JP3325597B2 - ポリペプチドの製法 - Google Patents
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Description
し、特に可溶性組換え分子の製法に関する。
ばE.コリー中で製造され、この発酵は、生長に好適な
条件下で、即ち約37℃の温度及び約6.8のpHで実
施される。
を満たす栄養物を含有する培地中で実施される。典型的
な培地には、細胞成分の合成及び熱量のための炭素及び
窒素源、イオン例えばスルフェート、ホスフェート、マ
グネシウム、カルシウム、鉄及び種々の微量元素を含有
する。この生長培地の成分として、酵母エキスもしばし
ば存在する。例えば、ルリアブイヨン(Luria Broth)
は、トリプトン及び塩化ナトリウムに加えて、酵母エキ
ス約0.5%を含有する。最近、ルリアブイヨンに酵母
エキスを富化させると、これは、酵母エキスバイオマス
1〜3%を含有し、β−ガラクトシダーゼ発現が増加さ
れることが報告された(X Li、J.W.Robbins及びK.
B.Taylor;Journal of Industrial Microbiology
5、85−94、1990参照)。更に、流加培養法
(fed−batch process)で酵母エキス及びグルコース
を発酵ブイヨン中に供給することにより、組換えヒトイ
ンシュリン類似生長因子を封入体として製造できること
も報告されている(L.B.Tsai等のJournal of Indus
trial Microbiology 2、181−187、1987
参照)。
培養を37℃でかつ6.8のpHで実施し、かつ生長培
地の濁りが約10のOD680である場合には、カサミノ
酸(casamino acid)の2%溶液を添加することよりな
るレシチンAの製法が記載されている。
くのポリペプチドを製造する場合には、このポリペプチ
ドは不溶性の形で、例えば不溶性集合物又は封入体とし
て得られる。この物質を使用すべき際には、これを生物
学的に活性な形に再生することを可能にするため、可溶
性にすべきである。この可溶化工程は、一般に、化学品
例えば、界面活性剤又はカオトロピック剤(これらは、
使用のためには煩雑かつ高価であり、蛋白質を化学的に
変性する)の使用を必要とする。
質が形成される傾向がある。例えば、欧州特許(EP)
第237676号明細書中には、E.コリー中、37
℃、pH6.8でのリシンAの発現は、不溶性物質をも
たらし、これは、尿素とSDSとの混合物での処理によ
り可溶化すべきであることが報告されている。欧州特許
第37676号明細書は、リシンAに関する暗号配列
が、E.コリーK12のアルカリホスファターゼ構造遺
伝子(phoA)のリーダー配列を暗号化するDNAと共
に直接読取りフレーム中に配置されている場合に、可溶
性リシンAが製造されることを報告している。
(abrin)は、植物細胞により製造され、細胞毒特性を
有する公知化合物である。この型のトキシンは、ジサル
ファイド橋を介して連結されている2個のポリペピチド
鎖より成る。このポリペプチド鎖の1方(A−鎖)は、
トキシン分子の細胞毒特性に第1に責任があり、他方の
ポリペプチド鎖(B−鎖)は、トキシン分子を細胞表面
に結合可能にする。
の条件に依存する: (i) B鎖上のガラクトース結合部位と細胞表面上に
露呈されている糖蛋白質又は糖脂質との相互作用による
細胞表面へのリシン分子の結合; (ii) 細胞の細胞質ゾル内への少なくともA鎖の侵
入;及び (iii) RNAの酵素的分解により蛋白質合成及び最終
的細胞死を阻止するリボソームの60S−サブユニット
になる。
その1次機能は別として、ここで細胞内へのリシンの吸
収を促進する重要な2次機能をすると信じられてもい
る。従って、分離されたA鎖及びB鎖は、実質的に無毒
性である。それというのも、B鎖は細胞毒性ではなく、
A鎖は細胞表面への結合能力に欠け、B鎖の不存在では
細胞の細胞質ゾル内に侵入する能力に欠けるからであ
る。
B鎖を正常細胞の存在で腫瘍細胞への結合能を有する種
々のキャリアで換えることができる場合には、抗腫瘍治
療に有用であることが既に暗示されている。従って、リ
シンA及び腫瘍特異性抗体より成る免疫毒素が抗腫瘍治
療で使用できることが提案されている。
の種子からのリシンのA鎖の製造は困難である。特に、
特に、リシンAの精製即ちB鎖からA鎖を分離すること
は困難である。
えばリシンAを製造することは可能であるが、なお、可
溶性ポリペプチドを製造する改良法は必要である。特
に、可溶性リシンAを製造するための改良法は必要であ
る。
る方法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発
現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、かつ
前記宿主を当初期間の間、この宿主の生長に好適な第1
のpH値で培養してポリペプチドを製造し、このpH値
を可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な第2の値に調節
し、かつ前記宿主をさらなる期間の間前記の第2のpH
値で培養し、かつ場合により培養の終末部の間に生長培
地の温度を低下させ、こうして可溶性ポリペプチドを得
ることより成る。
に、不溶性の形で製造される傾向を有するポリペプチド
を製造するために使用できる。
ペプチドの特別な例には、例えばリシンA又はその類縁
体が包含される。
ドを発現させることのできる宿主を培養し、かつこの方
法の間に、可溶性ポリペプチドが得られるようにpHを
調節することより成る、ポリペプチドの製法が提供され
る。特に、前記ポリペプチドを発現させることのできる
宿主を第1期間の間、この宿主の生長に好適な第1pH
値で、生長培地中で培養し、pHを可溶性ポリペプチド
の蓄積に好適な第2の値に調節し、かつ、この宿主を、
この第2のpH値で更なる期間の間培養することよりな
る、ポリペプチドの製造法が提供される。
は、一般に、宿主細胞の生長及び可溶性ポリペプチドの
生成に好適な温度で、宿主細胞を培養し、この培養の終
末部の間に生長培地(及び従って宿主)を冷却し、か
つ、前記終末部の間に宿主を収穫することよりなる。
するのに好適な温度が有利である。
ある温度は、約25℃〜約39℃(例えば37又は38
℃)であり、至適温度は、約37℃である。この温度
は、可溶性ポリペプチドを生成させる温度であるのが有
利であり、一般に、この温度は40℃を下まわる。一般
に、この温度が低下すると、宿主細胞は約25℃を下ま
わる温度まで例えば、約10℃(又はそれ以下)〜約2
5℃の範囲の温度まで冷却されることが有利である。
シンA)の蓄積が高い場所で、かつ最も有利には、最大
特異活性の所で又はその付近で冷却を行なうのが有利で
ある。
させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長
に好適である第1のpH値で第1期間の間培養し、かつ
このpHを第2の値に調節し、かつこの宿主を、この第
2値で更なる期間培養することが一般に有利である。こ
のpHは、多くの方法で調節でき、例えば1工程で又は
1連の工程で調節することができる。第2のpHは、例
えば、可溶性ポリペプチドの蓄積に好適である値より成
り、ここで、これは、ポリペプチドを可溶性形に保持
し、回収することを促進する。
製法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発現
させることのできる宿主を、第1のpH値及びこの宿主
の生長及び可溶性ポリペプチドの生成に好適である温度
で培養し、この方法の間にpH値を第2のpH値に調節
し、かつ場合により、この宿主を、培養の終末部の間に
冷却し、かつ可溶性ポリペプチドを含有する宿主を前記
の終末部の間に収穫することよりなる。
ると、前記の第2pH値は、第1pH値よりも低くな
る。他のポリペプチドを得るために、前記の第2pH値
は、ポリペプチドの種類に応じて、第1の値より大きい
か又は低くてよい。
に、このpH値は、第1の値から第1の値より低い第2
の値に変えられる。前記のように、このpHは、多くの
方法で低められ、例えば、1工程で又は一連の工程で低
下されうる。
から第2の値に調節することが有利であり、特に、この
pHは、直接的に、第1の値から第2の値に調節するこ
とができる。
には、例えば、約6〜8の範囲内の値が包含される。第
1期間の間のpHの有利な値は、例えば6.7又は約6.
7である。約6.7であるpH値には、例えば6.7±
0.1従って、6.8の値も包含される。
は、約5.5〜8の範囲特に約6〜8の範囲内の値であ
る。例えば、第1期間の間のpH(即ち前記の第1の
値)は、約6.7であり、更なる期間の間の特別なpH
値は、6.7より低く、約5.5よりは大きい(殊に約
6.0以上)の値である。
の製法を提供する。従って、本発明によれば、リシンA
又はその類縁体の製法が提供され、この方法は、リシン
A又はその類縁体を発現させることのできる宿主を栄養
培地中で、宿主の生長に好適である第1pHで第1期間
の間培養し、かつ、この宿主を、前記第1pH値よりも
低いpHで、更なる期間の間培養し、かつ、場合によ
り、この宿主をこの培養の終末部の間に冷却し、かつ前
記終末部の間にこの宿主を収穫することより成る。
し、1個以上のアミノ酸変更(欠失、付加、置換)によ
りリシンAの構造とは異なっているリシンAと関連して
いる1次構造を有し、細胞毒活性の欠如の結果をもたら
さない、ポリペプチドが包含される。リシンAを発現さ
せることのできる宿主の製造は、例えば、欧州特許(E
P)第145111号、国際特許(WO)第85/35
08号明細書及びLamb等によるEur.J.Biochem.19
85、148、265−270頁に記載されている。
プチド例えばリシンAは、腫瘍の治療に使用するための
免疫毒素の製造に使用できる。一般に、このような免疫
毒素は、処置されるべき腫瘍およびトキシンに対して特
異的な抗体よりなる。免疫毒素の製造の例は、公開され
たPCT特許出願(WO)第85/003508号明細
書中に記載されている。
えばE.コリー細胞より成るのが有利である。リシンA
の場合には、この宿主はE.コリー菌株例えばDS41
0より成るのが有利である。
を満たす栄養を含有する培地中で培養する。従って、こ
の培地は、一般に、細胞成分の合成及びエネルギーのた
めの炭素及び窒素源、イオン例えば、スルフェート、ホ
スフェート、マグネシウム、カルシウム、鉄及び微量元
素を含有する。
母エキスを添加するのが有利である。この酵母エキスの
添加の方法は、以下の記載に包含される。
はその類縁体)に関してコードし、適当なコントロール
配列例えばプロモータ配列、リボソーム結合部位及び転
写ターミネーター配列のコントロール下にあるDNA配
列を含有する。適当なプロモータ配列の特別な例は、ト
リプトファン(trp)プロモータ配列及びT7A3プロ
モータである。他のプロモータ例えばlac又はtac−プロ
モータも使用できる。従って、例えば、この宿主は、リ
シンAに関してコード化し、trp又はT7A3プロモー
タのコントロール下にあるDNA配列を有していてよ
い。
は、流加培養型(fed−batch type)の発酵より成る。
d−batch type)の方法とは、栄養例えば炭素源又は消
耗時に微生物の生長を限定する多くの栄養を含有するバ
ッチ生長培地を使用する発酵法である。この栄養が消耗
されると、その栄養(nutrient/nutrients)の供給が
開始される。この栄養の供給が必要になる時点は、流加
培養条件の開始に一致する。この発酵培地には、全搬的
に、又はこの発酵の間の段階で他の栄養を供給すること
ができる。
は、流加培養条件に達する時点又はそれ以前に、有利に
は流加培養地条件に達する前にpHを低めることができ
る。
めの流加培養型の発酵法が提供され、この方法は、リシ
ンAを発現させることのできるE.コリー宿主を、約
6.7のpH値で第1期間の間培養し、かつ、この宿主
を、前記の6.7より低いpHで更なる期間培養するこ
とよりなる。
又はその類縁体を製造するための流加培養型の発酵法が
提供され、この方法は、リシンA又はその類縁体を発現
させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長
及び可溶性リシンA又はリシンA類縁体の生成に好適な
第1のpH値及び温度で第1期間の間培養し、流加培養
条件が達成される前に前記第1の値より低い第2の値ま
でpHを調節し、場合により、培養の終末部の間に、こ
の生長培地を、リシンAを可溶性形に保持するのに好適
な温度まで冷却し、前記終末部の間に細胞を収穫するこ
とより成る。
先立ち、流加培養型の発酵法は、この発酵法の終りに回
収されうる可溶性リシンAの収率を減少させる結果をも
たらすことが判明した。意外にも、流加培養条件の達成
の前に冷却を行なう場合に、ポリペプチドの高水準が可
溶性形に保持でき、従って、可溶性ポリペプチドの収穫
を促進することが発見された。
の方法よりなるリシンA又はその類縁体を製造する方法
が提供される: (a) リシンA又はその類縁体を発現させることので
きる宿主を、生長培地中で、この宿主の生長及び可溶性
リシンA又はその類縁体の生成に好適である温度で培養
し、 (b) この生長培地を、この宿主の生長に必須の栄養
の消耗に達する(即ち流加培養条件に達する)前に、こ
の宿主の生長に好適でない温度まで冷却し、かつ (c) 前記栄養の消耗に達する前に細胞を収穫する。
前に収穫を行なう流加培養法に類似していることが明ら
かである。従って、宿主の生長のために必須の栄養の消
耗が起る時点は、流加培養条件に達する時点と等しい。
栄養消耗に達する前に冷却を行ない、有利に、例えば栄
養消耗に達する直前に行なう。
処方されている培地中で生長させることができ、OD
550が約50の場合又はOD550が50に達する前に、こ
の宿主を含有する発酵培地を冷却する。
で温度を低めることが望ましい場合には、この方法は次
の工程を包含していてよい: (a) リシンAを発現させることのできるE.コリー
宿主を栄養培地中で、約37℃〜39℃の範囲の温度で
培養し、 (b) この発酵培地を、流加培養条件に達する前に約
25℃より下まわる温度まで冷却し (c) 宿主細胞を流加培養条件に達する前に収穫す
る。
って、約10℃(又はそれ以下)から約25℃の範囲の
温度まで冷却することができる。
ともできる。このような方法は、前記の方法がリシンA
又はその類縁体を発現させることのできる宿主を生長培
地中で培養し、この培養の間に酵母エキスを含有する補
充物をこの生長培地に添加するような方法も含める。
コート又は実質的な連続的供給の方法で添加することが
できる。この酵母エキスは、一般に、宿主の生長相の間
に添加する。例えば、酵母エキスを含む補充物の添加
は、培養の開始後の予め決められた時間で開始するのが
有利である。この時間の特別な例は、流加培養条件が達
成される前の時点である。
の生長培地の酵母エキスが消耗されないようにするのが
有利である。従って、この生長培地の当初組成物中に酵
母エキスが含有される場合には、補充物の添加を、当初
組成物中に存在する酵母エキスが消費される前に開始す
るのが有利である。酵母エキス供給の好適な速度には、
例えば約0.85〜3.4g/l・hの範囲の供給速度が
包含される。供給の特別な速度は、1〜2g/l・hの
範囲殊に1.7g/l・hである。
細胞例えばE.コリーより成っていてよく、例えば、こ
の宿主細胞がリシンAを発現させることのできるもので
あるのが有利である。
温度で実施される。細菌細胞例えばE.コリーの生長に
特に好適である温度は、約37℃である。この温度は、
培養の間に(殊に、培養の終末部の間に)、前記のよう
に低下させることができる。
ンA製造時に意想外に有効であることも判明した。前記
のように、一般に、pHを調節しかつ/又は温度を低め
るのが有利である。
収する。この処理は、通例、細胞を崩壊させ、他の蛋白
質物質から、1以上の抽出工程で粗製リシンAポリペプ
チドを分離し、かつ更に、ゲル濾過、高速液体クロマト
グラフィ又は他の慣用の精製法により、リシンAを精製
することよりなる。
造に有利であることが判明した。
ペプチドの生成及び/又は回収に有利である。殊に、こ
の方法の間に、生長培地のpHを調節することにより、
可溶性ポリペプチドの高収率が得られることが判明し
た。意想外に、培養の終末部の間に生長培地を冷却し、
この終末部の間に細胞を収穫すると、可溶性ポリペプチ
ドの高収率が回収されうることも判明した。この冷却工
程は、特に有利であることが判明した。それというの
も、これは、収穫の前に遅延があっても、可溶性ポリペ
プチドの高収率が得られる大きな処理範囲をもたらすか
らである。
培養法が特に有利であることが判明した。
て、本発明の方法は、特に有利であることが判明した。
法の間に酵母エキスを添加する際に高められることが判
明した。pHも調節される方法殊に、pHが調節される
流加培養法は、予想外に、可溶性リシンAの高収率を与
えることが判明した。
性リシンAの製造に有利であることが判明した。この方
法の間に酵母エキスを添加すると、この収率は高められ
ることも判明した。
発明を詳説する:図1は、pICI0020の構成を説
明している図であり;図2は、pTB344の構成を説
明している図であり;図3は、pICI0042の構成
を説明している図であり;図4は、pICI1079の
構成を説明している図であり;図5は、pICI118
7の構成を説明している図であり、図6は、E.コリー
リゼートのクマシーブルー染色SDSゲルを示す図であ
り、ここでトラックAは、pICI1102、BはpI
CI0020であり、Cは分子量マーカーであり;図7
は、ピークRがリシンAを示しているpICI1102
のゲルプロフィルを示す図であり、図8は、pICI1
102により産生されたリシンAのウエスタンブロット
であり、ここでトラック1は分子量マーカーであり、2
及び3は、非−リシン産生クローンであり、4はpIC
I1102であり、5はpICI0020(対照プラス
ミド−非リシンA配列)であり;図9は、pICI11
02の部分配列であり;図10は、pICI1102の
構成を説明している図であり;図11は、プラスミドの
製造で用いられているフラグメントを示す図であり、図
12は、pICI0042のプラスミド地図であり、図
13は、転写ターミネーターの配列を示す図であり、図
14は、pICI1079のプラスミド地図であり、図
15、図16及び図17は、それぞれDS410に関す
るバイオマス、全リシンA蓄積及び可溶性フラクション
中のリシンAの分配率に及ぼす流加培養発酵の影響を示
す図であり;図18、図19、図20及び図21は、そ
れぞれ、バイオマス濃度、全リシンA蓄積、可溶性フラ
クション中の可溶性リシンA分配率及び可溶性リシンA
の収率に及ぼすpHの影響を示す図であり;図22は、
使用pHプロフィルを示す図であり;図23、図24及
び図25は、冷却の影響を示す図である。
例中に詳述する。
る: 菌株 ここで使用されるE.コリー菌株は、自由に入手可能で
ある。例えばE.コリーMM294及びW3110は、
自由に入手可能である。MM294及びW3110は、
例えば、E.コリー・ジエネティック・ストック・セン
ター(E.coligenetic Stock Centre、Yele Univers
ity、USA)から入手できる。W3110の△lac誘導
体は、当業者により容易に製造される。
ugan及びSherratt、Molecular andGeneral Genetic
s,Vol.151、p151−160、1977)、公開
されたゲノタイプF- ara azi tonA lacY minA
minB rpsL malA xyl mtl thiを有する。この菌株
は、一般的に自由に入手可能であり、更に、本発明者に
より1985年6月7日に、ブダペスト条約のもとで、
ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・
&・マリン・バクテリアLtd.アバディーン・スコット
ランド(National Collection of Industrial&Mari
ne BacteriaLtd,Aberdeen,Scotland)に寄託番号1
2100で寄託されている。
ばれるW3110のΔlac誘導体を、pICI 1187を用いて形質
転換した。
(pICI 1187)およびW3110Δlac(pICI 1187)を精製
し、グリセロールストック中で−80℃で維持した。そ
れぞれの培養基のアリコートをストックから除去し、L
−テトラサイクリンの寒天プレートに画線培養し、単一
コロニーを37℃で一晩中生長させた後に分離した。
87) およびMM294 (pICI 1187) の単一コロニーを除去
し、別々にL−テトラサイクリンブイヨン10mlに再
懸濁させ、100μlをただちに、L−テトラサイクリ
ンブイヨン75mlを含有する10個の250mlの三
角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪器で37℃で
16時間生長させた後、10個のそれぞれのセットのフ
ラスコの内容物を集め、LCM50(酵母エキス10g/
l)を含有する3つの別々の発酵槽に接種するために使
用した。
M水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節してpH
6で実施した。溶存酸素圧(dOT)設置点は50%の
空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の自動調整に
より制御した。発酵槽への空気流は常に、1容量容量/
分(VVM)に相当する20L/分である。
の間に光学密度(OD550)、細胞乾燥重量、細胞中の
リシンAの蓄積および分配率を測定するためにサンプル
を取った。リシンA蓄積は、公知のように、試料採取し
た細菌の全ての細胞リゼイトのクーマシーブルー(Coom
assie blue)染色SDS−PAGEゲルを走査すること
により測定した。細胞の細胞質(可溶性)および封入体
(不溶性)フラクション中のリシンAの分配率は、公知
のように、試料採取した細菌を音波処理溶菌にかけるこ
とにより測定した。
宿主菌株の変化は、可溶性の細胞質フラクション中に
分配されたリシンAの水準における予想外の変化を引き
起こした。第1表は、DS410(pICI 1187)、W3110Δlac
(pICI 1187)およびMM294(pICI 1187)の菌株につい
て、発酵の終了(14.25時間)での、得られたバイ
オマス、全リシンA蓄積および可溶性フラクション中に
分配しているリシンAのパーセンテージを表わした。
における劇的変化を引き起こすことができる。
よびMM294 (pICI 1187)を用いるLCM50増殖培地(酵母エ
キス20g/l)を用いて、例1に記載した発酵工程を
繰り返した。酵母エキスの溶液(333gl-1)を、
発酵槽に接種した後4.25hから、0.85gl-1
h-1で発酵槽中に供給した。この酵母エキスの供給速
度を、発酵槽に接種した後5.75hで、1.7gl
-1h-1に増大させた。発酵槽中の炭素源が枯渇した場
合、(dOP中の急速増加を引き起こす)、グリセロー
ル(714gl-1)および硫酸アンモニウム(143
gl-1)を含んだ飼料を、発酵槽中に細菌の酸素取り
上げ速度を制限する速度でポンプ輸送した。
の酵母エキス溶液の供給を除いて、3つの発酵槽の培地
及び発酵条件は、例1に記載された工程と同様である。
比較して、全て3つの菌株のバイオマスにおける改良、
菌株 DS410(pICI 1187)、W3110Δlac(pICI 1187)お
よびMM294(pICI 1187)の可溶性フラクション中に分配
されたリシンAの量の改良および、全菌株の可溶性リシ
ンAの全収量における改良を生じさせた。第2表は、最
終的なバイオマス濃度、全リシンA蓄積、可溶性フラク
ション中に分配されたリシンAのパーセンテージ、およ
び発酵の終了時(16.25時間)の可溶性リシンAの
計算された収量を表わす。
酵工程での3つの菌株に対する可溶性リシンAの計算し
た収量と比較した。
/Lであり、酵母エキスを発酵槽中に供給するおよび/
または酵母エキスを0.85gl-1h-1、1.7gl
-1h-1または3.4gl-1h-1で発酵槽中にポンプ
供給する場合に、同じ結果が得られた。
フラクション中に分配されたリシンAの%および発酵ブ
イヨン1リットルあたりの可溶性リシンの収量を増大さ
せることができる。
1187) およびDS410 (pICI 1187)を用いて、Lトリプト
ファン100mgl-1を追加したLCM50増殖培地(酵母
エキス10g/l)を用いて、例1に記載した発酵工程
を繰り返した。L−トリプトファン溶液(10g
l-1)は、発酵の間中、90mgl-1h-1で発酵槽
中にポンプ供給される。
了時(14.25h)で、バイオマス濃度、全リシンA
蓄積および可溶性フラクション中に分配されたリシンA
のパーセンテージを比較している。L−トリプトファン
の補充および供給は、公知のようにトリプトファンプロ
モータの活性に影響を及ぼすために実施した。例1及び
特に例2に記載した発酵工程と比較して、不利な効果が
全般的に観察された。菌株 MM294 (pICI 1187) はより
高いバイオマスを製造するが、可溶性フラクション中に
分配するリシンAのパーセンテージは減少した。菌株 D
S410 (pICI 1187)およびW3110Δlac (pICI 1187) はリ
シンAの分配率において変化を示さなかったが、製造さ
れたバイオマスの水準は減少した。例2に記載した酵母
エキスを用いて達成された結果は、添加した酵母エキス
が著しい量のトリプトファンを含有するため、最も意想
外であった。
l)中のE.コリー 菌株DS410(pICI 1187)を用いて
繰り返した。
よび6M水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節さ
れたpH6.7で実施した。溶存酸素圧(dOT)設置
点は50%空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の
自動調節により制御した。発酵槽への空気流は、最初
に、1容量容量/分(VVM)に相当する20L/分で
あり、発酵槽の攪拌速度が最大に達した場合に手作業で
45L/分に増大させた。この発酵は、34時間実施さ
れ、この時間の間に光学密度(OD550)、細胞乾燥重
量、細菌細胞中のリシンAの蓄積および分配率を測定す
るためにサンプルを取った。リシンAの蓄積は、公知の
ように、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクー
マシーブルー(Coomassie blue)染色SDS−PAGE
ゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質(可
溶性)および封入体(不溶性)フラクション中のリシン
Aの分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波
処理溶菌にかけることにより測定した。酵親エキス(3
33gl-1)の溶液は、接種の後4.5時間に、発酵槽
へ1.7gl-1h-1でポンプ供給された。
おける炭素源の供給は枯渇し、50%空気飽和からdO
Tにおいて急速増加を引き起こす。この時点から、グリ
セロール(714gl-1)および硫酸アンモニウム(1
43gl-1)を含有する飼料を、細菌の酸素取り込み速
度(OUR)を発酵槽の最大酸素移動速度の約80%ま
でに制限する速度で、発酵槽へポンプ供給し、その間に
dOTは50%空気飽和に戻り、次いでこれを維持し
た。
fermentation)、全リシンA蓄積および可溶性フラクシ
ョン中でのリシン分配率への影響は、図15、16およ
び17にそれぞれ表わした。流加発酵を開始した時点
は、それぞれの図に表示した(FB)。可溶性フラクシ
ョン中でのリシン分配率に関する流加発酵の効果は明ら
かである。
除去し、この培養100μlを除去し、即座にL−テト
ラサイクリンブイヨン600mlを含有する3つの2リ
ットルの三角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪機
上で37℃で16時間培養した後、フラスコの内容物
を、LCM50増殖培地(酵親エキス20g/l)を含
有する3つの発酵槽に接種するために用いた。
水酸化ナトリウム溶液の自動添加により制御するつぎの
pHで実施した。
6.0に調節 (C) 接種後10時間までpH6.7、その後pH
7.6に調節 この溶存酸素圧(dOT)設定点は50%空気飽和であ
り、最初に発酵槽攪拌速度を自動調節することにより制
御した。発酵槽への空気流は、最初に1容量容量/分に
相当して20L/分であり、発酵槽攪拌速度が最大(1
000rpm)にたした場合に45L/分に手作業で増
大させた。この発酵槽への空気流は、発酵の後半に向か
う場合、手作業で20L/分に減少させ、攪拌速度は自
動的に約500rpmに減少した。
間に、光学密度(OD550)、細胞乾燥重量、可溶性フ
ラクション中のリシンAの蓄積および分配率を測定する
ためにサンプルを取った。リシンAの蓄積は、公知のよ
うに、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクーマ
シーブルー(Coomassie blue)染色SDS−PAGEゲ
ルを走査することにより測定した。細胞の細胞質(可溶
性)および封入体(不溶性)フラクション中のリシンA
の分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波処
理溶菌にかけることにより測定した。
種の後4.5時間から、発酵槽へ1.7gl-1h-1でポ
ンプ供給された。
%空気飽和からdOTにおいて急速増加が引き起こされ
る)、グリセロール(714gl-1)および硫酸アンモ
ニウム(143gl-1)を含有する飼料を、細菌の最大
炭素需要に適合するために十分な速度で、発酵槽にポン
プ供給した。この制限された炭素源および硫酸アンモニ
ウムの供給速度は、次いで発酵の残りの間、変化させな
かった。
C)の効果を図18、19、20および21に示し、こ
れはバイオマス濃度、全リシンA蓄積、可溶性フラクシ
ョン中に分配するリシンAのパーセンテージおよび可溶
性リシンAの計算された収量をそれぞれ示す。図22は
発酵の間の増殖培地のpHを表わす。pH6.7〜pH
6.0への変更の可溶性リシンの収量に関する有利な効
果が明らかに示されている。
11.5時間に、発酵温度を次第に減少させた。
た。図23、24および25は得られた結果を示した。
図25は工程中の発酵温度を表わした。
えリシンAを製造するために使用したベクターの誘導に
おける多様な中間工程を記載した。
A変更を導くために使用した。引き続き記載した全ての
オリゴヌクレオチドは Applied Biosystems 380A のD
NA合成装置で、Applied Biosystems Inc.により提供
された手引書に従って、5′−ジメトキシトリチル塩基
保護されたヌクレオシド−2−シアノエチル−N,N−
ジイソプロピルホスホラミジットおよび制御孔ガラス担
体に連結させた保護されたヌクレオシドから0.2マイ
クロモル規模で製造した。
体から切り離し、全ての保護基を除去した後に、水(1
ml)に溶かし、濃度の測定のために260nmでの吸
光度の測定を使用した。
は、次に記載する操作において使用される。これらは多
くの供給元(Amersham International, BethesdaResear
ch Laboratories, Boehringer Mannheim または New En
gland Biolabs)の一つから得られ、反応条件に関する
製造説明書に従って使用した。
ナトリウム/水 エタノール/水洗浄を製造するための
塩化ナトリウム、トリスおよびEDTAの濃溶液;3)
グラスミルク(Glassmilk(TM))−水中のシリカマト
リックスの懸濁液1.25mlを含有する1.5mlバ
イアルからなる。
方法(National Academy of Sciences USAの会報(1979)
76版、615頁に公開)を基礎とするDNA精製の
ための技術である。
oratory manual" Second Edition,Sambrook, Fritsch
および Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 19
89)に記載された方法のいくつかが使用できる。
National Academy ofScience USA (1987) vol 84 pp 4
767-4771に公開)を基礎とする。
3ベースのプラスミドであり、この中で、651 bp
EcoRI−AccI領域は、 (1) 合成E.コリー trp プロモータおよびtr
pリーダーリボソーム結合部位 (2) 翻訳開始コドン (3) KpnI、BamHI、XbaI、SalI、
PstI、SphIおよびHindIIIを含有するM
13mp18から誘導された多重制限酵素認識配列 (4) 合成転写末端配列 からなる167 bp EcoRI−ClaIフラグメ
ントに置き換えられる。
た。
スミドベクターの組み立て法は公開されている(Windas
s et al Nuc. Acids Res. 10 p6639-6657, 1982)。プ
ロモータフラグメントは、酵素EcoRIおよびHpa
Iを用いた消化および電気溶離("Molecular Cloning -
A Laboratory Manual" Maniatis, Fristsch およびSam
brook, CSH laboratoryにより出版, 第2版1989お
よび後に "Maniatis"として報告)によりアガロースゲ
ルからの適当なバンドの精製の後で、このようなベクタ
ーから単離される。
位、翻訳開始コドンおよび3′KpnIクローニング部
位を提供するプロモータフラグメントのHpaI末端に
リゲートすることとなる相補性合成オリゴヌクレオチド
のペアが製造される。このようなオリゴヌクレオチド
は、等モル濃度で混合され、100℃に加熱されること
によりアニーリングし、引き続きゆっくりと室温に冷却
される。
リングしたオリゴヌクレオチドを、次にリゲートし、適
当なバンドをポリアクリルアミドゲルから電気溶離によ
り単離した。次に、このフラグメントを、HindII
I部位中にクローンしたtrpアテニュエーター配列
(合成オリゴヌクレオチドから生成した)を含有し、か
つアテニュエーターに対して3′に付加的ClaI制限
部位を導入しているM13mp18ベクター誘導体とリ
ゲートさせた。このリゲートしたDNAを、CaCl2
法(Maniatis, chapter 1p82)によりコンピテントにし
たE.コリー菌株JM109へトランスフェクションし
た。平板培養し、このプレートをインキュベートした
後、プラークを、あらかじめ単離したEcoRI−Hp
aIプロモータフラグメントのニックトトランスレーシ
ョン法により生成した32P標識プローブを用いるBenton
および Davies (Maniatis, chapter 4p41) の方法によ
りスクリーニングした。一本鎖DNAはポジティブのハ
イブリット形成プラークから、標準方法(Maniatis, ch
apter 4p29)により製造し、いくつかのサプライヤー、
たとえばシークエナーゼ(United States Bioscience)
によりキットの形で提供されているように、M13万能
プライマーおよびサンガーダイデオキシチェインターミ
ネーター法(Sanger dideoxy chain termination metho
d)を用いて配列決定させた。
結合部位/アテニュエーターが確認された一つの単離物
から製造された。このDNAは、EcoRIおよびCl
aIを用いて消化され、適当なフラグメントが、前記し
たようにポリアクリルアミドゲルから単離される。プラ
スミドpAT153は酵素EcoRIおよびAccIを
用いて消化され、単離したプロモータフラグメントとリ
ゲートされた。リゲートされたDNAは、コンピテント
E.コリー HB101(Bethesda Research Laborator
ies)を形質転換するために用いられ、およびアンピシ
リン耐性コロニーが選択された。
が製造され、DNA配列はEcoRIおよびClaI部
位の間の領域から誘導される。正確なプロモータ/アテ
ニュエーター領域を含有すると確認されたクローンは、
pICI 0020と命名した。
の中で、pAT153の抗生物質耐性マーカーは、プラ
スミドRP4からの単一な誘導テトラサイクリン耐性遺
伝子により置き換えられる(遺伝子tetAによりコー
ド化され、tetR遺伝子の製造により調節される)。
この遺伝子は、Klock et al (J. Bacteriol. 161 p326-
332, 1985)により特徴が示された。プラスミド安定機能
(cer)も組み込まれていた。これは、製造工程の全
てのパートにおいて、β−ラクタム抗生物質にとっての
必要物を除き、最終生成物においてこれについて分析さ
せる。この新規の耐性マーカーは抗生物質の存在でのみ
表現されるため、tetA遺伝子生成物は、プラスミド
をテトラサイクリンの不在で維持する培養中の組換えリ
シンAの潜在的汚染物ではない。
pAT153の誘導体を製造することであり、これから
テトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子を完全に除
去された。合成オリゴヌクレオチドの相補性ペアは、p
AT153からのEcoRI−AvaIフラグメント
を、その後のクローニングのための多様なユニーク制限
エンドヌクレアーゼを含有する短い配列に置き換えるた
めに設計された。
oRIおよびAvaIにより消化され、2.175Kb
pプラスミドDNAフラグメントは Geneclean(Bio 10
1, California)を用いる0.7%アガロースゲルか
ら、製造説明書に従って単離した。テトラサイクリン耐
性遺伝子を含有する1.425Kbpフラグメントはこ
のようにして除去される。
び80)を、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホ
スホリレート化され、等モル量を一緒にアニーリングさ
せた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドのサンプル
を、次いで、pAT153からのプラスミドフラグメン
トとリゲートした。リゲートしたDNAをE.コリーH
B101(BRL)中へ形質転換させ、アンピシリン耐
性コロニーを選択した。
A製造のために取り(Maniatis, chapter 1p25 に明ら
かにされたようなBirnboim および Doly の方法)、所
望の組み立てを、適当な酵素、たとえばEcoRI、A
vaIおよびBamHIを用いて制限分析により確認し
た。正確な制限パターンを有するものとして確認された
3つの単離物の構造は、pBR322 EcoRI部位
右回りプライマー(New England Biolabs)を用いるD
NA配列分析により確認された。単離物をpICI00
19と命名した。
クから、Holmes および Quigley (Maniats, chapter 1p
29)の方法により単離した。このDNAは、BglII
を用いて、次いで部分的にXmaI(25℃で、35分
まで)を用いて、多様な時点でサンプルを取りながら、
tetRおよびtetAを含有する2.45Kbpフラ
グメントが明らかに確認されるまで完全に切断した。p
UC8 DNAのサンプル(Amersham International)
はBamHIおよびXmaIを用いて完全に消化させ
た。リゲーションは、テトラサイクリン耐性遺伝子をp
UC8へ挿入するために行なった。リゲートしたDNA
は、CaCl2法(Maniatis, chapter 1p82)によりコ
ンピテントにしたE.コリー C600(Appleyard, R.
K. Genetics39 p440, 1954)を形質転換するために用ら
れ、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。プラス
ミドDNAは8クローンから製造され(Holmes および
Quigley)、RP4 tetRおよびA遺伝子の存在は、
制限分析により確認された。これらの単離物の一つをp
TB344と命名した。
ICI 0019からのEcoRI/PstIフラグメ
ントをpTB344からの相応するフラグメントに置き
換えることにより、pICI 0019(前記した)中
に挿入した。これは、結果として、pICI 0019
中のアンピシリン耐性遺伝子の大半がテトラサイクリン
耐性遺伝子に置き換えられることになる。プラスミドD
NAの消化およびリゲート、引き続きE.コリー C6
00の形質転換の後、コロニーを、表現形、つまりTc
RおよびApSに基づき選択した。プラスミドDNAをこ
のような4つのクローンから製造し、酵素、たとえばB
amHI/PstI/SstI、EcoRI/Sal
I、SmaI、StyI/SalIおよびAvaI/P
stIの組み合わせを用いて消化させた。制限パターン
を製造した全ての4つのクローンは所望の組み立てと一
致している。これらの一つをpTB351と表わした。
-1103, 1984)は、ColEI(たとえばpAT15
3)から誘導されたプラスミドの不安定性が、親プラス
ミド中に存在する283bp配列、cerの損失を引き
起こすことを明らかにした。この配列は、プラスミドオ
リゴマーの形成の妨害を補助し、後者は、いまだ不確定
の方法で分配されるプラスミドを崩壊させると思われ
る。このcer配列(Summers, D. et al MGG 201, p33
4-338, 1985)は、Prof. d. Scherrattにより、pUC
18(pKS492)中にクローンされたフラグメント
の形で、念入りに製造された。pKS492プラスミド
DNAは、BamHIおよびTaqIを用いて消化さ
せ、289bpのcer含有フラグメントを放出させ
た。プラスミドpTB351DNA(dam-宿主E.
コリー GM48から単離、Arraj, J. A.および Marin
us, M. G. J.Bact. 153 p562-565, 1983)を、Bam
HIおよびClaIで完全に消化させ、所望のpKS4
92DNAとリゲートさせた。コンピテントE.コリー
C600のリゲートしたDNAを用いた形質転換の
後、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。推定ク
ローンから酵素、AvaI、MluIおよびPvuIを
用いたプラスミドDNAの制限分析は、cerの存在の
確認のために用いられた。正確な構造を有する単離物の
一つをpICI0042と命名した。
および図3に概略した。
ン耐性のpAT153誘導プラスミドであり、これは、
EcoRIおよびStyI制限部位の間に次の要素: (i) ファージλからのCI857遺伝子 (ii) λPLプロモータ (iii) 合成リボソーム結合部位 (iv) 合成インターフェロンα2遺伝子配列 (v) ファージT4からSalIおよびStyI
制限部位の間に誘導された合成転写ターミネーター配列
を含有する。この転写ターミネーターのDNA配列は図
13に記載した。pICI 1079は図14に示し
た。
基づき寄託されている。この寄託はNCIMB, 23 St Macha
er Drive, Aberdeen, Scotland で行なわれた。
pICI 1185(下記の7.d参照)の生成のため
のT4転写ターミネーターの供給源を提供するために用
いられた。このプラスミドの生成のための出発点は、p
ICI 1043である。pICI 1043はpICI
0020(前記の3.a参照)をベースとしたプラス
ミドであり、この中で、λPLプロモータおよびインタ
ーフェロンα2遺伝子を含有する発現カセット(Edge e
t al Nuc. Acids Res. 11 p6419-6435, 1983)はEco
RIおよびSalI部位の間に存在する。
SalIおよび3′SphI付着末端を有するバクテリ
オファージT4の遺伝子32から転写ターミネーターの
生成のために合成される。このフラグメントを、Sal
IおよびSphIで完全に消化したpICI 1043
から単離したプラスミドフラグメントとリゲートした。
このように製造した中間プラスミド(pICI 107
8)は、T4ターミネーターおよびtrpアテニュエー
ター配列の両方を連結して含有する。
は、次に、pICI 1078のSphIおよびSty
I部位の間へ挿入することにより、trpアテニュエー
ター配列(およびテトラサイクリン耐性遺伝子の残りの
部分)を置き換えるために使用した。ユニークBamH
I部位は、この合成フラグメントの中で導入された。
8RA)を生成した。このクローンは、プラスミドpU
C8(Vieria, J and Messing, J. Gene, 19,p259, 198
2)中の公開されたcDNA配列(Lamb, I. F., Robert
s, L. M., Lord, J.M. Eur. J. Biochem, 1985, 148, p
265-279)に従って、リーダー配列中の塩基番号−74
からB−鎖内(塩基番号857)でBamHI部位まで
A鎖cDNAを含有する。さらに、部位突然変異は、成
熟リシンAの最終コドンに対して3′付近の翻訳終止コ
ドンを生成するために用いられた(O' Hare, M et al F
EBS Letters, 1987, 216, p73-78に報告)。全体のA鎖
をコード化する領域はこのクローンからBamHIフラ
グメントに含まれる。
創作者から得られた。後の保存のために、このDNAの
希釈液を、E.コリー DH5αコンピテント細胞(Be
thesda Research Laboratories)の形質転換のために使
用し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。このク
ローンからのプラスミドDNAは変更 Birnboim-Doly法
(Maniatis, chapter 1p25)により製造した。このDN
Aのサンプルは、BamHIおよびBanIを用いて別
々に消化し、アガロースゲル上で電気泳動の後に、DN
Aのオリジナルサンプルの相応する消化物と比較した。
制限パターンにおける差異は観察されず、これに基づき
2つのDNAサンプルは同一と断定された。
びファージM13菌株K19(Anglian Biotechnolog
y)からのRF(複製型)DNAは、標準の条件(Mania
tis, chapter 1p68)を用いて「ショットガン」リゲー
トした。対照リゲーションも実施される。これらのリゲ
ートされたDNAは、CaCl2法(Maniatis, chapter
1p82)によりコンピテントにしたE.コリー菌株TG
1(Gibson,1984/Anglian)を形質転換するために用い
られた。
表わす形質転換頻度は子孫に現われた。組換えファージ
は、lacZ(β−ガラクトシダーゼ)遺伝子の破壊の
ためIPTG+X−gal(BRL)含有プレート上に
透明プラークを生じることが予想される。野生型ファー
ジは、βガラクトシダーゼによるX−galの転換のた
め青色プラークを生じる。
のために取った。溶菌したファージ懸濁液の直接ゲル電
気泳動は、ファージクローンが、リシンA鎖コード化配
列を配列決定により確認されたかなりの大きさの挿入物
を含有することを示した。成熟リシンAコード化配列の
182塩基だけが確認されたが、これは完全なリシンA
遺伝子の存在についての十分な形跡として受け取られ
た。このクローンはM13K19RAと命名した。
発 成熟リシンAの開始部でpICI発現ベクターと一致す
るKpnI部位の生成のために、次の変化(アンダーラ
インで示した)が必要である:
I部位が生じる。KpnIフラグメントを含有するリシ
ンAを、突然変異体から取り出し、一連のICI発現ベ
クター中に挿入することができる。2つのN末端アミノ
酸修飾が行なわれた(ile−pheからmet−va
l)。
Aは、それぞれの突然変異戦略のための突然変異誘発工
程のための鋳型である。この戦略のための突然変異的な
全ての変化を誘導する一本鎖オリゴヌクレオチド(DT
R16)が合成された。
的DNA配列変化の導入のために存在する。以下に概略
したこれらの手引書は 、キットの形で提供されている
ような、Eckstein et al(Nuc. Acid Res., 1985, 13 p
8749-8764 および 1986, 14,p9679-9698)の方法を用い
て達成され、その製造手引書に従って使用した。
然変異オリゴヌクレオチドを挿入し、dATPの代わり
にdATPαSを組み込んだ相補的鎖を合成することで
ある。このヌクレオチドの使用は、ホスホロチオエート
結合の形成を生じさせ、この結合は特定の制限酵素(た
とえばNciI)により分解されない。第2の鎖の合成
の後に、NicIは親鎖の切開のために用いられ、エキ
ソヌクレアーゼIIIは突然変異点を過ぎて後方を消化
させるために添加した。DNAポリメラーゼIは親鎖を
最合成させる。結果として、この突然変異オリゴヌクレ
オチドは最合成の鋳型として行動し、この突然変異は、
形質転換する前に双方の鎖に導入される。全子孫の96
%までの突然変異頻度が要求され、スクリーニングはD
NA配列分析のためランダムでプラークをピッキングす
ることにより簡単に行なわれた。
中の4つが正確に突然変異を起こしていた。
ら、RF DNAが製造され、新たに生成された制限フ
ラグメント、たとえばKpnIの存在について確認し
た。
の特性表示 発現ベクター(セクション5参照)の一連のpICI
は、Trpプロモータに隣接したユニークKpnI制限
部位中に、クローンされたDNAフラグメントを受け入
れることができる。KpnI部位は翻訳開始コドン(A
TG)をオーバーラップし、これはこのプロモータの S
hine-Dalgarno 部位(AGGA)から8bp下方に位置
している。
(-5μg RF DNA)KpmI消化を行ない、関連
するリシンAコード化DNAフラグメントを、製造手引
書に従って、アガロースゲル(Nu-Sieve GTG アガロー
ス、FMC Bio-生成物)から、切除したゲルスライスのフ
ェノール抽出により単離した。
nIで消化され、次に、子牛腸アルカリ性ホスファター
ゼ(CIP−Boehringer Mannheim)を用いて脱ホスホ
リレートした。後の処理は、リゲーションの際のベクタ
ーの再環化を防ぎ、これは形質転換子孫中の親の高い割
合を導く。
8:1(w/w)〜1:3のプラスミドベクター対単離
したフラグメントの割合で始めた。ホスファターゼ処
理、リガーゼ活性等の効果を試験するための対照リゲー
ションを包含した。このリゲーション条件は、使用した
T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs or Amersh
am)の供給源にとって適当であった。反応物は一般に1
5℃で一晩中インキュベートした。
の50%を100μlまで1×TNE(トリス50m
M、NaCl50mM、EDTA1mM)で希釈し、コ
ンピテントE.コリー DS410200μlを添加し
た。標準の形質転換手引書(Maniatis, chapter 1p74)
に従って、細胞を、ストレプトマイシン(25μg/m
l)およびアンピシリン(100μg/ml)を添加さ
れたL寒天上にプレートし、37℃で一晩中インキュベ
ートした。E.コリー DS410は染色体ストレプト
マイシン耐性遺伝子を有している。
試験された。一般に、5〜10倍以上のクローンが、リ
ガーゼなしの対照と比較したリゲーションにおいて見ら
れた。これらのいくつかの場合、リガーゼの存在または
不在で産生されるクローンの数においてわずかな差異が
生じ、ベクターの不完全な消化または乏しいリガーゼ活
性を示す。
ブリダイゼーションスクリーニングのためのL寒天プレ
ート上に置いたニトロセルロースフィルターに取った
(Maniatis, chapter 1p98に記載されたように、Grunst
ein および Hognessの方法を基礎とする)。インキュベ
ートの後、コロニーを10%SDSおよび1MNaOH
を用いてその場で溶菌し、1Mトリス(pH7.5)を
用いて中和し、真空中で80℃で3時間乾燥した。
ポリヌクレオチドキナーゼを用いる突然変異オリゴヌク
レオチドの32P標識により生成した。このフィルター
は、室温で試験され、次いで、55〜65℃までの範囲
内で洗浄し、オートラジオグラフィーの前に、非特異的
結合カウントを除去した。特異的ハイブリダイゼーショ
ンは推定のリシンADNA含有クローンを示す。
25に特徴付けられたように、Holmesおよび Quigley ま
たは Birnboim-Dolyの方法による)はポジティブな雑種
形成クローンから作られた。このDNAは、関連する制
限酵素、たとえばKpnIおよびEcoRI/BglI
Iを用いて消化され、アガロースゲル上での電気泳動に
より分析した。ベクターDNAおよび突然変異RF D
NAは、これらの酵素により切断され、正確なクローン
について予想されるフラグメントサイズが立証された。
NA製造(Birnboim-Doly)は、より詳細な制限分析、
たとえばClaI、HindIII、BamHI、Ec
oRI/BglII、KpnIおよびScaIのために
使用された。アガロースゲル上で、これらの消化物は挿
入されたフラグメントのサイズ、この配向の表示、およ
びいくつかのユニークリシンA−鎖酵素部位の獲得を示
した。
りポジティブと同定されたこれらのクローンは、全細胞
リゼイトのSDS−PAGE分析によりリシンAの発現
について試験した。発現調査のための標準条件を次に示
す:1) L−ブイヨン+抗生物質10mlに単一コロ
ニーを接種し、温和に振盪させながら一晩中37℃で生
長させた。
を取り、マイクロフュージ(microfuge)中で、(65
00rpmで1分)細胞をペレット化させた。
appendix A.3)300μl+0.02%のカゼイン水解
物+0.2%グルコース+チアミン50μg/mlに再
懸濁させ、同様のもの10mlへ接種した。
一晩中37℃でインキュベートした。
定し、セルをペレット化させ、OD540=10per
mlまで、Leammli試料緩衝液(Maniatis, chap
ter 18p53)中に再懸濁させた。15分間煮沸した。
リアクリルアミドゲル上に移し、電気泳動し、クーマシ
ーブルーで染色し、脱色し、可視化した。
の中の一つだけは、-29KDの等しい分子量を有する
付加的バンドを示した(非グリコシル化した、成熟リシ
ンAに対して評価されたものと同じ)。ゲル走査は、全
細胞タンパク質の5〜10%の範囲内までの発現レベル
を示した。このクローンはpICI 1102と命名し
た。
略した。発現調査の結果は図6および図7に示した。
ランスファーおよび免疫検出 組換えリシンA−鎖タンパク質の確認は、まず、SDS
−ポリアクリレートアミドゲルのクーマシーブルー染色
により観察し、ウエスタンブロットにより確認された。
タンパク質バンドはニトロセルロースフィルターに移さ
れ、リシンAに特異的な抗体、引き続きペルオキシダー
ゼにより標識付けしたアンチグロブリンを用いて検出し
た。
一晩中経過させ、少なくとも30分間トランスファー緩
衝液中で平衡させた。
Rad Trans Blot 装置中で70Vで電気泳動により、ニ
トロセルロース膜に移した。このフィルターは、乾燥し
た後、封止したプラスチックバック中で−20℃で貯蔵
することができる。
Aの合成ペプチドフラグメントに対抗する多クローン性
抗体である。予備の調査はリシンAについての良好な親
和性を示すが、多数のE.コリータンパク質とのかなり
の交差反応性を示す。この交差反応性により引き起こさ
れる高いバックグラウンドを克服するため、抗体はE.
コリーリゼイトで予備インキュベートした。
L−ブイヨン一晩培養液10mlを、4000rpmで
10分間遠心分離し、細胞をペレット化させた。このペ
レットを細菌緩衝液5mlに再懸濁させ、氷上で30秒
間隔で冷却しながら、4〜6μで6×10秒バーストで
音波処理した。
A.1抗血清0.5mlと混合し、室温で90分間イン
キュベートした。細胞の残骸は5分間13000rpm
でスピンダウンし上澄みを−20℃で貯蔵した。
ルロースフィルターは、5%BSA−PBS/ツイーン
中で室温での一晩のインキュベーションによりブロック
した。(PBS ツイーン=PBS1リットルあたりツ
イーン20 5ml)。PBS/ツイーン中で3×3分
間洗浄した。0.5%BSA−PBS/ツイーン中のブ
ロックされたリシンA.1抗体の1/4000希釈液を
用いて、室温で2時間(または一晩中)インキュベート
した。PBS/ツイーン中で3×3分間洗浄した。0.
5%BSA−PBS/ツイーン中のヤギ−抗−ウサギ抗
血清の1/1000希釈液を用いて1時間インキュベー
トした。PBS/ツイーン中で3×3分間洗浄した。
0.5%BSA/PBS/ツイーン中のウサギペルオキ
シダーゼ−抗−ペルオキシダーゼ抗血清の1/5000
希釈液と共に、室温で1時間インキュベートした。PB
S/ツイーン中で3×3分間洗浄した。PBSで120
mlにし、過酸化水素12μlを含有するメタノール2
0ml中の4−クロロナフトール(60mg)の溶液中
で浸漬することにより展開した。バンドが可視化すると
すぐにこの膜を溶液から除去し、乾燥し、撮影した。
示した。
物学的アッセイ この目的は、E.コリー細胞からリシンA鎖精製の間に
生成した試料を、無細胞試験管内タンパク質合成アッセ
イにおける生物学的活性についての試験を行なうことが
できる条件を確定することであった。
よび Schweet(J Biol Chem (1962), 237, 760-767)の
方法により製造した。このアッセイは、新規に合成され
たタンパク質中へ14C標識ロイシンの組み込みの欠乏に
より、無細胞系におけるタンパク質合成の阻害を証明し
た。
シンを除く全てのL−アミノ酸を1mMで含有する溶液
(NaOHでpH7.4に調節し、−70℃で貯蔵)。
E) 600μl(60μCi) 反応混合物:テストサンプル 25μl アッセイ混合物 12.5μl ウサギ網状赤血球リゼイト 25μl ブランク溶液はPBS中のBSA2mg/ml 全てのアッセイは2重で行なった。
管に置いた。ブランクのために最初の4つにPBS中の
BSA 25μlを添加した。テストサンプル25μl
を残りの試験管に添加した。0.1M KOH 1ml
を最初の2つの試験管に添加した(バックグラウンドブ
ランク)。これらの試験管を水浴中で28℃に平衡させ
た。ウサギ網状赤血球リゼイト(液体窒素温度から溶か
した)25μlを、20秒間隔でそれぞれの試験管に添
加した。最初の試験管を12分間インキュベートした際
に、0.1M KOH 1mlを、再び20秒間隔でそれ
ぞれの試験管に添加し、全ての試験管を12分間インキ
ュベートさせた。20%の過酸化水素を2滴、それぞれ
の試験管に添加し、引き続き20%TCA1mlを添加
した。試験管内容物を混合し、少なくとも1時間、また
は一晩中4℃で放置した。沈殿物を、2.5cmのGF
Cディスクで濾過し、5%TCA3×4mlで洗浄し、
シンチレーションバイアルに移し、シンチラント(Read
y-Solv. MP, Beckman)10mlを添加した。1時間後
にこのバイアルを振盪し、計測した。
いるための技術の確立 L−ブイヨン一晩培養液10mlを37℃で生長させ
た。アリコート400μlを13000rpmで30秒
間ペレット化させ、上澄み液の大半をデカントした。
中での急速冷凍、引き続き37℃で解凍を2回行なっ
た。トリスHCl pH8.0 50mM中の25%の
スクロース12μlを添加し、引き続きリゾチームの1
0mg/ml溶液4μlを添加した。
0.25M EDTA 8μlを添加し、15分間インキ
ュベートを続けた。サンプルを水で400μlに希釈す
ることにより、浸透圧により溶菌を起こさせた。この方
法は1mlあたり80〜100のバイアル細胞数を製造
した。
セイ反応混合物に添加する場合、新たに合成されたタン
パク質への14C−ロイシンの組み込みのレベルは、リゼ
ートを除いてブランクの-10%であった。これは、リ
シンA8ng/mlにより製造されたものと同様の阻害
のレベルであった。E.コリーリゼイトの希釈物を、次
に製造し、このアッセイを繰り返した。この結果は、ブ
ランクのものと等しくなるまで、最小の16−倍の希釈
物がリゼイトの効果の減少のために必要であったことを
明らかに示した。
トはリシンA毒性に影響を及ぼさないことを可能なかぎ
り確実にするため、2対照アッセイを行なった。最初
は、植物由来のリシンAを、16倍希釈E.コリー細胞
ペレットに添加し、細胞溶菌後のアッセイ混合物中の8
ng/mlの最終濃度にした。双方のこの対照は、リシ
ンAの阻害活性に関してリゼイトまたは溶菌手順からの
有害な影響を示さなかった。
1102からの組換えリシンAおよび次に記載するク
ローンの合成を確認するために用いた。
析のために用いた。この選択した手引書は Zagursky et
al(Gene Analysis Techniques Vol 2, No.5)から修
正され、プライマーのアニーリングの前の二本鎖プラス
ミドDNAのアルカリ性変性および多様な製造元からキ
ッドの形(たとえばシーケナーゼ(United States Bios
cience)で提供されるような標準の手順による配列決定
を包含する。β−ラクタマーゼの3′末端で取り付ける
ためのオリゴヌクレオチドおよび多数のA鎖中間プライ
マーを使用する際に、プロモータおよびリシンA遺伝子
の双方の鎖の配列決定が可能であった。
nIフラグメントがプロモータとリシンAをコード化す
る配列との間に存在するという意想外の結果を示した。
すなわち:
19RAから得られ、制限酵素部位に加えてpUC8R
Aからクローンしたリシンリーダー配列を含む。リシン
A鎖の5′領域は突然変異誘発の間に誘導される塩基変
化を含む。
(ATG)がリシンAをコード化する領域の枠外にある
ことを表わす。さらに、枠内の終止コドン(TAG)は
リシンA開始コドンおよび第2のATGからの翻訳の再
開始することができる推定 Shine-Dalgarno 配列(AG
GA)の前にある。
のリシンA鎖の蓄積レベルに関して、この付加的DNA
フラグメントが、これを削除してあるものからのクロー
ンと比較して明らかな利点を与えたことを表わした。
伝子の完全DNA配列は図9に示した。
成 7.a) サブクローニングさせるためのリシンAクロ
ーンpICI 1102の突然変異 リシンA発現について完全な方向で、偶発的に生成した
pICI 1120からの2つのKpnIフラグメント
をサブクローニングすることは困難である。従って、単
一塩基置換(AからT)により、最初のKpnI認識部
位を変更することを計画した。これは、この部位でのK
pnI開裂を妨げ、単一のKpnIフラグメントのtr
p/RBSベクターへの部位へサブクローニングさせ
る。KpnI認識部位(GGTACC)のアデニンを、
チミン(たとえばGGTTCC)に置換する際に、リシ
ンAの最初の残基は変更しない(GTA/GTT=Va
l)。たとえば:
ヌクレオチドが、アンダーラインで示した塩基は突然変
異的変化を表わす次の配列: 5′ ATAACAACATGGTTCCCAAACAATAC 3′ を有する。
たリシンAフラグメントをtrp発現ベクターの部位へ
クローンすることを計画した。pICI 0020への
クローニングは、単一塩基置換が合った場合に、発現に
関する効果を測定するために、pICI 1102との
比較を提供する。
pICI 1102中に存在する2つのKpnIフラグ
メントを含むM13クローンである。突然変異誘発の後
に、所望の突然変異を有する単離体は、ランダムサンプ
リングおよび突然変異オリゴヌクレオチドが特異的に結
合する部位にわたるDNA配列測定により確認された。
れた。これは、さらに、非特異的突然変異の不在の確認
のために、完全なリシンAをコード化する配列のDNA
配列測定により分析された。
コンピテントE.コリーTG1細胞に形質転換するため
に用いられた。次に、個々のプラークをピッキングし、
複製型(RF、二本鎖)DNAを、塩化セシウム/エチ
ジウムブロミド浮遊密度勾配でバンド形成させることに
より精製した。精製したRFDNAはKpnIにより完
全に消化された。クローニングは、適当なKpnI切断
により消化したRF DNAと、ホスファターゼ処理し
た発現ベクターとのショットガンリゲーションにより、
またはアガロースゲルからのその精製後のリシンAの特
異的リゲーションにより行なわれた。リゲートしたDN
AはE.コリーTG1またはHB101へ形質転換され
た。
ンAを含有するクローン(pICI1121)から単離
したKpnIフラグメントのランダムヘキサヌクレオチ
ドプライミングにより製造した32P標識リシンAプロー
ブを用いるハイブリダイゼーションスクリーニングによ
り同定された。ポジティブなハイブリダイゼーションを
示すコロニーは、さらにKpnI単一消化およびEco
RI/BglII二重消化を用いるプラスミドDNAの
制限分析によりスクリーニングした。KpnIは挿入さ
れたフラグメントのサイズを同定し、EcoRI/Bg
lIIはフラグメントの配向を測定する。
フラグメントを有しているとして確認されたクローン
は、クローン選択成長およびSDS−PAGEによる分
析、引き続きクーマシー染色および複製ゲルのウエスタ
ンブロッティングにかけられる。これらのクローン中の
リシンA蓄積のレベルは、pICI 1102から検出
したものと同様であった。
名した。
使用 これら実験において、trpプロモータおよびリシンA
フラグメントは、酵素EcoRIおよびSalIを用い
た消化により切り取られる。後者の酵素は、リシンAを
コードする配列の3′末端およびtrpA転写ターミネ
ータとの間を開裂する。生じたフラグメントは、アガロ
ースゲル(2%NuSieve GTGアガロース、FM
C Bioproducts)から切り取られ、フェノールおよびク
ロロホルム抽出により、引き続きエタノール沈殿により
精製した。この精製したフラグメントは、EcoRIお
よびSalIにより切断されたpICI 1079とリ
ゲートされた。後者のプラスミドはユニークSalIと
SphI部位との間にT4ターミネータを有する。
コリーHB101(BRL)を形質転換するために用い
られ、ハイブリダイゼーションスクリーニングは、先の
実験においてと同様に、リシンA DNAの存在を検出
するために用いられた。ポジティブにハイブリッドした
クローンはプラスミドDNA製造のために、引き続いて
適当なサイズのフラグメントの存在を確認すると共に、
EcoRIおよびSalIを用いた制限分析のために選
択される。
pICI 1185と命名した。
ンドの使用 プラスミドDNAは、pICI 1185から製造さ
れ、trpプロモータ/RBS1/リシンA(MRA2
2)フラグメント/T4ターミネータを有する発現カセ
ットを切り取ると共に、EcoRIおよびSphIを用
いて消化した。このフラグメントは、6.dに概略した
方法により単離され、EcoRIおよびSphIにより
切断したpICI 0042とリゲートさせた。
01を形質転換するために用いられた。HB101形質
転換は、L寒天+テトラサイクリンにプレートし、37
℃で一晩中インキュベートし、コロニーを32P標識リシ
ンA DNAプローブを用いるハイブリダイゼーション
によりスクリーニングした。
れたクローンは、EcoRI/SphIおよびEcoR
I/BglII消化を用いるプラスミドDNAの制限分
析により確認した。3つの単離物が同定され、この一つ
(pICI 1187)は前記した形質転換において用
いられた。図10にpICI 1187の組み立てを概
略した。
列のリストである。この配列は、通常5′から3′の方
向で記載されている。
Sゲルを示す図、
02のゲルプロフィルを示す図、
ウエスタンブロットを示す図、
を示す図、
培養の影響を示す図;
加培養の影響を示す図、
リシンAの分配率に及ぼす流加培養の影響を示す図
率に及ぼすpHの影響を示す図
示す図
響を示す図
却の影響を示す図、
Claims (9)
- 【請求項1】 ポリペプチドの製法において、この方法
は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を
生長培地中で培養し、かつ前記宿主を当初期間の間、こ
の宿主の生長に好適な第1のpH値で培養してポリペプ
チドを製造し、このpH値を可溶性ポリペプチドの蓄積
に好適な第2の値に調節し、かつ前記宿主をさらなる期
間の間前記の第2のpH値で培養し、かつ場合により培
養の終末部の間に生長培地の温度を低下させ、こうして
可溶性ポリペプチドを得ることを特徴とする、ポリペプ
チドの製法。 - 【請求項2】 pHを、第1の値から第2の値にまで低
めることにより調節する、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 pHを、約6.7の値から5.5より大
きくかつ6.7より小さい値にまで調節する、請求項1
又は2記載の方法。 - 【請求項4】 この方法は、流加培養型の発酵であり、
ここで、pHを、流加培養条件に達する前に調節する、
請求項1,2又は3記載の方法。 - 【請求項5】 宿主はE.コリーより成り、ポリペプチ
ドはリシンA又はその類縁体よりなる、請求項1から4
までのいずれか1項記載の方法。 - 【請求項6】 宿主は、E.コリーDS410より成
る、請求項5記載の方法。 - 【請求項7】 リシンA又はその類縁体を発現させるこ
とのできる宿主を生長培地中で培養し、かつ酵母エキス
を含有する補充物を、この培養の間に生長培地に添加す
ることより成る、請求項1記載の方法。 - 【請求項8】 温度を、最初の約37℃の値から約25
℃以下の値まで低下させる、請求項1から7までのいず
れか1項記載の方法。 - 【請求項9】 リシンAの製法において、これは、流加
培養型の発酵より成り、ここでリシンAを発現させるこ
とのできるE.コリー宿主を、生長培地中で約6.7の
pHで培養し、このpHを5.5より大きくかつ6.7
より小さい値に低下させ、かつさらなる期間培養し、場
合により、この培養の終末部の間に、生長培地の温度を
低下させ、かつこの末端部の間にリシンAを収穫するこ
とより成ることを特徴とするリシンAの製法。
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