に
対しては実用的であり、このことから37℃以下の温度で
の増殖によってウイルスの収率が高くなることが示唆さ
れる。短期間のウイルス単離体に対する診断試料の保存
には、冷蔵で十分であり、それ以外の場合には、試料を
数ヶ月以上冷凍することができる。

例 ２ 例１における実験から測定されたように、MSD病原菌
を含む接種材料の最も純粋な形態を使用してMSD病原菌
を妊娠ブタに伝達し、病徴の複数形態を複製することが
できる。

考察。 最近、（当分野においてMSDの顕著な臨床的徴
候である）一過性食欲不振および早期分娩は、ノトバイ
オートブタに呼吸器系疾患による病変を生じさせる同一
のMSD接種材料を接種した雌ブタ２例中２例に生じた。
また、29例中15例（52％）のブタは死産で、残り14例は
衰弱し、十分に乳飲することができなかった。肉眼的病
変または顕微鏡的病変は、死産ブタには観察されなかっ
たが、微生物剤を検出する胎盤処理および単離処理が現
在進歩している。従って、以下の試験はMSDの複数形態
が経鼻腔で雌ブタに伝達されうるか否かと、胎児生存度
の干渉は胎児ではなく母系組織の複製から生じるのか否
かを述べた実験である。

例１の実験から、どのように接種材料を処理（フィル
ターの大きさ、組織培養の抽出およびプロテアーゼ診断
またはそのいずれか一方）するかに関する情報が提供さ
れ、接種材料（すなわちウイルス剤）に対するMSD因子
の最も純粋な形態が提供される。MSD因子には若いブタ
に対する呼吸器形態とブタ成体の複数形態とがあるの
で、症候群の後者の形態を複製し、さらに病原菌がMSD
の理論上の原因であることを証明しなければならない。

MSD病原菌を接種したブタに流産を実験的に誘導する
ことは可能であるので、妊娠93日目のブタを実験動物と
して使用する。雌ブタは、生殖上の問題がなく、MSDに
かかっていない商用群から購入すれば良い。この群の完
全な免疫学的記録をコンピュータ処理すると、妊娠期
間、同腹子の大きさ、死産児数の平均を比較研究に利用
することができる。３例の雌ブタから成るグループそれ
ぞれに妊娠93日目に0.20μmlの濾液（陽性対照）、病原
性であるが、例１の結果によって示される修飾接種材
料、接種材料の0.20μｍの濾液（陰性対照）または例１
の実験結果より示されるように修飾した対照接種材料の
何れかを経鼻腔で接種することができる。各グループの
ブタを個別隔離室に収容し、出産するまでの間毎日調査
を行なう。温度およぴ（食欲不振や、咳、クシャミ、浅
息呼吸、呼吸数の増加などの呼吸器系統の問題など）臨
床的徴候を毎日記録する。ブタのサンプリングは、血清
学上分娩前後の血液試料に限定される。実際の分娩日を
記録し、死産児、ミイラ化した胎児、生産「衰弱」ブタ
および生産「正常ブタ」を決定する。胎児に例１に述べ
たように肉眼的病変および顕微鏡的病変について調べ、
例３で述べるように、胎児組織を微生物学的方法で処理
する。胎児血清によってガンマグロブリンおよびPPVな
らびにEMCVの存在について調査することもできる（Joe
ら、In Proceedings of the Mystery Swine Disease Co
mittee Meeting,62−66（1990）、Kimら、J.Vet.Diagn.
Invest.,１,101−４（1990））。生産したブタを１週間
観察し、罹患率および死亡率を記録し、ブタを安楽死さ
せた後、胎児について述べたように、光学顕微鏡検査お
よび微生物学的検査用に組織を収集した。

MSD接種材料から成る0.2μｍの濾液および修飾した濾
液は、ブタに対して病原性があり、食欲不振や、時には
微熱、各同腹子の多数が死産か衰弱している早期分娩を
誘導する。これは、接種材料がMSD因子を含む証拠であ
る。対照接種材料を接種した雌ブタは、予定日近くに分
娩したが、この群の利用可能な疫学的データベースから
分かるように、元の群の標準範囲内の同腹子を出産して
いる。死産ブタの病変は認められず、生存衰弱ブタにお
いては生後１週間以内の致死率が高いことがわかった。

例 ３ MSD接種材料で接種し、接種後さまざまな時期に安楽
死させたノトバイオート仔ブタから収集した組織試料を
使用して、MSDの病原菌を単離同定し、病変の連続的発
達を測定し、MSD因子が免疫抑制的であることを確認す
る。

凍結組織および接種細胞培養に対する免疫蛍光検査法。
凍結組織および細胞スクラップに対する免疫蛍光検査
をBenfieldら、J.Clin.Microbiol.,16,186−190（198
2）およびBenfieldら、Am.J.Ver.Res.,49,330−36（198
8）に先述したような方法で実行する。凍結組織および
細胞スクラップをPPV、EMCV（頭字語については例４参
照）およびMSD因子についてスクリーニングを行なっ
た。PPVおよびEMCVに対する接合体は、South Dakota An
imal Disease Research and Diagnostic Laboratoryで
入手できる。ノトバイオートブタにおける高度免疫血清
をMSD接種材料の最も純粋な形態から調整する。ブタ２
例を経鼻腔接種し、初回接種２週間後および４週間後に
フロインドの不完全アジュバント中の接種材料を皮下経
由で追加抗原刺激する。血清を最後の追加抗原刺激２週
間後にこのブタから収集する。対照血清も、対照接種材
料とMSD接種材料に関して述べた同一の免疫化プロトコ
ルを用いてノトバイオートブタ２例について調整する。
これらの血清を一次抗体として使用し、フルオレセイン
イソシオチアン酸塩で接合したヤギまたはウサギの抗ブ
タ免疫グロブリンを二次抗体として使用し、凍結組織片
および細胞培養中のMSD抗原を検出することができる。

血清学的検査。 対照ブタまたは接種ブタから収集した
血清について、PPVおよびSIV（血球凝集阻害）、レプト
スピラ（微細凝集）、ならびにEMCV（ウイルス中和化）
に対する抗体が存在するか否かを検査する（頭字語につ
いては例４参照）。以前の結果は、他の一般の微生物学
的因子に対する血清学的検査には陰性であったことが示
されている（Collinsら、71st Meeting of the Confere
nce of Research Workers in Animal Disease,Abstract
No.2（1990））。

免疫学的検査。 組織および血液をMSD接種ブタおよび
対照ブタから収集し、免疫学的状態を測定する。ブタ白
血球をPescovitzら、J.immunol.,134,37−44（1985）に
よって示されるように、Histopaque 1077にかけて、単
回不連続勾配浮遊法によって末梢血から単離する。リン
パ結節、脾臓および胸腺から得た細胞を、生成細胞懸濁
液の組織および収集物を適度にミンスすることによっ
て、単細胞に分解する（Hurleyら、Cancer Res.47,3729
−35（1987））。

ブタ白血球表現型をアメリカン・タイプ・カルチャー
コレクションおよびJoan Lunney（USDA Beltsville,M
D）経由で入手できるモノクローナルパネルを使用して
決定することができる。これらには、Ｔ細胞、pCD2（MS
A4;Hammerbergら、Ver.Immunol.Immunopathol.,11,107
−21（1986）、ヘルパー／クラスII MHC 依存Ｔ細
胞、pCD4（74−12−;Lunneyら、Ver.Immunol.Immunopat
hol.,17,135−144（1987））細胞傷害性−サプレッサー
／クラスＩ MHC依存Ｔ細胞、pCD 8（74−２−11;Ibi
d）、マクロファージおよび顆粒細胞（74−22−15A:Ibi
d）、ヒトDRwと等価のブタMHCクラスII抗原（MSA3;Hamm
erbergら、Vet.Immunol.Immunopathol.,11,107−21（19
86）ならびにDQw（TH21A）およびその他VRMD、Pullma
n、WA;Davisら、Hybridoam Techonology in Agricultur
e and Veterinary Research.Rowman and Allanheld,121
−50（1984））などがある。ブタ免疫グロブリンに対す
るイソタイプ−特異モノクローナル抗体も利用可能であ
り（Paulら、J.Vet.Res.,50,471−79（1989））、末梢
血、リンパ結節およびパイエル板から得た白血球を間接
蛍光染色するために２度に分けて最小飽和濃度で使用す
ることができる（Vet.Immunol.Immunopathol.,25,177−
93（1990））。２色検査を実行するためには、ビオチン
（Pierce kit ＃21333）抗体で標識化した後、rPE−標
識化アビジンで細胞を染色すれば良い。細胞をフローサ
イトメトリーまたは２色解析蛍光顕微鏡（PTI FSCANシ
ステム）で解析する。フローサイメトリー時の488nmレ
ーザー光線での相互検出または二重蛍光顕微鏡法の使用
を容易に行なうことができる。細胞性蛍光強度および陽
性細胞の百分率も測定する。

コンカナバリンＡ、アメリカヤマゴボウマイトジェン
（PWM）および植物性血球凝集素（PHA）を用いるレクチ
ン有糸分裂法などのin vitro機能検査法をHammerberg
ら、Am.J.Vet.Res.,50,868−74（1989）に記載のように
実行する。リゾチームに対する抗原特異in vitroT細胞
反応を、それらの技術実行後にモデル化することができ
る。Ｂ細胞増殖検査を大腸菌およびネズミチフス菌LPS
または抗免疫グロブリンによって、Symonsら、Int.Arch
s.Allergy Appl.Immun.,54,67−77（1977）において報
告されているように行なうことができる。PWMを用いて
誘導されるin vitro抗体生成は、Hammerbergら、Am.J.V
er.Res.,50,668−74（1989）に述べられているように達
成され定量される。大腸菌LPSに対する48時間暴露後のI
1−１のマクロファージ生成をマウス胸腺細胞検査で測
定することができる（Mizel,Immunological Res.,63,51
−72（1982））。PHA−刺激リンパ球によるI1−２の生
成を、Stottら、Vet.Immunol.Immunopathol.,13,31−88
（1986））に記載のように測定することができる。イソ
タイプ−特異抗リゾチームELISAをブタ免疫グロブリン
イソタイプに対するモノクローナル抗体を用いて行なう
ことができる（Paulら、Am.J.Vet.Res.,50,471−79（19
89））。

in vivo抗体生成を評価するためには、MSD感染の仔ブ
タ３例および対照接種材料接種３例に対し、ヒツジ赤血
球の２％懸濁液およびウシ血清アルブミンの10μg/ml溶
液を別々の部位に、初回接種５、７、10、14および24日
後に注入すれば良い。初回接種24日後にブタを安楽死さ
せて、例１に述べたように組織病理学用に収集し、血液
を収集し、抗体検査をする。全抗体濃度および各抗原に
対する特異IgGおよびIgM反応を抗原特異放射免疫拡散法
またはE1ISAで測定する。抗原−特異プラーク検査を脾
細胞に対して実行し、感染ブタおよび対照ブタのＢ細胞
クローンの頻度を評価する（Kappler,J.Immunol.,112,1
271−85（1974））。

例 ４ 目的。 本実験の目的は、MSD単離体に対するノトバイ
オートブタの高度免疫抗血清を調整し、診断試薬として
使用して、MSDの抗原特性を特徴化することにある。

背景。 ミネソタ大学協力のサウスダコタ州立大学にお
けるノトバイオートブタの先行研究により、現場症例MN
−8935477より得たプール組織ホモジネートがノトバイ
オートブタの肺病変を誘導したことが示された。これら
のブタ由来のプール組織ホモジネートは、その後、日齢
３日のノトバイオートブタの臨床的疾患および呼吸器系
統病変の特性を生じさせるために使用されている（Coll
insら、71st Meeting of Research Workers in America
n Diseases.,Abstract No.2（1990））およびCollins
ら、Minnesota Swine Conference for Veterinaians,Ab
stract,245−55（1990））。肺ホモジネートおよび組織
ホモジネートをノトバイオートブタ（90×75）の初回接
種材料の第２継代から調整し、第２の接種材料を生成し
た。第２の接種材料を接種材料および抗原として、この
実験の高度免疫血清を生成するために使用することがで
きる。

目的を達成するための方法。

ノトバイオートブタ。ノトバイオートブタを先述のBene
fieldら、Am.J.Vet.Res.,49,330−36（1988）およびCol
linsら、Am.J.Res.,50 827−835（1989）に記載のよう
に誘導し維持することができる。

高度免疫血清接種。 高度免疫血清を上述のようにノト
バイオートブタ１例に初回接種することによって調整す
ることができる。その後、ブタには1mlの第の接種材料
および1mlのフロインドの不完全アジュバントを含む追
加抗原を初回接種14および21日後に投与する（Harlowお
よびLanne,1988）。このブタは、最終接種後14日以後に
安楽死させることが望ましい。血清を回収し、適切なア
リコートに調整し、−20℃で凍結することが望ましい。

血清学的検査。 大半の診断研究所で一般に行なうよう
に、高度免疫血清についてブタ共通の病原体に対する抗
体があるか試験をする。この血清をヘモフィルス、ブル
セラ、レプトスピラ（６血液型亜型）、仮性狂犬病ウイ
ルス（PRV）、パルボウイルス（PPV）、脳心筋炎ウイル
ス（EMC）およびブタインフルエンザウイルス（SI）に
対する抗体について検査することができる。

結果。 抗血清調整用のブタは、ブタ＃4B（実験番号90
x238）であった。このブタは1990年11月１日に接種し、
1990年11月29日殺処分するまで毎日臨床的徴候について
観察した。臨床的徴候は、表１にまとめた。残念なが
ら、ブタの連続変性条件は、1990年11月13日の僅か１回
の追加免疫後に安楽死させることであった。初回追加免
疫16日後の1990年11月29日にブタを安楽死させた。

血清学的結果は、16,384の力価を有するPPV以外の上
述の因子はすべて陰性だった（表２参照）。このブタの
滴定前の血清は処理しなかった。

肺、心臓、脳、腎臓、結腸、小腸、鼻甲介、脾臓、胃
および気管をブタ剖検時に収集した。これらの試料を評
価し、ブタ由来の肺がMSDの現場症例を伴って典型的に
みられるその重篤な肺炎に関する病変を有することがわ
かった。

この実験結果は、病原菌は、MSDの自然症例に典型的
に見られる臨床的疾患および病変を誘導するので、病原
菌が第２の接種材料に存在するとする初期の試験を確証
するものである。

表 ２ 接種ブタの抗体試験 1.ブタインフルエンザ−陰性 2.ブタ脳心筋炎−陰性 3.ブタAPP−陰性 4.ブタPRV−陰性 5.ブタPPV−陰性 6.ブタブルセラ−陰性 7.ブタレプトスピラ−陰性 8.ブタDEPI−陰性 例4A−モノクローナル抗体調整 マウス免疫化。 ハイブリドーマ融合の８日前、BALB/C
AnNマウスにフロインドの完全アジュバント（CFA）に
抗原を含む1:1の懸濁液をIP接種した。使用する抗原の
量は、抗原の免疫原性および毒性によって異なる。１マ
ウス当たり、最大0.3mlのCFAを使用する。融合１週間前
は、塩類溶液に含めた抗原でマウスをIP免疫する。融合
２日前は、マウスIVを塩類溶液に含めた抗原を接種す
る。

骨髄腫細胞。 10％のウシ胎児血清を含むダルベッコの
調整イーグル培地上で、マウス骨髄腫細胞（P3.NS−１
−Ag4−１（ATCC TIB 18））を維持する。約10⁷−10⁸個
の細胞を、模範的なマウスの１脾臓から得られたＢ細胞
に融合する。ハイブリドーマ融合直前に、50mlの遠心分
離管に対数期培養から骨髄腫細胞を収集し、５分間の20
0×ｇ遠心分離によってペレット細胞を収集する。上澄
みを抽出し、細胞を２度無血清DMEMで洗浄し、上述のよ
うに遠心分離にかける。（10⁷−10⁸個の細胞を含む）ペ
レットを1mlの無血清DMEMで再懸濁する。

脾臓リンパ球の単離。 頸部脱臼によってマウスを安楽
死させ、７分間70％のエタノールに浸漬する。無菌処理
によって脾臓を摘出し、5mlの低温無血清DMEMを含む無
菌ペトリ皿に移す。メスを使用し、長軸に沿って脾臓を
切れ目を入れ、脾臓の縦方向にそって徐々に解体して、
脾細胞を培地に放出する。ピペットを使用して遊離細胞
および培地を15mlの遠心分離管に移すが、脾臓ケーシン
グは残す。管の組織デブリを５分間放置し、単細胞懸濁
液を新たな管に移す。細胞を５分間200×ｇで遠心分離
し、上澄みを捨て、ペレットを低温無血清DMEMで洗浄す
る。細胞を1mlの無血清DMEMで再懸濁し、融合するまで
氷上で保管する。

融合。 脾細胞を骨髄腫細胞を含む遠心分離管に添加
し、５分間500×ｇ遠心分離する。上澄みをすべて除去
し、管の側面を軽く叩くことによって細胞ペレットを解
す。すべての試薬および細胞を37℃に維持し、1m150％
のポリエチレングリコール溶液（PEG 4000,Gibco,Grand
Island,NY）を滴状で穏やかに混ぜながら１分間かけて
添加する。37℃で１分間混合物を放置する。1mlの中温
無血清DMEMを穏やかに混ぜながら滴状に１分間かけて添
加する。最後20mlの無血清DMEMを４分間滴状添加して、
すぐに200×ｇで５分間細胞を遠心分離にかける。上澄
みを除去し、20％のウシ胎児血清、0.2単位/mlのインシ
ュリン、0.5mMのピルビン酸ナトリウム、1mMのオキザロ
酢酸、2mMのＬ−グルタミン、非必須アミノ酸および10
％のNCTC−109リンパ球培地を含む47mlのDMEMで細胞を
再懸濁する。1ml容量の細胞再懸濁を24−ウェル型平底
組織培養板２枚のウェルに添加する。骨髄腫細胞の対照
ウェルを含ませ、板を37℃および10％CO₂（SDMEM）で培
養する。

１晩培養した後、各ウェルから0.5mlの培地を細胞層
を動揺させずに取り出す。１×10^-4Mのヒポキサンチ
ン、４×10^-7Mのアミノプテリンおよび1.6×10^-5Mのチ
ミジン（HAT）を、各ウェルに添加し、37℃および10％C
O₂で培養を続ける。２−３週間週に３回、1mlの使用培
地を1mlの新鮮なDMEM＋HATを継続して取り替える。有意
なクローン増殖が見られた場合、ELISA、間接FAまたは
その他の適切な検定システムで特異抗体がウェルに存在
するか否かを検査する。

クローニング。 特異抗体に対して陽性試験を行なう一
次ウェルを、サブクローニングして直ちに安定した細胞
系を得て、その他のクローンによる過剰増殖を避けるこ
とが望ましい。選択した一次ウェル細胞を再懸濁して、
トリパンブルー染色法および血球計数器で細胞数を計測
する。細胞を稀釈し、SEMEM＋HT中約２細胞/mlの最終濃
度を得る。非接種マウスから得た標準脾細胞を100ml培
地当たり50μｌの濃縮細胞を添加することによって支持
細胞層として用いる。

250μｌの細胞懸濁液を96−ウェル型板の各ウェルに
添加し、37℃10％CO₂で培養する。クローンは、２−３
週間後には肉眼視できることが望ましく、単クローンを
含むウェルから得た上澄みは、有意な増殖が認められた
場合に検査する。特異抗体に対する陽性試験を行なうウ
ェルでクローニング処理を繰り返す。選択クローンを組
織培養フラスコに徐々に拡大し、さらに特徴化し凍結保
存する。

腹水生成。 ハイブリドーマ細胞接種の２週間前、BALB
/c AnNマウスに0.5mlのプリスタンのIP投与で初回抗原
刺激を行なう。ハイブリドーマ細胞を収集し、ハンクス
の均衡塩類溶液で１回洗浄する。HBSSで細胞を再懸濁
し、初回抗原刺激を受けたマウスに10⁴−10⁶の生存可能
細胞を接種する。腹水生成が明らかである場合（通常
は、接種１−２週間後）、鼠径部に16 G 1−1/2"ニード
ルを腹側挿入して抽出する。ニードルのハブを遠心分離
管上で固定し、腹水を管に排出する。腹水液を200×ｇ
で遠心分離し、0.2nmのフィルターで濾過し、凍結保管
する。

例４−SIRSモノクローナル抗体 （SDOW12およびSDOW17） SIRSウイスルに対するモノクローナル抗体SDOW12（AT
CC No.HB 10996）およびSDOW17（ATCC No.HB 10997）を
上述の標準モノクローナル抗体生成プロトコルを用いて
調整した。マウス免疫化に使用した抗原をBoehringer I
ngelheim Animal Health（BIAH）から得たMA−104で育
成した６回継代のSIRSウイルス（VR−2332）であった。
各免疫化には、マウスに力価10⁶TCID₅₀/100μｌを含む
0.3mlの勾配生成ウイルスを接種した。

間接蛍光抗体（IFA）検査を用いて、ハイブリドーマ
一次ウェルおよびクローンウェル中の特異抗体を検出し
た。96−ウェル型組織培養板におけるアセトン固定ウイ
ルス感染および非感染の細胞単層をIFAに用いた。これ
らのハイブリドーマ由来の細胞培養上澄みおよび腹水液
によって、SIRS感染細胞中に明るい顆粒細胞質蛍光が生
じた。

これらのモノクローナル抗体の予備的特性化には、免
疫グロブリンイソタイピングやSIRSウイルスタンパク質
の放射性免疫沈殿解析などがある。モノクローナル抗体
SDOW12およびSDOW17は、IgG₁イソタイプである。両抗体
は、15kDのウイルスタンパク質に放射性免疫沈殿解析時
に結合した。

例 ５ ３つの予備試験について説明する。ノトバイオートブ
タ試験は、現場材料を使用して、ノトバイオートブタに
おける症候群の呼吸器系成分に感染し、それを誘発する
ことができることを示すために意図された。一般の離乳
ブタを使用する第２の試験は、ノトバイオートブタに見
られる呼吸器疾患が一般のブタに再生されうるか否かを
判定するために意図された。最後に、妊娠ブタ試験は、
症候群の再生不全成分を実験的に複製できるか否かを判
定するために意図された。

材料および方法 現場症例。 例1Aの接種材料ソースを参照。

ノトバイオートブタ試験。 子宮摘出誘導のノトバイオ
ート仔ブタ６例に日齢３日目に現場接種材料（さまざな
まな組織を含む10％ホモジネート）を接種した。濾過
（0.22μｍ）および非濾過の接種材料を使用した。対照
仔ブタ２例には培地のみ接種した。臨床的徴候を毎日監
視し高度免疫血清生成に保持するブタ１例を除いて、接
種後８日目に安楽死させた。ウイルス単離および組織学
的検査に用いる組織を剖検時に血清とともに収集し、血
清をレプトスピラ、クラミジア、エペリスロゾーン、ア
ウジェスキー病ウイルス、ブタパルボウイルス、脳心筋
炎ウイルス、血球凝集性脳炎ウイルス、ブタインフルエ
ンザウイルス、ウシRSウイルス、犬ジステンパーウイル
ス、ウシ性下痢ウイルスおよびブタコレラに対する抗体
について、血清のスクリーニングを行なった。初回接種
材料は、ノトバイオート仔ブタを連続的に３回継代する
ために初代細胞系に接種した。さらに、直接免疫電子顕
微鏡検査を行なった。

通常飼育ブタ試験。 MSD病歴のない農場から入手した
通常飼育の日齢28日の離乳ブタ３例に、感染ノトバイオ
ート仔ブタ由来の10％肺ホモジネートを経鼻腔接種し
た。陰生ノトバイオートブタからの肺ホモジネートを対
照用の接種材料として用いた。仔ブタの臨床的徴候につ
いて毎日監視し、接種８日後に剖検した。血清／組織を
上述の方法で処理した。

妊娠ブタ試験。 MSDのない農場から得た過去の出産日
がわかっている経産雌ブタ８例を本試験に使用した。予
定分娩日の３週間前、雌ブタ６例に感染ノトバイオート
肺ホモジネートを経鼻腔で接種し、２例には陰性肺ホモ
ジネートを接種した。毎日、臨床的徴候を監視した。雌
ブタには自然分娩させ、可能であれば、分娩に立ち会
い、生産ブタから乳飲前の血清を収集した。雌ブタおよ
び生産ブタを分娩後間もなく安楽死させ、組織病理学用
およびウイルス単離用に収集した。血清または胸部液も
収集した。

結果 現場試験。 肉眼的病変は剖検時には見られなかった。
養生ブタの顕微鏡的試験から、壊死性間質性肺炎および
リンパ球単核脳炎があきらかになった。胎児には病変が
なかったが、雌ブタには頻度の脳炎があった。顕微鏡的
試験では決定的な結果は出なかった。

ノトバイオート試験。 接種後、仔ブタの食欲は減退
し、毛皮が荒くなった。対照動物は正常を維持した。顕
微鏡的病変が濾過または非濾過の材料を接種した当該の
ブタに認められた。病変は現場症例に類似し、壊死性間
質性肺炎（6/6［仔ブタ６例中６例］）、リンパ球形質
細胞性鼻炎（4/6）、リンパ球単核脳炎（2/6）および心
筋炎（1/6）を含んでいた。病因学的因子は、接種前後
の血清学的検査によっても接種材料／組織試験によって
も同定されなかった。

通常飼育離乳ブタ試験。 臨床的には、当該のブタが接
種２日後に鈍くなり食欲不振となった。これらのブタ
は、温度を十分に提供していてさえも、身震いをしてい
るように感じられた。１例の体温は、接種６日後に上昇
していた（41.5℃）。間質性肺炎、脳炎および心筋炎
は、当該のブタには認められたが、対照には認められな
かった。

妊娠ブタ試験。 臨床的には、２例に限っては、が接種
後３または５日後、若干の体温上昇があった（1.5
℃）。ただし、食欲減退は、4/6の雌ブタについて接種
４または５日後に認められた。３例は最大７日早く分娩
し、３例は予定通り分娩した。感染雌ブタの胎児の50％
以上が死産であったが、対照は正常な同腹子を産んだ。
実験室的所見は、決定的ではなく、特異因子は同定され
ず、病変は現在まで認められていない。

原因的微生物は同定されなかったが、所見からMSD
は、（１農場からの現場組織を使用して）実験的にノト
バイオートブタおよび通常飼育ブタに伝達され得ること
が示唆された。MSDに対する呼吸器系形態および生殖的
形態は、再生された。当該因子は、伝染性で0.22μｍに
おいて濾過性があると思われるほか、外見上選好性であ
る。

考察 米国だけではなく世界中でMSDは重要で新種の疾患で
ある。調整した環境において疾患を研究するには、ノト
バイオートブタには、MSDの臨床的徴候を経験している
農場から得た組織ホモジネートを用いて日齢３日目に経
鼻腔接種した。壊死性間質性肺炎を含む現場症例に類似
しているが、リンパ球形質細胞性鼻炎、リンパ球単核脳
炎または心筋炎にはあまり類似性が少ない顕微鏡的病変
は、実験動物には見られたが対照には見られなかった。
ノトバイオートブタから得た肺ホモジネートを使用した
場合、通常飼育の生後４週目の離乳ブタは同様の病変を
引き起こした。経産の妊娠ブタにも分娩日の３週間前に
ノトバイオートの肺ホモジネートを接種した。臨床的に
は、これらの雌ブタはある期間食欲不振になり、最大７
日間前までに分娩した。50％以上の胎児は死産または初
期の段階でミイラ化しているかのいずれかだった。これ
らの所見は、病減菌に関する病気を単離し、実験的に現
場組織を用いてノトバイオートブタに伝達させることが
でき、ノトバイオートのブタから通常飼育のブタまたは
妊娠ブタに伝達させることができる。本研究は、疾患の
呼吸器的形態および生殖的形態のモデルを提供するの
で、MSDの発生病理および診断方法をさらに調査するこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ (31)優先権主張番号 ８６０，４４４ (32)優先日 平成４年３月30日(1992．3．30) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＶＲ−２３３２ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ−１０９９６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ−１０９９７ 前置審査 (73)特許権者 593142743 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシテ ィ・オブ・ミネソタ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏ ｔａ アメリカ合衆国55455ミネソタ州ミネア ポリス、チャーチ・ストリート・サウ ス・イースト100番 モリル・ホール (72)発明者 コリンズ、ジェームズ・エドワード アメリカ合衆国 55110 ミネソタ、ホ ワイト・ベア・レイク、リヴェリア・ド ライブ・サウス 2658 (72)発明者 ベンフィールド、デイヴィド・アレン アメリカ合衆国 57006 サウス・ダコ タ、ブルッキングズ、ツウェルフス・ス トリート・サウス 1509 (72)発明者 クラデック、ダニー・ダブリュ アメリカ合衆国 64505 ミズーリ、セ ント・ジョセフ、エヴァーグリーン・テ ラス 19 (72)発明者 ハリス、ルイス・エル アメリカ合衆国 64505 ミズーリ、セ ント・ジョセフ、タングルウッド・ドラ イブ 402 (72)発明者 ゴーシカ、デイヴィド・イー アメリカ合衆国 64506 ミズーリ、セ ント・ジョセフ、エレファント・トレイ ル 2408 (56)参考文献 特開 平７−138186（ＪＰ，Ａ) Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅ ｒｌｙ，1991年，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ. ３，ｐ．121−130 Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅ ｒｌｙ，1991年，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ. ３，ｐ．131−136 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00 C07K 16/08 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ATCC取得番号VR−2332として寄託されたウ
   イルスの15kDの抗原上のエピトープに特異的に結合する
   モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】前記抗体が、ATCC取得番号HB 10996または
   HB 10997として寄託されたハイブリドーマ細胞系由来で
   あることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナ
   ル抗体。
3. 【請求項３】ATCC取得番号HB−10996またはHB−10997と
   して寄託されたハイブリドーマ細胞系。
4. 【請求項４】ATCC取得番号HB−10996またはATCC HB−10
   997として寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生
   されるモノクローナル抗体を用いてブタ不育呼吸器不全
   症候群ウイルスを同定する方法において、前記ウイルス
   を含有する試料を前記モノクローナル抗体と反応させて
   ウイルスと抗体との間に複合体を形成させる工程、及び
   この複合体を検出する工程を含む、ウイルスの同定方
   法。