JP3396218B2 - 核酸検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、感染症、遺伝病
の診断等に用いることができる核酸（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）の検出方法、およびその方法を行なうための核酸検
出用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、核酸をプロ−ブとして用いる核酸
検出方法が多くの分野で利用されている（Analytical B
iochemistory、 169、1-25、1988；Clinical Microbiol
ogy Reviews 、1988、82-101）。例えば、鎌型赤血球貧
血症のように、遺伝子と病気との関係が明らかな遺伝病
の診断において、上記核酸検出方法が利用されている
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78、5081-5085 、1981）。
また、臨床診断、食品関連の検査、環境関連の検査など
の分野においては、感染、汚染等の原因となる細菌また
はウイルスを検出するために、上記方法が利用されてい
る。とりわけ、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）のよう
な感染症に関連するウイルスの検出は重要であり、ろ過
ハイブリダイゼ−ション法（J.Inf.Diseases、155 、32
0-322 、1987）、サザ−ンブロット法（Science 、226
、1165-1171 、1984）、in situ ハイブリダイゼ−シ
ョン法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83、772-776 、198
6）、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction ；Natur
e、334 、440-444 、1988；U.S.Patent 4,683,202、Cet
us Corporation ）等において、核酸をプロ−ブとして
用いたウイルスの検出が行なわれている。なお、検出し
ようとするものが細菌である場合には、細菌のＤＮＡを
検出する方法の他に、細菌中に多量に存在するｍＲＮＡ
を検出する方法も用いられている（J.Clin.Microbiol、
23、481-484 、1986）。

【０００３】ところで、このような核酸検出を行なうた
めの試料は、通常微量しか得られないことが多い。この
ため、得られた試料をそのまま用いたのでは誤差が大き
く、事実上検出が不可能となることも多い。

【０００４】この問題点を解決するために様々な試みが
なされているが、その種類は大きく２つに分けることが
できる。第１の手法が、得られた試料はそのまま使用
し、高感度ラジオアイソト−プ等を用いる高感度分析技
術を駆使して検出感度を高めようとする方法である。そ
して、第２の手法が、タ−ゲットとなる核酸を増幅して
既存の技術で高感度の検出を行なおうとする方法であ
る。

【０００５】第１の手法は、ろ過ハイブリダイゼ−ショ
ン法、サザ−ンブロット法、サンドイッチハイブリダイ
ゼ−ション法（Gene、36、201-210 、1985；Clin.Che
m.、31、1438-1443 ）、液相ハイブリダイゼ−ション法
（Solution Hybridization；J.Clin.Microbiol. 、23、
481-484 、1986）、ホモジニアスアッセイ法（エネルギ
−転移法）、鎖置換法（Strand Displacement Assay ；
Clin.Chem.、32、1637-1641 ）等に応用されている。

【０００６】第２の手法の代表的なものが、ＰＣＲ法、
ＱＢシステム法等である。これらの方法は、まず、タ−
ゲットのＤＮＡまたはＲＮＡの配列の増幅を行なう。こ
の増幅に関しては、Clinical Microbiology Reviews 、
1989、217-226 に総説が掲載されている。また、ＰＣＲ
法におけるＤＮＡまたはＲＮＡの増幅は、前述のU.S.Pa
tent 4,683,202に記載されている。次に、増幅したタ−
ゲットＤＮＡまたはＲＮＡを、標識したプロ−ブを用い
て検出する。

【０００７】第２の手法を用いた核酸検出方法は多くの
分野で応用されており、例えば、ＨＩＶの研究（特開昭
63-294800 、Cetus Co. ）、遺伝病の研究（J.New Eng
l.J.Med. 、317 、985-990 （1987））、感染ウイルス
の検出に関する研究および癌遺伝子の研究（Nature、32
7 、293-297 （1987））において利用されている。

【０００８】特に、ＰＣＲ法は、タ−ゲットＤＮＡまた
はＲＮＡを大量に、かつ容易に増幅させることができる
ため、近年注目されている技法である。ＰＣＲ法の原理
は以下の通りである。まず、試料からＤＮＡまたはＲＮ
Ａを抽出し、二本鎖であるこのＤＮＡまたはＲＮＡを熱
処理して一本鎖に解離させる（工程１）。次に、２種の
プライマ−を添加し、通常50℃で一本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡとのアニ−リングを行なう（工程２）。ここで用い
られるプライマ−は、タ−ゲットＤＮＡまたはＲＮＡの
上流側の数十塩基と相補的な塩基配列を有するものであ
る。次いで、70℃まで昇温し、タ−ゲットシ−クエンス
に従って、プライマ−から下流側のＤＮＡまたはＲＮＡ
の合成を行なう（工程３）。このＤＮＡまたはＲＮＡの
際に用いられるポリメラ−ゼは、耐熱製のTaq ポリメラ
−ゼである。この工程により、元のＤＮＡまたはＲＮＡ
と同一の二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが２本得られる。そ
の後、さらに90℃に昇温し、得られた二本鎖ＤＮＡまた
はＲＮＡを一本鎖に解離する（工程４）。上記工程１〜
４が１サイクルと呼ばれている。このサイクルをｎ回繰
り返すことにより、タ−ゲットシ−クエンスを２n 倍に
増幅することができる。例えば、サイクルを２回繰り返
すことにより配列は４倍に増幅され、25回繰り返した場
合には、Cetus 社の資料によると、106 倍に増幅され
る。

【０００９】このようにして増幅されたタ−ゲットシ−
クエンスは、例えば、ドットブロット法（Lancet ii 、
418-421 、1988）、またはオリゴマ−開裂検出法（Olig
omerCleavage Detection ；J.Virol. 61:1690-1694 ）
を用いて検出する。通常、ドットブロット法が多く用い
られるので、以下の操作はドットブロット法を用いて説
明する。まず、ＰＣＲによって増幅した、タ−ゲットシ
−クエンスを含む核酸溶液を熱処理し、二本鎖ＤＮＡま
たはＲＮＡを一本鎖に解離させる。次に、この一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡを含む溶液をナイロン等のメンブラン
にドット状に吸着させる。その後、メンブランに固定化
したＤＮＡまたはＲＮＡと、増幅した配列に対して特異
的に反応するプロ−ブとをハイブリダイズさせる。この
際用いられるプロ−ブは、放射性標識もしくは非放射性
標識で予め標識されている。また、この反応は、通常、
夜通し行なわれる。

【００１０】プロ−ブがＰ32等の放射性物質で標識され
ている場合には、次に、放射線感光フィルムをハイブリ
ダイズを行なったメンブランに密着させる。露光時間
は、導入した放射性標識の量にもよるが、通常１ないし
５日である。このフィルムを現像すると、ポジティブサ
ンプルに密着した部分は黒いドットとなって現われ、色
の変化がないネガティブサンプルと区別することができ
る。

【００１１】また、プロ−ブが非放射性物質で標識され
ている場合には、例えば、アビジン- ビオチン反応を利
用してタ−ゲットシ−クエンスを検出することができ
る。この方法は、まず、予めプロ−ブをビオチンで標識
しておき、ＤＮＡまたはＲＮＡをメンブランに固定した
後、アルカリホスファタ−ゼ等の酵素で標識したアビジ
ンを加えて反応させる。次に、アビジンに標識した酵素
に対する基質を加える。これにより、ポジティブサンプ
ルは黒いドット状にメンブランが染まり、ネガティブサ
ンプルは色が変わらない。この反応に要する時間は、約
3ないし15時間である。

【００１２】このように、ＰＣＲ法を含む核酸の検出方
法は、タ−ゲットシ−クエンスを大幅に増幅し、従来の
検出法でより高感度の検出を行なうことを可能にする。
また、ＰＣＲ法によると、数時間でタ−ゲットシ−クエ
ンスを106 倍程度に増幅することができる。したがっ
て、105 個の細胞のうちの１個がエイズウイルスに感染
している状態、いわゆるサイレントエイズのステ−ジの
患者からのウイルスの検出にも十分対応することが可能
である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記方
法はいずれも、ＰＣＲ法によるタ−ゲットシ−クエンス
の増幅までは短時間かつ容易に反応を進めることができ
るが、その後の増幅したタ−ゲットシ−クエンスの検出
に長時間を要する。また、操作も繁雑であり、熟練した
技術者が必要であった。

【００１４】したがって、この発明の目的は、検出に要
する全体の時間が短く、かつ操作が簡単な核酸の検出方
法を提供することにある。

【００１５】また、この発明の別の目的は、上記核酸検
出方法を行なうための核酸検出用キットを提供すること
にある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】この発明による核酸の検
出方法は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも
１種のヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２
つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオ
チド配列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を
用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配
列に結合してハイブリッドを形成するような条件下で処
理する工程と、（ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ
−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを取り込むこ
とにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を伸長する工
程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオ
チドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオチドおよび
分離可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、
（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程（ｃ）において生じ
た一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件下で、工程（ａ）で
用いたプライマ−で処理し、次いで工程（ｂ）と同じ条
件下でプライマ−鎖を伸長する工程と、（ｅ）リガンド
を固相化した固相支持体にプライマ−の伸長生成物を結
合させることにより、増幅した伸長生成物を目的とする
ヌクレオチド配列以外の配列から分離する工程であっ
て、前記リガンドは、伸長生成物に組み込まれた、分離
可能に修飾されたヌクレオチドと結合することが可能で
ある工程と、（ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出
可能に修飾されているヌクレオチドの量を測定し、生物
学的試料中における目的とするヌクレオチド配列の検出
を行なう工程とを具備する方法である。

【００１７】また、この発明による他の核酸検出方法
は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２つの独
立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオチド配
列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を用い
て、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配列に
結合してハイブリッドを形成するような条件下で処理す
る工程であって、前記プライマ−の５´末端が分離可能
に修飾されている工程と、（ｂ）前記ヌクレオチド配列
をテンプレ−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを
取り込むことにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を
伸長する工程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれ
るヌクレオチドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオ
チドである工程と、（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ
−トから解離して一本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程
（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件
下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理し、次いで
工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸長する工程
と、（ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ
−の伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長
生成物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分
離する工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組
み込まれた、分離可能に修飾されたプライマ−と結合す
ることが可能である工程と、（ｆ）伸張生成物に組み込
まれている検出可能に修飾されているヌクレオチドの量
を測定し、生物学的試料中における目的とするヌクレオ
チド配列の検出を行なう工程とを具備する方法である。

【００１８】この発明によるさらに別の核酸検出方法
は、生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列の検出方法であって、（ａ）２つの独
立した相補鎖からなる少なくとも１種のヌクレオチド配
列を有する生物学的試料を、２種のプライマ−を用い
て、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレオチド配列に
結合してハイブリッドを形成するような条件下で処理す
る工程であって、（ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプ
レ−ト鎖として用い、溶液からヌクレオチドを取り込む
ことにより前記ハイブリッドのプライマ−鎖を伸長する
工程であって、伸長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレ
オチドの複数が検出可能に修飾されたヌクレオチドであ
る工程と、（ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから
解離して一本鎖を形成する工程と、（ｄ）工程（ｃ）に
おいて生じた一本鎖を、工程（ａ）と同じ条件下で、工
程（ａ）で用いたプライマ−で処理し、次いで工程
（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸長する工程と、
（ｅ）分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づい
て、増幅した伸長生成物を目的とするヌクレオチド配列
以外の配列から分離する工程と、（ｆ）伸張生成物に組
み込まれている検出可能に修飾されているヌクレオチド
の量を測定し、生物学的試料中のヌクレオチド配列の検
出を行なう工程とを具備する方法である。

【００１９】また、この発明による核酸検出用キット
は、検出しようとする核酸の塩基配列と相補的な塩基配
列を有するプライマ−と、ヌクレオチドを含有し、この
ヌクレオチドの少なくとも１種が検出可能な標識物質で
標識され、他の少なくとも１種に固相化用の標識がなさ
れているヌクレオチド溶液と、Ｔａｑポリメラ−ゼと、
表面に標識ヌクレオチドと結合可能なリガンドが固相化
されたリガンド固相化チュ−ブとを具備することを特徴
とする。

【００２０】この発明による他の核酸検出用キットは、
検出しようとする核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を
有するプライマ−と、ヌクレオチドを含有し、このヌク
レオチドの少なくとも１種が第１の蛍光物質で標識され
ているヌクレオチド溶液と、Ｔａｑポリメラ−ゼと、第
１の蛍光物質とは異なる第２の蛍光物質で標識されたプ
ロ−ブとを具備することを特徴とする。

【００２１】

【発明の実施の形態】この発明による核酸検出方法にお
いては、少なくとも４種類のヌクレオシド三リン酸（ヌ
クレオチド）、および２種のプライマ−を用いるポリメ
ラ−ゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）が行なわれ
る。ここで用いられるヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴ
Ｐ）は、ＰＣＲによるＤＮＡまたはＲＮＡ合成の際の原
料となるものであり、デオキシアデノシン 5'-三リン酸
（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン5'-三リン酸（ｄＣＴ
Ｐ）およびデオキシグアノシン 5'-三リン酸（ｄＧＴ
Ｐ）、デオキシチミジン 5'-三リン酸（ｄＴＴＰ）、デ
オキシウリジン 5'-三リン酸（ｄＵＴＰ）が含まれる。
これらの５種類のｄＮＴＰのうち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、およびｄＧＴＰの３種類は必須であり、残りのｄＴ
ＴＰおよびｄＵＴＰのうちのいずれかが１種が必要であ
る。また、ここで用いられるプライマ−は、試料中のタ
−ゲットとなるヌクレオチド配列に対して比較的短い
（例えば、ヌクレオチド10-100個）核酸配列を有してお
り、２種のプライマ−がタ−ゲットシ−クエンスの異な
る鎖にハイブリダイズすることができるように、タ−ゲ
ットとなるヌクレオチド配列の末端配列の相補的核酸配
列に対応している。

【００２２】上記ＰＣＲは下記の手順に従って行なわれ
る。まず、試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出
し、熱処理して二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを一本鎖にす
る（工程１）。次に、２種類のプライマ−、例えばプラ
イマ−Ａおよびプライマ−Ｂとタ−ゲットＤＮＡまたは
ＲＮＡとのアニ−リングを行なう（工程２）。このアニ
−リングは、通常30〜65℃で行なわれる。次いで、温度
を70〜75℃に上げ、Taq ポリメラ−ゼを用いて、プライ
マ−から下流側のＤＮＡの合成をタ−ゲットシ−クエン
スに従って行なう（工程３）。その後、温度をさらに90
〜98℃に上げて、合成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖に解
離させる（工程４）。この後、上記工程２ないし４を繰
り返すことにより、タ−ゲットシ−クエンスの増幅を行
なう。このようにＰＣＲによって検出しようとする核酸
を増幅した後、核酸の検出を行なう。

【００２３】この発明の第１の核酸検出方法において
は、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちのいずれか１種
が予め検出用標識剤で標識されており、かつ他の１種が
予め固相化用標識剤で標識されている。残りのｄＮＴＰ
は無標識である。

【００２４】この第１の核酸検出方法を図面を参照して
説明する。図１は、第１の核酸検出方法におけるＰＣＲ
の手順を説明する工程図である。この手順は、上記手順
と同一であり、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ11の一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ12への解離（工程１）、プライマ−13
のアニ−リング（工程２）、Taq ポリメラ−ゼによるＤ
ＮＡの伸長（工程３）および合成した二本鎖ＤＮＡの一
本鎖への解離（工程４）が含まれる。工程４により得ら
れた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、再び工程２に戻り同
様の手順を繰り返す。図２は、ＰＣＲにより得られた一
本鎖ＤＮＡを模式的に示す図である。第１の方法におい
ては、ＰＣＲの原料となるｄＮＴＰのいずれか１種に検
出用の標識剤14が、また他の１種に固相化用の標識剤15
がそれぞれ標識されているので、合成されたＤＮＡ16
に、これらの標識剤14および15が取り込まれる。

【００２５】次に、ＰＣＲにより増幅された核酸のＢ／
Ｆ（ bound／free）分離を行なう。図３は、得られたＤ
ＮＡの固相化を模式的に示す図である。固相支持体17に
は、ｄＮＴＰに標識した固相化用標識剤15と特異的に反
応するリガンド18が予め固定されており、このリガンド
18と標識剤15との特異的な反応によりＤＮＡ16を固相支
持体17に固定する。物質18および標識剤15は、リガンド
- リセプタ−反応または抗原- 抗体反応に基づいて結合
するものが好ましく、例えば、ｄＮＴＰをビオチンで標
識し、固相支持体にアビジンを固定しておけばよい。Ｐ
ＣＲにより増幅されたＤＮＡを固相化した後、固相支持
体17を洗浄して未反応の核酸、ｄＮＴＰ等を除去する。

【００２６】最後に、図４に示すように、固相化された
ＤＮＡの検出を行なう。この検出は、ｄＮＴＰの１種に
標識した検出用標識剤14を検出することにより行なう。
この検出用標識剤14は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ
に取り込まれている。ここで行なわれる検出は、従来行
なわれている方法をそのまま用いることができる。例え
ば、ｄＮＴＰを酵素で標識しておき、伸長生成物を固相
支持体17に結合した後基質を添加して酵素活性を検出す
ればよい。また、別の方法としては、ｄＮＴＰをハプテ
ンで標識してｍｄＮＴＰとし、固相化されたＤＮＡ中の
ｍｄＮＴＰと標識抗ハプテン抗体とを反応させて抗体の
標識を検出すればよい。標識の検出方法は、抗ハプテン
抗体の標識の種類によって異なるが、酵素を標識剤とし
て使用した場合には、化学発光物質や通常のＥＩＡ測定
の際に使用される呈色基質を用いることができる。ま
た、標識剤が蛍光物質である場合には、適当な波長の光
を照射して蛍光を励起させることによって行なう。

【００２７】この第１の核酸検出方法は、検出しようと
する核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライ
マ−と、ヌクレオシド三リン酸を含有し、該ヌクレオシ
ド三リン酸の少なくとも１種に検出用の標識がなされ、
かつ他の少なくとも１種に固相化用の標識がなされてい
るヌクレオシド三リン酸溶液と、Taq ポリメラ−ゼと、
標識ヌクレオチドと結合可能なリガンドが表面に固相化
されているリガンド固定化チュ−ブとを具備するキット
を用いることにより、より簡便に実施することが可能と
なる。

【００２８】この発明の第２の核酸検出方法において
は、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちのいずれか１種
が検出用の標識剤で予め標識されており、かつプライマ
−の 5' 末端が固相化用の標識剤で予め標識されてい
る。残りのｄＮＴＰは無標識である。

【００２９】図５は、第２の核酸検出方法におけるＰＣ
Ｒの手順を示す工程図である。この手順は第１の方法と
同様であり、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ21の一本鎖ＤＮ
ＡまたはＲＮＡ22への解離（工程１）、固相化用標識剤
25を標識したプライマ−23のアニ−リング（工程２）、
Taq ポリメラ−ゼによるＤＮＡの合成（工程３）および
合成した二本鎖ＤＮＡの一本鎖への解離（工程４）が含
まれる。工程４により得られた一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａは、再び工程２に戻り同様の手順を繰り返す。これに
より、図６に示すように、検出用の標識剤24および固相
化用の標識剤25が取り込まれたＤＮＡが合成される。

【００３０】次に、合成されたＤＮＡのＢ／Ｆ分離を行
なう。この工程も第１の方法と同様にして行なうことが
できる。すなわち、固相支持体27に、プライマ−に標識
した固相化用標識剤25と特異的に反応する物質28を予め
固定しておき、この物質28と標識剤25とを結合させるこ
とによりＤＮＡ26を固相支持体27に固相化する。ここ
で、用いられる標識剤25および物質28はリガンド- リセ
プタ−反応に基づいて結合するものが好ましく、例え
ば、プライマ−23の 5' 末端をビオチンで標識し、固相
支持体27にアビジンを固定化しておけばよい。固相支持
体27にＤＮＡ26が固定された状態を、図７に模式的に示
す。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを固相化した後、固
相支持体17を洗浄して未反応の核酸、ｄＮＴＰ等を除去
する。

【００３１】最後に、図８に示すように、固相支持体27
に固定されたＤＮＡの検出を行なう。この検出は、第１
の方法と同様に、ＰＣＲによりＤＮＡに取り込まれた検
出用標識剤24を検出することにより行ない、第１の方法
と同様の方法を用いることができる。

【００３２】この発明による第３の核酸検出方法におい
ては、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰのうちの少なくとも
いずれか１種が検出用の標識剤で予め標識されており、
ＰＣＲによって増幅された核酸を分子量、サイズ、また
は電荷量の差異に基づいて分離する。

【００３３】この第３の方法において行なわれるＰＣＲ
は、上記第１および第２の方法において行なわれるＰＣ
Ｒと同様の手順で行なうことができる。

【００３４】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの分離
は、分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づいて行
なわれるものであればどのようなものでもよく、例え
ば、キャピラリ−電気泳動、およびアガロ−ス電気泳動
を挙げることができる。

【００３５】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを分離し
た後、第１もしくは第２の方法と同様に、ｄＮＴＰの１
種に標識され、ＰＣＲによってＤＮＡに取り込まれた標
識剤を検出することによってＤＮＡの検出を行なう。こ
こで用いられる標識剤としては、ロ−ダミン、ＦＩＴＣ
のような蛍光物質が好ましい。

【００３６】この第３の方法においては、ＰＣＲの終了
後、増幅されたＤＮＡを分離する前に、さらに別の標識
剤で標識したプロ−ブを用いて、増幅されたＤＮＡとこ
のプロ−ブとのハイブリダイゼ−ションを行なうことが
できる。この場合、ＰＣＲに用いられるｄＮＴＰには蛍
光物質、例えばロ−ダミンが標識されており、プロ−ブ
には、ｄＮＴＰを標識する蛍光物質とは別の蛍光物質、
例えばＦＩＴＣが標識されていることが好ましい。これ
らの蛍光物質は、その蛍光波長が互いに異なるのであれ
ば、どのような組み合わせのものも使用することが可能
である。なかでも、１種類の励起光で異なる波長の蛍光
を発する蛍光物質の組み合わせが好ましい。そのような
組み合わせとしては、テキサス・レッド（ Texas RedT
M、MOLECULAR PROBES社製：励起光 488ｎｍ、蛍光 610
ｎｍ）およびＦＩＴＣ（励起光 488ｎｍ、蛍光 520ｎ
ｍ）の組み合わせを挙げることができる。

【００３７】プロ−ブとＤＮＡとのハイブリダイゼ−シ
ョンが終了した後、キャピラリ−電気泳動によりＤＮＡ
を分離して、異なる波長バンドで２種類の標識剤の検出
を同時に行なう。そして、２種類の異なる波長バンドで
同時に検出された場合にのみ陽性であると判定する。こ
のような判定では、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡをさらに
プライマ−にハイブリダイズさせているため、より高感
度の検出を行なうことが可能となる。

【００３８】この核酸検出方法は、検出しようとする核
酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマ−
と、ヌクレオシド三リン酸を含有し、かつ該ヌクレオシ
ド三リン酸の少なくとも１種が第１の蛍光物質で標識さ
れているヌクレオシド三リン酸溶液と、Taq ポリメラ−
ゼと、第１の蛍光物質とは異なる第２の蛍光物質で標識
されたプロ−ブとを具備するキットを用いることによ
り、より簡便に実施することが可能になる。

【００３９】

【実施例】以下、この発明の実施例を説明する。

【００４０】実施例１ ２種類のプライマ−と２種類の標識したヌクレオチドを
用いるＰＣＲによるＤＮＡの増幅 検出用に標識した１種のヌクレオチド、固相化用に標識
した他の１種のヌクレオチドおよび何も標識していない
２種のヌクレオチドを用いて、ＰＣＲによりＤＮＡの増
殖を行なった。

【００４１】実験手順 増殖を行なうＤＮＡの試料としては、ヒト細胞株MOLT 4
から抽出したＤＮＡ、およびプラスミドｐＢＨ 10 から
抽出したプラスミドＤＮＡの混合溶液を用いた。MOLT 4
は、ヒト末梢血急性リンパ芽球白血病細胞（human peri
pheral blood acute lymphoblastic leukemia cell）で
あり、その寄託番号は ATCC CRL 1582である。また、プ
ラスミドｐＢＨ10には、ＨＩＶのＤＮＡ配列の約98％が
組み込まれている。

【００４２】２種のプライマ−、ｄＮＴＰ混合物（ヌク
レオチド混合物）、MOLT 4のＤＮＡ、プラスミドｐＢＨ
10のＤＮＡ、Taq ポリメラ−ゼ、および反応緩衝液を下
記表に示す割合で混合し、 1.5ｍｌのチュ−ブに入れて
ＰＣＲを行なった。これらの成分のうち、プライマ−は
SYNTHETIC GENETIC INC. から入手したものである。こ
のプライマ−は、それぞれ28塩基からなる２種類のプラ
イマ−であり、ＨＩＶのＧＡＧ領域に特異性を有する。
このプライマ−を用いてＰＣＲを行なうことにより、11
4 塩基対のＧＡＧ領域が増幅される。これらのプライマ
−の配列を図９に、またこれらのプライマ−により増幅
される領域を図10にそれぞれ示した。また、プライマ−
およびｄＮＴＰ混合物以外の成分は、全て、GenEAmp Ｐ
ＣＲ試薬キット（Cetus PE Corporation）のものを使用
した。

【００４３】なお、この実施例においては、検出に使用
するための標識ヌクレオチドとしてジゴキシゲニン-11-
ｄＵＴＰ（BOEHRINGER MANNHEIM 社製）を、また固相化
に使用するための標識ヌクレオチドとしてビオチン-7-
ｄＡＴＰ（BRL 社製）を使用した。

【００４４】 実験条件 ＰＣＲ反応溶液（全量 100μｌ） No. 2 3 4 5 6 7 dNTP混合物** 200 200 200 200 200 200 （μＭ） プライマ−#1* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） プライマ−#2* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） MOLT4 ＤＮＡ 2 2 2 2 2 2 （μｇ） pBH10 ＤＮＡ 5×106 106 5×105 105 5×104 104 （コピ−数） Taq ポリメラ−ゼ 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 （ユニット） No. 9 10 11 12 13 14 dNTP混合物*** 200 200 200 200 200 200 （μＭ） プライマ−#1* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） プライマ−#2* 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 （μＭ） MOLT4 ＤＮＡ 2 2 2 2 2 2 （μｇ） pBH10 ＤＮＡ 5×106 106 5×105 105 5×104 104 （コピ−数） Taq ポリメラ−ゼ 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 （ユニット） プライマ−#1* 、プライマ−#2* ： SYNTHETIC GENETIC INC. 製 ｄＮＴＰ混合物**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ： 180μＭ、 ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴＰ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ｄＮＴＰ混合物*** ： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ： 200μＭ、 ｄＴＴＰ： 200μＭ ＰＣＲのサイクルは、PERKINE-ELMER CETUS 社の THERM
AL CYCLER を使用して、以下の設定で行なった。

【００４５】 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００４６】結 果 ＰＣＲ終了後、各試料 5μｌづつを、 3％アガロ−スゲ
ルを用いた電気泳動にかけた（Molecular Cloning 6-2
：Colc.Spring Harbor Laboratory Press 1989参
照）。電気泳動終了後、エチジウムブロマイドを用いて
ＤＮＡを染色し（Molecular Cloning 6-14参照）、得ら
れたパタ−ンをFCR-10カメラ（5-5330 FOTODYNE Incorp
orated）で撮影した。得られた写真を図11に示す。図11
に示されるように、14の試料は２列に配置され、上列左
から右へ #1 ないし #7 の試料が、また下列左から右へ
#8 ないし #14の試料がそれぞれ順に並べられている。

【００４７】この実施例の全工程の所用時間は 7.5時間
であった。

【００４８】図11において、#1および#8には、分子量マ
−カ−であるφX 174 Hae IIIフラグメントを使用し
た。このφX 174 Hae IIIフラグメントは、プラスミド
φX 174を制限酵素 HaeIIIで切断したものであり、BRL
社より入手した（Cat.No.5611SA ）。#2ないし#7および
#9ないし #14には、上述の試料を使用した。

【００４９】サイズマ−カ−により、増幅されたシ−ク
エンスのサイズは 114bpであることが確認された。

【００５０】図11から明らかなように、#2ないし#7およ
び#9ないし#14 の各試料が形成したバンドの間に大きな
相違はなく、またサイズが全て 114 bp である。したが
って、Taq ポリメラ−ゼがタ−ゲットシ−クエンスに従
ってＤＮＡの合成を行なう際に、標識した２種類のヌク
レオチド（ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰおよびビオチン
-7- ｄＡＴＰ）を、無標識のヌクレオチドと同様に取り
込んでいることが確認された。

【００５１】実施例２ 増幅したＤＮＡのイムノアッセイ法による検出 実施例１において増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ中に取り込
まれたビオチンを利用して予めアビジンを導入した固相
支持体に固相化した後、ＤＮＡの検出を行なった。ＤＮ
Ａの検出は、増幅されたＤＮＡに取り込まれたジゴキシ
ゲニンの量を測定することにより行なった。

【００５２】実験手順 Ａ．ストレプトアビジンの固相化 １）ストレプトアビジン（Boehringer Mannheim 社、Ca
t.No.973 190）を、固相化緩衝液（50ｍＭ炭酸緩衝液 p
H 9.5 ）に10μｇ／ｍｌとなるように溶解する。

【００５３】２）ＮＵＮＣプレ−ト（マイクロウェル
モデルＦ-16 ）の各ウェルに上記溶液を 100μｌ分注
し、 4℃で一晩保存する。

【００５４】３）プレ−トをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食
塩水）で洗浄し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の 1％
ＰＢＳ溶液 250ｍｌを分注し37℃で 1時間保存する。

【００５５】４）プレ−トをＰＢＳ（0.01％ Tween 20
）で洗浄する。

【００５６】Ｂ．ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのエ
タノ−ル処理 ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡをエタノ−ル処理して
未反応のヌクレオチドを除去する。

【００５７】１）ＰＣＲにより得られたＤＮＡ溶液 100
μｌに 3Ｍ酢酸ナトリウムを添加する。

【００５８】２）次に、エタノ−ル 250μｌを添加して
-70℃で15分間保存する。

【００５９】３） 15 分間遠心して沈殿したＤＮＡを70
％エタノ−ルで洗浄し、ＴＥ緩衝液（10ｍＭトリス、 1
ｍＭ ＥＤＴＡ、pH 8.0）に溶解する。

【００６０】Ｃ．イムノアッセイ Ａにおいて調製したストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣ
プレ−トを使用し、Ｂにおいてエタノ−ル処理したＤＮ
Ａを試料としてアッセイを行なう。

【００６１】１）Ｂにおいてエタノ−ル処理したＤＮＡ
を、ＴＥ緩衝液で10倍希釈する。

【００６２】２）Ａにおいて調製したストレプトアビジ
ン固相化ＮＵＮＣプレ−トに、上記希釈ＤＮＡ溶液 100
μｌを分注し、37℃で 1時間インキュベ−トする。

【００６３】３）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣプレ−トのウェルを洗浄し、 1％ＢＳＡを含む
ＴＥＳ´緩衝液で 1／5000希釈した抗ジゴキシゲニン(F
ab)-アルカリホスフェ−ト（Boehringer Mannheim 社）
の溶液 100μｌを分注して37℃で30分間インキュベ−ト
する。

【００６４】４）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＮａＣｌ、pH 7.6）でＮＵ
ＮＣプレ−トのウェルを洗浄した後、各ウェルに基質で
あるp-ＮＰＰ（p-ニトロフェニルホスフェ−ト：Phosph
ate Substrate System for ELISA、Kirkegard ＆ Perry
Laboratories Inc.） 100μｌを分注し、25℃で 1時間
インキュベ−トする。

【００６５】５）インキュベ−ト後、マイクロプレ−ト
リアクタ− モデル EL311（Microplate Reactor Model
EL311、Bio-Tek Instruments Inc.）を用いて、波長40
5 ｎｍにおける吸光度を測定する。

【００６６】 実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 2 3 4 dNTP混合物**（μＭ） 200 200 200 0 dNTP混合物*** （μＭ） 0 0 0 200 プライマ−#1* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 プライマ−#2* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 2 2 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 106 104 0 106 Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 2.5 2.5 2.5 プライマ−#1* 、プライマ−#2* ： SYNTHETIC GENETIC INC. 製 ｄＮＴＰ混合物**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ： 180μＭ、 ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴＰ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ｄＮＴＰ混合物*** ： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ： 200μＭ、 ｄＴＴＰ： 200μＭ ＰＣＲのサイクルは、THERMAL CYCLER（Perkine-Elmer
Cetus ）を使用して、以下の設定で行なった。

【００６７】 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００６８】結 果 波長 405ｎｍにおける吸光度の測定結果は以下の通りで
あった。

【００６９】 Ｎｏ． Ａ（405nm ） ＃１ 2.583 ＃２ 1.004 ＃３ 0.103 ＃４ 0.053 上記結果より明らかなように、#1および#2においては、
ｐＢＨ10 ＤＮＡのコピ−数に応じて吸光度が増加して
いる（#1のコピ−数は106 個、#2のコピ−数は104 個で
ある）。これに対して、ｐＢＨ10 ＤＡＮのコピ−を含
まない#3の試料、および無標識のヌクレオチドを使用し
た#4の試料の吸光度は、バックグランドのレベルであっ
た。

【００７０】なお、この実施例の全工程の所用時間は 2
8 時間であった。

【００７１】実施例３ 増幅したＤＮＡのアガロ−スゲルを用いた分画 実施例１において増幅したＤＮＡを、アガロ−スゲル
（バイオゲルＡ-15 #151-1050 ： BIO-RAD社）を用いて
分画した。これにより、増幅したシ−クエンスのバンド
のみを分画した。

【００７２】実験手順 Ａ．ＰＣＲによる増幅 実施例１と同様の方法で、目的のＤＮＡの増幅を行な
う。

【００７３】Ｂ．アガロ−スゲルカラムの作成 Current Protocols in Molecular Biology 3-4-8（ Joh
n Wiley ＆ Sons NewYork 1988 ）の方法に従って、図1
2に示すカラムを作製する。図に示すように、このカラ
ムは、パストゥ−ルピペット51にガラスウ−ル52および
カラム樹脂53を充填したものである。次に、Ａで増幅し
たＤＮＡ試料をカラムに通して分画し、ミクロ遠心管54
に取る。各々 100μｌのフラクション#1−#17 を採取す
る。

【００７４】Ｃ．アガロ−ス電気泳動を用いる、各フラ
クション中に含まれるＤＮＡの確認 各フラクションについて、Molecular Cloning 6-2 （Co
ld Spring Harbor Laboratory Press 1989）の方法に従
って電気泳動を行なう。次に、エチジウムブロマイドで
ＤＮＡを染色し（Molecular Cloning 6-14）、得られた
パタ−ンをFCR-10カメラ（5-5330、FOTODYNE Incorpora
ted ）を用いて撮影する。

【００７５】実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 dNTP混合物**（μＭ） 200 プライマ−#1* （μＭ） 1.0 プライマ−#2* （μＭ） 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 106 Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 プライマ−#1* 、プライマ−#2* ： SYNTHETIC GENETIC
INC. 製 ｄＮＴＰ混合物**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ：
180μＭ、 ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴＰ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ＰＣＲのサイクルは、THERMAL CYCLER（Perkine-Elmer
Cetus ）を使用して、以下の設定で行なった。

【００７６】 この第２サイクルを30回繰り返した。

【００７７】結 果 得られた電気泳動パタ−ンの写真を図13に示す。図に示
すように、20個の試料は２列に配置されており、上列左
から右へ #1 ないし #10の試料が、また下列左から右へ
#11ないし #20の試料がそれぞれ順に並べられている。

【００７８】図中、それぞれの試料 No.は次のフラクシ
ョンを示す。

【００７９】 試料 No. フラクション No. ＃１、＃11 分子サイズ標準（φX174RF DNA／ Hae III：BRL ） ＃２ ＰＣＲ反応後のサンプル（分画を行なっていない） ＃３ フラクション＃１ ＃４ フラクション＃２ ＃５ フラクション＃３ ＃６ フラクション＃４ ＃７ フラクション＃５ ＃８ フラクション＃６ ＃９ フラクション＃７ ＃10 フラクション＃８ ＃12 フラクション＃９ ＃13 フラクション＃10 ＃14 フラクション＃11 ＃15 フラクション＃12 ＃16 フラクション＃13 ＃17 フラクション＃14 ＃18 フラクション＃15 ＃19 フラクション＃16 ＃20 フラクション＃17 ＰＣＲの後の分画を行なわないままの試料 #2 では、増
幅されたシ−クエンスのバンドと、ウェル近くの MOLT
4 のバンドが見出される。増幅されたシ−クエンスのサ
イズは、サイズマ−カ−により 114塩基対であると確認
された。増幅されたシ−クエンスは、フラクション #9
に分画された。

【００８０】この実施例の全工程の所用時間は 8時間45
分であった。

【００８１】この実施例においては増幅したＤＮＡのフ
ラクションをアガロ−スゲル電気泳動によって行なって
いるが、アガロ−スゲル電気泳動の代わりにキャピラリ
−電気泳動を用いることにより、より短時間（30分以
内）で測定を行なうことができ、しかも増幅されたＤＮ
Ａの分子量の測定が可能となる。

【００８２】なお、この実施例の方法においては、ＰＣ
Ｒに用いられるヌクレオチドに対する固相化用の標識は
なくてもよい。また、本発明の態様によれば、一度の測
定のみにより、ターゲットヌクレオチドを確実に検出す
ることが可能である上に、更に、未結合成分の除去操作
が不要であるため、簡単に且つ短時間に目的の検出を実
施することが可能である。

【００８３】実施例４ 増幅したＤＮＡの、化学発光を利用するイムノアッセイ
法による検出 ＰＣＲの後、得られた試料をアガロ−スゲル（バイオゲ
ルＡ-15 #151-1050 ：BIO-RAD 社）を用いて分画し、増
幅されたＤＮＡを、実施例２のＡと同様の方法で作製し
たストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣイムノテストチュ
−ブ（Cat.No.444474 ）に固相化した。ＤＮＡの検出
は、増幅されたＤＮＡに取り込まれたジゴキシゲニンと
酵素標識した抗ジゴキシゲニン抗体とを反応させ、基質
として化学発光試薬を用いてジゴキシゲニンの量を測定
することにより行なった。なお、基質として、通常の吸
光度測定に使用される pＮＮＰを用いた比較試験も行な
った。

【００８４】実験手順 Ａ．ストレプトアビジンの固相化 １）ストレプトアビジン（Boehringer Mannheim 社、 C
at.No.973 190 ）を、固相化緩衝液（50ｍＭ炭酸緩衝液
pH 9.5 ）に 10 μｇ／ｍｌとなるように溶解する。

【００８５】２）ＮＵＮＣイムノテストチュ−ブ（Cat.
No.444474 ）に上記溶液を 100μｌ分注し、 4℃で一晩
保存する。

【００８６】３）テストチュ−ブをＰＢＳで洗浄し、Ｂ
ＳＡの 1％ＴＢＳ´溶液（10ｍＭトリス pH 8.0 、 150
ｍＭ ＮａＣｌ）250 ｍｌを分注し37℃で 1時間保存す
る。

【００８７】４）テストチュ−ブをＴＢＳ´0.01％ Twe
en 20 で洗浄する。

【００８８】Ｂ．ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡのア
ガロ−スゲル分画 アガロ−スゲルを用いて、ＰＣＲによって増幅されたＤ
ＮＡからの未反応のヌクレオチドの除去と、ＤＮＡの分
画処理を行なった。

【００８９】実施例３と同様に、Current Protocols in
Molecular Biology 3-4-8（ JhonWiley ＆ Sons New Y
ork 1988 ）に従ってカラムを作製した（図12）。次い
で、実施例１と同様の方法で増幅したＤＮＡ試料をカラ
ムに通して分画し、各々 100μｌのフラクション#1−#1
7 を採取する。#7のフラクションを試料として以下のイ
ムノアッセイを行なう。

【００９０】Ｃ．イムノアッセイ Ａにおいて調製したストレプトアビジン固相化ＮＵＮＣ
イムノテストチュ−ブを使用し、Ｂにおいて採取した #
7 のフラクションを試料としてアッセイを行なう。

【００９１】１）Ｂにおいて採取した #7 の分画を、Ｔ
ＢＳ´緩衝液で10倍希釈する。

【００９２】２）Ａにおいて作製したストレプトアビジ
ン固相化ＮＵＮＣイムノテストチュ−ブに、上記希釈Ｄ
ＮＡ溶液 100μｌを分注し、37℃で 1時間インキュベ−
トする。

【００９３】３）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣチュ−ブを 3回洗浄し、ＢＳＡの 1％ＴＥＳ´
緩衝溶液で 1／5000希釈した抗ジゴキシゲニン(Fab)-ア
ルカリホスフェ−ト（Boehringer Mannheim 社）の溶液
100μｌを分注して37℃で30分間インキュベ−トする。

【００９４】４）20％ Tween 20 を含有するＴＥＳ´緩
衝液（10ｍＭトリス、 150ｍＭ ＮａＣｌ、pH 7.6）で
ＮＵＮＣチュ−ブを洗浄した後、基質である化学発光試
薬Lumi-Phos TM 530（Lumigen inc.） 100μｌを分注
し、シンチレ−ションカウンタ− WALLAC 1410（PHARMA
CIA ）を用いて化学発光を測定する。

【００９５】５）４）における化学発光試薬の代わり
に、p-ＮＰＰ（Phosphate SubstrateSystem for ELIS
A、Kirkegard ＆ Perry Laboratories Inc.）100 ｍｌ
を分注して25℃で18時間インキュベ−トした後、マイク
ロプレ−トリアクタ−・モデル EL311（Bio-Tek Instru
ments Inc.）を使用して波長 405ｎｍにおける吸光度を
測定する。

【００９６】Ｄ．化学発光試薬を用いた測定 上述のように、この実施例においては、ＤＮＡ検出の際
に基質として Lumi-PhosTM 530（Lumigen Inc.）を使用
している。Lumigen Inc.によると、この試薬からの発光
はルミノメ−タ−を用いて測定するものとされている
（Clinical Chemistry、35、1863（1989）、Lumigen In
formation ）。しかしながら、この実施例において、本
発明者らは、この試薬からの発光をシンチレ−ションカ
ウンタ− WALLAC 1410（PHARMACIA ）を用いてカウント
することにより測定した。

【００９７】この実施例において用いた Lumi-PhosTM 5
30は、酵素の無い状態であっても、自然発光であると考
えられる1000 cpm程度の発光がある。したがって、この
試薬系はバックグランドが高く、このため測定の際の S
／N 比が著しく悪化する問題点が指摘されている。とこ
ろで、 Lumi-PhosTM 530の主成分である LumigenTM PPD
は、アルカリホスファタ−ゼによって不安定な状態に移
行し、発光する（Clinical Chemistry 35 、1863（198
9））。この光のエネルギ−は、さらに、発光系のエン
ハンサ−であるコ- ミセル化フルオレッサ−（co-micel
lized fluorescer）に移行し、 400倍の強度の光を発光
する。したがって、化学発光において、どのエネルギ−
の光がどの程度の強度を有しているかを分析することに
より、化学発光試薬そのものが発する光とエンヘンサ−
により増幅された光とを区別することが可能になるもの
と考えられる。

【００９８】一方、シンチレ−ションカウンタ−は、本
来、放射性同位体から発生するβ線を測定するものであ
り、β線をシンチレ−タ−で可視光に変換してその光子
数をフォトマルで測定する。放射性同位体から発生する
β線には、そのエネルギ−が核種によって異なるという
特性があるので、ある特定のエネルギ−を有する光子の
みを選択して取り出すことができれば、複数の核種を同
時に測定することが可能になる。本発明者らが用いたシ
ンチレ−ションカウンタ− WALLAC 1410は、ウインドウ
を設けることにより、特定のエネルギ−を有する光子の
みを取り出すことを可能にしている。

【００９９】本発明者らは、このシンチレ−ションカウ
ンタ− WALLAC 1410を用いて、 Lumi-PhosTM 530から発
生される光子のエネルギ−を測定した。その結果、酵素
の存在下で発生する光と酵素のない状態で発生する自然
発光とでは、光子のエネルギ−が有するエネルギ−準位
に明らかな相違があることが判明した。したがって、酵
素の存在下で発生する光子が有するエネルギ−で測定す
ることにより、バックグランドの値をほぼ０とし、 S／
N 比を飛躍的に向上させることが可能であることが確か
められた。このような知験の下に、本発明者らは、 WAL
LAC 1410のウインドウをチャンネル 250-1000 に設定
し、化学発光試薬そのものが発する低エネルギ−の光を
カットして、より高いエネルギ−の光を真のアルカリホ
スファタ−ゼによる発光として測定した。

【０１００】 実験条件 ＰＣＲの反応溶液（全容量 100μｌ） Ｎｏ． 1 2 3 4 dNTP混合物**（μＭ） 200 200 200 200 プライマ−#1* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 プライマ−#2* （μＭ） 1.0 1.0 1.0 1.0 MOLT4 ＤＮＡ（μｇ） 2 2 2 2 pBH10 ＤＮＡ（コピ−数） 106 104 102 0 Taq ポリメラ−ゼ（ユニット） 2.5 2.5 2.5 2.5 プライマ−#1* 、プライマ−#2* ： SYNTHETIC GENETIC INC. 製 ｄＮＴＰ混合物**： ｄＣＴＰ： 200μＭ、ｄＧＴＰ： 200μＭ、ｄＡＴＰ： 180μＭ、 ｄＴＴＰ： 180μＭ、ビオチン-7- ｄＡＴＰ：20μＭ ジゴキシゲニン-11-ｄＵＴＰ：20μＭ ＰＣＲのサイクルは、ハイブリッド・サ−マル・リアク
タ− モデルHB-TR1（tional Labnet Co. ）を使用し
て、以下の設定で行なった。

【０１０１】 この第２サイクルを 30 回繰り返した。

【０１０２】結 果 シンチレ−ションカウンタ−で測定した結果を図14に示
す。この図において、縦軸は 1分当りのカウント数（ C
PM）、横軸は時間を表わす。

【０１０３】図14より明らかなように、カウント数は化
学発光物質を添加した後約 1.5時間でほぼプラト−に達
する。この時点でのそれぞれの試料のカウント数は、以
下の通りである。

【０１０４】 試 料 ＣＰＭ MOLT 4＋106 コピ− 3.0×107 MOLT 4＋104 コピ− 4.6×106 MOLT 4＋102 コピ− 2.7×103 MOLT 4 0.9×10 同じ試料を、カロリメトリ法に用いられる呈色試薬を用
いて測定した場合には、次のような結果が得られた。

【０１０５】 試 料 吸光度（Ａ405 ） MOLT 4＋106 コピ− ＞ 2.5 MOLT 4＋104 コピ− 1.005 MOLT 4＋102 コピ− 0.603 MOLT 4 0.056 このように、この実施例の方法によると、ＤＮＡの増幅
を行なわないものとＤＮＡを106 倍に増幅したものとで
は、カウント数の比が106 オ−ダ−にもなる。すなわ
ち、106 という高い S／N 比が得られる。

【０１０６】これに対して、従来のカロリメトリ法によ
り得られた結果は、 S／N 比がわずかに102 のオ−ダ−
でしかない。また、酵素と反応させるために18時間とい
う長い時間インキュベ−ションしなければならない。

【０１０７】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、同一の
ターゲットヌクレオチドの異なるヌクレオチドのそれぞ
れに対して異なる標識物質を同時に反応させるので、短
時間で簡単に反応を行うことができる。また、本発明の
態様によれば、一度の除去操作だけで、未反応成分を全
て除くことができるので、反応後の検出も短時間に行う
ことができる。また、検出用と分離用の標識をそれぞれ
異なるヌクレオチドに標識したので、検出しようとする
核酸のコピー数に応じた測定値を得ることができる。更
に、検出工程を化学発光で行う場合のＳ／Ｎ比も減らせ
るので測定のカウント誤差も少ない。 ［０１０８］なお、本発明は以下の１から４の項目に記
載の態様も含む。 １． 生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種
のヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
件下で処理する工程と、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
出可能に修飾されたヌクレオチドおよび分離可能に修飾
されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
長する工程と、 （ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ−の
伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長生成
物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分離す
る工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組み込
まれた、分離可能に修飾されたヌクレオチドと結合する
ことが可能である工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中に
おける目的とするヌクレオチド配列の検出を行なう工程
とを具備する方法。 ２．生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
件下で処理する工程であって、前記プライマ−の５´末
端が分離可能に修飾されている工程と、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
出可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
長する工程と、 （ｅ）リガンドを固相化した固相支持体にプライマ−の
伸長生成物を結合させることにより、増幅した伸長生成
物を目的とするヌクレオチド配列以外の配列から分離す
る工程であって、前記リガンドは、伸長生成物に組み込
まれた、分離可能に修飾されたプライマ−と結合するこ
とが可能である工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中に
おける目的とするヌクレオチド配列の検出を行なう工程
とを具備する方法。 ３． 生物学的試料中の核酸に含まれる少なくとも１種
のヌクレオチド配列の検出方法であって、 （ａ）２つの独立した相補鎖からなる少なくとも１種の
ヌクレオチド配列を有する生物学的試料を、２種のプラ
イマ−を用いて、各々のプライマ−がそれぞれのヌクレ
オチド配列に結合してハイブリッドを形成するような条
件下で処理する工程であって、 （ｂ）前記ヌクレオチド配列をテンプレ−ト鎖として用
い、溶液からヌクレオチドを取り込むことにより前記ハ
イブリッドのプライマ−鎖を伸長する工程であって、伸
長プライマ−鎖に取り込まれるヌクレオチドの複数が検
出可能に修飾されたヌクレオチドである工程と、 （ｃ）伸長プライマ−鎖をテンプレ−トから解離して一
本鎖を形成する工程と、 （ｄ）工程（ｃ）において生じた一本鎖を、工程（ａ）
と同じ条件下で、工程（ａ）で用いたプライマ−で処理
し、次いで工程（ｂ）と同じ条件下でプライマ−鎖を伸
長する工程と、 （ｅ）分子量、サイズ、または電荷量の差異に基づい
て、増幅した伸長生成物を目的とするヌクレオチド配列
以外の配列から分離する工程と、 （ｆ）伸張生成物に組み込まれている検出可能に修飾さ
れているヌクレオチドの量を測定し、生物学的試料中の
ヌクレオチド配列の検出を行なう工程とを具備する方
法。 ４． 前記検出可能に修飾されたヌクレオチドが蛍光物
質で標識されたヌクレオチドであり、前記プライマ−が
いずれもヌクレオチドの標識に用いられる蛍光物質とは
異なる蛍光物質で標識されており、工程（ｅ）における
増幅された伸長生成物の分離がキャピラリ−電気泳動に
より行なわれ、かつ検出可能に修飾されたヌクレオチド
の量の測定が前記２種の蛍光標識を異なる波長領域で同
時に測定することにより行なわれる上記３の項目に記載
の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明による核酸検出方法の第１の態様にお
ける、ＰＣＲの原理を説明する図。

【図２】図１に示すＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを
模式的に示す図。

【図３】図２に示すＤＮＡの固相化を模式的に示す図。

【図４】固相化されたＤＮＡの検出を模式的に示す図。

【図５】この発明による核酸検出方法の第２の態様にお
ける、ＰＣＲの原理を説明する図。

【図６】図５に示すＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを
模式的に示す図。

【図７】図６に示すＤＮＡの固相化を模式的に示す図。

【図８】固相化されたＤＮＡの検出を模式的に示す図。

【図９】この発明の実施例において用いた、ＨＩＶのＧ
ＡＧ領域に特異性を有するプライマ−の塩基配列を示す
図。

【図１０】図９に示されるプライマ−によって増幅され
る、ＨＩＶ遺伝子の領域を示す図。

【図１１】この発明の実施例において、ＰＣＲによって
増幅されたＤＮＡに標識ヌクレオチドが取り込まれたこ
とを示す電気泳動パタ−ンの写真。

【図１２】この発明の実施例において用いられるアガロ
−スゲルカラムの概略を示す図。

【図１３】この発明の実施例において得られた、ゲルろ
過後の試料の電気泳動パタ−ンを示す写真。

【図１４】この発明の実施例における、コピ−数の異な
る試料に対する化学発光を利用したイムノアッセイの結
果を示すグラフである。

【符号の説明】

11、21…二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、12、22…一本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ、13、23…プライマ−、14、24…検出
用標識剤、15、25…固相化用標識剤、17、27…固相化
剤、18、28…リガンド、51…パストゥ−ルピペット、52
…ガラスウ−ル、53…カラム樹脂

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 3/00 G01N 33/50 - 33/98 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＰｕｂＭｅｄ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ターゲットヌクレオチドを検出する方法
   であって、 （ａ）分離用標識物質を有し、プライマーおよびｄＮＴ
   Ｐからなる群より独立して選択される第１のヌクレオチ
   ドと、検出用標識物質を有し、第１のヌクレオチドとは異なる
   種類のヌクレオチドであり、且つプライマーおよびｄＮ
   ＴＰからなる群より独立して選択される第２のヌクレオ
   チドとを、 同一のターゲットヌクレオチドと液中で混合し反応させ
   る工程；および （ｂ）前記分離用標識物質と検出用標識物質が共に結合
   されたターゲットヌクレオチドを検出することによっ
   て、ターゲットヌクレオチドを検出する工程； を具備するターゲットヌクレオチドを検出する方法。
2. 【請求項２】 ターゲットヌクレオチドを検出する方法
   であって、 （ａ）分離用標識物質を有し、プライマーおよびｄＮＴ
   Ｐからなる群より独立して選択される第１のヌクレオチ
   ドと、検出用標識物質を有し、第１のヌクレオチドとは異なる
   種類のヌクレオチドであり、且つプライマーおよびｄＮ
   ＴＰからなる群より独立して選択される第２のヌクレオ
   チドとを 、 同一のターゲットヌクレオチドと液中で混合し反応させ
   る工程；および （ｂ）前記分離用標識物質と特異的に反応する物質に対
   して前記分離用標識物質を結合して回収し、回収された
   該分離用標識物質と共にターゲットヌクレオチドに結合
   される検出用標識物質を検出することによってターゲッ
   トヌクレオチドを検出する工程； を具備するターゲットヌクレオチドを検出する方法。
3. 【請求項３】 ターゲットヌクレオチドを検出する方法
   であって、 （ａ）分離用標識物質を有し、プライマーおよびｄＮＴ
   Ｐからなる群より独立して選択される第１のヌクレオチ
   ドと、検出用標識物質を有し、第１のヌクレオチドとは異なる
   種類のヌクレオチドであり、且つプライマーおよびｄＮ
   ＴＰからなる群より独立して選択される第２のヌクレオ
   チドとを、 同一のターゲットヌクレオチドと液中で混合し反応させ
   る工程； （ｂ）前記分離用標識物質に特異的に反応する物質を固
   相化した支持体に対して、前記分離用標識物質を結合さ
   せ、前記支持体を洗浄して未結合の検出用標識物質を除
   去する工程；および （ｃ）前記ターゲットヌクレオチドに反応された検出用
   標識物質を検出することによってターゲットヌクレオチ
   ドを検出する工程； を具備するターゲットヌクレオチドを検出する方法。
4. 【請求項４】 請求項１から３に記載の検出方法であっ
   て、前記分離用標識物質と前記固相支持体との結合が、
   核酸反応以外の結合様式であることを特徴とするターゲ
   ットヌクレオチドを検出する方法。
5. 【請求項５】 請求項１から４の何れか１項に記載の検
   出方法であって、第１のヌクレオチドおよび第２のヌク
   レオチドが、互いに異なる種類のｄＮＴＰであることを
   特徴とするターゲットヌクレオチドを検出する方法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の検出方法であって、前
   記検出する工程が、化学発光のための酵素および基質を
   添加する工程と、前記酵素の存在下で発光する光が有す
   るエネルギーで測定する工程とを具備することを特徴と
   するターゲットヌクレオチドを検出する方法。
7. 【請求項７】 ターゲットヌクレオチドを検出する方法
   であって、 （ａ）第１の標識物質を有し、プライマーおよびｄＮＴ
   Ｐからなる群より独立して選択される第１のヌクレオチ
   ドと、第２の標識物質を有し、第１のヌクレオチドとは異なる
   種類のヌクレオチドであり、且つプライマーおよびｄＮ
   ＴＰからなる群より独立して選択される第２のヌクレオ
   チド とを、 ターゲットヌクレオチドに混合して、第１のヌクレオチ
   ドと第２のヌクレオチドを同一のターゲットヌクレオチ
   ドと液中で混合し反応させる工程 ここで、第１の標識物質と第２の標識物質は互いに異な
   る信号をもたらす； （ｂ）同一のターゲットヌクレオチドに反応された第１
   の標識物質からの第１の信号と、第２の標識物質から第
   ２の信号とを、同時に検出する工程；および （ｃ）前記（ｂ）の工程において検出されるべき信号の
   有無および／または量を基にターゲットヌクレオチドの
   検出を判定する工程； を具備するターゲットヌクレオチドを検出する方法。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の検出方法であって、第
   １のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドが、互いに
   異なる種類のｄＮＴＰであることを特徴とするターゲッ
   トヌクレオチドを検出する方法。
9. 【請求項９】 請求項７に記載の検出方法であって、前
   記検出する工程が、化学発光のための酵素および基質を
   添加する工程と、前記酵素の存在下で発光する光が有す
   るエネルギーで測定する工程とを具備することを特徴と
   するターゲットヌクレオチドを検出する方法。