JP3454275B2 - プログラムされた細胞死に関連した新規なポリペプチドおよびそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、プログラムされた細胞
死に関連した新規なポリペプチド（ＰＤ−１）および該
ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。

【０００２】

【発明の背景】発生学的に、また生理学的にコントロー
ルされた細胞の死は、種々の動物のほとんどあらゆる組
織で観察することができる。そのような細胞の死は一般
的に「プログラムされた細胞死」と呼ばれ、病理学的メ
カニズムによって起こる「偶然に起こる細胞死」とは区
別されている。動物における、種々のタイプのプログラ
ムされた細胞死を一律に定義することは不可能である
が、死をプログラムされた細胞のほとんどは、死ぬため
には新たにＲＮＡまたは蛋白のドゥノボ（de novo）合
成が必要であることが示されている。

【０００３】例えば、変態後の蛾（Manduca sexta ）の
体節間筋の死、オタマジャクシの尾の変態による細胞
死、ニワトリ胎児の神経死は、アクチノマイシンＤやシ
クロヘキサイミドのような蛋白合成阻害剤によって阻止
される。また、神経成長因子（ＮＧＦ）の除去によって
誘導されるラット神経細胞の死、あるいはグルココルチ
コイドや内因性のスーパーアンチゲンによって誘発され
るマウス胸腺細胞の死が、アクチノマイシンＤやシクロ
ヘキサイミドによって阻害されることを示すインビトロ
（in vitro）の実験もある。

【０００４】これらすべての事実は、何らかの遺伝子が
（もしかしたら細胞死に特定の遺伝子ではないかもしれ
ないが）、プログラムされた細胞死を起こすために発現
されなければならないことを示している。一方、あるク
ラスの細胞死の形態学的特徴を表わすのに「アポトーシ
ス」ということばが好んで用いられる。アポトーシスを
受けた細胞では、染色体は核の周辺部に凝集してくる
が、ミトコンドリアや他の細胞内小器官は大きく変化し
ない。

【０００５】生化学的には、アポトーシスによって死に
つつある細胞は、染色体は不規則にいくつかのヌクレオ
ソームを単位としたＤＮＡ断片に分断されている。哺乳
動物において、死をプログラムされたほとんどの細胞
は、アポトーシスの形態学的および生化学的状態を示す
ようであるが、明らかにアポトーシス状態を示さない細
胞もある。さらに、いかなる蛋白合成が行なわれなくて
もアポトーシスによる細胞死が引き起こされることもあ
る。このように、アポトーシスはプログラムされた細胞
死と同義語でないことを理解しておくことは重要なこと
であろう。最近になって、発ガン遺伝子のひとつである
ｂｃｌ−２は、細胞死を防ぐことによりＢ細胞を不死化
していることが明らかにされ、細胞死の制御の重要性が
示された。

【０００６】

【従来の技術】これまでに、プログラムされた細胞死に
関連したポリペプチドが数種類報告されている。代表的
なものとしてＦａｓ抗原が知られている［Itoh,N.et a
l.,Cell, 66, 233 (1991)］。ヒトのＦａｓ抗原は３３
５個のアミノ酸からなるポリペプチドで、Ｎ末端には１
６個の疎水性アミノ酸よりなるシグナルペプチドを有
し、成熟蛋白はＮ末端側より細胞外領域（１５７アミノ
酸）、膜貫通領域（１７アミノ酸）および細胞質領域
（１４５アミノ酸）に区分されるような構造を有すると
推定されている。そしてＦａｓ抗原は、細胞死を誘導す
る因子（リガンド）の受容体として機能していると考え
られている。

【０００７】

【発明の目的】本発明は、Ｆａｓ抗原に代表される既知
のポリペプチドとはまったく別個の、新規な哺乳動物の
プログラムされた細胞死に深く関わるポリペプチドおよ
びそれをコードするＤＮＡを見出すことを目的とする。

【０００８】本発明では、プログラムされた細胞死に深
く関わる遺伝子を単離し、その塩基配列を決定し、アミ
ノ酸配列を推定した。その結果、まったく新規なポリペ
プチドおよびそれをコードするＤＮＡを見出すことに成
功し、本発明を完成した。

【０００９】プログラムされた細胞死に深く関わる遺伝
子を単離するために、本発明者らは、インビトロ（in v
itro）の系でアポトティックな死が簡単に起こる哺乳動
物細胞の代表としてマウスの細胞株４種を選んだ。未成
熟なＴリンパ球と同様に、マウスＴ細胞ハイブリドー
マ、２Ｂ４．１１はそれが認識する抗原（Ｉ−Ｅ^k ＋ハ
トチトクロームＣ）で刺激されると、あるいはイオノマ
イシンとＰＭＡを組み合わせて刺激すると死ぬ。マウス
未成熟Ｂ細胞株、ＷＥＨＩ−２３１は、その表面ＩｇＭ
が抗ＩｇＭ抗体によってクロスリンクされると死が誘発
される。マウスのリンパ球性／骨髄性の前駆細胞株、Ｌ
ｙＤ９とマウスの細胞傷害性Ｔ細胞株、ＣＴＬＬ−２は
生存増殖のためにはそれぞれインターロイキン−３（Ｉ
Ｌ−３）とインターロイキン−２（ＩＬ−２）が必要で
ある。そしてこれらの細胞株は培養液から成長因子（Ｉ
Ｌ−３またはＩＬ−２）を除くと死ぬ。

【００１０】本発明者らは、まずそれぞれの細胞株の細
胞死に新たなＲＮＡ合成が必要かどうかを調べた。そし
て、２Ｂ４．１１とＬｙＤ９の死には新たなＲＮＡ合成
が必要だが、ＷＥＨＩ−２３１とＣＴＬＬ−２の死には
不要であることを確認した。２Ｂ４．１１とＬｙＤ９の
死のパターンには興味深い共通性、すなわち、いずれも
アポトティックな死であり、かつ新たなＲＮＡ合成が必
要であることがわかったので、これらの細胞死には共通
の生化学的経路が存在するにちがいないとの仮説をた
て、サブトラクティブハイブリダイゼーションテクニッ
クを用いて、刺激を受けた２Ｂ４．１１細胞とＩＬ−３
欠損培養液で培養したＬｙＤ９細胞の両方で新たに発現
される遺伝子を同定することを試みた。

【００１１】ふたつの細胞では、細胞死の誘発方法だけ
でなく、細胞株の性質も全く異なるので、刺激を受けた
２Ｂ４．１１細胞とＩＬ−３欠損培養液で培養したＬｙ
Ｄ９細胞の両方で活性化される遺伝子は、ふたつの処置
された細胞株に共通したただひとつの現象、すなわちプ
ログラムされた細胞死に深く関わっていると考えられ
る。

【００１２】本発明で同定された、プログラムされた細
胞死に関連したポリペプチドのアミノ酸配列を、ナショ
ナルバイオメディカルリサーチファンデーションのデー
タベースに登録されている既知のポリペプチドのアミノ
酸配列と比較してみたが、同一のアミノ酸配列を有して
いるものはまったくなかった。もちろん、該ポリペプチ
ドはＦａｓとは全く相同性のないことも確認された。そ
こで、新規なプログラムされた細胞死に深く関わるポリ
ペプチドをＰＤ−１と命名し、既知のポリペプチドとは
区別することにした。

【００１３】

【発明の構成】本発明は、哺乳動物における、プログラ
ムされた細胞死に深く関わるポリペプチド（以下、ＰＤ
−１と呼ぶ。）に関する。ＰＤ−１には、Ｆａｓとはそ
の構造的特徴のまったく異なる一連の（種々の哺乳動物
に共通の）ポリペプチド群が含まれる。すなわち、本発
明によってそのアミノ酸配列が明らかにされたマウスの
ＰＤ−１をはじめとし、マウスＰＤ−１と高いホモロジ
ーを有する（マウスＰＤ−１の抗体と交差反応を生じる
というような免疫学的同等性を意味する）他の哺乳動物
のＰＤ−１、とりわけヒトのＰＤ−１が含まれる。

【００１４】さらに、本発明のＰＤ−１には、天然のＰ
Ｄ−１以外に修飾ＰＤ−１が含まれる。すなわち、天然
のＰＤ−１のアミノ酸配列中の一部が欠損したもの（例
えば、シグナルペプチドが欠損し成熟蛋白部分だけから
なるポリペプチド、あるいは成熟蛋白中、活性の発現に
必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他
のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したア
ミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ
酸が付加または挿入されたものも含まれる。

【００１５】本発明ＰＤ−１のうち、マウスＰＤ−１の
構造的特徴は以下のようである。マウスＰＤ−１は２８
８個のアミノ酸からなる膜結合型蛋白であると考えられ
る。Ｎ末端部分と中間部分にふたつの疎水性領域を有し
ており、それらはそれぞれシグナルペプチドと細胞膜貫
通領域に相当すると思われる。マウスＰＤ−１のＮ末端
のシークエンスを、典型的シグナルペプチドの切断部位
と比べてみると、マウスＰＤ−１のシグナルペプチド
は、１番目のＭｅｔから２０番目のＧｌｎまでと推定さ
れる。従って、成熟蛋白部分は２１番目のＳｅｒから２
８８番目のＬｅｕまでの２６８アミノ酸よりなり、細胞
外領域（１４７アミノ酸）、膜貫通領域（２７アミノ
酸）および細胞質領域（９４アミノ酸）を構成している
ものと考えられる。また細胞外領域には４ヶ所のＮ−グ
リコシレーションサイトが存在する可能性がある。

【００１６】マウスＰＤ−１のアミノ酸配列をナショナ
ルバイオメディカルリサーチファンデーションのデータ
ベースに登録されたすべてのアミノ酸配列と照合してみ
ると、マウスＰＤ−１の細胞外領域は、既知の免疫グロ
ブリンスーパーファミリーに属する数種類のポリペプチ
ドとホモロジーを有していることがわかる。免疫グロブ
リンドメインは、保持されたアミノ酸パターンと逆行性
β−ストランドの数に基づいて分類されているＶ、Ｃ１
およびＣ２セットを有する。５４番目のＣｙｓと１２３
番目のＣｙｓに挟まれた６８個のアミノ酸配列はジスル
フィドで結合されたＶセット配列に類似している。ま
た、４個のアミノ酸残基（⁹⁴Ａｒｇ，⁹⁵Ｐｈｅ， ¹¹⁷Ａ
ｓｐおよび ¹¹⁹Ｇｌｙ）は多くの免疫グロブリンのＶセ
ット配列に特徴的なものである。

【００１７】細胞質領域は、既知のいかなる配列とも明
白なホモロジーを有していないが、注意深く調べると、
抗原受容体やＦｃ受容体に関連するほとんどのポリペプ
チドが有する細胞質領域の尾部にみられる共通の配列
（Asp/Glu-X7-Asp/Glu-X2-Tyr-X2-Leu-X7-Tyr-Leu/Ile
）の変形した配列を含んでいることがわかる。最近、
この共通配列が１単位あれば、シグナルを伝えるのに十
分であることが示されている。マウスＰＤ−１において
は、Ｌｅｕと２番目のＴｙｒの間の非保存アミノ酸数が
共通配列のそれよりかなり多いけれども、大抵の保存ア
ミノ酸残基とスペーサーの長さは、ＰＤ−１ポリペプチ
ドの細胞質領域において保存されている。他の哺乳動物
のＰＤ−１も配列中のアミノ酸の数や種類に多少の違い
はあるが、その構造上の特徴はマウスＰＤ−１に類似し
たものであると考えられる。

【００１８】本発明のＰＤ−１ポリペプチドをコードす
るＤＮＡは、以下の方法により作製することができる。
すなわち、外部からの刺激によりアポトーシスを起こさ
せた細胞（例えば、血球細胞等）から抽出したｍＲＮＡ
を用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡ
は健康な同細胞から抽出した過剰量のｍＲＮＡで数回
（好ましくは２〜３回）控除される。残ったｃＤＮＡ
は、ランダムプライミングによって³²Ｐでラベルし、プ
ローブが作製される。このようにして作製されたｃＤＮ
Ａプローブは、アポトーシスによる細胞死に関連したｍ
ＲＮＡ由来のｃＤＮＡが濃縮されていると考えられる。

【００１９】一方、ｃＤＮＡライブラリーを構築するた
めに、刺激した同細胞から抽出されたｍＲＮＡを用い
て、ｃＤＮＡを作製する。得られた一本鎖ｃＤＮＡは常
法により二本鎖ｃＤＮＡに変換して公知のベクター（例
えば、λｇｔ１０）に導入する。次に、このライブラリ
ーを先に作製した控除ｃＤＮＡプローブでスクリーニン
グすることにより目的のクローン、すなわち本発明のＰ
Ｄ−１のｃＤＮＡが得られる。

【００２０】上記の方法でも本発明のＰＤ−１のｃＤＮ
Ａは得られるが、さらにアポトーシスを起こす他の細胞
があれば、さらに確実な方法で二種の細胞の細胞死に共
通して活性化される遺伝子を得ることができる。すなわ
ち、外部からの刺激によりアポトーシスを起こさせた一
方の細胞（仮に細胞ａとする。）より抽出したｍＲＮＡ
を用いて一本鎖ｃＤＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡ
は健康な同細胞から抽出した過剰量のｍＲＮＡで数回
（好ましくは２〜３回）控除される。残ったｃＤＮＡ
は、ランダムプライミングによって³²Ｐでラベルし、プ
ローブが作製される。

【００２１】一方、ｃＤＮＡライブラリーを構築するた
めに、刺激によって死につつある他方の細胞（仮に細胞
ｂとする。）から抽出したｍＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤ
ＮＡを作製する。作製したｃＤＮＡは健康な同細胞から
抽出した過剰量のｍＲＮＡで数回（好ましくは２〜３
回）控除される。残ったｃＤＮＡは刺激した同細胞から
抽出した過剰量のｍＲＮＡとバックハイブリダイズさせ
た後、常法により二本鎖ｃＤＮＡに変換して公知のベク
ター（例えば、λｇｔ１０）に導入する。次にこのライ
ブラリーを先に細胞ａから作製した控除ｃＤＮＡプロー
ブを用いてスクリーニングすることにより目的とするク
ローン、すなわち細胞死に関連しかつ二種の細胞に共通
したクローンが得られる。

【００２２】ただし、一方の細胞（例えば、細胞ｂ）が
健康な状態の時でさえもわずかながら目的とする遺伝子
が発現されることがあるので、その場合は、控除ｃＤＮ
Ａライブラリーを作製する工程は、刺激時にのみ発現す
る細胞（例えば、細胞ａ）の健康な細胞から抽出したｍ
ＲＮＡを用いて控除されるべきである。

【００２３】ＰＤ−１をコードするＤＮＡの塩基配列
が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、
あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプロー
ブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明のＤ
ＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有する
ベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させ
ることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得る
ことができる。

【００２４】本発明のＰＤ−１ポリペプチドを取得する
方法としては、（１）生体または培養細胞から精製単離
する方法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）
遺伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げ
られるが、工業的には（３）に記載した方法が好まし
い。

【００２５】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。

【００２６】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟蛋白部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コドン
（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプロモ
ーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモー
ター、λＰ_L プロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下
流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐ
ＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発
現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質
転換した大腸菌（例えば、E.ColiＤＨ１、E.ColiＪＭ１
０９、E.ColiＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養し
て、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることが
できる。

【００２７】また、バクテリアのシグナルペプチド（例
えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペ
リプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌すること
もできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョン
プロテイン (fusion protein) を生産することもでき
る。

【００２８】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、ＰＤ−１の全長をコードするＤＮＡを適当
なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピロ
ーマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、
ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例え
ば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタ
ロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベ
クターを作製する。

【００２９】次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳
動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズ
ハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換
し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、
その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。
以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生
化学的方法によって単離精製することができる。

【００３０】本発明によって得られるＰＤ−１遺伝子を
コードするＤＮＡは、これをプローブとしてヒトを含む
マウス以外の動物のＰＤ−１遺伝子を分離することが可
能である。それらのＰＤ−１遺伝子をコードするＤＮＡ
あるいはＤＮＡ断片はプローブあるいはプライマーとし
てＰＤ−１遺伝子の検出ができ、これによって該遺伝子
と生体防御機能、免疫機能あるいは腫瘍等の疾患との関
係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができ
る。

【００３１】また、それらのＤＮＡは通常の遺伝子組換
法によって多大な有用性が期待されるＰＤ−１ポリペプ
チド、ポリペプチド断片あるいはその誘導体を生産する
際の必須の鋳型として用いることができる。そのように
して生産されたポリペプチド、ポリペプチド断片あるい
は修飾ポリペプチドは感染症、免疫機能の低下または亢
進あるいは腫瘍等の治療剤として用いることが期待され
る。

【００３２】さらに、本発明のポリペプチドあるいはそ
の断片を抗原として常法によりポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体を作製できるので、それらを用い
て該ポリペプチドを定量することによって該ポリペプチ
ドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用す
ることができる。また、該モノクローナル抗体はそのま
まの形あるいはヒト抗体とのキメラ抗体の形あるいはヒ
ト型に変換した形で治療剤として用いることができる。

【００３３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３４】実施例１：アポトーシスの誘導 マウス２Ｂ４．１１細胞（Ｄｒ．Ｊ．Ｄ．Ａｓｈｗｅｌ
ｌ，ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅより供与された）はＲＰＭＩ１６４０培養液（ＧＩＢ
ＣＯ社製）に１０％非働化牛胎児血清、２ｍＭグルタミ
ン、５０μＭ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍ
ｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン
を添加したもの（以下完全培養液と呼ぶ）を用いて培養
した。マウスＬｙＤ９細胞（Ｐａｌａｃｉｏｓ等，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，６，３６８７（１９８７）に記載）は完全
培養液にマウスＩＬ−３発現ベクターで形質転換したＸ
６３Ａｇミエローマ細胞（Ｋａｒａｓｕｙａｍａ等，Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８，９７（１９８８）
に記載）の培養上清を０．２％添加したものを用いて培
養した。

【００３５】２Ｂ４．１１細胞のアポトーシス誘導は完
全培養液に５００ｎｇ／ｍｌ イオノマイシン（カルビ
オケム社製）と１０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（フォルボール
１２−ミリステート１３−アセテート，カルビオケム社
製）を添加し、３７℃、５％ＣＯ₂ にて２〜６時間培養
することによって行なった。

【００３６】ＬｙＤ９細胞のアポトーシス誘導は増殖因
子の涸渇により行なった。すなわち、細胞をＲＰＭＩ 1
640 培養液を用いて３回洗浄した後、増殖因子を含まな
い完全培養液中で３７℃、５％ＣＯ₂ にて４〜１２時間
培養した。

【００３７】実施例２：アポトーシスの指標としてのＤ
ＮＡ断片化の検出 被検細胞（５×１０⁶ 〜１×１０⁷ 個）を遠心により集
め、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ^- ）で１回洗浄し
た。細胞沈渣を６００μｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 0.2
％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ トリス塩酸緩
衝液（ｐＨ 7.5）に溶解した。氷上に１０分間放置した
後、エッペンドルフ遠心機を用い、４℃にて13000 ｇ、
１０分間遠心した。

【００３８】上清（ＲＮＡおよび断片化ＤＮＡを含むが
もとのままのクロマチンは含まない）をフェノール抽出
し、次にフェノール／クロロホルム：イソアミルアルコ
ール（２４：１）を用いて抽出した。水層に食塩液を加
えて３００ｍＭとし、次に２倍量のエタノールを加えて
核酸を沈殿させた。沈渣を７０％エタノールで洗浄、風
乾した後、１５μｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ 7.5）に溶解した。 0.6ｍｇ／
ｍｌのアールエヌエースＡ（ＲＮａｓｅＡ）を加え、３
７℃にて３０分間反応させＲＮＡを分解した後、２％ア
ガロースゲル上でボイヤー緩衝液（５０ｍＭ トリス塩
酸，２０ｍＭ 酢酸ナトリウム，２ｍＭＥＤＴＡ，１８
ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ 8.05 ）を用いて電気泳動を行な
った。ＤＮＡはエチジウムブロマイド染色により検出し
た。

【００３９】結果を図１および図２に示す。図１中、レ
ーン１は無刺激時のパターンを示し、レーン２はイオノ
マイシンとＰＭＡで６時間刺激した時のパターンを示
し、レーン３〜８はそれぞれ刺激から０、１、２、３、
４および５時間後にＲＮＡ転写阻害剤を添加した時のパ
ターンを示している。また図２中、レーン１はＩＬ−３
添加時のパターンを示し、レーン２はＩＬ−３を涸渇さ
せて１２時間培養した時のパターンを示し、レーン３〜
７はそれぞれＩＬ−３の涸渇から０、２、４、６および
８時間後にＲＮＡ転写阻害剤を添加した時のパターンを
示している。

【００４０】結果は、２Ｂ４．１１細胞の場合には、イ
オノマイシンとＰＭＡで同時に６時間刺激するとアポト
ーシスに特徴的なＤＮＡ断片化が認められること、ま
た、刺激と同時にＲＮＡ転写阻害剤であるアクチノマイ
シンＤ（２００ｎｇ／ｍｌ，シグマ社製）を添加するこ
とによりほぼ完全に抑制されることを示す。このことは
２Ｂ４．１１細胞のアポトーシスにはＲＮＡのドゥノボ
合成が必要なことを明確に示している。また、アクチノ
マイシンＤの添加時期を変化させた実験から、この細胞
死に必要なｍＲＮＡ合成は刺激後３時間までに完了する
ことを示している。

【００４１】また、ＬｙＤ９細胞の場合には、ＩＬ−３
を涸渇させて１２時間培養すると同様のＤＮＡ断片化が
認められること、また、ＩＬ−３の涸渇と同時にアクチ
ノマイシンＤを添加することにより完全に抑制されるこ
とを示す。しかし、アクチノマイシンＤの添加時期を変
えた実験から、ＬｙＤ９細胞のこの細胞死に必要なｍＲ
ＮＡ合成は２Ｂ４．１１細胞の場合と比べると幾分長時
間にわたっているようであった。

【００４２】実施例３：控除ｃＤＮＡライブラリーの作
製 イオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ）とＰＭＡ（１０ｎ
ｇ／ｍｌ）を添加して２〜３時間刺激した２Ｂ４．１１
細胞（約５×１０^９個）から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔ
ｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃ
ｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊に記載）に従っ
てＰｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡ（３００μｇ）を得た。

【００４３】Poly(A)⁺ ＲＮＡ（４０μｇ）からオリゴ
ｄＴプライマーおよび６塩基ランダムプライマーを用い
て、アクチノマイシンＤと極微量の［α−³²Ｐ］ｄＣＴ
Ｐ存在下で逆転写酵素により、ファーストストランドを
合成した。 0.2Ｎカセイソーダを加え６８℃、３０分間
処理してＲＮＡテンプレートを加水分解して得た一本鎖
ｃＤＮＡを、ＩＬ−３存在下培養のＬｙＤ９細胞から抽
出した Poly(A)⁺ ＲＮＡの過剰量（２００μｇ）と５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、 0.2％ＳＤＳを含む 0.5Ｍ リン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ 6.8）中で６８℃、２６時間ハイブ
リダイゼーションを行なった。この反応のＣｏｔ値（高
塩濃度の影響を補正したもの、Britten等，Meth.Enzy
m.,29, 363-418 (1974)に記載）は7800ｍｏｌ・ｓｅｃ
／ｌで行なった。

【００４４】反応液は0.12Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ 6.8）で平衡化したハイドロキシアパタイトカラ
ム（バイオラッド社製）にウォータージャケット中で６
０℃に保ちながら通して、ｃＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本
鎖とハイブリダイズしなかった一本鎖ｃＤＮＡを分離し
た。この一本鎖ｃＤＮＡを前出のイオノマイシンとＰＭ
Ａで刺激した２Ｂ４．１１細胞から抽出した Poly(A)⁺
ＲＮＡの過剰量（２００μｇ）と8000ｍｏｌ・ｓｅｃ／
ｌのＣｏｔ値となるようバックハイブリダイズさせた。
得られたｃＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖から二本鎖ｃＤ
ＮＡへの変換およびλｇｔ１０へのクローン化は、Mole
cular Cloning （前出）に記載の方法に従って行なっ
た。以上の操作により全体の約９０％のｃＤＮＡが控除
されたことから、細胞死特異的と思われるｃＤＮＡクロ
ーンは約１０倍濃縮されたと判断した。

【００４５】実施例４：控除ｃＤＮＡプローブの作製 ｃＤＮＡ合成、ハイブリダイゼーションおよびハイドロ
キシアパタイトカラムクロマトグラフィーの方法は実施
例３に記載の方法に従った。すなわち、ＩＬ−３を涸渇
させて４〜６時間培養したＬｙＤ９細胞から抽出した P
oly(A)⁺ ＲＮＡ（４０μｇ）よりファーストストランド
を合成し、ＲＮＡテンプレートを加水分解して一本鎖ｃ
ＤＮＡを得た。これを、ＩＬ−３存在下培養のＬｙＤ９
細胞から抽出した Poly(A)⁺ ＲＮＡの過剰量（２００μ
ｇ）と8000ｍｏｌ・ｓｅｃ／ｌのＣｏｔ値となるようハ
イブリダイズした。ハイドロキシアパタイトカラムクロ
マトグラフィーによりハイブリダイズしなかった一本鎖
ｃＤＮＡを分離した。

【００４６】再度ハイブリダイゼーションとハイドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィーのサイクルを繰
り返して得た一本鎖ｃＤＮＡ（１３０ｎｇ）を、Molecu
larCloning （前出）に記載の方法に従い、６塩基ラン
ダムプライマーを用い［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（3000Ｃｉ
／ｍｍｏｌ，アマーシャム社製）により標識した。比活
性約４×１０⁹ ｄｐｍ／μｇのプローブが得られた。な
お、以上の操作により全体の約９６％のｃＤＮＡが控除
されたことから、ＩＬ−３涸渇に特異的な控除プローブ
は約２５倍に濃縮されていた。

【００４７】実施例５：ライブラリースクリーニング 実施例３で作製したｃＤＮＡライブラリーより、２０×
２０ｃｍのＬＢプレートに約１×１０⁴ 個のプラーク／
プレートの密度でクローンを播き（全部で２×１０
⁴ 個）、３７℃で１３時間培養した後、ニトロセルロー
スフィルターにＤＮＡを移し取りレプリカを作製した。
ハイブリダイゼーションは約５×１０⁸ ｄｐｍのプロー
ブ（実施例４で作製）を含むハイブリダイゼーション用
緩衝液（５×ＳＳＰＥ，５×デンハルト溶液，１２０μ
ｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡ，１０％デキストラン硫酸，
0.3％ナトリウムドデシル硫酸）中で６８℃、２７時間
行なった。

【００４８】反応後のフィルターは、まず２×ＳＳＣ溶
液（１×ＳＳＣ：0.15Ｍ ＮａＣｌ， 0.015Ｍ クエン
酸ナトリウム）中で５５℃、４０分間、次に 0.1％ナト
リウムドデシル硫酸を含む 0.1×ＳＳＣ溶液中で６８
℃、３０分間洗浄した。オートラジオグラフィーの結
果、強いシグナルを示したクローン（１２０個）を以下
の２次スクリーニングに供した。

【００４９】すなわち、それぞれのファージクローンを
直径１０ｃｍのＬＢプレートに播きなおし（約２００個
のプラーク／プレート）、ニトロセルロースフィルター
のレプリカを２枚ずつ作製した。一方のフィルター群は
上記の標識プローブと、他方のフィルター群はＩＬ−３
存在下培養のＬｙＤ９細胞由来ｃＤＮＡを同様の方法で
標識したプローブとハイブリダイゼーションを行なっ
た。洗浄、オートラジオグラフィー後、前者のプローブ
とだけハイブリダイズし、後者のプローブとはハイブリ
ダイズしない独立のクローン４個（すなわちＩＬ−３涸
渇特異的なクローン）を得、それぞれブルースクリプト
ＳＫプラスミドベクター（ストラタジーン社より販売）
にサブクローン化した。

【００５０】これら４個のクローンのインサートサイズ
は異なるが、制限酵素地図は重複し、かつ互いに非常に
強いストリンジェントな条件下においてもハイブリダイ
ズしたことから同一の遺伝子に由来するものと考えられ
た。この遺伝子をＰＤ−１と名付けた。

【００５１】次にＰＤ−１をプローブとして、イオノマ
イシンとＰＭＡで刺激した２Ｂ４．１１細胞から作製し
たλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー（控除は行なってい
ない）からもクローニングを行ない、最長のインサート
を持つクローン（ＰＤ−１ｃＤＮＡ＃７）を得た。これ
も同様にブルースクリプトＳＫプラスミドベクターにサ
ブクローン化した。以下の解析は主にＰＤ−１ ｃＤＮ
Ａ＃７を用いて行なった。

【００５２】実施例６：塩基配列の決定 塩基配列の決定はジデオキシチェインターミネーション
法（Sanger,F.,等， Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 74, 5463
(1977) に記載）により、修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
（United States Biochemical より入手）と［α−
³²Ｐ］ｄＣＴＰ（3000Ｃｉ／ｍｍｏｌ，アマーシャム社
製）を用いて実施した。

【００５３】得られたＰＤ−１ ｃＤＮＡ＃７の全塩基
配列とそれから予想されるアミノ酸配列を配列表１から
４に示し、制限酵素地図を図３に示す。ＰＤ−１遺伝子
は膜貫通部位と思われる２７アミノ酸を含む２８８アミ
ノ酸からなるポリペプチドをコードしているものと推測
された。

【００５４】実施例７：ノーザンブロッティング ＰＤ−１遺伝子が刺激した２Ｂ４．１１細胞やＩＬ−３
涸渇したＬｙＤ９細胞で共に活性化されていることを確
認するために、ノーザンブロッティング法による解析を
行った。全細胞ＲＮＡの抽出、Ｐｏｌｙ（Ａ）^＋ＲＮＡ
の精製およびノーザンハイブリダイゼーションの方法は
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）に記載の
標準法を用いた。プローブにはＰＤ−１ ｃＤＮＡ＃７
のコーディング領域に存在するＰｓｔＩ断片（６５０ｂ
ｐ）をランダムプライマーを用いて［α−^３２Ｐ］ｄＣ
ＴＡで標識したものを用いた。また、内部標準として、
マウスβ−アクチンｃＤＮＡの３’ノンコーディング領
域のみを含むプラスミドＰＭＡβ−３’ｕｔのＥｃｏＲ
Ｉ断片（３００ｂｐ）を同様に標識してプローブとし
た。

【００５５】結果を図４に示す。図中、レーン１は無刺
激時の２Ｂ４．１１細胞のパターンを示し、レーン２は
刺激後の２Ｂ４．１１細胞のパターンを示し、レーン３
はＩＬ−３含有培養後のＬｙＤ９細胞のパターンを示
し、そしてレーン４はＩＬ−３涸渇培養後のＬｙＤ９細
胞のパターンを示している。結果は、刺激後の２Ｂ４．
１１細胞においてＰＤ−１ ｍＲＮＡの発現が非常に強
く（１０倍以上）増強されていること、また、ＩＬ−３
涸渇後のＬｙＤ９細胞に特異的に発現されていることを
示している。

【００５６】次にＰＤ−１遺伝子が生体のどの組織で発
現されているかを検討した。５週令のＩＣＲマウス（静
岡実験動物センターより購入）にマウスＣＤ３（ε）に
対するモノクローナル抗体（Leo,O.等， Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA, 84, 1374-1378 (1987)に記載）を生産する
ハイブリドーマ１４５−２Ｃ１１を注射したＢＡＬＢ／
Ｃ ｎｕ／ｎｕマウスから集めた脱フィブリン化腹水２
００μｌまたはリン酸緩衝生理食塩水２００μｌを腹腔
内に注射した。一定時間後にマウスを屠殺し、各臓器か
らMolecular Cloning （前出）に記載の方法に従って全
ＲＮＡの抽出、 Poly(A)⁺ ＲＮＡの精製およびノーザン
ハイブリダイゼーションを行なった。プローブは本実施
例に記載のものを用いた。

【００５７】結果を図５および図６に示す。図５中、レ
ーン１〜７はそれぞれ脳、心臓、肺、胸腺、脾臓、肝臓
および腎臓におけるＰＤ−１ ｍＲＮＡの発現を示して
いる。図６中、レーン１〜５は胸腺を、レーン６〜１０
は脾臓を表わし、さらにレーン１と６は無処置群の、レ
ーン２と７はＰＢＳ投与８時間後の、レーン３と８はＰ
ＢＳ投与１２時間後の、レーン４と９は抗ＣＤ３抗体投
与８時間後の、そしてレーン５と１０は抗ＣＤ３抗体投
与１２時間後の、ＰＤ−１ ｍＲＮＡの発現を示してい
る。

【００５８】図５からはＰＤ−１ ｍＲＮＡの発現が胸
腺（胸腺では胸腺細胞の死が恒常的に起きている）にお
いて顕著であり、脳、心臓、肺、脾臓、肝臓および腎臓
では殆ど認められないことがわかる。さらに、図６か
ら、マウス胸腺内におけるアポトーシスによる細胞死を
増強することが知られている抗ＣＤ３モノクローナル抗
体の注射によって、８〜１２時間後にＰＤ−１ ｍＲＮ
Ａの発現が胸腺内において増強（約３倍）されているこ
と、また、興味深いことに脾臓においても増強されてい
ることがわかる。

【００５９】

【配列表】

【００６０】配列番号：１ 配列の長さ：２８８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp 20 25 30 Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala 35 40 45 Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met 50 55 60 Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala 65 70 75 80 Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln 85 90 95 Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp 100 105 110 Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu 115 120 125 His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val 130 135 140 Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro 145 150 155 160 Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala 165 170 175 Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val 180 185 190 Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp 195 200 205 Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala 210 215 220 Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro 225 230 235 240 Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly 245 250 255 Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln 260 265 270 Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：８６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTGGGTCC GGCAGGTACC CTGGTCATTC ACTTGGGCTG TGCTGCAGTT GAGCTGGCAA 60 TCAGGGTGGC TTCTAGAGGT CCCCAATGGG CCCTGGAGGT CCCTCACCTT CTACCCAGCC 120 TGGCTCACAG TGTCAGAGGG AGCAAATGCC ACCTTCACCT GCAGCTTGTC CAACTGGTCG 180 GAGGATCTTA TGCTGAACTG GAACCGCCTG AGTCCCAGCA ACCAGACTGA AAAACAGGCC 240 GCCTTCTGTA ATGGTTTGAG CCAACCCGTC CAGGATGCCC GCTTCCAGAT CATACAGCTG 300 CCCAACAGGC ATGACTTCCA CATGAACATC CTTGACACAC GGCGCAATGA CAGTGGCATC 360 TACCTCTGTG GGGCCATCTC CCTGCACCCC AAGGCAAAAA TCGAGGAGAG CCCTGGAGCA 420 GAGCTCGTGG TAACAGAGAG AATCCTGGAG ACCTCAACAA GATATCCCAG CCCCTCGCCC 480 AAACCAGAAG GCCGGTTTCA AGGCATGGTC ATTGGTATCA TGAGTGCCCT AGTGGGTATC 540 CCTGTATTGC TGCTGCTGGC CTGGGCCCTA GCTGTCTTCT GCTCAACAAG TATGTCAGAG 600 GCCAGAGGAG CTGGAAGCAA GGACGACACT CTGAAGGAGG AGCCTTCAGC AGCACCTGTC 660 CCTAGTGTGG CCTATGAGGA GCTGGACTTC CAGGGACGAG AGAAGACACC AGAGCTCCCT 720 ACCGCCTGTG TGCACACAGA ATATGCCACC ATTGTCTTCA CTGAAGGGCT GGGTGCCTCG 780 GCCATGGGAC GTAGGGGCTC AGCTGATGGC CTGCAGGGTC CTCGGCCTCC AAGACATGAG 840 GATGGACATT GTTCTTGGCC TCTT 864

【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：１９７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 TGAGCAGCGG GGAGGAGGAA GAGGAGACTG CTACTGAAGG CGACACTGCC AGGGGCTCTG 60 GGCATGTGGG TCCGGCAGGT ACCCTGGTCA TTCACTTGGG CTGTGCTGCA GTTGAGCTGG 120 CAATCAGGGT GGCTTCTAGA GGTCCCCAAT GGGCCCTGGA GGTCCCTCAC CTTCTACCCA 180 GCCTGGCTCA CAGTGTCAGA GGGAGCAAAT GCCACCTTCA CCTGCAGCTT GTCCAACTGG 240 TCGGAGGATC TTATGCTGAA CTGGAACCGC CTGAGTCCCA GCAACCAGAC TGAAAAACAG 300 GCCGCCTTCT GTAATGGTTT GAGCCAACCC GTCCAGGATG CCCGCTTCCA GATCATACAG 360 CTGCCCAACA GGCATGACTT CCACATGAAC ATCCTTGACA CACGGCGCAA TGACAGTGGC 420 ATCTACCTCT GTGGGGCCAT CTCCCTGCAC CCCAAGGCAA AAATCGAGGA GAGCCCTGGA 480 GCAGAGCTCG TGGTAACAGA GAGAATCCTG GAGACCTCAA CAAGATATCC CAGCCCCTCG 540 CCCAAACCAG AAGGCCGGTT TCAAGGCATG GTCATTGGTA TCATGAGTGC CCTAGTGGGT 600 ATCCCTGTAT TGCTGCTGCT GGCCTGGGCC CTAGCTGTCT TCTGCTCAAC AAGTATGTCA 660 GAGGCCAGAG GAGCTGGAAG CAAGGACGAC ACTCTGAAGG AGGAGCCTTC AGCAGCACCT 720 GTCCCTAGTG TGGCCTATGA GGAGCTGGAC TTCCAGGGAC GAGAGAAGAC ACCAGAGCTC 780 CCTACCGCCT GTGTGCACAC AGAATATGCC ACCATTGTCT TCACTGAAGG GCTGGGTGCC 840 TCGGCCATGG GACGTAGGGG CTCAGCTGAT GGCCTGCAGG GTCCTCGGCC TCCAAGACAT 900 GAGGATGGAC ATTGTTCTTG GCCTCTTTGA CCAGATTCTT CAGCCATTAG CATGCTGCAG 960 ACCCTCCACA GAGAGCACCG GTCCGTCCCT CAGTCAAGAG GAGCATGCAG GCTACAGTTC 1020 AGCCAAGGCT CCCAGGGTCT GAGCTAGCTG GAGTGACAGC CCAGCGCCTG CACCAATTCC 1080 AGCACATGCA CTGTTGAGTG AGAGCTCACT TCAGGTTTAC CACAAGCTGG GAGCAGCAGG 1140 CTTCCCGGTT TCCTATTGTC ACAAGGTGCA GAGCTGGGGC CTAAGCCTAT GTCTCCTGAA 1200 TCCTACTGTT GGGCACTTCT AGGGACTTGA GACACTATAG CCAATGGCCT CTGTGGGTTC 1260 TGTGCCTGGA AATGGAGAGA TCTGAGTACA GCCTGCTTTG AATGGCCCTG TGAGGCAACC 1320 CCAAAGCAAG GGGGTCCAGG TATACTATGG GCCCAGCACC TAAAGCCACC CTTGGGAGAT 1380 GATACTCAGG TGGGAAATTC GTAGACTGGG GGACTGAACC AATCCCAAGA TCTGGAAAAG 1440 TTTTGATGAA GACTTGAAAA GCTCCTAGCT TCGGGGGTCT GGGAAGCATG AGCACTTACC 1500 AGGCAAAAGC TCCGTGAGCG TATCTGCTGT CCTTCTGCAT GCCCAGGTAC CTCAGTTTTT 1560 TTCAACAGCA AGGAAACTAG GGCAATAAAG GGAACCAGCA GAGCTAGAGC CACCCACACA 1620 TCCAGGGGGG CACTTGACTC TCCCTACTCC TCCTAGGAAC CAAAAGGACA AAGTCCATGT 1680 TGACAGCAGG GAAGGAAAGG GGGATATAAC CTTGACGCAA ACCAACACTG GGGTGTTAGA 1740 ATCTCCTCAT TCACTCTGTC CTGGAGTTGG GTTCTGGCTC TCCTTCACAC CTAGGACTCT 1800 GAAATGAGCA AGCACTTCAG ACAGTCAGGG TAGCAAGAGT CTAGCTGTCT GGTGGGCACC 1860 CAAAATGACC AGGGCTTAAG TCCCTTTCCT TTGGTTTAAG CCCGTTATAA TTAAATGGTA 1920 CCAAAAGCTT TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1973

【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：１９７３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Mus musculus セルライン：2B4.11 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：64..927 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：64..123 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：124..927 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TGAGCAGCGG GGAGGAGGAA GAGGAGACTG CTACTGAAGG CGACACTGCC AGGGGCTCTG 60 GGC ATG TGG GTC CGG CAG GTA CCC TGG TCA TTC ACT TGG GCT GTG CTG 108 Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu -20 -15 -10 CAG TTG AGC TGG CAA TCA GGG TGG CTT CTA GAG GTC CCC AAT GGG CCC 156 Gln Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro -5 1 5 10 TGG AGG TCC CTC ACC TTC TAC CCA GCC TGG CTC ACA GTG TCA GAG GGA 204 Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly 15 20 25 GCA AAT GCC ACC TTC ACC TGC AGC TTG TCC AAC TGG TCG GAG GAT CTT 252 Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu 30 35 40 ATG CTG AAC TGG AAC CGC CTG AGT CCC AGC AAC CAG ACT GAA AAA CAG 300 Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln 45 50 55 GCC GCC TTC TGT AAT GGT TTG AGC CAA CCC GTC CAG GAT GCC CGC TTC 348 Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe 60 65 70 75 CAG ATC ATA CAG CTG CCC AAC AGG CAT GAC TTC CAC ATG AAC ATC CTT 396 Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu 80 85 90 GAC ACA CGG CGC AAT GAC AGT GGC ATC TAC CTC TGT GGG GCC ATC TCC 444 Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser 95 100 105 CTG CAC CCC AAG GCA AAA ATC GAG GAG AGC CCT GGA GCA GAG CTC GTG 492 Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val 110 115 120 GTA ACA GAG AGA ATC CTG GAG ACC TCA ACA AGA TAT CCC AGC CCC TCG 540 Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser 125 130 135 CCC AAA CCA GAA GGC CGG TTT CAA GGC ATG GTC ATT GGT ATC ATG AGT 588 Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser 140 145 150 155 GCC CTA GTG GGT ATC CCT GTA TTG CTG CTG CTG GCC TGG GCC CTA GCT 636 Ala Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala 160 165 170 GTC TTC TGC TCA ACA AGT ATG TCA GAG GCC AGA GGA GCT GGA AGC AAG 684 Val Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys 175 180 185 GAC GAC ACT CTG AAG GAG GAG CCT TCA GCA GCA CCT GTC CCT AGT GTG 732 Asp Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val 190 195 200 GCC TAT GAG GAG CTG GAC TTC CAG GGA CGA GAG AAG ACA CCA GAG CTC 780 Ala Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu 205 210 215 CCT ACC GCC TGT GTG CAC ACA GAA TAT GCC ACC ATT GTC TTC ACT GAA 828 Pro Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu 220 225 230 235 GGG CTG GGT GCC TCG GCC ATG GGA CGT AGG GGC TCA GCT GAT GGC CTG 876 Gly Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu 240 245 250 CAG GGT CCT CGG CCT CCA AGA CAT GAG GAT GGA CAT TGT TCT TGG CCT 924 Gln Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro 255 260 265 CTT TGA CCAGATTCTT CAGCCATTAG CATGCTGCAG ACCCTCCACA GAGAGCACCG 980 Leu *** GTCCGTCCCT CAGTCAAGAG GAGCATGCAG GCTACAGTTC AGCCAAGGCT CCCAGGGTCT 1040 GAGCTAGCTG GAGTGACAGC CCAGCGCCTG CACCAATTCC AGCACATGCA CTGTTGAGTG 1100 AGAGCTCACT TCAGGTTTAC CACAAGCTGG GAGCAGCAGG CTTCCCGGTT TCCTATTGTC 1160 ACAAGGTGCA GAGCTGGGGC CTAAGCCTAT GTCTCCTGAA TCCTACTGTT GGGCACTTCT 1220 AGGGACTTGA GACACTATAG CCAATGGCCT CTGTGGGTTC TGTGCCTGGA AATGGAGAGA 1280 TCTGAGTACA GCCTGCTTTG AATGGCCCTG TGAGGCAACC CCAAAGCAAG GGGGTCCAGG 1340 TATACTATGG GCCCAGCACC TAAAGCCACC CTTGGGAGAT GATACTCAGG TGGGAAATTC 1400 GTAGACTGGG GGACTGAACC AATCCCAAGA TCTGGAAAAG TTTTGATGAA GACTTGAAAA 1460 GCTCCTAGCT TCGGGGGTCT GGGAAGCATG AGCACTTACC AGGCAAAAGC TCCGTGAGCG 1520 TATCTGCTGT CCTTCTGCAT GCCCAGGTAC CTCAGTTTTT TTCAACAGCA AGGAAACTAG 1580 GGCAATAAAG GGAACCAGCA GAGCTAGAGC CACCCACACA TCCAGGGGGG CACTTGACTC 1640 TCCCTACTCC TCCTAGGAAC CAAAAGGACA AAGTCCATGT TGACAGCAGG GAAGGAAAGG 1700 GGGATATAAC CTTGACGCAA ACCAACACTG GGGTGTTAGA ATCTCCTCAT TCACTCTGTC 1760 CTGGAGTTGG GTTCTGGCTC TCCTTCACAC CTAGGACTCT GAAATGAGCA AGCACTTCAG 1820 ACAGTCAGGG TAGCAAGAGT CTAGCTGTCT GGTGGGCACC CAAAATGACC AGGGCTTAAG 1880 TCCCTTTCCT TTGGTTTAAG CCCGTTATAA TTAAATGGTA CCAAAAGCTT TAAAAAAAAA 1940 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1973

Ａ

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で行なった、刺激後の２Ｂ４．１１細
胞のＤＮＡ断片化を示す図である。

【図２】実施例２で行なった、ＩＬ−３涸渇培養後のＬ
ｙＤ９細胞のＤＮＡ断片化を示す図である。

【図３】マウスＰＤ−１遺伝子の制限酵素地図である。

【図４】実施例７で行なった、刺激後の２Ｂ４．１１細
胞およびＩＬ−３涸渇培養後のＬｙＤ９細胞におけるＰ
Ｄ−１ ｍＲＮＡの発現を示す図である。

【図５】実施例７で行なった、各臓器におけるＰＤ−１
ｍＲＮＡの発現を示す図である。

【図６】実施例７で行なった、抗ＣＤ３抗体投与後の胸
腺および脾臓におけるＰＤ−１ｍＲＮＡの発現を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 石田 靖雅 京都府京都市左京区浄土寺下馬場町97 ロイヤルセンタービル小林403

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なるマウスＰＤ−１。
2. 【請求項２】 配列番号４において、アミノ酸配列番号
   １から２６８で示されるマウスＰＤ−１成熟蛋白。